CN108794653B - 岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有通式Q结构的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇，各取代基基团的定义详见说明书；以硫酸软骨素A盐为原料，依次经过酸解、保护基操作、糖基化，利用多功能基的分子作为分子骨架，合成该糖簇化合物。利用其糖簇效应，可以模拟天然糖胺聚糖的活性，其结构的确定性使其能够应用到医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，更具体地说，涉及一种岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇及其制备方法、关键中间体，和该多价簇化合物的应用。
背景技术
岩藻糖基化硫酸软骨素是一类从海参中提取得到的糖胺聚糖，其结构以硫酸软骨素为骨架，同时在醛酸糖的3-位连有岩藻糖分支，并具有不同程度的硫酸化，由此组成三糖重复单元(J.Biol.Chem.1988,263,18176)。
岩藻糖基化硫酸软骨素具有抗凝血、抗炎、抗HIV、创伤修复等生物学功能(Carbohydr.Polym.2014,112,173)。其中抗凝血活性具有与肝素类药物不同的机制，大大减小了出血风险(P Natl Acad Sci USA,2015,112,8284)，并且口服有效(Thromb.Haemostasis,2006,96,822)，因而具有较大的发展前景与研究价值。
天然提取的聚糖具有血小板减少的副作用，为了解决该问题，发展了多种降解聚糖的方法，包括自由基降解(Food.Chem,2010,122,716)、光化学降解(J.Biol.Chem,2014,289,28284)、β-消除降解(Carbohydr.Polym,2015,127,427)等，保留其抗凝血活性的同时，减少了聚糖的副作用。但是由于提取或者降解方法得到的寡糖具有微观不均一性，且存在污染的风险，因而在质量控制方面难以达到临床用药的要求，大大限制了其成药的转化。因此，通过合成的方法获取有明确结构且纯度较高的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖，是进行更深层次的生物学与药化研究的唯一有效方法。
现有技术中，以葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖和岩藻糖为原料，通过常规的保护基操作和糖基化进行寡糖的组装，合成岩藻糖基化硫酸软骨素三糖，从糖砌块算起共16步反应，总收率0.95％(Tetrahedron.Lett,2013,54,3940)，尚有很大优化的空间；以软骨素聚糖为原料，通过岩藻糖基化半合成得到类天然聚糖，但其结构仍存在不确定性(Biomacromolecules,2015,16,2237)。因此，开发新的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖的化学合成方法具有重要意义。
此外，研究表明岩藻糖基化硫酸软骨素的抗凝血活性与其分子量大小正相关(J.Biol,Chem,2014,289,28284)，并且岩藻糖侧链的硫酸化模式显著影响其活性，研究表明以岩藻糖侧链2,4-O-硫酸化结构的抗凝血活性最好(Carbohydr.Polym,2011,83,688)。但是目前所有的研究结果均是基于提取或者降解方法得到的寡糖，其结构具有微观不均一性，因而无法得出确切的结论和明确的构效关系。
将合成来源的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖组装成结构明确的多价物，可以根据需要调整其硫酸化模式，探究不同硫酸化模式对其抗凝血活性的影响；并且便于通过更改骨架改变糖簇价数，从而调整糖簇分子量大小，对于促进岩藻糖基化硫酸软骨素的药化研究具有重要意义。
发明内容：
本发明人以较廉价的硫酸软骨素A盐为原料，通过酸解获得软骨素骨架二糖、化学修饰得到岩藻糖基化硫酸软骨素三糖，同时，制备了具有抗凝血活性的糖簇化合物，克服了现有技术存在的不足。
本发明的第一个目的是提供一种岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇。
本发明的第二个目的是提供上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的制备方法。
本发明的第三个目的提供上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的中间体化合物。
本发明的第四个目的是提供包含上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的药物组合物。
本发明的第五个目的是提供上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的应用。
具体地说，在本发明的实施方案中，本发明的提供了一种如通式Q所示的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇：
其中，n为2-15的整数，优选地，n为2、3、4、6、8、9；
R4选自C1-C10脂肪族烷烃亚基，C1-C10脂肪族烯烃亚基，或-(CH2)m-(OCH2CH2)p-，这里m，p为1-10的整数；优选地，选自C1-C10脂肪族烷烃亚基；
T为三氮唑基，即如下基团
Y为糖簇的多官能团支架，即带有多个羟基的树枝状分子；优选地，选自下式中的一种：
R2选自氢、C1-C10脂肪族烷基、未取代的苯基或取代的苯基，更优选地，选自甲基；
R13、R14和R15各自独立地选自H、或-SO3Na。
在本发明的特别优选实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇，选自：
这里，Ac为乙酰基。
第二方面，在本发明的实施方案中，本发明的提供了上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，包括如下步骤：
(1)式A化合物(即硫酸软骨素M盐)在无机酸溶液中，加热水解得到式B化合物；其中，q为正整数；
(2)式B化合物在无机酸的醇R1OH溶液中进行酯化反应，得到式C化合物；
(3)采用酸酐R2-C(O)-O-C(O)-R2，在碱性条件下对式C化合物的氨基和其余的所有羟基进行酰化保护，得到式D化合物；
(4)式D化合物在酸催化下得到噁唑啉E；
(5)式E化合物在酸存在下，在有机溶剂中，与醇R3-R4-OH反应，得到式F化合物；
(6)式F化合物在酸或碱的R1OH溶液中，脱去式F化合物上所有O原子上的酰基，得到式G化合物；
(7)式G化合物在R5C(O)H或R5C(O)H缩二脂肪醇的存在下，在酸催化下选择性保护式G化合物的4,6二羟基，得到式H化合物；
(8)式H化合物在无机碱存在的条件下脱除羧酸酯基，得到式I化合物；
(9)式I化合物在酸酐R6-O-R6的作用下，环合得到式J化合物；
(10)式J化合物在碱的催化下，在R1OH溶液中打开内酯环，得到式K化合物；
(11)式K化合物在酸催化作用下，与岩藻糖供体式L化合物反应得到式M化合物；
(12)式M化合物在酸作用下脱除氨基半乳糖4,6-OH保护，然后选择性脱除保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8，或者保护基R7、R8和R9，得到式N化合物；
或者，式M化合物选择性脱除保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8，或者保护基R7、R8和R9；再在酸作用下脱除氨基半乳糖4,6-OH保护，得到式N化合物；
或者，式M化合物选择性脱除保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8；再与酰氯或酸酐反应，使得脱除R7、或R7和R9、或R7和R8后羟基被保护；然后选择性脱除R8和/或R9；最后，在酸作用下脱除氨基半乳糖4,6-OH保护，得到式N化合物；
(13)式N化合物经过硫酸化与脱保护操作得到式O化合物；
(14)式O化合物在Cu(I)即碘化亚铜或者硫酸铜/L-抗坏血酸钠催化下，与多分支骨架结构进行点击化学反应得到通式Q化合物；
在上述合成方法中，涉及化合物的取代基定义如下：
式Q化合物中，n为2-15的整数，优选地，n为2、3、4、6、8、9；
R4选自C1-C10脂肪族烷烃亚基，C1-C10脂肪族烯烃亚基，或-(CH2)m-(OCH2CH2)p-，这里m，p为1-10的整数；优选地，选自C1～C10脂肪族烷烃亚基；
T为三氮唑基即如下基团
Y为糖簇的多官能团支架，即带有多个羟基的树枝状分子；优选地，选自下式中的一种：
R1OH、式C-式H化合物、式K化合物、式M化合物和式N化合物中，R1选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R1选自甲基、乙基、烯丙基、苄基，4-甲氧基苄基，更优选地选自甲基、乙基、苄基；
