ES2638919T3 - Variante de la anexina V y preparación y uso de la misma - Google Patents

Abstract

Una variante de la anexina V, teniendo dicha variante añadido al extremo C de una anexina V (i) un resto de cisteína o (ii) un péptido corto con estructura flexible, en el que el péptido corto tiene hasta 25 restos de aminoácidos, de los cuales 1-3 son restos de cisteína y los otros restos de aminoácidos, si los hay, son restos de glicina, alanina y/o serina.

Description

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aproximadamente 0,6; la temperatura de la tabla de agitación desciende a 25 ºC y continuar cultivando durante media hora y añadir IPTG hasta que la concentración final es de 0,5 mM para inducir la expresión de la proteína diana. Después de agitar el cultivo a 25 ºC durante 5 horas, se recogen las bacterias.

g: el líquido con bacterias recogido en la etapa f se resuspende con la proporción de 5 ml de tampón (NH4Cl 50 mM, a pH 9,0) a 1 g de bacterias húmedas y añadir lisozima para tratar las bacterias, añadir sacarosa hasta que la concentración es del 60 % tras 1 hora, después diluir en el tampón (NH4Cl 50 mM, CaCl2 20 mM, pH 9,0) con 20 veces el volumen, centrifugar y descartar el sobrenadante, recoger el precipitado. Resuspender el precipitado con la proporción de 5 ml de solución de desorción (NH4Cl 50 mM, pH 9,0, EDTA 20 mM) a 1 g de precipitado, centrifugar y adquirir el sobrenadante. El sobrenadante obtenido anteriormente se precipita graduado en sulfato de amonio, y recoger 40-70 % partes de la precipitación que se va a volver a disolver y dializar, después se filtra para eliminar la sustancia insoluble. Usar el tampón de inicio (NH4Cl 50 mM, pH 9,0) para equilibrar la columna de cromatografía Super Q-650M (Japan TOSOH company), usando el tampón de elución (NH4Cl 50 mM, pH 9,0, NaCl 200 mM ) para eluir, recoger el pico de elución; usando el tampón de inicio I (NH4Cl 20 mM, NaCl 80 mM, CaCl2 15 mM, pH 9,0) Para equilibrar la columna de cromatografía SP y usar el tampón de elución (NH4Cl 20 mM, NaCl 400 mM, pH 9.0) para eluir y recoger el pico de elución. Los fluidos recogidos se analizan mediante SDS-PAGE y los resultados se muestran en la Figura 2, en la que 1: patrones del peso molecular (de arriba a abajo son: 116,0, 66,2, 45,0, 35,0, 25,0, 18,4, 14,4 kDa ); 2: productos de desorción; 3, 4: productos de precipitación fraccionada en sulfato de amonio; 5: muestras purificadas de cromatografía Super Q -650M; 6: el flujo de la columna de cromatografía Super Q -650M; 7: picos de elución de la cromatografía Super Q -650M; 8: muestras purificadas mediante cromatografía SP; 9: el flujo de la columna de cromatografía de SP; 10: picos de elución de la cromatografía de SP. Mediante los métodos de purificación mencionados anteriormente se obtiene la variante de la anexina V cuya pureza es superior al 97 % y se obtienen más de 110 mg de la variante de la anexina V por litro de fermentación. Mediante estos dos métodos de purificación altamente complementarios de la columna Super Q y la columna SP, se puede retirar la mayor parte de la proteína contaminante de la variante de la anexina V. Los resultados experimentales también muestran que después de las dos purificaciones, la pureza de la proteína es superior al 97 %.

h: marcaje fluorescente con FITC de la anexina V y la variante de la anexina V: Colocar la solución que contiene 3 mg de anexina V y la variante de la anexina V en un tubo de ultrafiltración cuyo pero molecular es de 10 KDa, usando una solución de bicarbonato sódico 0,1 M cuyo valor de pH es 9,0 para realizar ultrafiltración, centrifugación verter el sobrenadante, añadir la solución de bicarbonato sódico de nuevo, repetir tres veces y medir la concentración de proteína. La concentración final es de aproximadamente 5 mg/ml. Se extraen 200 µl la solución y se introducen en un vial Cryule™ antes de la reacción, en agitación. Disolver 2 mg de FITC en 1ml de bicarbonato sódico 0,1 M (pH 9,0), en agitación rápida a temperatura ambiente. Se extrae una cantidad apropiada de solución de FITC (la relación molar entre FITC y la proteína es de 60 a 100:1) y se deja caer lentamente en la solución de proteína y controlando que el volumen final de reacción no excede los 250 µl. La mezcla se agita durante dos horas a temperatura ambiente en oscuridad. Se usan tubos de ultrafiltración para ultrafiltrar el líquido de reacción usando PBS (pH 7,2) hasta que no se pueden encontrar moléculas de FITC de color verde claro en el filtrado y los productos deben ser una solución transparente de color amarillo-naranja. El conjugado resultante se tapa con papel de aluminio y se introduce en el refrigerador a 20 ºC.

i: comparación de la actividad biológica para detectar la apoptosis celular de la variante recombinante de anexina V y la anexina V recombinante:

Se trataron las células A549 de carcinoma de pulmón humano (1,5 X 105) mediante 100 ng/ml de concentración final de TRAIL humano recombinante durante 6 horas, se digirieron con la enzima tripsina y se centrifugaron durante 5 minutos para recoger las células a 4 ºC y 800 rpm. Se añaden 400 µl de anexina V recombinante o variante de la anexina V marcadas con FITC que contenía 0,36 mM, 0,12 nM, 0,036 nM a cada muestra, respectivamente, para detectar apoptosis celular mediante citometría de flujo. Los experimentos de cada concentración de anexina V recombinante o variante de la anexina V se repiten tres veces, con las células de la muestra sin marcador como control. Los resultados de la comparación de la actividad biológica se muestran en la figura 3, en la que 3A: diferentes concentraciones (verde: 0,36 nM; rosa: 0,12 nM; azul: 0,036 M) de la variante recombinante de anexina V para detectar apoptosis celular; 3B: concentración diferente (verde: 0,36 nM; rosa: 0,12 nM; azul: 0,036 nM) de la anexina V recombinante para detectar la apoptosis celular; 3C: comparación de la actividad biológica de diferentes concentraciones de la anexina V recombinante y la variante recombinante de anexina V para detectar apoptosis celular (verde: 0,36 nM; rosa: 0,12 nM, azul: 0,036 nM). Cuando el color es el mismo, la sonda representada por el pico alto es la variante de la anexina V-FITC.

j: marcaje con radionúclido de la anexina V y la variante de la anexina V:

disolver 3,5 mg de SnCl2 en 10 ml de PBS cuyo valor de pH es de 7,4 para obtener 0,35 µg/ml de solución de SnCl2. Tomar 100 µl (35 µg) de SnCl2 a temperatura ambiente y añadir 20 µl de 0,6 µg/µl de anexina V y

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