ES2629855T3 - Nuevo anticuerpo anti-c-Met - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional divalente del mismo, que puede inhibir la dimerización de c- Met, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID nº: 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID nº: 5, 6 y 7, estando dicho anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo caracterizado además por que comprende asimismo una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 22, 23, 24, 26, 28, 59 a 63 y 65 a 71.

Description

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DESCRIPCION

Nuevo anticuerpo anti-c-Met.

La presente invencion se refiere a un nuevo anticuerpo divalente que puede unirse especfficamente al receptor c- Met humano y/o que puede inhibir especfficamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor, asf como tambien las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos que codifican dicho anticuerpo. Mas particularmente, el anticuerpo segun la invencion puede inhibir la dimerizacion de c-Met. La invencion asimismo comprende el uso de dicho anticuerpo como un medicamento para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de canceres o de cualquier patologfa relacionada con la sobreexpresion de dicho receptor asf como tambien en procesos o kits para el diagnostico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresion de c-Met. La invencion comprende finalmente productos y/o unas composiciones que comprenden ese tipo de anticuerpo en combinacion con otros anticuerpos y/o compuestos qufmicos dirigidos contra otros factores de crecimiento involucrados en la progresion de tumores o metastasis y/o compuestos y/o agentes anticancerfgenos o agentes conjugados con toxinas y su utilizacion para la prevencion y/o el tratamiento de ciertos canceres.

Los agentes dirigidos hacia la tirosina cinasa receptora (RTK) tales como los inhibidores de trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, imatinib y gefitinib han ilustrado el interes de emplear esta clase de protefna para el tratamiento de canceres seleccionados.

La c-Met es el miembro prototfpico de una subfamilia de RTKs la cual tambien incluye RON y SEA. La familia de RTK de c-Met es estructuralmente diferente de otras familias de RTK y es el unico receptor de alta afinidad conocido para el factor del crecimiento de hapatocitos (HGF), tambien denominado factor de dispersion (SF, scatter factor) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. c-Met y HGF son ampliamente expresados en una variedad de tejidos y su expresion esta normalmente restringida a celulas de origen epitelial y mesenquimal respectivamente [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Son ambos requeridos para el desarrollo normal de los mamfferos y han demostrado ser particularmente importantes en la migracion celular, diferenciacion morfogenica, y organizacion de las estructuras tubulares tridimensionales asf como tambien el crecimiento y la angiogenesis [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. Si bien la regulacion controlada de c-Met y HGF ha demostrado ser importante en el desarrollo de mamfferos, mantenimiento y reparacion de los tejidos [Nagayama T., Nagayama M., Kohara S., Kamiguchi H., Shibuya M., Katoh Y., Itoh J., Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2):155-66; Tahara Y., Ido A., Yamamoto S., Miyata Y., Uto H., Hori T., Hayashi K., Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1):146-51], su desregulacion esta implicada en la progresion de canceres.

La senalizacion aberrante impulsada por la activacion inapropiada de c-Met es una de las alteraciones mas frecuentes observada en los canceres humanos y juega un rol fundamental en la tumorigenesis y en la metastasis [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino y Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300].

La activacion inapropiada de c-Met puede surgir mediante mecanismos dependientes e independientes del ligando, los cuales incluyen la sobreexpresion de c-Met, y/o la activacion paracrina o autocrina, o a traves del aumento de la mutacion funcional [J.G. Christensen, Burrows J. y Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]. Sin embargo, una oligomerizacion del receptor c-Met, en presencia o en ausencia del ligando, es requerida para regular la afinidad de union y la cinetica de union de la cinasa hacia ATP y los sustratos peptfdicos que contienen tirosina [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 17 de agosto, 43:10570-8]. c-Met activado recluta efectores de la senalizacion a su sitio “multidocking” ubicado en el dominio citoplasmatico, dando como resultado la activacion de diversas rutas de senalizacion claves, incluyendo Ras-MAPK, PI3K, Src y Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1 ):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Estas rutas son esenciales para la proliferacion, invasion y angiogenesis de celulas tumorales y para evadir la apoptosis [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude Gf, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H., Neel BG, Trends Cell Biol. Mar 2003, 13(3):122-30; Fan S., Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q., Cao Y., Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 27 de abril 2000, 19(18):2212-23]. Por anadidura, una faceta unica de la senalizacion de c-Met relacionada con otro RTK es su interaccion reportada con complejos de adhesion focal y companeros de la union no cinasa tales como las integrinas a6p4 [Trusolino L., Bertotti A., Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R., Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M., Prevo R., Smit L., David G., Hartmann G., Gherardi E., Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274(10):6499-506], Plexina B1 o semaforinas [Giordano S., Corso S., Conrotto P., Artigiani S., Gilestro G., Barberis D., Tamagnone L., Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P., Valdembri D., Corso S., Serini G., Tamagnone L., Comoglio PM, Bussolino F., Giordano S., Blood. 2005, 105(11 ):4321 -9; Conrotto P., Corso S., Gamberini S., Comoglio PM, Giordano S., Oncogene. 2004, 23:5131-7] los cuales pueden sumar adicionalmente a la complejidad de regulacion de la funcion celular por este receptor. Finalmente, datos recientes demuestran que c-Met podrfa estar involucrado en la resistencia tumoral a gefitinib o erlotinib lo cual sugiere que la combinacion del direccionamiento de compuestos hacia EGFR y c-Met podrfa ser de interes significativo [Engelman JA et al., Science, 2007, 316:1039-43].

