ES2635413T3 - Un proceso eficiente y escalable para la fabricación de fondaparinux sódico - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la preparación de un precursor de pentasacárido heparínico protegido para fondaparinux sódico que tiene la estructura **(Ver fórmula)** que comprende la etapa de acoplar un trímero EDC que tiene la estructura **(Ver fórmula)** con un dímero BA que tiene la estructura **(Ver fórmula)** en el que el trímero EDC se prepara usando una glucosilación de Schmidt que comprende las etapas: (a) acoplar un monómero E que tiene la estructura **(Ver fórmula)** con un elemento estructural de DC que tiene la estructura **(Ver fórmula)** para obtener un precursor de EDC que tiene la estructura **(Ver fórmula)** (b) convertir el precursor de EDC en el trímero EDC.
Description
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DESCRIPCION
Un proceso eficiente y escalable para la fabricacion de fondaparinux sodico Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un proceso para la sfntesis del factor Xa anticoagulante fondaparinux y compuestos relacionados. La invencion se refiere ademas a procesos eficientes y escalables para la sfntesis de diversos productos intermedios utiles en la sfntesis de fondaparinux y compuestos relacionados.
Antecedentes de la invencion
En la patente de EE.UU. N.° 7.468.358, fondaparinux sodico se describe como el "unico anticoagulante pensado para estar completamente libre de riesgo de induccion de HIT-2". En The biochemical and pharmacologic rationale for the development of a synthetic heparin pentasaccharide en Thromb. Res., 86(1), 1-36, 1997, Walenga et al. citaron el pentasacarido sintetico recientemente autorizado el inhibidor del factor Xa fondaparinux sodico. Fondaparinux tambien se ha descrito en Walenga et al., Expert Opin. Investig. Drugs, Vol. 11, 397-407, 2002 y Bauer, Best Practice & Research Clinical Hematology, Vol. 17, N.° 1, 89-104, 2004.
Fondaparinux sodico es una molecula de pentasacarido octasulfatado lineal (oligosacarido con cinco unidades de monosacarido) que tiene cinco esteres de sulfato en el oxfgeno (restos O-sulfatados) y tres sulfatos en un nitrogeno (restos N-sulfatados). Ademas, fondaparinux contiene cinco grupos hidroxilo en la molecula que no estan sulfatados y dos carboxilatos de sodio. De los cinco sacaridos, hay tres derivados de glucosamina y un acido glucuronico y uno L-iduronico. Los cinco sacaridos estan conectados entre sf en enlaces glucosilados en a y p alternos, como se muestra a continuacion.
Fondaparinux sodico
NaOOC
Enlace p
Enlace p
Enlace a
Enlace a
Monosacarido D
Monosacarido D
Monosacarido A
Monosacarido E
Monosacarido B
derivado
derivado
denvado
derivado
derivado
del monomero D
del monomero D
del monomero A2
del monomero E
del monomero B1
Fondaparinux sodico es un derivado de metilglucosido qufmicamente sintetizado de la secuencia de pentasacarido natural, que es el sitio activo de heparina que media en la interaccion con antitrombina (Casu et al., J. Biochem., 197, 59, 1981). Tiene un patron exigente de O- y N-sulfatos, estereoqufmica glucosfdica especffica y unidades de repeticion de glucosaminas y acidos uronicos (Petitou et al., Progress in the Chemistry of Organic Natural Product, 60, 144-209, 1992).
Las unidades de monosacarido que comprenden la molecula de fondaparinux se marcan segun la estructura mostrada anteriormente, con la unidad de glucosamina a la derecha denominada monosacarido A y la siguiente, una unidad de acido uronico a su izquierda, B y unidades posteriores, C, D y E, respectivamente. La sfntesis qufmica de fondaparinux empieza con monosacaridos de estructuras definidas que ellas mismos se denominan elemento estructural A, elemento estructural B, elemento estructural de DC y monomero E, para la diferenciacion y comodidad, y llegar a ser los monosacaridos correspondientes en fondaparinux sodico.
Debido a esta mezcla compleja de grupos hidroxilo libres y sulfatados, y la presencia de restos N-sulfatados, el diseno de una via de sfntesis para fondaparinux requiere una cuidadosa estrategia de proteccion y desproteccion de grupos funcionales reactivos durante la sfntesis de la molecula. Sfntesis previamente descritas de fondaparinux adoptaron todas una estrategia similar para completar la sfntesis de esta molecula. Puede concebirse que esta estrategia tenga cuatro etapas. La estrategia en la primera etapa requiere la desproteccion selectiva de cinco de los diez grupos hidroxilo. Durante la segunda etapa, estos cincos hidroxilos se sulfonan selectivamente. La tercera etapa del proceso implica la desproteccion de los cinco grupos hidroxilo restantes. La cuarta etapa del proceso es la
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sulfonacion selectiva de los 3 grupos amino, en presencia de cinco grupos hidroxilo que no estan sulfatados, en la molecula final. Esta estrategia puede ser concebida a partir del siguiente pentasacarido completamente protegido, tambien denominado el producto intermedio de etapa tardfa.
En esta estrategia, todos los grupos hidroxilo que van a ser sulfatados se protegen con un grupo protector de acilo, por ejemplo, como acetatos (R = CH3) o benzoatos (R = arilo) (etapas 1 y 2). Todos los grupos hidroxilo que van a quedar como tales se protegen con grupo bencilo como bencil eteres (etapa 3). El grupo amino, que posteriormente se sulfona, se enmascara como un resto de azida (N3) (etapa 4). R1 y R2 normalmente son sodio en el compuesto farmaceutico activo (por ejemplo, fondaparinux sodico).
Esta estrategia permite preparar el producto final siguiendo las operaciones sinteticas que se explican resumidamente a continuacion:
a) Tratamiento del producto intermedio de etapa tardfa con base para hidrolizar (desproteger) los grupos ester de acilo para revelar los cinco grupos hidroxilo. Los dos grupos ester R1 y R2 se hidrolizan en esta etapa tambien.
b) Sulfonacion de los grupos hidroxilo recientemente revelados.
c) Hidrogenacion del pentasacarido O-sulfatado para desbencilar los cinco hidroxilos protegidos con bencilo, y al mismo tiempo, desenmascarar las tres azidas para los grupos amino correspondientes.
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d) En la ultima etapa de la operacion, los grupos amino se sulfatan selectivamente a un pH alto, en presencia de los cinco hidroxilos libres para dar fondaparinux.
Se han desarrollado varios enfoques sinteticos con el fin de preparar pentasacaridos completamente protegidos (EDCBA) que puedan usarse en la sfntesis de fondaparinux sodico (vease, por ejemplo, el documento WO2011/014793 A1).
La sfntesis del fragmento EDCBA, sin embargo, se complica por la presencia de diferentes grupos funcionales en posiciones variables en el pentasacarido que requieren una estrategia de proteccion - desproteccion elaborada. Vease, por ejemplo, L. Poletti et al., Eur. J. Org. Chem., 2999-3024, 2003; W. Hague et al., Capftulo 17, "Modern Method in Carbohydrate Synthesis", Eds. Shaheer Khan and R. A. O'Neill; Harwood Academic Publisher GmbH, 403436, 1996; M. Petitou et al., Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Vol. 60, 143-209, 1992, Springer-Verlag, New York, 1992).
Los actuales metodos para la sfntesis de pentasacaridos completamente protegidos (EDCBA) normalmente requieren aproximadamente 60 etapas y producen, por tanto, bajo rendimiento de producto. Asf, el aumento de escala del proceso es un problema importante, ya que esto afecta directamente el coste y tiempo requerido para completar la fabricacion de fondaparinux sodico.
Por tanto, como se apreciara, hay una necesidad en la materia de nuevos procedimientos de sfntesis que produzcan fondaparinux sodico y productos intermedios utiles en la sfntesis de los mismos. Los procesos de la presente invencion proporcionan una sfntesis unica, fiable y escalable de compuestos tales como fondaparinux sodico.
Sumario de la invencion
La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier divulgacion que vaya mas alla del alcance de dichas reivindicaciones esta solo prevista para fines ilustrativos.
Los solicitantes han desarrollado estrategias sinteticas novedosas para la sfntesis de fondaparinux sodico y productos intermedios utiles en la preparacion de fondaparinux sodico. Los procesos descritos en el presente documento permiten el eficiente aumento de escala, requieren menos etapas sinteticas y siguen adelante con rendimientos mas altos de producto. Los procesos descritos en el presente documento tambien proporcionan un mejor perfil de pureza debido a la contaminacion reducida de p-metilglucosido en el producto final.
Una realizacion de la presente invencion es un proceso para la preparacion de un precursor de pentasacarido heparfnico protegido para fondaparinux sodico que tiene la estructura
que comprende la etapa de acoplar un trfmero EDC que tiene la estructura
con un dfmero BA que tiene la estructura
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En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un proceso que comprende ademas convertir el precursor de pentasacarido hepannico protegido en fondaparinux sodico.
Otra realizacion de la presente invencion es un proceso de preparacion del tnmero EDC que tiene la formula
en la que el tnmero EDC se prepara usando un proceso (glucosilacion de Schmidt) que comprende las etapas:
(a) Acoplar un monomero E que tiene la estructura
con un elemento estructural de DC
para obtener un precursor de EDC
que tiene la estructura
que tiene la estructura
DC.BB
y
(b) convertir el precursor de EDC en el tnmero EDC.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un proceso que comprende ademas convertir el tnmero EDC en fondaparinux sodico.
Aun otra realizacion de la presente invencion es un proceso de preparacion del elemento estructural de DC que tiene la formula
donde el elemento estructural de DC se prepara a partir de 1,6-anhidrocelobiosa que tiene la estructura
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que comprende al menos cuatro de las siguientes etapas:
(a) proteger la 1,6-anhidrocelobiosa para formar CB1 que tiene la estructura
-o
(b) tosilar CB1 para formar CB2 que tiene la estructura
(c) hacer reaccionar CB2 con base para formar CB3 que tiene la estructura
(d) proteger CB3 para formar CB4 que tiene la estructura
(e) hacer reaccionar CB4 con azida para formar CB5 que tiene la estructura
-O
(f) acetilar CB5 para formar CB6 que tiene la estructura
(g) desproteger CB6 para formar CB7 que tiene la estructura
(h) oxidar CB7 para formar CB8 que tiene la estructura
(i) bencilar CB8 para formar el dfmero DC.
y
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En ciertas realizaciones, el proceso incluye al menos seis etapas de las etapas (a)-(i).
En realizaciones adicionales, el proceso incluye todas las etapas (a)-(i).
Otra realizacion de la presente invencion es un proceso en el que el dfmero BA se prepara usando una glucosilacion de Schmidt que comprende la etapa de acoplar un monomero B que tiene la estructura
I \ OCNHCCh MeOOC oBz
donde Lev es levulinilo, Bn es bencilo, Bz es benzoflo y TCA es tricloroacetimidato, a un monomero A que tiene la estructura
para formar el dfmero BA.
Otra realizacion de la presente invencion es un proceso de preparacion de AMod5 [tambien denominado en el presente documento el elemento estructural A] que tiene la formula:
en el que el monomero A se prepara a partir de un compuesto de formula IntAI
comprendiendo el proceso una o mas de las siguientes etapas:
(a) ciclar (1,6-yodociclado oxidativo) un compuesto de formula IntAI para formar un compuesto de formula IntA2:
l lntA2;
(b) epoxidar un compuesto de formula IntA2 para formar un epoxido de Cerny en un compuesto de formula IntA2a:
TntA2a;
(c) convertir (p-metoxibencilar) un compuesto de formula IntA2a en un compuesto de formula IntA3:
I---------°
PMBO------O
(d) convertir (apertura de anillo asistida por azida del epoxido compuesto de formula IntA4
TntA3;
de Cerny) un compuesto de formula IntA3 en un
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(e) convertir (bencilar) denominado IntA5]
un compuesto de formula IntA4 en un
IntA4;
compuesto de monomero de formula A2 [tambien
(f) convertir (por ejemplo, desproteger PMB, apertura del anillo de anhidro y acetilar) un compuesto de monomero de formula A2 [tambien denominado IntA5] en un compuesto de formula AModl:
n3 AModl;
(g) convertir (a-metilglucosilar) un compuesto de formula AModl en un compuesto de formula AMod3:
(h) convertir (desacetilar) un compuesto de formula AMod3 en un compuesto de formula AMod4:
(i) convertir (benzoilar) un compuesto de formula AMod4 en AMod5 [tambien denominado elemento estructural A]
y
(j) recristalizar AMod5.
Una realizacion de la presente invencion es un proceso en el que el AMod5 [tambien denominado elemento estructural A] que se forma esta sustancialmente libre de p-metilglucosido.
Realizaciones adicionales de la presente invencion incluyen un proceso donde el pentasacarido heparfnico protegido que se forma contiene menos de aproximadamente el 1 %, menos de aproximadamente el 0,5 %, menos de aproximadamente el 0,11 %, menos de aproximadamente el 0,05 % o menos de aproximadamente el 0,01 % de p- metilglucosido.
Otra realizacion de la presente invencion es un proceso de preparacion de un monosacarido de formula AMod3
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que comprende desproteger PMB, apertura del anillo de anhidro, acetilar y a-metilglucosilar un compuesto de monomero de formula A2 (tambien denominado IntA5)
Otra realizacion de la presente invencion es un proceso de purificacion de un monosacarido de formula Amod5:
que comprende recristalizar el monosacarido en un disolvente organico.
Breve descripcion de los dibujos
Las Figuras 1A y 1B son cromatogramas de cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) de fondaparinux sodico. Descripcion detallada de la invencion
Los solicitantes han desarrollado novedosas estrategias sinteticas para la sfntesis de fondaparinux sodico y productos intermedios utiles en la preparacion de fondaparinux sodico. Los procesos descritos en el presente documento permiten el eficiente aumento de escala, requieren menos etapas sinteticas y siguen adelante con rendimientos mas altos de producto que los procesos actuales. Los procesos descritos en el presente documento tambien proporcionan un perfil de pureza mas alto debido a contaminacion de p-metilglucosido reducida en el producto final.
Asf, en un aspecto, la presente invencion se refiere a un proceso para la preparacion de fondaparinux sodico en una manera novedosa y eficiente para proporcionar el compuesto deseado con buen rendimiento y de un modo que sea escalable y reproducible en una escala industrial. El proceso de la presente invencion comprende una estrategia unica que ha sido desarrollada para obtener un proceso sintetico que es tan convergente como sea posible.
La via 1, via 2 y via 3 mostradas a continuacion representan estrategias informadas en la bibliograffa para la sfntesis del pentasacarido EDCBA. A diferencia, un ejemplo de un proceso novedoso para la produccion de fondaparinux sodico segun la presente invencion tambien se muestra a continuacion.
Prcscntc invention
E+D-C B + A
I I
E-D-C +B-A
I
E-D-C-B-A
Los procesos de la presente invencion, como se explican resumidamente en el esquema anterior, proporcionan el producto de pentasacarido (EDCBA) deseado en menos etapas sinteticas. Las menos etapas sinteticas aumentan la 5 viabilidad economica del proceso. Esto es particularmente importante para producir decenas de kilogramos de fondaparinux por ano. Para una revision del aumento de escala del proceso, vease, por ejemplo, van Boeckel et al., Angew. Chem. Intl. Ed., 32 1671-1818, 1993.
Un aspecto de un proceso de la presente invencion, Proceso 1, se resume en el esquema a continuacion:
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Proceso 1
donde Ac es acetilo, Bn es bencilo, Lev es levulinilo y TCA es tricloroacetimidato. 15
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Sintesis:
Siguiendo la estrategia resumidamente explicada para el Proceso I en el esquema anterior, los siguientes elementos estructurales han sido preparados para su uso en la preparacion de fondaparinux sodico.
Sintesis del monosacarido E
donde Ac es acetilo, Bn es bencilo y TCA es tricloroacetimidato.
En una realizacion, el monomero E puede prepararse por el proceso mostrado a continuacion. Este metodo se ha usado en los procesos de la presente invencion a una escala de varios kilogramos y ha conducido a una selectividad de a-glucosilacion >95 %. Vease, por ejemplo, Zhe et al., Angew. Chem. Int. Ed., 48, 1900-1934, 2009. El monomero E se prepara en 8 etapas a partir del triacetato de glucal comercialmente disponible. La introduccion de la azida se logra mediante un producto intermedio de epoxido de Cerny (M. Cerny et. al, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 1977, 34, 23-127), como se explica resumidamente en el siguiente esquema.