R2-C(O)-O-C(O)-R2、式D-式K化合物、式M-式O化合物以及通式Q中，R2选自氢、C1-C10脂肪族烷基，未取代的苯基或取代的苯基，更优选地，选自甲基；
R3-R4-OH、式F-式K化合物、式M-式O化合物以及通式Q中，R4选自C1-C10脂肪族烷烃亚基，C1-C10脂肪族烯烃亚基，或-(CH2)m-(OCH2CH2)p-，这里m，p为1-10的整数；优选地，选自C1～C10脂肪族烷烃亚基；R3选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基(-CHO)、巯基；所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基，所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基；优选地，R3-R4-为N3-(CH2)6-；
R5C(O)H或R5C(O)H缩二脂肪醇(例如R5CH(OCH3)2)、式H-式K化合物以及式M化合物中，R5选自未取代的苯基或取代的苯基，这里，所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R5选自苯基，4-甲氧基苯基，4-氯代苯基、或4-溴代苯基，更优选地，选自苯基，或4-甲氧基苯基；
酸酐R6-O-R6、式J、式K、式M和式N化合物中，R6选自未取代的脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、正戊酰基、新戊酰基、正己酰基、乙酰丙酰基)；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代、所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R6选自乙酰基、苯甲酰基、乙酰丙酰基、4-氯代苯甲酰基、或4-溴代苯甲酰基，更优选地选自乙酰基、或苯甲酰基；
式L和式M化合物中，R7选自未取代苄基或者取代的苄基；所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，所述取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R7选自苄基或者对甲氧苄基；
式L和式M化合物中，R8和R9各自独立的选自未取代的脂肪族酰基或取代的脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基、未取代苄基或者取代的苄基。这里，所述未取代的脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、正戊酰基、新戊酰基、正己酰基、乙酰丙酰基)；所述未取代的脂肪族酰基是指未取代的脂肪族酰基上的氢被卤素、和/或C1-C4烷酰基所取代；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，这里的取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，这里的取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R8和R9各自独立的选自苄基、对甲氧苄基、乙酰丙酰基、或氯乙酰基；
式N化合物中，R10、R11和R12各自独立地为氢、未取代的脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述未取代的脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、正戊酰基、新戊酰基、正己酰基、乙酰丙酰基)；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，这里的取代基选自卤素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基)、C1-C4卤代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；优选地，R10选自乙酰基、苯甲酰基、乙酰丙酰基、4-氯代苯甲酰基、或4-溴代苯甲酰基；更优选地，R10、R11和R12各自独立地选自氢、乙酰基、或苯甲酰基；
式O-式Q化合物中，R13、R14和R15各自独立地选自H、或-SO3Na；
式A-式B中，M为钠，钾，锂或钙，优选地为钠。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(1)中，无机酸为盐酸或硫酸，作为优选，选用硫酸；所述无机酸的浓度选自0.1M到1M之间，优选地，选自0.5M硫酸溶液；反应温度优选100℃。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(2)中，无机酸为氯化氢、硫酸、硝酸或磷酸，优选地，为氯化氢或硫酸；醇R1OH中R1如上所述。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(3)中碱性条件下，指下列碱存在下:选自醋酸钠，吡啶，磷酸二氢钠，碳酸钾，或三乙胺或哌啶，优选地，选自吡啶，或醋酸钠。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(4)中，酸催化下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸，或樟脑磺酸，优选地，选自三氟甲磺酸烷基硅脂。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(5)中，酸存在下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸、或樟脑磺酸；优选地，选自氯化铜、或三氟甲磺酸C1-C4三烷基取代的硅脂；所述有机溶剂选自：二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、丙酮或1,2-二氯乙烷中的一种；优选地，选自氯仿。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(6)中，酸的R1OH溶液中的酸指下列酸：选自氯化氢、硫酸、硝酸、磷酸或三氟化硼乙醚中的一种，优选地，选自氯化氢或三氟化硼乙醚；碱的R1OH溶液中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、碳酸钾中的一种，优选地选自甲醇钠或碳酸钾。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(7)中，酸催化下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自对甲基苯磺酸，或樟脑磺酸。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(8)中，在无机碱存在的条件下指下列碱存在下：选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种，优选地，选自氢氧化锂。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(10)中，所用的碱选自甲醇钠、醋酸钠中的一种。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(11)中，酸催化作用下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自三氟甲磺酸、三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟甲磺酸金属盐、三氟化硼乙醚中的一种，优选地，选自三氟甲磺酸金属盐；所述步骤(11)反应是在下列溶剂中进行的：选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、甲苯，优选地选自二氯甲烷。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(12)中，所用酸选自醋酸、樟脑磺酸、或对甲苯磺酸中的一种。所述“选择性脱除岩藻糖上保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8，或者保护基R7、R8和R9”或“选择性脱除岩藻糖上保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8”所用试剂选自硝酸铈铵、或DDQ(2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌)。所述“选择性脱除R8和/或R9”所用试剂选自水合肼、或者硫脲。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(13)中，硫酸化所用试剂选自三氧化硫吡啶复合物、三氧化硫三甲胺复合物、或三氧化硫三乙胺复合物；所述步骤(13)的反应是在下列溶剂中进行的：选自无水吡啶或者无水DMF；保护基脱除选用的碱为氢氧化锂、或氢氧化钠。
