ES2639306T3 - Método y aparato para clasificar células - Google Patents

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ES2639306T3 ES09176836.6T ES09176836T ES2639306T3 ES 2639306 T3 ES2639306 T3 ES 2639306T3 ES 09176836 T ES09176836 T ES 09176836T ES 2639306 T3 ES2639306 T3 ES 2639306T3
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Amy L. Anderson
Christopher R. Knutson
Joseph Plewa
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Abstract

Un aparato detector para la formación de imágenes de un objeto (660) en una célula de flujo de un clasificador de flujos, comprendiendo dicho aparato: una fuente óptica (342) que produce un haz de salida (344, 644) dirigido hacia una trayectoria de flujo de una muestra (336) en el clasificador de flujos para iluminar el objeto; una lente colectora (664) proporciona una distancia predeterminada desde el plano del objeto (662) igual a una longitud focal eficaz de la lente colectora; la iluminación del objeto (660) produce haces (646L, 646C, 646R) que salen de la lente colectora (664) y son colimados en forma de haces muy pequeños (666L, 666C, 666R) que se dividen en haces muy pequeños fuera del eje y haces muy pequeños del eje central, para formar múltiples imágenes del objeto en la forma de una luz que sale del plano del objeto a diferentes ángulos con relación a un eje central (C) del detector; caracterizado por: una pluralidad de espejos de divisores de haces (672L, 672R) que separan los haces muy pequeños que salen de dicha lente colectora (664) en forma de dichos haces muy pequeños fuera del eje (666L, 666R) a lo largo del mismo eje, en cualquier lado de los haces muy pequeños del eje central (666C); en el que se determina una ubicación lateral de cada haz muy pequeño colimado (666L, 666C, 666R) principalmente mediante su ángulo desde el plano del objeto; y una pluralidad de detectores (680L, 680C, 680R) sensibles a la luz de cada uno de dichos haces muy pequeños fuera del eje (666L, 666R) y dichos haces muy pequeños del eje central (666C).

Description

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DESCRIPCION
Metodo y aparato para clasificar celulas
La invencion se refiere a un clasificador de flujos que emplea un sistema de deteccion y de captura de imageries selectivo multiangular para clasificar celulas. Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo y a un aparato para la deteccion optica y para la captura de imagenes de objetos.
Los sistemas de captura de imagenes conocidos tienden a ser acimutalmente simetricos, aceptando la luz dentro de un cierto intervalo de angulos establecido por la apertura numerica (NA, por sus siglas en ingles, Numerical Aperture) del sistema de captura de imagenes. Toda la luz que viene del plano del objeto dentro de la NA se transfiere idealmente al plano de la imagen de manera uniforme, en ausencia de aberraciones o difuminacion mediante la optica o las aperturas que son demasiado pequenas. La razon de este diseno es que es deseable tener una eficacia de captura de luz razonablemente alta (es decir, una NA alta) y que las variaciones angulares en intensidad a menudo no llevan informacion importante.
Un sistema de captura de imagenes de ejemplo es una unica lente redonda o un par de lentes redondas. Para los casos en los que se desea una alta eficiencia de captura, tal como en los sistemas de captura de imagenes que son tenues, se disena un sistema de NA alta usando un elemento optico que es grande en comparacion con el tamano del objeto y que esta cerca en comparacion con su tamano. De esta manera, la lente captura una gran fraccion de la luz. Una NA alta tambien es importante para maximizar la resolucion y para obtener una profundidad focal estrecha.
Los citometros de flujo son dispositivos que utilizan la dispersion optica y la fluorescencia para diferenciar entre celulas u otros objetos pequenos, tales como perlas fluorescentes, y para clasificarlos en base a las mediciones opticas diferenciadas. A medida que los objetos fluyen a traves de un chorro estrecho, la luz laser de entrada se dispersa, incidiendo en los objetos, e incita a la fluorescencia. Se detectan senales de luz dispersada y fluorescente en angulos variables para caracterizar y diferenciar objetos con propiedades diferentes.
Una de las dificultades de la clasificacion en el genero de los espermatozoides es la forma muy plana de los espermatozoides, especialmente del esperma bovino. La forma plana, combinada con el mayor indice de refraccion del ADN en relacion con el entorno acuoso, provocan el efecto de lente de la luz y la reflexion interna, incluyendo la luz fluorescente que se origina en la cabeza del espermatozoide. Este efecto de lente provoca que la luz se emita preferentemente a traves de los bordes de los espermatozoides, con una emision mucho menor a traves de las dos caras planas de la cabeza del espermatozoide. Por lo tanto, la deteccion de la intensidad de luz y la determinacion del contenido cromosomico X o Y de los espermatozoides depende de la alineacion fiable de los espermatozoides y de la capacidad de ver la fluorescencia de los espermatozoides desde multiples angulos.