Sintesis de monomero E
equiv.), 5 °C a TA, 2 h; 4. NaH (2 equiv.), DMF, BnBr (2,5 equiv), -20 °C a TA, 3 h; 5. NaN3, DMF, 120 °C, 12 h; 6. NaH, DMF, BnBr (2,5 equiv), 0 °C a TA, 3 h.
Sintesis del elemento estructural de DC
La celobiosa es un disacarido natural que tiene un enlace p-glucosidico entre azucares. Ambos disacaridos, DC y BA, en fondaparinux sodico estan conectados mediante enlaces p-glucosfdicos. Ademas, el uso de celobiosa como elemento estructural ofrece una sintesis mas convergente y asf un numero apreciablemente reducido de etapas en la sintesis de fondaparinux sodico.
Se ha informado de celobiosa para la sintesis de elementos estructurales de los disacaridos DC y BA. Veanse, por ejemplo, H. Kuzuhara et al., Carbohydr. Res., 1988, 172, 73-64, 1988; H. Kuzuhara et al., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 611-614, 1986; H. Kuzuhara, Carbhydr. Res., 1985, 141, 273-282, 1985 y M. Petitou et al., Biorg. Med. Chem. Lett., 1991, 1 (2), 95-98. Sin embargo, su uso para la preparacion del disacarido BA no fue particularmente satisfactorio, ya que el rendimiento para la inversion del centro C-5 para convertir glucosa en idosa fue decepcionantemente bajo (18 %). Por tanto, este enfoque no fue practico. Como se representa en el esquema a continuacion, el rendimiento global del disacarido DC en la sintesis de Kuzuhara tambien fue bajo (solo 3,5 % en las 12 etapas). La modificacion de Petitou (uso de una tosilacion selectiva de 2-OH en el resto de C) produce un ligero aumento en el rendimiento (11,58 % en 12 etapas). Sin embargo, el rendimiento es todavfa muy bajo.
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Los solicitantes han descubierto sorprendentemente que las modificaciones qufmicas novedosas permiten la sfntesis del elemento estructural de DC [disacarido DC] en rendimientos mas altos, que implica menos etapas sinteticas (por ejemplo, 27,5 % de rendimiento en 9 etapas). Este enfoque se explica resumidamente en el esquema a continuacion.
Elemento estructural de celobiosa - Sfntesis de dfmero de DC
Asf, otra realizacion de la presente invencion es un proceso de preparacion del elemento estructural de DC que tiene la formula
donde el elemento estructural de DC se prepara a partir de 1,6-anhidrocelobiosa que tiene la estructura
que comprende al menos cuatro de las siguientes etapas:
(a) proteger la 1,6-anhidrocelobiosa para formar CB1 que tiene la estructura
(b) tosilar CB1 para formar CB2 que tiene la estructura
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(c) hacer reaccionar CB2 con base para formar CB3 que tiene la estructura
(d) proteger CB3 para formar CB4 que tiene la estructura
(e) hacer reaccionar CB4 con azida para formar CB5 que tiene la estructura
(f) acetilar CB5 para formar CB6 que tiene la estructura
(g) deproteger CB6 para formar CB7 que tiene la estructura
(h) oxidar CB7 para formar CB8 que tiene la estructura
y
(i) bencilar CB8 para formar el dfmero DC.
En ciertas realizaciones, el proceso incluye al menos seis etapas de las etapas (a)-(i). En realizaciones adicionales, el proceso incluye todas las etapas (a)-(i).
El proceso de la presente invencion para la sfntesis del dfmero DC emplea un procedimiento de oxidacion mas suave usando una oxidacion con TEMPO/NaOCl que elimina la necesidad de las tres etapas del proceso de Choay: tritilacion, levulinacion y deslevulinacion. Este proceso mejorado de la presente invencion tambien proporciona rendimientos mejorados del dfmero DC (hasta el 27,5 %).
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Sintesis del elemento estructural de trisacarido EDC
La sintesis del fragmento de EDC [EDC-3-CB] se logra en 8 etapas y en ~40 % de rendimiento global. Vease la solicitud provisional de EE.UU. N.° de serie 61/230.557 presentada el 31 de julio de 2009 y la solicitud de patente de EE.UU. N.° 12/847.719 presentada el 30 de julio de 2010, que se incorporan por este documento por referencia en sus totalidades. La estereoquimica del a-acoplamiento deseada del enlace de glucosilo entre el monomero E y el elemento estructural de disacarido DC se obtiene mediante quimica de acetimidato de Schmidt, que proporciona el trisacarido. No podria detectarse p-isomero por RMN 1H en el producto aislado. El trisacarido anhidro puede convertirse en el aceptor de tricloroacetimidato correspondiente usando los metodos descritos en el presente documento o mediante tecnicas convencionales conocidas en la tecnica (J. Choay et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1, 95-98, 1991).
Asi otra realizacion de la presente invencion es un proceso de preparacion del trimero EDC que tiene la formula
en la que el trimero EDC se prepara por un proceso (por ejemplo, una glucosilacion de Schmidt) que comprende las etapas:
(a) acoplar un monomero E que tiene la estructura
con un elemento estructural de DC que tiene la estructura
para obtener un precursor de EDC que tiene la estructura
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(b) convertir el precursor de EDC en el trfmero EDC.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un proceso que comprende ademas convertir el trfmero EDC en fondaparinux sodico.
Sfntesis del elemento estructural de disacarido BA
(j) Sfntesis del elemento estructural A (AMod5)
Una estrategia general eficiente para la sfntesis del pentasacarido EDCBA usando el proceso de conexion E + DC + BA requiere un proceso eficiente para la sfntesis de tanto los elementos estructurales de monosacarido B como A. Varias publicaciones cientfficas describen metodos para la sfntesis del derivado de a-metilglucosamina glucosido el monosacarido A. Veanse, por ejemplo, S. Y. Luo et al. Tetrahedron Lett., 43, 4889-4892, 2002; M. Petitou et al. Carbohydr. Res., 281, 253-276, 1996; T. Suami et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 55, 1574-1578, 1982; y M. J. Hadd et al., Carbohydr. Res., 1999, 320, 61-69, 1999.
Elemento estructural A - Sfntesis
Via de Alchemia Via de Organon Via de Sanofi Presente invencion
HO \ AcO—\
HO
H(X
BnO
AcO
\ O
O—'
BnO
AcOH2C
AcO—y^L^O
AcO
BzO
- AcHN
- OH BnO
- ^1' AcO—\ »
Br
HO
BnO
X
BnO
N3 OMe problemas de seguridad; no escalable
AcO
X.
BnO
OR
no a-selectivo, dio mezclas
AcO
V1
mediante nitro
BzO
HO
BnO
X.
HO
BnO
X.
N
'3 OMe
OMe
bajos
rendimientos,
escalabilidad
19,6 % en 10etapas
24,4 % en 13 etapas
At'2008200616 07 Feb 2008; P. B. Alper et. al. Tet. Lett. 1996, .17 (24). 6029-6022
N.M. Spijker. et. al Tetrahedron., 1992, 48(20), 6297-6216
C. labour cL al, Carbohyd. Res., 1996. 281, 253-276; R. V. Lcmieux. et. al Can. J. Chem., 1979, 57, 1244-1251
M. J. Hadd et. al. Carbohyd. Res., 1999. 220. 61-69: S. Arndt, et. al Org. Lett.., 2003. 5 (22), 4179-4182
Sin embargo, un grave inconveniente en todos los enfoques sinteticos conocidos para fondaparinux es la contaminacion por algun porcentaje del isomero de p-metilglucosido no deseado [Compuesto P1].
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Compuesto P1
Las Figuras 1A y 1B representan el cromatograma de HPLC para fondaparinux sodico, y muestran la proximidad del pico para el p-anomero (Compuesto P1) al producto a-anomerico deseado (Fondaparinux sodico).
La contaminacion por incluso una pequena cantidad de Compuesto P1 [p-anomero] es problematica para la sfntesis global de fondaparinux, ya que se requiere la separacion de este contaminante no deseado del a-anomero deseado. Esfuerzos para efectuar la separacion del p-anomero no deseado producen una perdida de producto sustancial, como se demuestra por los bajos rendimientos. Los solicitantes han desarrollado dos enfoques que vencen este problema.
En el primer enfoque, la presente invencion emplea metil-a-D-glucopiranosido altamente purificado (Aldrich, min. 99 % de pureza) como material de partida para la sfntesis del monomero A. Este proceso elimina la posibilidad de la presencia de cualquier p-anomero en el producto final. Asf, el metil-a-D-glucopiranosido se convierte en el elemento estructural deseado segun el esquema representado a continuacion. Durante las manipulaciones sinteticas adicionales hacia la preparacion de fondaparinux a partir del elemento estructural A no hay operaciones sinteticas que puedan epimerizar el centro anomerico en este monomero. Esta estrategia proporciona a-metil-2-azido-3-bencil- 6-benzoil-D-glucosido libre a partir de su p-anomero.
PhClI(OMe)2
O*.
L-Cl 1
ACN.CSA.
/'V
TA. durante
Reflujo , 5h
cQ.. la noche
Kfl
787r
95%
TosO
OMe
Metil-a-D-
(-BuOK, t-BuOH,
glucopiranosido
SS\
Dioxano . 40 c, 4h
NaN3, 5 equiv
DM17H20 (15/n
reflujo, durante
la roche
(lXV,
OMe
NaH. BnBr.
75%
DMP
O BzCl,
O TFA ac. al
80 %
HO
75%
90% BnO
OMe
Elemento estructural A
En un segundo enfoque, la presente invencion se refiere a un proceso de preparacion del elemento estructural A que implica las etapas mostradas en el siguiente esquema. El elemento estructural A [tambien denominado AMod5] puede prepararse a partir de triacetil-D-glucal [tambien denominado SM-A]. El triacetil-D-glucal se hidroliza para formar D-glucal [tambien denominado IntA1 ]. La 1,6-yodociclacion oxidativa de IntA1 da IntA2. Epoxidacion del compuesto IntA2 para formar el compuesto [el epoxido de Cerny] IntA2a [no aislado] que esta p-metoxibencilado para formar el compuesto IntA3. La apertura de anillo asistida por azida del epoxido de Cerny IntA3 proporciona el derivado de azida IntA4. El bencilar el resto de hidroxilo C-3 en IntA4 da el monomero A2 [tambien denominado IntA5]. El monomero A2 se a-metilglucosila para formar el compuesto AMod3, que tras la desacetilacion da el
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compuesto AMod4. El resto de hidroxilo C-5 en AMod4 se benzofla selectivamente para dar el compuesto AMod5 [Elemento estructural A] que se recristaliza para dar exclusivamente el a-anomero de AMod5. Esto se muestra en el esquema a continuacion.
AcOH2C
hoh2c
PMBO
PMBO-
ESQUEMA 1 - Sintesis del monomero A-2 y Amod5 [Elemento estructural Al
too1;-;
80%
IntAI
SM-A
lntA2
CfiHglO^
272.04
psm mol
272 25
Peso mol.: 146.14
mol
PMBO
78%
76%
ntA3
nlA4
n A2a
CmHisOs
CgHb04
Peso mol 284.27
3eso mol
307.30
_ Peso mol.: 144 13
90%
83%
75°'<
Monomero A2 lntA5 N3
A Mod 1
A Mod 3
U21H23N3U5
C19H23N3O8
C18H23N3O7
Peso mol.: 397 42
Peso mol.: 421,40
Peso mol.: 393 39
88%
84%
A Mod 4
A Mod 5
C-uHigNoOt
C2i HoiNoOk
Peso mol.: 309.32
413,42
Reactivos: 1. NaOMe, MeOH, TA, 2 h, resina 50wx; 2. (Bu3Sn)2O (0,8 equiv.), ACN, MS, reflujo, 3 h; 3. I2 (1,5 equiv.), 5 °C a TA, 2 h; 4. NaH (2 equiv.), DMF, p-MeOCaH4CH2Br (PMB-Br, 2,5 equiv), -20 °C a TA, 2 h; 5. NaN3, DMF, 120 °C, 12 h; 6. NaH, DMF, BnBr, 0 °C a TA, 3 h; 7. BF3-Et2O, Ac2O, DCM, -20 °C a TA. 8. (a) TMS-I, TBAI, TA, 2 h; (b) DIPEA, MeOH, 16 h, TA; 9. NaOMe, forma H+ de la resina Dowex 50WX8-100, TA, 3 h; 10. Piridina, Bz- Cl, -40 °C a -10 °C, 2 h;
El proceso descrito anteriormente permite la sintesis completa del elemento estructural A en 10 etapas y aproximadamente con un rendimiento global del 20 % (M. J. Hadd et. al, Carbohyd. Res., 1999, 320, 61-69; S. Arndt, et. al Org. Lett., 2003, 5 (22), 4179-4182). Este proceso tiene el numero mas bajo de etapas y a nuestro leal saber es el metodo mas eficiente y seguro de produccion de cantidades de varios kilogramos de derivados de 2-azido-1- alfa-metilglucopiranosido que evita la azidonitracion de Lemieux de glucales que ofrecen una mala selectividad a/p (veanse, por ejemplo, R. U. Lemieux, et al., Can. J. Chem., 1979, 57, 1244-1251; C. Tabeur et al., Carbohyd. Res., 1996, 281, 253-276, patente de EE.UU. N.° 4.818.816; N.M. Spijker, et al., Tetrahedron, 1992, 48(30), 6297-6316) y la peligrosa transferencia de diazo catalizada por metal para la incorporacion de azida en la posicion 2 que posee una grave seguridad se refiere a la fabricacion a escala de varios kilogramos (veanse, por ejemplo, P. B. Alper et. al. Tet. Lett. 1996, 37 (34), 6029-6032; patente australiana N.° AU 2008 200616).
El proceso desvelado en el presente documento produce el elemento estructural A de la pureza mas alta (>99 %) que se ha informado hasta la fecha. En una realizacion, el proceso implica un procedimiento de cristalizacion que produce la pureza potenciada del a-anomero de AMod5 [Elemento estructural A]. En ciertas realizaciones, AMod5 [Elemento estructural A] recristaliza en un disolvente seleccionado de hidrocarburos C5 a C7. En una realizacion, el disolvente es heptano. La cristalizacion de AMod5 se lleva a cabo disolviendo AMod5 en un disolvente (tal como un disolvente de hidrocarburo C5-C7) a temperaturas entre aproximadamente 50 y aproximadamente 80 °C. En una
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realizacion, la cristalizacion de AMod5 se lleva a cabo disolviendo AMod5 en heptano a temperatures entre aproximadamente 50 y aproximadamente 60 °C. En ciertas realizaciones, la solucion de AMod5 se enfna entonces a temperature ambiente y se deja reposar (por ejemplo, durante aproximadamente 16 horas) a esta temperature.
En realizaciones adicionales, el elemento estructural A se prepara en mas de aproximadamente el 95 %, mas de aproximadamente el 96 %, mas de aproximadamente el 97,5 %, mas de aproximadamente el 98 %, mas de aproximadamente el 99 %, mas de aproximadamente el 99,5 %, o superior a aproximadamente el 99,9 % de la forma de a-anomero.
En realizaciones adicionales, el elemento estructural A preparado contiene menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 4 %, menos de aproximadamente el 2,5 %, menos de aproximadamente el 2 %, menos de aproximadamente el 1 %, menos de aproximadamente el 0,5 %, menos de aproximadamente el 0,1 % o menos de aproximadamente el 0,05 % de la forma de p-anomero.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo de purificacion de un monosacarido de formula
cristalizando el monosacarido en un disolvente organico seleccionado de hidrocarburos C5 a C7, tales como heptano.
En todavfa una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a un metodo de preparacion de un monosacarido AMod3
AcO—\
Ac°'/V^r\
N3 |
OMe AMod3
que comprende a-metilglucosilar el compuesto el monomero A2 [tambien denominado IntA5]
(ii) Sintesis del elemento estructural B
Otro problema exigente en la sintesis de fondaparinux sodico es una fuente accesible del azucar idosa. Este problema surge debido a que no se conoce fuente natural para este hidrato de carbono. Ademas, materiales de partida comercialmente disponibles son de costes prohibitivos para las aplicaciones industriales a gran escala.
En una realizacion de la presente invencion, el elemento estructural B [tambien denominado BMod6] puede prepararse segun como se muestra en el esquema a continuacion.