在本发明的实施方案中，本发明提供的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的合成方法，其中，所述步骤(14)中，点击化学反应使用的催化剂选用碘化亚铜或者硫酸铜/L-抗坏血酸钠，所用溶剂选自二甲基亚砜、甲醇/水或者氯仿/甲醇/水。
第三方面，本发明提供了用于合成上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的中间体化合物，选自式G-式O化合物中的一种：
其中，各取代基的定义如上面的合成方法所定义的。
在本发明的特别优选实施方案中，本发明提供了一种中间体化合物，选自：
6-叠氮己基-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-6,3-内酯)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苄基-3-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2-O-对甲氧苄基-3,4-二-O-氯乙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-对甲氧苄基-4-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2-O-苯甲酰基-3,4-二-O-氯乙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-苯甲酰基-4-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(3-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2-O-苯甲酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-苯甲酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐；
6-叠氮己基-O-(3,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐；
6-叠氮己基-O-(4-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐。
第四方面，本发明提供了提供包含上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇的药物组合物。本发明提供的上述药物组合物，可以是口服或非胃肠给药的制剂形式，剂量可以是0.1-1000mg/次/日。
第五方面，本发明提供了上述岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇在制备抗凝血药物中的应用。
本发明以价格较为低廉的硫酸软骨素A钠盐为原料，通过酸解得到可用于化学修饰的二糖骨架，而后对其进行常规的保护基操作和一步糖基化，从而合成岩藻糖基化硫酸软骨素三糖，紧接着利用点击化学反应组装成多价糖簇，便于岩藻糖基化硫酸软骨素的药化研究和成药性探索。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步地说明本发明的可实施性，并非对本发明保护范围的限制。
检测仪器：
核磁：Bruker AV-400型核磁共振仪，溶剂为CDCl3,TMS为内标。
质谱：Bruker APEX IV型质谱仪。
缩略语：
CDCl3为氘代氯仿
CH2Cl2为二氯甲烷
EtOAc为乙酸乙酯
MeOH为甲醇
PE为石油醚
Et3N为三乙胺
HRMS:高分辨质谱
ESI:电喷雾质谱
Acyl:酰基
TMS：四甲基硅烷
TLC：薄层层析
实施例1：(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(1,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
硫酸软骨素A钠盐(20.0g)溶于200mL去离子水中，加入IR-120阳离子交换树脂调节pH至1.6(pH计)，过滤，树脂用去离子水洗涤3次，合并滤液，调整体积至390mL，缓慢滴加浓硫酸(18M，11.1mL，终浓度为0.5M)，100℃加热反应6小时，冷却至室温，剧烈搅拌下加入八水合氢氧化钡调节pH至3.5，放置过夜。硅藻土滤除沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得到黄色滤液，浓缩至约200mL，缓慢通过一段IR-120阳离子树脂柱(柱体积约200mL)，然后分别用去离子水(400mL)、乙酸/水(3:1，400mL)洗脱，最后用1M盐酸洗脱至无产物流出。合并茚三酮能够显色的组份，蒸干，用甲苯带3次，真空干燥过夜。粗产物溶于盐酸甲醇溶液(0.02M，200mL)中，4℃反应4天，浓缩过程中不断加入乙醇使固体析出，最终得到淡黄色固体为化合物。将粗产品溶于吡啶(180mL)，冰浴条件下缓慢滴加醋酸酐(70mL)，自然升至室温，反应过夜。TLC显示反应完全后，冰浴条件下用甲醇淬灭反应，溶剂蒸干，乙酸乙酯稀释，1M盐酸洗涤，水相用二氯甲烷反萃三次，有机相合并，分别用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸干。柱层析分离(CH2Cl2/MeOH 70:1～50:1,0.1％Et3N)，得到白色微黄固体(5.6g)。Rf＝0.30(CH2Cl2/MeOH＝40:1)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,TMS)δ6.40(1H,m,NH),6.34(1H,d,HA-1,J＝3.3Hz),5.28-5.24(2H,m,HA-4,HB-3),5.18-5.13(2H,m,HB-2,HB-3),4.87(1H,d,HB-1,J＝8.1Hz),4.55(1H,m,HA-2),4.24-4.20(2H,m,HA-3,HA-5),4.13-4.06(2H,m,HA-6a,HB-5),4.00(1H,m,HA-6b),3.76(3H,s,COOCH3),2.19-2.04(18H,m,CH3CO),1.91(3H,s,CH3CONH)；
13C NMR(100MHz,CDCl3,TMS)δ170.6,170.4,169.7,169.5,169.0,167.4,97.5,91.4,72.1,71.9,69.0,68.9,68.6,68.3,67.9,61.1,53.2,48.0,22.9,21.0,20.8,20.7,20.6,20.5,20.4；
HRMS[M+H]+计算值664.2083,实测值[M+H]+664.2092.
实施例2：(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1，2-二脱氧-α-D-吡喃半乳糖基)[2,1,d]2-噁唑啉的合成
氩气保护下，(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(1,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(5.00g，7.54mmol)溶于无水CH2Cl2(180mL)，冰浴条件下缓慢滴加三甲基硅基三氟甲磺酸酯(2.73mL,15.08mmol，2.0eq)，移至室温反应。TLC显示原料消失后，冰浴下加入Et3N淬灭。反应液蒸干，直接柱层析纯化(PE/EtOAc＝1:1.7～1:2.0,0.1％Et3N)，减压浓缩，得到白色固体(4.55g，79％)。Rf＝0.50(CH2Cl2/MeOH 30:1)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,TMS)δ5.93(1H,d,HA-1,J＝6.5Hz),5.40(1H,d,HA-4,J＝3.5Hz),5.30-5.20(2H,m,HB-3,HB-4),5.07(1H,d,HB-1,J＝8.0Hz),4.99(1H,t,HB-2,J＝J＝8.0Hz),4.18-4.12(3H,m,HA-6a,HA-6b,HA-5),4.08(1H,d,HB-5,J＝9.5Hz),3.93(1H,dd,HA-3,J＝6.5Hz,J＝3.5Hz),3.83(1H,t,HA-2,J＝J＝6.5Hz),3.76(3H,s,COOCH3),2.08-2.02(18H,m,CH3CO)；
13C NMR(100MHz,CDCl3,TMS)δ170.6,170.0,169.6,169.3,169.0,167.2,165.6,101.5,98.8,75.8,72.5,71.7,71.2,70.1,69.3,66.3,65.9,62.1,52.8,20.8,20.6,20.6,20.5,20.5,14.4；
HRMS[M+H]+计算值604.1872,实测值[M+H]+604.1882.