Los sistemas de alineacion conocidos emplean un dispositivo en el que los espermatozoides se orientan y se proyectan en una zona de deteccion por medio de una boquilla, tal como se ilustra en la patente de Estados Unidos n.° 5.985.216, de Rens et al. En tal dispositivo, la boquilla de clasificacion tiene una seccion transversal eliptica para orientar las celulas aplanadas. Una desventaja de Rens es que si el caudal es superior a aproximadamente 5.000 espermatozoides por segundo, las celulas no pueden captarse ni caracterizarse de forma fiable. Un caudal de 5.000 espermatozoides por segundo es ineficaz y lento. Un caudal mas practico para clasificar el esperma es de aproximadamente 100.000 espermatozoides por segundo o superior. El documento US 4.737.648 muestra tambien un ejemplo de detector de la tecnica anterior.
En la solicitud de patente de Estados Unidos con n.° de serie 10/974.976, titulada "SYSTEM AND METHOD FOR MANIPULATING AND PROCESSING NANOMATERIALS USING HOLOGRAPHIC OPTICAL TRAPPING", presentada el 28 de octubre de 2004, y en la solicitud de patente de Estados Unidos con n.° de serie 10/934.597, presentada el 3 de septiembre de 2004, titulada " MULTIPLE LAMINAR FLOW-BASED PARTICLE AND CELLULAR SEPARATION WITH LASER STEERING" se describe un tipo de sistema de captura de imagenes utilizado para manipular pequenas particulas.
Sumario de la invencion
Segun un primer aspecto, la invencion proporciona un aparato detector para la formacion de imagenes de un objeto (660) en una celula de flujo de un clasificador de flujos, comprendiendo dicho aparato:
una fuente optica (342) que produce un haz de salida (344, 644) dirigido hacia una trayectoria de flujo (336) de la muestra en el clasificador de flujos para iluminar el objeto;
una lente colectora (664) proporciona una distancia predeterminada desde el plano del objeto (662) igual a una longitud focal eficaz de la lente colectora.
La iluminacion del objeto (660) produce haces (646L, 646C, 646R) que salen de la lente colectora (664) y son colimados en forma de haces muy pequenos (666L, 666C, 666R) que se dividen en haces muy pequenos fuera del
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eje y haces muy pequenos del eje central, para formar multiples imagenes del objeto en la forma de luz que sale del plano del objeto a diferentes angulos con relacion a un eje central (C) del detector; caracterizado por:
una pluralidad de espejos de divisores de haces (672L, 672R) que separan los haces muy pequenos que salen de dicha lente colectora (664) en forma de dichos haces muy pequenos fuera del eje (666L, 666c, 666R) a lo largo del mismo eje, en cualquier lado de los haces muy pequenos del eje central (666C); en el que se determina una ubicacion lateral de cada haz muy pequeno colimado (666L, 666C, 666R) principalmente mediante su angulo desde el plano del objeto; y
una pluralidad de detectores (680L, 680C, 680R) sensibles a la luz de cada uno de dichos haces muy pequenos fuera del eje (666L, 666R) y dichos haces muy pequenos del eje central (666C).
Segun un segundo aspecto, la invencion proporciona un metodo de formacion de imagenes de un objeto en una celula de flujo de un clasificador de flujos, que comprende:
producir un haz de salida dirigido hacia una trayectoria de flujo de la muestra en un clasificador de flujos, iluminando dicho haz de salida el objeto en la trayectoria de flujo de la muestra de la celula de flujo;
en el que la iluminacion del objeto produce haces que salen de una lente colectora proporciono una distancia predeterminada desde el plano del objeto igual a una longitud focal eficaz de la lente colectora;
colimar dichos haces que salen de dicha lente colectora en forma de haces muy pequenos que se dividen en forma de haces muy pequenos fuera del eje y haces muy pequenos del eje central, para formar multiples imagenes del objeto en la forma de luz que sale del plano del objeto a diferentes angulos con relacion a un eje central de dicho clasificador de flujos;
separar dichos haces muy pequenos que salen de dicha lente colectora usando una pluralidad de espejos o divisores de haces, en forma de dichos haces muy pequenos fuera del eje a lo largo del mismo eje, y en cualquier lado de los haces muy pequenos del eje central; y
detectar el objeto usando un detector sensible a la luz de cada uno de dichos haces muy pequenos fuera del eje (666L, 666R) y dichos haces muy pequenos del eje central (666C);
en el que se determina una ubicacion lateral de cada uno de los haces muy pequenos colimados principalmente mediante su angulo desde el plano del objeto.
La presente invencion se basa en el descubrimiento de que un clasificador de flujos para clasificar y orientar celulas emplea un canal de flujo que tiene una entrada, una salida, una zona de deteccion intermedia, y opcionalmente, una zona de clasificacion. La entrada recibe una de cada una de las corrientes alternas separadas del fluido envolvente de entrada y una corriente de muestra que contiene las celulas a clasificar entre las corrientes envolventes. Las corrientes envolventes y la corriente de muestra tienen caudales o presiones en la camara de flujo respectivos, de tal manera que la corriente de muestra se estrangula formando de este modo una corriente de muestra relativamente estrecha en la zona de deteccion mediante la que las celulas se orientan en una direccion seleccionada con respecto a la luz de entrada. Un detector que emplea una configuracion multiangulo o una configuracion de imagenes de vector K se enfoca en la zona de deteccion para discriminar entre las celulas deseadas y las no deseadas.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama de flujo de las etapas para clasificar celulas que se han tenido con un tinte fluorescente.