OTBDPS
MeOOC
LevO'
OTBDPS
LevO'
"OCNHCC!;
MeOOC
MeOOC
MeOOC
BMod5
lntB2
SM-B
ntB1
89°/
100°'
s-
Ci 2H20°6
Peso mol.: 310
Peso mol.: 260.28
350 41
ntB5
90"',
lnlB4
In t B3
s-
C17H2207
C34H3405S3
Cl5H18°5
Peso mol.: 338.35
Peso mol.: 618.83
Peso mol.: 278.30
50°/i
Monomero B-1
p ci 7HS2O7
HO
lntB6
OH
80%
Peso mol.: 338 35
C14H18O7
OH
COpMe /^
reso mol.: OQp gg
0?Me
00°/<
BMod3 MeOOC OH
80%
BMod2 MeOOC OH
90°/
C19H24O9
Peso mol.: 634 79
BModl C22H28O9
Peso mol.: 396.39
91°/<
Peso mol 436.45
73°;
91%
BMod4
c42h46°10Si
BMod6 C28H28Cl3N01o
Peso mol.: 500,49
738.89
Peso mol.: 644.88
Esquema 2 - Sintesis del Monomero B-1 v BMod6 TEIemento estructural B1
Reactivos: 1. NaH, BnBr, THF, DMF, 0 °C a 65 °C, 3 h; 2. 66 % de acido acetico / H2O, 40 °C, 16 h; 3. NaIO4, (Bu)4NBr, DCM, H2O, oscuridad, 3 h; 4. (PhS)3CH, n-BuLi, THF, -78 °C, 3 h; 5. CuCl2 / CuO, MeOH, H2O, 3 h; 6. 5 90 % de TFA/H2O, DCM, TA, 2 h; 7. DMF, CSA 2-metoxipropeno, 0 °C a TA, 16 h; MeOH, TEA. 8. Lev2O, DIPEA,
TA, 16 h; 9. 90 % de TFA, TA, 4 h; 10. Imidazol, TBDPSi-Cl, TA, 3 h; 11. Piridina, BzCl, TA, 3 h; 12. TBAF, TA, 3 h; 13. TCA, DBU, TA, 2 h;
Veanse tambien, por ejemplo, Bonnaffe et al., Tetrahedron Lett., 41, 307-311, 2000; Bonnaffe et al., Carbohydr. 10 Res., 2003, 338, 681-686, 2003; y Seeberger et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 7559-7561,2003.
El metodo de la presente invencion usa cloruro de t-butildifenilsililo [TBDPS] en lugar de cloruro de t-butildimetilsililo [TBDMS] debido a la facilidad de migracion del grupo protector de TBDMs a la posicion 2 durante la etapa de sililacion. El uso de TBDPS produce un aumento en el rendimiento de BMod6 [Elemento estructural B] de ~ 5 %. El 15 rendimiento global de BMod6 [Elemento estructural B] de diacetona glucosa [SM-B] es, por ejemplo, ~11 %.
(iii) Sintesis del fragmento de dimero BA
En otra realizacion de los procesos descritos en el presente documento, los monomeros A y B, preparados como se 20 ha descrito anteriormente, pueden unirse para formar el dimero BA, con p-estereoespecificidad completa en el enlace glucosfdico. Por ejemplo, el dimero BA puede prepararse con p-estereoespecificidad completa en el enlace glucosfdico con ~ 72 % de rendimiento en una escala de varios kilogramos. La eliminacion del grupo Lev (82 %) por metodos convencionales proporciona el dimero BA en una forma lista para el acoplamiento con el elemento estructural del trfmero EDC.
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Pentasacarido completamente protegido EDCBA
En otra realizacion de los procesos descritos en el presente documento, el acoplamiento del trfmero EDC con el donante de disacarido BA produce el pentasacarido unido en a deseado (EDCBA, tambien denominado pentasacarido completamente protegido (FPP)), como se muestra en el esquema a continuacion.
MeOOi
1CNHCCI3
MeOOi
EDC-3-CB
Dimero BA
71°/c
Pentamero EDCBA-CB
Asf, otra realizacion de la presente invencion es un proceso para la preparacion de un precursor de pentasacarido heparfnico completamente protegido para fondaparinux sodico que tiene la estructura
que comprende la etapa de acoplar un trimero EDC que tiene la estructura
con un dimero BA que tiene la estructura
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un proceso que comprende ademas convertir el precursor de pentasacarido heparfnico completamente protegido en fondaparinux sodico.
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Sumario sintetico
Empleando los procesos de la presente invencion, como se describe en el presente documento, el precursor de pentasacarido completamente protegido (EDCBA) puede prepararse en 44 etapas, que puede entonces convertirse en fondaparinux sodico en cuatro etapas (total de 48 etapas globales). Los procesos descritos en el presente documento permiten la sfntesis de fondaparinux sodico en menos etapas sinteticas que aquellas previamente descritas. Los procesos descritos en el presente documento tambien proporcionan un mejor perfil de pureza debido a contaminacion de p-metil glucosido reducida en el producto final.
Compuestos con cantidades reducidas de p-anomero
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un precursor de pentasacarido heparfnico completamente protegido para fondaparinux sodico que tiene la estructura
en el que la cantidad de p-metilglucosido correspondiente es inferior a aproximadamente el 0,5 %, tal como inferior a aproximadamente el 0,4 %, inferior a aproximadamente el 0,3 %, inferior a aproximadamente el 0,2 %, inferior a aproximadamente el 0,1 %, inferior a aproximadamente el 0,05 %, inferior a aproximadamente el 0,01 %, inferior a aproximadamente el 0,005 %, o inferior a aproximadamente el 0,001 %. En una realizacion, el precursor de pentasacarido heparfnico completamente protegido esta sustancialmente libre del p-metilglucosido correspondiente.
El termino "sustancialmente libre de", como se usa en el presente documento cuando se refiere a una impureza (tal como un p-metilglucosido), significa que un compuesto deseado contiene menos de aproximadamente el 0,1 %, tal como menos de aproximadamente el 0,05 %, menos de aproximadamente el 0,01 %, menos de aproximadamente el 0,005 %, menos de aproximadamente el 0,001 % o menos de aproximadamente el 0,0005 % en peso de la impureza.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere al elemento estructural A [tambien denominado AMod5, monosacarido A] que tiene la estructura
en el que la cantidad del anomero de p-metilo correspondiente es inferior a aproximadamente el 0,5 %, tal como inferior a aproximadamente el 0,4 %, inferior a aproximadamente el 0,3 %, inferior a aproximadamente el 0,2 %, inferior a aproximadamente el 0,1 %, inferior a aproximadamente el 0,05 %, inferior a aproximadamente el 0,01 %, inferior a aproximadamente el 0,005 %, o inferior a aproximadamente el 0,001 %. En una realizacion, el elemento estructural A [AMod5, monosacarido A] esta sustancialmente libre del anomero de p-metilo correspondiente.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a fondaparinux, o una sal del mismo (por ejemplo, fondaparinux sodico) y composiciones que contienen el mismo, en el que se reduce la cantidad de Compuesto P1 (beta-anomero de fondaparinux sodico).
En ciertas realizaciones, el Compuesto P1 esta presente en una cantidad inferior a aproximadamente el 0,5 %, tal como inferior a aproximadamente el 0,4 %, inferior a aproximadamente el 0,3 %, inferior a aproximadamente el 0,2 %, inferior a aproximadamente el 0,1 %, inferior a aproximadamente el 0,05 %, inferior a aproximadamente el 0,01 %, inferior a aproximadamente el 0,005 %, o inferior a aproximadamente el 0,001 % basado en el peso total de fondaparinux o composicion. En una realizacion, el fondaparinux sodico, o una composicion que contiene fondaparinux sodico, esta sustancialmente libre del Compuesto P1.
Puede administrarse cualquiera de las formas anteriormente mencionadas de fondaparinux (o una sal del mismo) o composiciones que contienen fondaparinux (o una sal del mismo) (por ejemplo, 2,5 mg, 5 mg, 7,5 mg, 10 mg, de solucion para inyeccion) para la profilaxis de trombosis venosa profunda (TVP) que puede conducir a embolia pulmonar (EP) en pacientes que se someten a (i) cirugfa de rotura de la cadera (incluyendo profilaxis prolongada),
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(ii) cirugfa de sustitucion de la cadera, (iii) cirugfa sustitucion de la rodilla y (iv) cirugfa abdominal (que esta en riesgo de complicaciones tromboembolicas). Las formas y composiciones descritas en el presente documento tambien pueden administrarse conjuntamente con warfarina sodica para el tratamiento de TVP y EP aguda.
Definiciones
Ejemplos de grupos alquilo que tienen uno a seis atomos de carbono son metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, y todas las formas isomericas y lineales y ramificadas de los mismos.
El termino "acilo", a menos que se defina de otro modo, se refiere al grupo qufmico -C(O)R. R puede ser, por ejemplo, arilo (por ejemplo, fenilo) o alquilo (por ejemplo, alquilo C1-C6).
El termino "arilo" se refiere a un grupo aromatico que tiene 6 a 14 atomos de carbono tal como, por ejemplo, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo y bifenilo. El termino "heteroarilo" se refiere a un grupo aromatico que tiene 5 a 14 atomos, donde al menos uno de los carbonos se ha sustituido con N, O o S. Ejemplos adecuados incluyen, por ejemplo, piridilo, quinolinilo, dihidroquinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, dihidroquinazolilo y tetrahidroquinazolilo.
Sera evidente para aquellos expertos en la materia que grupos funcionales sensibles pueden necesitar ser protegidos y desprotegidos durante la sfntesis de un compuesto de la invencion. Esto puede lograrse por metodos convencionales, por ejemplo, como se describe en "Protective Groups in Organic Synthesis" por Greene and Wuts, John Wiley & Sons Inc (1999), y referencias en su interior que pueden anadirse o quitarse usando los procedimientos expuesto en el presente documento. Ejemplos de grupos hidroxilo protegidos (es decir, grupos protectores de hidroxilo) incluyen silil eteres tales como aquellos obtenidos haciendo reaccionar un grupo hidroxilo con un reactivo tal como, pero no se limita a, t-butildimetil-clorosilano, trimetilclorosilano, triisopropilclorosilano, trietilclorosilano; metil y etil eteres sustituidos tales como, pero no se limitan a, metoxi metil eter, metiltiometil eter, benciloximetil eter, t-butoximetil eter, 2-metoxietoximetil eter, tetrahidropiranil eteres, 1 -etoxietil eter, alil eter, bencil eter; esteres tales como, pero no se limitan a, benzoilformiato, formiato, acetato, tricloroacetato y trifluoroacetato. Ejemplos de grupos amina protegidos (es decir, grupos protectores de amino) incluyen, pero no se limitan a, amidas tales como formamida, acetamida, trifluoroacetamida y benzamida; imidas, tales como ftalimida y ditiosuccinimida; y otros. Ejemplos de grupos sulfhidrilo protegidos incluyen, pero no se limitan a, tioeteres tales como S-bencil tioeter y S-4-picolil tioeter; derivados de S-metilo sustituidos tales como hemitio, ditio y aminotio acetales; y similares.
Un grupo protector que puede eliminarse mediante hidrogenacion es, a modo de ejemplo, bencilo o un grupo bencilo sustituido, por ejemplo bencil eteres, bencilidenacetales. Aunque el grupo bencilo es el mismo un grupo protector comunmente usado que puede eliminarse mediante hidrogenacion, un ejemplo de un grupo protector de bencilo sustituido es p-metoxibencilo.
En toda la descripcion y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender" y otras formas de la palabra, tales como "que comprende" y "comprende", significa que incluye, pero no se limita a, y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, numeros enteros o etapas.
Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes en plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Asf, por ejemplo, referencia a "un componente" incluye mezclas de dos o mas componentes.
Los intervalos pueden expresarse en el presente documento como de "aproximadamente" un valor particular, y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa un intervalo tal, otro aspecto incluye de un valor particular y/o al otro valor particular. Similarmente, cuando los valores se expresan como aproximaciones, por el uso del antecedente "aproximadamente", se entendera que el valor particular forma otro aspecto. Se entendera ademas que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relacion con el otro punto final, e independientemente del otro punto final. Tambien se entiende que hay varios valores desvelados en el presente documento, y que cada valor tambien se desvela en el presente documento como "aproximadamente" ese valor particular, ademas del propio valor. Por ejemplo, si se desvela el valor "10", entonces tambien se desvela "aproximadamente 10". Tambien se entiende que tambien se desvela cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se desvelan 10 y 15, entonces tambien se desvelan 11, 12, 13 y 14.
En toda esta memoria descriptiva, se referencian diversas publicaciones. Las divulgaciones de estas publicaciones en sus totalidades se incorporan por este documento por referencia en la presente solicitud con el fin de describir mas completamente el estado de la tecnica al que se refiere la materia desvelada. Las referencias desveladas tambien se incorporan individualmente y especfficamente por referencia en el presente documento para el material contenido en ellas que se trata en la frase en la que se basa la referencia.
Los siguientes ejemplos son simplemente ilustrativos de la presente invencion y no deben interpretarse de ningun modo como limitante del alcance de la invencion, ya que muchas variaciones y equivalentes que estan englobados por la presente invencion seran evidentes para aquellos expertos en la materia tras la lectura de la presente divulgacion.
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Ejemplos
Se usan las siguientes abreviaturas: Ac es acetilo; ACN es acetonitrilo; MS es tamices moleculares; DMF es dimetilformamida; PMB es p-metoxibencilo; Bn es bencilo; DCM es diclorometano; THF es tetrahidrofurano; TFA es acido trifluoroacetico; CSA es acido canforsulfonico; TEA es trietilamina; MeOH es metanol; DMAP es dimetilaminopiridina; TA es temperatura ambiente; CAN es nitrato de amonio cerico; Ac2O es anhfdrido acetico; HBr es bromuro de hidrogeno; TEMPO es N-oxido de tetrametilpiperidina; TBAC1 es cloruro de tetrabutilamonio; EtOAc es acetato de etilo; HOBT es hidroxibenzotriazol; DCC es diciclohexilcarbodiimida; Lev es levunlinilo; TBDPS es terc- butildifenilsililo; TBDMS es terc-butildimetilsililo; TCA es tricloroacetonitrilo; O-TCA es O-tricloroacetimidato; Lev2O es anhfdrido levulfnico; DIPEA es diisopropiletilamina; Bz es benzoflo; TBAF es fluoruro de tetrabutilamonio; DBU es diazabicicloundecano; BF3^Et2O es trifluoruro de boro-eterato; TMSI es yoduro de trimetilsililo; TBAI es yoduro de tetrabutilamonio; TES-Tf es trifluorometanosulfonato de trietilsililo (triflato de trietilsililo); DHP es dihidropirano; PTS es acido p-toluenosulfonico.
La preparacion de ciertos monomeros usados en los procesos descritos en el presente documento es tanto conocida en la tecnica como puede prepararse usando los metodos descritos en el presente documento.
PM BO
Monomero A-2
_ I-l._
C21H23N3O5 N3 Peso mol.: 397 42
lntA5
Monomero A-2
La sfntesis del monomero A-2 (Numero de registro CAS 134221-42-4) se ha descrito en las siguientes referencias: Arndt et al., Organic Letters, 5(22), 4179-4182, 2003; Sakairi et al., Bulletin of the Chemical Society of Japan, 67(6), 1756-8, 1994; y Sakairi et al., Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, (5), 289-90, 1991, y las referencias citadas en su interior, que se incorporan por este documento por referencia en sus totalidades.
El monomero A2 tambien puede obtenerse en 6 etapas sinteticas a partir de tri-O-acetil D-glucal. El triacetato, SM-A, se desacetilo con metoxido de sodio en metanol dando el producto intermedio, IntA1. El grupo hidroxilo primario se convirtio en el derivado anhidro con oxido de tributilestano y entonces se yodo en un procedimiento de un recipiente de dos etapas dando el derivado de yodo IntA2. El derivado de yodo se convirtio en el derivado de bisanhidro [tambien conocido como epoxido] y el C4-hidroxilo se protegio como su eter de PMB IntA3 mediante tratamiento con hidruro de sodio y bromuro de p-metoxibencilo. El epoxido de IntA3 se abrio en el anillo con azida de sodio dando el derivado de C2-azido IntA4. El hidroxilo libre en la posicion C3 se alquilo entonces con bromuro de bencilo para formar el compuesto de biseter el monomero A2.