实施例3：6-叠氮己基-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
氩气保护下，(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1，2-二脱氧-α-D-吡喃半乳糖基)[2,1,d]2-噁唑啉(3.564g，5.91mmol)溶于无水氯仿，加入-6-叠氮己醇(6.623g，46.3mmol，7.8eq)和无水氯化铜(874mg，6.50mmol，1.1eq)，加热回流，反应过夜。加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，硅藻土过滤除去固体，滤液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(PE/EtOAc＝1:1.5～1:2.0,0.1％Et3N)，减压浓缩得到白色固体(4.142g，94％)。Rf＝0.30(CH2Cl2/MeOH40:1)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,TMS)δ5.80(1H,d,NH,J＝7.0Hz),5.39(1H,d,HA-4,J＝3.2Hz),5.23-5.15(2H,m,HB-3,HB-4),5.00-4.95(2H,m,HA-1,HB-2),4.71(1H,d,HB-1,J＝7.8Hz),4.66(1H,dd,HA-3,J＝3.2Hz,J＝10.8Hz),4.15-3.99(3H,m,HA-6a,HA-6b,HB-5),3.87-3.83(2H,m,HA-5,OCH2),3.75(3H,s,COOCH3),3.48(1H,m,OCH2),3.37(1H,m,HA-2),3.27(2H,t,CH2N3,J＝6.7Hz),2.08-1.96(18H,m,CH3CO),1.60(4H,m,CH2),1.38(4H,m,CH2)；
13C NMR(100MHz,CDCl3,TMS)δ170.8,170.4,170.0,169.9,169.3,166.9,99.4,99.1,74.4,72.3,72.2,71.1,71.1,69.9,69.0,67.8,62.2,54.9,52.8,51.3,29.3,28.7,26.4,25.5,23.5,20.7,20.6,20.5,20.5；
HRMS[M+H]+计算值747.2931,实测值[M+H]+747.2924.
实施例4：6-叠氮己基-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
氩气保护下，6-叠氮己基-O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(4.106g，5.50mmol)溶于无水甲醇(220mL)，冷却至-10℃，加入无水碳酸钾(380mg，2.75mmol，0.5eq)，反应1小时后自然升至室温。反应完毕后加入1M盐酸中和，溶液蒸干，并用甲苯带水3次。氩气保护下，将得到的固体溶于无水乙腈(60mL)，分别加入樟脑磺酸(256mg，1.1mmol，0.2eq)和苯甲醛二甲基缩醛(3.8mL，27.5mmol，5.0eq)，室温反应2小时，加入Et3N淬灭反应，溶剂蒸干。柱层析分离(CH2Cl2/MeOH 12:1)，减压浓缩得到白色固体(2.843g，两步收率83％)。Rf＝0.30(CH2Cl2/MeOH12:1)。
HRMS[M+H]+计算值625.2715,实测值[M+H]+625.2725.
实施例5：6-叠氮己基-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
6-叠氮己基-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(2.843g，4.55mmol)溶于甲醇/水(70mL/10mL)混合溶剂，冰浴条件下加入一水合氢氧化锂(336mg，8.0mmol)，自然升至室温反应5小时。原料消失后，加入IR-120阳离子交换树脂中和，过滤，树脂用甲醇洗3次，合并滤液，蒸干，固体用甲苯带水3次得到白色固体(2.676g，96％)，直接投下一步反应。Rf＝0.60(正丁醇/乙醇/水1:1:1)。
实施例6：6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-6,3-内酯)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
氩气保护下，6-叠氮己基-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(381mg，0.624mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(11mL)，加入苯甲酸酐(3.53g，15.6mmol，25eq)，85℃反应4小时，冷却至室温。分别加入吡啶(3mL)和4-二甲氨基吡啶(46mg,0.376mmol,0.6eq)，常温反应过夜。反应完毕后，溶液蒸干，用无水乙醚洗涤固体除去过量苯甲酸酐，得到化合物直接投下一步反应。Rf＝0.40(CH2Cl2/MeOH50:1)。
HRMS计算值[M+H]+801.2978,实测值[M+H]+801.2975.
实施例7：6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-6,3-内酯)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖粗产物溶于甲醇/二氯甲烷(15mL/11mL)混合溶剂，加入无水醋酸钠(46mg，0.56mmol，0.9eq)，室温反应过夜。反应结束后溶液浓缩，直接柱层析分离(PE/EtOAc＝1:1.5～1:2)，减压浓缩，得到白色固体(333mg，两步收率64％)。Rf＝0.25(CH2Cl2/MeOH 50:1)。
HRMS计算值[M+H]+833.3240,实测值[M+H]+833.3215.
实施例8：6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苄基-3-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
氩气保护下，乙基-2,4-二-O-苄基-3-O-乙酰丙酰基-1-硫-β-L-岩藻糖(261mg，0.537mmol，1.5eq)、6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(298mg,0.358mmol，1.0eq)溶于无水二氯甲烷(7.5mL)，加入
分子筛(700mg)，室温搅拌2小时，冷却至-20℃，依次加入N-碘代丁二酰亚胺(161mg,0.716mmol,2.0eq)和三氟甲磺酸银(36.8mg,0.143mmol,0.4eq)，-20℃反应2小时，自然升至室温反应过夜。加入Et3N淬灭反应，硅藻土过滤除去分子筛，滤液蒸干，得到的固体溶于乙酸/乙酸酐(1:3，4mL)混合溶剂，70℃反应2小时，溶剂用甲苯带干，柱层析分离(石油醚/丙酮＝3:1～2:1)，减压浓缩得到微黄色固体(381mg，85％)。Rf＝0.40(CH2Cl2/MeOH 50:1)。
HRMS计算值[M+H]+1257.5126,实测值[M+H]+1257.5143.
实施例9：6-叠氮己基-O-(2-O-对甲氧苄基-3,4-二-O-氯乙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
氩气保护下，乙基-2-O-对甲氧苄基-3,4-二-O-氯乙酰基-1-硫-β-L-岩藻糖(276mg，0.575mmol，1.5eq)、6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(314mg,0.383mmol，1.0eq)溶于无水二氯甲烷(7.5mL)，加入
分子筛(600mg)，室温搅拌2小时，冷却至-20℃，依次加入N-碘代丁二酰亚胺(172mg,0.766mmol,2.0eq)和三氟甲磺酸银(34.4mg,0.143mmol,0.35eq)，-20℃反应2小时，自然升至室温反应过夜。加入Et3N淬灭反应，硅藻土过滤除去分子筛，滤液蒸干，柱层析分离(石油醚/丙酮＝3:1～2:1)，减压浓缩得到白色固体(367mg，78％)。Rf＝0.45(CH2Cl2/MeOH50:1)。
HRMS计算值[M+NH4]+1268.4091,实测值[M+NH4]+1268.4119.