La figura 2 es una ilustracion esquematica en perspectiva de un dispositivo o cartucho de flujo de acuerdo con la invencion.
La figura 3 es una ilustracion esquematica de un dispositivo de flujo de canal unico para clasificar, que no forma parte de la presente invencion.
La figura 4 es una vista lateral de un dispositivo de flujo multicanal para clasificar.
La figura 4A es una vista en planta (borde) superior, orientada a las entradas del sistema multicanal mostrado en la figura 4.
La figura 5 es una representacion esquematica de un detector de canal unico para detectar la luz dispersada (es decir, el sistema optico para captar imagenes de vector K).
Las figuras 5A-5D ilustran elementos opticos alternativos empleados en la disposicion de la figura 5.
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La figura 6 es una representacion esquematica de un detector de canal unico para detectar luz fluorescente y luz dispersada utilizando captura de imagenes de vector K.
La figura 7 es un dispositivo de canal multicanal para capturar imagenes de vector K con excitacion y deteccion de luz dispersada y fluorescente.
La figura 8 es una representacion esquematica de un accionador externo que ajusta las velocidades de flujo en un canal o en un dispositivo para clasificar celulas.
La figura 9 es una representacion esquematica de una vista superior de un dispositivo multicanal o cartucho para detectar y clasificar celulas.
Las figuras 10A-10D muestran varias formas alternativas de dirigir celulas que utilizan tres accionadores en M,W, F (figura 10 A), dos accionadores en S1, S2 (figura 10B), un accionador en S1 (figura 10C), y dos accionadores en M, F (figura 10D).
Las figuras 11A-11B muestran varias formas alternativas de destruir celulas mediante destruccion o activacion por laser (figura 11A), y destruccion o activacion electrica (figura 11B).
Descripcion de la invencion
La figura 1 ilustra un diagrama de flujo que expone las etapas para caracterizar, clasificar y procesar objetos, para la conservacion criogenica, particularmente de los espermatozoides bovinos.
La primera fase desde la recogida 100, la extension 101, hasta el enfriamiento lento 102, es el objeto de diversos procedimientos, algunos de los cuales son novedosos y otros ya se conocen.
Un sistema novedoso para preparar celulas para la clasificacion se expone en la solicitud de patente de Estados Unidos con n.° de serie (por asignar) en tramite junto con la presente, titulada: "Novel Method For In Vivo Staining of Cells for Identification and Sorting", presentada el 1 de febrero de 2005.
Las etapas incluyen cargar una muestra en un chip desechable 200; filtrar la muestra para eliminar el material agregado de gran tamano 201, tal como agregados vitelinos; emplear una alineacion basada en el flujo 202 como se expone en lo sucesivo en el presente documento; emplear la deteccion de genero paralelizada 203, las etapas de discriminacion (es decir, la discriminacion de genero 204) y el accionamiento (es decir, el accionamiento de genero 205); la concentracion pasiva y la compensacion 206, y el suministro a un deposito de salida 207. El metodo tambien puede suprimir opcionalmente algunas etapas e incluir una etapa de discriminacion y de destruccion para eliminar espermatozoides vivos no deseados.
Las etapas de clasificacion de genero 103 que incluyen todo lo anterior, vas seguidas de las etapas de enfriamiento lento a 4 °C y sedimentacion 104; extension final 105; envasado en pajuelas 106; sedimentacion 107 y congelacion 108.
Las figuras 2-3 ilustran en diversas formas un citometro de flujo 300 de acuerdo con la invencion. El dispositivo puede ser un sistema de canal unico. Sin embargo, la invencion esta bien adecuada para aplicaciones multicanal, particularmente en aplicaciones de clasificacion de espermatozoides, donde debe clasificarse un gran numero de espermatozoides en una cantidad razonable de tiempo.
En las figuras 2-3, el dispositivo 300 comprende una camara de cuerpo o camara de flujo 312 formada por un par de paredes enfrentadas 314 y de paredes terminales 316 (solo una de las cuales se muestra en la figura 1), una parte superior abierta o entrada 318 y un fondo abierto o salida 320.
La entrada 318 se divide en tres secciones que incluyen entradas exteriores 322 y una entrada central o entrada de la muestra 324. Las entradas exteriores 322 son para recibir un fluido envolvente 326 en las mismas y la entrada central 324 es para recibir un fluido de muestra 328 que contiene un medio liquido y celulas 330 dispersadas en el mismo.
La salida 320 tiene secciones exteriores de salida 332 y canales centrales de recogida de muestra, especificamente, un canal izquierdo de salida de la muestra 334L, un canal central de salida de la muestra 334C y un canal derecho de salida de la muestra 334R. El canal 334L es para una primera muestra clasificada, el canal 334C es para una segunda muestra clasificada y el canal 334R es para otra muestra clasificada.