El monomero E (Numero de registro CAS 55682-48-9) puede sintetizarse usando los metodos descritos en las siguientes referencias bibliograficas: Hawley et al., European Journal of Organic Chemistry, (12), 1925-1936, 2002; Dondoni et al., Journal of Organic Chemistry, 67(13), 4475-4486, 2002; Van der Klein et al., Tetrahedron, 48(22), 4649-58, 1992; Hori et al., Journal of Organic Chemistry, 54(6), 1346-53, 1989; Sakairi et al., Bulletin of the Chemical Society of Japan, 67(6), 1756-8, 1994; Tailler et al., Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1: Organic
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and Bio-Organic Chemistry, (23), 3163-4, (1972-1999) (1992); Paulsen et al., Chemische Berichte, 111(6), 2334-47, 1978; Dasgupta et al., Synthesis, (8), 626-8, 1988; Paulsen et al., Angewandte Chemie, 87(15), 547-8, 1975; y referencias citadas en su interior, que se incorporan por este documento por referencia en sus totalidades.
El monomero B-1 (Numero de registro CAS 444118-44-9) puede sintetizarse usando los metodos descritos en las siguientes referencias bibliograficas: Lohman et al., Journal of Organic Chemistry, 68(19), 7559-7561, 2003; Orgueira et al., Chemistry--A European Journal, 9(1), 140-169, 2003; Manabe et al., Journal of the American Chemical Society, 128(33), 10666-10667, 2006; Orgueira et al., Angewandte Chemie, International Edition, 41(12), 2128-2131, 2002; y referencias citadas en su interior, que se incorporan por este documento por referencia en sus totalidades.
El monomero B1 tambien puede obtenerse en 7 etapas sinteticas a partir de diacetona glucosa [SM-B]. El resto de C3-hidroxilo en la diacetona glucosa (SM-B) se protegio como el bencil eter mediante reaccion con bromuro de bencilo dando IntB1. El resto de isopropilideno C5-C6 se desprotegio selectivamente con acido acetico acuoso dando el producto intermedio de diol IntB2. El diol C5-C6 se escindio entonces de forma oxidativa con peryodato de sodio dando el derivado de aldehfdo IntB3. El aldehfdo IntB3 se convirtio en el derivado de ortoester IntB4 con tris[feniltio]metano y butil-litio. Entonces se convirtio IntB4 en el derivado de yodofuranuronato IntB5 en presencia de cloruro de cobre (II) y oxido de cobre (II). El resto de isopropilideno C1-C2 se desprotegio con acido trifluoroacetico acuoso dando el diol de glucopiranuronato IntB6. El diol C1-C2 IntB6 se protegio entonces como su derivado de isopropilideno dando el monomero B1.
Sintesis del elemento estructural de DC (dimero DC) de EDCBA (que es equivalente al dimero EF del pentasacarido DEFGH
Se preparo el elemento estructural de DC [DCBB] en 9 etapas sinteticas a partir de anhidrocelobiosa usando el siguiente procedimiento: Se protegieron los restos de alcohol C4 y C6 del anillo 'D' de anhidrocelobiosa [ACB] como el derivado de bencilideno [CB1] usando benzaldehfdo dimetilacetal en acetonitrilo y acido canforsulfonico como catalizador. El C2-hidroxilo en el anillo de 'C' del disacarido CB1 se hizo reaccionar con cloruro de p-toluenosulfonilo en piridina con una cantidad catalftica de DMAP dando el derivado tosilado CB2. El derivado de tosilo CB2 se hizo reaccionar con t-butoxido de potasio en terc-butanol y diclorometano dando el producto intermedio de epoxido CB3. Los restos de hidroxilo C-2 y C-3 en el anillo 'D' se protegieron como los bencil eteres mediante la reaccion con bromuro de bencilo en DMF e hidruro de sodio como base, dando el producto intermedio de dibencilo CB4. Se abrio el anillo de epoxido de CB4 con azida de sodio en agua y DMF dando el derivado de azido, CB5. El C3-hidroxilo en el anillo 'C' del disacarido CB5 se hizo reaccionar con anhfdrido acetico en diclorometano y una cantidad catalftica de DMAP dando el derivado de acetato CB6. El resto de bencilideno de CB6 se desprotegio usando 8 % de TFA en tetrahidrofurano dando el producto intermedio de diol CB7. El C6-hidroxilo del anillo 'D' en CB7 se oxido usando TEMPO con hipoclorito de sodio en acetonitrilo y tampon NaH2PO4 dando el producto intermedio de acido carboxflico CB8. El resto de acido carboxflico en CB8 se esterifico usando alcohol bencflico en presencia del agente de acoplamiento EDC, DMAP y diclorometano dando el elemento estructural de DC, DCBB.
Conversion de anhidrocelobiosa en el elemento estructural de DC:
Reactivos: 1. PhCH(OMe)2 (1,3 eq), CSA (0,1 eq) ACN; 2. p-TosCl (3 eq), DMAP, piridina; 3. t-BuOH, KOtBu (3 eq), 5 DCM; 4. NaH (3,3 eq), BnBr (3 eq), DMF; 5. NaN (7 eq), DMF/H2O (10 %); 6. Ac2O (5 eq), DCM, DMAP; 7. TFA ac al 80 %, THF; 8. TEMPO (1,0 eq), 10 % de NaOCl, DCM, H2O, tampon NaH2PO4; 9. EDC (2 eq), DMAP (0,1 eq), bencil-OH (5 eq), DCM
Sintesis del dimero BA
Se preparo el dimero BA en 12 etapas sinteticas a partir del monomero B1 y el monomero A2 usando el siguiente procedimiento:
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•OTBDPS
McOOl
McOOC
McOOC
ocnhcci
Me(X)i
McOOl
MeOOt
Sintesis de dimero BA
Lev^=Q
-4-
Mcooc o
OOS
Monomero B1
RYInd2
... 1
Cnll-O,
C-V«I I'if( )q
Peso mol.; 396,39
Peso mol.: 338,35
Peso mol.; 436,45
SO*
91*
91%
B\lo<l:
mii.d-i
BM«kI3
Ca,H:sO,c
t'ljILifrOioSi
C35H;;OoSi
Peso mol.: wc*49
73 B M
Peso mol.:
Peso mol.: 634.79
S-r
73%
kv-;
A Mod I
Nj
Monomero
t WH23N3C*
BMocK
Peso mol.: 421.40
C-21H21N3O5
Peso mol.: 644 88
8 75%
397.42
Peso
KX%
84%
A Mod 5
VModJ
C21IJ23N (Q,
C1SH:«N<0
1 i.|H.pN |Cl»,
Peso mol.: 413,42
Peso mol.; 393,39
Peso mol.: 309,32
72% o
82%
Dimero BA
c47h«n,o,5
Peso mol.: 79 ■,80
Peso mol.: 895.90
Reactivos: 1. Lev2O, DIPEA, TA, 16 h; 2. 90 % de TFA, TA, 4 h; 3. Imidazol, TBDPSi-Cl, TA, 3 h; 4. Piridina, BzCl, TA. 3 h; 5. TBAF, TA, 3 h; 6. TCA, DBU, TA, 2 h; 7. BF3.Et2O, Ac2O. DCM, -20 °C a TA, 3 h; 8. (a) TMS-I, TBAI, TA,
2 h; (b) DIPEA, MeOH, 16 h, TA; 9. NaOMe, forma H+ de la resina Dowex 50WX8-100, TA, 3 h; 10. Piridina, Bz-Cl, - 40 °C a -10 °C, 2 h; 11. BF3.Et2O. DCM. -20 °C-TA; 12. NH2NH2.H2O. TA, 3 h.
El C4-hidroxilo del monomero B-1 se levulino usando anhfdrido levulfnico y diisopropiletilamina (DIPEA) con mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas dando el ester de levulinato BMod1, que fue seguido de hidrolisis del acetonido con 90 % de acido trifluoroacetico y mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas dando el diol BMod2. El C1 -hidroxilo del diol BMod2 se sililo con cloruro de ferc-butildifenilsililo mezclando a temperatura ambiente durante
3 horas dando el derivado de sililo BMod3. El C2-hidroxilo se benzoilo entonces con cloruro de benzoflo en piridina, y se mezclo a temperatura ambiente durante 3 horas dando el compuesto BMod4. El grupo sililo en BMod4 se desprotegio entonces con fluoruro de ferc-butilamonio y se mezclo a temperatura ambiente durante 3 horas dando el C1 -hidroxilo BMod5. El C1 -hidroxilo se dejo reaccionar entonces con tricloroacetonitrilo en presencia de diazobicicloundecano (DBU) y mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas dando el derivado de tricloroacetamidato (TCA) BMod6, que era adecuado para el acoplamiento, por ejemplo, con el monomero A-2.
Se preparo el monomero A-2 para el acoplamiento por apertura del resto de anhidro con BF3^Et2O seguido de acetilacion de los grupos hidroxilo resultantes dando el derivado de triacetato AMod1.
Se preparo el monomero A-2 para la reaccion de acoplamiento por apertura del resto de anhidro y acetilacion de los grupos hidroxilo resultantes dando el derivado de triacetato AMod1. Esta transformacion se produce usando trifluoruro de boro-eterato, anhfdrido acetico y diclorometano, entre -20 °C y temperatura ambiente durante 3 horas. El C1-acetato de AMod1 se hidrolizo entonces y se metilo en dos etapas dando el diacetato AMod3. Es decir, primero se hizo reaccionar AMod1 con yoduro de trimetilsililo y se mezclo a temperatura ambiente durante 2 horas,
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luego se hizo reaccionar con y yoduro de tetrabutilamonio. Esta mezcla se hizo reaccionar con diisopropiletilamina y metanol y se agito durante 16 horas a temperatura ambiente, formando asf AMod3. Los C4 y C6-acetatos de AMod3 se hidrolizan con metoxido de sodio dando el diol Amod4. La mezcla de AMod3 tambien se sometio a mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas con la resina Dowex 50 Wx4X8-100 en forma de acido para la neutralizacion. Esto formo Amod4. El C6-hidroxilo de AMod4 se benzofla entonces tratando con cloruro de benzoflo en piridina a - 40 °C y luego dejandolo calentar a -10 °C durante 2 horas dando AMod5.
El acoplamiento del monomero AMod5 con el grupo C4-hidroxilo libre de BMod6 se realizo en presencia de BF3^Et2O y diclorometano con mezcla entre -20 °C y temperatura ambiente durante 3 horas para proporcionar el disacarido BA1. El resto C4-levulinilo del disacarido se hidrolizo entonces con hidracina dando el dfmero BA, que es adecuado para las posteriores reacciones de acoplamiento.
Sintesis del trimero EDC
Se preparo el trimero EDC en 4 etapas sinteticas a partir del monomero E y el elemento estructural de DC usando el siguiente procedimiento:
Preparacion de Trimero EDC-CB:
Reactivos: 1. BFa.Et2O, Ac2O, DCM, 0 °C-TA, 3 h; 2. NhhNhh.Ac, DMF, TA, 3 h; 3. TCA, DBU, DCM, TA, 2 h; 4. DCBB (1 eq), E-Mod 3 (3,0 eq), TES-OTf, -40 °C, 2 h;
Se preparo el monomero E para el acoplamiento por apertura del resto anhidro con BF3^Et2O seguido de acetilacion de los grupos hidroxilo resultantes dando el diacetato EMod1. Esto se produce mediante la adicion de monomero E con trifluoruro de boro-eterato, anhfdrido acetico y diclorometano a -10 °C, y dejando que la reaccion se caliente a temperatura ambiente con agitacion durante 3 horas. El C1-acetato de EMod1 se hidroliza entonces dando el alcohol, EMod2. Esto se produce haciendo reaccionar Emod1 con acetato de hidracina y dimetilformamida y mezclando a temperatura ambiente durante 3 horas. El C1 -hidroxilo de Emod2 se hace reaccionar entonces con tricloroacetonitrilo dando el derivado de tricloroacetamidato (TCA) EMod3 adecuado para el acoplamiento, reaccion que tambien emplea diazabicicloundecano y diclorometano y mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. El elemento estructural de DC [DCBB], que tiene un grupo C4-hidroxilo libre en el anillo 'D', se acoplo entonces con el derivado de TCA EMod3 en presencia de triflato de trietilsililo dando el trisacarido trimero EDC-CB
Sintesis del pentamero EDCBA
Se preparo el pentamero EDCBA usando el siguiente procedimiento:
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Preparacion del pentamero completamente protegido:
Reactivos: 1. BF3.Et2O (0,8 eq), Ac2O, DCM, -10 °C a TA, 6 h; 2. BnNH (6 eq), THF, -10 °C, 4 h; 3. TCA (20 eq), DBU (0,5 eq), TA, 2 h; 4. TES-Tf (0,5 eq), -30 °C, 2 h;
La preparacion de pentamero EDCBA-CB se lleva a cabo del siguiente modo. Se prepara el trfmero EDC-CB, un producto intermedio de diacetato, para la reaccion de acoplamiento con el dfmero BA abriendo inicialmente el resto anhidro y acetilacion de los grupos hidroxilo resultantes dando el derivado de tetraacetato EDC1-CB. Esto se produce haciendo reaccionar el trfmero EDC con trifluoruro de boro-eterato, anhfdrido acetico y diclorometano, y agitacion entre -10 °C y temperatura ambiente durante 6 horas. El C1-acetato de EDC1-CB se hidroliza entonces dando el alcohol, EDC2-CB, haciendo reaccionar EDC1-CB con bencilamina [BnNH2] y tetrahidrofurano y mezclando a -10 °C durante 4 horas. El C1 -hidroxilo de EDC2-CB se hace reaccionar entonces con tricloroacetonitrilo y diazabicicloundecano, con mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas, dando el derivado de tricloroacetamidato (TCA) EDC3-CB adecuado para el acoplamiento.
El dfmero BA, que tiene el grupo C4-hidroxilo libre, se acopla con el trisacarido EDC3-CB en presencia de trietilsililtriflato a -40 °C mezclando durante 2 horas dando el pentasacarido pentamero EDCBA-CB.
Sfntesis de fondaparinux
Se preparo fondaparinux usando el siguiente procedimiento:
Conversion de FPP (tambien denominado un pentamero completamente protegido) en fondaparinux sodico:
MeOOC Bzi
Pentamero EDCBA-CB
Cl0lHl06^9°3O Peso mol.: 1924 95
HOOC
API-1-CB
C73H83N9O25 Peso mol.: 1486
HO3SO
API-2-CB
C73H83N9O40S5 Peso mol.: 1886,81
NaQ3SO-
Na03SHN
Na03SO'— t Na03SHN
Na03SHN
FONDAPARINUX SODICO
C31H 43 N3Na-| o04gSg Peso mol.: 1728,09
HO*
NaOOi
Reactivos: 1. NaOH, H2O2, LiOH, dioxano, TA, 24-48 h; 2. PLSO3, DMF, 60 °C, 2 h, purificacion en CG-161; 3. 10 % de Pd/C, H2, 72 h; 4. (a) PLSO3, NaOH, NH4OAc, 12 h, (b) intercambio ionico de NH4OAc/NaCl HiQ, desalacion 5 en Sephadex y (c) intercambio ionico de NaCI HiQ, desalacion en Sephadex
Se hidrolizaron los restos de ester en el pentamero EDCBA-CB con hidroxido de sodio y de litio en presencia de peroxido de hidrogeno en dioxano mezclando a temperature ambiente durante 24-48 horas dando el producto intermedio de pentasacarido API1-CB. Los cinco restos hidroxilo en API1-CB se sulfataron usando un complejo de 10 piridina-trioxido de azufre en dimetilformamida, mezclando a 60 °C durante 2 horas y luego se purificaron usando cromatograffa en columna (CG-161), dando el pentasacarido API2-CB pentasulfatado. El producto intermedio API2- CB se hidrogeno entonces para reducir las tres azidas en los azucares E, C y A a aminas y la desproteccion reductora de los seis bencil eteres a sus grupos hidroxilo correspondientes para formar el producto intermedio API3-
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CB. Esta transformacion se produce haciendo reaccionar API2-CB con catalizador de 10 % de paladio/carbono con gas hidrogeno durante 72 horas. Las tres aminas en API3-CB se sulfataron entonces usando el complejo de piridina- trioxido de azufre en hidroxido sodico y acetato de amonio, permitiendo que la reaccion avanzara durante l2 horas. El fondaparinux en bruto se purifica y posteriormente se convierte en su forma de sal. La mezcla en bruto se purifico usando una columna cromatografica de intercambio ionico (resina HiQ), seguido de desalacion usando una resina de exclusion de tamano o filtracion en gel (Biorad Sephadex G25) dando el producto final, fondaparinux sodico.