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En los ultimos pocos anos, se han desarrollado muchas estrategias diferentes para atenuar la senalizacion de c- Met en lmeas celulares cancerfgenas. Estas estrategias incluyen i) neutralizar anticuerpos contra c-Met o HGF/SF [Cao B., Su Y., Oskarsson M., Zhao P., Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T., Schmidt NO, Eckerich C., Fillbrandt R., Merchant M., Schwall R., Westphal M., Lamszus K., Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] o el uso de NK4 antagonista de HGF/SF para evitar la union del ligando a c-Met [Kuba K., Matsumoto K., Date K., Shimura H., Tanaka M., Nakamura T., Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) inhibidores del sitio de union a ATP pequeno a c-Met que bloquean la actividad de cinasas [Christensen JG, Schreck R., Burrows J., Kuruganti P., Chan E, Le P., Chen J., Wang X., Ruslim L., Blake R., Lipson KE, Ramphal J., Do S., Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) polipeptido de dominio SH2 genomanipulado que interfiere con el acceso al sitio “multidocking” y RNAi o ribozima que reducen la expresion del receptor o del ligando. La mayorfa de estos metodos exhiben una inhibicion selectiva de c-Met dando como resultado la inhibicion tumoral y mostrando que c-Met podrfa ser interesante para la intervencion terapeutica en el cancer.

Entre las moleculas generadas para el direccionamiento hacia c-Met, algunas son anticuerpos. El mas extensamente descrito es el anticuerpo anti-c-Met 5D5 generado por Genentech [WO 96/38557] el cual se comporta como un potente agonista cuando es agregado solo en diversos modelos y como un antagonista cuando se utiliza como un fragmento Fab. Una forma genomanipulada monovalente de este anticuerpo descrito como un 5D5 armado (OA5D5) y producida como una protema recombinante en E. Coli es tambien el objeto de una solicitud de patente [documento WO 2006/015371] por Genentech. Sin embargo, esta molecula que no podrfa ser considerada como un anticuerpo debido a su estructura en particular, exhibe tambien mutaciones que podnan ser inmunogenas en seres humanos. En terminos de actividad, esta molecula no glicosilada esta desprovista de funciones efectoras y finalmente, no hay datos claros que demuestran que OA5D5 inhibe la dimerizacion de c-Met. Adicionalmente, cuando se ensaya en el modelo in vivo de G55, una lmea de celulas de glioblastoma que expresa c-Met pero no ARNm de HGF y protema y que crece independientemente del ligando, el anti-c-Met armado no tuvo efecto significativo alguno sobre el crecimiento tumoral de G55 lo cual sugiere que OA5D5 actua principalmente bloqueando la union de HGF y no es capaz de dirigirse hacia tumores activados independientemente de HGF [Martens T. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152].

Otro anticuerpo que se dirige hacia c-Met es descrito por Pfizer como un anticuerpo que actua “predominantemente como antagonista de c-Met, y en algunos casos como un agonista de c-Met” [documento WO 2005/016382]. No hay datos descritos en esta solicitud que muestren efecto alguno de los anticuerpos de Pfizer sobre la dimerizacion de c-Met.

Se puede mencionar el documento de patente WO 2007/126799 A2 (Novartis, ) que divulga unos anticuerpos humanos de c-Met antagonistas en el formato IgG1 e IgG4.

Finalmente, se puede mencionar el documento de patente WO 2009/007427 A2 (Pierre Fabre Medicament, 15-12009) que divulga unos anticuerpos de c-Met murinos divalentes que presentan una actividad c-Met antagonista.

Uno de los aspectos innovadores de la presente invencion consiste en generar un anticuerpo monoclonal quimerico y/o humanizado sin actividad agonista intrmseca e inhibir la dimerizacion de c-Met. Mas particularmente, un aspecto innovador de la presente invencion consiste en generar un anticuerpo monoclonal quimerico y/o humanizado con actividad antagonista e inhibir la dimerizacion de c-Met.

