DK175970B1 - Fremgangsmåde til organisk syntese af oligosaccharider indeholdende galactosamin-uronsyre-mönstre, ved fremgangsmåden opnåede oligosaccharider og biologisk anvendelse af sådanne oligosaccharider - Google Patents

Description

i DK 175970 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til · organisk syntese af oligosaccharider indeholdende galac-* tosamin-uronsyre-mønstre. Oisse oligosaccharider udgør eller indeholder fragmenter af mucopolysaccharid-syrer.

5 I forbindelse med denne fremgangsmåde indgår ligeledes syntesen af derivater af disse oligosaccharider.

Opfindelsen angår derudover hidtil.ukendte oligosaccharider af den ovenfor' angivne art samt derivater deraf, som især er i besiddelse af biologiske egenskaber, 'hvor-10 ved de især får interesse som lægemidler, eller/og de f.eks.'er anvendelige som laboratorie-reagenser.

Opfindelsen angår ligeledes anvendelsen af disse for- . bindeiser, især biologisk og biokemisk anvendelse.

Ved udtrykket "mucopolysaccharid-syre" betegnes deriva-15 ter, der ligeledes hyppigt betegnes glucosamino-glucuron- glucaner. Det drejer sig om oligosa'ccharider og poly-saccharider, der ganske særlig træffes i kæder.i biologisk aktive derivater,.såsom derivater af typen · dermatan-sulfat, chohdroitiner, chondrosin og chondroitin-sulfa-20 ter.

Inden for naturprodukterne er de pågældende mucopoly-saccharider i hovedsagen dannet af alternerende „gentagelsesgrupper aminosukkerart-uronsyre, eller omvendt. Blandt disse gentagelsesgrupper udviser aminosukkerarterne, 25 som i det efterfølgende er betegnet som A, især en D-ga- lactosamin-struktur. Uronsyren, som man vil betegne U, udviser, især en D-glucuronsyre-struktur eller en L-iduronsyre-struktur.

Basis-strukturerne for Å og-U svarer henholdsvis til 30 de nedenfor anførte formler x, y og z: I DK 175970 B1 I C-Oll HO h o I \0H V*°H .

I Y

éminogruppe-deriv'at (x) D-galactosamin

COOH

I J—ev Æ~°\' / \ ' /COOH y-^.OH ' I K OH N'V-OH j\OH / I „N-—/ "o^-j.

I OH

0H

H D-glucuronsyre (z ) 'L-iduronsyre

Inden for de pågældende naturprodukter er disse forskel- I

lige gentagelsesgrupper indbyrdes forbundet på stereo- I

H specifik måde i almindelighed gennem bindingerne: I

1 -—> 3 , 1 > 3 og 1 > 4 .

5 Inden for chondroitinerne og chondroitinsulfaterne støder I

I man på. bindinger af typen 1-^ ^ 3 (mellem grupperne I

I y og x) og 1 —-—> 4 (mellem grupperne x og y). I

Derudover foreligger i dermatan-sulfat bindinger af I

I typen 1 ---^3 (mellem grupperne z og x) og ί-^ 4 I

I 10 (mellem grupperne x og z). I

Man vil yderligere bemærke, idet der stadig er tale I

I om naturprodukterne, at de ovenfor omtalte gentagel- I

I sesgrupper indeholder specifikke substituenter, dvs. I

I bestemte substituenter på bestemte stillinger. I

3 DK 175970 B1 Således indeholder kæderne i naturprodukterne f.eks. gentagelsesgrupper der er O-substituerede i 4- eller 6-stillingen, eller 4,6-di-0-D-galactosaminsulfat eller gentagelsesgrupper, der ikke er O-substituéret, såsom 5 f.eks. gentagelsesgrupper D-glucuronsyre; L-iduronsyre og D-galactosamin. Derudover er gentagelsesgruppen x N-substitueret i 2-stillingen med N-acetylgrupper.

Betydningen af terapeutisk anvendelse af ovennævnte mucopolysaccharidsyrer er velkendt, især til forebyg-10 gelse af og behandling af vanskeligheder med koagula tionen og med de vaskulære karvægge, især thromboser og artheroscleroser og arterioscleroser, eller til bekæmpelse af ældningen af væv eller manifestationer af degenerativ type, såsom alopecier.

15 De indtil nu foreslåede fremgangsmåder til opnåelse af denne type af produkter gør brug af ekstraktionstek-• nik ud fra naturlige kilder, f.eks. ud fra dyreorganer.

Den fremskredne udvikling af arbejderne inden for dette . område har ført forskerne til at søge efter hidtil ukend-20 te midler, som førte til denne type produkter, især til at undersøge mulighederne for at opnå disse ad syntesevejen.

I den forbindelse er det passende at se på det antal problemer, .som opstår gennem en sådan syntese. På den 25 ene side indeholder disse produkter i deres kæde adskil- • lige typer af gentagelsesgrupper A og U. På den anden side svarer visse bindinger imellem disse gentagelses-grupper til en given stereokemisk tilstand, og de er af typen 1,4, hvis gennemførelse som bekendt er behæf-30 tet med.betydelige vanskeligheder. Derudover indeholder hver gentagelsesgruppe en eller flere specifikke substi-tuenter afhængig af det pågældende produkt.

I DK I7597O B1

• Som følge heraf har sådanne synteser indtil nu praktisk talt aldrig været omtalt i den videnskabelige litteratur. Dette gælder' I

især hvad angår L-iduronsyren. I

5 Alle disse elementår fastsætter afgørende restriktioner, som man · I

let forstår, medfører vanskeligheder ved gennemførelse af én gene- I

rel proces og synteseprocessen. . .I

Oligosaccharider med aminosukkerart-uronsyrekæder eller omvendt, · I

10 beskrevet soin kendt teknik, opnås i mange af tilfælde ved enzyma- I

tiske processer eller ved salpeter-holdig depolymerisering. I

j Resultatet heraf er at der ikke kan være.tale om rene produkter I

men om blandinger, som desuden er sammensat af kæder, der er.for- I

15 andrede i forhold til naturlige kæder, under påvirkning af de en- I

zymer eller den salpetersyrling, som er anvendt i disse fremgangs- I

måder. Sådanne blandinger af oligosaccharider er blandt andet be- I

skrevet i EP-A-0 048 231 og EP-A-0 014 184 i navnet KABI, Barker , I

et al., Chemical Abstract, vol. 55, nr.. 27533e, Klein et al., Car- I

20 bohydrate Research, vol. 78, 1980, s. 249-256, EP-A-0 027 089, Se- I

no et al., Carbohydrate Research, vol. 103, nr. 1, 1982, s. 190- I

194, Ogamo et al., Carbohydrate Research, vol. 105, nr. 1, 1982, I

s. 69-85, Ayotte et al., Carbo-hydrate Research, vol;. 87, 1980, s.· I

297-301, Kosakai et al., J. of'Biochemistry, vol. 92, 1982, s. I

25 295-303 og Hopwood et al.·, Chemical Abstract, vol. 97, 1982, nr. I

160637U. I

Andre oligosaccharid-derivater er blevet beskrevet, men de anvend- I

te reagenser og syntesebetingelser løser ikke.de problemer, som I

30 opfindelsen tilsigter at løse (se blandt andet Methods Carbohydra- . I

te Chem., vol. 8, 1980, s. 305-311, Tetrahedron Letters, nr. ' 30, I

1972, s. 3055-58, Helvetica Chimica Acta, vol. 58, 1975, nr. 204- I

205, s. 1847-1864 og Tetrahedron Letters, nr. 5, 1972, s. 431- I

433). I

35 I

5 DK 175970 B1

Under udforskningen af betingelserne for ose-syntesen, som er egnet til fremstilling af denne type forbindelser, har man nu udviklet en strategi gennem udvælgelsen af visse særlige typer af beskyttelse for de produkter, der tages i brug.

5

De pågældende undersøgelser har vist, at med sådanne produkter, der er beskyttet på en sådan måde, var det muligt at gennemføre en stereospecifik kædedannelse og derpå indføre, om ønsket, i de dannede sekvenser, givne substituenter i fast-10 lagte stillinger.

Ved en aspekt, hvis interesse vil fremgå af det følgende, udviser den foreliggende fremgangsmåde stor smidighed. Det er | således muligt at opnå med fordel, især med hensyn til speci- 15 fikke resultater og renhed, som er knyttet til en synteseproces, talrige oligosaccharid-derivater indeholdende specifikke substituenter, som man møder dem i naturprodukterne, eller også med forskellige substituenter og/eller med gentagelsesgrupper med analog struktur, men med afvigende kon-20 figurationer.

Man har takket være denne fremgangsmåde opnået biologisk aktive produkter. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man ligeledes nå til et stort antal oligosaccharider, der er gan-25 ske særligt værdifulde, især som biologiske reagenser og/eller som referenceforbindelser ved strukturundersøgelser.

* I DK 175970 B1 Η

Opfindelsen har således til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til ad syntesevejen at opnå oligosac-charider og derivater deraf eller analoge forbindelser H 5 dertil, som består åf eller som svarer til fragmenter af mucopolysaccharidsyrer.

Opfindelsen har ligeledes til formål at tilvejebringe midler, som gør det muligt at etablere glucosid-bindinger mellem gentagelsesgrupperne af typerne A og U i overens-H 10 stemmelse med den ønskede stereospecificitet.

H Opfindelsen angår ligeledes til vejebringelsen af midler, H som gør det muligt at indføre i gentagelsesgrupperne i glucosid-kædeh givne funktionelle grupper; især spe- H cifikke substituenter, således som man møder demiks- H 15 derne i biologisk aktive.molekyler, især sådanne af ; typen dermatan-sul.fat, chondroitin-sulfater eller· chon- droitiner.

Opfindelsen har ligeledes til formål at tilvejebringe midler, som gør det muligt at opnå oligosaccharider 20 som ovenfor fremhævet, idet dog substituenterne og/eller H den kemiske art af·sukkerar ter og/eller stillingen og konfigurationen af interglucosid-bindingerne og/eller monosaccharidernes konfiguration og/eller rækkefølgen i kædedannelsen adskiller sig fra de tilsvarende forhold H 25 hos naturprodukterne.

I Opfindelsen har ud fra en anden synsvinkel ligeledes I til formål at tilvejebringe hidtil ukendte oligosaccha- rider, som udgør syntesemellemprodukter ved fremgangsmå- I den til den pågældende syntese, og hvori samtlige 0H- 30 grupper i de forskellige gentagelsesgrupper er blokeret I med beskyttelsesgrupper, og hvor de grupper, som er 7 DK 175970 B1 præcursorer for eventuelt tilstedeværende funktionelle grupper om ønsket i sig selv ligeledes er beskyttende.

I Ud fra endnu en synsvinkel har den foreliggende opfindelse til 5 formål at tilvejebringe hidtil ukendte oligosaccharider, som udviser den ovenfor angivne struktur svarende til naturprodukterne, såvel som oligosaccharider, der svarer til fragmenter i I af disse produkter.

10 Opfindelsen har ligeledes til formål at tilvejebringe hidtil ukendte oligosaccharider, som er i besiddelse af de for naturprodukterne specifikke substituenter.

Opfindelsen har ligeledes til formål at tilvejebringe hidtil 15 ukendte oligosaccharider, som har substituenter, der er forskellige fra de pågældende specifikke substituenter og/eller som indeholder gentagelsesgrupper, der er forskellige i forhold til de ovenfor i betragtning kommende naturlige produk-

Opfindelsen angår ligeledes den biologiske anvendelse af disse oligosaccharider, især som aktive bestanddele i lægemidler, som reagenser i laboratoriet eller som referenceprodukter ved undersøgelsen i-særdeleshed af forbindelser, som rummer denne 25 type af strukturer.

Opfindelsens synteseproces er kendetegnet ved, at - man i en glycosyleringsreaktion anvender to produkter, der henholdsvis er afsluttet med eller består af en A-enhed med 30 galactosaminstruktur og en U-enhed med D-glucuronsyre- eller L-iduronsyrestruktur, idet én af enhederne A eller U er en alkohol, hvori -OH-gruppen med alkohol-funktion indtager en hvilken som helst af positionerne 3 eller 4, og den anden enhed har et aktiveret, anomert carbon substitueret med en reak-35 tiv gruppe, der er forenelig med de øvrige grupper, der er til DK 175970 B1 stede på enhederne, idet alle de øvrige positioner i A og U, . med undtagelse af den, hvori det anomere carbon er aktiveret H og den, der indtages af OH-gruppen med alkohol-funktion, bærer H énteh amino- eller carboxyl-grupper, eller præcursorer for H 5 sådanne grupper, eller -OH-grupper, idet disse grupper ind- H tager forud fastlagte positioner, og idet amino- og carboxyl- H grupperne, når de er til stede, henholdsvis er blokerede med beskyttelsesgrupper med amino- og carboxyl-funktion, idet -OH- grupperne er blokerede med mindst to typer beskyttelsesgrup- H 10 per, der er sekventielt fjerbare, hvilket muliggør’ indførelse af ønskede grupper i givne positioner, hvorefter -OH-grupperne kan frigives i andre positioner, - glycosyleringstrinnet eventuelt gentages til forlængelse af H 15 oligosaccharidkæden, - -OH-beskyttélsesgrupperne sekventielt elimineres ved ind- føring af ønskede substitutions-grupper i specifikke posi- H tioner, hvorefter -OH-grupperne i andre specifikke positioner 20 samt amino- og carboxyl-grupperne frigøres.

Det er således muligt takket være de ovenfor beskrevne for- holdsregler at gennemføre en kovalent binding mellem gentagelsesgrupperne med strukturen A og U, og dette i over- 25 ensstemmelse med den stereokemi, som udvi-

DK 175970 B1 I

9 I

ses af denne type kædedannelse inden· for de allerede I

beskrevne biologisk aktive molekyler. I

Oet er ligeledes muligt under anvendelse af fremgangs- I

måden ifølge opfindelsen at fremstille ønskede- kæder I

5 i overensstemmelse med en given række følge.og/eller I

med gi.vne stereospecifikke egenskaber. I

De midler, som foreslås ved fremgangsmåden ifølge opfin- I

delsen, gør det således muligt især at danne en binding I

af typen 1--->3 mellem en L-.iduronsy regruppe og

10 en galactosamingruppe, en binding af typen 1-^—^4 I

mellem en D-galactosamingruppe og en gruppe, som enten I

kan være D-glucuronsyre, eller L-iduronsyre, samt en 1

I binding af typen 1---^ 3 mellem en D-glucurunsyre- I

gruppe og en D-galactosamingruppe.· I

15 Mono- eller oligosacchari.d-mellemprodukterne ved denne syntese er halvåbne eller åbne produkter. Man vil betegne som en "halvåben til' højre forbindelse" en forbindelse, der er ' aktiveret, eller som lader sig aktivere ved sit anomere carbonatom, hvorved det er muligt· at 20 overføre den til den ikke-reducerende ende af et.mono- saccharid eller af et oligosaccharid. Ved udtrykket "halvåben forbindelse til venstre" skal betegnes et monosaccharid eller en oligosaccharid, som har en enkelt OH-gruppe, der er fri, eller som potentielt er Z5 fri, hvorved der kan dannes en specifik glucosylering.

Til belysning heraf er i det følgende angivet formlen (1) af et eksempel på en halvåben til venstre forbindelse, og formlen (2) for et eksempel på en halvåben til højre forbindelse DK 175970 B1 I r—0Bn cuoMe I L—.° /—-—o mco r y i i \ a y V>H /OBn. Bno \[ /sr I (lj NHAc. -(2) OBn .

Ac betegner en acetylgruppe, Bn, berizylgruppe og Me methyl gruppe.

Det følger heraf, at man vil beskrive som åbne forbin- delser et derivat, der er halvåbent samtidigt·til ven- 5 stre og til højre i overensstemmelse med den ovenfor anførte definition, idet sådanne forbindelser gør det muligt at forlænge kæden i begge retningerne. Et deri- vat af denne type svarer f.eks. til efterfølgende formel I (y): · COOM.e I )—°

: KOBn A

U MCAO \] /Br I

1 I (3) 0Bn 10 hvori Bn og Me har samme betydning som ovenfor angivet, H og MCAO betegner en monochloracetyIgruppe.

I Med hensyn til de lukkede derivater drejer det sig her om produkter, hvis gentagelsesgrupper ikke kan forårsage I forlængelse af kæderne pa grund af arten af gruppernes I 15 substituenter.

Ved et supplerende arrangement med henblik på at kunne tilføje gentagelsesgrupper til den i forudgående trin dannede sekvens A-U eller U-A, bør gentagelsesgrupperne I A og U i den dannede sekvens indeholde midlertidige 11 DK 175970 B1 beskyttelsesgrupper, dvs. grupper, som er 1 stand .til' selektivt at blokere en stilling i gentagelsesgruppen A eller U, som er beregnet til at indgå i en senere .glucosyleringsreaktion. Disse grupper lader.sig fjer-, 5 ne i nærvær af· andre grupper, som er til stede på gen-tagelsesgrupperrié i udgangsmaterialet, idet man genskaber en alkohol, hvilket gør det muligt at gentage det ovenfor beskrevne glucosylerings-trin til forlængelse af glucidinskelettet.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen åbner således adgang til syntesen af oligosacchari der med varierende kæde-grupperinger, hvad enten det drejer sig om stereospecificitet α eller 0 og/eller rækkefølgen i kædedannelsen mellem gehtagelsesgrupperne x, z og/eller y, idet- for-15 længeisen kan gennemføres som ønsket.

I overensstemmelse med endnu et andet arrangement af fremgangsmåden ifølge opfindelsen underkaster man den således fremstillede glucidinkæde.én eller flere kemiske reaktioner f.or at indføre en given type af funk-, 20 tionelle grupper eller successivt flere forskellige typer af grupper, for derpå at danne, dersom detté ønskes, derivater af disse funktionelle grupper.

Dette trin til indførelse af funktionelle gruppér kan gennemføres derved,, at man- kun fjerner visse af beskyt-25 telsesgrupperne og/ellér visse af præcursorerne for de aminogruppeholdige derivater, eller også den samlede mængde beskyttelsesgruppe og/eller prs.cursorer, og idet man i stedet for disse indfører en given type substituent, eller successivt forskellige substitu.ente r, 30 hvorpå man frigiver en del eller, den samlede mængde af de således blokerede OH-grupper, dersom dette ønskes.