实施例10：6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-对甲氧苄基-4-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
氩气保护下，乙基-2,3-二-O-对甲氧苄基-4-O-乙酰丙酰基-1-硫-β-L-岩藻糖(243mg，0.445mmol，1.5eq)、6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(236mg,0.284mmol，1.0eq)溶于无水二氯甲烷(7.0mL)，加入
分子筛(550mg)，室温搅拌2小时，冷却至-20℃，依次加入N-碘代丁二酰亚胺(128mg,0.567mmol,2.0eq)和三氟甲磺酸银(25.5mg,0.099mmol,0.35eq)，-20℃反应2小时，自然升至室温反应过夜。加入Et3N淬灭反应，硅藻土过滤除去分子筛，滤液蒸干，得到的固体溶于乙酸/乙酸酐(1:3，4mL)混合溶剂，70℃反应2小时，溶剂用甲苯带干，柱层析分离(石油醚/丙酮＝3:1～1.5:1)，减压浓缩得到微黄色固体(287mg，77％)。Rf＝0.45(CH2Cl2/MeOH 50:1)。
HRMS计算值[M+NH4]+1334.5602,实测值[M+NH4]+1334.5558.
实施例11：6-叠氮己基-O-(2-O-苯甲酰基-3,4-二-O-氯乙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2-O-对甲氧苄基-3,4-二-O-氯乙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(22.1mg,0.0177mmol)溶于CH2Cl2(0.4mL)，滴加10％体积的水(40μL)，加入二氯二氰基苯醌(6.0mg,0.0265mmol,1.5eq)，室温反应4小时。反应完毕后，二氯甲烷稀释，分别用饱和碳酸氢钠/硫代硫酸钠混合溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，并用甲苯带干。氩气保护下，将得到的固体溶于无水吡啶(0.5mL)，冷却至-10℃，滴加苯甲酰氯(3.0μL,0.0265mmol,1.5eq)，在-10℃下反应1小时，移至0℃，继续反应30分钟，乙酸乙酯稀释，1M盐酸洗，水相用二氯甲烷反萃三次，有机相合并，分别用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸干。柱层析分离(CH2Cl2/MeOH 60:1)，减压浓缩得到白色固体(19.4mg，两步收率89％)。Rf＝0.50(CH2Cl2/MeOH40:1)。
HRMS计算值[M+NH4]+1252.3778,实测值[M+NH4]+1252.3761.
实施例12：6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-苯甲酰基-4-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-对甲氧苄基-4-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(193.1mg,0.147mmol)溶于CH2Cl2(3.0mL)，滴加10％体积的水(0.3mL)，加入二氯二氰基苯醌(166mg,0.733mmol,5.0eq)，室温反应4小时。反应完毕后，二氯甲烷稀释，分别用饱和碳酸氢钠/硫代硫酸钠混合溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，并用甲苯带干。氩气保护下，将得到的固体溶于无水吡啶(3.5mL)，冷却至-10℃，滴加苯甲酰氯(51μL,0.44mmol,3.0eq)，在-10℃下反应1小时，移至0℃，继续反应1小时，乙酸乙酯稀释，1M盐酸洗，水相用二氯甲烷反萃三次，有机相合并，分别用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸干。柱层析分离(CH2Cl2/MeOH 70:1～60:1)，减压浓缩得到白色固体(172.1mg，两步收率91％)。Rf＝0.45(CH2Cl2/MeOH 45:1)。
HRMS计算值[M+NH4]+1302.4976,实测值[M+NH4]+1302.4955
实施例13：6-叠氮己基-O-(3-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苄基-3-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(52.5mg，0.0418mmol)溶于80％乙酸水溶液中(1.0mL)，50℃加热反应1.5小时。反应液直接浓缩，用甲苯带干。将得到的固体用乙醚洗涤，除去苯甲醛，得到白色固体溶于乙酸乙酯(1.0mL)，加入溴酸钠水溶液(39.1mg，0.26mmol，7.0eq，0.5mL水)，缓慢滴加连二亚硫酸钠水溶液(85％,45.5mg,0.22mmol,6.0eq，0.6mL水)，室温反应6小时，饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗涤，柱层析分离(CH2Cl2/MeOH 20:1～15:1)，减压浓缩得到白色固体(26.8mg，73％)。Rf＝0.30(CH2Cl2/MeOH 15:1)。
HRMS计算值[M+H]+989.3874,实测值[M+H]+989.3897.
实施例14：6-叠氮己基-O-(2-O-苯甲酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(3,4-二-O-氯乙酰基-2-O-苯甲酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(126.7mg，0.1026mmol)溶于80％乙酸水溶液中(3.0mL)，50℃加热反应3小时。反应液直接浓缩，用甲苯带干。得到的固体溶于甲醇(2.5mL)，分别加入硫脲(117mg,1.54mmol,15eq)和2,6-二甲基吡啶(180μL,1.54mmol,15eq)，60℃加热反应8小时。反应结束后溶剂蒸干，固体用乙酸乙酯溶解，1M盐酸洗，水相用二氯甲烷反萃三次，有机相合并，分别用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸干。柱层析分离(CH2Cl2/MeOH30:1～20:1)，减压浓缩得到白色固体(70.7mg，两步收率70％)。Rf＝0.35(CH2Cl2/MeOH 15:1)。
HRMS计算值[M+NH4]+1012.4034,实测值[M+NH4]+1012.4058.
实施例15：6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-苯甲酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；
6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-苯甲酰基-4-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(172.1mg，0.134mmol)溶于80％乙酸水溶液中(3.0mL)，50℃加热反应3小时。反应液直接浓缩，用甲苯带干。得到的固体溶于二氯甲烷(2mL)，冰浴条件下滴加0.5M醋酸肼(0.8mL，水合肼溶于吡啶/乙酸＝3:2的混合溶剂中)。自然升至室温反应5小时，乙酸乙酯稀释，1M盐酸洗，水相用二氯甲烷反萃三次，有机相合并，分别用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，蒸干。柱层析分离(CH2Cl2/MeOH 30:1～25:1)，减压浓缩得到白色固体(112.2mg，两步收率76％)。Rf＝0.30(CH2Cl2/MeOH 25:1)。
HRMS计算值[M+NH4]+1114.4296,实测值[M+NH4]+1116.4275.