Ademas de dirigirse contra tumores dependientes de ligando, este metodo tambien disminuira las activaciones independientes del ligando de c-Met debido a su sobreexpresion o mutaciones de los dominios intracelulares los cuales permanecieron dependientes de la oligomerizacion para la senalizacion. Otro aspecto de la actividad de este anticuerpo podrfa ser un impedimento esterico para la interaccion de c-Met con sus socios que dara como resultado un menoscabo de las funciones de c-Met. Este anticuerpo es humanizado y genomanipulado con preferencia, aunque sin limitarse a, como IgG1 humana para obtener funciones efectoras tales como ADCC y CDC ademas de funciones vinculadas con el bloqueo espedfico del receptor c-Met.

Sorprendentemente, por primera vez, los inventores han podido generar un anticuerpo antagonista monoclonal quimerico y/o humanizado capaz de unirse a c-Met pero tambien capaz de inhibir la dimerizacion de c-Met, siendo dicho anticuerpo monoclonal divalente en oposicion a los anticuerpos antagonistas existentes dirigidos contra c-Met. Si es cierto que, en la tecnica anterior, algunas veces se sugiere que un anticuerpo capaz de inhibir la dimerizacion de c-Met con sus socios podrfa ser un anticuerpo interesante, nunca se ha descrito, o claramente sugerido, un anticuerpo capaz de hacerlo. Por anadidura, en cuanto a la especificidad del anticuerpo, no fue evidente para nada el tener exito en la generacion de ese tipo de anticuerpo divalente activo.

Segun lo explicado anteriormente, la inhibicion de la dimerizacion de c-Met es un aspecto capital de la invencion ya que ese tipo de anticuerpos presentaran un real interes para una poblacion mas grande de pacientes. No solo el cancer de c-Met activado dependiente del ligando, como resulto ser el caso hasta la presente invencion, sino ademas el cancer de c-Met activado independiente del ligando pudo tratarse con los anticuerpos generados

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mediante el proceso de la presente invencion.

Los anticuerpos fueron evaluados mediante analisis BRET sobre celulas que expresan tanto c-Met-RLuc/c-Met- YFP y se seleccionaron por su capacidad de inhibir por lo menos 40%, con preferencia 45%, 50%, 55% y con maxima preferencia 60% de la senal de BRET.

La tecnologfa BRET es conocida como siendo representativa de la dimerizacion proteica [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].

La tecnologfa BRET es bien conocida por el experto en la materia y sera detallada en los siguientes ejemplos. Mas particularmente, BRET (Transferencia de Energfa por Resonancia de Bioluminiscencia) es un transferencia de energfa no radiactiva que ocurre entre un donante bioluminiscente (Renilla Luciferasa (Rluc) y un aceptor fluorescente, un mutante de GFP (Protefna Fluorescente Verde) o YFP (Protefna fluorescente amarilla). En el presente caso, se utilizo EYFP ( (Protefna Fluorescente Amarilla Potenciada). La eficacia de la transferencia depende de la orientacion y la distancia entre el donante y el aceptor. Luego, la transferencia de energfa puede ocurrir solamente si las dos moleculas estan en cercana proximidad (1-10 nm). Esta propiedad se utiliza para generar ensayos de interaccion protefna- protefna. De hecho, con el fin de estudiar la interaccion entre dos socios, el primero es geneticamente fusionado a la Renilla Luciferasa y el segundo al mutante amarillo de la GFP. Las protefnas de fusion son generalmente, aunque no obligatoriamente, expresadas en celulas de mamffero. En presencia de su sustrato permeable a la membrana (coelenterazina), Rluc emite luz azul. Si el mutante de GFP esta mas cerca que 10 nm de la Rluc, puede producirse una transferencia energetica y puede detectarse una senal amarilla adicional. La senal de BRET se mide como la relacion entre la luz emitida por el aceptor y la luz emitida por el donante. De modo que la senal de BRET aumentara a medida que las dos protefnas de fusion se llevan a proximidad o si un cambio conformacional trae a Rluc y el mutante de GFP mas cerca.

Si el analisis de BRET consiste en una forma de realizacion preferida, cualquier metodo conocido por el experto en la materia puede utilizarse para medir la dimerizacion de c-Met. Sin limitacion, pueden mencionarse las siguientes tecnologfas: FRET (Transferencia de Energfa por Resonancia de Fluorescencia), HTRF (Fluorescencia Homogenea resuelta en el Tiempo), FLIM (Microscopfa por Imagenes de Tiempo de Vida de Fluorescencia) o SW-FCCS (espectroscopia de correlacion cruzada de fluorescencia de longitud de onda unica).

Otras tecnologfas clasicas tambien podrfan utilizarse, tales como Coinmunoprecipitacion, Alpha screen, Entrecruzamiento qufmico, Doble Hfbrido, Cromatograffa de Afinidad, ELISA o transferencia Far western.

Los terminos “anticuerpo”, “anticuerpos” o “inmunoglobulina” se utilizan de manera indistinta en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecfficos (por ejemplo, anticuerpos biespecfficos siempre y cuando exhiban la actividad biologica deseada).