El fluido envolvente 326 se introduce en las entradas exteriores 322 con un caudal seleccionado. El fluido demuestra 326 se introduce en la entrada central 324 con un caudal o presion seleccionados en relacion con el caudal o la presion del fluido envolvente, de tal manera que los fluidos envolventes comprimen y estrangulan el flujo de la
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muestra a una trayectoria de flujo de la muestra relativamente estrecha 336 como se muestra. En una realizacion ejemplar, la anchura de la trayectoria de flujo de la muestra 336 es aproximadamente un 10 % o menos de la anchura del fluido de muestra en la entrada central de 324, por ejemplo, aproximadamente 50 micrometros.
Las celulas 330 son circulares pero aplanadas. Como resultado, el estrangulamiento del fluido de muestra hace que las celulas 330 se orienten de modo que sus lados planos sean mas o menos paralelos a las paredes enfrentadas 314. La intensidad de la luz irradiada por una celula es diferente en diferentes orientaciones. Por eso, para compararla intensidad de dos o mas celulas, estas deben tener la misma orientacion. Por lo tanto, las celulas alineadas reducen el ruido o el error sistematico causado por tener emisores de luz anisotropica en orientaciones aleatorias.
Al alternar las entradas de fluido envolvente 326 y la entrada de la muestra o de la solucion objeto 328 (vease la figura 3) que entran en el sistema, se crea una pequena cantidad de estrangulamiento (en relacion con el estrangulamiento en la direccion ortogonal) 401, que provoca la cizalladura, y el flujo de cizallamiento alinea las celulas 400. Este patron de flujo alterno se comprime mas severamente entre dos flujos de entrada de fluido envolvente largos, lo que consigue la alineacion necesaria. Esta disposicion puede combinarse, en lo sucesivo en el presente documento, con la deteccion, para proporcionar un sistema paralelo en el que puedan interrogarse multiples flujos.
Especificamente, el flujo de estrangulamiento mueve objetos en el plano focal 402, y acelera el movimiento a traves de la zona de deteccion 403. La curva 404 en el sistema muestra el limite de fluido 404, y la zona de deteccion 405 permite la caracterizacion. El cono de luz 406 permite la interrogacion, y la posicion de la corriente de defecto 407 puede dirigirse entre multiples salidas.
Al variar el caudal a traves de los tres canales de salida 409-411, las celulas u otros objetos en la solucion pueden clasificarse en una de las multiples corrientes de salida. El accionamiento puede hacerse de varias maneras, como se ha especificado anteriormente. La conmutacion de flujo de alta velocidad puede realizarse mediante dispositivos piezoelectricos que pueden ser intrinsecos a la maquina o intrinsecos al cartucho de canal de flujo desechable. La region de conmutacion de flujo 408 controla el caudal preciso, que varia con el tiempo para cambiar entre los canales de salida 409-411 (donde V2<V1 y V4~v2).
El detector 340 (figura 2) comprende un laser 342 u otra fuente adecuada que produzca un haz de salida 344 dirigido hacia la trayectoria de flujo de la muestra 336 en una zona de deteccion 338 intermedia entre la entrada y la salida. El haz 344 incide sobre la celula 330 en la zona de deteccion 338 y se dispersa formando un haz de salida 346. La celula contiene un fluoroforo y, por lo tanto, tambien produce luz fluorescente, que esta contenida en el haz de salida 346. Los componentes dispersados y fluorescentes respectivos 346S, 346F del haz de salida 346 se introducen en un detector optico que contiene un sistema optico 348 y un sistema detector electronico 350. El sistema optico y el sistema detector electronico se analizan en lo sucesivo en el presente documento.
El haz de salida 346 lleva la informacion al detector 340 que discrimina entre las celulas 330 y produce una salida 354 a un clasificador 356. El clasificador 356 controla los controladores 358 en relacion operativa con los canales de salida 334 para variar los caudales relativos, de manera que cada celula 330 se clasifique en un canal apropiado. Alternativamente, las celulas pueden clasificarse como deseadas o no deseadas, y las celulas deseadas pueden recogerse y las celulas no deseadas pueden destruirse.
La figura 3 muestra un sistema de canal unico que tiene solo dos flujos envolventes 326 y un unico flujo de muestra 328. La figura 4 muestra un sistema multicanal con cuatro flujos demuestra 328 y flujos envolventes compartidos 326. La figura 4A muestra la camara de flujo y las trayectorias de flujo en planta superior.
Las figuras 4-4A muestran una posible forma de paralelizar el diseno para tener muchas corrientes paralelas 500 de la solucion de entrada. El flujo puede estrangularse tanto en el plano como normal al plano. Sin embargo, para los casos en los que es necesaria la alineacion de las celulas, tal como con el esperma bovino, el cizallamiento a lo largo de la direccion de la luz entrante debe ser mucho mayor para garantizar la alineacion normal a la luz entrante. La region de investigacion optica 502 es donde tiene lugar la dispersion laser y la fluorescencia.
En el ejemplo, cada envolvente tiene un sistema de lentes especializado, multiples elementos PMT cada uno de los cuales se dedica a una corriente correspondiente. Debe entenderse que el sistema puede tener un sistema detector de la lente para todos los canales y tambien un sistema optico de laser para todos los canales. Hay multiples posibles canales de salida 503 para cada corriente de flujo.