实施例16：6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐的合成
氩气保护下，6-叠氮己基-O-(3-O-乙酰丙酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(53.5mg,0.0541mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(1.2mL)，加入三氧化硫三甲胺复合物(151mg,1.08mmol,5eq/羟基)，50℃加热反应72小时，冷却至室温，滴加甲醇淬灭反应，直接使用葡聚糖凝胶LH-20纯化(CH2Cl2/MeOH＝1:1)，减压浓缩得到白色固体(80.5mg，～95％)。Rf＝0.65(氯仿/甲醇/水10:10:3)。取白色固体(50.1mg，0.0325mmol)溶于四氢呋喃/水(3:1,2mL)混合溶剂，冷却至-10℃，滴加新制1M氢氧化锂水溶液和35％过氧化氢水溶液(2:1，0.75mL)，-10℃反应1小时，移至室温反应过夜。冰浴条件下加入甲醇(0.5mL)，缓慢滴加4M氢氧化钠水溶液(1.3mL)，自然升至室温反应10小时。IR-120阳离子交换树脂中和反应液，过滤，并用蒸馏水洗涤树脂，滤液浓缩，LH-20凝胶柱纯化(纯水洗脱)，冷冻干燥，得到白色固体(32.1mg，90％)。Rf＝0.40(乙酸乙酯/乙醇/水2:1:1)。
HRMS计算值[M+3H]2-493.0429,实测值[M+3H]2-493.0446.
实施例17：6-叠氮己基-O-(3,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐的合成
氩气保护下，6-叠氮己基-O-(2-O-苯甲酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(42.8mg,0.043mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)，加入三氧化硫三甲胺复合物(120mg,0.861mmol,5eq/羟基)，50℃加热反应72小时，冷却至室温，滴加甲醇淬灭反应，直接使用葡聚糖凝胶LH-20纯化(CH2Cl2/MeOH＝1:1)，减压浓缩得到白色固体(65mg，～97％)。Rf＝0.65(氯仿/甲醇/水10:10:3)。取白色固体(52.7mg，0.034mmol)溶于四氢呋喃/水(3:1,2mL)混合溶剂，冷却至-10℃，滴加新制1M氢氧化锂水溶液和35％过氧化氢水溶液(2:1，0.75mL)，-10℃反应1小时，移至室温反应过夜。冰浴条件下加入甲醇(0.5mL)，缓慢滴加4M氢氧化钠水溶液(1.3mL)，自然升至室温反应10小时。IR-120阳离子交换树脂中和反应液，过滤，并用蒸馏水洗涤树脂，滤液浓缩，LH-20凝胶柱纯化(纯水洗脱)，冷冻干燥，得到白色固体(34.5mg，92％)。Rf＝0.45(乙酸乙酯/乙醇/水2:1:1)。
HRMS计算值[M+3H]2-493.0429,实测值[M+3H]2-493.0446.
实施例18：6-叠氮己基-O-(4-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐的合成
氩气保护下，6-叠氮己基-O-(2,3-二-O-苯甲酰基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖(50.8mg,0.0463mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺1.0mL)，加入三氧化硫三甲胺复合物(96.5mg,0.694mmol,5eq/羟基)，50℃加热反应72小时，冷却至室温，滴加甲醇淬灭反应，直接使用葡聚糖凝胶LH-20纯化(CH2Cl2/MeOH＝1:1)，减压浓缩得到白色固体(59.5mg，～95％)。Rf＝0.70(氯仿/甲醇/水10:10:3)。取白色固体(46mg，0.0328mmol)溶于四氢呋喃/水(3:1,2mL)混合溶剂，冷却至-10℃，滴加新制1M氢氧化锂水溶液和35％过氧化氢水溶液(2:1，0.75mL)，-10℃反应1小时，移至室温反应过夜。冰浴条件下加入甲醇(0.5mL)，缓慢滴加4M氢氧化钠水溶液(1.3mL)，自然升至室温反应10小时。IR-120阳离子交换树脂中和反应液，过滤，并用蒸馏水洗涤树脂，滤液浓缩，LH-20凝胶柱纯化(纯水洗脱)，冷冻干燥，得到白色固体(32.1mg，98％)。Rf＝0.45(乙酸乙酯/乙醇/水2:1:1)。
HRMS计算值[M+2H]2-453.0645,实测值[M+2H]2-453.0658.
实施例19：糖簇合成举例——二价糖簇G1的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐(17.2mg,15.7μmol,2.4eq)，二价骨架L1(0.902mg,6.53μmol,1.0eq)，无水硫酸铜(0.26mmg,1.64μmol,0.25eq)，L-抗坏血酸钠(2.6mg,13.1μmol,2.0eq)溶于氯仿/甲醇/水混合溶液中，45℃加热反应过夜。TLC显示反应完毕后，直接LH-20凝胶柱纯化(H2O)，冷冻干燥得到白色固体(9.1mg，60％)，Rf＝0.30(乙酸乙酯/乙醇/水2:1:1)。
实施例20：糖簇合成举例——三价糖簇G2的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐(24.3mg,22.1μmol,3.6eq)，三价骨架L2(1.44mg,6.15μmol,1.0eq)，无水硫酸铜(0.37mmg,2.28μmol,0.37eq)，L-抗坏血酸钠(3.7mg,18.4μmol,3.0eq)溶于氯仿/甲醇/水混合溶液中，45℃加热反应过夜。TLC显示反应完毕后，直接LH-20凝胶柱纯化(H2O)，冷冻干燥得到白色固体(14.7mg，68％)，Rf＝0.30(乙酸乙酯/乙醇/水2:1:1)。
实施例21：糖簇合成举例——三价糖簇G3的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐(21.7mg,19.8μmol,3.6eq)，三价骨架L3(1.3mg,5.5μmol,1.0eq)，无水硫酸铜(0.34mmg,2.08μmol,0.37eq)，L-抗坏血酸钠(3.3mg,16.6μmol,3.0eq)溶于氯仿/甲醇/水混合溶液中，45℃加热反应过夜。TLC显示反应完毕后，直接LH-20凝胶柱纯化(H2O)，冷冻干燥得到白色固体(13.7mg，70％)。
实施例22：糖簇合成举例——四价糖簇G4的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐(21.8mg,19.9μmol,4.8eq)，四价骨架L4(1.20mg,4.15μmol,1.0eq)，无水硫酸铜(0.34mmg,2.08μmol,0.5eq)，L-抗坏血酸钠(3.3mg,16.6μmol,4.0eq)溶于氯仿/甲醇/水混合溶液中，45℃加热反应过夜。TLC显示反应完毕后，直接LH-20凝胶柱纯化(H2O)，冷冻干燥得到白色固体(15.5mg，80％)，Rf＝0.30(乙酸乙酯/乙醇/水2:1:1)。
实施例23：糖簇合成举例——六价糖簇G5的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐(28.1mg,25.6μmol,7.2eq)，六价骨架L5(1.71mg,3.55μmol,1.0eq)，无水硫酸铜(0.43mmg,2.67μmol,0.75eq)，L-抗坏血酸钠(4.3mg,21.3μmol,6.0eq)溶于氯仿/甲醇/水混合溶液中，45℃加热反应过夜。TLC显示反应完毕后，直接LH-20凝胶柱纯化(H2O)，冷冻干燥得到白色固体(18.3mg，73％)，Rf＝0.10(乙酸乙酯/乙醇/水2:1:1)。
