DK174348B1 - Pentasaccharider, tetrasaccharider og mellemprodukter i form af pentasaccharider, tetrasaccharider og disaccharider til fremstilling af pentasaccharider, samt fremgangsmåde til fremstilling af pentasaccharider - Google Patents

Description

DK 174348 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte tetra- og pentasaccharider med terapeutisk aktivitet samt hidtil ukendte mellemprodukter for disse. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af pentasaccharider. De omhandlede slutprodukter besidder især biologiske egenskaber, der 5 særligt gør dem interessante som lægemidler og/eller anvendelige f.eks. som laboratoriereagenser. De omhandlede slutprodukter finder især anvendelse inden for det biologiske og biokemiske område.

Ved udtrykket ”mucopolysaccharidsyrer" forstås forbindelser, der ligeledes 10 kan betegnes som glycosaminoglycuron-glycaner. Det drejer sig om oligo-saccharider og polysaccharider, som man især møder i kæderne tilhørende biologisk aktive derivater, såsom derivater af hepraintypen og af heparansul-fattypen.

15 Mucopolysaccharider er i naturprodukter i hovedsagen sammensat af alternerende komponenter, nemlig aminosukkerart-uronsyre eller omvendt. Ami-nosukkerarten, der i det efterfølgende betegnes med A, udviser i sådanne komponenter (gentagelsesgrupper) især en D-glucosamin-struktur. Uronsy-ren, som i det følgende betegnes med U, udviser især en D-glucuronsyre-20 struktur eller L-iduronsyre-struktur.

Basisstrukturen for A svarer til nedenstående formel a, og basisstrukturen for U svarer til nedenstående formler b og c:

25 6r0H

Æ~\ areinderivat (a) Drglucosamin

SO COOH

J—o A_0\

/ \ /COOH V^OH

i^/0" „r/

I OH

Oli (b) D-glucuronsyre (c) L-iduronsyre 2 DK 174348 B1

De forskellige komponenter er i de pågældende naturprodukter indbyrdes forbundet på stereospecifik måde, som i almindelighed sker ved bindingerne i 1-*4 (a) samt 1—>4 (β).

5

Man finder således for eksempel i heparin-bindinger af typen 1->4 (a) (mellem grupperne c og a, a og b samt a og c) og af typen 1—>4 (β) (mellem grupperne b og a), 10 Man bemærker endvidere, idet det stadig drejer sig om naturprodukterne, at de ovenfor omtalte komponenter indeholder specifikke substitutioner, det vil sige bestemte substitutioner i bestemte stillinger. Naturprodukternes kæder indeholder således for eksempel komponenter, der er -O-substituerede, såsom 2-O-sulfat-L-iduronsyre, 3-O-sulfat-D-glucosamin, 3,6-di-O-sulfat-D- 15 glucosamin, 6-O-sulfat-D-glucosamin, samt grupper, der ikke er -0-substituerede, såsom f.eks, D-glucuronsyregrupper, L-iduronsyregrupper og D-glucosamingrupper. Derudover er de med a betegnede grupper N-substituerede i 2-stillingen med -N-acetylgrupper og/eller -N-sulfatgrupper.

20 De ovenfor omtalte mucopolysaccharidsyrers anvendelighed inden for terapien er velkendt, især til forebyggelse af og behandling af koagulationsproblemer og karvægs-problemer, især thromboser samt atherosclerose og arte-riesclerose.

25 Man kender desuden talrige arbejder udført af ansøgeren til opnåelse af fragmenter med høj affinitet over for AT III og med biologisk aktivitet ud fra heparinkæder. De grundlæggende opfindelser i forbindelse med disse arbejder er omtalt i forskellige patentansøgninger, herunder europæisk patentansøgning nr. 80 40 1425,6 jf. EP 270089 A1 og fransk patentansøgning nr. 81 30 08604, offentliggørelsesnummer FR 2504928 B1.

3 DK 174348 B1 I den omtalte europæiske patentansøgning omtales især et octasaccharid, der betegnes som ABCDEFGH, og som besidder anti-thrombose-egenskaber af stor interesse, som har strukturformlen:

' c0° p OR p OR ^0° r- OR rOR

5 Lo Lo .-o Lo . J-oA /Lo /-o /o,

OSO" KHSO" OH NHAc OH NHSO" OSO~ NHSO~ 10A B CDE FG H

I denne formel betegner R en S(V-gruppe eller et hydrogenatom.

I ovenfor omtalte franske patentansøgning omtales en homogen hexasac-charid-forbindelse med strukturen C’DEFGH, som ligeledes er i besiddelse af 15 kraftige anti-thrombose-egenskaber. Denne forbindelses struktur svarer til formlen:

r- OR cno” j- OR r OR

20 II OH NHAc Oli NHSO" 0S°3 IJHSO~

C D E F G H

hvori R betegner en SO3 -gruppe eller et hydrogenatom.

25

De hidtil beskrevne fremgangsmåder til opnåelse af produkter af denne type anvender ekstraktions-teknik ud fra heparin eller produkter opnået under fremstillingen af heparin, eller også depolymerisationsteknik anvendt på he-parin-kæder under indvirkning af et kemisk eller enzymatisk middel efterfulgt 30 af specifik fraktionering, især gennem affinitetskromatografi.

4 DK 174348 B1

Yderligere forskning inden for dette område har været rettet mod nye fremgangsmåder til opnåelse af denne produkttype, især til undersøgelsen af mulighederne for at opnå sådanne ad syntesevejen.

5 Her skal nævnes det store antal problemer, der opstår ved en sådan syntese.

Sådanne produkter indeholder på den ene side i deres kæder flere komponenter af type A og U. Bindingerne mellem disse komponenter svarer på den anden side til en fastlagt stereokemi, idet det drejer sig om bindinger af 1,4-typen, der som bekendt er vanskelige at frembringe. Hver komponent bærer 10 derudover en eller flere specifikke substitutioner afhængig af den pågældende produkttype. Glucosamin-komponenterne i naturprodukterne indeholder ligeledes to indbyrdes forskellige nitrogenholdige grupper, en N-acetylgruppe og en N-sulfat-gruppe.

15 Det følger heraf, at sådanne synteser indtil nu praktisk talt aldrig er blevet omtalt i videnskabelig litteratur, især hvad angår L-iduronsyre.

Alle disse enkeltheder fastlægger begrænsede krav, hvorfor det er let at forstå de vanskeligheder, som man møder ved udarbejdningen af en almen 20 proces og en syntese-fremgangsmåde.

Under udforskningen af sammenfletningssyntese-betingelserne, der egner sig til fremstillingen af en sådan type forbindelser, har man nu udviklet en strategi gennem udvælgelsen af visse særlige typer af beskyttelse for de an-25 vendte udgangsmaterialer.

De gennemførte undersøgelser viser, at med sådanne udgangsmaterialer beskyttet på en sådan måde er det muligt at gennemføre en stereospecifik kædedannelse og derpå, om ønsket, på de således dannede sekvenser ind-30 føre fastlagte substitutioner i forudbestemte stillinger.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udviser en meget stor flexibilitet, hvilket er en egenskab af stor betydning. Det er således muligt med visse fordele, 5 DK 174348 B1 især med hensyn til specificitet og renhed, at opnå talrige oligosaccharid-derivater, der indeholder specifikke substitutioner, som man finder dem hos naturprodukter, eller forskellige substitutioner og/eller komponenter med analog struktur, men med forskellige konfigurationer.

5

Man har ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kunnet opnå pentasaccharider, der især besidder meget værdifulde medicinske egenskaber, især med høj anti-thromboseaktivitet. Man kan ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ligeledes opnå et stort antal særligt værdifulde pentasac-10 charider, der især kan anvendes som biologiske reagenser og/eller som reference-forbindelse til strukturundersøgelser.

Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse hermed hidtil ukendte terapeutisk aktive tetra- og pentasaccharider og mellemprodukter i form af 15 tetra- eller penta- eller disaccharider samt en fremgangsmåde til fremstilling af nogle af de terapeutisk aktive pentasaccharider.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indføres bestemte funktionelle grupper i komponenterne i glycosid-kæden, især specifikke substituenter, 20 således som man møder dem hos biologisk aktive molekylers kæder, især forbindelser af typen heparin og heparan-sulfat. Fremgangsmåden anvendes til fremstilling af pentasaccharider, der har de ovenfor omtalte naturprodukters struktur.

25 I et første aspekt af den foreliggende opfindelse har de omhandlende pentasaccharider formlen: - υΟΟϊ'Ά I—O-jp i—Oi>p

Ni 0i> N-L °*ρ N3 6 DK 174348 B1 hvor M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl;

Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetyl, benzoyl, aryl, benzyl, hydrogen og sulfat, idet Sp og P ikke kan være benzoyl samtidig, Sp og P er fortrinsvist acetyl, hydrogen eller sulfat og mest foretrukkent er P hy~ 5 drogen eller benzyl og Sp acetyl, hydrogen eller sulfat;

Ni, N2, og N3 er uafhængigt valgt blandt NH2, -NH-COO-benzyl, -NH-COO-acetyl, -NH-SO3" og -NH-acetyl, fortrinsvist -NH-COO-benzyl, -NH-SO3' og -NH-acetyl og mest foretrukkent NH2 og -NH-COO-benzyl; T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, eller p-10 methoxybenzoyl, fortrinsvist hydrogen, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, p-methoxybenzoyl, og mest foretrukkent hydrogen eller benzyl; og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, og benzyl, fortrinsvist benzyl; eller -OR er halogen, f.eks. Br, eller imidoyl; 15 og deres salte, hvor M er et alkali-metal.

I et andet aspekt af den foreliggende opfindelse har de omhandlende penta-saccharider formlen: o»- co°' roso’' rOSOi' f HH50, °f N,ISUi‘· 0B0‘ NHS0> 25 hvor P er valgt blandt acetyl, benzoyl, aryl, benzyl, hydrogen og sulfat, fortrinsvist hydrogen, -NHSO3' kan erstattes med -NH-acetyl, og 30 -OH kan erstattes med alkoxy, f.eks. methoxy.

I et tredje aspekt af den foreliggende opfindelse har de omhandlende tetra-saccharider formlen: 7 DK 174348 B1 COOi''* Οίρ r—0> (' T|^4vwf^O'°s“m’

Op W„ 05p hvor M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl, fortrinsvist alkyl, 10 Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetyl, benzoyl, aryl, benzyl, hydrogen og sulfat, idet Sp og P ikke kan være benzoyl samtidig, fortrinsvist er Sp acetyl, hydrogen eller sulfat og P benzyl eller hydrogen,

Ni og N2 uafhængigt valgt blandt -NH-COO-benzyl, -NH-COO-acetyl , NH2 15 eller-NH-SO3, fortrinsvist -NH-COO-benzyl, -NH-COO-acetyl eller NH2, T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, eller p-methoxybenzoyl, fortrinsvist hydrogen, monochloracetyl eller benzyl og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, og benzyl; eller OR er halogen, f.eks. Br, eller imidoyl, 20 og deres salte, hvori M er et alkali-metal.

Et fjerde aspekt af den foreliggende opfindelse omfatter mellemprodukter i form af pentasaccharider med formlen XXIV eller i form af tetrasaccharider med formlen XXIII, hvori substituenterne er som ovenfor defineret for de til-25 svarende slutforbindelser med samme formel, og idet mindst én af grupperne Ni, N2 og/ eller N3 er azido.

Et femte aspekt af den foreliggende opfindelse omhandler mellemprodukter i form af disaccharider med formlen: 30 8 DK 174348 B1

C O OM

i r°Rl jcVvØ- “

5 hvor uRj W

M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl, N er valgt blandt -NH-COO-benzyl, azido, -NH-COO-acetyl, -NH-SO3' og -NH-acetyl, T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, eller p-10 methoxybenzoyl; og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, og benzyl, eller OR er halogen, f.eks. Br, eller imidoyl,

Ri er acetyl, benzyl, hydrogen eller sulfat, eller R og Ri tilsammen danner det divalente radikal -CH2-O-, 15 og deres salte hvor M er et alkali-metal.

I en foretrukken udførelsesform er disse disaccharid-mellemprodukter ifølge den foreliggende opfindelse med formlen I, hvor M er Na+ eller alkyl, 20 T er monochloracetyl, hydrogen, benzyl eller acetyl, R er alkyl, eller -OR er brom,

Ri er acetyl, benzyl, hydrogen eller sulfat, eller R og Ri tilsammen danner det divalente radikal -CH2-0-, N er azido eller acetylamino.

25

Et sjette aspekt af den foreliggende opfindelse angår mellemprodukter i form af disaccharider med formlen: p- o fc 1 t— o —o 30 /'(CcrOM f\OR. ύ ^ (VIII)

OA, N

9 DK 174348 B1 hvor T, R1f M, og R er defineret som for formel I, og hvor M fortrinsvist er alkyl eller hydrogen, 5 N fortrinsvist er -NH-COO-benzyl eller azido, T fortrinsvist er hydrogen, monochloracetyl eller benzyl,

Ri fortrinsvist er benzyl eller acetyl, R fortrinsvist er benzyl, eller

Ri og R fortrisnvist tilsammen danner den divalente radikal -CH2-O-.

10

Et sidste aspekt af opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et pentasaccharid med formlen XXXII ifølge den foreliggende opfindelse, hvori P er hydogen, hvilken fremgangsmåde omfatter at en forbindelse med formlen XXIV ifølge den foreliggende opfindelse, hvor Sp er acetyl, P er benzyl, 15 Nt og N2 er azido, N3 er -NH-COO-benzyl, M er alkyl, og T er benzyl, gøres til genstand for følgende reaktioner: - fjernelse af de O-acyl-blokerende grupper, - sulfatering af de frigjorte OH-grupper ved anvendelse af et tri- 20 methylamin/S03-kompleks som sulfaterings-middel, - frigørelse af de OH-grupper, der er beskyttet af benzylgrupper, og omdannelse af de nitrogenholdige grupper til funktionsdygtige aminogrupper ved katalytisk hydrogenering, og - sulfatering af frie OH-grupper og af funktionsdygtige ami- 25 nogrupper ved anvendelse af et trimethylamin/S03-kompleks som sulfaterings-middel.

I en udførelsesform af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan sulfateringen udføres i et opløsningsmiddel, f.eks. dimethylforma-30 mid, ved en temperatur, der er højere end stuetemperatur og i nærheden af 50 'C.

10 DK 174348 B1 I en anden udførelsesform af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan den katalytiske hydrogenering udføres under hydrogentryk i nærvær af en katalysator af Pd/D-typen i et organisk opløsningsmiddel.

5

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan desuden yderligere omfatte, at den anvendte forbindelse med formlen XXIV er fremstillet ved omsætning af en forbindelse med formlen XXIII ifølge opfindelsen, hvor Sp er acetyl, P er benzyl, T er Η, M er alkyl, Ni er azido, og N2 er -10 NHCOO-benzyl med et monosaccharid med formlen: r* Of\c Λ l\08n / 15 BnO \L_/ &<' (44) I en foretrukken udførelsesform af denne fremgangsmåde omfatter den yderligere, at den anvendte forbindelse med formlen XXIII er fremstillet ved en 20 kondenseringsreaktion mellem følgende disaccharider: -OAc pOAc -_α

OBn Ντ I

J OAc nh (20) (40 t 30 hvor MCA betegner monochloracetyl og efterfølgende -O-dechloracetylering, eller alternativt, at den anvendte forbindelse med formlen XXIII er fremstillet ved en kondenseringsreaktion mellem følgende disaccharider: 11 DK 174348 B1

.—OAC

iOOM' —0AC I

5 +

I I OA c NH

OBn Mj t=0 (97) (41) (>Bn 10

Slutprodukter og mellemprodukter ifølge opfindelsen fremstilles ved at etablere covalente bindinger mellem komponenter med strukturen A og U i overensstemmelse med den stereokemi, som foreligger ved denne type kædedannelse inden for de ønskede biologisk aktive molekyler.