Det er her underforstået, at de forskellige grupper, I DK 175970 B1 som foreligger i kædens gentagelsesgrupper, er forlige-' ' lige med de substituenter, der i hvert-enkelt trin indføres.

Den eller de kemiske reaktioner, der tages i brug under 5 trinnet til indføring af funktionelle grupper, gennem føres- på en sådan måde, at de ikke ændrer kædens struktur eller de grupper, som man eventuelt ønsker at opretholde, og/eller sådanne, som allerede er blevet indført.' 10 Man anvender ved en Foretrukken udførelsesform for frem gangsmåden ifølge opfindelsen til opnåelse af oligo-saccharider med specifikke substituenter som ovenfor defineret med fordel udgangsprodukter, som indeholder flere typer af beskyttelsesgrupper-, nemlig (1) en eller 15 flere semi-permanente grupper, og (II) en eller flere permanente grupper. .

Ved udtrykket semipermanente grupper forstår man grupper, som i første omgang lader sig fjerne efter glucosylerings-reaktionerne, når glucidinskelettet indeholder de øn-20 skede antal gentagel.sesgrupper uden fjernelse eller ændring af de øvrige tilstedeværende grupper, hvorved man kan indføre de ønskede funktionelle grupper i. de stillinger, som de optager.

Permanente grupper er grupper, som er i stand til at 25 opretholde beskyttelsen af OH-grupperne under indfø- I

ring af de funktionelle grupper i. stedet for de semi- I

permanente grupper. I

Disse grupper vælges blandt de grupper, som er forli- I

gelige med de funktionelle grupper, som er indført efter I

30 fjernelsen af de semipermanente grupper. Det drejer I

sig derudover om grupper, der er inerte over for de I

13 DK 175970 B1 reaktioner, som gennemføres for at anbringe disse funktionelle grupper, og de lader sig fjerne,, uden at de funktionelle grupper undergår ændringer.

Anvendelsen af -sådanne arrangementer tillader på fordel-5 agtig måde at fremstille en glucidinkæde, hvori gentagel sesgrupperne A og U på selektiv-måde er substituerede.

For ganske særligt at fremstille oligosaccharider indeholdende gentagelsesgrupperne A og/eller U svarende til de ovenfor fremhævede biologisk aktive molekyler 10 anvender man med fordel beskyttelsesgrupper, såsom acyl- grupper, eventuelt substitueret alkylgrupper eller aryl-grupper. Gentagélsesgrupperne i de af type A anvendte produkter indeholder i 2-stillingen en nitrogenhol dig gruppe, som gør det muligt at opretholde tilstedeværelsen 15 af en nitrogenholdig funktion under iværksættelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen... Denne nitrogenholdige gruppe består med fordel af grupper såsom N^- eller N-phthalimidogrupper, éller en hvilken som helst anden gruppe, som udgør en precursor for en aminogruppe eller 20 et aminoderivat, især -NH-acyl og ganske sær.lig -NH-COCH^ samt eventuelt -NHSOj.

Med hensyn til carboxylgrupperne i .gentagelsesgrupperne U, er disse blokerede med grupper, som er inerte over for de reaktioner, der tages i brug ved udskiftningen 2 5 ' af beskyttelsesgrupperne og bort fjernelsesgrupperne ved syntesens afslutning til frigørelse af carboxyl'grup-perne, eventuelt ved afslutningen af saltdannelsen.

Disse beskyttelsesgrupper for·carboxylgrupper er med fordel valgt blandt alkylgrupper eller arylgrupperl 30 Carboxyl-funktionen kan ligeledes opnås efter glucosyle- ringen ved hjælp af en neutral sukkerart og påfølgende selektiv afblokering og oxidation·af den primære alkohol- DK 175970 B1 funktion.

H Man vælger strukturen for det produkt, som tages’ i brug ved glucosyleringsreaktionen, som en funktion af de H ønskede gentagelsesgrupper i glucidinskelettet savel H 5 som af de ønskede substituenter.

H For f-eks. at danne et disaccharid af typen -U.-A- anvender H man to forbindelser, som henholdsvis har uronsyrestruk- H tur og aminosukkerstruktur, og som i øvrigt er i overens- H stemmelse med de ovenfor anførte, de.finitioner.

H 10 Med henblik på forlængelse af kæden indeholder disse I

H forbindelser, således som de anvendes til dannelsen I

H af det pågældende disaccharid, derudover en midlertidig I

gruppe i den- stilling, som er bestemt til· at blive inuol- I

H veret i den nye glucosyleringsreaktionI Med henblik I

15 på en forlængelse af disaccharidet U-A mod venstre befin- I

der denne midlertidige gruppe sig på gentagelsesgruppen I

U, og med henblik på en forlængelse til højre på gentagel- I

sesgruppen A. I

Det er således muligt at opnå i særlig grad kædesystemer- I

20 ne Αχ Az, hvori summen af indextegnene er på mellem I

2 og 12, idet de nævnte værdier er inkluderet i interval- I

let, og idet w og y ikke samtidig kan have værdien 0. I

I Regelmæssige kædefordelinger er af typen U(AU)n, (AU)nA, I

I (UA) eller også (AU) , hvori 1< n<6.

η P . n — — -I

I 25 Man kan ved en variant af gennemførelsen af fremgangs- I

I måden ifølge opfindelsen modificere den skiften mel- I

I lem typerne A-U eller U-A, som man møder i strukturer-

I ne tilhørende de naturlige produkter, idet man anven- I

I der i stedet for én eller flere af gentagelsesgrupper- I

30 ne A eller U en sukkerart, som udgør en bestanddel af I

I en strukturanalog med gentagelsesgrupperne A eller U, I

15 DK 175970 B1 såsom en neutral sukkerart eller en desoxysukkerart, eller også andre gentagelsesgrupper af typen uronsyre . eller aminosukkerarter U eller A med afvigende konfigura- . tioner.

5 Man.omsætter ved en. foretrukken udførelsesform for frem gangsmåden ifølge opfindelsen den ovenfor beskrevne' alkohol med et reaktionsdygtigt derivat, såsom et halogenid, et imidat eller en orthoester. Disse kondensationer gennemføres under vandfrie reaktionsbetingelser.

10 Kondensationsreaktionen mellem halogenidet og alkoholen.

er mest fordelagtig af typen Koenigs^Knorr. Halogenidet består fortrinsvis af et bromid eller et chlorid på grund af den bekvemme tilgængelighed.

Der arbejdes i opløsningsmiddelmedium, især i et organisk 15 opløsningsmiddel, særligt af typen dichlormethan eller dichlorethan.

Man anvender med fordel en katalysator, i almindelighed et sølvsalt eller et kv.iksøl vsalt, f.eks. søl vtrifluor-methansulfonat, soro i almindelighed betegnes som sølv-20 triflat, sølvcarbonat, sølvoxid, mercuribromid eller mercuricyanid. Man anvender ligeledes en protonacceptor, såsom sym-collidin såvel som et opsamlingsmiddel for . det vand, der eventuelt er til stede og/eller for den dannede hydrogenhalogensyre, f.eks. en molekular.sigte 25 k å’

En undersøgelse-af reaktionsbetingelserne viser, at det er passende at arbejde ved omgivelsernes temperatur eller ved en lavere temperatur, som kan nå ned på 0 °C eller lavere, og under en atmosfære af inert gas, 20 såsom nitrogen eller argon.

DK 175970 B1

I I

Disse betingelser gør det muligt at kondensere gentagel- I

H sesgrupper med strukturen x og y eller, z (eller omvendt) I

i overensstemmelse med den ønskede stereokemi. De tills- I

der ligeledes etableringen af coyalente bindinger med I

H 5 neutrale sukkerarter eller med desoxysukkerarter.· I

En variant, som indbefatter anvendelsen som katalysator I

H af mercuriderivater, især af mercuricyanid og/eller I

mercuribromid, har vist sig pa'ssende til fremstillingen I

af covalente bindinger mellem alkoholer med varierende I

H 10 struktur og en udgangsforbindelse for L-idose med et I

H gentagelsesmotiv med strukturen z (L-iduronsyre). Ifølge I

H denne variant anvender man ligeledes molekylærsigter I

H 4 A. Det organiske opløsningsmiddel er valgt i overens- I

stemmelse med reaktiviteten med alkoholen. Man anvender I

15 således med·fordel et opløsningsmiddel af typen nitro- I

H benzen, når kondensationen kræver en temperatur over I

H 100 °C. For lavere temperatur anvender man opløsningsmid- I

H ler såsom benzen eller.dichlormethan. Opløsningsmiddel- I

blandinger egner sig ligeledes til gennemførelse af I

20 kondensationsreaktionen. I

Det er med gentagelsesgrupper af typen U muligt at anvende I

en orthoester som reaktionsdygtig gruppe. Man gennemfører I

I så fortrinsvis reaktionen ved en temperatur over 100 I

I °c. I

I 25 Opløsningsmiddelmediet er af typen chlorbenzen eller I

I et hvilken som helst andet opløsningsmiddel, hvis koge- I

I punkt ligger højere end 100 °C, og som fortrinsvis be- I

I finder sig mellem 100 og 150 °C. For at aktivere reak- I

I tionen anvender man en katalysator, såsom 2,6-dimethyl- I

I 50 pyridiniumperchlorat. I

I Denne udførelsesform for kondensationstrinnet har vist I

I sig at være af stor interesse ved etableringen af en I

17 DK 175970 B1 intergiycosidisk binding mellem en gentagelsesgruppe med.strukturen U (uronsyre) og en gentagelsesgruppe med strukturen A (D-galactosamin).

Anvendelsen af en orthoestergruppe udviser især en· dob-5 belt fordel.

På den ene side gør den det muligt at overføre til det anomere carbonatom i U den reaktivitet, som er nødvendig til glucosyleringsreakt ionen. På den anden side sikrer åbningen af denne gruppe placering i 2-stillin-10 gen . i-'11 af en beskyttelsesgruppe,, der selektivt lader sig fjerne, hvorved den tillader indføringen i stedét derfor af en specifik substitutionsgruppe.

Det er således muligt ved reaktion mellem en gruppe 1,2-0-méthoxyéthyliden i én gentagelsesgruppe U og' grup-15 pen -OH i en gentagelsesgruppe x på én gang at etable- · re en interglucosidisk binding.mellem de to anvendte produkter og at anbringe i 2-stillingen i U en gruppe -OAc (idet Ac betegner·en acetylgruppe), som vil kunne fjernes selektivt efter afslutningen af indføringen 20 af en given funktionel gruppe, f-eks. -SO^./Dette. ar rangement tillader ligeledes fuldstændig frihed til behandling af 4-stillingen i gentagelsesgruppen U.

Når man som reaktionsdygtig gruppe anvender en imidyl-gruppe, har. det vist sig passende at arbejde ved lave 25 temperaturer, især ved en temperatur lavere, end eller lig med ca. 0 °C, og i opløsningsmiddelmedium, især i dichlormethan, i nærvær en molekularsigte 4 Å og af en katalysator, såsom bortrifluoridetherat.

Den frie OH-gruppe indtager' i udgangsalkoholen den stil-30 ling, som man ønsker at anvende ved glucosyleringsbin- dingen. Dét er gennem valget af den passende alkohol I DK 175970 B1 I 18 således muligt at etablere bindinger.af typen 1-2, 1-3, 1-4 eller 1-6.

Ud fra den sekvens, som er dannet ved afslutningen af kondensationsreaktionen, opbygger man derpå en kæde 5 indeholdende det ønskede antal gentagelsesgrupper, idet man gentager glucosyleringstrinnet.

Alkoholgruppen i en af gentagelsesgrupperne A eller

Uj som er indvolveret i den allerede opbyggede gluci- H dinsekvens frigives derfor med fordel fra sin midler- H 10 tidigé beskyttelsesgruppe. Valget, af denne gruppe vil H let kunne bestemmes af fagmanden afhængig af arten af H de øvrige på glu'cidinkæden tilstedeværende grupper.

H Blandt de forskellige grupper, som,kan anvendes, kan

H man nævne allylgruppen, som ved behandling, eksempelvis I

15 først med et isomeriserende middel såsom et derivat I

. af Pd, Rh eller Ir, i særdeleshed tris-triphenylphosphin- I

H rhodium(I)chlorid eller kalium-tért-butoxid, og deref- I

ter med en syre, i særdeleshed med en blanding af mer-' I

curioxid og mercurichlorid, .gør det muligt let at gen- I

. 20 skabe en alkohol i den stilling,.som denne .gruppe optager. I

H På samme måde er det muligt at opnå en -OH-gruppe ved I

hydrolyse af en -0-acy1-gruppe, i særdeleshed -O-acetyl,

-0-chloracetyl eller -0-lævulinyl. I

I Disse radikaler kan elimineres med henblik på at fri gi- I

.25 ve en -OH-funktion, f.eks. ved hjælp af thiourinstof I

i et opløsningsmiddel, idet man med fordel anvender I

I en temperatur på over 80 °C, fortrinsvis af størrelses- I

I ordenen 100 °C. I

I De foregående forholdsregler gør det muligt at opnå I

30 en carbonhydratkæde med skiftende gentagelsesenheder I

19 DK 175970 B1 A-U og U-A.

Denne regelmæssige omskiftning kan modi ficeres ved anvendelse af passende produkter i glucosyleringsreaktionen.

Det er således muligt at tilvejebringe en uregelmæssig 5 struktur, hvori.der er inkorporeret andre enheder end U eller A, i særdeléshed neutrale sukkerarter eller også desoxy-sukkerarter. En anden type uregelmæssig struktur kan opnås ved at indskyde flere på hinanden følgende A-enheder eller U-enheder imellem to geritagel-10 sesenheder med strukturen A-U eller. U-A.

Det skal forstås, at de forskellige arrangementer ifølge opfindelsen med hensyn til enhederne A og U også' gør sig gældende for andre enheder, som kan indgå i carbonhydrat.kæden, såsom neutrale sukkerarter eller 1.5 desoxysukker arter.

5om allerede anført vælges de forskellige grupper, som ér til stede på enhederne A og U,.på en sådan måde, at de bibringer disse enheder en reakt ivi tetsom er tilstrækkelig til at tilvejebringe den pågældende gly-20 cosidiskebinding.

Beskyttelsesgrupperne for -OH-grupperne, bortset fra de allerede omtalte midlertidige grupper, vælges i almindelighed inden for en gruppe omfattende acylgrupperne (især acetyl, alkyl, alkyl, som eventuelt er substitu-25 eret, såsom med benzyl), og for to nabostillede stillin ger blandt acetalgrupperne eller cetalgrupperne, f.eks. benzyliden. En anden form For beskyttelse består deri, at man gennemfører en blokering af de to OH-grupper på epoxidform eller i form af en 1,6-anhydro-bro.

30 De ved glucosyleringsreaktionen anvendte produkter in deholder med fordel flere typer beskyttelsesgrupper,

I DK 175970 B1 I

hvilket tillader under forløbet af behandlingstrinnet . I

til:ind føring af funktionelle grupper successivt at I

indføre en eller flere funktionelle grupper og at fri- I

give en eller flere OH-grupper, dersom dette ønskes. - I

5 Beskyttelsesgrupperne kan i almindelighed allerede ind- I

tage forud fastlagte stillinger .på de produkter, der I

tages i brug ved glucosy ler ingsreaktionen . I

Dé kan ligeledes indføres ud fra andre grupper, når I

først man har dannet glucidinskelettet. Denne variant I

10 indbefatter f.eks. anvendelsen til glucosylering af- I

et produkt A, hvori O.H-grupperne i stillingerne 2 og I

3 og i stillingerne 1 og 6 er blokerede på anhydro-form, I

henholdsvis 2,3-epoxyderet og 1,6-anhydro. Takket være I

denne blokering har man til disposition under, opbygnin- I

15 gen af glucidin-skelettet et indgående element, som - I

potentielt er af gentagelsesgruppen A, men som ikke I

. interfererer ved de reaktioner, der tages i brug under I

syntesen. Dette arrangement udviser den fordel, at det I

giver stor frihed til gennemførelse af de ønskede reak- I

20 tioner på grupperne på de øvrige gentagelsesgrupper. I

Det skal i øvrigt bemærkes, at åbningen af epoxid-funk- I

tionen i det foreliggende tilfælde ved hjælp af natri- I

umazid gør det muligt at indføre i 2-stillingen en N^- I

gruppe, som således udgør e.n præcursor for en amino- I

25 funktion. . I

Man anvender på foretrukken måde for· at have til rådig- I

hed en glucidinkæde, som gør det muligt selektivt at I

indføre en eller flere typer af substituenter under I

trinnet til indføring af funktionelle grupper, især I

30 de ovenfor beskrevne specifikke substitutioner, produk- I

ter, som indeholder Flere typer af beskyttelsesgrupper, I

nemlig såvel semi-permanente grupper som permanente I

21 DK 175970 B1 gruppert som tidligere defineret.. Substituenterne i de omtalte naturlige produkter, med undtagelse af så-, danne, der befinder sig i 2-stillingen i gentagelses-grupperne-A, består som allerede indikeret' i hovedsagen 5 af sulfatgrupper.

Man har nu gennemført undersøgelser for at fastlægge de passende· betingelser for sulfateringen, hvilket har vist, at det er muligt og samtidig fordelagtigt at’gennemføre en sulfateringsreaktion i nærvær af benzylgrup-10 per. 1 modsætning til almindelig mening inden for dette område kan man gennemføre elimineringen af permanente benzylgrupper i nærvær af -O-sulfatgrupper.

OH-grupperne i de udgangsforbindelser, som er.bestemt til at blive sulfaterede, beskyttes derfor på foretruk-15 ken måde ved acylgrupper, især acetyl grupper, medens OHrgrupperne, der er beregnet til at blive frigivet I . ved afslutningen af syntesen, beskyttes med én perma nent gruppe, såsom en benzylgruppe.

Ved én særlig smidig udførelses form for fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen er. det muligt at underkaste hele den således- fremstillede glucidinkæde en given kemisk reaktion med henblik på at indføre en fastlagt type substituent.