Sfntesis del monomero A2
Etapa 1: Formacion de IntAI por desacetilacion de tri-O-acetil-D-glucal
Se disuelve el tri-O-acetil-D-glucal [SM-A] (100 g, 367 mmoles) en MeOH seco [1,5 l], y entonces se anade NaOMe (110 mmoles, 5,95 g) a la mezcla de reaccion. En el plazo de aproximadamente 20 minutos, la CCF (40 % de EtOAc/60 % de hexanos y 100 % de EtOAc) confirmo el glucal desacetilado. La reaccion se inactiva con la resina de cation intercambio 50WX4 hasta que el pH sea proximo a 7,0 por papel en tiras de pH. La mezcla se filtra y se evapora a sequedad a vacfo dando el producto intermedio de glucal como jarabe IntA1 (59 g). Rendimiento teorico =100 g x (146/272) = 53,7 g. CCF Rf de IntA1 = 0,1, SiO2, 100 % de acetato de etilo
Etapa 2 y 3: Conversion en 1,6-anhidro-2-desoxi-2-yodo-p-D-glucopiranosa [IntA2]
Se trata el D-glucal como jarabe desacetilado IntA1 de la etapa 1 (53,7 g, basado en rendimiento cuantitativo, 367 mmoles) con oxido de bis(tributilestano) (175 g, 150 ml, 294 mmoles, 0,8 eq) y tamices moleculares de 3A en polvo activados [150 g] en acetonitrilo seco a reflujo [3,5 l] durante 16 horas. A la manana siguiente, la mezcla se enfrfa a 5 °C bajo N2 y se anade I2 [140 g, 551 mmoles] en una porcion. La mezcla marron oscura se agita durante 15 minutos a 5 °C, luego durante 3 horas a temperatura ambiente. La CCF (tanto 1/1:tolueno/acetona como 100 % de EtOAc) mostro la conversion completa de D-glucal (Rf 0,14) en derivado de yodo (Rf 0,45). La mezcla se filtro a traves de Celite y se concentro. A este residuo se anade tiosulfato de sodio acuoso saturado (200 ml) y hexanos (200 ml). La mezcla bifasica se mezcla vigorosamente durante 16 horas. La fase acuosa se extrae entonces continuamente con DCM (1,5 l) durante 24 horas (hasta que no se detecto producto en la fase acuosa). El extracto organico se seca sobre Na2SO4 y se concentra. Al residuo se anadieron 500 ml de acetona. El material insoluble amarillo se filtro y se desecho. La solucion de acetona se evaporo a sequedad. El residuo se trato con EtOAc para separar el derivado de yodo-1,6-anhidro, IntA2, como un solido blanco. Rendimiento: 76 g. CCF Rf de IntA2 = 0,7, SiO2, 100 % de acetato de etilo.
Etapa 4: Conversion en 1,6:2,3-bisanhidro-4-O-p-metoxibencil-p-D-glucopiranosa [IntA3]
Se co-evaporo dos veces el derivado de yodo, IntA2 (152 g, 279 mmoles) de la etapa previa usando acetonitrilo seco [^volumen?], se disolvio en DMF (2 l) y se enfrio a -20 °C en bano de hielo seco. Se anade cloruro de 4- metoxibencilo [94 ml, 698 mmoles, 2,5 eq.] y NaH (60 % en aceite mineral) [22,4 g, 559 mmoles, 2,0 eq.] y la mezcla de reaccion se agita durante 2 horas (-20 °C hasta temperatura ambiente). La CCF (20 % de EtOAc/80 % de hexanos) confirmo la conversion completa del material de partida en epoxido y algo de epoxido no bencilado (<10 %). La reaccion se extinguio vertiendo la mezcla en 2000 g de hielo picado. La mezcla se diluye con 2 l de THF y 4 l de EtOAc. La fase acuosa se extrae cuatro veces con EtOAc. La fase organica combinada se lava con NaCl acuoso saturado (2 l), se seca con Na2SO4, se filtro y el disolvente se elimina a vacfo. La cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice (hexanos:EtOAc/6:4) proporciono 143 g del epoxido deseado, IntA3. CCF Rf de IntA3 = 0,8, SiO2, 100 % de acetato de etilo; Rf de IntA2 = 0,7, SiO2, 100 % de acetato de etilo.
Etapa 5: Conversion en 1,6-anhidro-2-azido-4-O-p-metoxibencil-2-desoxi-p-D-glucopiranosa [IntA4]
Se disuelve el derivado de epoxido, IntA3 [142 g, 537 mmoles] en DMF [5,68 l] y agua [625 ml]. Entonces se anade azida de sodio [210 g, 3224 mmoles, 6 eq.]. La mezcla se calienta a 120 °C durante 12 horas, se enfrfa hasta temperatura ambiente y se vierte en una mezcla de agua y EtOAc. La fase acuosa se extrae cuatro veces con acetato de etilo y las fases organicas combinadas se lavan con salmuera y se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran. El producto en bruto se purifica por gel de sflice dando 124 g de derivado de azucar de azida puro, IntA4. CCF Rf de IntA4 = 0,6, SiO2, 50 % de acetato de etilo y 50 % de hexanos; Rf de IntA3 = 0,7, SiO2, 50 % de acetato de etilo y 50 % de hexanos.
Etapa 6: Conversion en 1,6-anhidro-2-azido-3-bencil-4-O-p-metoxibencil-2-desoxi-p-D-glucopiranosa
[Monomero A2]
Se disuelve el derivado de azido-PMB-azucar IntA4 [2,865 g, 9,32 mmoles] en DMF seca [30 ml] y se enfrfa a 0 °C. Se anade hidruro de sodio (60 % en aceite mineral) [0,45 g, 11,2 mmoles, 1,2 eq.] en una porcion, seguido de bromuro de bencilo [1,33 ml, 11,2 mmoles, 1,2 eq.] gota a gota. La mezcla se agita a 0 °C hasta que se acabo toda la adicion, entonces se dejo calentar a temperatura ambiente. La CCF (30 % de EtOAc / 70 % de hexanos) mostro la conversion completa de S.M en el producto deseado en una hora (Rf de 0,2 a 0,7). Despues de una hora la mezcla de reaccion se vierte en hielo/agua. Entonces se diluye con DCM y NH4Cl acuoso saturado. La fase acuosa se retro-
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extrae con DCM. Las fases organicas combinadas se lavan con NH4CI acuoso saturado, salmuera y agua, se secan sobre Na2SO4, se filtran y se evaporan dando el residuo aceitoso. El residuo se somete a cromatograffa en gel de sflice dando el derivado de biseter puro, el monomero A2 con un rendimiento del 90 %. CCF Rf de monomero A2 =
0. 7, SiO2, 30 % de acetato de etilo y 70 % de hexanos; Rf de IntA4 = 0,2, SiO2, 30 % de acetato de etilo y 70 % de hexanos
La conversion del monomero A2 en AMod5, etapas 7 a 10, se informa en la seccion que detalla la preparacion del dfmero BA.
Sfntesis del monomero B1
Etapa 1. Preparacion de 3-O-bencil-diacetonaglucosa [IntBI]
Se enfriaron 35 ml de THF en un bano de hielo/metanol. Tambien se ajustaron un condensador, embudo de adicion a presion y tabique al matraz. El sistema se purgo con nitrogeno seco mientras que se enfriaba. Se anadio lentamente hidruro de sodio (60 % en aceite mineral) [5,769 g, 144,23 mmoles] a este matraz. La diacetona glucosa [SM-B, 30 g, 115,38 mmoles] se disolvio en una mezcla 1 a 1 de DMF [172,5 ml] y THF [172,5 ml]. Esta se cargo en el embudo de adicion a presion y se anadio lentamente gota a gota en el hidruro de sodio durante 20 minutos. Una vez se habfa anadido toda la diacetona glucosa, la mezcla se agito durante 20 minutos antes de la adicion de bromuro de bencilo [17,27 ml, 144,23 mmoles]. Con todo el bromuro de bencilo anadido la solucion se saco del bano de hielo y se calento lentamente a reflujo (65 °C). El progreso de la reaccion se comprobo por CCF (20 % de EtOAc/hexanos). Tras completarse la reaccion se inactivo vertiendo el contenido sobre hielo y anadiendo 100 ml de H2O y 100 ml de cloruro de amonio saturado. Se anadieron 350 ml de acetato de etilo y la mezcla se separo. La fase acuosa se re-extrajo con 125 ml de EtOAc y una vez con 100 ml de 1:1 de EtOAc/THF. Las fases organicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron en rotavapor dando un jarabe amarillo. El material en bruto se uso en la siguiente etapa. Rendimiento: se supuso cuantitativo. CCF de IntB1 - Rf = 0,45 en tampon de elucion: 20 % de acetato de etilo y 80 % de hexanos
Etapa 2. Hidrolisis selectiva de 5,6-isopropilideno [IntB2]
Se disolvio el material en bruto (suponiendo rendimiento cuantitativo) de la etapa una en 66 % de acido acetico [112,5 ml] / agua [62,5 ml] y se calento a 40 °C durante la noche. A la manana siguiente se comprobo la CCF usando 30 % de EtOAc/hexanos y la reaccion se extinguio por la cuidadosa adicion de carbonato de potasio saturado [~250 ml] hasta que el pH de la solucion alcanzo 7. La solucion se diluyo con agua y se transfirio a un embudo de decantacion. Esta se extrajo tres veces con DCM. Las fases organicas combinadas se lavaron dos veces con salmuera antes de secarse sobre sulfato de sodio. Esta se filtro y se evaporo en rotavapor antes de re-disolverse en una cantidad minima de DCM para cromatograffa en gel de sflice. Se usaron 2 l de sflice y se eluyeron con 2 l de 30 %, 3 l de 40 %, 3 l de 50 %, 1 l de 60 % y 2 l de 65 % de EtOAc/hexanos. Rendimiento del 88,5 % en dos etapas,
1. CCF de IntB2 - Rf = 0,16 en tampon de elucion: 30 % de acetato de etilo y 70 % de hexanos
Etapa 3: Escision oxidativa de 5,6-hidroxi por peryodato de sodio en 3-O-bencil-5,6-dihidroxi-1,2- isopropilidenglucofuranosa [IntB3]
Se dispuso el azucar de partida de 5,6-hidroxi [IntB2, 31,2 g, 100,61 mmoles] en un matraz y se disolvio en DCM [375 ml]. A este se anadieron 375 ml de agua y bromuro de tetrabutilamonio [3,24 g, 10,06 mmoles]. La mezcla se cubrio con lamina de aluminio para excluir tanta luz como fuera posible de ella con el fin de prevenir la descomposicion del peryodato. Se peso el peryodato de sodio [25,82 g, 120,7 mmoles] y se anadio a la mezcla en tres porciones. Una vez se completo la adicion, se dejo que el matraz se calentara lentamente hasta temperatura ambiente. El progreso de la reaccion se comprobo por CCF (40 % de EtOAc/hexanos). Una vez se completo la reaccion se transfirio a un embudo de decantacion y se extrajo. La fase acuosa se re-extrajo con 3X200 ml de DCM. Las fases organicas se combinaron y se lavaron dos veces con 150 ml de H2O y una vez con 200 ml de salmuera. La cromatograffa en gel de sflice dio el producto puro. Rendimiento: 87,7 %. CCF de IntB3 - Rf = 0,55 en tampon de elucion: 40 % de acetato de etilo y 60 % de hexanos.
Etapa 4: Conversion en tio-orto ester configurado por L-idosa [IntB4]
Se seco todo el material de vidrio en un horno durante la noche para garantizar que estuviera seco. A un matraz secado se anadio tris(feniltio) metano [54,62 g, 160,4 mmoles, 1,8 eq.) y THF seco (125 ml). Este se enfrio entonces en un bano de nieve carbonica/ acetona a -78 °C. Una vez a -78 °C, se anadio el n-butil-litio (1,6 M en hexanos, 100 ml, 160,4 mmoles, 1,8 eq.) gota a gota. La solucion amarilla brillante se dejo calentar a -50 °C durante una hora y luego se enfrio a -78 °C durante 30 minutos antes de la adicion del bruto de la etapa tres.
El material en bruto IntB3 (24,8 g, 89,11 mmoles) de la etapa 3 se disolvio en 125 ml de THF seco y se cargo en un embudo de adicion a presion. Este se anadio gota a gota, mientras que se mantema a -78 °C, durante los 15 minutos siguientes. La reaccion se agito durante una hora adicional a -78 °C antes dejar que se calentara a temperatura ambiente. Este se inactivo con una solucion de cloruro de amonio saturado (660 ml). La solucion se
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transfirio a un embudo de decantacion y se extrajo con acetato de etilo. La fase acuosa se re-extrajo tres veces con 100 ml de EtOAc. Las fases organicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a presion reducida. El material en bruto se uso en la siguiente etapa. Rendimiento: 90 %. CCF de IntB4 - Rf = 0,70 en tampon de elucion: 40 % de acetato de etilo y 60 % de hexanos.
Etapa 5: 3-O-bencil-1,2-isopropiliden-a-L-idofuranuronato de metilo [IntB5]
Se dispuso en un matraz cloruro de cobre (II) (43,51 g, 323,62 mmoles) y oxido de cobre (II) (10,94 g, 137,54 mmoles) junto con metanol (600 ml) y agua (50 ml) en una relacion 12 a 1. Se disolvio el IntB4 en bruto (50 g, 80,9 mmoles) de la etapa 4 en una cantidad minima de DCM y se anadio lentamente a la mezcla. La reaccion se agito hasta que se completo como se indica por CCF (40 % de EtOAc/hexanos). Una vez se completo la reaccion, se paso a traves de un lecho de Supercel [agente de filtracion] para eliminar el oxido de cobre (II). La mezcla de reaccion se concentro entonces a presion reducida y el produzco blanco verdoso se extrajo con EtOAc y H2O. La fase acuosa se re-extrajo con 2X150 ml de EtOAc. Las fases organicas combinadas se lavaron con 2X100 ml de H2O y 2X100 de salmuera antes de secarse sobre sulfato de sodio. La purificacion por cromatografia en gel de silice dio el producto puro (2 l de silice y se eluyo con 2 l de cada uno de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % de EtOAc/hexanos) como un aceite amarillo claro. Rendimiento: 80 %. CCF de IntB5 - Rf = 0,3 en tampon de elucion: 40 % de acetato de etilo y 60 % de hexanos.
Etapa 6: Escision del 1,2-isopropilideno en 3-O-bencil-1,2-isopropiliden-a-L-idofuranuronato [IntB6]
Se disolvio el material de partida IntB5 (22 g, 65 mmoles) en una cantidad minima de DCM. A esta se anadio 90 % de TFA/agua (200 ml) y se agito a temperatura ambiente. La reaccion se comprobo por CCF (30 % de EtOAc/hexanos para el material de partida y 60 % de EtOAc/hexanos para el producto) y se encontro que estaba completa despues de 30 min. Entonces esta se diluyo con tolueno y se evaporo en rotavapor a casi sequedad. Se co-evaporo con tolueno 3X40 ml. La cromatografia en gel de silice (2 l de silice y se eluyo con 2 l de 30 %, 40 %, 50 %, 60 % de EtOAc/hexanos) proporciono el producto como un solido de blanco a blanquecino. El rendimiento del producto deseado en la mezcla fue del 55 %. CCF de IntB6 - Rf = 0,25 en tampon de elucion: 60 % de acetato de etilo y 40 % de hexanos
Etapa 7: 3-O-Bencil-1,2-isopropiliden-a-D-glucopiranuronato de metilo [Monomero B1]
Se disolvio el derivado de azucar IntB6 (230 g, 0,8 moles, 1 eq.) en 1 l de DMF en un matraz redondo de tres bocas dotado de agitacion magnetica. Se tapo la boca central. Las otras dos bocas se dotaron de una sonda de temperatura y controlador y un embudo de adicion a presion. La mezcla de reaccion se enfrio a cero en un bano de hielo/agua/sal. Se anadio 2-metoxipropeno (766,11 ml, 8 moles, 10 eq.) cuando la mezcla estuvo a aproximadamente 4-5 °C. Entonces esta se agito hasta que se alcanzo una temperatura de cero. Se disolvio el CSA (18,58 g, 0,08 moles, 0,1 eq.) en 125 ml de DMF y se cargo en un embudo de goteo. Con la temperatura a cero empezo la adicion gota a gota lenta de CSA. Cuando se observo que la temperatura ascendfa, y continuaba aumentando rapidamente, se detuvo la adicion y se dejo que el sistema se enfriara a cero otra vez. Despues de la exotermia inicial se encontro que el CSA adicional no causo que la mezcla se calentara. Con todo el CSA anadido, la mezcla se dejo calentar a temperatura ambiente. A medida que se calienta la reaccion, el color de la reaccion avanza para volverse muy oscuro. El progreso de la reaccion fue seguido de CCF (40 % de E-H), se encontro que el producto iba mas alto. Una vez se completo la reaccion, se anadieron 800 ml de metanol y se agito durante una hora antes de que la reaccion se inactivara con 200 ml de TEA. Cuando se anadio TEA la mezcla llego a ser de color mucho mas claro. La mezcla de reaccion se evaporo para eliminar el exceso de metanol antes de la extraccion. La extraccion se hizo usando EtOAc/H2O. La fase organica se lavo 2X con agua. La fase acuosa se lavo una vez con EtOAc. La fase organica combinada se lavo una vez con salmuera y se seco sobre sulfato de sodio. El sulfato de sodio se filtro antes de la concentracion a presion reducida en la preparacion para una columna de silice. La columna de silice se hizo en 15 l de silice (10 % de E-H). El producto se eluyo con 20 l de cada uno: 10 %,15 %, 20 % y 40 l de 30 % seguido de 20 l de 40 %. La piranosa se separo de la furanosa. Las fracciones puras se reunieron y se concentraron. CCF de monomero B1 - Rf = 0,40 en tampon de elucion: 60 % de acetato de etilo y 40 % de hexanos
La conversion del monomero B1 en BMod6, etapas 8 a 13, se informa en la seccion que detalla la preparacion del dfmero BA.