实施例24：糖簇合成举例——八价糖簇G6的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐(27.9mg,25.4μmol,9.6eq)，八价骨架L6(1.80mg,2.65μmol,1.0eq)，无水硫酸铜(0.42mmg,2.65μmol,1.0eq)，L-抗坏血酸钠(4.2mg,21.2μmol,8.0eq)溶于氯仿/甲醇/水混合溶液中，45℃加热反应过夜。TLC显示反应完毕后，直接LH-20凝胶柱纯化(H2O)，冷冻干燥得到白色固体(18.9mg，75％)。
实施例25：糖簇合成举例——九价糖簇G7的合成
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐(22.3mg,20.4μmol,11eq)，九价骨架L7(1.60mg,1.85μmol,1.0eq)，无水硫酸铜(0.34mmg,2.08μmol,1.1eq)，L-抗坏血酸钠(3.3mg,16.6μmol,9.0eq)溶于氯仿/甲醇/水混合溶液中，45℃加热反应过夜。TLC显示反应完毕后，直接LH-20凝胶柱纯化(H2O)，冷冻干燥得到白色固体(13.8mg，70％)。
抗凝血活性测试
糖簇化合物G1～G7进行抗凝血活性测试，包括活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)。
PT测定
整个实验按照PT试剂盒的说明书进行操作；首先将20ul乏血小板血浆和5ul待测溶液(对照组或样品溶液)混合入测试杯并在37℃预热区孵育3min；然后将测试杯换入测试区后加入50ul预热的PT试剂(预热时间大于10min但不超过30min)，同时立即启动记录纤维蛋白形成的时间；实验停止后，在血凝仪上读取纤维蛋白形成时间。
APTT测定
整个实验按照APTT试剂盒的说明书进行操作；首先将20ul乏血小板血浆和5ul待测溶液(对照组或样品溶液)混合入测试杯并在37℃预热区孵育3min；然后向该混合体系中加入25ul的APTT试剂，再在37℃条件下继续孵育3min；接下来，将测试杯换入测试区，加入25ul预热5min的氯化钙溶液，同时立即启动记录纤维蛋白形成的时间；实验停止后，在血凝仪上读取纤维蛋白形成时间。
测试结果如下(表中数据代表使APTT/PT延长一倍所需浓度)：
注：
三糖化合物指6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-磺酸基-α-L-岩藻糖基)-(1→3)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(4,6-二-O-磺酸基-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖-五钠盐。
Claims (14)
1.一种如通式Q所示的岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖糖簇：
其中，n为3、6、8、或9；
R4选自C1-C10脂肪族烷烃亚基，C1-C10脂肪族烯烃亚基，或-(CH2)m-(OCH2CH2)p-，这里m，p为1-10的整数；
T为三氮唑基即如下基团
Y为糖簇的多官能团支架，选自下式中的一种：
R2选自氢、C1-C10脂肪族烷基、未取代的苯基或取代的苯基；
R13、R14和R15各自独立地选自H、或-SO3Na。
2.如权利要求1所述的寡糖糖簇，其中，通式Q中R4为C1-C10脂肪族烷烃亚基。
3.如权利要求1或2所述的寡糖糖簇，其中，通式Q中R2为甲基。
4.如权利要求1所述的寡糖糖簇，所述寡糖糖簇选自糖簇G3、糖簇G5、糖簇G6和糖簇G7中的一种；
5.权利要求1所述的寡糖糖簇的合成方法，所述方法包括如下步骤：
(1)式A化合物即硫酸软骨素M盐，在无机酸溶液中，加热水解得到式B化合物；其中，q为正整数；
(2)式B化合物在无机酸的醇R1OH溶液中进行酯化反应，得到式C化合物；
(3)采用酸酐R2-C(O)-O-C(O)-R2，在碱性条件下对式C化合物的氨基和其余的所有羟基进行酰化保护，得到式D化合物；
(4)式D化合物在酸催化下得到噁唑啉E
(5)式E化合物在酸存在下，在有机溶剂中，与醇R3-R4OH反应，得到式F化合物；
(6)式F化合物在酸或碱的R1OH溶液中，脱去式F化合物上所有O原子上的酰基，得到式G化合物；
(7)式G化合物在R5C(O)H或R5C(O)H缩二脂肪醇的存在下，在酸催化下选择性保护式G化合物的4,6二羟基，得到式H化合物；
(8)式H化合物在无机碱存在的条件下脱除羧酸酯基，得到式I化合物；
(9)式I化合物在酸酐R6-O-R6的作用下，环合得到式J化合物；
(10)式J化合物在碱的催化下，在R1OH溶液中打开内酯环，得到式K化合物；
(11)式K化合物在酸催化作用下，与岩藻糖供体式L化合物反应得到式M化合物；
(12)式M化合物在酸作用下脱除氨基半乳糖4,6-OH保护，然后选择性脱除保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8，或者保护基R7、R8和R9，得到式N化合物；
或者，式M化合物选择性脱除保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8，或者保护基R7、R8和R9；再在酸作用下脱除氨基半乳糖4,6-OH保护，得到式N化合物；
或者，式M化合物选择性脱除保护基R7，或者保护基R7和R9，或者保护基R7和R8；再与酰氯或酸酐反应，使得脱除R7、或R7和R9、或R7和R8后羟基被保护；然后选择性脱除R8和/或R9；最后，在酸作用下脱除氨基半乳糖4,6-OH保护，得到式N化合物；
(13)式N化合物经过硫酸化与脱保护操作得到式O化合物；
(14)式O化合物在碘化亚铜、或者硫酸铜和L-抗坏血酸钠催化下，与多分支骨架结构进行点击化学反应得到通式Q化合物；
在上述合成方法中，涉及化合物的取代基定义如下：
式Q化合物中，n为3、6、8、或9；
R4选自C1-C10脂肪族烷烃亚基，C1-C10脂肪族烯烃亚基，或-(CH2)m-(OCH2CH2)p-，这里m，p为1-10的整数；
T为三氮唑基即如下基团
Y为糖簇的多官能团支架，选自下式中的一种：
R1OH、式C-式H化合物、式K化合物、式M化合物和式N化合物中，R1选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
R2-C(O)-O-C(O)-R2、式D-式K化合物、式M-式O化合物以及通式Q中，R2选自氢、C1-C10脂肪族烷基，未取代的苯基或取代的苯基；
R3-R4-OH、式F-式K化合物、式M-式O化合物以及通式Q中，R4选自C1-C10脂肪族烷烃亚基，C1-C10脂肪族烯烃亚基，或-(CH2)m-(OCH2CH2)p-，这里m，p为1-10的整数；R3选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、巯基；所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基，所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、或三氟乙酰基；
R5C(O)H或R5C(O)H缩二脂肪醇、式H-式K化合物以及式M化合物中，R5选自未取代的苯基或取代的苯基，这里，所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
酸酐R6-O-R6、式J、式K、式M和式N化合物中，R6选自未取代的脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述未取代的脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
式L和式M化合物中，R7选自未取代苄基或者取代的苄基；所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、或C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