Mas particularmente, dicha molecula consiste en una glucoprotefna que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada esta compuesta por una region variable de cadena pesada (o dominio) (abreviado en la presente invencion HCVR o VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada esta compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta por una region variable de cadena ligera (abreviado en esta invencion como LCVR o VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera esta compuesta por un dominio, CL. Las regiones de VH y VL puede estar adicionalmente subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinates de complementariedad (CDR), mezcladas con regiones que son mas conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL esta compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el termino amino hasta el termino carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden intervenir en la union de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huespedes, incluyendo diversas celulas del sistema inmune (por ejemplo celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complementos clasico.

Las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas pueden estar divididas en tres regiones funcionales: la region Fd, la region bisagra, y la region Fc (cristalizable por fragmento). La region Fd comprende los dominios VH y CHl y, en combinacion con la cadena ligera, forma Fab - el fragmento de union al antfgeno. El fragmento Fc es responsable de las funciones efectoras de inmunoglobulinas, lo cual incluye, por ejemplo, la fijacion al complemento y la union a los receptores de Fc cognados de las celulas efectoras. La region bisagra, encontrada en las clases de inmunoglobulinas IgG, IgA, y IgD, actua como un espaciador flexible que permite que la porcion de Fab se mueva libremente en el espacio con relacion a la region Fc. Los dominios bisagra son estructuralmente diversos, variando en la secuencia como en la longitud entre las clases y subclases de inmunoglobulinas.

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De acuerdo con estudios cristalograficos, la region bisagra de inmunoglobulina puede estar adicionalmente subdividida estructural y funcionalmente en tres regiones: la bisagra superior, el nucleo y la bisagra inferior (Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992). La bisagra superior incluye aminoacidos desde el extremo carboxilo de CHl hasta el primer residuo en la bisagra que restringe el movimiento, en general el primer residuo cistefna que forma un enlace disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas. La longitud de la region bisagra superior se correlaciona con la flexibilidad segmental del anticuerpo. La region bisagra nucleo contiene los puentes disulfuro entre las cadenas pesadas. La region bisagra inferior une el extremo terminal amino de, e incluye los residuos en el dominio CH2. La region bisagra nucleo de IgG1 humana contiene la secuencia Cys- Pro-Pro-Cys que, cuando se dimeriza mediante la formulacion de un enlace disulfuro, da como resultado un octapeptido cfclico que se cree que actua como un pivote, confiriendo de ese modo flexibilidad. Los cambios conformacionales permitidos por la estructura y flexibilidad de la secuencia polipeptfdica de la region bisagra de la inmunoglobulina pueden afectar las funciones efectoras de la porcion Fc del anticuerpo.

El termino “anticuerpo monoclonal” se utiliza de acuerdo con su significado comun para denotar un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por las posibles mutaciones de presentacion natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Es decir, un anticuerpo monoclonal consiste en un anticuerpo homogeneo que es el resultado de la proliferacion de un unico clon de celulas (por ejemplo, celulas de hibridoma, celulas hospedadoras eucarioticas transfectadas con ADN que codifica el anticuerpo homogeneo, celulas hospedadoras procarioticas transformadas con ADN que codifica el anticuerpo homogeneo, etc.), y el cual es generalmente caracterizado por cadenas pesadas de una unica clase y subclase, y cadenas ligeras de un solo tipo. Los anticuerpos monoclonales son altamente especfficos, siendo dirigidos contra un unico antfgeno. Adicionalmente, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que tfpicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinates, o epftopo, cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un unico determinante en el antfgeno.

En la presente descripcion, los terminos polipeptidos, secuencias de polipeptidos, secuencias de aminoacidos, peptidos y protefnas unidos a compuestos de anticuerpo o a su secuencia son intercambiables.

Es divulgado un anticuerpo monoclonal, o a un fragmento o derivado del mismo funcional divalente, capaz de inhibir la dimerizacion de c-Met y que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR- H3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 1, 2 y 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de la alineacion optima con secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 5, 6 y 7 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de la alineacion optima con las secuencias SEC ID n° 5, 6 o 7, estando dicho anticuerpo adicionalmente caracterizado por que tambien comprende una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 56.

Es divulgado asimismo un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, segun lo descrito anteriormente caracterizado por que comprende asimismo una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 57.

Es asimismo divulgado un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, capaz de inhibir la dimerizacion de c-Met y que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 1,2 y 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de la alineacion optima con las secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 5, 6 y 7 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de la alineacion optima con las secuencias SEC ID n° 5, 6 o 7, estando dicho anticuerpo adicionalmente caracterizado por que tambien comprende una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 57.

Es asimismo divulgado un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, segun lo descrito anteriormente caracterizado por que tambien comprende una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 21.

La invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal, o su fragmento funcional divalente, capaz de inhibir la dimerizacion de c-Met, comprendiendo dichos anticuerpo y fragmento divalente del mismo una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 1, 2 y 3 y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 5, 6 y 7, estando dichos anticuerpo o fragmento divalente del mismo adicionalmente caracterizados por que tambien comprenden una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 22, 23, 24, 26, 28, 59 a 63 y 65 a 71.

Como resulta evidente para el experto en la materia, las secuencias de consenso SEC ID n° 57 y 21 estan comprendidas en la secuencia de consenso SEC ID n° 56.

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Tabla 1

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B) SEC ID NO 56

X1 X2 X3 C X5 X6 X7

C) SEC ID NO 57

X1 X2 X3 C X5 X6 X7

D) SEC ID NO 21

X1 X2 X3 C X5 - C

Tabla 1

#08 #09 #10 #11 #12 #13 #14

E) SEC ID NO 56

X8 X9 C X11 X12 C X14

F) SEC ID NO 57

X8 X9 C P P C P

G) SEC ID NO 21

X8 X9 C X11 X12 C X14

Para SEC ID n° 56:

X1: P, R, C, - X5: D, C, G, - X8: H, V, K, - X12: P, -

X2: K, C, R, - X6: K, C, - X9: T, C, E, P, - X14: P, T

X3: S, C, D, - X7: T, C, - X11: P, I

La expresion “fragmentos y derivados funcionales” sera definida en detalle a continuacion en la presente

memoria.

Por regiones CDR o CDR(s), se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas segun lo definido por IMGT.

La numeracion unica de IMGT ha sido definida para comparar los dominios variables cualquiera sea el receptor del antfgeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeracion unica de IMGT, los aminoacidos conservados siempre tienen la misma posicion, por ejemplo cistefna 23 (1er-CYS), triptofano 41 (TRP-CONSERVADO), aminoacido hidrofobo 89, cistefna 104 (2da-CYS), fenilalanina o triptofano 118 (J-PHE o J-TRP). La numeracion unica de IMGT proporciona una delimitacion estandarizada de las regiones estructurales (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinates de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Como los espacios vacfos representan posiciones no ocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ej. [8.8.13]) resultan una informacion crucial. La numeracion unica de IMGT se utiliza en representaciones graficas en 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en las estructuras en 3D en IMGT/estructura 3D-Db [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Existen tres CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El termino CDR o CDR se utiliza en esta invencion con el fin de indicar, de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones las cuales contienen la mayorfa de los residuos de aminoacidos responsables de la union por afinidad del anticuerpo para el antfgeno o el epftopo el cual reconoce.

Por “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos en el sentido de la presente invencion, tiene el proposito de indicar un porcentaje de nucleotidos o de residuos aminoacidos identicos entre las dos secuencias que se van a comparar, obtenidas despues de la mejor alineacion (alineacion optima), siendo este porcentaje puramente estadfstico y las diferentes entre las dos secuencias son distribuidas al azar y por toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos se llevan a cabo, tradicionalmente, comparando estas secuencias despues de haberlas alineado en forma optima, siendo dicha comparacion capaz se ser llevada a cabo por segmento o por “ventana de comparacion”. La alineacion optima de las secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo, ademas de manualmente, por medio del algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homologfa local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], por medio del metodo de investigacion de similitudes de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), por medio de programas informaticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informatico Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wi, o sino mediante programa informatico de comparacion BLAST N o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas en forma optima y en las cuales la secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos a ser comparadas pueden comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para

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una alineacion optima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando la cantidad de posiciones identicas para las cuales el nucleotido o el residuo aminoacido es identico entre las dos secuencias, dividiendo este numero de posiciones identicas por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparacion y multiplicando el resultado obtenido por 100 con el fin de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Por ejemplo, es posible utilizar el programa BLAST, “secuencias BLAST 2” (Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en el sitio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, siendo los parametros utilizados aquellos proporcionados por error (en particular para los parametros “open gap penalty”: 5, y “extension gap penalty”: 2; siendo la matriz seleccionada, por ejemplo, la matriz “BLOSUM 62” propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que se van a comparar es calculado directamente por el programa.

Por secuencia de aminoacidos que tiene por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoacidos de referencia, aquellas que tienen, con respecto a la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una delecion, adicion o sustitucion de por lo menos un aminoacido, una truncacion o una elongacion son preferidas. En el caso de una sustitucion de uno o mas aminoacidos consecutivos o no consecutivos, las sustituciones son preferidas en las cuales los aminoacidos sustituidos son reemplazados por aminoacidos “equivalentes”. La expresion “aminoacidos equivalentes” tiene el proposito de indicar cualquier aminoacido capaz de ser sustituido con uno de los aminoacidos de la estructura de base sin, sin embargo, modificar esencialmente las actividades biologicas de los anticuerpos correspondientes y como seran definidos mas adelante, especialmente en los ejemplos. Estos aminoacidos equivalentes pueden ser determinados ya sea basandose en su homologfa estructural con los aminoacidos que los mismos reemplazan, o en los resultados de ensayos comparativos de actividad biologica entre los diferentes anticuerpos capaces de llevarse a cabo.