15

Den ønskede kædedannelse gennemføres i en given rækkefølge og/eller med givet stereospecifikt forhold.

Man kan således især frembringe en binding af typen 1—>4 (a) mellem en D-20 glucosaminkomponent og enten D-glucuronsyre eller L-iduronsyre, en binding af typen “l-tA (β) mellem en D-glucuronsyrekomponent og en D-glucosaminkomponent samt en binding af typen 1—4 (a) mellem en L-iduronsyrekomponent og en D-glucosaminkomponent.

25 De som mellemprodukter ved denne syntese optrædende mono- eller oligo-saccharider er halvåbne eller åbne forbindelser. Man betegner med udtrykket halvåben til højre en forbindelse, der er aktiveret eller som lader sig aktivere, ved sit anomere carbonatom, hvorved den lader sig overføre til den ikke-reducerende ende af et monosaccharid eller et oligosaccharid. Udtrykket 30 "forbindelse, der er halvåben til venstre", betegner et monosaccharid eller et oligosaccharid, som har en enkelt OH-gruppe, der er fri, eller som er potentielt fri, hvilket muliggør specifik glycosiddannelse. Som illustration viser efter- 12 DK 174348 B1 følgende formel 1 et eksempel på en forbindelse, der er halvåben til venstre, og formel 2 viser et eksempel på en forbindelse, der er halvåben til højre: rrO!\c cool^ F\ o6>\,

N

10 1 2

Som følge heraf betegner man som åbne forbindelser en forbindelse, der samtidig er halvåben til venstre og til højre ifølge ovenstående definition, idet sådanne forbindelser muliggør en kædeforlængelse i begge retninger. En 15 forbindelse af en sådan type kan for eksempel svare til formlen 3: tø*· /1 20 (MtAO y---j \

rV

3 25 Med hensyn til lukkede forbindelser drejer det sig om forbindelser, hvis grupper ikke er i stand til at føre til en kædeforlængelse på grund af arten af de indgående substituenter,

Komponenterne A eller U i den dannede sekvens bør med henblik på tilføjel-30 se af yderligere komponenter til den i forudgående behandlingstrin opnåede sekvens A-U eller U-A indeholde midlertidige beskyttelsesgrupper, det vil sige grupper, som er i stand til selektivt at blokere en stilling i komponenten A eller U, som er beregnet til at indgå i en yderligere glycosiddannelses- 13 DK 174348 B1 omsætning. Disse grupper lader sig fjerne i nærvær af andre i udgangskomponenterne tilstedeværende grupper under gendannelse af en alkohol, hvilket ved gentagelse af det forudgående glycosiddannelses-behandlingstrin tillader forlængelse af glycosidskelettet.

5

Fremgangsmåden giver således adgang til syntese af oligosaccharider med varierende kædekonfigurationer, hvad enten det drejer sig om stereospecificitet α eller β og/eller rækkefølgen i kædedannelsen mellem komponenterne a og/eller b og c og/eller d, idet denne forlængelse kan gennemføres efter 10 behag.

Ved en anden udførelsesform underkastes den således fremstillede glycosid-kæde en eller flere kemiske omsætninger til indførelse af en given type af funktionsdygtige grupper eller successivt flere typer af grupper, hvorpå man, 15 om ønsket, kan danne derivater af disse funktionelle grupper.

Dette behandlingstrin til indførelse af funktionsdygtige grupper kan gennemføres, idet man kun fjerner visse af beskyttelsesgrupperne og/eller visse af forstadie-grupperne for de aminogruppeholdige derivater, eller også den tota-20 le mængde beskyttelsesgrupper og/eller forstadie-grupper, og idet man i stedet for disse indfører en given type substituent eller successivt forskellige substituenter, hvorpå man, om ønsket, frigør en del af eller det totale antal af de stadigt blokerede OH-grupper.

25 Det er underforstået, at de forskellige i kædens gentagelsesgrupper tilstedeværende grupper er forligelige med de i hvert enkelt trin indførte substituenter.

Den eller de kemiske omsætninger, der tages i brug under de forskellige be-30 handlingstrin til indførelse af funktionelle grupper, gennemføres på en sådan måde at de ikke ændrer kædens struktur, eller de grupper, som man ønsker eventuelt at opretholde og/eller sådanne, som allerede er blevet indført.

14 DK 174348 B1

Ved en foretrukken metode til opnåelse af pentasaccharider med specifikke substituenter, som ovenfor defineret, anvender man med fordel udgangskomponenter, som indeholder flere typer af beskyttelsesgrupper, det vil sige (1) en eller flere semipermanente grupper og (2) en eller flere permanente 5 grupper. Ved udtrykket "semipermanente grupper" forstår man grupper, der lader sig eliminere i det første trin efter glycosid-dannelsesomsætningen, når glycosid-skelettet indeholder det ønskede antal komponenter, uden undtagelse af eller ændring af de andre tilstedeværende grupper, hvorved man muliggør indførelsen af de ønskede funktionelle grupper i de stillinger, som 10 de optager.

"Permanente grupper” er sådanne, som er i stand til at opretholde beskyttelsen af OH-grupperne under indførelsen af de funktionelle grupper i stedet for de semipermanente grupper.

15

Disse grupper er valgt blandt sådanne, som er forligelige med de funktionelle grupper, som er indført efter elimineringen af de semipermanente grupper.

Derudover drejer det sig om grupper, som er inerte over for de reaktioner, der gennemføres for at bringe disse funktionelle grupper på plads, og som 20 kan fjernes, uden at de omtalte funktionelle grupper bliver ændret.

Man kan på fordelagtig måde ved disse systemer fremstille en glycosid-kæde, hvori komponenterne A og U er substitueret på selektiv måde.

25 Til fremstilling især af oligosaccharider, som indeholder gentageisesgrupper A og/eller U af de ovenfor omtalte biologisk aktive molekyler, kan man med fordel anvende beskyttelsesgrupper, såsom acylgrupper, alkylgrupper, der eventuelt er substituerede, eller arylgrupper.

30 De komponenter af typen A, der tages i brug, indeholder i 2-stillingen en ni-trogenholdig gruppe, som muliggør bevarelse af tilstedeværelsen af en nitro-genholdig funktionel gruppe under de behandlinger, som gennemføres ved fremgangsmåden. Den nitrogenholdige gruppe består fortrinsvis at sådanne 15 DK 174348 B1 grupper som -N3 eller -NHCOO-CH2-C6H5, eller en hvilken som helst anden gruppe, som udgør et forstadium for aminogruppen eller et aminoderivat, især -NHSO3· eller -NH-acyl, ganske særligt -NH-COCH3.

5 Hvad angår carboxylgrupperne i komponenterne U, er disse blokeret med grupper, som er inerte over for de omsætninger, der tages i anvendelse for at erstatte beskyttelses-grupperne, og som lader sig fjerne ved syntesens afslutning til frigørelse af disse carboxylgrupper, eventuelt med henblik på saltdannelsen. Disse beskyttelsesgrupper for carboxylgruppen vælges med for-10 del blandt alkylgrupper eller arylgrupper.

Strukturen af de udgangsmaterialer, der anvendes ved glycosylerings-omsætningen, vælges afhængigt af de ønskede komponenter i glycosid-skelettet såvel som af de ønskede substituenter.

15

Man anvender for eksempel, dersom man ønsker at danne et disaccharid af typen -U-A-, to forbindelser henholdsvis med uronsyrestruktur og aminosuk-kerstruktur, idet disse i øvrigt svarer til de ovenfor anførte definitioner.

20 Disse forbindelser, således som de anvendes for at fremstille det pågældende disaccharid, indeholder i øvrigt med henblik på forlængelse af kæden en midlertidig gruppe i den stilling, som er beregnet til at indgå i den påfølgende glycosiddannelses-omsætning. Med henblik på en forlængelse af disacchari-det U-A mod venstre er den pågældende midlertidige gruppe til stede på 25 gentagelsesgruppen U, medens den for en forlængelse mod højre befinder sig på gentagelsesgruppen A..

På denne måde er det muligt at opnå især kædekonfigurationer Uw Αχ UY Az, hvori summen af de angivne indexværdier er på fra og med 2 til og med 12, 30 idet w og y ikke samtidigt kan have værdien nul. Regelmæssige kædekonfigurationer er af typen U(AU)n (AU)nA, (UA)n eller (AU)n, idet 1 < n < 6.

Man kan modificere det skift imellem typen A-U eller U-A, som man møder i naturprodukternes strukturer, idet man i stedet for den ene eller den anden af 16 DK 174348 B1 gentagelsesgrupperne A eller U anvender en sukkerart, som udgør en strukturanalog til gentagelsesgrupperne A eller U, såsom en neutral sukkerart eller en desoxysukkerart, eller andre uronsyre- eller aminosukkkerartkompo-nenter U eller A med forskellige konfigurationer.

5

Man omsætter f.eks. den ovenfor beskrevne alkohol med et reaktionsdygtigt derivat, såsom et halogenid, et imidat eller en orthoester. Sådanne kondensationer gennemføres under vandfri betingelser.

10 Kondensations-reaktionen mellem halogenidet og alkoholen er mest fordelagtigt den såkaldte Koenigs-Knorr-type. Halogenidet er fortrinsvis et bromid eller et chlorid på grund af disses lette tilgængelighed.

Der arbejdes i et opløsningsmiddelmedium, især i et medium af et organisk 15 opløsningsmiddel, særligt af typen chlormethan eller dichlorethan.

Der anvendes med fordel en katalysator, i almindelighed et sølvsalt eller et kviksølvsalt, for eksempel sølvtrifluormethansulfonat, som hyppigt betegnes sølvtriflat, sølvcarbonat, sølvoxid, mercuribromid eller mercuricyanid. Der 20 anvendes ligeledes en proton-acceptor, såsom symcollidin, såvel som en acceptor for det vand, der eventuelt er til stede og/eller for den dannede hy-drogenhalogenidsyre, f.eks. en 4 Å molekylsigte

Ved undersøgelse af reaktionsbetingelserne har man påvist, at man passen-25 de kan arbejde ved omgivelsernes temperatur eller ved en lavere temperatur, som dog mindst er på O’C, samt under atmosfæretryk af en inert gas, såsom nitrogen eller argon.

Under disse betingelser er det muligt efter den ønskede stereokemiske kon-30 figuration at kondensere komponenter med strukturen a og b eller c (eller omvendt). Det er ligeledes muligt at etablere covalente bindinger med neutrale sukkerarter eller med desoxysukkerarter.

En variant, som indebærer anvendelsen som katalysator af mercuri-derivater, 17 DK 174348 B1 især af mercuricyanid og/eller mercuribromid, har vist sig egnet til etablering af covalente bindinger mellem alkoholer med varierende struktur og udgående forbindelser for et L-idose-forstadium for en komponent med strukturen c (L-iduronsyre). Man anvender ved denne variant ligeledes en 4 Å mole-5 kylarsigte. Det organiske opløsningsmiddel er valgt afhængigt af alkoholens reaktionsdygtighed. Man anvender således med fordel et opløsningsmiddel af typen nitrobenzen, når kondensationen kræver en temperatur højere end 100'C. Man anvender lavere temperaturer opløsningsmidler, såsom benzen eller dichlormethan.

10

Blandingen af opløsningsmidler egner sig ligeledes til gennemførelse af kondensations-reaktionen.

Det er ved komponenter af typen U, især af typen betegnet som c, fordelag-15 tigt som reaktionsdygtig gruppe at anvende en såkaldt orthoester. Herved anvendes fortrinsvis til omsætningen en temperatur over 100‘C.

Opløsningsmiddel-mediet er af typen chlorbenzen eller et vilkårligt andet opløsningsmiddel, hvis kogepunkt overstiger 100*C, og som med fordel er mel-20 lem 100 og 150°C. Til aktivering af omsætningen anvender man en katalysator, såsom 2, 6-dimethylpyridinperchlorat.

Denne udførelsesform for kondensations-trinnet har vist sig at være af stor interesse for tilvejebringelsen af en interglycosid-binding mellem en kompo-25 nent med strukturen c (L-iduronsyre) og en komponent med strukturen a (D-glucosamin).

Man opnår ved anvendelsen af en orthoester-gruppe i øvrigt en dobbelt fordel.

30

Man opnår derved på den ene side at tilføre det anomere carbonatom i c den reaktivitet, som er nødvendig til glycosiddannelses-omsætningen. Åbningen at denne gruppe sikrer på den anden side placeringen i 2-stillingen af c af en beskyttelsesgruppe, der selektivt lader sig fjerne og erstatte med en specifik 18 DK 174348 B1 substituentgruppe

Det er således muligt ved omsætning mellem en 1,2-O-methoxyethyliden-gruppe i en komponent c med OH-gruppen fra en komponent a på én gang 5 at skabe en interglycosid-binding mellem de to anvendte udgangsprodukter og i 2-stiMingen af c at have en O-Ac-gruppe til rådighed (idet Ac betegner en acetylgruppe), som vil kunne fjernes selektivt efter afslutningen af indførelsen afen given funktionel gruppe, fx -$03', Denne forholdsregel medfører ligeledes fuldstændig frihed med hensyn til behandlingen af 4-stillingen i kompo-10 nentc.

Man kan ved disse særligt fordelagtige forholdsregler frembringe en 2-0-iduronsulfat-gentagelsesgruppe, således som den for eksempel foreligger i heparin-kæderne.

15

Det har vist sig passende, når man som reaktionsdygtig gruppe anvender en imidoylgruppe, at arbejde ved lave, temperaturer, især ved en temperatur lavere end eller lig med ca. OX, i opløsningsmiddelmiljø, såsom i di-chlormethan, i nærvær af en molekylarsigte af typen 4 Å samt af en katalysa-20 tor, såsom bortrifluoridetherat.

I udgangsalkoholen gentager den frie OH-gruppe den stilling, som man ønsker at anvende ved glycosid-bindingen.

25 Det er således muligt ved valg af en passende alkohol at etablere bindinger af typen 1-2, 1-3, 1 -4 eller 1 -6.

Man oparbejder ud fra den sekvens, som er dannet ved afslutningen af kondensations-reaktionen, en kæde, der indeholder det ønskede antal gentagel-30 sesgrupper, idet man gentager glucosiddannelses-trinnet.

Alkoholgruppen i en af gentagelsesgrupperne A eller U, som er impliceret i den allerede fremstillede glycosidsekvens, frigøres derpå fra sin midlertidige beskyttelsesgruppe. Valget af en sådan gruppe er let at fastlægge for fag- 19 DK 174348 B1 manden afhængig af arten af de øvrige i glycosid-kæden tilstedeværende grupper.

Blandt de forskellige grupper, der lader sig anvende, kan nævnes allylgrup-5 pen, som ved behandling for eksempel først med et isomeriseringsmiddel, såsom derivater af Pd, Rh og Ir, især rhodium tris-triphenylphosphin (I) eller kaliumtertiobutoxid, og påfølgende behandling, især under sure betingelser, med en blanding af mercurioxid og mercurichlorid, let fører til gendannelsen af en alkohol i den stilling, som den indtager.

10

Det er ligeledes muligt at opnå en OH-gruppe ved forsæbning af en O-acyl-gruppe, især en O-acetylgruppe eller O-chloracetylgruppe.

Disse grupper kan derpå for eksempel elimineres til frigivelse af en OH-15 gruppe, f.eks. ved hjælp af thiourinstof i opløsningsmiddelmiljø, især ved en temperatur over 80°C, fortrinsvis i størrelsesordenen 100‘C.

De i det forudgående beskrevne arrangementer tillader opnåelsen af en gly-cosidkæde med alternerende gentagelses grupper A-U eller U-A.