Denne behandling kan f.eks-. bestå i en esterif icering, 25 især en sulfatering ved hjælp af et passende middel, som gennemføres under reaktionsbetingelser, som ikke ændrer "ose"-strukturen. Denne sulfatéring kan gennemføres på specifik måde eller på ikke-specifik måde eventuelt på det fuldstændigt ikke-beskyttede glycosid.

30 Trinnet til indføring af funktionelle grupper gennemføres imidlertid ved· en foretrukken udførelsesform for frem- ______ I DK 175970 B1 gangsmåden ifølge opfindelsen selektivt således, at man.· successivt indfører i kæden flere typer af substi-

tuenter, hvorpå man frigiver visse OH-grupper. I

Man anvender under reaktionsbetingelser, som er ganske I

H 5 særlig fordelagtige, og som gør det muligt at indføre

H sulfatgrupper på fastlagte stillinger i gentagelsesgrup- I

H perne, at frigive OH-grupper i andre stillinger, og

at danne i 2-stillingen gentage'lsesgrupper A af et ami- I

noderivat og i 6-stillingen gentagelsesgrupper U af I

10 syrederivater, idet sådanne gentagelsesgrupper svarer I

til de' i det følgende anførte karakteristika. I

De semipermanenté gruppér i disse, gentagelsesgrupper I

indtager de stillinger, som er bestemt til at blive

sulfaterede, og de består af -0-acetylgrupper. I

15 Med hensyn til de stillinger, der svarer til en QH-grup- I

pe, som er bestemt at blivefrigjort, indtages disse I

af semipermanente grupper bestående af benzylgrupper I

H eller af andre permanente grupper. I

2-Stilli'ngerne i gentagélsesgrupperne A substitueres I

20 med grupper såsom eller NH-phthalimidy1 eller -NH- I

I acetyl, og 6-stillingerne i gentagelsesgrupperne U ind-

I tages af carboxylgrupper, som er beskyttet med en al- I

I kylgruppe især med en methylgruppe. I

I Disse reaktionsbetingelser gør det muligt at gennemføre I

I 25 trinnet til indføring af funktionelle grupper f.eks. I

på følgende måde; I

Man indfører først selektivt sulfatgrupperne efter at I

have fjernet de blokerende -Q-acetylgrupper. Denne reak- I

I tion gennemføres således, at den ikke indvirker på benzyl- I

I 30 grupperne eller på de tilstedeværende nitrogenholdige I

23 DK 175970 B1 og carboxylholdige grupper.

Med.henblik herpå gennemfører man med fordel en forsæbningsreaktion ved hjælp af en stærk base såsom natriumhydroxid.

5 Denne reaktion gennemføres fortrinsvis ved en tempera tur lavere end omgivelsernes temperatur, især i nærheden af 0 °C.

Man underkaster det derved opnåede reaktionsprodukt hydrolyse under indvirkning af et alkylerihgsroi’ddel 10· for at indføre på carboxylgruppen beskyttelses-alky1- grupperne, som er blevet fjernet under hydrolysen.

Ved reaktion med et sulfateringsmiddel opnår man så indføringen af sul f a'tgrupperne i de stillinger, som er blevet frigivet ved hydrolysen, og som er efterladt · 15 . frie efter indvirkning af alky.leringsmidlet.

Til gennemførelsen af sulfateringen tilfredsstillende reaktionsbetingelser omfatter anvendelsen af et sulfateringsmiddel, såsom et trimethylamin/SO^'-kompléx. .Man gennemfører med fordel denne reaktion T opløsningsmiddel-20 medium, især i et opløsningsmiddel såsom dimethylfor- mamid. Der arbejdes fortrinsvis ved en temperatur højere end omgivelsernes temperatur, i almindelighed i nærheden af 50 °C, hvilket svarer til en reaktionstid på ca,.

12 timer.

25 Efter indføringen af sulfatgrupperne på alkoholgrupperne fortsætter man med frigivelsen af de OH-grupper, som er blokerede med benzylgrupper.

Fjernelsen af benzylgrupperne gennemføres med fordel ved katalytisk hydrogenering under betingelser, som I DK 175970 B1 I 24 er forligelige' med opretholdelsen af sulfatgrupperne og omdannelsen af de nitrogenholdige grupper til grup-per indeholdende aminofunktionen.

Man arbejder fortrinsvis' under et hydrogentryk i nærvær 5 af en katalysator af typen Pd/C.

Denne reaktion gennemføres med fordel i organisk o'pløs- ningsmiddelmiljø, især i alkoholisk medium tilsat vand.

H Til opnåelse af hydrogeneringen af de nitrogenholdige udgangsmateri ale-grupper og fjernelsen af beskyttelses- 10 grupperne for OH-grupperne, gennemføres reaktionen m'ed fordel i et tidsforløb på ca. 3-4 dage.

Som det tidligere er antydet, foreligger i de pågældende biologisk aktive molekyler de funktionelle aminogrupper i form af derivater af typen N-acetyl-, fil dannelse 15 af N-acetyl-grupper underkaster man det reaktionsprodukt, som stammer fra hydrogeneringsreaktionen, en indvirkning af et acetyleringsmiddel. Hertil udgør eddikesyreanhydrid I et særligt passende·middel.

I Til gennemførelse af denne selektive acyleringsreaktion I uden indflydelse på de øvrige på gentagelsesgrupperne 20 tilstede varende substituenter er det iser bekvemt at I arbejde ved basisk pH, issr i nsrheden af 8 og i vandigt I medium.

I Man kan ligeledes ønske at danne N-sulfat-gruppef, hvilket I kan lade sig gennemføre ved hjælp af et sulfateringsmid- I 25 del af den ovenfor angivne type. Til denne sulfatering anvender man pH-værdier større end 9, med fordel i ster- I relsesordene 9 - 10.

I Efter sulfateringsreaktionen eller acetyleringsreaktionen 25 DK 175970 B1 fører tilsætningen af eh stærk base til frigivelse a'f · carboxy1grupperne.

De således dannede produkter kan let overføres på saltform ved hjælp af ionbytterharpikser med en passende kation.

5 Ved naturlige produkter er den særlige kation sædvanlig vis natrium. Man anvender således- med fordel natriumkat-ionbyttende harpikser.

«

Man kan ligeledes danne salte med kalium, lithium, magnesium og calcium. Man anvender så en protonbyttende 10 harpiks, hvorpå man neutraliserer, den dannede syre med kationbasen..

Opfindelsen angår ligeledes oligosaccharider, som udgør mellemprodukter i de forskellige trin ved den ovenfor definerede syntesefremgangsmåde.

15 , I en familie indeholder disse oligosaccharider mindst ét binært gentagelsesgruppemønstér A-U eller U-A, som er fuldstændig beskyttet,· og som besidder enten en reaktionsdygtig gruppe på dét -anomere carbonatom i den gentagelsesgruppe,. hvis ende. er reducerende, eller en enkelt 20 fri OH-gruppe på den gentagelsesgruppe, hvis ende er ikke-reducerende, idet denne OH-gruppe indtager stillingen 3, 4 eller 6, når det drejer sig om en gentagelsesgruppe A, og stillingen 2, 3 eller 4, når det drejer sig om gentagelsesgruppe U.

?5 1 en anden familie består oligosacchariderne af fuld stændigt beskyttede gentagelsesgrupper, således som de er opnået ved afslutningen af glucosyleringstrinnet.

Endnu en anden familie omfatter produkter, i hvilke én eller flere OH-grupper ef frigjorte.

30 Disse forskell-ige oligosaccharider indeholder en kæde ! I DK 175970 B1

baseret på binære gentagelsesgrupper med strukturen I

(A-U) eller (U-A) , hvori n er et tal fra 1-6. I

η η I

Disse oligosacchari der svarer til en kædedannelse af I

typen x - y eller også x - ϊ. I

5 I e'n gruppe af olig'osacchar idmellemprodukter ifølge I

opfindelsen består glycosidksden af en enkelt type af I

disse binære kædegrupperinger.' I

I en anden gruppe foreligger flere af disse typer. I

De tilsvarende oligosaccharider indeholder i deres kæder I

10 gentagelsesgrupperne x-y og x-z. . I

Det er underforstået, at rækkefølgen i de ovenfor be-' I

skrevne kædedannelser i den· ene eller i flere af· de . I

binære gentagelsesgrupper kan være byttet om og stadig I

befinde sig inden for opfindelsens rammer. I

15 Ved en variant indeholder oligosaccharid-mellemprodukter- I

ne, som ovenfor defineret, en eller flere konsekutive I

gentagelsesgrupper x eller også y. eller z. . I

Ved en. anden variant indeholder oligosaccharid-mellempro- I

dukterne én eller flere gentagelsesgrupper af neutrale I

20 sukkerarter og/eller flere desoxysukkerarter i struk- I

turen. De forskellige beskyttelsesgrupper for disse I

sukkerarter svarer'til de ovenfor anførte definitioner I

i forbindelse med gentagelsesgrupperne A og U. I

I disse oligosaccharider er de indgående gentagelsesgrup- I

25 per indbyrdes forbundne ved bindinger af typen 1-2, I

1-3, 1-4 eller 1-6 afhængig af arten af den anvendte I

alkohol i glucosyleringstrinnet. I

27 DK 175970 B1

De oligosaccharider, som har struktur som fragmenter af chondroitiner, chondroitinsulfater eller dermatansul-· fater indeholder bindinger af typen 1 —> 3, og de indeholder-henholdsvis gentagelsesgrupperné y 1*—^^ 3 x., 3 z 1 ——^ 3x , x 1 -—> 4z og x 1 -—> 4y .

En foretrukken gruppe af oligosaccharider indeholder mindst en binær gentagelsesgruppe, som har en struktur af typen x 1 —^ 4y, dvs. [D'-galactosamin ] 1 —^4 [D-glucuronsyre], hvilket svarer til formlen (I):

OR COOM

Rl°

V \Λ Ar V-0R

Yot J O /\\^Λ J

W ORl 10 hvori: - grupperne R^, som kan være identiske eller forskellige, eventuelt sammen med R betegner en beskyttelsesgruppe,· især en sp (semi-permanent.) eller en p (permanent) gruppe, 15 - T betegner en midlertidig gruppe t, eller en perma nent gruppe p, eller et hydrogenatom, - N betegner en nitrogenhol dig gruppe, som er precursor for en aminogruppe eller et amino-derivat, - R betegner en alifatisk eller aromatisk gruppe, især 20 en alkylgruppe, indeholdende 1-4 carbonatomer, hvori OR betegner en reaktionsdygtig gruppe, såsom et halogenid, eller også er R en alkylgruppe, og - m -betegner en gruppe, som blokerer syrefunktionen-, idet alle disse forskellige symboler har den ovenfor 25 anførte betydning.

I en undergruppe er samtlige grupper R, R^ og T identiske, I DK 175970 B1

I 28 I

og de betegner' en gruppe p eller. sp. I

I en anden undergruppe er grupperne forskellige fra · I

hverandre, idet mindst én af dem betegner en gruppe I

H af typen sp, eventuelt sammen med.R, idet den eller I

5 de andre grupper betegner en gruppe p. I

H Det skal bemærkes, at de almene betegnelser for symboler- I

ne''i formlen (I) ligeledes er gyldige ved formlerne’ I

af de i det følgende forskellige omtalte grupper. Man, I

H genfinder dog i hver af disse grupper især de ovenfor I

10 fremhævede to undergrupper. I

H Foretrukne oligosaccharider omfatter gentagelsesgrupper I

med de i det følgende anførte formler (II) - (V):. I

I . Opou Osp COOM I

I Opou Osp ) ^ v /V / 0 \ I

I (? y (ii) i

I ’ π I I

°p I

I i— ^ I

I ?/ °\ /Λ / \ I

/ \/ \ . /COCMe \r,R UII)

I \[T / °/ ^ I

I N Op i COOM _ .

I _Cp ou Osp

I J-o Osp ou Op l-0 I

I /cp (IV) I

I 'w I

I Op N · I

29 DK 175970 B1

J

(—°?

A— 9 n=rJ—O

/coa-j \ \ lxn

LCp V----*L· WOR

To\i / \l /

°? N

Man vil bemærke, at oligosacch’ariderrie (II) og (IV) gør det muligt at gennemføre esterificeringsreaktioner, især sulfateringer, i 4- eller 6-stillingen henholdsvis i galactosamin-gentagelsesgruppen og glucuronsyre-genta-5' gelsesgruppen, idet man kan forlænge kæden.

01 igosaccharidérne med formlerne (III) og (V) gør det muligt at gennemføre de pågældende reaktioner henholdsvis i 4-stillingen i galactosamin eller i iduronsyre, og dette ligeledes samtidig med en forlængelse af kæden.

10’ '1 formlerne (II) - (V) har de anførte symboler, hvad enten de foreligger uafhængig eller i kombination, følgende betydninger: - M betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe,· især methyl, 15 - sp betegner en acylgruppe, især acetyl, - p betegner en substitueret alkylgruppe, især benzyl, - R betegner en acylgruppe i a eller β, især en acetyl-gruppe, en alkylgruppe, især methyl eller substitueret alkyl , især benzyl, eller -OR, et halogenatom, især 20 et bromid, eller en imidylgruppe, - N betegner en azido-gruppe eller phthalimidogruppe, - T betegner gruppen t, som repræsenterer en.acylgruppe, især acetyl, en halogeneret acetylgruppe, især en monochlor- eller trichloracetylgruppe, eller gruppen 25 p betegnende en substitueret alkylgruppe især benzyl- gruppen, som eventuelt selv er para-methoxy, eller I DK 175970 B1 • også et hydrogenatoro.

En anden foretrukken familie af oligosaccharider, som I

indgår inden for opfindelsens rammer, svarer, til sådanne I

produkter, i hvilke beskyttelsesgrupperne er blevet 5 partielt fjernet under syntesens forløb. Sådanne produk- I

ter indeholder isår en OH-gruppe i stedet for grupperne

i I

En foretrukken gruppe af trisaccharid-mellemprodukter I

har en struktur, som svarer til en af efterfølgende I

10 formler (VI) - (IX): I

9°°“ Op eller Osp OpellerOsp COOM

°P qJ* :i Op I

^oa(v 11] °p e-^leros p (fXXi ZellerOsp

i—- 1 - Λ eller .. I

\OT y ° ( \vor<VI11* I

N Op N I

r— Op I

ellpr I eller i-Od I

Opeiieros t——O _Q 0spj_o I

Ύ ° Vpr(ιχ) I

31 DK 175970 B1 hvori de forskellige symboler har den tidligere anførte betydning.

Andre foretrukne oligosaccharid-mellemprodukter består af tetrasaccharider. Ét særligt fordelagtigt tetrasaccha-5 rid har efterfølgende strukturformel (X): CCCM ropeUero5p cæ» · op^osp J— O cp^wP-o j—oo^cpi-^o K Cp O) 7 Op Y λ! V-oh(X)

Cp N · Op N

Som det er fremhævet ovenfor i forbindelse med de binære gentagelsesgrupper, angår opfindelsen ligeledes de ovennævnte oligosaccharider, hvori en, flere eller eventuelt det samlede antal OH-g.rupper foreligger i frigivet til-10 stand under syntese forløbet.

Opfindelsen angår derudover som hidtil ukendte forbindelser ol igosaccharide'rne, der svarer til henholdsvis de ovenfor angivne forskellige definitioner, men som. indeholder en eller flere funktionelle grupper.

15. Disse funktionelle grupper består fortrinsvis af estere, og de foreligger ganske særlig i form af uorganiske anioner.

Estere, som er særligt foretrukket på grund af deres tilstedeværelse i de biologisk aktive molekyler af typen 20 chondroitiner og chondroitinsulfater samt dermatan-sul-fat, består af sul fatestere.

Andre fordelagtige estere svarer til phosphatesteré.

DK 175970 B1

Disse funktionelle grupper er båret af en eller flere primære alkoholgrupper og/eller sekundære alkoholgrup-per og/eller primære aminogrupper.

En foretrukken.familie'af oligosåccharider ifølge opfin-' 5 delsen indeholder ligeledes gentagelsesgrupper x, som indeholder en anion, som defineret ovenfor, i 6-stil- lingen og/eller 4-stillingen.

Oligosacchariderne i denne familie indeholder i 2-stil- H lingen i disse gentagelsesgrupper x en funktionel pri- 10 mær aminogruppe, som med fordel er substitueret med en sulfatgruppe eller med en andén substituéntgruppe.

I de oligosåccharider ifølge opfindelsen, som indehol- der mindst to gentagelsesgrupper x, kan den funktionelle aminogruppe i 2-stillingen være substitueret med én H 15 og samme gruppe eller med forskelligartede grupper.

En foretrukken gruppe af oligosåccharider af den pågæl- dende familie indeholder gentagelsesgrupper x, som inde- holder sulfatgrupper eller sekundære alkoholgrupper I og/eller primære alk.oholgrupper.

20 Foretrukne oligosåccharider i denne gruppe indeholder I i 2-stillingen i disse gentagelsesgrupper en NH-acyl- gruppe især NH-acetyl. Andre oligosåccharider indeholder

I en NH-50^~-gruppe. I

I 25 De i det følgende omtalte estere foreligger fortrinsvis I

I i form af salte med en uorganisk eller organisk kation, I

I især en metalkation, og særligt en alkalimetalkation, I

I eller også med en kation afledt af en nitrogenhol dig I

I organisk base, f.eks. triethylammonium. I

I 30 Anvendte kationer består af natrium. Andre kationer I

33 DK 175970 B1 er ligeledes anvendelige, såsom kalium, magnesium eller calciumkationer.

Ved en anden foretrukken familie af oligosacchariderne . ifølge opfindelsen er carboxyl grupperne i gen tagel ses-5 grupperne y eller z frie, eller de foreligger fortrins vis i form af salte med en organisk eller uorganisk' kation, som ovenfor defineret. De kan ligeledes være beskyttet som tidligere beskrevet.

Andre foretrukne reaktionsprodukter udviser sulfater 10 i gentagelsesgruppen y·.