En la figura 5 se muestra una vista en planta simplificada del sistema optico del detector 640. Una muestra 660 se encuentra en un plano del objeto 662. En esta ilustracion, el haz de salida o los rayos de luz 646 emanan de la muestra 660 como haces elementales 646C, 646L, 646R. Los haces elementales 646C representan haces agrupados en el centro cerca del eje optico central C; y los haces elementales 646L y 646R se agrupan a la izquierda y a la derecha del eje central C. Los haces elementales proporcionan diferentes vistas de la muestra 660. Una lente colectora 664 (que puede ser una lente objetivo de un microscopio) se coloca a una distancia del plano del
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objeto 662, que es igual a la longitud focal efectiva (EFL, por sus siglas en ingles, Effective Focal Length) de la lente. La lente 664 puede ser una lente compuesta, si se desea, pero por simplicidad se describe como una unica lente con una EFL. Por lo tanto, al colocar la lente 664, la luz 646 del objeto que sale de la lente colectora 664 se colima como haces elementales 666 divididos a su vez, como 666R, 666C, 666L como se muestra. Esto crea un espacio infinito en el sistema de captura de imagenes. Aunque la presente invencion no requiere este espacio infinito, es una disposicion conveniente. El posicionamiento lateral de cada rayo de luz colimado se determina principalmente por su angulo que viene del plano del objeto. Los haces elementales 666L, 666R y 666C siguen a los haces elementales respectivos 642L, 642R y 642C.
Los haces elementales de luz central 666C salen de la lente 664 a lo largo de eje central C para centrarse en la lente 676C que enfoca la luz en el siguiente plano de la imagen 678C. Los espejos 672L, 672R separan los haces elementales 666L y 666R fuera del eje que salen de la lente colectora 664. Tengase en cuenta que esto tambien puede hacerse con la colocacion del detector 674A (figura 5A0) o de fibra optica 674B (figura 5B) en esta region, que son pequenos en comparacion con el tamano del haz en este espacio. Tengase en cuenta tambien, que en este espacio pueden insertarse elementos opticos adicionales, tales como lentes adicionales 674C (figura 5C) o un orificio 674D (figura 5D) para restringir el intervalo de angulos de luz que salen de la lente colectora 664, o para controlar (reiniciar o expandir) la profundidad focal desde la que se recoge la luz como en las mediciones de microscopia confocal. En algunas circunstancias, pueden utilizarse un par de lentes adicionales, con un orificio. En otros casos, puede utilizarse una mascara con tamano, forma o posicion controlables, para controlar la luz que llega a un detector dado.
La luz de los haces elementales 666L se desvia mediante el espejo 672L a la lente de enfoque izquierda 676L; y laluz del haz elemental 666R se dirige mediante el espejo 672R a la lente 676R y al plano derecho de la imagen 678R.Los detectores de luz 680L, 680R y 680C pueden estar situados en los respectivos planos focales de la imagen 678L, 678R y 670C para detectar las imagenes respectivas. Estos detectores de luz pueden ser CCD, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, tubos fotomultiplicadores multi-anodo u otros detectores.
En muchos casos, es deseable recoger tanto la luz dispersada como la luz fluorescente, en las que al menos una de las imagenes o detecciones realizadas requieren un intervalo reducido de angulos de rayos de la muestra. La figura 6 ilustra como puede hacerse esto, utilizando la configuracion de imagenes de vector K como se ha descrito anteriormente, pero con filtros y divisores de haces adicionales segun sea necesario. Los elementos similares tienen los mismos numeros de referencia.
En la figura 6, la iluminacion y la luz de excitacion 800 pasa a traves de la lente colectora 801, y se refleja mediante los espejos 802, 803 a traves de filtros de emision 688EL, 688ER a las lentes de enfoque 804, 805 y a los fotodetectores 690L, 690R, respectivamente, que forman los planos izquierdo y derecho de la imagen fluorescente.
El divisor de haz en 686C redirige la luz en el campo central 666C a traves de un filtro de emision 688E a la lente de enfoque 676FC. La salida 689E del filtro de emision 688E corresponde a la emision de fluorescencia de la celula. El filtro de la linea laser 688L en el eje optico central filtra la luz laser dispersa a la lente 676C y al fotodetector 690C, en los que se forma el siguiente plano de la imagen dispersada.