20

Denne regelmæssige alternering kan modificeres ved anvendelsen af passende udgangsmaterialer ved glycosiddannelses-reaktionen. Det er således muligt at fremstille en uregelmæssig struktur med inkorporering af komponenter forskellige fra U eller A, især neutrale sukkerarter eller desoxysukke-25 rarter. Man kan opnå en anden type af uregelmæssig struktur ved tilføjelse af tiere konsekutive komponenter A eller U mellem to komponenter i strukturen A-U eller U-A.

Det er klart, at de forskellige arrangementer ifølge opfindelsen, som er be-30 skrevet for komponenterne A og U, ligeledes lader sig anvende på andre komponenter, der kan være indeholdt i glycosidkæden, såsom neutrale sukkerarter eller desoxysukkerarter.

Som tidligere angivet vælges de forskellige grupper, som er til stede på kom- 20 DK 174348 B1 ponenterne A og U, på en sådan måde, at de tilfører disse sidstnævnte en tilstrækkelig reaktionsdygtighed til at etablere den pågældende glycosid-binding.

5 Man vælger i almindelighed beskyttelsesgrupperne for OH-grupperne, bortset fra de allerede omtalte midlertidige beskyttelsesgrupper, inden for gruppen omfattende acylgrupper, især acetyl, alkyl og substitueret alkyl, såsom benzyl, samt for to nabostillinger inden for gruppen bestående af acetaler eller ketaler, f.eks benzyliden. En anden form for beskyttelse består i, at man 10 gennemfører en blokering af to OH-grupper i form af et epoxid eller af en 1, 6-anhydro-bro.

De udgangsprodukter, som anvendes ved glycosiddannelsesreaktionen, indeholder med fordel flere typer af beskyttelsesgrupper, hvorved man under 15 behandlingstrinnet til indførelse af funktionelle grupper successivt kan indføre en eller flere funktionelle grupper og frigive en eller flere OH-grupper, dersom dette ønskes.

Udtrykt alment kan beskyttelsesgrupperne allerede optage forud fastlagte 20 stillinger i de udgangsprodukter, som anvendes ved glycosiddannelsesreaktionen.

De kan ligeledes indføres ud fra andre grupper, når først glycosid-skelettet er blevet oprettet. Ved denne variant kan man for eksempel til glycosiddannel-25 sen anvende en komponent A, hvori OH-grupperne i 2 og 3-stillingen samt i 1- og 6-stillingen er blokeret på anhydridform, henholdsvis som 2,3-epoxid og som 1,6-anhydro. Man har takket være denne blokering et element til disposition under udarbejdelsen af glycosid-skelettet, som potentielt udgør en gen-tagelsesgruppe A; men som ikke interfererer med de under syntesen 30 anvendte reaktioner. Dette arrangement har den fordel, at man har en stor grad af frihed til at gennemføre de ønskede reaktioner med de øvrige komponenters grupper.

21 DK 174348 B1

Det skal i øvrigt bemærkes i det foreliggende tilfælde, af åbningen af epoxid-gruppen ved hjælp af natriumazid tillader indførelse i 2-stillingen af en N3-gruppe, der således udgør et forstadium for aminogruppen.

5 Man anvender fortrinsvis, for at kunne disponere over en glycosid-kæde, som tillader den selektive indførelse af en eller flere typer af substituenter under behandlingen til indførelse af funktionelle grupper, især de ovenfor omtalte specifikke substitutioner, udgangsprodukter, som indeholder forskellige typer af beskyttelsesgrupper, nemlig såvel semipermanente som permanente 10 grupper, således som det er defineret ovenfor.

Substituenterne i de pågældende naturprodukter, med undtagelse af substi-tuenterne i 2-stillingerne i gentagelsesgrupperne A, består, som allerede antydet, i hovedsagen af sulfatqrupper.

15

Undersøgelser, som man har gennemført til fastlæggelse af de passende sulfaterings-betingelser, har vist, at det er muligt og endda fordelagtigt at gennemføre en sulfaterings-reaktion i nærvær af benzylgrupper. Man kan gennemføre fjernelsen af permanente benzyl-grupper i nærvær af O-sulfat-20 grupper i modsætning til, hvad man hidtil har ment.

De OH-grupper i udgangsmaterialet, som er beregnet til at blive sulfateret, beskyttes på foretrukken måde med acylgrupper, især acetyl-grupper, medens de OH-grupper, der er beregnet til at blive frigjort ved syntesens afslut-25 ning, beskyttes med en permanent gruppe, såsom en benzylgruppe.

Det er muligt, takket være den store fleksibilitet knyttet til fremgangsmåden at underkaste hele den således fremstillede glycosid-kæde en given kemisk reaktion til indføring af en bestemt type substituent.

Denne behandling kan for eksempel bestå af en esteriticering, især en sulfa-tering, ved hjælp af et passende middel, idet denne behandling gennemføres under betingelser, som ikke ændrer den sammenflettede struktur. Denne sul- 30 22 DK 174348 B1 fatering kan gennemføres specifikt eller uspecifikt og om ønsket på det totalt for beskyttelsesgrupper befriede glycosid.

Behandlingstrinnet til indføring af funktionelle grupper kan f.eks. gennemfø-5 res selektivt på en sådan måde, at man i kæden successivt indfører flere typer substituenter og derpå frigør visse OH-grupper.

Under særligt fordelagtige betingelser, som tillader, at man indfører sulfatgrupper i bestemte stillinger i komponenterne, at man frigør OH-grupper i 10 andre stillinger, at man i 2-stillingen af A-komponenter danner et amino-derivat og i 6-stillingen af U-komponenter danner syrederivater, anvender man komponenter, som er i overensstemmelse med følgende karakteristika:

De semi-permanente grupper i disse komponenter indtager stillinger, som er 15 beregnet til at blive sulfateret, og de består af -O-acetyl-grupper,

Med hensyn til de stillinger, som svarer til en OH-gruppe, der er beregnet til at blive frigjort, er de optaget af semi-permanente grupper bestående af ben-zylgrupper, 20 2-stillingerne i A-komponenterne er substitueret med grupper, såsom eller -NH-COO-CH2-C6-H5, og 6-stillingerne i U-komponenterne er optaget af car-boxylsyregrupper, der er beskyttet af en alkylgruppe, især methyl.

25 Disse betingelser tillader gennemførelse af behandlingstrinnet til indføring af funktionelle grupper, fx på følgende måde: Først indføres sulfatgrupperne selektivt, efter at man har fjernet -OH-acetylgrupperne anvendt til blokering. Denne reaktion gennemføres således, 30 at den ikke indvirker på de tilstedeværende benzylgrupper, nitrogenholdige grupper eller carboxylgrupper

Med henblik herpå gennemfører man med fordel en forsæbnings-reaktion 23 DK 174348 B1 ved hjælp af en stærk base, såsom natriumhydroxid.

Man gennemfører fortrinsvis denne reaktion ved en temperatur lavere end omgivelsernes temperatur, især i nærheden af O'C.

5

Det således fremstillede reaktionsprodukt kan underkastes hydrolyse ved indvirkning af et alkyleringsmiddel for på carboxylgruppen at indføre de alkyl-beskyttelsesgrupper, som vil blive fjernet under hydrolysen.

10 Man opnår på denne måde ved omsætning med et sulfaterings-middel indførelse af sulfatgrupper i de stillinger, som er frigjort gennem hydrolyse, og som er forblevet frie efter indvirkningen med alkyleringsmidlet.

For at opnå tilfredsstillende reaktionsbetingelser til gennemførelsen af sulfa-15 teringen anvender man et sulfaterings-middel, såsom et trimethylamin/S03-komplex. Denne reaktion gennemføres fordelagtigt i opløsningsmiddelmedium, især i et opløsningsmiddel, såsom dimethylformamid. Man arbejder fortrinsvis ved en temperatur højere end omgivelsernes temperatur, i almindelighed ved ca. 50°C, hvilket svarer til en reaktionstid på ca. 12 timer.

20

Man fortsætter efter indførelsen af sulfatgrupperne på alkohol-grupperne med frigørelsen af de OH-grupper, som er blokeret med benzylgrupper.

Man gennemfører med fordel fjernelse af benzylgrupperne ved katalyseret 25 hydrogenering under reaktionsbetingelser, som er forligeliqe med opretholdelsen af sulfatgrupperne og med omdannelsen af de kvælstofholdige grupper til funktionsdygtige aminogrupper.

Man arbejder fortrinsvis under hydrogentryk i nærvær af en katalysator af 30 typen Pd/C.

Denne reaktion gennemføres fordelagtigt i et organisk opløsningsmiddelmedium. især alkoholisk, hvortil der er sat vand.

24 DK 174348 B1

Reaktionen gennemføres med fordel til opnåelse af hydroqeneringen af de nitrogenholdige forstadie-grupper og fjernelse af de grupper, der beskytter OH-grupperne, med en reaktionstid på ca. 3 - 4 dage, 5 De funktionelle aminogrupper foreligger, som allerede anført, i de pågældende biologisk aktive molekyler i form af derivater af typen N-acetyl eller N- sulfat.

Til dannelsen af N-acetylgrupper underkaster man reaktionsproduktet, der er 10 opnået ved hydrogenerings-omsætningen, indvirkning af et acetylenngsmid-del. Eddikesyreanhydrid udgør et særligt egnet middel til dette formål.

For at gennemføre denne selektive acetylerings-reaktion uden at indvirke på de andre substituenter, der er til stede på komponenterne, er det især be-15 kvemt at arbejde ved basisk pH, især nær værdien 8 og i vandigt medium.

Man kan ligeledes ønske at danne N-sulfatgrupper, hvilket lader sig gennemføre ved hjælp af et sulfateringsmiddel som ovenfor angivet. Ved denne sul-fatering anvender man pH-værdier større end 9, især i størrelsesordenen 9- 20 10.

Tilsætning af en stærk base efter sulfateringsomsætningen tillader en frigørelse af carboxylgrupperne.

25 De således dannede reaktionsprodukter lader sig let omdanne til salte ved hjælp af passende kationbytter harpikser. Denne kation består i naturprodukterne, især af natrium. Man anvender derfor med fordel ionbytterharpikser indeholdende natriumioner.

30 Man kan ligeledes danne salte med kalium, lithium, magnesium og calcium.

Her udnyttes så en proton-ionbytterharpiks, hvorpå man neutraliserer den derved dannede syre med den til kationen svarende base.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes forbindelser, som udgør synte- 25 DK 174348 B1 semellemprodukter ved de forskellige trin i den ovenfor beskrevne syntesefremgangsmåde.

Mellemprodukter i form af penta-, tetra-, og disaccharider ifølge opfindelsen 5 indeholder f.eks. mindst én fuldstændig beskyttet, binær gentagelsesgruppe A-U og U-A, som har enten en reaktionsdygtig gruppe på det anomere car-bonatom i komponenten i den reducerende ende, eller en enkel fri OH-gruppe på komponenten i den ikke-reducerende ende, idet denne OH-gruppe indtager stillingen 3, 4 eller 6, når det drejer sig om en komponent af 10 typen A, eller stillingen 2, 3 eller 4, når det drejer sig om en komponent af typen U.

Mellemprodukter kan også bestå af fuldstændigt beskyttede gentagelses-grupper, således som disse opnås ved afslutningen af glycosid-15 dannelsestrinnet, eller af produkter, hvori en eller flere OH-grupper er frigjort.

Disse forskellige oligosaccharider indeholder en kæde, baseret på binære gentagelsesgrupper med strukturen (A-U)n eller (U-A)n hvori n er et tal fra 1 til 6.

20

Disse oligosaccharider svarer til en kædedannelse af typen a-b eller a-c.

Glycosidkæden kan også bestå af en enkelt type af disse binære gentagelsesgrupper.

25 I andre tilfælde er flere af disse typer til stede.

Tilsvarende oligosaccharider indeholder i kæderne gentagelsesgrupper a-b og a-c.

30

Det er klart, at den ovenfor beskrevne rækkefølge i kædedannelsen inden for en eller flere af de binære gentagelsesgrupper kan byttes om inden for opfindelsens rammer.

26 DK 174348 B1

Mellemprodukter ifølge opfindelsen indeholder ifølge en variant en eller flere konsekutive komponenter a eller b eller c.

Mellemprodukterne indeholder ifølge en anden variant i strukturen en eller 5 flere komponenter bestående af neutrale sukkerarter og/elier flere desoxy-sukkerarter. De forskellige beskyttelsesgrupper for disse sukkerarter svarer til de ovenfor i forbindelse med komponenterne A og U anførte definitioner.

De i disse forbindelser indgående komponenter er indbyrdes forbundet med 10 bindinger af typen 1-2, 1-3, 1-4 eller 1-6 afhængig af arten af den alkohol, der tages i anvendelse ved glycosid-dannelsestrinnet.

De forbindelser, som har strukturen som heparmfragmenter eller heparansul-fat-fragmenter, indeholder bindinger d(a)1—>4a, a(a)1—>4b, a(a)1—>4c og 15 b(p)1-4a.

Foretrukne forbindelser tilhørende denne gruppe indeholder i 2-stillingen af disse komponenter en -NHSCV-gruppe. Andre forbindelser indeholder en -NH-acyl-gruppe, især -NFI-acetyl 20

De i det følgende omtalte estere foreligger fortrinsvis i form at salte med en uorganisk eller organisk kation, især en metalkation, særligt en alkalimetal-kation, eller en kation afledt at en nitrogenholdig organisk base, for eksempel triethylammoniumionen.

25

De anvendte kationer består fortrinsvis af natrium. Andre kationer egner sig ligeledes, såsom kalium, magnesium eller calcium.

Forbindelser ifølge opfindelsen indeholdende carboxylgrupper i kom-30 ponenterne b eller c kan være frie, eller de foreligger fortrinsvis i form at salte med en organisk eller uorganisk kation, som ovenfor defineret. De kan ligeledes være beskyttet som ovenfor omtalt.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan anvendes som biologiske reagenser, 27 DK 174348 B1 der lader sig anvende i laboratoriet, især som sammenligningsforbindelser ved undersøgelsen af andre forbindelser, hvis antikoagulations-aktivitet man ønsker at afprøve, især i relation til inhibering af faktor Xa og bestemmelse af antithrombin III (AT III).

5

Man kan teste et oligosaccharid for antikoagulationsaktivitet (anti-Xa-aktivitet) ved at anvende faktor Xa, således som den markedsføres af firmaet SIGMA, i en opløsning indeholdende 8 U/ml i fysiologisk saltopløsning, idet koncentrationen af substratet er 1,33 mM.

10

Til gennemførelsen af denne prøve går man frem på følgende måde:

Man blander 10 pi af den opløsning, der skal måles, og 300 μΙ human plasma, som er fortyndet med en bufter (Tris-maleat 0,02 M, pH 5).

15

Man lader inkubere 1 minut ved. 37°C.

Derpå tilsættes 100 μΙ af ovennævnte faktor Xa (8 U/ml), hvorpå man 1 minut senere indsprøjter den således opnåede opløsning i substratet.

20

Visse forbindelser har den fordel, at de ikke har en virkning til aktivering af blodplade-aggregationen, og at de ikke medfører thrombocytopeni. De har ligeledes den fordel, at de er praktisk talt blottet for indvirkning på blødningstiden, hvilket eliminerer risikoen for blødninger. Disse to egenskaber er 25 overordentlig vigtige ved den medicinske anvendelse.

Man har derudover ved subcutan indgift iagttaget en forlænget pharmacoki-netik, hvilket ligeledes giver disse forbindelser stor betydning.

30 Derudover udviser sådanne forbindelser ingen toxicitet.

Disse forbindelser er derfor særligt værdifulde ved fremstillingen af lægemidler, der især er anvendelige ved forebyggelsen af og behandlingen af throm-boser.

28 DK 174348 B1 Sådanne forbindelser lader sig ligeledes anvende ved fremstillingen af farmaceutiske formuleringer, der indeholder forbindelser med høj anti-Xa-aktivitet, især de ovenfor beskrevne pentasaccharider.