式L和式M化合物中，R8和R9各自独立的选自未取代的脂肪族酰基或取代的脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基、未取代苄基或者取代的苄基；这里，所述未取代的脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基；所述取代的脂肪族酰基是指未取代的脂肪族酰基上的氢被卤素、和/或C1-C4烷酰基所取代；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，这里的取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，这里的取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
式N化合物中，R10、R11和R12各自独立地为氢、未取代的脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述未取代的脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，这里的取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
式O-式Q化合物中，R13、R14和R15各自独立地选自H、或-SO3Na；
式A-式B中，M为钠，钾，锂或钙。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
式Q化合物中，n为3、6、8、或9；
R4选自C1～C10脂肪族烷烃亚基；
R1OH、式C-式H化合物、式K化合物、式M化合物和式N化合物中，R1选自甲基、乙基、烯丙基、苄基、4-甲氧基苄基；
R2-C(O)-O-C(O)-R2、式D-式K化合物、式M-式O化合物以及通式Q中，R2为甲基；
R3-R4-OH、式F-式K化合物、式M-式O化合物以及通式Q中，R3-R4-为N3-(CH2)6-；
R5C(O)H或R5C(O)H缩二脂肪醇、式H-式K化合物以及式M化合物中，R5选自苯基，4-甲氧基苯基，4-氯代苯基、或4-溴代苯基；
酸酐R6-O-R6、式J、式K、式M和式N化合物中，R6选自乙酰基、苯甲酰基、乙酰丙酰基、4-氯代苯甲酰基、或4-溴代苯甲酰基；
式L和式M化合物中，R7选自苄基或者对甲氧苄基；
式L和式M化合物中，R8和R9各自独立的选自苄基、对甲氧苄基、乙酰丙酰基、或氯乙酰基；
式N化合物中，R10、R11和R12各自独立地选自氢、乙酰基、或苯甲酰基；
式A-式B中，M为钠。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤(1)中无机酸为盐酸或硫酸；所述无机酸的浓度选自0.1M到1M之间；反应温度为100℃；和/或
所述步骤(2)中，无机酸为氯化氢、硫酸、硝酸、或磷酸；和/或
所述步骤(3)中，碱性条件下，指下列碱存在下:选自醋酸钠，吡啶，磷酸二氢钠，碳酸钾，三乙胺或哌啶；和/或
所述步骤(4)中，酸催化下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸，或樟脑磺酸；和/或
所述步骤(5)中，酸存在下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化铜、对甲基苯磺酸、或樟脑磺酸；所述有机溶剂选自：二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、丙酮或1,2-二氯乙烷中的一种；和/或
所述步骤(6)中，酸的R1OH溶液中的酸指下列酸：选自氯化氢、硫酸、硝酸、磷酸或三氟化硼乙醚中的一种；碱的R1OH溶液中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、碳酸钾中的一种；和/或
所述步骤(7)中，酸催化下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自对甲基苯磺酸，或樟脑磺酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤(1)中无机酸为硫酸；所述无机酸的浓度选自0.5M硫酸溶液；和/或
所述步骤(2)中，无机酸为氯化氢、或硫酸；和/或
所述步骤(3)中，碱性条件下，指下列碱存在下:选自吡啶，或醋酸钠；和/或
所述步骤(4)中，酸催化下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自三氟甲磺酸烷基硅脂；和/或
所述步骤(5)中，酸存在下指下列质子酸或路易斯酸存在下：选自氯化铜、或三氟甲磺酸C1-C4三烷基取代的硅脂；所述有机溶剂选自氯仿；和/或
所述步骤(6)中，酸的R1OH溶液中的酸指下列酸：选自氯化氢或三氟化硼乙醚；碱的R1OH溶液中的碱选自甲醇钠或碳酸钾。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤(8)中，在无机碱存在的条件下指下列碱存在下：选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(8)中，在无机碱存在的条件下指下列碱存在下：选自氢氧化锂。
11.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤(10)中，所用的碱选自甲醇钠、醋酸钠中的一种。
12.用于合成权利要求1所述寡糖糖簇的中间体化合物，选自如下式J和式K化合物中的一种：
其中，
R1选自未取代的苄基或取代的苄基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、或烯丙基；这里，所述取代的苄基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
R2选自氢、C1-C10脂肪族烷基，未取代的苯基或取代的苯基；
R4选自C1-C10脂肪族烷烃亚基，C1-C10脂肪族烯烃亚基，或-(CH2)m-(OCH2CH2)p-，这里m，p为1-10的整数；R3选自叠氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、巯基；所述取代的氨基是指被保护基保护的氨基，所述保护基选自苄氧羰酰基、叔丁氧羰酰基、三氯乙酰基、或三氟乙酰基；
R5选自未取代的苯基或取代的苯基，这里，所述取代的苯基是指苯环被一个或两个以上取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置；
R6选自未取代的脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；这里，所述未取代的脂肪族酰基是指C2-C6烷酰基；所述取代的苯甲酰基是指苯环被一个或两个以上的取代基所取代，所述取代基选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基；并且，任选地，所述取代基在苯环的任意位置。
13.如权利要求12所述的中间体化合物，选自下列化合物之一：
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-6,3-内酯)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖；和
6-叠氮己基-O-(2,4-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-苄叉-2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖。
14.如权利要求1至4中任一项所述的寡糖糖簇在制备抗凝血药物中的应用。
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