Conversion de anhidrocelobiosa [ACB] en el elemento estructural de DC [DC BB]
Etapa: 1 Preparacion de benciliden-anhidro-celobiosa (CB1) - Formacion de bencilideno
A una suspension de 800 gramos (2468,30 mmoles, 1 eq) de 1,6-anhidro-p-d-celobiosa (ACB) comercialmente disponible en 12 litros de acetonitrilo se anadieron 57,33 gramos (246,83 mmoles, 0,1 eq) de acido canforsulfonico (CSA). Entonces se anadieron gota a gota 481,38 ml (3208,79 mmoles, 1,3 eq) de benzaldehfdo dimetilacetal y la mezcla de reaccion se calento a reflujo durante 2 horas. La suspension blanca llego a ser una solucion transparente despues de 30 minutos de reaccion. La CCF (20 % de metanol/acetato de etilo) indico que la reaccion se habfa
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completado. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se concentro a vacfo usando un evaporador rotatorio. El residuo (~570 g) de CB1 se uso para la etapa 2 sin mas purificacion.
Etapa: 2 Preparacion de tosil-anhidro-celobiosa (CB2): Tosilacion
Se disolvio el producto de la etapa 1 benciliden-anhidro-celobiosa (CB1) en bruto ~570 gr, (1382,15 mmoles, 1 eq) en 2,5 litros de piridina. Entonces se anadieron 34 gramos (276,44 mmoles) de N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) y 789,70 gramos (4146,46 mmoles, 3 eq) de cloruro de p-toluenosulfonilo. La mezcla de reaccion se agito durante 6 h bajo una atmosfera de N2 a temperatura ambiente. La CCF (5 % y 20 % de metanol/acetato de etilo) indico que la reaccion se habfa completado. La mezcla de reaccion se inactivo en metanol (400 ml) y se concentro a vacfo, el residuo se diluyo con acetato de etilo (4 litros) y se lavo con H2O (2 X 1,5 litros). La fase organica se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se evaporo a vacfo. El residuo se co-evaporo con tolueno (2 x 1,5 litros) a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (gradiente de 80 % de acetato de etilo / 20 % de heptano a 100 % de acetato de etilo) dando tosil-anhidro-celobiosa (CB2) como una espuma blanca (442,0 gramos, rendimiento del 56,4 % en 2 etapas).
Etapa: 3 Preparacion de epoxido-anhidro-celobiosa (CB3) - Formacion de epoxido
Se anadio lentamente una solucion de 262,82 gramos (2342,14 mmoles, 3 eq) de terc-butoxido de potasio en 1,8 litros de alcohol terc-butflico a una solucion de 442,0 gramos (780,72 mmoles, 1 eq) de tosil-anhidro-celobiosa (CB2) disuelta en 5 litros de diclorometano seco a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se calento y se dejo a reflujo suavemente durante aproximadamente 2 horas bajo una atmosfera de N2. El analisis de CCF (100 % de acetato de etilo) mostro conversion del material de partida en el producto. La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se vertio lentamente en 5 litros de solucion saturada de cloruro de amonio y se extrajo con diclorometano (2 X 2,5 litros). Las fases organicas se combinaron, se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a vacfo dando un solido amarillo (~234 g, 76,06 % de rendimiento del bruto), que se uso para la etapa 4 sin mas purificacion.
Etapa: 4 Preparacion de bencil-epoxido-celobiosa (CB4) - Bencilacion.
A una suspension de 78,30 gramos (1958,0 mmoles, 3,3 eq) de hidruro de sodio (60 % de aceite) en 600 ml de DMF seca a -28 °C se anadio lentamente una solucion de 234,0 gramos (593 mmoles, 1 eq) de derivado de epoxido- anhidro (CB3) en 800 ml de DMF seca, manteniendo la temperatura por debajo de -15 °C. Tras completarse la adicion, la mezcla se calento lentamente hasta temperatura ambiente y se anadio una solucion de 211,71 ml (1780,0 mmoles, 3 eq) de bromuro de bencilo en 500 ml de DMF seca. Despues de agitar la reaccion durante 16 horas a temperatura ambiente bajo atmosfera de N2, el analisis de CCF (40 % de acetato de etilo/60 % de heptano) mostro conversion del material de partida en el producto. La mezcla de reaccion se inactivo en hielo y se extrajo con acetato de etilo (2 X 4 litros), se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se evaporo a vacfo. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (gradiente de 10 % de acetato de etilo/90 % de heptano) con 5 % de gradiente para proporcionar el producto (CB4) (275,0 g, 80 %).
Etapa: 5 Preparacion de azida-anhidro-celobiosa (CB5) - Reaccion de azidacion.
Se disolvieron 275,0 gramos (478,58 mmoles, 1 eq) de dibencil-epoxido-celobiosa (CB4) en 9,56 litros de DMF, se anadieron 1,06 litros de H2O y 217,75 gramos (3350,04 mmoles, 7 eq) de azida de sodio. La mezcla de reaccion se calento a reflujo. La CCF (40 % de acetato de etilo/heptano) mostro la completitud de la reaccion despues de 16 horas. Tras completarse, la mezcla se diluyo con acetato de etilo (5 litros) y se lavo con agua (1 X 1,5 litros) y se evaporo a vacfo. El residuo se co-evaporo con tolueno (3x2 litros) a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (gradiente de 30 % de acetato de etilo / 70 % de heptano) para proporcionar el producto (CB5) como un solido blanco (266,0 gramos, 90 %).
Etapa: 6 Preparacion de acetato-anhidro-celobiosa (CB6) - Acetilacion
Se disolvieron 266,0 gramos (430,66 mmoles, 1 eq) de azida-anhidro-celobiosa (CB5) en 2 litros de diclorometano seco y se anadieron 78,92 gramos (64,60 mmoles) de N,N-dimetilaminopiridina (DMAP). La solucion se enfrio a 0 °C y se anadieron 203,57 ml (2153,32 mmoles, 5 eq) de anhfdrido acetico. La mezcla se calento a temperatura ambiente y se agito durante 2 h o hasta que la reaccion estaba completa por CCF (40 % de acetato de etilo/heptano). La reaccion se inactivo con metanol (1,5 litros), se concentro a vacfo y dio 284,0 gramos de producto en bruto de espuma blanca. El producto en bruto de acetato-anhidro-celobiosa (CB6) se uso para la etapa 7 sin mas purificacion.
Etapa: 7 Preparacion del producto intermedio CB7 - Desproteccion del resto bencilideno
Se disolvieron 284,0 gramos (430,51 mmoles, 1 eq) de acetato-anhidro-celobiosa (CB6) en 2,16 litros de tetrahidrofurano (THF). La solucion se enfrio a 0 °C y se anadieron lentamente 5,68 litros de acido trifluoroacetico (TFA) acuoso al 80 %. La mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante 4 horas.
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La CCF (60 % de acetato de etilo/heptano) mostro la completitud de la reaccion. La mezcla de reaccion se enfrio a - 5,0 °C y anadiendo 8,2 litros de trietilamina (TEA, 5963,13 gramos, 58,93 moles, 1,0 equiv/TFA) lentamente en la solucion hasta que el pH fue 7,0. Durante la adicion de TFA mantener la temperatura entre -5,0 °C y 5,0 °C. Entonces el residuo se diluyo con CH2Cl2 (3 litros) y se lavo con H2O (1 X 1,5 litros). La fase organica se extrajo con solucion al 10 % de bicarbonato sodico (3 X 1,0 litro), se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se evaporo a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (gradiente de 60 % de acetato de etilo en heptano) como espuma blanca de celobiosa-diol (CB7) (227,0 g, 92,2 %).
Etapa: 8 Preparacion de acido carboxflico - celobiosa (CB8) - Oxidacion de 6-hidroxilo
Se disolvieron 227,0 gramos (397,15 mmoles, 1 eq) de celobiosa-diol (CB7) en 12,5 litros de acetonitrilo (ACN) y 8,2 litros de tampon (1:1) de Na2HPO4 0,67 M y NaH2PO4 0,67 M a pH 6,5. La mezcla de reaccion se calento a 35 °C. Entonces se anadieron 62,05 gramos (397,15 mmoles, 1 eq) de reactivo de 2,2,6,6-tetrametil-piperidin-1-oxilo (TEMPO) y se anadieron 415 ml de solucion de NaOCl que contenfa 10-13 % de cloro disponible. La mezcla de reaccion se agito a 35 °C hasta que la reaccion estaba completa por CCF (5 % de metanol / acetato de etilo). Despues de 16 horas la reaccion se enfrio a 0 °C, se diluyo con agua (2 litros) y el pH se ajusto a pH 8,5 - 9,0 usando NaOH 1 N (2,5 litros). La mezcla de reaccion se vertio entonces en 500 ml de solucion de sulfito de sodio frfa en hielo (30 gramos en 500 ml de agua). La reaccion se extrajo con metil t-butil eter (MTBE) (2 litros) y se desecho la fase organica. La fase acuosa se acidifico con HCl 1,0 N (6 litros) a pH 2,5. La reaccion se extrajo entonces con diclorometano, se seco con sulfato de sodio anhidro y se evaporo dando un jarabe (212,0 gramos). El producto en bruto de acido carboxflico-celobiosa (CB8) se uso para la etapa 7 sin mas purificacion.
Etapa: 9 Preparacion de ester bencflico-anhidro-celobiosa (DCBB) - Bencilacion de acido carboxflico
Se disolvieron 212 gramos (362,05 mmoles, 1 eq) de acido carboxflico-celobiosa (CB8) de la etapa 8 en 3,5 litros de DCM seco y se anadieron 11,05 gramos (90,52 mmoles) de N,N-dimetilaminopiridina (DMAP). Se anadieron lentamente 138,80 gramos (724,09 mmoles, 2 eq) de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y 177,90 ml (1810,24 mmoles, 5 eq) de alcohol bencflico y la reaccion se agito a temperatura ambiente bajo atmosfera de N2. La CCF (60 % de acetato de etilo/heptano) mostro la completitud de la reaccion despues de 16 h. El residuo se diluyo con DCM (2,5 litros) y se extrajo con agua (1 X 1,5 ml), seguido de solucion saturada de bicarbonato sodico (1 X 1,5 ml) y salmuera (1 X 1,5 ml). La mezcla se seco entonces sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se evaporo a vacfo. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (gradiente de 5 % de acetato de etilo en heptano) y dio 124,0 gramos de producto de ester bencflico-anhidro-celobiosa DCBB (rendimiento del 50 %).
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 1. Preparacion de BModl, levulinacion del monomero B1
Se cargo un reactor de 100 l con 7,207 kg del monomero B1 (21,3 moles, 1 equiv), 20 l de tetrahidrofurano (THF) seco y se agito hasta disolverse. Cuando fue clara, se purgo con nitrogeno y se cargaron 260 g de dimetilaminopiridina (DMAP, 2,13 moles, 0,1 equiv) y 11,05 l de diisopropiletilamina (DIPEA, 8,275 kg, 63,9 moles, 3 equiv) en el reactor. El reactor se enfrio a 10-15 °C y se transfirieron 13,7 kg de anhfdrido levulfnico (63,9 moles, 3 equiv) al reactor. Cuando la adicion se completo, la reaccion se calento a temperatura ambiente y se agito durante la noche o 12-16 horas. La completitud de la reaccion se monitorizo por CCF (40:60 de acetato de etilo/hexano) y HPLC. Cuando la reaccion se completo, se transfirieron 20 l de 10 % de acido cftrico, 10 l de agua y 25 l de acetato de etilo al reactor. La mezcla se agito durante 30 min y las capas se separaron. La fase organica (capa de EtOAc) se extrajo con 20 l de agua, 20 l de 5 % de bicarbonato sodico y 20 l de soluciones al 25 % de salmuera. La solucion de acetato de etilo se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C) y se seco durante la noche. El rendimiento del jarabe aislado de BMod1 fue del 100 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 2. Preparacion de BMod2, hidrolisis por TFA de BModl
Se cargo un reactor de 100 l con 9,296 kg del monomero B1 de 4-Lev (BMod1) (21,3 moles, 1 equiv). El enfriador del reactor se giro a < 5 °C y la agitacion empezo, despues de lo cual se transfirieron 17,6 l de solucion al 90 % de TFA (TFA, 213 moles, 10 equiv) al reactor. Cuando la adicion se completo, la reaccion se monitorizo por CCF y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 2-3 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, el reactor se enfrio y se transfirieron 26,72 l de trietilamina (TEA, 19,4 kg, 191,7 moles, 0,9 equiv) al reactor. Se transfirieron 20 l de agua y 20 l de acetato de etilo adicionales al reactor. Este se agito durante 30 min y las capas se separaron. La fase organica se extrajo (capa de EtOAc) con 20 l de 5 % de bicarbonato sodico y 20 l de soluciones al 25 % de salmuera. La solucion de acetato de etilo se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El producto en bruto se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 50:50, 80:20 (EtOAc/heptano), 100 % de EtOAc, 5:95, 10:90 (MeOH/EtOAc). Las fracciones puras se reunieron y se evaporaron dando un jarabe. El rendimiento del jarabe aislado, BMod2 fue del 90 %.