5

De er især egnet til fremstillingen af farmaceutiske formuleringer, som ikke indeholder pyrogene bestanddele, og som indeholder en effektiv mængde af aktiv-bestanddelene sammen med sædvanlige farmaceutiske strækkemidler.

10 De finder ligeledes anvendelse i formuleringer, i hvilke det farmaceutiske bærermiddel er egnet til indgift ad peroral vej. Sådanne formuleringer, egnet til peroral indgift, kan være gastroresistente gelatinekapsler, tabletter eller piller, eller de kan foreligge som liposomer.

15 Atter andre farmaceutiske formuleringer indeholdende disse forbindelser sammen med passende strækkemidler kan være beregnet til rectal indgift.

De tilsvarende former kan bestå af suppositorier.

Andre indgift-former for de pågældende forbindelser består af aerosoler eller 20 pomader

De pågældende forbindelser kan ligeledes foreligge som injicerbare formuleringer, som er sterile eller lader sig sterilisere, og som er egnet til intravenøs såvel som intramusculær eller subcutan indgift.

25 Sådanne opløsninger indeholder med fordel 1000 til 100.000 enheder (Yin— Wessler)/ml oligosaccharider, fortrinsvis 5.000 - 50.000, f.eks. 25.000 U./ml, når disse opløsninger er beregnet til subcutan indsprøjtning. De kan for eksempel indeholde 500 - 10.000, især 5.000 u/ml oligosaccharider, når de er 30 beregnet til intravenøs indsprøjtning eller perfusion.

Sådanne farmaceutiske formuleringer kan med fordel foreligge som en-gangssprøjter, der er parat til anvendelse.

29 DK 174348 B1

De omhandlede forbindelser kan ligeledes indgå i farmaceutiske formuleringer, som indeholder sådanne forbindelser sammen med en anden aktiv-bestanddel, hvilke især lader sig anvende til prophylaxe og behandling af thromboser, såsom et venetonisk middel, såsom dihydroergotamin, et nico-5 tinsyresalt eller et thrombolytisk middel, såsom urokinase.

De pågældende farmaceutiske formuleringer er især egnede til regulering (forebyggende eller helbredende) af visse trin vedrørende blodets koagulation hos mennesker eller hos dyr, især når det drejer sig om sådanne tilfælde, 10 hvor patienten er udsat tor risici for hyperkoaguleringsevne stammende især fra kirurgiske operationer, atheromatøse processer, udviklingen af tumorer samt sygdomstilstande med hensyn til koagulationen grundet bakterielle eller enzymatiske aktivatorer etc.

15 Til belysning af sådanne forbindelsers anvendelse skal i det følgende gives eksempel på posologi, således som den lader sig anvende over for mennesker: En sådan posologi omfatter for eksempel indgift i patienten af 1.000 - 25.000 enheder (Yin-Wessler) på subcutan måde en til tre gange hver dag, afhængig af graden af risiko for hyperkoaguleringsevne eller patientens 20 thrombotiske tilstand, henholdsvis 1.000 - 25.000 enheder/24 timer ved intravenøs indgift med diskontinuert tilførsel med regelmæssige mellemrum eller kontinuert gennem perfusion eller også 1.000 - 25.000 enheder (tre gange pr. uge) ad intramusculær eller subcutan vej (idet alle disse enheder er udtrykt som såkaldte Yin-Wessler-enheder). Sådanne doser kan naturligvis regule-25 res for hver enkelt patient, afhængig af de opnåede resultater og de forinden foretagne analyser af blodet, afhængig af arten af den lidelse, som patienten lider under, og alment af vedkommendes helbredstilstand.

Foruden at indeholde oligosaccharider, kan de pågældende farmaceutiske 30 formuleringer ligeledes indeholde mindst én forbindelse, som ovenfor defineret, forbundet ved covalent binding til et opløseligt eller et uopløseligt bærer-stof med fordel ved hjælp af en sukkerart med endestillet reducerende gruppe.

30 DK 174348 B1

Foretrukne konjugater af forbindelserne med opløselige bærerstoffer er forbindelser bundet til AT III.

Andre foretrukne konjugater med opløselige bærerstoffer udgøres af forbin-5 delser, der er fastgjort til en bærer, såsom et protein, især polylysin eller bovint serumalbumin.

Disse produkter er anvendelige som immunogene substanser, der i sig selv er kilde til antistof-cirkulationsprodukter in vivo eller monoklonale antistoffer, 10 som er klonede in vitro ved hjælp af passende teknik.

De omhandlede forbindelser er ved andre foretrukne konjugater bundet til uopløselige bærerstoffer. Man vil her med fordel anvende de klassiske bærerstoffer. Disse konjugater lader sig anvende som immunoabsorbenter, 15 f.eks. ved en højt specifik oprensning af AT III samt ved bestemmelse deraf eller til fremstilling af hidtil ukendte athrombotiske polymere, der er forligelige med blod, ved fiksering af forbindelserne på biologisk forligelige polymere.

De omhandlede oligasaccharider finder ligeledes anvendelse inden for nu-20 klearmedicinen som radiofarmaceutiske produkter. Disse produkter markeres i så fald ved hjælp af en tracer, valgt blandt sådanne, som almindeligvis anvendes inden for dette område, især ved hjælp af technetium 99 m.

Med henblik herpå omdanner man technetium 99 m, som opnås ud fra kom-25 mercielt tilgængelige generatorer i form af ikke-reaktionsdygtigt natriumper-technetat med valensen 7 til technetium, som er reduceret i valens til 4, hvilket er den mest reaktionsdygtige form for technetium. Denne omdannelse gennemføres med et reducerende system, som dannes ud fra tinsalte (stan-nochlorid), jernsalte (ferrosulfat), titansalte (titantrichlorid) eller andre salte.

30 I langt de fleste tilfælde er denne simple reduktion af technetium tilstrækkelig til, at man under fastlagte pH-betingelser kan gennemføre fikseringen af technetium på det pågældende molekyle.

31 DK 174348 B1

Man kan anvende de omhandlede forbindelser, som på en vis måde udgør et bærerstof, ved målinger i størrelses-ordenen 100 - 200 enheder Yin-Wessler.

Ved videreudvikling af disse radiofarmaceutiske reaktionskomponenter kan 5 man gå frem i overensstemmelse med den metode, der er angivet af P.V.

KULKARNI et al. i The Journal of Nuclear Medicine 21, nr. 2, side 117-121.

Man anvender med fordel de således mærkede produkter ved afprøvninger in vivo til påvisningen af og diagnostiseringen af omfanget af thromboser og 10 af thrombotiske tilstande.

De omhandlede forbindelser kan ligeledes anvendes til bestemmelsen af specificiteten i talrige enzymsystemer, som er indblandet i glucosaminoglucu-ronglycanernes metabolisme.

15 I årene 2001 og 2002 er der blevet publiceret et stort antal artikler, der alle dokumenterer de terapeutiske samt andre gavnlige effekter af følgende forbindelse, der tillige omtales som Fondaparinux natrium (en specifik udførelsesform med formel XXIV) og som sælges under navnet "ARIXTRA": 20 °S°,- coo- C!o°!'

Lh 25 O"' "JHS0 OH NHSOj- OSO,' NHSO,·

Fondaparinux natrium inhiberer specifikt faktor Xa. Dette er veldokumenteret 30 i bl.a.: Petitou et al. Semin. Thromb. Hemost. (2002) the synthetic pentasaccharide Fondaparinux: First in the class of antithrombotic agents that selectively inhibit coagulation facor Xa 28(4): 393-402; Bauer et al. PMID (2002)

Factor Xa inhibition in the prevention of venous thromboembolism and treat- 32 DK 174348 B1 ment of pateints with venous thromboembolism 8(5):398-404; Bauer et al.

Cardiovasc. Drug Rev. (2002) Fondaparinux, a synthetic pentasaccharide: the first in a new class of antithrombotic agents - the selective factor Xa inhibitors 20(1): 37-52. Review, 5

Desuden er der publiceret en række artikler, der dokumenterer, at Fondaparinux kan bruges med succes i forbindelse med ortopædkirurgiske indgreb til forebyggelse af thrombose, eksempelvis: Bauer et al. N. Eng. J. Med. Fondaparinux compared with enoxapahn for the prevention of venous throm-10 boembolism after elective major knee surgery 18:1305-10; Eriksson et al. N.

Engl. J. Med. (2001) Fondaparinux compared with enoxapahn for the prevention of venous thromboembolism after hip-fracture surgery 18:1298-304.

De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen. Figurerne 1-32 illustrerer 15 nogle af de produkter, som anvendes ved de beskrevne synteser.

I disse figurer anvendes formlernes nummereringer ligeledes i eksemplerne til beskrivelse af ensartede produkter.

20 I de pågældende formler anvendes følgende forkortelser: A: allyl

Ac: acetyl

Me: methyl 25 Bn: benzyl

Bz: benzoyl MCAO. monochloracetyl

Tr: trityl P; propenyl 30 but.: butyl og S betegner: enS03'gruppe 33 DK 174348 B1 EKSEMPEL 1 (Udgangsmaterialet 5 Syntese af derivatet 13: methvl-(prop-1 '-envl)-2,3-di-Q-benzvl-g-D-glucopyranosid-uronat med formlen: COOMe H ON-βΡ OBn 15 Denne syntese gennemføres ud fra glucose under anvendelse af følgende trin (a) til (m): (a) fremstilling af allylderivatet; 20 (b) blokering af stillingerne 4 og 6 i allylderivatet med en benzyli- dengruppe; (c) indføring af benzylgrupper i stillingerne 2 og 3; 25 (d) deblokering af stillingerne 4 og 6 ved fjernelse af benzyli- dengruppen; (e) indføring af en tritylgruppe i stillingen 6 efterfulgt af en acetyle-rings-reaktion i 4-stillingen; 30 (f) fjernelse af tritylgruppen fra 6-stillingen; (g) oxidering af den primære alkoholgruppe i 6-stillingen; 34 DK 174348 B1 (h) methylering af carboxylgruppen i 6-stillingen; (i) indføring af propenylgruppen i 1-stillingen; 5 (j) fjernelse af acetylgruppen i 4-stillingen.

Disse trin gennemføres som vist i det følgende (se figurerne 1 og 2): (a) Fremstilling af allyl-a-D-qlvcopyranosid (forbindelse 1) 10

En opløsning af gasformig hydrogenchlorid (18 g) i allylalkohol (600 ml) opvarmes ved 70°C. Derpå tilsættes vandfri glucose (300 g), og temperaturen opretholdes i 3 timer, 15 Reaktionen lader sig følge ved tyndtlagskramatograti (TLC) i opløsningsmiddelblandingen methanol/chloroform (1/4, v/v). Den efter 3 timers forløb opnåede brune opløsning inddampes til tørhed under vakuum, neutraliseres med en opløsning af koncentreret ammoniakvand (50 ml), hvorpå den på ny inddampes til tørhed. Til den således opnåede inddampningsrest tilføres aceto-20 ne (500 ml), der opvarmes til kogning, og kogningen vedligeholdes indtil fuldstændig opløsning. Væsken fradekanteres efter afkøling. Inddampningsre-sten underkastes på ny den samme behandling, indtil TLC-analyse af ekstrakten viser en udpining af forbindelsenl i inddampningsresten, henholdsvis en for kraftig kontaminering af ekstrakten med urenheder.

25

En del af den først ekstraherede fraktion (12 g) kromatograferes over siliciumoxid. Man opnår forbindelsen 1, som kan omkrystalliseres i en blanding af acetone/ether (6,5 g; smeltepunkt 95 - 99°C). Resten af det fremstillede produkt kan renses ved samme fremgangsmåde.

30 (b) Blokering af 4- og S-stillinoerne i allylderivatet førende til allvl-4 .6-0-benzvliden-a-D-qlucopvranosid (forbindelse 2)

Forbindelsen 1 (37 g) opløses i dimethylformamid (200 ml). Derpå tilsættes 35 DK 174348 B1 dimethoxytoluen (41 g) efterfulgt af ptoluensulfonsyre med krystalvand (130 mg). Efter 2 timers opvarmning (vandbad) under vakuum og tilbagesvaling er omsætningen tilendebragt (TLC; methanol/chloroform, 2/25, v/v). Opløsningsmidlet afdampes. Den sirupsagtige væske opløses i methanol (mindst 5 mulig mængde), og denne opløsning hældes dråbe for dråbe ind i en vandig opløsning af natriumhydrogencarbonat (6,3 g i 320 ml vand). Det således opnåede bundfald om krystalliseres fra ethanol (21 g; smeltepunkt 120 -121°C). Moderluden fører til yderligere mængder af reaktionsproduktet 2.

Samlet udbytte ( 37 g; 71,4%).

10 (c) Indføring af benzvlqruppen førende til allvl-2,3-di-0-benzvl-4, 6-0-benzvliden-a-D-qlucopvranasid (forbindelse 31

Forbindelsen 2 (45 g) opløses i vandfrit DMF (500 ml). Der tilsættes natrium-15 hydrid (28 g 50% dispersion i olie).

Blandingen afkøles efter 30 minutters forløb til 0°C, hvorpå der dråbe for dråbe tilsættes benzylbromid (52 ml). Reaktionen følges ved TLC (ether/hexan, 1/1, v/v). Derpå tilsættes langsomt methanol (150 ml), der ind-20 dampes til tørhed og genopløses i chloroform. Chloroformfasen vaskes med vand, tørres over natriumsulfat. Efter afdampning af opløsningsmidlet omkrystalliseres inddampningsresten fra en blanding af ether/hexan (36,5 g: smeltepunkt 83 - 84°C). Dette reaktionsprodukt er lettere forurenet med en urenhed, der bevæger sig hurtigere ved TLC (ether/ hexan; 1/1; v/v).

25 (d) Fjernelse af benzvlidenqruppen hørende til allvl-2, 3-di-O-benzvl-g-D-qlucopvranosid (forbindelse 4)

Man sætter til en opløsning af forbindelsen 3 (56 g) i methanol (1 liter) vand 30 (450 ml) og derpå p-toluensulfon-syre med krystalvand (17 g).

Efter 2 timer ved 80°C afkøles blandingen, opløsningsmidlet afdampes, og inddampningsresten genopløses i chloroform (1 liter). Chloroformopløsnin-gen vaskes med vand indtil neutralt pH, hvorpå den tørres over natriumsulfat.

36 DK 174348 B1 På denne måde opnås en lysegul sirup (48 g), som anvendes i efterfølgende trin (syntese af forbindelsen 5).

(θ’) Indføring af en tritvlqruppe i 6-stillingen efterfulgt af en acetvlerinqs-5 reaktion i 4-stillinqen førende successivt til allvl-2,3-di-0-benzvl-6-0-tritvl-a-D-gluco-pyranosid (forbindelse 5) og dennes 4-Q-acetvl-analoqe forbindelse (forbindelse 6a) (R = acetyl i figur 1-2)

Det ovenfor opnåede derivat 4 (48 g) opløses i pyridin (250 ml), og man til-10 sætter tritylchlorid (28,5 g). Efter 1 times forløb ved 100°C er reaktionen tilendebragt (TLC, ether/ hexan, 1/1, v/v). Ti) den forannævnte opløsning sættes eddikesyreanhydrid (200 ml). Efter en nats forløb er reaktionen tilendebragt (TLC, ether/hexan, 1/2, v/v). Der inddampes til tørhed, inddampnings-resten genopløses i chloroform (500 ml), chloroformfasen vaskes med en 15 10% kaliumhydrogensulfatopløsning, med vand, og der tørres over natrium sulfat.

Chloroformen afdampes. På denne måde opnås forbindelsen 6a, der anvendes, som den foreligger, i omsætningen til fremstilling af forbindelsen 7a.

20 (f) Fjernelse af tritvlqruppen førende til allyl-4-0-acetyl-2,3-di-Q-benzvl-a-D-qlucopyranosid (forbindelse 7a)

Det således opnåede derivat 6a opløses i chloroform (500 ml). Man tilsætter 25 dråbe for dråbe under omrøring til denne opløsning, som er nedkølet til 0°C, en opløsning af bortrifluorid i methanol (12%, 120 ml). Reaktionen følges med TLC (toluen/acetone, 10/2, v/v).