Inden for disse forskellige familier af oligosaccharider er hydroxylgrupperne i pyran-ringene mere specielt de anomere hydroxylgrupper (på grund af deres stabilitet) enten frie eller beskyttede af permanente beskyttelses-15 grupper af alkyltypen, især af methylgrupper.

Foretrukne reaktionsprodukter inden for disse forskellige familier indeholder· i kombination gentagelsesgrupperne A og U svarende til de ovenfor anførte karakteristika.·

Den farmakologiske undersøgelse af oligosaccharider 20 med denne type struktur har påvist biologiske aktivite ter hos visse af disse forbindelser, som gør det muligt på specifik måde at regulere visse trin i blodets koagulation (Griffith M.J. og Marber G.A., Biochem. Biophys.

Res. commun; 112 (1983) 663-670).

25 Den foreliggende opfindelse angår således ligeledes anvendelsen af disse forbindelser ved opbygningen af biologiske reagenser, som er anv.endelige i laboratoriet,· især som sammenligningselementer ved undersøgelsen af andre substanser, hvor man ønsker at afprøve aktivi-30 teten over for koagulationen.

I DK 175970 B1

Man har gennemført undersøgelser,·der har vist, at denne

type produkt er i stand til at udøve en· kraftig anti- I

thrombotisk aktivitet. (E.G. Va'irel et al. Ann. Pharm.

Franc, under trykning).

5 Derudover har derivaterne ifølge opfindelsen stor inte- I

resse til bekæmpelse af vanskeligheder i vaskulære vægge (atheroscleroser og arterioscleroser) samt ved. ældning I

af væv.' De har ligeledes indvirkning på cellernes ad- I

hæsion. Derudover har de den fordel, at de ikke har I

10 en aktiverende virkning på blodpladeaggregationen og I

ikke at medføre thrombocytopeni. De har ligeledes den I

fordel, at de er praktisk talt blottet for indvirkning I

på blødningstiden, hvilket eliminerer blødningsresicsi. I

Disse to egenskaber er overordentlige vigtige ved anven- I

15 delse inden for medicinen, I

Qligosacchariderne ifølge opfindelsen er derudover prak- I

tisk talt fri for toxicitet. I

Disse produkter er således ganske særlig værdifulde I

ved udviklingen af lægemidler, der er anvendelige·især. I

20 ved behandlingen af koagulations-forstyrrelser, ved I

ældningen af væv samt ved vanskeligheder med cellede- I

lingen·. I

Opfindelsen angår således ligeledes farmaceutiske præ- I

parater indeholdende disse oligosaccharider. I

25 Opfindelsen angår især farmaceutiske præparater, som I

er fri for pyrogene indholdsstoffer, og som indeholder I

en effektiv mængde aktiv bestanddel sammen med farma- I

ceutiske strækkemidler. I

Den angår ligeledes præparater, hvori det farmaceutiske I

30 bærestof er velegnet til peroral indgift. Indgivnings- I

35 DK 175970 B1 former, som er passende til peroral indgift, kan med fordel være gastro-resistente gelatinekapsler, tabletter, piller, eller produkterne kan foreligge i form af liposomer eller drikkelige opløsninger.·Disse præpa-5 rater indeholder med fordel 50 mg til 5 g pr. vægtenhed, fortrinsvis 100 - 250 mg for gelatinekapsler, tabletter og piller, og fra 1 '- 5 g for de-drikkelige opløsninger.

Andre farmaceutiske præparater- indeholder disse oligosac-charider sammen med passende strækkemidler til rektal .

10 indgift. Tilsvarende indgivningsformer består af sup positorier.

Andre former for indgift består af aerosoler eller af salver.

Opfindelsen angår ligeledes farmaceutiske præparater 15 til injektionsbrug, som er sterile eller som er steri- liserbare, til indgift enten intravenøst eller intra-muskulært eller subcutant.

Disse opløsninger indeholder med fordel 50 - 250 mg oligosaccharider, fortrinsvis 100 - 150 mg T.eks. 150 -20 mg/ml, når disse opløsninger er beregnet til injektion subcutant. De kan indeholde f.eks. 25 - 250, især 150 mg/ml oligosaccharider, når' de er beregnet til intravenøs indsprøjtning eller til indgift ved perfusion.

Sådanne farmaceutiske præparater kan foreligge i form .25 af engangssprøjter klar til anvendelse.

Andre præparater foreligger i form af drikkelige opløsninger fortrinsvis indeholdende 50 mg til 5 g aktiv bestanddel.

Opfindelsen angår ligeledes farmaceutiske præparater I DK 175970 B1

indeholdende disse oligosaccharider sammen med en anden aktiv bestanddel, som især er anvendelig ved pro-, I

phylaxe og behandling af thromb'oser, såsom et vene-tonisk middel som dihydroergotamin, et nicotinsyresalt eller' I

5 et thrombolytisk middel som urokinase. I

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er sær- I

ligt egnede til regulering (forebyggende eller.· helbre- I

dende) af visse trin i blodets koagulation (hos menne- I

sker eller hos dyr), især i sådanne tilfælde, hvor .pa- I

10 tienten er underkastet risiko for h.yperkoagulabilitet, I

hvilket især stammer fra kirurgiske operationer, at'he- I

romatøse processer, udvikling af tumorer og koagulations- I

forstyrrelser gennem aktivatorer af bakteriel eller I

enzymatisk oprindelse. I

15 Præparaterne ifølge opfindelsen er særlig egnede til I

at bekæmpe ældning af væv eller manifestationer af de- I

generativ art., såsom alopecier. De anvendes ligeledes I

ved behandlingen af åtherosclero.se-tilstandé og ved I

celledelingsvanskeligheder. I

20 Til belysning af opfindelsen er i det følgende anvendt I

et eksempel på posologi, som kan anvendes hos menne- I

sker: denne posologi består f.eks. af indgift til.en I

patient af 50 mg til 150 mg subcutant 1 - 3 gange dag- I

lig afhængig,af niveauet for risikoen for hyperkoagula- I

25 bilitet eller patientens thrombotiske tilstand, eller I

af 150 mg/24 timer ved intravenøs indgift med diskon- I

tinuert indgift med regelmæssige intervaller, eller I

kontinuert ved perfusion eller også 150 mg (3 gange I

pr. uge) intramuskulært eller subcutant. Disse dose- I

30 ringer kan naturligvis reguleres for den enkelt.e pa- I

tient som en funktion af de opnåede resultater og af I

forinden gennemførte blodanalyser, af arten af den li- I

delse, der foreligger, samt af sundhedstilstanden i I

37 DK 175970 B1 almindelighed.

Opfindelsen angår ligeledes ud over farmaceutiske præparater indeholdende oligosacchariderne, som de foreligger, farmaceutiske præparater indeholdende mindst 5 ét oligosaccharid som ovenfor defineret, som er for bundet med covalent binding til ,et opløseligt bærestof, eller et uopløseligt bærestof, fortrinsvis ved hjælp af en sukkerart med endestillet reduktionsgruppe.

i : -

Andre foretrukne forbindelser med opløselige bærestof-10 fer udgøres af et oligosaccharid, der er fikseret til et bærestof såsom et -protein, især polylysin, eller bovint serumalbumin.

Disse produkter er anvendelige som · immunogener, der i sig selv er kilder til antistoffer, som cirkulerer 15 produkterne in vivo eller til monoclonale antistoffer, som er klonet in vitro ved passende teknik.

Oligosacchariderne ifølge opfindelsen kan også fortrinsvis være bundet til uopløsel.ige bærestoffer. Her anvendes med fordel de klassiske bærestoffer.- 20 Disse forbindelser er anvendelige som immunoabsorban- ter, f.eks. ved dosering deraf eller ved udviklingen gennem fiksering på polymere, som er anvendelige ved levende væv-, og nye athrombitiske polymere, som er forligelige med blod.

25 Opfindelsen angår ligeledes anvendelsen af de pågælden de oligosaccharider inden for nuclarmedicinen som radio-farmaceutiske produkter. Disse produkter markeres så ; med sporemidler valgt blandt de hyppigt inden for dette i område anvendte, især ved hjælp af technetium 99 m.

I DK 175970 B1

Med henblik herpå omdanner man technetium 99 m opnået ud fra kommercielt tilgængelige generatorer i form af ikke-reaktionsdygtigt natriumpertechnitat med valensen 7 til technetium reduceret til valensen 4, som er deri 5 mest 'reaktionsdygtige form af technetium. Denne omdannelse gennemføres ved hjælp af et reduktionssystem, som er dannet ud frå tins'alte (stannochl or id), jern-

salte (ferrosulfat), .titansalte .(titaritrichlorid) eller. I

andre salte. I

10 I størstedelen af tilfaldene er denne simple reduktion I

af technetium tilstrækkelig til under de givne pH-bé- I

tingelser at gennemføre fikseringen af technetium på I

det pågældende molekyle. I

Man kan ved udarbejdelsen af disseradio farmaceutis- I

15 ke reagenser arbejde i overensstemmelse med den meto- I

de, som er angivet af.P.V. KULKARNI et al. i The Journal I

of Nuclear Medecine 21, nr. 2 p. 117-121. I

De således markerede produkter anvendes med fordel ved I

afprøvninger in vivo til detektion af og diagnose- af . I

. 20 omfanget af thromboser samt af thrombotiske tilstande. I

Oligosacchariderne ifølge opfindelsen kan ligeledes I

anvendes til bestemmelsen af de specifikke egenskaber I

for talrige enzymer, som er. involveret i metabolismen I

af glucosaminoglucanerne. I

25 Produkterne ifølge den foreliggende opfindelse udgør I

på grund af deres struktur derudover syntesemellempro- I

dukter af stor interesse, som gør det muligt at opnå ' I

givne fragmenter eller derivater af fragmenter af bio- I

logisk aktive molekyler. De udgør især referencefbr- I

'30 bindeiser ved strukturundersøgelser. I

39 DK 175970 B1

Andre karakteristiske fordele vil fremgå af de efterfølgende eksempler og af fig. 1 - 12, som belyser de produkter, der anvendes ved de beskrevne synteser.

I disse figurer- er de numeriske referencer for formler-5 ne ligeledes anvendt i eksemplerne til beskrivelse .af de samme produkter.·

De i disse formler anvendte forkortelser har følgende betydning:

Ac: efi acetylgruppe; Me: methyl; Bn: benzyl; Bz: benzoyl; 10. .MCAO: monochloracetyl·; Tr: trityl; but·: butyl; S en SOj”-gruppe; Pht: phthalimidyl og L: lævulin.yl.

Alle temperaturer er anført i °C.

EKSEMPEL 1

Syntese af disacchariderne (11) pg (12) med formlerne 15 (se fig. 1 og 2): . .

COOMe OBn 3 ^9/ o OBn . NHAc (IX) I DK 175970 B1 I .COOMe. OBn I - /—0 Ac9/ o I ' KOBft X-_\o ),

Bn OVY n—_/ OBn I OBn H'rlAc I (12) 1) Præparation af benzyl-2-acetamido-2-desoxy-a-D-galac- topyrgnosid (2)_.__/_/_

Han omrører i 16 timer ved 70 °C og beskyttet mod fug- tighed en suspension af 3 g N-acetyl-D-galactosamin

I 3 (1) i 40 ml vandfrit benzyl alkohol indeholdende 2% hydro- I

genchlorid (gasformig, tørret). Efter afkøling hældes .

den klare opløsning langsomt ud i kold ether. (400 ml).

H Bundfaldet køles i 2 timer ved -20 °C og afdryppes.

De faste stoffer skyldes med ether' og opløses derpå .

10 i en blanding methanol-vand (4:1, v/v, 100 ml) og opvar- mes til kogning igennem 1/2 time i nærvær af 1 g aktivt.

kul. Den varme opløsning filtreres og inddampes derpå H til tørhed. Inddampningsresten underkastes en fraktioneret I krystallisation frå 2-propanol til dannelse af forbin- I 15. delsen (2) (2,54 g, 60¾)} smp. = 205 - 206 °C; [β]β + I 210° (cl, H20).

I (lit..: H.M. FLOWERS og D. SHAPIRO, 3. Org. Chem., 30

I (1965) 2041-43, I

I Smp.: = 203 - 205 0 [b]0 + 204° (cO,9B, H20)).

41 DK 175970 B1 2) Acetaldannelse af forbindelse (2) a) Acetaldannelse ved acetone i surt medium

Man omrører en suspension af 311 mg (1 mM) af forbindelsen (2) i vandfri acetone {20 ml) beskyttet mod fugtighed 5 men i nærvær af p-toluensulfonsyre (mohohydrat-, 40 mg).

Blandingen bliver homogen efter 1 times forløb og omrøres ia'it i 3 timer og 30 minutter. Der tilsættes 0,5 ml triethylamin, og reaktionsblandingen inddampes til tørhed. Inddampningsresten opløses med 50 ml chloroform, den 10 organiske fase vaskes med· en vandig 5%'tig natriumhydro- gencarbonatopløsning,.med vand, den tørres (natriumsulfat), filtreres dg inddampes. Inddampningsresten chroma-tograferes over en silicagelsøjle (20 g). Eluering- med éthylacetat fører til: 15 - forbindelsen (3), sirup, (222 mg,.63%), [ex3q + 193° (cl, methanol), NMR. (90 MHz; CDClj) : £ : 7,30 (s, 5H, Ph); 5,95 (d, IHj NH, J.= 8,5 Hz), 4,92 (d, IH, H^, 2 =·3,5 Hz), 2-,80 (IH, OH, udbyttet med D2O), 1,97 (s, 3H, NAc), 1,55 og-,1,32 (2s, 2 x 3H, isopro- .

,20 Py1)» - forbindelsen (4), sirup, (110 mg, 31%); [a]p + 154° (cl, chloroform), NMR (90 MHz, CDCl^riT : 7,32 (s, 5H, Ph), 5,80 (d, IH, NH, J = 8,5 Hz), 5,0 (d, IH, Η^ 2 = 3,5 Hz); 2,75 (IH, OH, udbyttet med D2O); 25 1,96 (s, 3H, NAc); 1,46 (s, 6H, isopropyl).

b) Acetaldannelse ved 2-methoxypropeh (kinetisk kontrol) 311 mg (1 mM) af denne forbindelse (2) opløses 18 ml vandfrit Ν,Ν-dimethylformamid. Der tilsættes successivt 0,3 ml 2rmethoxypropen og 3 mg p-toluensulfonsyre,mono- ; 30 hydrat, og reaktionsblandingen omrøres beskyttet mod fugtighed i 3 timer. Behandling identisk med den, der I DK 175970 B1 H er beskrevet i afsnit a, efterfulgt af chromatografi over silicagelsøjle (20 g) fører gennem eluering med blandingen dichlormethan-methanbl. (15:1, v/v, indehol-H dende 0,1¾ triethylamin) til: H 5 forbindelsen (3), sirup (34 mg, 10¾) - forbindelsen (4), sirup (259 mg, 85¾).

- Benzoylerinq af forbindelsen (4)

Man behandler ved 0 °C og beskyttet,mod fugtighed igen- nem 4 timer med 60 ^ul. (0,5 mM) benzoylchlorid en opløs- .

10 ning af 90 mg (0,25 mM) af forbindelsen (4) i. en blan- ding af 5 ml vandfrit dichlormethan og. 1 ml .vandfri pyridin. Derpå tilsættes 1 ml methanol, og efter 15

minutters forløb fortyndes reaktionsblandingen med -20 I

ml dichlormethan. Den organiske fase vaskes med én vandig I

15 10?i'tig opløsning af natriumhydrogensulfat, med vand, I

med en vandig 5Vtig natriumhydrogencarbonatopløsning, I

med vand, den tørres (natriumsulfat), filtreres og ind- I

dampes. Den gelatineagtige inddampningsrest omkrystal- I

liseres fra en blanding af ethylacetat, ether og hexan I

I 20 til dannelse af forbindelsen (5) (105 mg, 9(få), smp. . I

1B5 - 186 0 C; [a]Q + 189° (cl, chloroform), NMR (90 I

MH2 , C D C L j ) ·. £ : 8,05 (m, 2H, H o-benzoyl); 7,40 (m, I

I 8H, lPh + H m-pbenzoyl), -5,.73 (d, IH, NH, J = 9 Hz), I

I 5,33 (d. af d., IH, H3> 3 = 10 »z, k = 3,5 Hz), I

I 25 1,83 (s, 3H, NAc), 1,48 og 1,39 (2s, 2 x 3H, isopropyl). I

I N ♦ B. : Tilstedeværelsen ved S> = 5,33 ppm af en dublet I

af dublet med koblingskonstant for 10 og 35 Hz viser I

på eentydig måde tilstedeværelsen af en elektrontil- I

I trækkende gruppe (benzoat) ved C-3, og sikrer således I

30 placeringen ved 4 og ved 6 af ispropy1 yden. I

43 DK 175970 B1

Hydrolyse og selektiv benzoylering af forbindelsen (5) til ' (έ)_^_·

Man opvarmer i 30 minutter ved 100 °C under omrøring en blanding af . 72 mg af forbindelsen (5) og 5 ml 80%'tig 5 eddikesyre. Efter nedkøling til omgivelsernes temperatur inddampes reaktionsblandingen til tørhed, den inddampes med vand (3 x 10 ml) og derpå med toluen. Den faste inddampningsrest tørres i dessikator under højt vakuum.

Den rå diol opløses i en blanding af 0,5 ml vandfrit 10 pyridin.og 3 ml dichlormethan. Der tilsættes 33 mg ben- zoylcyanid, og reaktionsblandingen omrøres i 16 timer.

Der tilsættes 5 ml methanol og efter 1 time under omrøring inddampes reaktionsblandingen til tørhed. Inddamp-ningsresten omkrystalliseres i en blanding af ethylace-15 tat og hexan. til dannelse af forbindelsen (6) (71 mg, 86¾ ud fra forbindelsen (5)); smp.= 180 - 1B1 °C; [ό]^ + 109° (cl, chloroform); NMR (90 MHz, CDC13):4: 8,02 (m, 4H, H ortho af 2-behzoyl); 7,40 (m, 11H, lPh + H · meta, para af 2-benzoyl)j 5,88 (d, IH, NH, 1=9 Hz); 20 5,38 (d. af d. , IH, H3, J2 j·. = 10 H , 4 = 3 H ) , 5,02 (d, l'H, H1, 31 2 = 35 Hz), 3,30 (IH·* OH, udbyttet med 020, 1,81 ( s, 3H, NAc ).