Se desea la paralelizacion para mejorar el rendimiento y las capacidades generales de un dispositivo. La figura 7 muestra como se logra esto. El laser 642 produce un haz de laser de entrada 644, que excita la fluorescencia, se divide en N haces multiples mediante el divisor de haz 690 (por ejemplo, red de difraccion u holograma). Los haces 692A y 692N se dispersan y cada uno se dirige a la zona de deteccion de una envolvente de muestra correspondiente (vease figura 4). Los haces elementales 692A-692N se coliman en haces paralelos mediante la lente colimadora 694. La salida 696 de la lente colimadora 694, se dirige a traves de la lente cilindrica 698 que enfoca los haces individuales 700A-700N en las corrientes de muestra en el plano del objeto 701. Como se muestra, (figura 4) la corriente de entrada se divide en muchas corrientes. La luz procedente de uno o todos los haces elementales 700A-700N en el ejemplo mostrado y las corrientes de muestra entran en la lente colectora 702K y se trata como se ha descrito anteriormente en la figura 6. Aqui, sin embargo, se utiliza un dispositivo de conjunto de detectores (tal como los PMT multi-anodo) 720 (720C, 720R, 720L, 720CF...) para cada grupo de haces de deteccion. La deteccion se logra mejor, no mediante la colocacion de un unico detector en cada posicion de captura de imagenes, sino mediante el uso de un conjunto de detectores, tal como un conjunto PMT lineal de 32 elementos 720.
El rendimiento de un sistema que captura imagenes o hace mediciones en muchos objetos dependera, en parte, del numero de detectores y de su velocidad. Para muchas aplicaciones, en cada plano de imagen se utiliza un unico detector, tal como un tubo fotomultiplicador (PMT). Esto es adecuado para los casos en los que los objetos pasan a traves del plano del objeto en una linea de fila unica. El clasificador 856 se describe en detalle en lo sucesivo en el presente documento. En la figura 8 se muestra un clasificador de canal unico.
El clasificador 856 comprende un miembro estructural 812; un canal que define la capa 816 formada con una ranura 818 que define un canal de flujo 820; una capa de membrana flexible 822 encima del canal que define la capa 816, y un miembro estructural 824 que completa la disposicion. Se acopla un accionador piezoelectrico o de otro tipo 826 a
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un controlador 828. Un piston 860 impulsado mediante el accionador 826 se acopla a la membrana flexible 822 opuesto al canal de flujo 820 para cambiar el patron de flujo dentro del canal de acuerdo con el suministro de tension la alimentacion de tension al piezoelectrico. Una pluralidad de tales estructuras puede miniaturizarse para localizarse en la ventana del accionador mediante la cual pueden clasificarse multiples flujos de muestras.
El uno o mas accionadores 826 pueden incluir: un transductor piezoelectrico para convertir las senales electricas en el accionamiento mecanico de los caudales; un calentador termico para calentar una region para expandir rapidamente un fluido, material o burbuja; una generacion de burbujas termica para crear una burbuja para reducir el flujo de la solucion; un dispositivo de movimiento capacitivo para una membrana; un dispositivo optico para calentar o mover el material, pared, membrana, burbuja, u otro material u objeto para impactar la velocidad de flujo en uno o mas de los canales de salida 934. El accionamiento puede ser intrinseco al dispositivo o puede aplicarse externamente. Por ejemplo, el accionador 826 y el piston 860 pueden ser un equipo externo, separado del dispositivo de flujo desechable 856 (es decir, el chip desechable con accionador externo/no desechable).
La figura 9 ilustra la disposicion en paralelo de multiples canales en los que los canales de entrada 900 alimentan las corrientes envolventes a los canales de flujo y los canales de salida 901 reciben los diversos espermatozoides clasificados. Se proporciona la ventana 930 para acoplar la luz de interrogacion a cada uno de los canales demuestra de detectores paralelos. La ventana de clasificacion 932 recibe una pluralidad de accionadores y elementos clasificadores desechables. Las clavijas de registro de chips del dispositivo 100 se designan como 940.
Las figuras 10A-10E ilustran realizaciones alternativas para dirigir celulas, que emplean una variedad de accionadores 934 en un dispositivo de flujo para clasificar esperma. En cada caso, se utilizan uno o mas accionadores, en el que cada accionador podria basarse en dispositivos piezoelectricos (intrinsecos o extrinsecos al cartucho), accionadores capacitivos, expansion termica, u otras tecnologias como se ha descrito en las divulgaciones anteriores. En la mayoria de los casos, se desean al menos dos accionadores 934, y posiblemente mas de dos accionadores, para controlar por que canal de salida 936 entra una celula u objeto particular. Los accionadores permiten controlar y variar los flujos a tasas muy altas. Son necesarias solamente perturbaciones minimas en el flujo para provocar que una corriente se mueva temporalmente de una salida a otra.
Las figuras 11A-11B muestran ejemplos de configuraciones de destruccion o de activacion sin clasificacion para lograr un resultado deseable. En la figura 11A, un laser 940 incide sobre la corriente del objeto/espermatozoide 942. Este laser se controla para que solamente incida energia letal en ciertos espermatozoides u objetos en funcion del resultado de la interrogacion.
Por ejemplo, este laser puede destruir ciertos espermatozoides u otras celulas segun se desee. Por ejemplo, puede destruir todos los espermatozoides de un genero determinado o incierto. Alternativamente, el laser no puede destruir directamente las celulas, pero puede "activarlas" de otro modo. Por ejemplo, podria activar algun producto quimico que se haya introducido previamente en los espermatozoides, dando como resultado general la destruccion de los mismos o afectando de otra manera a la fertilizacion. En las aplicaciones mas generales, la activacion puede tener un intervalo mucho mas amplio de actividades.