Reaktionsblandingen overføres til en skilletragt. Chloroformfasen vaskes 30 med vand (2 x 100 ml) med en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og derpå med vand indtil neutral pH. Den efter tørring og inddampning opnåede inddampningsrest overføres til en siliciumoxidsøjle (500 g), som er bragt i ligevægt med toluen. Efter eluering af førstedelen af urenhederne ved hjælp af ren toluen elueres reaktionsproduktet med en blanding toluen/ acetone 37 DK 174348 B1 (10/2, v/v). På denne måde opnås 48 g af forbindelsen 7a, som anvendes direkte ved syntesen af forbindelsen 8a. En del af forbindelsen 7a blev fremstillet i ren tilstand: (a]20o = +11* (chloroform). Strukturen blev bekræftet ved IR-og NMR-spektre såvel som ved elementæranalyse.

5 (g) Oxidation af den primære alkoholaruppe i 6-stillina førende til 4-allvl-Q-acetvl-2,3-di-O-benzvl-a-D-alucopvranosid-uronsvre (forbindelse 8a)

En opløsning af forbindelsen 7a (48 g) i acetone (800 ml) køles til -5°C. Der-10 på tilsættes dråbe for dråbe en opløsning af chromtrioxid (30 g) i svovlsyre (3,5 M; 125 ml). Blandingen får lov til at nå op på omgivelsernes temperatur. Reaktionen overvåges med TLC (methanol/chloroform, (1/10, v/v). Efter omsætningens afslutning udhældes reaktionsblandingen i vand (500 ml). Reaktionsproduktet ekstraheres med chloroform (3 x 250 ml). Chloroformfasen va-15 skes med vand indtil neutralt pH, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed.

Den således opnåede sirup (83 g) anvendes, som den foreligger, ved fremstillingen af forbindelsen 9a.

20 (h) Methylering af carboxylgruppen i 6-stillinqen førende til methvl-(4-allvl-0-acetvl-2,3-di-O-benzvl-g-D-qlucopvranosid-uronat fforbindelse 9a)

Den i trinnet til fremstilling af forbindelsen 8a fremstillede sirup opløses i 25 ether (300 ml). Derpå tilsættes en opløsning af diazomethan i ether, indtil forbindelsen 8a forsvinder (TLC, ether/hexan, 1/1, v/v). Opløsningsmidlerne fjernes, efter at man har gjort surt med eddikesyre.

Den opnåede inddampningsrest (53 g) opløses i ethanol i varmen. Forbin-30 delsen 9a udkrystalliserer ved afkøling. Man opnår efter omkrystallisation denne forbindelse 9a i ren tilstand (18,4 g, smeltepunkt 85 - 86°C, [a]20o = +12° (1,2 chloroform).

Dette produkt karakteriseres gennem IR- og NMR-spektre samt ved elemen- 38 DK 174348 B1 tæranalyse.

Man opnår yderligere 7,6 g af forbindelsen 9a ud fra krystallisationens filtrat.

5 Det samlede udbytte af 9a fremstillet ud fra forbindelsen 2 er 38%.

(i) Indføring af propenvlqruppen i 1-stilling førende til methvl-(prop-1’-envl-4-O-acetyl-2 ,3-di-0-benzvl-q-D-qlucopyranosid)-uronat (forbindelsel Oa) 10 Derivatet 9a (4 g) opløses i en blanding af ethanol (119 ml)L og benzen (51 ml) samt vand (17 ml). Derpå tilsættes diazabicyclooctan (170 mg, og der opvarmes til tilbagesvaling. Til den kogende opløsning sættes tris-(tri-phenylphosphin)-rhodium (I) (550 mg) Kogningen opretholdes i 4 timer (TLC, ether/hexan, 1/1, v/v).

15

Ved omsætningens afslutning filtreres opløsningen, og opløsningsmidlerne fjernes. Inddampnmgsresten chromatograferes over siliciumoxidgel (150 g) med en blanding ethyl-acetat/chloroform (1/50, v/v). Man opnår forbindelsen 10a (3,25 g; 81%),som omkrystalliserer fra ethanol. [α]20ο = +12° (1, chloro-20 form). Smeltepunkt 90°C. Forbindelsens struktur bekræftes ved elementæranalyse samt ved IR- og NMR-spektre, (i) Fiemelse af acetylqruppen fra 4-stillinqen førende til methvl- fprop-1 '-enyl-2 , 3-di-Q-benzvi-a-D-qluco-pvranosid)-uronat (forbindelse 13) 25

Forbindelsen 10a (350 mg) opløses i methanol (5 ml). Der tilsættes natrium-methanolat (0,2 ml, 2 M). Efter 1 time ved omgivelsernes temperatur standses reaktionen ved tilsætning af ionbytterharpiksen "Dowex 50-Η+" , Man opnår efter filtrering reaktionsproduktet 13, som er forurenet med en smule af 30 reaktionsproduktet stammende fra α-β-eliminationen.

Man kan ved en variant af trinnet (e) i stedet for at gennemføre en acetyle-rings-reaktion gennemføre en benzylerings-reaktion, hvilket fører til 4-allyl-O--benzoyl-2,3-di-0-benzyl-4-0-benzoyl-6-0-trityl-a-D-glucopyranosid (forbin- 39 DK 174348 B1 delse 6b) (R6 = benzyl i figur 1-2), hvorfra man derpå fjerner tritylgruppen, hvilket tillader opnåelse af 4-allyl-0-benzoyl-2,3-di-0-benzyl-a-D-glucopyranosid {forbindelse 7b).

5 Disse reaktioner gennemføres på følgende måde:

Fremstilling af forbindelserne 6b oa 7b

Til opløsningen i pyridin af forbindelsen 5 tilsættes benzoylchlorid (1,5 ækvi-10 valenter), og reaktionen følges med TLC (ethylacetat/benzen, 1/20, v/v). Overskuddet af benzoylchlorid ødelægges ved tilsætning af et overskud af methanol. Efter afdampning til tørhed vaskes inddampningsresten, som er genopløst i chloroform, med en 10% opløsning af KHS04, med vand, den tørres og inddampes til tørhed. Den således opnåede sirup anvendes, som 15 den foreligger, ved syntesen af forbindelsen 7b. Denne sirup (105 g, opnået ud fra 30 g af forbindelsen 3) opløses i chloroform (300 ml). Man tilsætter p~ toluensulfonsyre (76 g af monohydratet i 100 ml methanol. Efter en nats forløb er reaktionen tilendebragt (TLC, ethylacetat/chloroform, 1/20, v/v). Chlo-roformfasen vaskes med vand indtil neutralt pH, den tørres og opkoncentre-20 res til tørhed. Den således opnåede sirup chromatograferes over en søjle af siliciumoxidgel (1,2 kg), elueres med chloroform (0,6 liter) og derpå med en blanding af ethylacetat/chloroform (1/20, v/v). På denne måde opnås derivatet 7b i ren tilstand (30 g), som man anvender, som det foreligger, i trinnet til fremstilling af forbindelsen 8b.

25

Det er muligt ud fra forbindelsen 7b at oxidere -CH20H-gruppen i 6-stillingen og derpå indføre en methylgruppe på den således dannede carboxylgruppe, idet man successivt danner 4-ally!-0-benzoyl-2 , 3-di-O-benzyl-a-D-glyco-pyranosid-uronsyre (forbindelse 8b) og den tilsvarende methylester (forbin-30 delse 9b). Disse derivater fremstilles, idet man går frem på følgende måde:

Fremstilling af forbindelsen 8b og af esteren 9b

Forbindelsen 7b (27 g) behandles analogt med det beskrevne for 7a ved 40 DK 174348 B1 fremstillingen af 8a. Den ved behandlingen opnåede sirup indeholder forbindelsen 8b, som methyleres med diazoniethan, som beskrevet for forbindelsen 8a.

5 Den ved afslutningen af methyleringen opnåede inddampninqsrest renses over siliciumoxidgel (200 g; ether l/hexan I). På denne måde opnås forbindelsen 9b (21 g; 77,5%). Strukturen bekræftes af IR- og NMR-spektre.

Man fremstiller ud. fra forbindelsen 9b det tilsvarende propenyl-derivat 10b, 10 idet man går frem analogt med 10a. Derpå opnås derivatet 13 ud fra10b ved samme reaktion, som er anført for 10a.

Man fremstiller ifølge en anden variant aliyi-2,3-di-0-benzyl-a-D-glucopyranosid-uronsyre og methyl-(allyl-2, 3-di-O-benzyl-a-D-15 glucopyranosid-uronat (forbindelserne 11 og 12) ved at opløse forbindelsen 8b (1,9 g) i methanol (40 ml). Derpå tilsættes 5N natriumhydroxid i tilstrækkelig stor mængde til opnåelse af en 1M koncentration med hensyn til natriumhydroxid Reaktionen overvåges ved TLC (methanol/chloroform, 1/4, v/v). Når den er tilendebragt, tilsætter man vand (100 ml). Der vaskes med 20 ether, gøres surt, og reaktionsproduktet ekstraheres med ether. Den sure etherfase vaskes med vand indtil neutralt pH. Man isolerer ikke derivatet 11 Det methyleres ved hjælp af en etheropløsning af diazomethan, som således fører til forbindelsen 12 (900 mg, 56%), der derpå renses over en søjle af siliciumoxidge! (ether/hexan, 1/1, v/v) [o]20d = +35,2° (1,3, chloroform) 25 Strukturen bekræftes af elementæranalyse samt af IR- og NMR-spektre. Man kan på tilsvarende måde opnå derivaterne 11 og derpå 12 ud fra 9a eller 9b.

Forbindelsen 13 kan opnås ud fra forbindelsen 12, idet man går frem på følgende måde: 30

Forbindelsen 12 behandles med rhodium-komplekset som beskrevet i forbindelse med 9a. Forbindelsen 13 opnås med et udbytte på 90%. Den er karakteriseret gennem sine IR- og NMR-spektre. Derudover ved behandling med eddikesyreanhydrid (1 ml til 180 mg 9a) til forbindelsen 10a.

41 DK 174348 B1

Derivatet 13 kan ud fra endnu en variant opnås ud fra 10a eller 10b, idet man går frem som beskrevet ved fremstillingen af 17 ud fra 9a eller 9b.

5 EKSEMPEL 2 (Mellemprodukt med formlen I)

Syntese af disaccaridet 20 eller 1-brom-3.6-di-0-acetyl-2-azido-4-0[methvl-10 2.3-di-0-benzvl-4-0-chloracetvl-8-D-qlucopvranosyl-uronatl-D-qlucopyranose med formlen: COOMe i—Q Ac M3Bn /\/oAc )

15 MCA0\_Y

OBn N3 (20)

Denne syntese består af følgende trin (se figurerne 3 og 4): 20 (A) Fremstillingen ud fra derivat 13 fra eksempel 1 af monosaccharidet 16 eller methyl-(1-brom-2,3-di-0-benzyl-4-0-chloracetyI-a-D-glucopyranosyl-uronat; (B) Kondensation af forbindelsen 16 med monosaccharidet 17 førende til di-25 saccharidet 18; (C) Acetolyse af forbindelsen 18 førende til disaccharidet 19 samt (D) Bromering førende til disaccharidet 20.

30 (Al Fremstilling af monosaccharidet 17

Denne syntese gennemføres ud fra monosaccharidet 13 eller methyl- (prop-1’-enyl-2,3-di-0-benzyl-a-D-glycopyranosid-uronat ifølge efterfølgende tre 42 DK 174348 B1 trin: 1: Chloracetylering af forbindelsen 13; 5 2: Deblokering af det anomere carbonatom; 3: Bromering af det anomere carbonatom.

1: Chloracetylering af forbindelsen 13 førende til forbindelsen 14, dvs.

10 methvl-f orop-1 -envl-2, 3-di-0-benzvl-4-0-chloracetvl-a-D-qlucopyranosid-uronat

Man opløser 2,8 g af forbindelsen 13 i 30 ml pyridin (6,56 mmol). Der tilsættes efter afkøling til 0°C dråbe for dråbe 10 ml af en opløsning af 2 ml chlora-15 cetylchlond i 20 ml dichlormethan. Efter 30 minutters forløb inddampes til tørhed, inddampningsresten opløses i 200 ml chloroform, der vaskes med en 10% opløsning af KHS04, derpå med vand, og der tørres og inddampes. Den opnåede sirup chromatograferes over siliciumoxidgel (200 g; elueringsmiddel AcOEt/hexan; 1/3, v/v). På denne måde opnås 2,7 g af forbindelsen 14 i ren 20 form i form af en sirup (udbytte: 80%). [α]20ο = +2’ (c 1,5, chloroform). Den forventede struktur bekræftes af elementæranalyse og af NMR-spektret.

2: Afbiokering af det anomere carbonatom førende til forbindelsen 15 eller methyl-(2 ,3-di-0-benzv!-4-Q-ch!oracetv!-D-q!ucopyranosid)-uronat 25

Man opløser 2,7 g (5,3 mmol) af derivatet 14 i 80 ml af en blanding af aceto-ne/vand (5/1; v/v). Derpå tilsættes mercurioxid (3,1 g) efterfulgt af en opløsning af mercuri-chlorid (3,9 g) i acetone (27 ml). Efter 5 minutters forløb fjernes saltene ved filtrering. Efter opkoncentration til tørhed genopløses ind-30 dampningsresten i chloroform. Chloroformfasen vaskes med en 10% Kl-opløsning og derpå med vand, Reaktionsproduktet omkrystalliseres efter inddampning fra en blanding af ethylacetat/hexan. Man opnår 2 g af et fast stof med smeltepunkt 105 - I07X; [a]20o = -4,7* ((ækv., 1, chloroform). Elementæranalyse og undersøgelse af NMR bekræfter strukturen (udbytte 80%).

43 DK 174348 B1 3: Bromerinq af det anomere carbonatom førende til forbindelsen 16 eller methvl-(1-brom-2.3-di-0-benzvl-4-Q-chloracetvl-o-D-qiucopyranosid)-uronat 5

Man opløser 2 g (4,30 mol) af forbindelsen 15 i 50 ml dichlormethan. Derpå tilsættes ved 0°C 4,8 ml (34,4 mmol) symcollidin efterfulgt af brommethylen-dimethylammoniumbromid (17 mmol), der er fremstillet efter HEPBURN D.R. og HUDSON H.R., J. Chem. Soc. Perkin I (1976) 754—757.

10

Blandingen fortyndes efter 4 timers reaktion med 100 ml dichlormethan, hvorpå den hældes ud i isvand. Efter vask med isvand afdampes opløsningsmidlet. Efter chromatografering over siliciumoxidgel (20 g, elue-ringsmiddel hexan/ethylacetat, 2/1, v/v) opnår man 2,06 g af forbindelsen 16 i 15 form af en sirup (udbytte: 90%), [o]20d = +82,5° (c= 1,5; chloroform). Strukturen bekræftes af elementæranalyse og en undersøgelse af NMR.

(B) Fremstilling af disaccharidet 18 eller 3-0-acetvl-1, 6-anhvdro-2-azido-4-O- fmethvl-2, 3-di-0-benzvl-4-0-chloracetvl-g-D-qlucopvranosvl1-uronat-B-D-20 qluco-pyranose

Denne syntese er baseret på kondensationen af monosacchariderne 16 og 17 med 78 mg (3,8 mmol).