Man vil bemærke, at ved benzyleringen, 0-debenzoylerin-25 gen, og den påfølgende selektive acylering ved C-6, kan forbindelsen (6) føre til et derivat af. typen: j—0-acyl .

V °\ 'Æ-Zw, NHAC ! som er en passende beskyttet precursor, som er anvendelig ved syntesen af chrondroitin-6-sulfat.

I DK 175970 B1 H - Ben2ylerinq af derivatet (3)

Man opløser 200 mg (0,57 mM) af forbindelsen (2) i 5 ml vandfrit Ν,Ν-dimethylformamid. Man tilsætter succes- sivt 700 mg (4,5 mM) vandfrit baryt,'168 mg .(0,5 mM) ‘5 bariumhydroxid,octahydrat og 120^ul (1 mM) benzylbromid.

H Reaktionsblandingen omrøres beskyttet mod fugtighed i 20 timer. Der tilsættes 0,5 ml methanol og derpå efter 30 minutter filtreres reaktionsblandingen, og de faste H bestanddele skylles med 50 ml chloroform. Den organiske 10 fase vaskes med en kold opløsning af 50¾1tig eddikesyre, med vand, med en vandig .5X'tig natriumhydrogencarbonåt- opløsning, med vand, den tørres (natriumsulfat), filtre- res og inddampes. Inddampningsresten vaskes-over en silicagelsøjle (10 g). Eluering med en blanding af ethyl- 15 acetat og hexan (3:1, v/v) fører til forbindelsen (7) i form af en farveløs glas, som det ikke har været muligt I at få til at krystallisere (228 mg, 91¾)} (ot]p + 136° I (c 1,5, chloroform), NMR (90 MHz, CDC1-j):«£ : 7,30 (m, 10H, 2 Ph), 5,86 (d, IH, NH, J = 8,5 Hz), 4,89' (d, IH,, I 20 H1, J1 2- 3,5 Hz)·, 1,93 (s, 3H, N AC), 1,55 dg 1,31 I (2s, .2 x 3H, isopropyl).

I - Sur hydrolyse af derivatet (7) I En blanding af 150 mg af forbindelsen (7) og 5 ml 80%'tig I eddikesyre omrøres i 1/2 time ved 100 °C. Efter afkøling I 25 til omgivelsernes temperatur inddampes reaktionsblandin- I gen til tørhed, inddampes med vand (3 x 10.. ml) og derpå I med toluen. Den gelatineagtige inddampningsrest omkry- I stalliseres i ethanol til dannelse af diolen(8) (121 I mg, 89λ), smp. = 183 - 184 “C; ta]p.+ 171° (cl, methanol).

I 30 Præparation af 4-0-acetyl-derivatet (9) I Man omrører i 1· time beskyttet mod fugtighed en blanding 45 DK 175970 B1 af 100 mg af forbindelsen (8), 5 ml vandfrit tgluen, 0,5 ml trimethylorthoacetat og 1 mg p-toluensulfonsyre, ‘ monohydrat (mediet bliver homogent efter.ca. 45 minutters forløb). Derpå tilsættes 0,2 ml triethylamin, og .

5 reaktionsblandingen fortyndes med 20 ml toluen. Deri organiske fase vaskes med.vand (2 gange), tørres (natriumsulfat), filtreres og inddampes.'NMR-spektrum af råproduktet er i overensstemmelse med den forventede struktur (S: 3,24 (s, 3H., OMe)1,65 (s, 3H, CMe); men 10 deri ustabile orthoester anvendes umiddelbart efter.ved efterfølgende reaktion:

En blanding af den i det foregående fremstillede orthoester og 5· ml 80?i'tig eddikesyre omrores i 10 minutter ved omgivelsernes temperatur, hvorpå der inddampes til 15 tørhed. Denne inddampningsrest inddampes sammen med vand og derpå med toluen. Omkrystallisation i en blanding af ethylacetat o.g hexan fører til forbindelsen (9) (95 mg, 85¾ ud fra forbindelsen (8)), smp. =146° -147 °C, [a]D + 94° (cl chloroform) , NMR (90 MHz, CDClVj): 20 <£: 7,32 (m, 10H, 2 Ph), 5,92 (d, IH, NH, J = 8,5 Hz), 5,37 (d. af d., 1 H, H^i Jy^ = 3 Hz, 3^5 = 1 Hj·) , 4,96 d, IH, Hl, 2 = 3,5 Hz), 3,60 (IH,’ OH, udbyttet med D20), 2,11 og 1,95 (2s, 2 x 3 H, OAc og NAc).

(Tilstedeværelsen ved <S = 5,37 af en dublet af dublet 25 med koblingskonstanter på 3 og 1 Hz viser på ikke-tvety- dig måde tilstedeværelsen af en acylgruppe (acetat) ved.C-4).

Derivatet (9) er en foretrukken precursor ved præparationen af basis-disaccharid for: 30 - chondroitin-4-sulfat, - L-iduronsyre 1-^3 N-Ac-D-galactosamin-4-0-sulfat).

H DK 175970 B1 Η - Kondensation mellem alkoholen (9) oq imidatet (10)

Imidatet (10): Lit.: R.R. SCHMIDT og G. Grundler, Synthé-, sis, (1981) 885-87.

H Man omrører beskyttet mod fugtighed og i nærvær af en . I

5 molekylarsigte 4 A (pulver, 100 mg) en opløsning af I

76 mg (0,17 mM) af alkoholen (9) og 175 mg (0,28 mM) I

af imidatet (ID) i 2,5 ml vandfrit dichlormethan. Reak- I

tionsbi andingen køles til 0 °C, og man tilsætter 4^ul· I

(32 yum) bortrifluoridetherat (Bf^: Et20) i én enkelt I

10 omgang. Efter omrøring i 1 time ved 0 °C og derpå i I

3 dage ved omgivelsernes temperatur tilsættes 100 mg I

natriumhydrogencarbonat. Efter 15 minutters forløb afdryp- I

pes de faste bestanddele, de skylles med 50 ml dichlor- I

methan, og den organiske fase vaskes med vandig 5$'tig I

H 15 natriumhydrogencarbonatopløsning og med vand, den tørres I

(natriumsulfat), filtreres og inddampes. I

Inddampningsresten chromatograferes over en silicagel- I

søjle (18 g). Eluering med blandingen ethylacétat-hexan I

(1:1, v/v) fører til isolering af: I

20 - en disaccharidfraktion (62 mg), I

I - udgangsproduktet, som ikke er blevet omsat, (47.mg, I

60%). I

Disaccharidfraktionen chromatograferes endnu engang I

over en silicagelsøjle (5 g, gel 230 - 400 mesh). Elu- I

I 25 ering med blandingen dichlormethan-ethylacetat (5:1, I

v/v) fører til isolering af (anført efter elueringsræk- I

ke f ølgen): I

H * CS I

- disaccharidet 1-^3 (12), farveløs sirup (24 mg, 15%), I

I [a]p + chl°r°form); NMR (90 MHz, CDClj): I

I 30 -S: 7,30 (m, 25H, 5 Ph); 5,65 (d, IH, NH, 0 = 9,5 Hz); I

47 DK 175970 B1 5,52 (d. af d., 1 H, H^ , = 3 Hz); 5,05 (d* 1H-.

H’l> Jl',2?'= 3,5 HZ); *’95’(d’ 1H* H1’ Ji 2...= 3,5 Hz); 3,63 (s, 3H, COOMe), 1,92 og 1,82 (2s| 2 x 3 · H, OAc og NAc); 5 - disaccharidet 1—^->3 (11), farveløs sirup.(24 mg, 15%), [alp + 80° (cl, chloroform); NMR (90 MHz, CDCl^): <k: 7,30 (m, 25 H, '5 Ph); 5,48 (d, IH, NH, J a 9· Hz); 5,46. (d. af d., IH, Ηή, = 3 Hz); 4,97 (d, IH,

Hl, J1 2 = 3,5 Hz); 3,78 (s’ 3H, COOMe); -2,04 og 1,61 10 (2s, 2 x 3H, OAc og NAc).

EKSEMPEL 2

Syntese af et disaccharid af typen: I-°t π o |\0p °f' Ν'.

Disaccharidet (22), som er opnået på syntesemåde, svarer til ovenfor anførte formel, hvori M betegner Me, p og ‘ 15.. R betegner en benzylgruppe, sp betegner en OH^gruppe,.

og N betegner en -NH-acetyl-gruppe.

Man,gennemfører denne syntese ud' fra 1,6-anhydro-a-L-idopyranose i overensstemmelse med de efterfølgende anførte syntesetrin 1 - 6 (se fig. 3).

20 1) - Præparation af 1,6-anhydro-2,3,4-tri-0-benzyl-α-L- idopyranose ________ ’_

Man sætter til en opløsning af 1 g 1,6-anhydro-a-L-idopy- DK 175970 B1 H 48 H ranose i 60 ml vandfrit DMF 1,5 g NaH'iSOSi'tig emulsion i olie) og derpå 4 ml benzylbromid, H Efter. 1 ti'mes omrøring ved omgivelsernes temperatur tilsættes 5 ml ..methanol, hvorpå blandingen opkoncen-H 5 treres til tørhed- Det derved opnåede reaktionsprodukt ekstraheres med dichlormethari. Den organiske fase vaskes med vand og tørres igen over natriumsulfat.

i Den således opnåede sirup føres igennem en silicagel- kolonne, idet man først eluerer med hexan og derpå med 10 en blanding af hexan og ethylacetat (8:1, v/v), og der- p å (4:1 v / v ) .

H Deh således opnåede sirup krystalliserer under tørrin- I gen (2,5 g - 88%).

Man omkrystalliserer reaktionsproduktet i en blanding

I 15 af ether og hexan [al^Q = +30° (c = 1, chloroform). I

Smp.: 69 - 70 °C.

2) - Acetolyse

I En opløsning af 405 mg af forbindelsen (13) i en bian- I

ding af 10 ml eddikesyreanhydrid og 2 ml fluoreddike- I

20 syre underkastes omrøring i 4 timer ved omgivelsernes I

I temperatur og beskyttet mod fugtighed. Man tilsætter I

20 ml xylen, hvorpå man inddamper reaktionsblandingen I

I til tørhed. Derpå gennemføres en co-afdampning med xylen I

I (2x5 ml), og der tørres under vakuum. Man opnår 455 I

25 mg af forbindelsen (14) (udbytte 91%) i form af en 'far- I

veløs sirup. NMR-spektrum er i overensstemmelse med I

on I

den forventede4 struktur. [a]p °C = + 2,9° (c = 1, CHClj). I

49 DK 175970 B1 .3) Eliminering af acetylqrupperne fra forbindelsen (14)

Man behandler en opløsning af 534 mg af forbindelsen

(14) i -10 ml vandfrit methanol ved 4 °C med.en opløsning af 0,1 ml 1 M natriummethylat i cé. 14 timer. Reaktions-5 blandingen neutraliseres med harpiksen Amberlite IR

120(H+), harpiksen frafiltreres, hvorpå opløsningsmidlet afdampes.

Inddampningsresten omkrystalliseres i en blanding af -ether og hexan, hvilket fører til 412 mg af forbindelsen 10 (15) (udbytte 91¾) snip.:. 81.- 82 °C; [ex]*0 °C = +11° (c = 1, chci.3) .

NMR-spektrum og elementæranalyse er i overensstemmelse med den forventede struktur.

4) Monochloracetylering'af forbindelsen (15) 15 Man afkøler en opløsning af 740 mg af diolen (15) i en blanding af 8 ml vandfrit dichlormethanog lml vand-frit pyridin under omrøring ved -20 °C og under en atmosfære af tørt argon.

Derpå tilsættes dråbe for dråbe i løbet' af 10 minutter 20 en opløsning af 0,40' ml monochloracetylchlorid i 2 ml vandfrit dichlormethan. Blandingen underkastes omrøring i 40 minutter ved -20 °C, hvorpå den under stadig omrøring hældes ud i en blanding af vand og is.(100 ml).

Efter 1. times forløb ekstraheres blandinge.n med dichlor-25 methan (3 x 20 ml), og de organiske faser vaskes med 10%’tig KHSO^, med vand, med mættet NaHCO^, med vand, hvorpå de tørres over natriumsulfat, filtreres og ind- j dampes.

Inddampningsresten bringes over på en silicagelkolonne I DK 175970 B1

(20 g). Eluering gennemføres med en blanding af hexan · I

H og ethylacetat 7:2 (v/v). Man opnår 854 mg af forbin- I

delsen (16) i form af en farveløs sirup (udbytte '87¾) I

on I

[alp. = +5'° (c = 1, CHC13).

5 NMR-spektrum er i overensstemmelse med den forventede I

struktur. I

5) Preparation af idopyranosylchlorid (17) I

H Man behandler en opløsning af 260 mg af forbindelsen I

H (16) i 2 ml vandfrit dichlorraethan ved 0 °C med en mst- I

10 . t e t opløsning af HC1.(gasformig, tørret) i 10 ml vånd- I

frit dichlormethan igennem 3 timer. Reaktionsblandingen I

inddampes derpå til tørhed, der co-inddampes med toluen I

I (3 x 20 ml), og man tørrer under kraftigt vakuum. Man I

opnår 216 mg.af forbindelsen (17) i form af en ustabil I

7 Π I

15 farveløs sirup (udbytte 92¾). (alp = -41° (c = 1, CHCl^). I

NMR-spektrum bekrsfter den forventede struktur. I

I 6) Kondensation mellem chloridet (17) og alkoholen (18) I

I En blanding af 153 ml (0,28 mmol) af chloridet (17) I

og 80 mg (0,18 mmol) af alkoholen (18) i 3,5 ml vandfrit I

I 20 dichlormethan underkastes omrøring i nærvær af 100 mg I

I molekylarsigte 4 A ved omgivelsernes temperatur og under I

en atmosfære af tørt argon. Blandingen køles til -20 I

°C, hvorpå.man tilsætter 66 ^,ul sym-collidin og 108 I

mg sølvtriflat. I 1

25 Reaktionsblandingen omrøres beskyttet mod lyset, og I

man lader temperaturen langsomt stige mod omgivelsernes I

I temperatur i løbet af ca. 14 timer. Derpå fortyndes I

blandingen med 50 ml dichlormethan, hvorpå mari filterer I

I den over et leje af Celite 543. I

53.

DK 175970 B1

Filteret vaskes med 0,1 N isafkølet HC1, med vand, .med' mættet NaHCO^ 6g derpå med vand. Derpå tørres filtra-, tet over natriumsulfat, der filtreres og inddampes.

Inddampningsresten chromatograferes over en kolonne 1 5 a.f silicagel (3.0 g).· Eluering med en blanding af ethyl- j- acetat og hexan 1:1 (v/v) fører til i elueringsrække- følgen disaccharidet (19) og disaccharidet (20). ‘ .

Disaccharidet (19) omkrystalliseres i en blanding af ether'og hexan, og man indvinder 45 mg af reaktions- 2 0 10 produktet, hvilket svarer til et. udbytte på 26¾. Cot ]q = +48° (c = 1, CHClj). NMR-spektrum-bekræfter den forventede struktur.

Disaccharidet (20) foreligger· i form af en sirup (117 o n mg, 68¾) [a].p = +92° (c = 1, CHClj). Man slutter sig 15 til anomerien af de to disaccharider ud fra NMR-spektra (, 2< ^>5 Hz for og = 2 Hz (20) for og ud fra • værdien af rotationsevnen. Smp.: 73 - 74 °C.

7) Eliminering af monochloracetylqruppen i å'-stillinqen

Man omrører ved 100 °C i 20 minutter i nærvær af 7 mg 20 thiourinstof en opløsning af 40 mg (19) og (20) i en blanding af 1 ml pyridin og 0,2 ml ethanol. Efter afkøling og sædvanlig behandling vaskes inddampningsresten over en silicagelsøjle (2 g). Eluering med blandingen hexanAcOEt (3:1, v/v) fører til forbindelsen '(21) (30 25 mg, 81¾) i form af en farveløs sirup. NMR-spektra er i overensstemmelse med de forventede strukturer.

8) Oxidation for overgangen idose-iduronsyre

Man oxiderer ved 0 °C i 3 ml acetone 30 mg af forbindelsen (21) ved hjælp af blandingen CrO^/H^SO^ 3,5 M igennem 30 1 time. Efter sædvanlig behandling opløses inddampnings- DK 175970 B1

H resten i THE: \/and (4:1, v/v), og · den behandles med I

H 2 M natriumhydroxidopløsning (1 ml). I

Efter 3 timers forløb gøres reaktionsblandingen sur I

til pH 1 med 1 M HC1, og man ekstraherer med chloroform. I

5 De organiske faser vaskes med vand, tørres og inddampes. I

H Inddampningsresten behandles med· en etheropløsning af I

dia20methan i 1/2 time. Efter inddampning til tørhed I

vaskes inddampningsresten over en silicaaelsøjle (2 I

g). Eluering med blandingen hexan-AcOEt (3:2, v/v) fø- I

10 rer til forbindelsen (22) ( 22 mg, 75?£), i form af en I

H farveløs sirup. I

I NMR (CDClj):£ 3,40 (s, 3H, COOMe ido), 2,85 (IH, OH). I

Resten af spektret er i overensstemmelse med den forvente- I

de struktur. I

15 Ved O-sulfatering (f.eks. med et 50^: Me^N-kompleks I

' i DMF) og påfølgende hydrolyse (f.eks. ved hjælp af I

Pd/C i Me0H,H2.*) opnår man basis-gentagelsesgruppen I

i dermatan-sulfat. I

I EKSEMPEL 3 I

H 20 Syntese af er derivat A af typen: I

I n r°n I ΙΛ 0 I \?H h*09'

I N

I som lader sig anvende i en sekvens af typen (U-A)^, I

og som har gentagelsesgruppen A i sekvensens afslutten- I

DK 175970. B1 53 de del med reducerende egenskaber.