La figura 11B muestra la destruccion o activacion utilizando pulsos electricos letales, introducidos a traves de electrodos 944 que se insertan en el flujo para acceder localmente a la corriente central 942. Al igual que con la solucion laser, los electrodos pueden activarse o desactivarse rapidamente dependiendo del resultado de la interrogacion.
El direccionamiento tambien puede conseguirse opticamente, en el que las celulas se manipulan mediante un aparato de captura optica. Alternativamente, el proceso de accionamiento puede ser la electroporacion de las celulas, que puede ser letal o tener otro efecto sobre las celulas.
La siguiente tecnica alinea los espermatozoides utilizando el flujo de compresion:
Se introdujeron tres flujos en un chip de flujo usando una bomba peristaltica. Cada flujo se mantuvo en regimen laminar de manera que cada flujo no se mezcle con los otros. La corriente que contiene espermatozoides fluye entre las corrientes superiores e inferiores que son aguas. Aunque la velocidad del flujo superior e inferior se mantiene igual, al cambiar la relacion de estas con el flujo de espermatozoides, se pudo ver la compresion del flujo de esperma.
orientacion de los espermatozoides (%)
angulo desde la direccion de flujo (grados)
Re
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Se espera que el flujo comprimido ayude a que los espermatozoides se orienten a la direccion del flujo.
Se tomaron imagenes de los espermatozoides en el flujo usando una camara CCD equipada en nuestro microscopio.
La tabla anterior muestra el grado de orientacion de los espermatozoides en el flujo, donde Re es el numero de Reynolds definido como Dur/m donde D es el diametro del canal de flujo, U es la velocidad, r es la densidad del fluido y m es la viscosidad.
Re indica si el flujo es laminar o no. Incluso aunque valores de Re por debajo de 1000 se consideran flujo laminar, en algunas aplicaciones, se requieren valores muy pequenos de Re, tal como inferiores a 1.
A medida que aumenta la velocidad del flujo de espermatozoides, el valor de Re en el canal de entrada aumenta, pero todavia permanece en la region laminar que indica que la corriente de flujo no se perturba en nuestra region experimental.
La orientacion de los espermatozoides se cuantifico mediante la numeracion de los mismos en funcion del grado de alineacion de la cabeza de los espermatozoides a la direccion del flujo.
En el intervalo del experimento, aproximadamente el 80% de los espermatozoides capturados estaban orientados en menos de 15 grados a la direccion del flujo.
Se mostro una mejor alineacion a la direccion del flujo a mayor velocidad, pero tambien se encontraron mas espermatozoides perturbados.
Los resultados muestran que el sistema podria alinear espermatozoides usando esta tecnica.
Se debe entender que el control de la temperatura del fluido envolvente y del fluido de muestra puede emplearse para prolongar la vida de los espermatozoides. En una realizacion de ejemplo, la temperatura de los fluidos en el dispositivo de flujo puede mantenerse alrededor de 2 a 10 °C para inmovilizar los espermatozoides y, por lo tanto, prolongar su vida util.

Claims (28)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un aparato detector para la formacion de imageries de un objeto (660) en una celula de flujo de un clasificador de flujos, comprendiendo dicho aparato:
    una fuente optica (342) que produce un haz de salida (344, 644) dirigido hacia una trayectoria de flujo de una muestra (336) en el clasificador de flujos para iluminar el objeto;
    una lente colectora (664) proporciona una distancia predeterminada desde el plano del objeto (662) igual a una longitud focal eficaz de la lente colectora;
    la iluminacion del objeto (660) produce haces (646L, 646C, 646R) que salen de la lente colectora (664) y son colimados en forma de haces muy pequenos (666L, 666C, 666R) que se dividen en haces muy pequenos fuera del eje y haces muy pequenos del eje central, para formar multiples imagenes del objeto en la forma de una luz que sale del plano del objeto a diferentes angulos con relacion a un eje central (C) del detector;
    caracterizado por:
    una pluralidad de espejos de divisores de haces (672L, 672R) que separan los haces muy pequenos que salen de dicha lente colectora (664) en forma de dichos haces muy pequenos fuera del eje (666L, 666R) a lo largo del mismo eje, en cualquier lado de los haces muy pequenos del eje central (666C); en el que se determina una ubicacion lateral de cada haz muy pequeno colimado (666L, 666C, 666R) principalmente mediante su angulo desde el plano del objeto; y
    una pluralidad de detectores (680L, 680C, 680R) sensibles a la luz de cada uno de dichos haces muy pequenos fuera del eje (666L, 666R) y dichos haces muy pequenos del eje central (666C).
  2. 2. El aparato de la reivindicacion 1, en el que el detector es sensible a al menos una de una luz dirigida a lo largo del eje optico del detector y una luz dirigida fuera del eje del detector.
  3. 3. El aparato de la reivindicacion 2, en el que el detector fuera del eje comprende al menos dos fotodetectores lateralmente desplazados con respecto al eje central para detectar una luz fuera del eje correspondiente a diferentes posiciones en el plano del objeto.
  4. 4. El aparato de la reivindicacion 3, que incluye adicionalmente un filtro para filtrar al menos una de luz fluorescente y dispersada de cada haz.