25 Man sætter til en opløsning af 870 mg (3,8 mmol) af forbindelsen 17 i dichlormethan 1 g drierite, 0,5 g molekylarsigte 4 Å i pulverform samt 0,525 g frisk fremstillet sølvcarbonat. Efter 2 timers omrøring tilsættes dråbe for dråbe ved 0°C 670 mg (1,3 mmol) af forbindelsen 16. Efter 6 timers forløb fjernes de faste bestanddele ved filtrering. Den således opnåede sirup chroma-30 tograferes efter inddampning over siliciumoxidgel (50 g; elueringsmiddel: chloroform/ethylacetat, 4/1, v/v). Man opnår disaccharidet 18 i form af et skum (421 mg; 50%). [a]20D = -17° (c = 1, chloroform). Elementæranalyse bekræfter strukturen. Undersøgelse ved NMR bekræfter den interglycosi-diske bindings konfiguration.

44 DK 174348 B1 (C) Fremstilling af disaccharider med strukturen 19 ved acetolvse af disac-charidet 18 5 Disachcariderne 19 fremstilles, idet man underkaster disaccharidet 18 en acetolyse-reaktion som vist i det følgende.

300 mg af forbindelsen 19 opløses i en blanding af 4 ml eddikesyreanhydrid og 0,5 ml frisk destilleret trifluor-eddikesyre. Reaktionsblandingen underka-10 stes omrøring i 0 timer ved 18°C, hvorpå den inddampes til tørhed og geninddampes sammen med toluen. Inddampningsresten chromatograferes over en siliciumoxidgelsøjle (15 g). Man indvinder ved eluering med en blanding af dichlormethan og ethylacetat (19/1, v/v) 282 mg af en blanding af de anome-re acetater med strukturen 19 i form af en farveløs sirup (udbytte: 86%). For-15 holdet mellem α-formerne og β-formerne bestemt ved NMR-analyse, er 4/1.

NMR-spektret bekræfter den forventede struktur.

(D) Fremstilling af disaccharidet 20 ved bromerinq af disacchariderne 19 20

Man underkaster blandingen af acetaterne med strukturen 19 indvirkning af TiBr4: Man underkaster under omrøring en opløsning af 140 mg af acetatblandingen 19 i en blanding af 3 ml dichlormethan og 0,3 ml ethylacetat ved 17-18°C og under en tør argonatmosfsere i nærvær af 140 mg TiBr (~2 ækvi-25 valenter) i 2 timer. Efter køling til 0°C og fortynding med 30 ml dichlormethan vaskes blandingen med isvand og derpå med en vandig 5% kaliumbromidop-løsning samt endelig med vand og tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes. Inddampningsresten chromatograferes over en siliciumoxidgelko-lonne (10 g). Ved eluering med en blanding af dichlormethan og ethylacetat 30 (19/1, v/v) genvinder man i elueringsrækkefølgen: • bromidet 20 (74 mg; udbytte 50%) i form af en farveløs sirup, som er ustabil (og som umiddelbart anvendes i efterfølgende reaktion); NMR-spektrum bekræfter den forventede struktur.

45 DK 174348 B1 • en fraktion (28 mg; udbytte 20%), som svarer til uomsat udgangsforbindelse; 5 · en fraktion, som bevæger sig langsommere, og som svarer til partielle O-debenzylerings-reaktionsprodukter.

EKSEMPEL 3 10 (Udgangsmateriale)

Syntese af monosaccharidet 22 eller benzvl-6-Q-acetyl-3-Q-benzvl-2-benzvloxocarbonvlamino-2-desoxv-a-D-glucopvranosid med formlen: 15 |— oAg /~\

hoNlYW

2q WHCoo Βγ»

Dette derivat fremstilles ud fra benzyl-3-0-benzyl-2-benzyloxy-carbonylamino-2-desoxy-a-D-glucopyranosid (derivat 21), idet man går frem på følgende måde (se fig. 5): 25

Man omrører under tilbagesvaling i 30 timer en suspension af forbindelsen 21 (987 mg, 2 mM, denne forbindelse er fremstillet i overensstemmelse med P.C. WYSS og J. KISS, Helv. Chim. Acta, 58 (1975) 1833-1847) i vandfrit 1,2-dichlorethan (15 ml) i nærvær af N-acetyl-imidazol (2,5 mM, frisk fremstil-30 let). Efter afkøling og fortynding med chloroform (50 ml) vaskes den organiske fase med en is-afkølet opløsning af 1 M hydrogenchlorid, med vand, med en mættet opløsning af natriumhydrogencarbonat, med vand, der tørres (natriumsulfat), filtreres og inddampes. Inddampningsresten chromatograferes over en siliciumoxidkolonne (50 g). Eluering med en blanding af dichlor- 46 DK 174348 B1 melhan og acetone (15/1, v/v) fører til derivatet 22 i form af en sirup, som udkrystalliserer fra en blanding af ethylacetat og hexan (759 mg, 71%), smeltepunkt: 114-115‘C; [a]D = + 88° (c = 1, chloroform).

5 EKSEMPEL 4 (Udgangsmateriale)

Syntese af monosaccharidet 33 med formlen: 10 /; °\ / COOMe

Aob" / 15 ~ l

OH

Denne syntese gennemføres ud fra forbindelsen 23 under anvendelse af følgende trin (se fig. 6): 20 (1) indføring af en benzoylgruppe i 5-stillingen (2) methylenng af carboxylgruppen i 6-stillingen (3) isomering af OH-gruppen i 5-stillingen (4) dannelse af pyran-ringen.

25 (1) Benzoylerinqsreaktionen

Man opløser 63 g 3-Obenzyl-l,2-0-isopropyliden-a-D-glucufuranosid (forbindelse 23) i 500 ml vandfrit pyridin. Derpå tilsættes 85 g tritylchlorid, og der 30 opvarmes til 80”C gennem en time. På denne måde opnås forbindelsen 24.

Optisk rotation: (α]20ο = ~34,7\ chloroform.

Denne forbindelses struktur er blevet bekræftet ved IR og NMR-spektre, og jt 47 DK 174348 B1 en elementæranalyse har vist sig korrekt.

Derpå køles blandingen til 0°C, og der tilsættes 45 ml benzoylchlorid. Efter en nats forløb destrueres overskydende mængder reaktionskomponenter ved 5 tilsætning af 300 ml methanol. Man genopløser den således opnåede blanding, der inddampes til tørhed, i chloroform. Chloroformfasen vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes. På denne måde opnås forbindelsen 25.

10 Den således opnåede sirup opløses i 400 ml chloroform. Efter tilsætning af 100 ml af en opløsning af p-toluen-sulfonsyre 5 M i methanol får opløsningen lov til at henstå ved 4°C natten over. Man opnår efter vask med vand af den organiske fase 215 g af en blanding. Forbindelsen opnås ved chromatografe-ring af denne blanding over siliciumoxidgel med et opløsningsmiddel ether-15 hexan 2/1 (v/v). På denne måde opnås 36 g af forbindelsen 26. Optisk rotation: [a]20o = 65,3°, chloroform. Strukturen af forbindelsen 26 er bekræftet ved IR- og NMR-spektre.

(21 Methylerinq af carboxvlqruppen i 6-stillingen 20

Man opløser forbindelsen 26 (1,88 g) i acetone (20 ml). Derpå tilsættes dråbe for dråbe ved -50°C 3,5 ml af en opløsning af Cr03 (13 g) i 3,5 M H2S04(29 ml). Man lader temperaturen stige og efterlader 1 time under disse betingelser. Reaktionsblandingen hældes derpå ud over is, og produktet ekstrahe-25 res med chloroform. Efter vask med vand og tørring inddampes til tørhed.

Man opnår forbindelsen 27.

Den således opnåede forbindelse opløses i methanol (20 ml), der tilsættes derpå 10 m 1 N natriumhydroxid, og man lader henstå en nat ved omgivel-30 sernes temperatur. Reaktionsblandingen passerer derpå gennem en kolonne (25 ml) af kunstharpiksen “Dowex 50” på f-Γ-formen, som forinden er blevet skyllet med methanol. · Reaktionsproduktet opnås ved opkoncentrering af eluatet. På denne måde opnås forbindelsen 28.

48 DK 174348 B1

Denne forbindelse opløses i ether og methyleres på klassisk måde ved hjælp af diazomethan. Man opnår efter inddampning forbindelsen 29 (1,08 g; 70,4%).

5 Optisk rotation: [a]20o = -27’, chloroform.

Den fundne elementæranalyse for forbindelsen 29 er korrekt. Strukturen deraf bekræftes yderligere ved IR- og NMR-spektre.

10 (3) Isomeriserinq af QH-qruppen i 5-stillinqen

Ti! en opløsning af trifluoreddikesyreanhydrid (0,8 ml) i dichlormethan (16 ml), der er kølet til -20°C, tilsættes dråbe for dråbe en opløsning af pyridin (0,8 ml) i dichlormethan (8 ml). Derpå tilsættes ved -10°C dråbe for dråbe 15 800 mg af forbindelsen 29 opløst i dichlormethan (8 ml). Efter en times forløb ved -50°C hældes reaktionsblandingen ud i en blanding af vand og is (8 ml) indeholdende 160 mg natriumhydrogencarbonat. Man omrører indtil adskillelsen af de to faser, den organiske og den vandige Den organiske fase vaskes med 3% HCI, med H2O, med mættet NaCI, den tørres og inddampes.

20 På denne måde opnås forbindelsen 30.

Sirupen genopløses i DMF (10 ml). Der tilsættes natriumtrifluoracetat (1,6 g) og opvarmes til 80°C i 3 timer. På denne måde opnås forbindelsen 31. Efter inddampning, genopløsning i dichlormethan, vask med vand og tørring gen-25 opløses inddampningsresten i methanol, hvorpå opløsningsmidlet afdampes efter en times forløb. Man opnår efter chromatografering over en kolonne i opløsningsmidlet etherhexan 2/1 forbindelsen 32 (450 mg; 56,2%).

Optisk rotation: [a]20D = -33°, chloroform.

30

Strukturen af forbindelsen 32 bekræftes af IR- og NMR-spektre. Den fundne eiementæranalyse er korrekt.

(4) Dannelsen af pyran-rinqen 49 DK 174348 B1

Denne syntese gennemføres ud fra forbindelsen 32. Man opløser forbindelsen 32 (200 mg) i en blanding af trifluoreddikesyre og vand i forholdet 9:1.

Efter 15 minutters forløb afdampes opløsningsmidlerne. Inddampningsresten 5 omkrystalliseres fra ethylacetat/hexan. På denne måde opnås 110 mg af forbindelsen 33.

Karakteristika for denne forbindelse er som følger: 10 IR-spektrum: i CHCh, y i cm*1: 3450 (OH), 3080. 3060, 3030 (CH2:benzyl) og 1740 (COOCH3).

NMR-spektrum: δ i ppm i forhold til TMS: 15 3,75 (s, 3H+, COOMe) 4,98 (1H*) 7,30 (s, 5H+, C6H5)

Optisk rotation: [a]20o = + 13*. methanol.

20

Elementæranalyse for C14H1807:

Beregnet: C 56,37 - H 6,08 Fundet: C 56,17 - H 5,85.

25 Smeltepunkt: 125-126°C.

EKSEMPEL 5 (Udgangsmateriale) 30

Syntese af derivatet 38 eller 3-0-benzvl-4-0-chloracetvl-1.2-0-tert-butoxyliden-a-L-methvI-idopyranuronat med formlen: 50 DK 174348 B1 /ÆoMe°\ \0Βη Λ MCAOV—/ x0 U-j·—Ot- but 5 CH3

Denne syntese (se fig. 7) gennemføres ud fra derivatet 33 med iduronsy-restrukturen, idet man (a) underkaster derivatet 33 en acetyleringsreaktion, 10 (β) underkaster blandingen af de således opnåede anomere acetater 34 og 35 indvirkning af et bromeringsmiddel til indførelse af et bromatom på det anomere carbonatom, 15 (y) danner en orthoester i stillingerne 1,2 samt (δ) gennemfører en monochloracetylering i 4-stillingen af orthoesteren (a) acetyleringsreaktion førende til 1,2,4-tri-0-acetyl-3-0-benzyl-a, β-l-20 methyl-idopyranuronater (derivaterne 34 og 35).

En opløsning af forbindelsen 33 {3 g) i en blanding af vandfrit pyridin (20 ml) og eddikesyreanhydrid (10 ml) omrøres ved 0°C uden tilstedeværelsen af fugtighed igennem 5 timer. Reaktionsblandingen inddampes ti! tørhed, md-25 dampes sammen med toluen (4 x 20 ml) samt tørres under vakuum. Ind-dampningsresten chromatograferes over en siliciumoxidgelkolonne (150 g).

Eluering med en blanding af toluen/ethylacetat (4/1, v/v) fører til i eluerings-rækkefølgen: 30 · en forfraktion bestående af furanderivater, • forbindelsen 34 (anomer a), sirup (170 mg, 4%), [a]D -43'; (c: a, chloroform), NMR (CDCI3)6: 6,23 (s, 1H, H-1), 51 DK 174348 B1 • forbindelsen 35 (anomer β), der udkrystaliiserer fra en blanding af ether og hexan (2,688 g, 63%), smeltepunkt: 112 - 113°C, [a]D = + 9* (c: 1, chloroform), NMR (CDCI3)6: 6,08 (d, 1 Η. H-1, J,.2: 1,5 Hz).

5 De anomere forbindelser α og β 34 henholdsvis 35 adskilles ikke, når man går videre med den beskrevne rækkefølge af synteser. Blandingen deraf anvendes direkte i form af en sirup til de efterfølgende reaktioner, (3) Bromerinqsreaktion førende til forbindelsen 36 eller 2, 4-di-Q-acetyl-3 -Q-10 benzyl-g-L-methvI-idopyranuronylbromid

Man opløser en blanding af acetaterne 34 og 35 (212 mg; 0,5 mM) i vandfrit dichlormethan (5 ml) og i vandfrit ethylacetat (0,5 ml). Der tilsættes på én gang titan-tetrabromid (250 mg, 0,7 mM), og reaktionsblandingen omrøres 24 15 timer ved omgivelsernes temperatur uden tilstedeværelse af fugtighed. Efter køling til 0°C og fortynding med dichlormethan vaskes den organiske fase med isvand (tre gange), den tørres (natriumsulfat), filtreres og inddampes til dannelse af derivatet 36 i form af en svagt farvet sirup (217 mg, 96%), NMR (CDCI3)5: 6,41 (s, 1H, H-1). Denne forbindelse, der er meget ustabil, anven-20 des umiddelbart i den efterfølgende reaktion.

(y) Fremstilling af orthoesteren eller 4-0-acetvl-3-0-benzvl-1. 2-O-tert-butoxyethvliden-B-L-methvl-ido-pvranuronat 25 En opløsning af bromidet 36 [der er frisk fremstillet ud fra 2,122 g, 5 mM, af blandingen af acetaterne 34 og 35 i vandfrit dichlormethan (20 ml)] omrøres ved omgivelsernes temperatur under en atmosfære af tør argon.. Der tilsættes successivt 7-collidin (2,65 ml, 20 mM) og vandfrit tert. butanol (3 ml; 30 mM), og reaktionsblandingen omrøres 15 timer under disse betingelser.

30 Efter fortynding med dichlormethan (50 ml) vaskes den organiske fase med en mættet vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, med vand, der tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes. Inddampningsresten chromatogra-feres over en siliciumoxidgelkolonne (120g). Eluering med en blanding af hexan/ethylacetat (2/1, v/v, indeholdende 0,5% triethylamin) fører til forbin- 52 DK 174348 B1 delsen 37 i form af en ren sirup (1,542 g, 70% ud fra 34 og 35). [a] = -23* (c: 1, chloroform), NMR (CDCI3)5: 5,48 (d, 1H, H-1, J,i2: 2,5 Hz).