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Sfntesis del dfmero BA - Etapa 3. Preparacion de BMod3, sililacion de BMod2
Se cargo un reactor de 100 l con 6,755 kg del monomero B1 de 4-Lev-1,2-DiOH (BMod2) (17,04 moles, 1 equiv), 2328 g de imidazol (34,2 moles, 2 equiv) y 30 l de diclorometano. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a - 20 °C, entonces se transfirieron 5,22 l de ferc-butildifenilcloro-silano (TBDPS-Cl, 5,607 kg, 20,4 moles, 1,2 equiv) al reactor. Cuando se completo la adicion, el enfriador se apago y la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La reaccion se monitorizo por CCF (40 % de acetato de etilo/hexano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 3 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, se transfirieron 20 l de agua y 10 l de DCM al reactor y se agito durante 30 min, despues de lo cual se separaron las capas. La fase organica (capa de DCM) se extrajo con 20 l de agua y 20 l de soluciones al 25 % de salmuera. Se seco la solucion de diclorometano en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El rendimiento de BMod3 fue aproximadamente del 80 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 4. Preparacion de BMod4, benzoilacion
Se cargo un reactor de 100 l con 8,113 kg del monomero B1 de 4-Lev-1-Si-2-OH (BMod3) (12,78 moles, 1 equiv), 9 l de piridina y 30 l de diclorometano. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a -20 °C, despues de lo cual se transfirieron 1,78 l de cloruro de benzoflo (2155 g, 15,34 moles, 1,2 equiv) al reactor. Cuando se completo la adicion, la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La reaccion se monitorizo por CCF (40 % de acetato de etilo/heptano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 3 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, se transfirieron 20 l de agua y 10 l de DCM al reactor y se agito durante 30 min, despues de lo cual las capas se separaron. La fase organica (capa de DCM) se extrajo con 20 l de agua y 20 l de soluciones al 25 % de salmuera. La solucion de DCM se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El jarabe aislado BMod4 se obtuvo con un rendimiento del 91 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 5. Preparacion de BMod5, desililacion
Se cargo un reactor de 100 l con 8,601 kg del monomero B1 de 4-Lev-1-Si-2-Bz (BMod4) (11,64 moles, 1 equiv) en 30 l de tetrahidrofurano. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a 0 °C, despues de lo cual se transfirieron 5,49 kg de fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF, 17,4 moles, 1,5 equiv) y 996 ml (1045 g, 17,4 moles, 1,5 equiv) de acido acetico glacial al reactor. Cuando se completo la adicion, la reaccion se agito a temperatura ambiente. La reaccion se monitorizo por CCF (40:60 de acetato de etilo/hexano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 6 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, se transfirieron 20 l de agua y 10 l de DCM al reactor y se agito durante 30 min, despues de lo cual se separaron las capas. La fase organica (capa de DCM) se extrajo con 20 l de agua y 20 l de soluciones al 25 % de salmuera. La solucion de diclorometano se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El producto en bruto se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 (EtOAc/heptano) y 200 l de 100 % de EtOAc. Se reunieron las fracciones puras y se evaporaron dando un jarabe. El producto intermedio BMod5 se aislo como un jarabe con un rendimiento del 91 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 6: Preparacion de BMod6, formacion de TCA
Se cargo un reactor de 100 l con 5,238 kg del monomero B1 de 4-Lev-1-OH-2-Bz (BMod5) (10,44 moles, 1 equiv) en 30 l de DCM. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a 10-15 °C, despues de lo cual se transfirieron 780 ml de diazabicicloundeceno (DBU, 795 g, 5,22 moles, 0,5 equiv) y 10,47 l de tricloroacetonitrilo (TCA, 15,08 kg, 104,4 moles, 10 equiv) al reactor. La agitacion continuo y la reaccion se mantuvo bajo una atmosfera de nitrogeno. Despues de la adicion de reactivo, la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La reaccion se monitorizo por HPLC y CCF (40:60 de acetato de etilo/heptano). La reaccion necesito aproximadamente 2 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, se transfirieron 20 l de agua y 10 l de diclorometano al reactor. Este se agito durante 30 min y se separaron las capas. La fase organica (capa de DCM) se separo con 20 l de agua y 20 l de soluciones al 25 % de salmuera. La solucion de diclorometano se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El producto en bruto se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 y 50:50 (EtOAc/heptano). Se reunieron las fracciones puras y se evaporaron dando un jarabe. El rendimiento aislado de BMod6 fue del 73 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 7. Preparacion de AModl, acetilacion del monomero A2
Se cargo un reactor de 100 l con 6,772 kg del monomero A2 (17,04 moles, 1 eq.), 32,2 l (34,8 kg, 340,8 moles, 20 eq.) de anhfdrido acetico y 32 l de diclorometano. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a -20 °C. Cuando la temperatura alcanzo -20 °C, se transfirieron 3,24 l (3,63 kg, 25,68 moles, 1,5 equiv) de trifluoruro de boro-eterato (BF3.Et2O) al reactor. Despues de la adicion completa de trifluoruro de boro-eterato, la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La completitud de la reaccion se monitorizo por HPLC y CCF (30:70 de acetato de etilo/heptano). La reaccion necesito aproximadamente 3-5 horas para completarse. Cuando la reaccion se completo, se realizo extraccion con 3x15 l de 10 % de bicarbonato sodico y 20 l de agua. La fase organica (DCM) se evaporo
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dando un jarabe (temp. del bano 40 °C) y se dejo secar durante la noche. El jarabe se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 y 50:50 (EtOAc/heptano). Se reunieron las fracciones puras y se evaporaron dando un jarabe. El rendimiento aislado de AMod1 fue del 83 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 8. Preparacion de AMod3, 1-metilacion de AModl
Se cargo un reactor de 100 l con 5891 g de monomero A2 de acetilo (AMod1) (13,98 moles, 1 eq.) en 32 l de diclorometano. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a 0 °C, despues de lo cual se transfirieran 2598 ml de yoduro de trimetilsililo (TMSI, 3636 g, 18 moles, 1,3 equiv) al reactor. Cuando se completo la adicion, la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La completitud de la reaccion se monitorizo por HPLC y CCF (30:70 de acetato de etilo/heptano). La reaccion necesito aproximadamente 2-4 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, la mezcla se diluyo con 20 l de tolueno. La solucion se evaporo dando un jarabe y se co- evaporo con 3 x 6 l de tolueno. El reactor se cargo con 36 l de diclorometano (DCM), 3,2 kg de tamices moleculares de 4A secos, 15505 g (42 moles, 3 equiv) de yoduro de tetrabutilamonio (TBAI) y 9 l de metanol seco. Esta se agito hasta que el TBAI se disolvio completamente, despues de lo cual se transfirieron 3630 ml de diisopropil-etilamina (DIPEA, 2712 g, 21 moles, 1,5 equiv) al reactor en una porcion. La completitud de la reaccion se monitorizo por HPLC y CCF (30:70 de acetato de etilo/heptano). La reaccion necesito aproximadamente 16 horas para completarse. Cuando la reaccion se completo, los tamices moleculares se eliminaron por filtracion. Se anadieron 20 l de EtOAc y se extrajeron con 4x20 l de 25 % de tiosulfato de sodio y 20 l de soluciones al 10 % de NaCl. La fase organica se separo y se seco con 8-12 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El producto en bruto se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 5:95, 10:90, 20:80, 30:70 y 40:60 (EtOAc/heptano). Las fracciones puras se reunieron y se evaporaron dando el producto intermedio AMod3 como un jarabe. El rendimiento aislado fue del 75 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 9. Preparacion de AMod4, desacetilacion de AMod3
Se cargo un reactor de 100 l con 4128 g del monomero A2 de 1-metil-4,6-diacetilo (AMod3) (10,5 moles, 1 equiv) y 18 l de metanol seco y se disolvio, despues de lo cual se transfirieron 113,4 g (2,1 moles, 0,2 equiv) de metoxido de sodio al reactor. La reaccion se agito a temperatura ambiente y se monitorizo por CCF (40 % de acetato de etilo/hexano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 2-4 horas para completarse. Cuando la reaccion se completo, se anadio la resina cationica Dowex 50W x 8 en porciones pequenas hasta que el pH alcanzo 6-8. Se filtro la resina Dowex 50W x 8 y la solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El jarabe se diluyo con 10 l de acetato de etilo y se extrajo con 20 l de salmuera y 20 l de agua. La solucion de acetato de etilo se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C) y se seco durante la noche a la misma temperatura. El rendimiento aislado del jarabe AMod4 fue aproximadamente del 88 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 10. Preparacion de AMod5, 6-benzoilacion
Se cargo un reactor de 100 l con 2858 g del monomero A2 de metil-4,6-diOH (AMod4) (9,24 moles, 1 equiv) y se co- evaporo con 3 x 10 l de piridina. Cuando se completo la evaporacion, se transfirieron 15 l de diclorometano, 6 l de piridina al reactor y se disolvieron. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a -40 °C. El reactor se cargo con 1044 ml (1299 g, 9,24 moles, 1 equiv) de cloruro de benzoflo. Cuando se completo la adicion, la reaccion se dejo calentar a -10 °C durante un periodo de 2 horas. La reaccion se monitorizo por CCF (60 % de acetato de etilo/hexano). Cuando la reaccion se completo, la solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). Este se co-evaporo con 3x15 l de tolueno. El jarabe se diluyo con 40 l de acetato de etilo. La extraccion se llevo a cabo con 20 l de agua y 20 l de solucion de salmuera. La solucion de acetato de etilo se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El producto en bruto se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 5:95, 10:90, 20:80, 25:70 y 30:60 (EtOAc/heptano). Las fracciones puras se reunieron y se evaporaron dando un jarabe. El rendimiento aislado del producto intermedio AMod5 fue del 84 %.
Etapa 11: Cristalizacion de AMod5.
Se disolvio el solido en bruto (10 gramos) de AMod5 en 500 ml de heptano a 50 - 60 °C. La solucion se enfrio a temperatura ambiente y se dejo reposar durante 16 horas a esta temperatura. El cristal blanco resultante se aislo por filtracion dando 9,10 gramos (92 %).
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 11. Preparacion de BA1, acoplamiento de Amod5 con BMod6
Se cargo un reactor de 100 l con 3054 g del monomero A2 de metil-4-hidroxi- (AMod5) de la etapa 10 (7,38 moles, 1 equiv) y 4764 g del monomero B1 de 4-Lev-1-TCA- (BMod6) de la etapa 6 (7,38 moles, 1 equiv). Los monomeros combinados se disolvieron en 20 l de tolueno y se co-evaporaron a 40 °C. La co-evaporacion se repitio con 2 x 20 l de tolueno adicionales, despues de lo cual se transfirieron 30 l de diclorometano (DCM) al reactor y se disolvieron. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio por debajo de -20 °C. Cuando la temperatura estuvo entre -20 °C y -40 °C,
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se transfirieron 1572 g (1404 ml, 11,12 moles, 1,5 equiv) de trifluoruro de boro-eterato (BF3.Et2O) al reactor. Despues de la adicion completa de trifluoruro de boro-eterato, la reaccion se dejo calentar a 0 °C y la agitacion continuo. La completitud de la reaccion se monitorizo por HPLC y CCF (40:70 de acetato de etilo/heptano). La reaccion requirio 3-4 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, se transfirieron 926 ml (672 g, 6,64 moles, 0,9 equiv) de trietilamina (TEA) a la mezcla y se agito durante 30 minutos adicionales, despues de lo cual se transfirieron 20 l de agua y 10 l de diclorometano al reactor. La solucion se agito durante 30 min y las capas se separaron. La fase organica (capa de DCM) se separo con 2 x 20 l de agua y 20 l de solucion al 25 % de 4:1 de cloruro sodico/bicarbonato sodico. La solucion de diclorometano se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C) y se uso en la siguiente etapa. El rendimiento aislado del disacarido BA1 fue aproximadamente del 72 %.
Sfntesis del dfmero BA - Etapa 12, eliminacion de levulinato ([(2-O-benzoil-3-O-bencil-a-l-idopiranosiluronato de metilo)-(1^4)-2-azido-6-O-benzoil-3-O-bencil]-2-desoxi-a-D-glucopiran6sido de metilo)
Se cargo un reactor de 100 l con 4,104 kg del dfmero BA de 4-Lev (BA1) (4,56 moles, 1 equiv) en 20 l de THF. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a -20 a -25 °C, despues de lo cual se transfirieron 896 ml de hidrato de hidracina (923 g, 18,24 moles, 4 equiv) al reactor. La agitacion continuo y la reaccion se monitorizo por CCF (40 % de acetato de etilo/heptano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 2-3 horas para la completitud, despues de lo cual se transfirieron 20 l de 10 % de acido cftrico, 10 l de agua y 25 l de acetato de etilo al reactor. Esta se agito durante 30 min y las capas se separaron. La fase organica (capa de EtOAc) se extrajo con 20 l de soluciones al 25 % de salmuera. La solucion de acetato de etilo se seco en 4-6 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El producto en bruto se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 10:90, 20:80, 30:70, 40:60 y 50:50 (EtOAc/heptano). Se reunieron las fracciones puras y se evaporaron a sequedad. El rendimiento aislado del dfmero BA fue del 82 %. Formula: C42H43N3O13; Peso mol. 797,80.
Sfntesis del trfmero EDC - Etapa 1. Preparacion de EModl, acetilacion
Se cargo un reactor de 100 l con 16533 g del monomero E (45 moles, 1 eq.), 21,25 l de anhfdrido acetico (225 moles, 5 eq.) y 60 l de diclorometano. El reactor se purgo con nitrogeno y se enfrio a -10 °C. Cuando la temperatura fue a -10 °C, se transfirieron 1,14 l (1277 g) de trifluoruro de boro-eterato (BF3.Et2O, 9,0 moles, 0,2 eq) al reactor. Despues de la adicion completa de trifluoruro de boro-eterato, la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La completitud de la reaccion se monitorizo por CCF (30:70 de acetato de etilo/heptano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 3-6 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, la mezcla se extrajo con 3x50 l de 10 % de bicarbonato sodico y 50 l de agua. La fase organica (DCM) se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C) y se dejo secar durante la noche. El rendimiento aislado de EMod1 fue del 97 %.
Sfntesis del trfmero EDC - Etapa 2. Preparacion de EMod2, desacetilacion de azidoglucosa
Se cargo un reactor de 100 l con 21016 g de monomero E de 1,6-diacetilo (EMod1) (45 moles, 1 eq.), 5434 g de acetato de hidracina (NH2NH2.HOAc, 24,75 moles, 0,55 eq.) y 50 l de DMF (dimetilformamida). La solucion se agito a temperatura ambiente y la reaccion se monitorizo por CCF (30 % de acetato de etilo/hexano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 2-4 horas para completarse. Cuando la reaccion se completo, se transfirieron 50 l de diclorometano y 40 l de agua al reactor. Esta se agito durante 30 minutos y las capas se separaron. Esta se extrajo con 40 l de agua adicionales y la fase organica se seco en 6-8 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C) y se seco durante la noche a la misma temperatura. El jarabe se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 20:80, 30:70, 40:60 y 50:50 (EtOAc/heptano). Se reunieron las fracciones puras y se evaporaron dando un jarabe. El rendimiento aislado de producto intermedio EMod2 fue del 100 %.
Sfntesis del trfmero EDC - Etapa 3. Preparacion de EMod3, formacion de 1-TCA
Se cargo un reactor de 100 l con 12752 g del monomero E de 1 -hidroxi (EMod2) (30 moles, 1 eq.) en 40 l de diclorometano. El reactor se purgo con nitrogeno y empezo la agitacion, despues de lo cual se transfirieron 2,25 l de DBU (15 moles, 0,5eq.) y 15,13 l de tricloroacetonitrilo (150,9 moles, 5,03 eq) al reactor. La agitacion continuo y la reaccion se mantuvo bajo nitrogeno. Despues de la adicion de reactivo, la reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La reaccion se monitorizo por CCF (30:70 de acetato de etilo/heptano) y HPLC. La reaccion necesito aproximadamente 2-3 horas para alcanzar la completitud. Cuando la reaccion se completo, se cargaron 40 l de agua y 20 l de DCM al reactor. Este se agito durante 30 min y las capas se separaron. La fase organica (capa de DCM) se extrajo con 40 l de agua y la solucion de DCM se seco en 6-8 kg de sulfato de sodio anhidro. La solucion se evaporo dando un jarabe (temp. del bano 40 °C). El producto en bruto se purifico en una columna de sflice de 200 l usando 140-200 l de cada uno de los siguientes perfiles de gradiente: 10:90 (DCM/EtOAc/heptano), 20:5:75 (DCM/EtOAc/heptano) y 20:10:70 (DCM/EtOAc/heptano). Se reunieron las fracciones puras y se evaporaron dando el producto intermedio EMod3 como un jarabe. El rendimiento aislado fue del 53 %.
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Sfntesis del trfmero EDC-CB - Etapa 4. (Glucosilacion) Acoplamiento de E-TCA con el elemento estructural de DC
Se disolvieron 118,0 gramos (174,64 mmoles, 1 eq) de DCBB y 299,60 gramos (523,92 mmoles, 3 eq) de E-Mod 3 en 250 ml de tolueno y se evaporaron a sequedad. El jarabe resultante se co-evaporo con tolueno (3 X 300 ml) a sequedad y se puso a vacfo durante 2 horas. Entonces se disolvio el jarabe secado en 1180 ml de diclorometano secado, y se enfrio a -40,0 °C. Entonces se anadieron 23,08 gramos (87,32 mmoles, 0,5 eq) de triflato de trietilsililo (TES-triflato) mientras que se mantenfa la temperatura entre -40,0 °C y -25,0 °C. Cuando se completo la adicion, la mezcla de reaccion se calento inmediatamente hasta temperatura ambiente y se agito durante 2 horas bajo atmosfera de argon. La CCF (35 % de acetato de etilo/heptano) indico que la reaccion se habfa completado. La mezcla de reaccion se enfrio a 0 °C y se extinguio con 15,91 gramos (158 mmoles, 0,9 eq/triflato de TES) de trietilamina (TEA), se agito durante 30 min adicionales. Se anadio agua (180 ml) y la reaccion se extrajo con 150 ml adicionales de diclorometano. La fase organica se extrajo con una solucion al 25 % (4:1) de cloruro sodico/bicarbonato sodico (2 X 180 ml), se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se evaporo a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (gradiente de 5 % de acetato de etilo en heptano) como espuma blanca de trfmero EDC-CB (122 g, 65 %).
Modificacion del trfmero EDC-CB.