  5. 5. El aparato de la reivindicacion 3, en el que el fotodetector comprende un tubo fotomultiplicador de elementos multiples para detectar multiples haces de luz.
  6. 6. El aparato de la reivindicacion 1, en el que la fuente optica comprende un laser.
  7. 7. El aparato de la reivindicacion 6, que incluye adicionalmente una lente para colimar la luz de cada objeto en forma de haces separados.
  8. 8. El aparato de la reivindicacion 7, que incluye adicionalmente una lente colectora para cada haz.
  9. 9. Un sistema que comprende un aparato detector segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye adicionalmente un destructor de celulas en direccion descendente del detector para destruir celulas no deseadas.
  10. 10. El sistema de la reivindicacion 9, en el que el destructor de celulas comprende al menos uno de un laser y electrodo para dirigir una energia letal a las celulas no deseadas.
  11. 11. El sistema de la reivindicacion 9, en el que el destructor de celulas comprende una fuente de luz para activar una diana letal en la celula.
  12. 12. Un sistema que comprende un aparato detector segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que incluye adicionalmente una electroporacion de celulas para tratar o destruir eficazmente celulas no deseadas.
  13. 13. El aparato de la reivindicacion 1, en el que el clasificador de flujos puede funcionar a aproximadamente 2°C - 10°C para prolongar la vida de las celulas.
  14. 14. El aparato de la reivindicacion 1, en el que el detector (680L, 680C, 680R) en la zona del detector detecta celulas.
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  15. 15. El aparato de la reivindicacion 14, en el que las celulas son espermatozoides.
  16. 16. El aparato de la reivindicacion 15, en el que el detector detecta celulas deseadas y dichas celulas deseadas son una de celulas de cromosoma X o cromosoma Y.
  17. 17. El aparato de la reivindicacion 16, en el que las celulas no deseadas son una de dichas celulas de cromosoma X o cromosoma Y.
  18. 18. El aparato de la reivindicacion 17, en el que dichas celulas no deseadas son destruidas usando una emision de laser.
  19. 19. Un sistema que comprende un aparato detector segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que incluye adicionalmente un clasificador de flujos que clasifica celulas deseadas de celulas no deseadas.
  20. 20. El sistema de la reivindicacion 19, en el que dichas celulas son espermatozoides.
  21. 21. El sistema de la reivindicacion 20, en el que dichas celulas deseadas son una de celulas de cromosoma X o cromosoma Y.
  22. 22. El sistema de la reivindicacion 20, en el que dichas celulas no deseadas son una de celulas de cromosoma X o cromosoma Y.
  23. 23. Un metodo de formacion de imagenes de un objeto en una celula de flujo de un clasificador de flujos, que comprende:
    producir un haz de salida dirigido hacia una trayectoria de flujo de la muestra en un clasificador de flujos, en el que dicho haz de salida ilumina el objeto en la trayectoria de flujo de la muestra de la celula de flujo;
    en el que la iluminacion del objeto produce haces que salen de una lente colectora que proporcionan una distancia predeterminada desde el plano del objeto igual a una longitud focal eficaz de la lente colectora;
    colimar dichos haces que salen de dicha lente colectora en forma de haces muy pequenos que se dividen en forma de haces muy pequenos fuera del eje y haces muy pequenos del eje central, para formar multiples imagenes del objeto en la forma de luz que sale del plano del objeto a diferentes angulos con relacion a un eje central de dicho clasificador de flujos;
    separar dichos haces muy pequenos que salen de dicha lente colectora usando una pluralidad de espejos o divisores de haces, en forma de dichos haces muy pequenos fuera del eje a lo largo del mismo eje, y en cualquier lado de los haces muy pequenos del eje central; y
    detectar el objeto usando un detector sensible a la luz de cada uno de dichos haces muy pequenos fuera del eje (666L, 666R) y dichos haces muy pequenos del eje central (666C);
    en el que se determina una ubicacion lateral de cada uno de los haces muy pequenos colimados principalmente mediante su angulo desde el plano del objeto.
  24. 24. El aparato de la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente:
    lentes adicionales (674C) o un orificio (674D) dispuesto donde dichos haces muy pequenos separados salen de dicha lente colectora (664) en forma de dichos haces muy pequenos fuera del eje (666l, 666R).
  25. 25. El aparato de la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente:
    un divisor de haces (686C) que redirige dichos haces muy pequenos en un campo central (666C) a traves de un filtro de emision (688E) hacia una lente de enfoque (676FC).
  26. 26. El aparato de la reivindicacion 25, que comprende adicionalmente:
    un filtro de linea laser (688L) dispuesto en dicho eje central (C) que filtra haces muy pequenos dispersados de dicho laser (800) hacia la lente (676C) y el fotodetector (690C).
  27. 27. El aparato de la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente:
    una lente cilindrica (698) que enfoca haces muy pequenos individuales (700A-700N) en dicha lente colectora (702K).
  28. 28. El aparato de la reivindicacion 8, en el que dichos detectores son sustituidos con un conjunto PMT lineal de
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