(5) Monochloracetylerinq af orthoesteren 37 5

Man køler en opløsning af orthoesteren 37 (220 mg, 0,5 mM) i vandfri methanol (10 ml) til -20°C under omrøring og en tør argonatmosfære. Der tilsættes vandfrit kaliumcarbonat (40 mg), og reaktionsblandingen omrøres i 5 timer under disse betingelser. De faste stoffer afsuges, filtratet inddampes, 10 og inddampningsresten genopløses i chloroform (50 ml). Den organiske fase vaskes hurtigt med is-vand (3 gange), tørres (natriumsulfat), filtreres og inddampes. Inddampningsresten opløses umiddelbart i vandfrit pyridin (4 ml) og vandfrit dichlormethan (2 ml). Efter køling til -20°C under en tør argonatmosfære tilsættes dråbe for dråbe en opløsning af chloracetylchlorid (0,1 ml, 15 1,24 mM, frisk destilleret) i vandfrit dichlormethan (1 ml). Reaktionsblandin gen omrøres under disse betingelser i 30 minutter, hvorpå den hældes ud i en blanding af is og vand (100 ml). Efter omrøring i 15 minutter ekstraheres blandingen i chloroform (3 x 20 ml). De organiske faser vaskes med isvand, med en vandig 2% natriumhydrogencarbonat-opløsning, med vand, de tørres 20 (natriumsulfat), filtreres og inddampes. Inddampningsresten chromatografe-res hurtigt over en silicagelkolonne (12 g). Eluering med en blanding af he-xan/ethylacetat (5/2, v/v, indeholdende 0,2% triethylamin) fører til i eluerings-rækkefølgen: 25 · en umættet forbindelse 39 (15 mg, 8%), • orthoesteren 38 sirup (145 mg, 61% udfra 12), [a]D = +19° (c: 1, chloroform), NMR (CDCI3)6: 5,45 (d, 1 Η, H-1, Ji.2: 2,5 Hz), 30 5,24 (d af d, 1 Η, H-4, J3.<: 2,5 Hz, J4.5: 1.5 Hz), 4,00 (s, 2H; CI-CHg-COO-).

53 DK 174348 B1 EKSEMPEL 6 (Mellemprodukt med formlen VIII) 5 Syntese af disaccharidet 41 eller benzvl-6-Q-acetvl-3-0-benzyl-2-benzvioxvcarbonvlamino-2-desoxv-4-Q-(2-0-acetvl-3-0-benzyl-a-L-methvl-idopvranuronol)-a-D-glucopvranosid I—OAc OAc NHCOOBn 15 Først fremstilles analogt med trinnet (a) disaccharidet 40 ved kondensation af monosacchariderne 38 og 22, derpå fjerner man monochloracetylgruppen i ^-stillingen i trinnet β, hvilket fører til det ønskede disaccharid 41 (se fig. 8): 20 Trin a: Fremstilling af disaccharidet 40 eller benzvl- 6-0-acetvl-3-0-benzvl-2-benzvloxvcarbonvlamino-2-desoxv-4-0-(2-0-acetyl-3-0-benzvl-4-0-chlor-acetyl-a-L-methvI-idopvranuronvP-a-D-glucopvranosid

Man opvarmer en opløsning af orthoesteren 38 (284 mg, 0,6 mM) og alkoho-25 len 22 (214 mg, 0,4 mM) i vandfri chlorbenzen (12 ml) til 140°C under omrøring og en svag strøm af tør argon. Efter langsom afdestillation af 10 ml af opøsningsmidlet tilsættes dråbe for dråbe en opløsning af 2,6-dimethyl-pyridiniumperchlorat (0,006 mM, frisk fremstillet) i chlorbenzen (4 ml) i løbet af 30 minutter under samtidig afdestillation af opløsningsmidlet (4 ml). Reak-30 tionsblandingen omrøres 1 time med tilsætning af frisk opløsningsmiddel (10 ml) og samtidig afdestillation, således at reaktionsrumfanget forbliver konstant og lig med ca. 4 ml. Efter afkøling og fortynding med chloroform vaskes den organiske fase med en mættet natriumhydrogencarbonat-opløsning, med vand, der tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes. Inddamp- 54 DK 174348 B1 ningsresten chromatograferes over en silicagel-kolonne (40 g). Eluering med en blanding af hexan og ethylacetat (4/3, v/v) fører i elueringsrækkefølgén til: • produktet 22 (120 mg, 56%), 5 • disaccharidet 40, som udkrystalliseres af en blanding af ether og hexan (112 mg, 30%, smeltepunkt: 144 -145°C, [a]20D = +35‘ (c: 1, chloroform), NMR (CDCI3) i overensstemmelse med den forventede struktur.

10

Trin β: Fjernelse af monochloracetylqruppen

Man omrører i 30 minutter ved 100°C en blanding af disaccharidet 40 (56 mg, 0,06 mM) og thiourinstof (7 mg, 0,1 mM) i pyridin (2,5 ml) og absolut 15 ethanol (0,5 ml). Efter køling og inddampning til tørhed genopløses ind-dampningsresten i en blanding af vand og chloroform (1/1, v/v, 40 ml) . Den organiske fase vaskes med vand, tørres (natriumsulfat), filtreres og inddampes. Inddampnings-resten chromatograferes over en silicagelkolonne (2 g).

Eluering med en blanding af ethylacetat og hexan (2/1, v/v) fører til disaccha-20 ridet 41, som omkrystalliseres fra ether (46 mg, 30%), smeltepunkt: 146 -147°C, , [ajo = 44’ (c: 1, chloroform), NMR (CDCI3): i overensstemmelse med den forventede struktur.

EKSEMPEL 7 25 (Mellemprodukt med formlen XXIII)

Syntese af disaccharidet 43 med formlen: 30 55 DK 174348 B1 c0°«e QAc OAc

OBn N OAc ,NH

3 c=o 5 Man fremstiller tetrasaccharidet 43, idet man gennemfører: 00n • i trin (a) kondensationen af disacchariderne 20 og 41, hvis syntese er beskrevet henholdsvis i eksemplerne 2 og 6, og idet man underkaster under trin (b) det dannede tetrasaccharid 42 en selektiv -ΟΙ 0 demonochloracetylering i 4-stillingen (se fig. 9, jf. også krav 21): la) Kondensations-reaktionen

Man omrører i en halv time ved omgivelsernes temperatur under en tørar-15 gonatmosfære en blanding af 65 mg (80 μΜ) af bromidet 20, der er frisk fremstillet, 51 mg (60 μΜ) af forbindelsen 141 og 80 ml 4 Å molekylarsigte på pulverform i 1,5 ml vandfrit dichlorethan, hvorpå der køles til -20*C. Derpå tilsættes successivt 20 ml (150 μΜ) symcollidin og 31 mg (120 μΜ) sølvtriflat. Reaktionsblandingen holdes 1 time under omrøring ved -20*C, hvorpå man 20 lader temperaturen stige til omgivelsernes temperatur i løbet af 15 minutter.

Efter fortynding med 50 ml dichlormethan afsuges de faste bestanddele, og filtratet vaskes med en 1 M hydrogenchlorid-opløsning i isvand, derpå med vand (2 gange). Der tørres derpå over natriumsulfat, filtreres og inddampes.

25 Inddampningsresten chromatograferes over en silicagelkolonne (8 g, gel 230-400 mesh). Eluering med en blanding af hexan og ethylacetat (4/3, v/v) fører til indvinding af 37 mg af tetrasaccharidet 42 (udbytte 39% i form af et farveløst glas. [a]2^ = + 56° (c = 0,6; CHC13); NMR-spektret bekræfter den forventede struktur.

30

Ved eluering af kolonnen med blandingen ethylacetat-hexan (2/1, v/v) opnås 23 mg af udgangsproduktet 41 (udbytte 44%).

fb) O-dechloracetvIerinqs-reaktionen 56 DK 174348 B1

Man opvarmer en opløsning af 36 mg (23 μΜ) af tetrasaccharidet 42 i'1,25 ml af en blanding af pyridin og 0,25 ml absolut ethanol til 100°C i nærvær af 7 g (100 μΜ) thiourinstof igennem 20 minutter. Efter afkøling og inddampning 5 til tørhed genopløses den faste inddampningsrest i 20 ml vand og ekstrahe-res med chloroform (5x5 ml), De organiske faser vaskes med en 10% vandig natriumhydrogen-sulfatopløsning, med vand, de tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes. Inddampningsresten chromatograferes over en silica-gelkolonne (3 g). Ved eluering med en blanding af ethylacetat og hexan (3/2; 10 v/v) opnår man 27 g af derivatet 43 (udbytte 80%) i form af et farveløst glas.

[α]20ο = -6Γ (c = 0,8; chloroform); NMR-spektret bekræfter den forventede struktur (se fig, 31).

EKSEMPEL 8 15 (Mellemprodukt med formlen XXIV)

Syntese af pentasaccharidet 45 med formlen.

20 rOSO;«,+ COOMi .-OSO'/Wi'*· pOSo/M,-*-

A A/» A A„ A

A?1*' /Λ?8" / Α°Ά°\?Βη / Atln A

'-------{ I .....I I · "I

25 n3 oli" N} oso;w,* KHCOe6

Man gennemfører en kondensations-reaktion mellem tetrasaccharidet 43 og monosaccharidet 44, hvilket fører til pentasaccharidet 45.

30

Man omrører i en halv time ved omgivelsernes temperatur og under en tør argonatmosfære en blanding af 27 mg (54 μΜ) af bromidet 48, der er fremstillet ifølge B. PAULSEN og W. STENZEL, Chem. Ber.. 111 (1978) 2334-2347, 26 mg (18 μΜ) af tetrasaccharidet 43 og 50 mg molekylarsigte 4 Å i 57 DK 174348 B1 pulverform i 0,8 ml dichlorethan, hvorpå der køles til -20eC. 16 ml (120 μΜ) sym-collidin og 26 mg (100 μΜ) sølvtriflat tilsættes successivt, og reaktions-blandingen underkastes omrøring i 18 timer, idet man langsomt lader temperaturen stige til omgivelsernes temperatur.

5

Efter fortynding med 50 ml dichiormethan frasuges de faste bestanddele, og filtratet vaskes med en 1 M hydrogenchlorid-opløsning i isvand og derpå med vand (2 gange). Derpå tørres over natriumsulfat, der filtreres og inddampes.

10 Inddampningsresten chromatograferes over en silicagel-kolonne (5 g, gel 230-400 mesh.). Man opnår ved eluering med en blanding af hexan og ethy-lacetat (4/3, v/v) 30 g af pentasaccharidet 45 i form af et farveløst glas (udbytte 90%). [a]20o = + 67° (c: 1, chloroform). NMR-spektret bekræfter den forventede struktur. Man finder især for de anomere protoner i glucosamin-15 enhederne forskydninger (δ, TMS) på henholdsvis 5,36 og 5,52 ppm for protonerne tilhørende H, F og D.

EKSEMPEL 9 20 (Slutprodukt med formlen XXIV)

Fremstilling af pentasaccharidet 50 (se fig. 10 og 11)

Man anvender her følgende trin: 25 (a) Fjernelse af acetylgrupper - (pentasaccharidet 46) (b) sulfatering af de således frigjorte OH-grupper (pentasaccharidet 47) 30 (c) Hydrogenering til frigørelse af OH-grupper beskyttet af benzylgrupper og til omdannelse af N3-gruppen til NH2-gruppen (pentasaccharidet 48) (d) Sulfatering af NH2grupperne (pentasaccharidet 49), påfølgende forsæb- 58 DK 174348 B1 ning af grupperne -COOMe i 6-stillingen (pentasaccharidet 50).

Disse trin gennemføres på følgende måde: 5 (a) Fjernelse af acetvlqrupperne fra derivatet 45

Man køler under omrøring til 0°C en opløsning af 28 mg af pentasaccaridet 45 i en blanding af 2,5 ml 1,2-dimethoxyethan og 0,8 ml methanol. Derpå tilsættes dråbe for dråbe i løbet af 10 minutter 1 ml af en 1 M opløsning af 10 natriumhydroxid. Reaktionsblandingen underkastes omrøring i 1 time ved 0°C, og derpå i 12 timer ved omgivelsernes temperatur Man tilsætter efter afkøling til 0°C 3 ml 1 M saltsyreopløsning, og den mælkeagtige blanding ekstraheres umiddelbart derefter med chloroform (5x5 ml). De organiske faser vaskes med vand, tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes, 15 Inddampningsresten genopløses i 2 ml methanol og behandles med en opløsning af diazomethan i ether (i overskud indtil blivende gul farvning) igennem en halv time.

Efter inddampning til tørhed chromatograferes inddampningsresten over en 20 silicagel-kolonne (2 g, gel 230-400 mesh). Man opnår ved eluering med en blanding af dichlormethan og methanol (15/1, v/v) 18 mg af pentasaccharidet 46 (udbytte: 72%) i form af et farveløst glas. [a]20D - +57* (c = 1; chloroform).

Den forventede struktur bekræftes af NMR-spektret.

25 (b) Sulfaterinq af OH-qrupperne

Man sætter til en opløsning af forbindelsen 46 (22 mg) i dimethylformamid (0,5 mf) komplexet trimethylamm/S03 (22 mg, 2,5 ækvivalenter/OH), Reakti-30 onsblandingen opvarmes til 50°C i ca. 14 timer. Derpå tilsættes på ny komplexet trimethylamin/S03 (10 mg), og reaktionen får lov til at udvikle sig i 24 timer. Derpå tilsættes til reaktions-blandingen methanol (0,5 ml) og chloroform (0,5 ml). Opløsningen indføres på toppen af en kolonne af “Sephadex.

LH2o", som er bragt i ligevægt med en blanding CHCI3/CH3OH (1/1, v/v). De 59 DK 174348 B1 fraktioner, som indeholder det sulfaterede reaktionsprodukt, samles, og opløsningsmidlet afdampes. På denne måde opnås et glas (30 mg). Dette glas chromatograferes derpå over silicagel (10 g) i et opløsningsmiddel bestående af tre dele af en blanding ethylenacetat/pyridin/eddikesyre/vand (6/2/0,6/1, 5 v/v/v/v) og to dele af en blanding ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand (5/5/1 /3, v/v/v/v).

De fraktioner, som indeholder det ønskede reaktionsprodukt, opsamles og koncentreres. Den således opnåede inddampningsrest opløses efter af-10 dampning af opløsningsmidlerne i methanol tilsat vand, hvorpå den ledes gennem en kolonne af "Dowex 50 W x 4, Na+", som er bragt i ligevægt med en blanding af methanol/vand (50/50, v/v). På denne måde opnår man natriumsaltet (forbindelse 47).

15 (c) Hydrooenerina

Det ovenfor opnåede reaktionsprodukt opløses i methanol (3,7 ml), hvortil er sat vand (0,3 ml). Man tilsætter til denne opløsning katalysatoren (Pd/C, 5%, 40 mg) og omrører igennem 5 døgn under en hydrogenatmostære. Efter fjer-20 nelse af katalysatoren ved filtrering viser UV-spektralanalyse af den således opnåede opløsning den totale forsvinding af den absorption, som skyldes benzylgrupperne. Derpå afdampes opløsningsmidlet, hvorved man opnår en inddampningsrest, der er forbindelsen 48.

25 fdi Sulfaterino af NH?-qrupperne og påfølgende forsæbning af carboxylqrup-perne

Forbindelsen 48 opløses i vand (4 ml). Derpå reguleres pH til 9,5, hvorpå man tilsætter til opløsningen komplexet trimethylamin/S03 (54 mg). pH hol-30 des på 9,5 under hele reaktionens varighed ved tilsætning af 0,1 N natriumhydroxid.

Efter en nats forløb fortsættes med yderligere tilsætning af sulfateringsmidlet (27 mg). Efter 24 timers forløb tilsættes en sidste portion.