A tftulo de ejemplo, se mencionan las posibilidades de sustitucion que pueden ser llevadas a cabo sin dar como resultado una modificacion profunda de la actividad biologica del anticuerpo modificado correspondiente.

Como ejemplo no limitativo, la siguiente tabla 2 proporciona posibilidades de sustitucion concebibles con una conservacion de la actividad biologica del anticuerpo modificado. Las sustituciones inversas tambien son, naturalmente, posibles en las mismas condiciones.

Tabla 2

Residuo original

Sustitucion(es)

Ala (A)

Val, Gly, Pro

Arg (R)

Lys, His

Asn(N)

Gln

Asp(D)

Glu

Cys(C)

Ser

Gln (Q)

Asn

Glu (G)

Asp

Gly (G)

Ala

His (H)

Arg

Ile (I)

Leu

Leu (L)

Ile, Val, Met

Lys (K)

Arg

Met (M)

Leu

Phe (F)

Tyr

Pro (P)

Ala

Ser(S)

Thr, Cys

Thr (T)

Ser

Trp (W)

Tyr

Tyr (Y)

Phe, Trp

Val (V)

Leu, Ala

Debe apreciarse que la invencion no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, no estan en su medio ambiente natural pero que han sido capaces de ser aislados u obtenidos por purificacion de fuentes naturales, o han sido obtenidos mediante recombinacion genetica, o mediante sfntesis qufmica, y pueden entonces contener aminoacidos no naturales como sera descrito a continuacion.

Tambien debe apreciarse, segun lo mencionado anteriormente, que la invencion se refiere, mas particularmente, a un anticuerpo divalente quimerico y/o humanizado, o cualquier fragmento o derivado funcional divalente, con una actividad antagonista. Los anticuerpos divalentes de la tecnica anterior son agonistas o agonistas parciales.

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El anticuerpo monoclonal divulgado, incluyendo una bisagra modificada segun lo descrito anteriormente, es decir, incluyendo una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 56, 57 o 21, es nuevo y presenta la particularidad de tener una actividad antagonista mejorada en comparacion con el anticuerpo quimerico o humanizado 224G11 sin ese tipo de bisagra modificada como sera evidente de los ejemplos siguientes.

Contrariamente a la tecnica anterior, los inventores han obtenido una actividad antagonista mejorada sin modificar el formato del anticuerpo. De hecho, en la tecnica previa mas cercana representada por el anticuerpo 5D5, ha sido necesario desarrollar un fragmento monovalente del anticuerpo para generar una actividad antagonista. En la presente solicitud, mediante el uso de la bisagra de la invencion, es posible, por primera vez, obtener un anticuerpo divalente completo con mayor actividad antagonista, y esto se opone al conocimiento general.

En una forma de realizacion preferida, el anticuerpo de la invencion comprende una region bisagra que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo formado por SEC ID n° 24, 26, 28, 59 a 63 y 65 a 71.

Para mas claridad, las siguientes tablas 3 y 4 reagrupan a los aminoacidos y secuencias nucleotfdicas de las diferentes bisagras preferidas de la invencion.

Tabla 3

SEC ID n°

Aminoacidos SEC ID n° Nucleotidos

22

RKCCVECPPCP 29 AGGAAGTGCT GT GT GGAGT GCCCCCCCT GCCCA

23

PRDCGCKPCICT 30 CCCCGGGACT GTGGGTGCAAGCCTT GCATTT GTACC

24

PKSCGCKPCICT 31 CCCAAGAGCT GT GGGTGCAAGCCTT GCATTT GT ACC

25

PKSCGCKPCICP 32 CCAAAGAGCT GCGGCTGCAAGCCTT GT AT CT GTCCC

26

PRDCGCKPCPPCP 33 CCACGGGACT GT GGCTGCAAGCCCT GCCCT CCGT GT CCA

27

PRDCGCHTCPPCP 34 CCCAGAGACT GT GGGTGTCACACCT GCCCT CCTT GT CCT

28

PKSCDCHCPPCP 35 CCCAAAAGCT GCGATT GCCACTGTCCT CCAT GT CCA

Tabla 4

SEC ID n°

Aminoacidos SEC ID n° Nucleotidos

58

CKSCDKTHTCPPCP 73 T GCAAGAGCT GCGACAAGACCCACACCT GT CCCCCCTGCCCT

59

PCSCDKTHTCPPCP 74 CCCT GCAGCT GCGACAAGACCCACACCT GT CCCCCCTGCCCT

60

PKCCDKTHTCPPCP 75 C C CAAGTGCT GC GACAAGACC CACACCTGTCCCCCCTGCCCT

61

PKSCCKTHTCPPCP 76 CCTAAGAGCTGTTGCAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT

62

PKSCDCTHTCPPCP 77 CCCAAGAGCTGCGACTGCACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT

63

PKSCDKCHTCPPCP 78 CCCAAGAGCT GCGACAAGT GCCACACCT GT CCCCCCTGCCCT

64

PKSCDKTHCCPPCP 79 CCCAAGAGCT GCGACAAGACCCACT GCT GT CCCCCCTGCCCT

65

KCDKTHTCPPCP 80 AAGT GCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCT GCCCT

66

PKSCDCHTCPPCP 81 CCCAAGAGCT GCGACTGCCACACCT GTCCCCCCT GCCCT

67

PKSCDCTHCPPCP 82 CCCAAGAGCT GCGACTGCACCCACT GCCCCCCCT GCCCT

68

PCSCKHTCPPCP 83 CCCT GCAGCT GCAAGCACACCTGTCCCCCCT GCCCT

69

PSCCTHTCPPCP 84 CCTAGCTGCTGCACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT

70

PSCDKHCCPPCP 85 CCCAGCTGCGACAAGCACTGCTGCCCCCCCTGCCCT

71

PKSCTCPPCP 86 CCCAAGAGCT GCACCTGTCCCCCTT GT CCT

72

PKSCDKCVECPPCP 87 C C CAAGAGCT GC GAT AAGT GC GT GGAGT GC CCCCCTTGTCCT

De acuerdo con un primer enfoque, el anticuerpo sera definido por su secuencia de cadena pesada. Mas particularmente, es divulgado que el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, es caracterizado por que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR seleccionada entre las CDR que comprenden las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 1 a 3.

Las secuencias mencionadas son las siguientes:

SEC ID n° 1: GYIFTAYT

SEC ID n° 2: IKPNNGLA

SEC ID n° 3: ARSEITTEFDY

Segun un aspecto preferido es divulgado que el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente dos, y todavfa mas preferentemente tres, CDR(s) seleccionadas entre CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde:

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- CDR-H1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 1,

- CDR-H2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 2,

- CDR-H3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 3.

En un segundo enfoque, el anticuerpo sera a continuacion definido por su secuencia de cadena ligera.

Es divulgado que el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, es caracterizado por que comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una CDR seleccionada entre CDR que comprenden la secuencia de aminoacidos sEc ID n° 5 a 7.

Las secuencias mencionadas son las siguientes:

SEC ID n° 5: ESVDSYANSF

SEC ID n° 6: RAS

SEC ID n° 7: QQSKEDPLT

Es divulgado que el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, que comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente dos, y todavfa mas preferentemente tres, CDR(s) seleccionadas entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde:

- CDR-L1 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 5,

- CDR-L2 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 6,

- CDR-L3 comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 7.

El hibridoma murino capaz de secretar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invencion, especialmente hibridoma de origen murino, fue depositado en el CNCM (Institut Pasteur, Paris, Francia) el 14/03/2007 bajo el numero CNCM I-3731.

En la presente solicitud, se prefiere que IgG1 obtengan funciones efectoras, y todavfa mas preferentemente, ADCC y CDC.

El experto en la materia reconocera que las funciones efectoras incluyen, por ejemplo, union de Clq; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); union al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependientes del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; y regulacion descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo el receptor de celulas B; BCR).

Los anticuerpos segun la presente invencion son preferentemente anticuerpos monoclonales especfficos, especialmente de origen murino, quimerico o humanizado, los cuales pueden ser obtenidos de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos por el experto en la materia.

En general, para la preparacion de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos o derivados funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a tecnicas que son descritas en particular en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la tecnica de preparacion a partir de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los anticuerpos monoclonales segun la invencion pueden obtenerse, por ejemplo, de una celula animal inmunizada con el c-Met, o uno de sus fragmentos que contiene el epitopo especificamente reconocido por dichos anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invencion. Dicho c-Met, o uno de sus fragmentos, puede especialmente ser producido de acuerdo con los metodos de elaboracion usuales, mediante recombinacion genetica comenzando con una secuencia de acidos nucleicos contenida en la secuencia de ADNc que codifica al c-Met o por sfntesis peptidica comenzando a partir de una secuencia de aminoacidos comprendida en la secuencia peptidica del c-Met.