På denne måde fremstilles gentagelsesgruppen A med formlen (26) i* overensstemmelse med de efterfølgende trin a) - c) ud fra et derivat med formlen (23), der i sig 5 selv er opnået ved den metode, som er angivet af H-

Paulsen et al dans Tetrahedron.Lett., '24 (1983) 1759 -1762. (Se fig. 4). . · 0y O 0Ale 0 OMo \ Ομ / \ OH / \ι_^ \lL/ (2-¾) /1¾ (Z-Sj^T.

a).Præparation af derivatet 3,4-0-isopropylidén (24)

Man omrører ved omgivelsernes temperatur i 5 timer i.

10 nervær af p-toluensulfonsyre,monohydrat (40 mg) en opløsning af 635 mg af forbindelsen (23) i 20 ml vandfri acetone. Man tilsætter Ί ml triethylamin, og reaktions-blandingen inddampes til tørhed. Inddampningsresten chromatograferes over en silicagelsøjle (40 g). Eluering 15 med blandingen CH2Cl2-AcOEt (5:1, v/v) indeholdende 0,2?ί triethylamin fører til i eluer ingsrskkef øl gen t - derivatet 4,6-0-isopropyliden, (202 mg, 27%) , som hydrolyseres og omkrystalliseres til gendannelse af, forbindelsen (23).

20 - Det ønskede derivat (24) (488 mg‘, 65?ί), smeltepunkt 84 - 85 °C (ether-hexan), [a]p + 43° (cl; CHClj). (NMR-spektrum er i overensstemmelse med den forventede struktur). (AcOEt betegner ethylacetat).

! DK 175970 B1 I 54

b) Benzylerinq og hydrolyse af (23) I

En opløsning af 520 mg af forbindelsen (24) i 8 ml vand- I

frit DMF behandles successivt med natriumhydrid (196 I

mg i form af 50?« i olie) og med 0,36 ml benzylbromid. I

5 Efter 1 times forløb tilsættes 1 ml methanol med for- I

sigtighed, og reaktionsblandingen inddampes til tør- I

H hed. Inddampningsresten genopløses i 50 ml chloroform, I

og den organiske fase vaskes me.d vand, tørres (natrium- I

sulfat) og - inddampes^ I

iQ Inddampningsresten opløses i 10 ml 90S'tig trifluor- I

H eddikesyre, der omrøres 10 minutter, ved omgivelsernes I

H temperatur, og man inddamper til tørhed. Inddampnings- I

resten vaskes over en silicagelsøjle (10 g). Eluering I

I med blandingen AcOEtihexan (1:1,. v/v) fører til deri- I

^5 vatet (25) (540 mg, 87fi) i form af en farveløs sirup, I

[a]p + chloroform). (NMR-spektrum bekræfter I

den forventede, struktur). I

c) Selektiv acetylering til dannelse af det halvåbne I

I derivat (26 )_· ' _ I

20 450 mg af diolen (25) omrøres i en blanding af 10 ml I

I vandfrit toluen og '1,5 ml trimethylorthoacetat ved om- I

I givelsernes temperatur. Derpå tilsættes 3 mg p-toluen- I

I sul fonsyre,monohydrat, og der omrøres yderligere 1 ti- I

I me. Derpå tilsættes 1 ml triethylamin, blandingen for- I

I 25 tyndes med 30 ml toluen og vaskes med vand, tørres (na- I

I triumsulfat) og inddampes. Inddampningsresten opløses I

I i 80’ tig eddikesyre, der omrøres 10 minutter ved omgi- I

I velsernes temperatur, hvorpå der inddampes til tørhed I

I til kvantitativ dannelse af forbindelsen (26) (485 mg, I

I 30 95% ud fra forbindelsen (25)), sirup, (a)p - 45° (cl, I

I CHC13). NMR (CDC13)«T: 7,25 (s,. 5H, Ph), 5,26 (d. af I

I d, , IH, J3 : 3 Hz, 1 Hz, H-4), 4,14 (d, IH, ^ I

.· 55 DK 175970 B1 7 Hz, H-l), 3,52 (s, 3H, OMe), 2,90 (d, IH, J, 3 Hz, OH). . EKSEMPEL 4

Præparation af en åben forbindelse A.af typen Det fremstillede derivat svarer til formlen (31): r-0i p • I_‘ r0k {V °N „ oif—o k-f μ og det opnås ud· fra derivatet (27) gennem trinnene, 1-4 · som i det følgende er angivet: ψ' °n) v / NH2

Syntesen af (27) er rapporteret af R.W. JEANLOZ et al. i J.A.C.S. 76 (1954) 5682 (se fig. 5).

I DK 175970 B1 Η i Η 1) N-phthalimidylerinq åf (28) H En opløsning af 100 mg af forbindelsen (27) i 1 ml meth- H anol behandles igennem 1 time ved 60 °C med 75 mg phthal-

syreahhydrid og.60 ^ul triethylamin. Efter afkøling I

H 5 inddampes blandingen til tørhed og omkrystalliseres I

ud fra en blanding af Ct^Cig-éth.er-hexan. Mellemprodukt-, I

forbindelsen 2-(2'-carboxybenzamido) opløses i 5 ml I

: eddikesyreanhydrid og opvarmes til 100 °C i 2 timer I

H i nærvær af 100 mg natriumacetat. Blandingen hældes I

10 efter afkøling i isvand og omrøres 1 time. Efter eks- I

H trakti'on med chloroform vaskes de organiske faser med I

H vand, tørres og inddampes'. Inddampningsresten desacetyle- I

res med natriumméthylat til dannelse af forbindelsen I

(28) (101 mg, 66%), i form af en sirup, som krystalliserer I

j .15 fra ether, smp.: 157 °C; [a]p + 82° (cl, chloroform). I

NMR-spektrum er i overensstemmelse med den forventede I

struktur. I

I 2) Monochloracétylerinq· af (28) I

I 100 mg af forbindelsen (28) behandles ved -20 °C’ med I

20 monochloracetylchlorid på sædvanlig måde. Reaktions- I

I blandingen behandles på klassisk måde til dannelse af I

115 mg (96¾) af forbindelsen (29), sirup, [α]φ +55° I

(cl, CH2CI2). NMR-spektrum er i overensstemmelse med I

I den forventede struktur. I

I 25 3) Acetolyse af 1,6-anhydro- (29) I

I 100 mg af forbindelsen (29) behandles med en blanding I

I af eddikesyreanhydrid og tri fluoreddikesyre (9:1, v/v, I

I 10 ml) igennem 2A timer, hvorpå der inddampes til tørhed I

I og tørres under høj vakuum til dannelse af blandingen I

I 30 af a, (3-acetaterne (30) (115 mg, 99¾) i form af en sirup. I

57 DK 175970 B1 NMR-spektrum (CDCl^) viser tilstedeværelsen åf 3s (totalt'

6H) ved £ 2,05, 1,99 og 1,97, som tilskrives 6-OAc, I

1-OAc α og (J.

4) Præparation af brdniidet (31) I 5 En opløsning af 100 mg af blandingen af acetaterne (30) ! i en blanding af 4,5 ml dichlormethan og 0,5 ml ethyl- acetat behandles med 100 mg ti.tantetrabromid (TiBr^) natten igennem. Sædvanlig behandling fører til brom.idet (31) (90 mg, 84¾), i form af en farveløs sirup, NMR j 10 (CDClj) 6,69 (d, IH, 3^ ^: 3,5 Hz, H-l). Den øvrige.

I del af spektret er i .overensstemmelse med den.forven tede struktur.

Denne ustabile forbindelse anvendes umiddelbart til glucosylerings-reaktionerne.

15 EKSEMPEL 5

Præparation af en forbindelse A med formlen (39); r-0'β ' W—o \l-/ Br NPKf* ud fra derivatet (32) med formlen:

r0H

jt) W . oAiic.

I DK 175970 B1

Man gennemfører følgende behandlingstrin 1-7: (se.

1) Benzylering af 1,2 : 3,4-d i-0-isorpopy 1 idenr-a-D-galac-topyranose (32)_ .__________ 5 2,60 g af forbindelsen (32) 'benzyleres i 20 ml DMF ved··.

indvirkning af 2 ml benzylbromid og 1 g natriumhydrid.

Sædvanlig behandling fører til en inddampningsrest, som destilleres under vakuum til dannelse af forbindelsen .(33) (3,16 g, 90?ό), kogepunkt 130 - 132 I

NMR-spektrum er i overensstemmelse med den forventede I

struktur. I

2) Hydrolyse og acetylerinq af derivatet (33) I

1 g af derivatet (33) opløses i 20 ml 90%'tig trifluor- I

15 eddikesyre, der omrøres 30 minutter ved omgivelsernes I

temperatur, hvorpå der inddampes til tørhed. Inddamp- I

ningsresten geninddampes med· vand (3 x 10 ml), hvorpå I

der tørres under vakuum. I

Inddampningsresten opløses i 10 ml eddikesyreanhydr id I

20 og opvarmes til 100 °C igennem 3 timer sammen med 500 I

mg vandfrit natriumacetat. Efter afkøling og sædvanlig I

behandling chromatograferes inddampningsresten over I

en silicagelsøjle (100 g). Eluering med· blandingen hexan- I

ethylacetat (3:2, v/v) fører til i elueringsrækkefølgen : I

25 - en fraktion indeholdende furan-isomererne (480 mg, I

38S), for hvilken α-isomeren er den overvejende (NMR: I

ϋ 6,32 (d, IH, 31 5 Hz, H^). I

- en fraktion indeholdende acetatet (34) (612 mg, 49¾) I

i form af en farveløs sirup, NMR.’é 5,68 (d, IH, J. I

1 > Z I

59 DK 175970 B1 7,5 .Hz, H^). Den øvrige del af spektret er i overensstemmelse med den forventede struktur.

3) Preparation af det såkaldte "qålactal" (35)·

En opløsning af 1 g af acetatet (34) i 10 ml ether om-5 røres ved omgivelsernes temperatur' i nærvær af 1 ml benzylamin i 2 timer. Efter fortynding med-50 ml dichlor-methan vaskes den organiske fase med 0,1 M isafkølet HC1, og med vand, der tørres (natriumsulfat) og inddampes. Inddampningsresten (som er et reducerende produkt, _ 10 der er frit for anomert carbon) opløses i 10'·'ml vandfrit dichlormethan og béhandles med et overskud af.dimethyl-bromf ormiminiumbromid· (V/ilsmeiers bromerede reagens) i nærvær af sym-collidin (0,5 ml) igennem 1 time ved omgivelsernes temperatur. Sædvanlig behandling fører 15 til mellemproduktet i form af a-bromderivatet, som er ustabilt, og som anvendes direkte til eliminerings-reaktionen (885 mg, 81¾). NMR:^1; 7,25 (m, 5H, Ph), 6^31 (d, IH, J1>2 3,5 Hz, H-1).

En opløsning af det frisk fremstillede bromid (885' mg) 20 i 5 ml eddikesyre sættes dråbe for dråbe ved 0 °C'til en opløsning af 4 ml eddikesyre, 15 ml vand, 2 g natriumacetat, 1 g zink i pulverform og 0,1 g Ευ50^,5Η20.

Efter 4 timers kraftig omrøring ved 0 °C filtreres blandingen, filtratet fortyndes med vand og ekstraheres 25 med chloroform (3 x 20 ml). Den organiske fase vaskes med vand, .tørres (natriumsulfat) og inddampes. Inddampningsresten vaskes over en silicagelsøjle (50 g). Eluering med blandingen hexan-ethylacetat (5:3, v/v) fører til galactal (35) i form af en farveløs sirup (595 g, 65¾), 30 og NMR-spektrum er i overensstemmelse med den forventede struktur.

I DK 175970 B1

i I

4) Acidonitretinq af qalactal (35) I

En opløsning af 1 g galactal (35) i 10 ml. vandfrit ace- I

tonitril omrøres ved -20 °C under en atmosfære af tørt I

argon i narvær af 200 mg natriumazid og 3,5 g cerium- I

5 ammoniumnitrat.igennem 12 timer. Efter fortynding med I

50 ml kold ether vaskes den organiske fase med vand, I

der tørres (natriumsulfat) og inddampes. Inddampningsres- I

ten (som i hovedsagen indeholder en blanding af ot og I

β-nitraterne) opløses umiddelbart i 10 ml eddikesyre I

10 og opvarmes til 100 °C i nærvær af 400 mg vandfrit na- I

triumacetat igennem 1 time. Sadvanlig behandling fører I

til en inddarapningsrest, som chromatograferes over en I

silicagelsøjle (50 g). Eluering med en blanding toluen- I

ethylacetat (8:1, v/v) fører til blandingen af acetater- I

I 15 ne (36) (760 mg, 51¾ ud fra forbindelsen (35)), som I

I indeholder i overvejende grad α-acetatet, NMR<£?,28 I

I (s, 5H, Ph), 6,22 (d, IH, H1j2 3,5 Hz, H^). I

5) Praparation af N-phthalimido-derivatet (37) I

I 200 mg af blandingen af acetaterne (36) opløses i 10 - I

I 20 ml ethanol indeholdende .0,4 g NiCl2,6H20 samt 0,2 g I

I borsyre H^BO^. Derpå tilsættes dråbe for dråbe en opløs- I

ning af NaBH^ i ethanol (10 mg/ml) indtil den grønne I

I farve er forsvundet, og der er fremkommet en gråsort I

I farve. Blandingen inddampes derpå til tørhed og fortyn- I

I 25 des med vand, hvorpå man ekstraherer med chloroform I

I (5 x 10 ml). Den organiske fase vaskes med vand, tørres I

I (natriumsulfat) og inddampes. I 1

Inddampningsresten (2-aminoderivatet, som giver en rosa- I

I farvet plet ved vaporisering med ninhydrin under TLC) I

I 30 behandles umiddelbart i 3 ml methanol med 150 mg phthal- I

I syreanhydrid i nærvær af triethylamin (120 ^ul) ved I

I 60 °C igennem 2 timer. Efter sædvanlig behandling be- I

61 DK 175970 B1 handles inddampningsresten ved 100 °C i 2 timer.med 10 ml eddikesyreanhydrid og 200 mg natriumacetat. Efter behandling chromatograferes den således opnåede inddamp-, ningsrest over en silicagelsøjle (15 g). Eluering med 5 en blanding af ethylacetat og hexan (1:1, v/y). fører til blandingen af acetaterne (37) (152 mg, 66S). NMR-spek-trum. er i overensstemmelse med den forventede struktur. IR-spektrum viser det fuldstændige fravær af bånd svarende til azid-gruppen.

10 6) Præparation af derivatet (38)

Blandingen af acetaterne (37) (150.mg) desacet-yleres på i og for sig kendt måde ved 0 °C (MeONa i methanol). Inddampningsresten monochloracetyleres ved -20 °C i en blanding af pyridin og dichlormethan på sædvanlig 15 · måde til.dannelse af en blanding af de a, B-anomere monochloracetater,i form af en sirup (155 mg., 87«)· NMR-spektrum er i overensstemmelse med den forventede struktur; 7) Præparation af bromidet (39) 20 Man behandler igennem 16 timer en opløsning af'100 mg af blandingen af monochloracetaterne (38) i 5 ml dichlormethan og 0,5 ml ethylacetat ved omgivels'ernes ‘ temperatur med 100 mg titantetrabromid (TiBr^). Sædvanlig behandling fører til bromidet (39) (76 mg, 75«)i form af en usta-25 bil sirup. NMR:&: 8,0 - 7,10 (m, 9H, aromatisk), 6,59 (d, IH, 2: 5,5 Hz, ,H-1). Den øvrige del.af spektret er i overensstemmelse med den forventede struktur.

Denne såkaldt "aktiverede" forbindelse anvendes umiddelbart til de endelige glucosyleringsreaktioner.

I DK 175970 B1

I 62 I

EKSEMPEL 6 I

Preparation af et halvåbent derivat "U-A" af typen: I

I COCMe Osp I

I )' O W o I U y—Xo v.or I tcNLY \!—(

I °P N, I

Delen "A" er en halvaben gentagelsesgruppe, som er anven- I

delig, når det drejer sig om chondroitin-6-sulfat, og I

5 den fremstilles ifølge reaktionsskemaet: I

I o Ac I

I Q .1 MeOH l/ I

I \0M“ A . yV ) I

N \ l thiourinstor λ I

... /VPK*- ΝΡίι^ I

I Delen "U" er et derivat af I

CjOO k^e I

I /-°\

I ioh /i I

__( &r I

I C*b I

I Koblingen gennemføres i overensstemmelse med det på I

I fig. 7 viste skema til dannelse af disaccharidet (43). I

I r~0&c I

I o —0 I

I / —v V* I

I ) I

I οε> Nfkh I

Syntese af forbindelsen (40) ud fra bromidet (27) 63 DK 175970 B1

Man omrører en opløsning af 200 mg af bromidet (27) i 3 ml vandfrit dichlormethan under beskyttelse mod lys og mod fugtighed i nærvær af 300 mg sølvsilicat, 5 100 mg molekylærsigte 4 Å samt 0,25 ml methanol igennem 5 timer ved omgivelsernes temperatur. De faste stoffer frafi 11reres, skylles med dichlormethan, og Filtratet inddampes.

Inddampningsresten des-O-monochloracetyleres med thio-urinstof i en blanding af pyridin og ethanol på sædvanlig måde· Inddampningsresten vaskes over en silicagelsøj-le (15 g). Eluering med blandingen AcOEt-hexan (2:1, v/v) fører til derivatet (40) (122 mg, 78X) i form af en farveløs sirup.

15 NMR:£ 3,60 (s, 3H, OMe), 2,30 (IH, OH, udskiftelig med . D20), 2,06 (s, 3H, QAc).

Kondensation·af qentagelsesqrupperne (40) og (41)

Man omrører ved omgivelsernes temperatur og.beskyttet mod lys og mod fugtighed en opløsning af 158 mg af bro-20 midet (41) og 91 mg af alkoholen (40) i 5 ml vandfrit dichlormethan i nærvær af 120 mg frisk fremstillet sølv-carbonat og 200 mg molekylæ.rsigte 4 A i pulverform igennem 3 dage.