60 DK 174348 B1

Efter 48 timers forløb tilsættes natriumhydroxid (3 M, 34 ml) til den dannede forbindelsen 49, hvorpå opløsningen omrøres i 3 timer ved omgivelsernes temperatur, således at man hydrolyserer methylestrene i komponenterne af 5 uronsyretypen. Reaktionsblandingen neutraliseres derpå og opkoncentreres til et volumen på ca. 2 ml, Den således opnåede opløsning sættes til en kolonne med “Sephadex 25" (100 ml), der elueres med vand. De opsamlede fraktioner analyseres ved UV-absorption (206 nm) samt ved polarometri (265 nm). De fraktioner, der er optisk aktive, opsamles, opløsningsmidlet fjernes, 10 og inddampningsresten opløses i ca. 2 ml vand og frysetørres.

På denne måde opnår man derivatet 50 i form af et hvidt pulver (5,6 mg, 25% i forhold til udgangsforbindelsen 45).

15 NMR-undersøgelse bekræfter den forventede struktur. Man finder især for de anomere protoner i glucosarnin-enhederne forskydninger (δ, TMS) på henholdsvis 5,36, 5,45 og 5,52 ppm for de protoner, som hører til H, F og D.

EKSEMPEL 10 20 (Mellemprodukt med formlen I)

Syntese af disaccharidet 92 med formlen 25 COOMe fr X1·-^

BnO i I

OB π N, 30 3

Der henvises til fig. 19.

Udgangsforbindelsen 91 (1 g) i opløsning i dichlormethan (50 ml) omrøres i nærvær af drierite (6 g) og frisk f remstillet sølvcarbonat (4,5 g) i 1 time under 61 DK 174348 B1 en argonatmosfære. Derpå tilsættes halogenidet 90 (2,8 g) opløst i dichlor-methan (10 ml). Efter 1,5 timers forløb tilsættes på ny 2,8 g af halogenidet 90, Efter en nats forløb fjernes de faste bestanddele ved filtrering, og den efter afdampning af opløsningsmidlerne opnåede inddampningsrest renses 5 over en silicakolonne med opløsningsmidlet ethyl acetat/chloroform (1/30; v/v).

På denne måde opnås produktet 92 (866 mg; udbytte 42%). Det omkrystalli-seres fra en blanding af hexan og ethylacetat. Smeltepunkt: 104 - 106"C; 10 [a]20o = 0* (c = 1; chloroform).

Elementæranalyse og NMR-spektret er i overensstemmelse med den ønskede struktur.

15 EKSEMPEL 11 (Mellemprodukt med formlen I)

Syntese af derivatet 94 med formlen 20

C OOM c _O

BnO I I

oc I ' ZO Oftn N3

Der henvises til figurerne 19 og 20.

Derivatet 92 (1,5 g) opløses i en blanding af chloroform og methanol (1/1; 30 v/v). Derpå tilsættes 2 ml natriummethanolat (2 M i methanol). Efter 20 minut ters forløb neutraliseres opløsningen ved tilsætning af harpiksen “Dowex 50", hvilket fører til derivatet 93, som ikke isoleres. Efter filtrering og inddampning kan man ved en klassisk methylering med diazomethan i ether reesterificere den eventuelt frigjorte carboxylsyrefraktion. Efter inddampning behandles 62 DK 174348 B1 inddampningsresten med en blanding af pyridin (20 ml) og eddikesyrean-hydrid (2 ml) natten over. Efter inddampning omkrystalliseres inddampningsresten fra ethylacetat og hexan, hvilket fører til produktet 94 (1,125 g; udbytte 81,6%).

5

Smeltepunkt: 103 -105’C; [α]20ο = β 5,2 (c — 1; chloroform).

Elementæranalyse og NMR-spektret er i overensstemmelse med den eftersøgte struktur.

10

Man kan som en variant fremstille derivatet 94 ved at gå frem som ovenfor beskrevet, idet man dog anvender derivatet 95 i stedet for derivatet 91.

EKSEMPEL 12 15 (Mellemprodukt med formlen I)

Syntese af derivatet nr. 97 (se fiq. 20) 20 Man gennemfører i et første trin en åbning af anhydrobroen, hvorpå man i et følgende trin gennemfører en bromerings-reaktion.

1: Åbning af 1,6-anhydrobroen 25 Forbindelsen 94 (1 g) opløses i eddikesyreanhydnd (10 ml), hvorpå der køles til -20°C under en argonatmosfære. Til den kolde opløsning sættes koncentreret svovlsyre (100 pi). Efter 30 minutters forløb fortyndes reaktionsblandingen med chloroform (150 ml), hvorpå den hældes ud over en vandig natriumhydrogencarbonatopløsning (26,5 g, 400 ml). Efter afslutningen af 30 gasafgivelsen vaskes chlorofomnfasen to gange med mættet NaCI-opløsning, hvorpå den tørres og opkoncentreres. Efter chromatografi over siliciumoxid (50 mg) i en blanding af ethylacetat og chloroform (1/20, v/v) opnår man forbindelsen 96 (995 mg; udbytte 86,7%).

63 DK 174348 B1

Denne forbindelse foreligger i form af et hvidt skum.

Spektrum og elementæranalyse bekræfter, at man har opnået den ønskede 5 struktur.

2: Bromerinq

En opløsning af derivatet 96 (0,2 g) i dichlormethan/ethylacetat (9/1; v/v, 4 10 ml) sættes til titantetrabromid (213 mg). Efter en nats forløb under omrøring efterfulgt af fortynding med dichlormethan udhældes over en isvandblanding (50 ml), hvorpå man vasker to gange med 50 ml isvand. Efter tørring og ind-dampning chromatograferes den opnåede sirup over siliciumoxid i opløsningsmidlet ethylacetat/chloroform (1/20; v/v). På denne måde opnås deriva-15 tet 97 med et udbytte på 25 - 50%.

NMR-spektrum: (ppm, CDC13) 2,04 2,11 (1 singlet af 3 protoner 2-Oac) 20 3,7 (1 singlet af 3 protoner COOMe) 6,33 (1 dublet af 1 proton Hi, Ji,2 = 3,5 Hz) 25

Claims (22)

1. Pentasaccharider med formlen; 5 r'0ip co0^ ρΟίρ hi i 0? CXp Ni, 10 hvor M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl; Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetyl,benzoyl, aryl, benzyl, hydrogen og sulfat, idet Sp og P ikke kan være benzoyl samtidig, Ni, Nj, og N3 er uafhængigt valgt blandt NH2l -NH-COO-benzyl, -NH-COO-15 acetyl, -NH-SO3' og -NH-acetyl; T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, eller p-methoxybenzoyl; og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, og benzyl; eller -OR er halogen, f.eks. Br, eller imidoyl; 20 og deres salte, hvor M er et alkali-metal.

2. Pentasaccharider ifølge krav 1; hvor M er hydrogen, eller alkyl, f.eks. methyl, Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetyl, hydrogen og 25 sulfat; Ni, N2 og N3 er uafhængigt valgt blandt -NH-COO-benzyl, -NH-SO3' og -NH-acetyl; T er hydrogen, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, p-methoxybenzoyl, og 30. er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, benzyl; eller -OR er halogen, f.eks. Br eller imidoyl; og deres salte hvor M er et alkali-metal. DK 174348 B1

3. Pentasaccharider ifølge krav 1, hvor M er alkyl, Ni, N2 og N3 er valgt uafhængigt blandt NH2 og -NH-COO-benzyl, T er hydrogen eller benzyl, 5. er hydrogen eller benzyl, Sp er acetyl, hydrogen eller sulfat, og R er benzyl.

4. Pentasaccharider med formlen: 10 fasv cocr ros<>y j-osos- <xm 1 15 nhso; °p nhso3- oso; nhso; hvor P er valgt blandt acetyl, benzoyl, aryl, benzyl, hydrogen og sulfat, -NHS03‘ kan erstattes med -NH-acetyl, og 20 -OH kan erstattes med alkoxy, f.eks. methoxy.

5 Rt er benzyl eller acetyl, R er benzyl, eller Ri og R tilsammen danner den divalente radikal -CH2-O-.

5 N, og N2 uafhængigt valgt blandt -NH-COO-benzyl, -NH-COO-acetyl , NH2 eller -NH-SO3, og T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracety! eller trichloracetyl, eller p-methoxybenzoyl, og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, og benzyl; eller 10 OR er halogen, f.eks. Br, eller imidoyl, og deres salte, hvori M er et alkali-metal.

5. Pentasaccharider ifølge krav 4, hvor P er hydrogen, og NHSO3· kan erstattes med -NH-acetyl. 25

6. Tetrasaccharider med formlen: coot^1 pOsp p o~v Of o5p ^2_ DK 174348 B1 hvor M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl, Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetyl,benzoyl, aryl, benzyl, hydrogen og sulfat, idet Sp og P ikke kan være benzoyl samtidig,

7. Tetrasaccharid ifølge krav 6, hvor M er alkyl;

8. Mellemprodukter i form af pentasaccharider med formlen: m--, COONi .. 0;p ni Γ ? I ^ i P N i °? N1_ Οί? N y hvor M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl;

30 Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetylbenzoyl, aryl, benzyl, hydrogen og sulfat, idet Sp og P ikke kan være benzoyl samtidig; DK 174348 B1 Ni, N2, og N3 er uafhængigt valgt blandt NH2, -NH-COO-benzyl, azido, -NH-COO-acetyl, -NH-SO3' og -NH-acetyl; idet mindst én af grupperne N, N2 og/ eller N3 er azido, T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, eller p-5 methoxybenzoyl; og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, og benzyl; eller -OR er halogen, f.eks. Br, eller imidoyl; og deres salte, hvor M er et alkali-metal.

9. Mellemprodukter ifølge krav 8, hvor M er alkyl, Ni, N2 og N3 er valgt uafhængigt blandt NHh, azido og -NH-COO-benzyl, idet mindst én af grupperne Ni, N2, og/eller N3 er azido, T er hydrogen eller benzyl, 15. er hydrogen eller benzyl, Sp er acetyl, hydrogen eller sulfat, og R er benzyl.

10 BnO \J_/ Br N3 (44)

10 Ni og N2 uafhængigt valgt blandt NH2 -NH-COO-benzyl, azido, -NH-COO-acetyl, -NH-acetyl, NH2 eller -NH-SO3, idet mindst én af grupperne Ni og/eller N2 er azido og T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, eller p-methoxybenzoyl, og 15. er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks methyl, og benzyl; eller OR er halogen, f.eks. Br, eller imidoyl, og deres salte, hvori M er et alkali-metal.

10. Mellemprodukter ifølge krav 8, hvor 20 M er hydrogen, eller alkyl, f.eks. methyl; Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetyl, hydrogen og sulfat; Ni, N2 og N3 er valgt uafhængigt blandt -NH-COO-benzyl, azido, -NH-SO3" og -NH-acetyl, idet mindst én af grupperne N, N2, og/eller N3 er azido, 25. er hydrogen, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, p-methoxybenzoyl, og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, benzyl; eller -OR er halogen, f.eks. Br eller imidoyl; og deres salte hvor M er et alkali-metal. 30

11. Mellemprodukter i form af tetrasaccharider med formlen: DK 174348 B1 COO^ r-CKp pOsv y'o/ ^ /c 00\o / 'VoQ- (χχ 111} y^/°T^/ J\T_/ Op \JA Os p 5 hvor M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl, Sp og P er identiske eller forskellige og er valgt blandt acetylbenzoyl, aryl. benzyl, hydrogen og sulfat, idet Sp og P ikke kan være benzoyl samtidig,

12. Mellemprodukt ifølge krav 11, hvor 20 M er alkyl; Ni og N2 er valgt uafhængigt blandt azido, -NH-CO-O-benzyl, -NH-acetyl og NH2, idet mindst én af grupperne N, og/eller N2 er azido, Sp er acetyl, hydrogen eller sulfat, P er benzyl eller hydrogen, 25. er hydrogen, monochloracetyl eller benzyl

13. Mellemprodukter i form af disaccharider med formlen; COOH _OR,

30 I—o \-o /°n? /or, 0R (I) T0\i—J N— OR, N DK 174348 B1 hvor M er hydrogen eller alkyl, f.eks. methyl, 5. er valgt blandt -NH-COO-benzyl, azido, -NH-COO-acetyl, -NH-SO3' og -NH-acetyl, T er hydrogen, benzyl, acetyl, monochloracetyl eller trichloracetyl, eller p-methoxybenzoyl; og R er valgt blandt acetyl, alkyl, f.eks. methyl, og benzyl, eller 10 OR er halogen, f.eks. 8r, eller imidoyl, Ri er acetyl, benzyl, hydrogen eller sulfat, eller R og Rt tilsammen danner det divalente radikal -CH2-O-, og deres salte hvor M er et alkali-metal.

14. Mellemprodukter ifølge krav 13. hvor M er Na+ eller alkyl, T er monochloracetyl, hydrogen, benzyl eller acetyl, R er alkyl, eller -OR er brom, Ri er acetyl, benzyl, hydrogen eller sulfat, eller 20 R og Ri tilsammen danner det divalente radikal -CH2-O-. N er azido eller acetylamino.

15. Mellemprodukter i form af disaccharider med formlen: 25 .— 0 /v I <VIn’ o/μ n 30 hvor T, Ri, Μ, N og R er defineret som i krav 13. DK 174348 B1

15 Ni og N2 er valgt uafhængigt blandt -NH-COO-benzyl, -NH-COO-acetyl og NH2, Sp er acetyl, hydrogen eller sulfat, P er benzyl eller hydrogen, T er hydrogen, monochloracetyl eller benzyl 20

16. Mellemprodukter ifølge krav 15, hvor M er alkyl eller hydrogen, N er -NH-COO-benzyl eller azido, T er hydrogen, monochloracetyl eller benzyl,

17. Fremgangsmåde til fremstilling af et pentasaccharid med form-10 len XXXII ifølge krav 4 eller 6, hvori P er hydogen, hvilken fremgangsmåde omfatter at en forbindelse med formlen XXIV ifølge krav 1, hvor Sp er acetyl, P er benzyl, Ni og N2 er azido, N3 er -NH-CO-O-benzyl, M er alkyl, og T er benzyl, gøres ti! genstand forfølgende reaktioner: 15. fjernelse af de O-acyl-blokerende grupper, b. sulfatering af de frigjorte OH-grupper ved anvendelse af et tnmethylamin/S03-kompleks som sulfaterings-middel, c. frigørelse af de OH-grupper, der er beskyttet af benzylgrup-per, og omdannelse af de nitrogenholdige grupper til funkti- 20 onsdygtige aminogrupper ved katalytisk hydrogenering, og d. sulfatering af frie OH-grupper og af funktionsdygtige aminogrupper ved anvendelse af et trimethylamin/S03-kompleks som sulfaterings-middel.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, hvor sulfateringen udføres i et opløsningsmiddel, f.eks. dimethylformamid, ved en temperatur, der er højere end stuetemperatur og i nærheden af 50 "C.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 17 eller krav 18, hvor den katalyti-30 ske hydrogenering udføres under hydrogen-tryk i nærvær af en katalysator af Pd/D-typen i et organisk opløsningsmiddel. DK 174348 B1

20. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 17-19, kendetegnet ved, at den anvendte forbindelse med formlen XXIV, er fremstillet ved omsætning af en forbindelse med formlen XXIII ifølge krav 6, hvor Sp er acetyl, P er benzyl, T er Η, M er alkyl, Ni er azido, og N2 er -NHCOO-5 benzyl med et monosaccharid med formlen: r" O Ac· A f\OBn /

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at den anvendte forbindelse med formlen XXIII, er fremstillet ved en kondense-15 ringsreaktion mellem følgende disaccharider: COOM* -OAC j—O- MCAO -i N-f 3t HO ^-f I ODn i,,. *3 r0 (20) (41) Οβη 25 hvor MCA betegner monochloracetyl og efterfølgende -0-dechloracetylering.

22. Fremgangsmåde Ifølge krav 20, kendetegnet ved, at den anvend-30 te forbindelse med formlen XXIII, er fremstillet ved en kondenseringsreaktion mellem følgende disaccharider: DK 174348 B1 COOMe __^-Oftc r—— OAc && + 08(1 M3 OAc NH C = 0 <f) B π (97) (41)