Etapa: 1 Formacion de EDC-1-C: Apertura del anillo de anhidro y acetilacion
6-O-acetil-2-azido-2-desoxi-3,4-di-O-bencil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-[bencil-2,3-O-dibencil-p-D-
glucopiranosiluronato]-(1^4)-O-2-azido-2-desoxi-1,3,6-tri-O-acetil-p-D-glucopiranosa
Se disolvieron 122,0 gramos (112,43 mmoles, 1 eq) del trfmero EDC-CB en diclorometano seco y se anadieron 307,45 ml (3372,90 mmoles, 30 eq) de anhfdrido acetico. La solucion se enfrio a -45 a -35 °C y se anadieron lentamente 118,20 ml (899,44 mmoles, 8 eq) de trifluoruro de boro-eterato. Tras completarse de adicion, la mezcla de reaccion se calento a temperatura ambiente y se agito durante 6 horas hasta que la reaccion se completo por CCF (35 % de acetato de etilo/heptano). La mezcla de reaccion se enfrio a -10 °C y se extinguio cuidadosamente con solucion saturada de bicarbonato sodico y se agito durante 1 h adicional. Entonces, la mezcla se extrajo con 2 litros adicionales de diclorometano. La fase organica se extrajo con salmuera (1 x 1,5 litros), se seco sobre sulfato de sodio anhidro y se concentro a vacfo dando un jarabe. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (10 % de gradiente acetato de etilo en heptano) como espuma blanca de EDC-1-CB (86 gramos, 65 %).
Etapa: 2 Preparacion de EDC-2-CB: Desacetilacion
6-O-acetil-2-azido-2-desoxi-3,4-di-O-bencil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-[bencil-2,3-O-dibencil-p-D-
glucopiranosiluronato]-(1^-4)-O-2-azido-2-desoxi-3,6-di-O-acetil-p-D-glucopiranosa
Se disolvieron 86 gramos (72,44 mmoles, 1 eq) de EDC-1-CB en 360 ml de tetrahidrofurano (THF) seco y se enfrio a 5 - 10 °C. Entonces, se anadieron lentamente 77,62 gramos (724,39 mmoles, 10 eq) de bencilamina mientras que se mantenfa la temperatura de reaccion por debajo de 15 °C. La mezcla de reaccion se agito durante 4 horas. La CCF (40 % de acetato de etilo/heptano) indico que la reaccion se habfa completado. La mezcla de reaccion se diluyo con 1 litro de acetato de etilo y se extrajo con solucion al 10 % de acido cftrico (2 X 300 ml). La fase organica se extrajo entonces con solucion saturada de bicarbonato sodico (1 X 200 ml), salmuera (1X 200 ml) y agua (1X 200 ml). La fase organica se seco usando sulfato de sodio anhidro y se evaporo a sequedad. El residuo se purifico por cromatograffa en columna de gel de sflice (gradiente de 60 % de acetato de etilo en heptano) como espuma blanca de EDC-2-CB (52 gramos, 62 %).
Etapa: 3 Formacion de EDC-3-CB: Formacion de derivado de TCA
6-O-acetil-2-azido-2-desoxi-3,4-di-O-bencil-a-D-glucopiranosil-(1^-4)-O-[bencil-2,3-O-dibencil-p-D-
glucopiranosiluronato]-(1^-4)-O-2-azido-2-desoxi-3,6-di-O-acetil-1-O-tricloroacetimidoil-p-D-glucopiranosa
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A 52,0 gramos (45,40 mmoles, 1 eq) de EDC-2-CB en 300 ml de diclorometano (DCM) seco se anadieron 126,10 ml (899,43 mmoles, 20 eq) de tricloroacetonitrilo (TCA). La solucion se enfrio a 0° - 5° C y se anadieron 3,36 ml (22,49 mmoles, 0,5 eq) de diazabicicloundeceno (DBU). La mezcla de reaccion se dejo calentar a 10 °C y se agito durante 3 horas o hasta que la reaccion se completo. La mezcla de reaccion se diluyo con 150 ml de agua y se extrajo con la adicion de 250 ml de diclorometano. La fase organica se seco con sulfato de sodio anhidro, se filtro y se concentro a sequedad y se co-evaporo con tolueno (2 X 100 ml) dando un jarabe. La separacion en columna cromatografica usando gel de sflice y 5 - 50 % de acetato de etilo/heptano dio 46 gramos (78 %) de EDC-3-CB.
Sfntesis del pentamero EDCBA-CB: Acoplamiento de EDC-3-CB con el dfmero BA
O-6-O-acetil-2-azido-2-desoxi-3,4-di-O-bencil-a-D-glucopiranosil)-(1^-4)-O-[bencil-2,3-O-dibencil-p-D- glucopiranosiluronato]-(1^4)-O-2-azido-2-desoxi-3,6-di-O-acetil-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-[2-O-benzoil-3-O- bencil-a-l-idopiranosiluronato de metilo]-(1^4)-2-azido-6-O-benzoil-3-O-bencil-2-desoxi-a-D-glucopiran6sido de metilo
Se evaporo a sequedad una solucion de 46,0 gramos (35,67 mmoles, 1 eq) de EDC-3-CB y 56,92 gramos (74,34 mmoles, 2 eq) de dfmero BA en 200 ml de tolueno. El jarabe resultante se co-evaporo con (2 x 300 ml) adicionales de tolueno. El jarabe secado se disolvio entonces en 185 ml de diclorometano (DCM) seco y se enfrio a -40 °C. La mezcla de reaccion se anadio lentamente a 9,43 gramos (35,68 mmoles, 0,5 eq) de triflato de trietilsililo (triflato de TES). Cuando se completo la adicion, la reaccion se calento a temperatura ambiente y se agito durante 2 horas bajo atmosfera de argon. La reaccion se considero completa por CCF (45 % de acetato de etilo/heptano). La mezcla de reaccion se enfrio a 0 - 5 °C y se extinguio anadiendo lentamente 4,33 gramos (42,81 mmoles, 5,55 ml, 1,2 eq) de trietilamina (TEA). La mezcla de reaccion se extrajo con 185 ml de agua y 100 ml de diclorometano. La fase organica se extrajo entonces con 25 % (4:1) de bicarbonato sodico saturado y solucion de salmuera (2 X 150 ml), se seco sobre sulfato de sodio anhidro, se filtro y se evaporo a sequedad. La separacion en columna cromatografica usando gel de sflice y 5-50 % de acetato de etilo/heptano dio 49,0 gramos (71 %) de pentamero completamente protegido EDCBA-CB [tambien denominado pentamero completamente protegido, FPP] como forma blanca.
Conversion de FPP en fondaparinux sodico mediante celobiosa con Obn en C-2 del anillo D)
Etapa: 1 Preparacion de API-1-CB: Saponificacion del pentamero EDCBA-CB
Sal de disodio de O-2-azido-2-desoxi-3,4-di-O-bencil-a-D-glucopiranosil-(1^-4)-O-2,3-O-dibencil-p-D-
glucopiranosiluronosil-(1^4)-O-2-azido-2-desoxi-a-D-glucopiranosil-(1^-4)-O-3-O-bencil-a-l-idopiranosiluronosil- (1^4)-2-azido-3-O-bencil-2-desoxi-a-D-glucopiran6sido de metilo
A una solucion de 43,6 gramos (22,65 mmoles, 1 eq) del pentamero EDCBA-CB en 523 ml de dioxano y 785 ml de tetrahidrofurano (THF) se anadieron 872 ml de solucion de hidroxido de litio 0,7 M (0,610 mmoles, 27 eq), seguido de 102 ml (1,0 mol, 44 eq) de 30 % de peroxido de hidrogeno. La mezcla de reaccion se agito durante 16 horas. Entonces, se anadieron 193 ml (0,77 moles, 34 eq) de solucion de hidroxido sodico 4 N. La reaccion se dejo con agitacion durante 24-48 horas adicionales. La mezcla de reaccion se extrajo entonces con 1,5 litros de acetato de etilo. La fase organica se extrajo con 900 ml de solucion de salmuera y se seco con sulfato de sodio anhidro. Evaporacion del disolvente a vacfo y co-evaporacion con tolueno (1 X 395 ml) para dar el jarabe de API-1-CB. El producto en bruto se uso para la siguiente etapa sin mas purificacion.
Etapa: 2 Preparacion de API-2-CB: O-Sulfonacion de API-1-CB:
O-2-azido-2-desoxi-3,4-di-O-bencil-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1^-4)-O-2,3-O-dibencil -p-D-glucopiranosiluronosil- (1^4)-O-2-azido-2-desoxi-3,6-di-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-3-O-bencil-2-O-sulfo-a-l-idopiranuronosil- (1^4)-2-azido-2-desoxi-6-O-sulfo-a-D-glucopiran6sido de metilo, sal de heptasodio
Se disolvio el producto en bruto 39,6 gramos (26,64 mmoles, 1 eq) de API-1-CB obtenido en la etapa previa 1 en 1,0 litro de dimetilformamida (DMF) seca. A esta se anadio una solucion previamente preparada que contenfa 211,68 gramos (1,33 moles, 50 eq) del complejo trioxido de azufre-piridina en 205 ml de piridina y 512 ml de dimetilformamida (DMF). La mezcla de reaccion se calento a 60 °C durante 45 minutos adicionales. Despues de agitar 2 horas a 60 °C, la reaccion se enfrio a 20 °C y se inactivo en 3 litros de solucion al 8 % de bicarbonato sodico que se mantuvo a 10 °C. El pH de la mezcla extinguida se mantuvo a pH 7 - 9 mediante la adicion de solucion de bicarbonato sodico. La mezcla extinguida se agito durante 16 horas. Cuando el pH se estabilizo por encima de ~7, la solucion se diluyo con agua y la mezcla resultante se purifico usando una columna de HPLC preparativa cargada con Amberchrom CG161-M y se eluyo con 90 % - 10 % de metanol/solucion acuosa. La fraccion pura se concentro a vacfo dando un solido blanco, 39,0 gramos de API-2-CB (rendimiento del 84,4 % en 2 etapas).
Etapa: 3 Preparacion de API-3-CB: Hidrogenacion
O-2-amino-2-desoxi-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-2-O-hidroxil-p-D-glucopiranosiluronosil-(1^4)-O-2-amino-
2-desoxi-3,6-di-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-2-O-sulfo-a-l-idopiranuronosil-(1^4)-2-amino-2-desoxi-6-O-
5
10
15
20
25
30
35
sulfo-a-D-glucopiranosido de metilo, sal de heptasodio
Se trato una solucion de 39,0 gramos (19,13 mmoles) del pentasacarido O-sulfatado API-2-CB en metanol y agua con 30 % en peso de paladio en carbono activo bajo 100 psi de presion de hidrogeno a temperatura ambiente durante 24 h o hasta la completitud de la reaccion. La mezcla se concentro dando 26 g (95,67 %) de API-3-CB.
Se trato una solucion de 1581 g (0,78 moles) del pentasacarido O-sulfatado API2 en 38 l de metanol y 32 l de agua con 30 % en peso de paladio en carbono activo bajo 100 psi de presion de hidrogeno a 60-65 °C durante 60 horas o hasta la completitud de la reaccion. La mezcla se filtro entonces a traves de cartuchos de filtro de 1,0 p y 0,2 p y el disolvente se evaporo a vacfo dando 942 g (rendimiento del 80 %) de API3 [tambien denominado EDCBA(OSO3)5(NH2)3].
Preparacion de fondaparinux sodico - Etapa 4: N-Sulfatacion de API-3-CB:
O-2-desoxi-6-O-sulfo-2-(sulfoamino)-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-p-D-glucopiranuronosil-(1^-4)-O-2-desoxi-3,6-di-O- sulfo-2-(sulfoamino)-a-D-glucopiranosil-(1^4)-O-2-O-sulfo-a-l-idopiranuronosil-(1^4)-2-desoxi-6-O-sulfo-2- (sulfoamino)-a-D- glucopiranosido de metilo, sal de decasodio
A una solucion de 25,4 gramos (16,80 mmoles, 1 eq) de API-3-CB en 847 ml de agua se anadieron lentamente 66,85 gramos (446,88 mmoles, 25 eq) del complejo trioxido de azufre-piridina, manteniendo el pH de la mezcla de reaccion a pH 9-9,5 durante la adicion usando solucion 2 N de hidroxido sodico. La reaccion se dejo con agitacion durante 4 horas a pH 9,0 - 9,5. Cuando la reaccion se completo, el pH se ajusto a 7,0 usando 70 ml de 50 mmoles de solucion de acetato de amonio a pH ~3,5. La mezcla de celobiosa N-sulfatada resultante se purifico usando columna cromatografica de intercambio ionico, seguido de desalacion usando resina de exclusion de tamano para dar gramos (%) de la forma de fondaparinux sodico purificada.
A una solucion de 942 g (0,63 moles) de API3 en 46 l de agua se anadieron lentamente 3,25 kg (20,4 moles, 32 eq) del complejo trioxido de azufre-piridina, manteniendo el pH de la mezcla de reaccion a pH 9-9,5 durante la adicion usando solucion 2 N de hidroxido sodico. La reaccion se dejo con agitacion durante 4-6 horas a pH 9,0-9,5. Cuando la reaccion se completo, el pH se ajusto a pH 7,0 usando solucion 50 mM de acetato de amonio a pH 3,5. La mezcla de EDCBA(OSO3)5(NHSO3)3 N-sulfatada resultante se purifico usando columna cromatografica de intercambio ionico (columna Varian Preparative 15 cm HiQ), seguido de desalacion usando una resina de exclusion de tamano o filtracion en gel (Biorad G25). La mezcla resultante se trato entonces con carbon vegetal activo y se repitieron la purificacion por intercambio ionico y la desalacion dando 516 g (rendimiento del 47,6 %) de la forma de fondaparinux sodico purificada.
Claims (7)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un proceso para la preparacion de un precursor de pentasacarido heparfnico protegido para fondaparinux sodico que tiene la estructura
imagen1 que comprende la etapa de acoplar un trfmero EDC que tiene la estructuraimagen2 con un dfmero BA que tiene la estructuraimagen3 en el que el trfmero EDC se prepara usando una glucosilacion de Schmidt que comprende las etapas:(a) acoplar un monomero E que tiene la estructuraimagen4 con un elemento estructural de DC que tiene la estructuraimagen5 para obtener un precursor de EDC que tiene la estructura101520imagen6 (b) convertir el precursor de EDC en el trfmero EDC.5 2. Un proceso de preparacion del trfmero EDC que tiene la formulaimagen7 en el que el trfmero EDC se prepara usando una glucosilacion de Schmidt que comprende las etapas:(a) acoplar un monomero E que tiene la estructuraimagen8 con un elemento estructural de DC que tiene la estructuraimagen9 para obtener un precursor de EDC que tiene la estructuraimagen10 (b) convertir el precursor de EDC en el trfmero EDC.5101520253035 - 3. Un proceso de preparacion del elemento estructural de DC que tiene la formula
imagen11 donde el elemento estructural de DC se prepara a partir de 1,6-anhidrocelobiosa que tiene la estructuraimagen12 que comprende al menos cuatro de las siguientes etapas:(a) proteger 1,6-anhidrocelobiosa para formar CB1 que tiene la estructuraimagen13 (b) tosilar CB1 para formar CB2 que tiene la estructuraimagen14 (c) hacer reaccionar CB2 con base para formar CB3 que tiene la estructuraimagen15 (d) proteger CB3 para formar CB4 que tiene la estructuraimagen16 (e) hacer reaccionar CB4 con azida para formar CB5 que tiene la estructura-oimagen17 (f) acetilar CB5 para formar CB6 que tiene la estructuraimagen18 5101520253035(g) deproteger CB6 para formar CB7 que tiene la estructuraimagen19 (h) oxidar CB7 para formar CB8 que tiene la estructuraimagen20 y(i) bencilar CB8 para formar el dfmero DC. - 4. El proceso de la reivindicacion 3, en el que el proceso incluye al menos seis etapas de las etapas (a) - (i).
- 5. El proceso de la reivindicacion 3, en el que el proceso incluye todas de las etapas (a) - (i).
- 6. El proceso de la reivindicacion 1, en el que el dfmero BA se prepara usando una glucosilacion de Schmidt quecomprende la etapa de acoplar un monomero B que tiene la estructura
imagen21 donde Lev es levulinilo, Bn es bencilo, Bz es benzoflo y TCA es tricloroacetimidato, con un monomero A que tiene la estructuraimagen22 para formar el dfmero BA. - 7. El proceso de la reivindicacion 1, que comprende ademas convertir el compuesto de formula
imagen23 en fondaparinux sodico. - 8. El proceso de la reivindicacion 2, que comprende ademas(c) acoplar el compuesto trfmero EDC de formula
imagen24 con un dfmero BA que tiene la estructura5imagen25 para formar un compuesto que tiene la estructuraimagen26 10y(c) convertir el compuesto de formulaimagen27 15en fondaparinux sodico.
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