De faste bestanddele frafiltreres, f iltratet inddampes, 25 og inddampningsresten chromatograferes over en silica- gelsøjle (20 g). Eluering med blandingen AcOEt:hexan (1:1, v/v) fører til disaccharidet (42) (106 mg, 52X) i form af en sirup.

NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen:

DK 175970 BT I

64 I

<£3,70 (s, 3H, COOMe), 3,50 (s, 3H, OMe), 2,04 (s, 3H, I

OAc ). I

Des-O-monochloracetylerinq af derivatet (42) I

80 mg af disaccharidet (42.) des-O-monochloracetyleres I

5· med hydrazin-dithiocarbonat (H.D.T.C.) i overensstemmel- I

se med den fremgangsmåde, som er. beskrevet af C.A. van H

Boechel og T. Beetz, Tetrahedron, Letters, .24 (1983) I

3775. Efter behandlingen vaskes inddampningsresten ..over I

en silicagelsøjle (5 g). Eluering med blandingen AcOEt- I

10 hexan (2:1, v/v) fører til det halvåbne disacchar id.. I

(43) (67 mg, 90¾) i form af en sirup. I

NMR:5 8,0 - 7,10 (m, 19H, aromatisk), 3,74 (s, 3H, COOMe), I

3,46 (s, 3H,0Me), 2,70 (IH, OH, udskiftelig med O2O), " I

. 1,98 (s, 3H, OAc). I

15 EKSEMPEL 7 I

Syntese af halvåbne derivater A-U af typen: I

λ COOMe. rDp I

. rup . i_ . n Li.·· ‘_ I

(y o / o 9y o I

\or ^o /oP \ot / °KS\°ti

μ ioj °p . N (y. °p I

disse derivater er anvendelige, når det drejer sig om I

chondroitin-4-sulfat (a) og om dermatan-sulfat (b). I

Gentagelsesgrupperne A fremstilles ud fra derivatet I

20 (39). I

Gentagelsesgrupperne U svarer til reaktionsprodukterne I

65 DK 175970 B1 (.13). og (115) i fransk patentansøgning nr. FR 82 18003 af 27.10/1982 med samme opfinder (se Dansk patentansøgning nr. 143/83), og med hensyn til nummereringen svarer denne til den foreliggende tekst's. formler (44) og (45,).· 5 Der henvises til fig. 8.

a) Præparation af et derivat af typen (a)

Man går frem i overensstemmelse med følgende to trin 1 og 2: 1) Kondensationsreaktion til fremstilling af forbin-10 delsen (46)_· _

En opløsning af 124 mg af forbindelsen (39) og 64 mg af forbindelsen (44) i 3 ml vandfrit dichlormethan omrøres ved -20 °C i nærvær af 100 mg molekylarsigte 4 Å i pulverform under en atmosfære af tørt argon. Derpå 15 tilsættes successiv! 0,10 ml sym-collidin og 70 mg sølv- triflat, og man lader temperaturen stige op til omgivelsernes temperatur i løbet af; natten. De faste stoffer · afdryppes, vaskes med dichlormethan, og filtratet vaskes med 0,1 M isafkølet HC1, med vand, med 5%’tig NaHCOj 20. og med vand, der tørres (natriumsulfat) og inddampes.

1nddampningsresten chromatograferes over en silicagel-søjle (20 g). Eluering med blandingen hexan:Ac0Et (2:1, v/v) fører til disaccharidet (46) (110 mg, 70Si) i form af en sirup.

25 NMR:£ 3,98 og 3,96 (2s, 4H, 2' C1-CH2C00), 3,72 (s, 3H, COOMe). Den øvrige del af spektret er i overensstemmelse med den forventede struktur.

I DK 175970 B1 I 66 I 2) Syntese af det halvåbne disaccharid (47) I 100 mg af disaccharidet (46) des-O-monochloracetylere's I med hydrazindithiocarbonat som tidligere beskrevet.

I Den derved opnåede disaccharid-diol behandles, i 5 nil I 5 toluen med 1 ml trimethylorthoacetat i nærvær af 1 mg I p-toluensul fonsyre igennem 2 timer, hvorpå den således I dannede, orthoester behandles med BOS'tig eddikesyre . i 10 minutter ved omgivelsernes temperatur.· Man opnår I efter inddampning til tørhed det halvåbne derivat (.47)·· I 10 (72 mg, 80¾) i form af en farveløs sirup.

I NMR: <**: 8,0 - 7,10 (m, 19H, aromatisk), 5,25 (d. af I d., IH, J3, ftl: 3 Hz, J4, 5,: 1 Hz, H'-4), 3,73 (s, I 3H, C00Me)/2,70 (IH, OH, * udskiftelig med D20), 2,01 I (s , 3H , 0 Ac ) .

I 13 b) Præparation af et derivat af typen (b) I Kondensationsreaktion til fremstilling af forbindelsen

I (48) · _· ___-- . I

I 124 mg af forbindelsen (39) og 60 mg af forbindelsen I (45) kondenseres og behandles på samme made som beskre- I 20 vet i forbindelse med præparationen af forbindelsen

I (46) til dannelsen af disaccharidet (47) (102 mg, 12%), I

i form af en .sirup. I

NMR :^8,0 - 7,15 (m, 19H, aromatisk), 3,98.og 3,94 (2s,

AH, 2 C1.CH2C00), 3,65 (s, 3H, COOMe), 3,46 (s, 3H, .· I

25 OMe). I

I Syntese af det halvåbne derivat (49) I

I 80 mg af disaccharidet (48) behandles som ovenfor beskre- I

I vet i forbindelse med fremstillingen af derivatet (47) I

DK 175970 B1 67 til ..dannelse af forbindelsen (49) (56 mg, 7855), i form af en sirup.

NMR:<£ .5,22' (d. af d. , IH, J-j , } Hz, , 5,: i Hz, ' . H'-4), 3,62 (s, 3H, COOMe), 3^42 (s, 3H, OMe), 2,55 5 (IH,. OH, udskiftelig med D20), 1,97 (s, 3H, OAc).

EKSEMPEL B

Syntese af et halvåbent derivat A-U af typen: j—Ojp COOPa ?/-o /—o; 1lAiL/V01 iVP^ Cp

Derivaterne af denne type er anvendelige når det drejer sig om chondroitin-6-sulf.at .

10 Gentagelsesgruppen A fremstilles ud fra forbindelsen (27), og gentagelsesgruppen U svarer til forbindelsen (13) i fransk patentansøgning FR 82 18003 (jvf. Dansk patentansøgning nr. 143/83), hvor den bærer nummeret (44).

15 Man fremstiller disaccharidet (51), idet man går frem som følger (se fig. 9).

Kondensationsreåktion til præparation af disaccharidet (50)_'

En blanding af 64 mg af forbindelsen (44) og 116 mg 20 af bromidet (27) behandles på nøjagtig samme måde, som beskrevet i forbindelse med fremstillingen af disacchari- i

DK 175970 B1 I

68 I

det (46)· I

Inddampningsresten chromatograferes over en silicagel- I

søjle (25 g). Eluering med blandingen hexan-AcOEt (5:2, I

v/v) fører til disaccharidet (50) (112 mg, 74¾) i form I

5 af en sirup. NMR:£ 8,05 - 7,15 (m, 19H, aromatisk), I

3,97 (s, 2H, C1-CH2C00), 3,75 (s, 3H, COOMe), 2,07 (s, I

3H, OAc) . Den øvrige del af spektret er i overensstem- I

melse med den forventede struktur.

Des-O-monochloracetylerinq af disaccharidet (50) I

10' 95 mg af disaccharidet (50) des-O-monochloracetyleres I

ved hjælp af thiourinstof i en blanding pyridin-ethanol. I

Efter rensning over en silicagelsøjle (5 g) og eluering I

med en blanding hexan-AcOEt (4:3, v/v) opnår man det I

halvåbne disåccharid (51) (64 mg, 72¾) i .form af en I

15 sirup. I

NMR:å 8,0 - 7,10 (m, 19H, aromatisk), 3,78 (s, 3H, COOMe), I

2,85 (IH, OH, udskiftelig med D20), z>^6 (s, OAc). I

EKSEMPEL 9 I

Syntese af et trisaccharid U-A-U af typen: I

cock rosP I

-CL, /-0. , I

V\q y°J\pp I

? Op ti ϋΡ I

20 Trisaccharider af denne type er anvendelige, når det I

drejer sig om chondroitin-6-sul fat. I

Synteseskemaet er gengivet på fig, 10 og 11. I

,............— π i DK 175970 B1 69 >

Forbindelsen (52) fremstilles i overensstemmelse med den teknik, dér er beskrevet af R.R. SCHMIDT et al. i Tetrahedron Letters, 21 (1980) 1421.

Syntese af disaccharidet (53) 5 En opløsning af 76 mg af alkoholen (29) og 216 mg'af bromidet (52) i 5 ml vandfrit dichlormethan omrøres i 4 dage ved omgivelsernes temperatur beskyttet mod lys og i nærvær af 160 mg frisk fremstillet søl v.carbonat og 200 mg molekylarsigte 4 Å i pulverform. Efter filtre-10 ring og inddampning chr.omatograferes inddampningsresten over en silicagelsøjle (30 g). Eluering med en blanding hexan-ethy lacetat (2:1, v/v) fører til disaccharidet (53) (87 mg, 52%), i form af en sirup.

NMR:«S8,0 - 7,15 (m, 24H, aromatisk), 3,74 (s, 3H, COOMe), 15 5,32 (s, bred, H-l).

Acetolyse og bromerinq af disaccharidet (53) 100 mg af disaccharidet (53) acetolyseres med blandingen eddikesyreanhydrid:tri fluoreddikesyre (9:1, v/v, -5' ml) natten over. Efter inddampning til tørhed behandles 20 inddampningsresten (en blanding af de anomere α,β-aceta- ter) med benzylamin i ether, som tidligere beskrevet, til dannelse af det reducerende disaccharid (frit for det anomere carbonatom i A) som umiddelbart behandles med dimethylbromformiminiumbromid i nærvær af sym-col-25 lidin til dannelse af bromidet (54) (78 mg, .68%) i form af en ustabil sirup, som umiddelbart anvendes.

NMR:iT 6,41 (d, lH,^ 2 3,5 Hz, H-l), 2,05 (s, 3H, OAc).

Den øvrige del af spektret er i overensstemmelse med den forventede struktur.

I DK 175970 B1 I

I 70 I

I Kondensation til præparation af trisaccharidet (56) I

I Man kondenserer 43 mg af alkoholen (44.) og 144 mg af I

I halogenidet (34) ved metoden under anvendelse af sølv- I

I sulfat, således som det er beskrevet i forbindelse med I

5 disaccharidet (46.). Inddampningsresten chromatograferes I

I over en silicagelsøjle (20 g). Eluering med en blanding . I

I AcOEt:hexan (1:1, v/v) fører til trisaccharidet (53) I

I (163 mg, 53%). I

I NMR:<£ 7,95 - 7,10 (m, 34H, aromatisk), 3,74 og 3,71 I

I 10 (2s, 2 x 3H, 2 COOMe), 2,0.5 (s,.3H, OAc). Den øvrige' I

I del af spektret er i overensstemmelse med den forvente- I

I de struktur. I

EKSEMPEL 10 I

I Syntese af et tetrasaccharid af typen U-A-U-A: I

I C.OOH Γ~^·"Ρ I

I 0I

I or /v ; ί?Γ fj I

H 15 Man fremstiller tetrasac.charidet (56) ud fra disacchari- I

derne (54) og (43), idet man går frem som følger (se I

I fig. 12). I

96 mg. af forbindelsen (54) og 90 mg af forbindelsen I

(43). kondenseres under anvendelse af metoden med sølvsul- I

20 fat som ovenfor beskrevet i forbindelse med disaccharidet I

H (46). Inddampningsresten chromatograferes .over en sili- I

cagelsøjle (20 g). Eluering med en blanding hexan-AcOEt I

I (4:3, v/v) fører til tetrasaceharidet (56) (82 mg, 46%) I

i form af en farveløst glas. I

I 25 NMR:£ : 8,10 - 7,05 (m, 43H, aromatisk), 3,77 og 3,70 I

I (2s, 2x3H, 2 COOMe), 3,46 (s, 3H, OMe), 2,08 og 2,04 I

I (2s, 2x3H, 2 OAc). I

Claims (30)

1. Fremgangsmåde til organisk syntese af oligosaccharider omfattende [D-galactosamin]-[D-glucuronsyre eller L-iduronsyre] kædedannelser såsom de, der findes i dermatansulfater, chondroitiner, chondrosin eller chondroitin-sulfater, kendetegnet ved, at man: 5 i en glycosyleringsreaktion anvender to forbindelser, der henholdsvis er afsluttet med eller består af en A-enhed med D-galactosaminstruktur og en U-enhed med D-glucuronsyre- eller L-iduronsyrestruktur, idet én af enhederne A eller U er en alkohol, hvori -OH-gruppen med alkohol-funktion ind-10 tager en af positionerne 3 eller 4, og den anden enhed har et aktiveret, anomert carbon substitueret med en reaktiv gruppe, der er forenelig med de øvrige grupper, der er til stede på enhederne, idet alle de øvrige positioner i A og U, med undtagelse af den, hvori det anomere carbon er aktiveret og den, der indtages af OH-gruppen med alkohol-funktion, bærer enten amino-15 eller carboxyl-grupper, eller præcursorer for sådanne grupper, eller -OH-grupper, idet disse grupper indtager forud fastlagte positioner, og idet amino-og carboxyl-grupperne, når de er til stede, henholdsvis er blokerede med beskyttelsesgrupper for amino- og carboxyl-funktion, idet -OH-grupperne er blokerede med mindst to typer beskyttelsesgrupper, der sekventielt kan 2 o fjernes, hvilket muliggør indførelse af ønskede grupper i givne positioner, hvorefter -OH-grupperne kan frigives i andre positioner, hvilken glycosyleringsreaktion giver; enten en 1,3-binding med alfa-stereospecificitet mellem en L-iduronsyre 25 og en D-galactosamin, eller en 1,3-binding med beta-stereospecificitet mellem en D-glucoronsyre-enhed og en D-galactosamin-enhed, en 1,4-binding med beta-stereospecificitet mellem en D-galactosamin-enhed og en D-glucuronsyre- eller L-iduronsyre-enhed, 30 idet glycosyleringstrinnet eventuelt gentages til forlængelse af oligo-saccharidkæden, og DK 175970 B1 I I 72 I -OH-beskyttelsesgrupperne sekventielt elimineres ved indføring af I ønskede substitutions-grupper i specifikke positioner, hvorefter -OH-grupper- I ne i andre specifikke positioner samt amino- og carboxyl-grupperne frigøres. I I 5

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at produkterne I med A-og U-enheder omfatter flere typer-OH-beskyttelsesgrupper, nemlig I I (1) én eller flere semi-permanente grupper, dvs. grupper, der for det første I I kan fjernes efter glycosylerings-reaktionerne, når glucidinskelettet indeholder I I det ønskede antal rester, uden fjernelse eller ændring af andre tilstedevær- I I 10 ende grupper, og (2) én eller flere permanente grupper, dvs. grupper, der er i I I stand til at opretholde -OH-grupperne i beskyttet form under indføringen af I I funktionelle grupper i stedet for de semi-permanente grupper, idet disse I beskyttelsesgrupper vælges blandt grupper, såsom acyl, alkyl, eventuelt I substitueret alkyl eller aryl. I I 15 I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at -OH- I I beskyttelsesgrupperne vælges fra gruppen omfattende acyl, især acetyl, I alkyl, substitueret alkyl, såsom benzyl, og til to nabostillede positioner I acetater eller ketaler, for eksempel benzyliden, idet en anden beskyttelses- I I 20 form består i at blokere to -OH-grupper som epoxy- og/ eller 1,6-anhydro- I broform. I

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegn- I e t ved, at de i glycosyleringsreaktionen anvendte produkter indeholder flere I 25 typer beskyttelsesgrupper, idet beskyttelsesgrupperne eventuelt allerede I I indtager bestemte positioner på de i glycosylerings-reaktionen anvendte I I produkter eller alternativt indføres fra andre grupper, når først glucidinskelet- I I tet er blevet opbygget, hvilket alternativ f.eks. omfatter, at der til glycosylering I I anvendes en forbindelse A, hvori -OH-gruppeme i 2- og 3-positionen og i 1- I I 30 og 6-positionen er blokeret i vandfri form, henholdsvis 2,3-epoxid og 1,6- I I anhydro, idet åbningen af epoxid-funktionen ved hjælp af natriumazid mulig- I I gør indføring i 2-positionen af en N3-gruppe, som herved udgør en præcursor I I for en amin-funktion. I DK 175970 B1

5 COCM N «1 10 eller én disaccharid-enhed med en struktur af typen z1 -s-> 3x eller y1 -s-> 3x med formlen la: 15 COCM p-O^ 20 to\| / \]_/ ORj N hvori:

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegn-e t ved, at -OH-grupper i de udgangsmaterialer, der er bestemt til at blive sulfaterede, er beskyttet med acyl-grupper, især med acetyl, medens de -OH-grupper, der er bestemt til at blive frigivet ved syntesens afslutning, er 5 beskyttet med en permanent gruppe, såsom benzyl-gruppen.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegn- e t ved, at forbindelsen A i 2-positionen indeholder en nitrogenholdig gruppe, der fortrinsvis udgøres af grupper, såsom -N3 eller -N-phtalimido, eller en 1 10 hvilken som helst anden gruppe, som udgør en praecursor for amin-funktion- en eller for et aminderivat, især for -NHSO3* eller for -NH-acyl, især -NH-COCH3.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet 15 ved, at U-enhedernes carboxyl-funktioner er blokerede med grupper, som er inerte over for de reaktioner, der anvendes til udskiftning af beskyttelsesgrupperne, og som kan fjernes ved syntesens afslutning, til frigivelse af carboxyl-gruppeme, eventuelt med henblik på saltdannelse, idet disse beskyttelsesgrupper med carboxyl-funktion med fordel vælges blandt alkyl-2 o grupper eller aryl-grupper.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at A- og U-enhedeme i den dannede sekvens indeholder midlertidige beskyttelsesgrupper, dvs. grupper, der er i stand til selektivt at blokere en position i A- 25 eller U-enheden, der er bestemt til at deltage i en ny glycosylerings-reaktion, idet disse grupper kan fjernes i nærvær af de andre grupper, som er til stede i udgangsforbindelsernes enheder under gendannelse af en alkohol.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at, når det drejer 30 sig om et U-A-disaccharid med forlængelse mod højre, er de(n) midlertidige beskyttelsesgrupper til stede på A-enheden og, ved forlængelse mod venstre på U-enheden, hvilket ved gennemførelse af successive glycosylerings-reaktioner muliggør opnåelse af de ønskede kædedannelser UwAxUyAz, hvori summen af indexene er på mellem 2 og 12, idet disse værdier er inkluderet i DK 175970 B1 ! intervallet, hvor w og y ikke samtidig kan være 0, idet regulære kædedan- H neiser er af typen U (AU)n, (AU)nA, {UA)n eller (AU)n, hvor n er lig med 1-6.

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-9, kendetegn- 5. t ved, at alkohol-funktionen i en af enhederne A eller U, der indgår i den allerede dannede glucidinsekvens, fortrinsvis befries for sin midlertidige ! beskyttelsesgruppe, for eksempel: fra en allyl-gruppe ved en behandling af den type, som først omfatter 10 anvendelse af et isomeriseringsmiddel, for eksempel Pd-, Rh- og Ir-derivater, I især tris-triphenylphosphinrhodium (I) chlorid eller kaliumtertiærtbutoxid, og I derpå under sure betingelser, behandling især med en blanding af mercuri- oxid og mercurichlorid, eller 15 fra en -O-acyl-gruppe, især -O-acetyl, -O-chloracetyl eller -O-lævinyl, I ved forsæbning idet disse grupper kan fjernes for eksempel ved hjælp af I thiourinstof i et opløsningsmiddel, fortrinsvis ved en temperatur over 80 °C, især i størrelsesordenen 100 °C. I 20

11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-10, kend et egn - I e t ved, at alkoholfunktionen omsættes med et reaktivt derivat, såsom et halogenid, fortrinsvis et chlorid eller et bromid, et imidat eller en orthoester, I idet kondensationsreaktionen mellem halogenidet og alkoholen fordel- I 25 agtigt er af typen Koenings-Knorr, og gennemføres i et opløsningsmedium, I især i et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis af typen dichlormethan eller I dichlorethan, med fordel i nærvær af en katalysator, generelt et sølvsalt eller I et kviksølvsalt, f.eks. sølvtrifluormethansulfonat, almindeligvis betegnet sølv- I triflat, sølvcarbonat, sølvoxid, mercuribromid eller mercuricyanid, og ligeledes 30 med en protonacceptor, såsom sym-collidin, og en ekstraktor for det vand, I der eventuelt er til stede, og/eller for den dannede hydrogenhalogensyre, for I eksempel 4 A molekylsigter, ved stuetemperatur eller ved lavere temperatur, I der kan gå ned til 0 °C eller der under, i en atmosfære af en inert gas, såsom I nitrogen eller argon, eller alternativt til dannelse af covalente bindinger DK 175970 B1 mellem alkoholer med forskellige strukturer og en L-idose-præcursor for L-iduronsyren, hvor kondensationsreaktionen gennemføres under anvendelse som katalysator af mercuriderivater, især cyanid- og/eller mercuribromid, molekylsigter, især 4 Å molekylsigter, i et organisk opløsningsmiddel valgt alt 5 efter alkoholens reaktivitet, idet kondensationen med en orth oester, såsom en 1,2-0-methoxy-ethyl-iden-gruppe, fortrinsvis gennemføres ved en temperatur over 100 °C i et opløsningsmiddel af typen chlorbenzen eller ethvert andet opløsningsmiddel, 10 hvis kogepunkt overstiger 100 °C, og som fortrinsvis ligger mellem 100 og 150 °C, i nærvær af en katalysator, såsom 2,6-dimethylpyridiniumperchlorat, idet kondensationen med et imidat gennemføres ved lav temperatur, især ved en temperatur lavere end eller lig med ca. 0 °C, i et opløsnings-15 middel, såsom dichlormethan, i nærvær af en 4 Å molekylsigte og en katalysator, såsom bortrifluoridetherat.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den dannede glucidinkæde underkastes én eller flere kemiske reaktioner til indføring af en 20 type givne funktionelle grupper, eller successivt flere typer grupper, for derpå om ønsket at danne derivater af de funktionelle grupper.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at funktional-iseringstrinnet udføres ved eliminering kun af visse beskyttelsesgrupper 2. og/eller visse præcursor-grupper for amino-derivaterne, eller alle beskyttelsesgrupperne og/eller præcursor-grupperne, og ved i stedet for disse at indføre en given type substituent eller successivt forskellige substituenter, hvorpå en del af eller alle de endnu blokerede -OH-grupper om ønsket frigøres. 30

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at funktionaliseringstrinnet selektivt udføres på en sådan måde, at der i kæden successivt indføres flere typer substituenter, især sulfat-grupper, i fastlagte positioner på enhederne til dannelse i 2-positionen i A-enheder af et amin- I DK 175970 B1 I I 76 I derivat og i 6-positionen i U-enheder af et syrederivat, hvorefter -OH- I funktionerne frigives i andre positioner, idet funktionaliseringstrinnet udføres I I under anvendelse af derivater, hvori de semi-permanente grupper indtager I I positioner, som er bestemt til at blive sulfaterede, og som udgøres af -O- I I 5 acetyl-grupper, idet de positioner, som svarer til en -OH-gruppe, der er I I bestemt til at blive frigivet, indtages af permanente grupper, der udgøres af I I benzyl-grupper, og 2-positionen i A-enheder er substitueret med grupper, I I såsom -N3 eller NH-COO-CH2-C6H5, og 6-positionen i U-enheder indtages af I carboxyl-grupper beskyttet med en alkyl-gruppe, især methyl. I I 10 I

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at funktional- I I iseringstrinnet omfatter: I I selektiv indføring af sulfat-grupperne efter fjernelse af -O-acetyl-bloker- I I 15 ingsgruppen ved en forsæbningsreaktion, der udføres ved hjælp af en stærk I I base, såsom natriumhydroxid, fortrinsvis ved en temperatur lavere end I I omgivelsestemperatur, og især tæt på 0 °C, hvorefter det fra hydrolysen I I resulterende produkt underkastes indvirkning af et alkyleringsmiddel til ind- I I føring på carboxyl-gruppen af de beskyttede alkyl-grupper, der fjernes ved I I 20 hydrolyse, idet denne alkylering efterfølges af en sulfateringsbehandling til I I indføring af sulfat-grupper i de positioner, som blev frigivet ved hydrolyse, og I I som er efterladt i fri tilstand efter indvirkning af alkyleringsmidlet, hvilken I I sulfatisering omfatter anvendelse af et sulfateringsmiddel, såsom et trimethyl- I I amin/SOa-kompleks, i et opløsningsmiddelmedium, især i et opløsnings- I I 25 middel, såsom dimethylformamid, fortrinsvis ved en temperatur højere end I I stuetemperatur, generelt i nærheden af 50 °C, hvilket svarer til en reaktions- I I tid på ca. 12 timer, I I frigivelse af de med benzyl-grupper blokerede -OH-grupper ved fjernelse I I 30 af benzyl-grupperne ved katalytisk hydrogenering under betingelser, der er I I forenelige med opretholdelse af sulfat-grupperne og omdannelsen af de I I nitrogenholdige grupper til funktionelle amino-grupper, fortrinsvis under I I hydrogentryk i nærvær af en katalysator af typen Pd/C, i et organisk opløs- I I ningsmiddel, især et alkoholisk medium tilsat vand, I DK 175970 B1 dannelse af en N-acetyl-gruppe ved at tilføre det fra hydrogeneringsreaktionen resulterende produkt et acetyleringsmiddel, såsom eddikesyre-anhydrid, idet reaktionen med fordel udføres ved basisk pH-værdi, især tæt 5 på 8, i et vandigt medium, eller dannelse af en N-sulfat-gruppe ved hjælp af et sulfatiseringsmiddel af den ovenfor anførte type ved pH højere end 9, fortrinsvis i størrelsesordenen 9-10, frigivelse af carboxyl-gruppen ved tilsætning af en stærk base, 10. saltdannelse af carboxyl-gruppen, for eksempel under anvendelse af ' ionbytterharpikser med den ønskede kation, især med natrium, kalium, lithium, magnesium eller calcium. J

16. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kende tegnet ved, at der i stedet for én eller flere af A- eller U-enhederne anvendes en sukkerart, der udgør en strukturel analog af en A- eller ll-enhed, såsom en neutral sukkerart eller en deoxysukkerart.

17. Oligosaccharider til brug som mellemprodukter ved fremgangsmåden ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at de omfatter en kæde baseret på binære enheder med strukturen (A-U)n eller (U-A)n svarende til kædedannelser x-y (eller omvendt) hvor x, y og z henholdsvis har , formlen 25 30 i I DK 175970 B1 I I 6j—oh COCH I HO 1—o I_c I I '&» V-« /« V** I I 5 ΝΕγ, «Nl-Y Aminoderivat ch I (x) D-galactosamin (y) D-glucuronsyre I i I I /cOQH \ I K I I æ ( I OH ' I I 15 (z) L-iduronsyre I I hvor n er et tal fra 1 til 6, idet (1) den binære enhed er fuldstændigt beskyttet I I . og har enten en reaktiv gruppe på det anomere carbon i den enhed, der I befinder sig ved den reducerende ende, eller en enkelt fri -OH-gruppe på I I 20 den enhed, der befinder sig i den ikke-reducerende ende, idet denne -OH- I I gruppe indtager position 3, 4 eller 6, når det drejer sig om en A-enhed, og I position 2, 3 eller 4, når det drejer sig om U-enheder, eller (2) udgøres af I I fuldstændigt beskyttede enheder, såsom dem, der opnås ved slutningen af I I glycosyleringstrinnet, eller (3) omfatter produkter, hvori én eller flere -OH- I I 25 grupper er frigivet, idet oligosaccharid-mellemprodukterne eventuelt inde- I I holder én eller flere konsekutive x- eller y-enheder og/eller én eller flere I I enheder af neutrale sukkerarter og/eller flere desoxy-sukkerarter i deres I struktur. I I 30

18. Oligosaccharider ifølge krav 17, k e n d e t e g n e t ved, at de har I I samme struktur som fragmenter af dermatan-sulfat, chondroitin-sulfater, I I chondroitiner eller chondrosin og, at de omfatter z1 -a-> 3x, x1 -6-> 4y eller z I I og y1 -a-> 3x bindinger. I DK 175970 B1

19. Oligosaccharider ifølge krav 18, kendetegnet ved, at de omfatter mindst én disacccharid-enhed med en struktur af typen x1 -fi-> 4y med formlen I:

20. Oligosaccharid-mellemprodukter ifølge krav 17 svarende til produkter, hvorfra beskyttelsesgrupperne er delvis fjernet under syntesen, kende- 25 tegnet ved, at produkterne især indbefatter -OH-grupper i stedet for sp-grupperne.

21. Mellemprodukter til brug ved fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1-16, k e n d e t e g n e t ved, at de omfatter: 30 en trisaccharid-struktur især med én af formlerne VI - IX: DK 175970 B1 I I I j1 Opj eller Osp Op eller Osp tj00M I I . - I Op · M op · I I Γ-Op I *—o osp r—o __ .— o I I „ - I °p . . oL €efler Osp QCQM [ Op OU Osp I / 0 ( λ 9P / \b \\OR I « op N1 ^1 I— I Op I OpeterOspyT^ \/~\ A \/ \ (IX) I I V / ^ '-Af / \°\ / I " · op I I 25 I hvori substituenteme har de i krav 19 anførte betydninger, I I en tetrasaccharid-struktur, især med den almene formel: I 30 CCCH ^ Hier Qsp CCOM OpWosp I }-O op eller οερ^ O /-o Osp eller O? /-0‘ I op Op N DK 175970 B1 hvori de forskellige substituenter har de ovenfor anførte betydninger

22. Oligosaccharider ifølge ethvert af kravene 17-21 .kendetegn- e t ved, at der i disse frigøres én, flere eller samtlige -OH-grupper i løbet af 5 syntesen og/eller, at de indeholder én eller flere funktionelle grupper, idet de funktionelle grupper fortrinsvis udgøres af estere og især foreligger i form af uorganiske anioner, især sulfatestere eller phosphatestere, hvilke funktionelle grupper bæres af én eller flere primære alkohol-funktioner og/eller sekundære alkohol-funktioner og/eller primære amin-funktioner. 10

23. Oligosaccharider ifølge krav 22, kendetegnet ved, at de omfatter: x-enheder, der er substitueret i 6- og/eller 3-positionen med estere, fordelagtigt i form af salt med en uorganisk eller organisk kation, især en 15 metalkation, særligt en alkalkation, især natrium, eller en kation afledt af en nitrogenholdig organisk base, f.eks. triethylammonium, idet disse x-enheder endvidere fortrinsvis i 2-positionen har en primær amino-funktionel gruppe, fortrinsvis substitueret med en gruppe, såsom en sulfat- eller en acyl-gruppe, især en acetyl-gruppe, og yderligere fortrinsvis omfatter 20 grupper y eller z med carboxyl-grupper i fri tilstand eller i form af salte med en organisk eller uorganisk kation, som ovenfor defineret, eller beskyttet som ovenfor nævnt, og som mere fortrinsvis indbefatter enheder z omfattende en sulfat-gruppe i 2-positionen og/eller sulfat-grupper på y-enhedeme, 2. idet hydroxyl-funktionerne i pyranringene i enhederne x, y eller z enten er i fri tilstand eller beskyttet med permanente grupper af alkyltypen, især med methyl-grupper.

24. Oligosaccharider ifølge krav 22 svarende til produkterne med formel (I) - 30 (X), kendetegnet ved, at -sp-grupperne i disse er erstattet med anioner, og fortrinsvis indbefatter NH-acyl-grupper, især -NHCOCH3- eller NHS03-grupper på galactosamin-enhederne. I DK 175970 B1 i I

25. Forbindelser ifølge ethvert af kravene 17-24, kendetegnet ved, at I de indeholder frie -OH-grupper i stedet for -Op-gruppeme. I

25 Ri, der er ens eller indbyrdes forskellige, om nødvendigt sammen med R betegner en beskyttelsesgruppe, især en semi-permanent gruppe sp eller en permanent gruppe p, T betegner en midlertidig gruppe t eller en permanent gruppe p, eller et 30 hydrogenatom, N betegner en nitrogenholdig gruppe amin- eller amin-derivat-præcursor, DK 175970 B1 R betegner en alifatisk eller aromatisk gruppe, især en alkyl-gruppe med .1-4 carbonatomer, eller R betegner en substitueret alkyl-gruppe, især en benzyl-gruppe, eller OR betegner en reaktiv gruppe, såsom et halogenid, og 5. betegner en gruppe, der blokerer syre-funktionen, hvor disse forskel- lige symboler har de ovenfor anførte betydninger, idet foretrukne disaccharid- enheder har en af formlerne: I io r— Op eller Osp Op eBer Osp 1—0 j 0 ζοτ. ^ OR m I K Op I ” I 20 I COM L_0 cp ener I . I 25 Op K I __ p °P I M - cy~\ ( _ / Wor (V) iNL·/ \L_/ I Op 1 I 30 DK 175970 B1 hvori: 5. betegner et hydrogenatom eller alkyl, især metyl, sp betegner en acyl-gruppe, især acetyl, p betegner en substitueret alkyl-gruppe, især benzyl, 10 R betegner en acyl-gruppe i α eller β, især acetyl, alkyl, især methyl, eller substitueret alkyl, især benzyl, eller OR betegner et halogenid, især bromid, eller imidoyl, 15 N betegner en azid- eller en phthalimidolyl-gruppe, T betegner gruppen t, der betegner acyl, især acetyl, halogeneret acyl, især monochlor- eller trichloracetyl, eller gruppen p betegner substitueret 2 o alkyl, især benzyl, der eventuelt selv er paramethoxy, eller et hydrogenatom, idet disse enheders kædedannelsesrækkefølge eventuelt er omvendt.

26. Anvendelse af oligosaccharider ifølge ethvert af kravene 23-25 som I i 5 biologiske reagenser og/eller som referenceprodukter. I

27. Farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at de omfatter en I effektiv mængde af et biologisk aktivt oligosaccharid ifølge krav 24 i I sammenblanding med en inert bærer. I I I

28. Farmaceutiske præparater ifølge krav 27, kendetegnet ved, at det I I inerte medium er egnet til oral indgivelse og, at de er i form af gastro- I I resistente kapsler, pellets eller tabletter, piller eller er på liposom form eller i I I form af drikbare opløsninger, fortrinsvis indeholdende fra 50 mg til 5 g efter I I 15 vægt-enhed, fortrinsvis 100-250 mg til kapsler, tabletter og piller, og 1-5 g til I I drikbare opløsninger. I

29. Farmaceutiske præparater ifølge krav 27, kendetegnet ved, at I I oligosacchariderne er i sammenblanding med egnede excipienser til rektal I I 2 0 indgivelse, og er i form af suppositorier eller i former egnet til topisk indgiv- I I else, og er i form af aerosoler eller pomader. I

30. Farmaceutiske præparater ifølge krav 27, kendetegnet ved, at de I I er i form af sterile eller steriliserbare injicerbare farmaceutiske præparater til I I 25 indgivelse såvel intravenøst som intramuskulært eller subkutant, idet opløs- I I ningerne fortrinsvis indeholder 50-250 mg/ml oligosaccharider, fortrinsvis I I 100-150, for eksempel 150 mg/ml, når opløsningerne er beregnet til sub- I I kutane injiceringer eller, at de for eksempel indeholder 25-250, især 150 I I mg/ml, oligosaccharider, når de er beregnet til intravenøs injektion eller I I 30 perfusionsinjektion eller alternativt, at de er i form af drikbare opløsninger I I fortrinsvis indeholdende 500 mg - 5 g virksomme indholdsstoffer. I