Los anticuerpos monoclonales segun la invencion pueden ser, por ejemplo, purificados en una columna de afinidad en la cual el c-Met o uno de sus fragmentos que contiene el epitopo especificamente reconocido por dichos anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invencion ha sido previamente inmovilizado. Mas particularmente, dichos anticuerpos monoclonales pueden ser purificados por cromatograffa en protefna A y/o G, seguido o no seguido por cromatograffa de intercambio ionico que apunta a eliminar los contaminantes proteicos residuales asf como tambien el ADN y el LPS, en si mismo seguido o no seguido por cromatograffa de exclusion en gel Sepharose™ con el fin de eliminar los potenciales agregados debido a la presencia de dfmeros o de otros multfmeros. En una forma aun mas preferida, la totalidad de estas tecnicas pueden utilizarse en forma simultanea o consecutiva.

El anticuerpo de la invencion, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste preferentemente en un anticuerpo quimerico.

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Por anticuerpo quimerico, se pretende indicar un anticuerpo el cual contiene una region variable natural (de cadena pesada y cadena ligera) derivada de un anticuerpo de una especie determinada en combinacion con las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heterologa a dicha especie determinada (por ejemplo, raton, caballo, conejo, perro, vaca, gallina, etc.).

Los anticuerpos o sus fragmentos del tipo quimerico segun la invencion pueden prepararse utilizando las tecnicas de recombinacion genetica. Por ejemplo, el anticuerpo quimerico puede ser producido clonando un ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica la region variable de un anticuerpo monoclonal, no humano, especialmente murino, y una secuencia que codifica la region constante de anticuerpo humano. Un anticuerpo quimerico de la invencion codificado por ese tipo de gen recombinante sera, por ejemplo, una quimera de raton- hombre, determinandose la especificidad de este anticuerpo por la region variable derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la region constante derivada del ADN humano. Para los metodos de preparacion de anticuerpos quimericos, es posible, por ejemplo, referirse a los documentos Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) o patente US n° 4.816.567.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional, comprende un dominio variable de cadena pesada quimerico de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 46.

SEC. ID. n° 46: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLGESLDWIGGIKPNNGLANYNQ KFKGKATLTVDKSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSEITTEFDYWGQGTALTVSS

Es divulgado que el anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo funcional, comprende un dominio variable de cadena ligera quimerico de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 47.

SEC ID n° 47: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIP ARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSKEDPLTFGSGTKLEMKR

Es divulgado que el anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11][IgG2quim], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 22.

En la presente solicitud, el uso de corchetes no es necesario y, como en el ejemplo, la referencia [224G11][IgG2quim] debe ser considerada como identica a 224G11IgG2chim. En un mismo modo, para indicar que el anticuerpo es un anticuerpo murino, la expresion murino o la letra n puede agregarse para indicar que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico, la expresion quim o la letra c puede agregarse y ; para indicar que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, puede agregarse la expresion, hz, Hz o la letra h. Como un ejemplo, el anticuerpo quimerico 224G1IgG2 puede ser denominado c224G11IgG2, c224G11[IgG2], c[224G11]IgG2, c[224G11 ][IgG2], 224G111gG2quim, 224G11 [IgG2quim], [224G11 ]IgG2quim o [224G11 ][IgG2quim].

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [TH7quim], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 28.

En la presente solicitud, la referencia TH7 debe ser considerada como identica a C7D6-9 o TH7C7D6-9. El sfmbolo D significa delecion.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [MHquim], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 23.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [MUP9Hquim], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 26.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [MMCHquim], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos

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SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 24.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [C1], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 58.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11 ] [C2], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 59.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [C3], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 60.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11 ] [C5], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 61.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11 ] [C6], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 62.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11 ] [C7], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 63.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11 ] [C9], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 64.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [D1-3], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 65.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [C7D6], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos sEc ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 66.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [C6D9], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos sEc ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 67.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [C2D5-7], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 68.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [C5D2-6], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 69.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [C9D2-7], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una

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region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 70.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [D5-6-7- 8], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 71.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [IgG1/IgG2], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 47, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 72.

El anticuerpo de la invencion, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste preferentemente en un anticuerpo humano.

El termino “anticuerpo humano” incluye a todos los anticuerpos que tienen una o mas regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una forma de realizacion preferida, todos los dominios variables y constantes (o regiones) son derivados de secuencia de inmunoglobulina humana (anticuerpo totalmente humano). En otras palabras, incluye cualquier anticuerpo que presenta regiones variables y constantes (en caso de estar presentes) derivado de secuencias de inmunoglobulina de lfnea germinal humana, es decir, que posee una secuencia de aminoacidos la cual corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que ha sido preparado utilizando cualquiera de las tecnicas para la preparacion de anticuerpos humanos conocidas por el experto en la materia.

En una forma de realizacion, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos mediante un hibridoma el cual incluye una celula B obtenida de un animal no humano transgenico, por ejemplo, un raton transgenico, que presenta un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera fusionados a una celula inmortalizada.

Como ejemplo para ese tipo de raton transgenico, puede mencionarse el XENOMOUSE™ el cual es una cepa de raton modificada por ingenierfa genetica que comprende fragmentos grandes de los sitios de inmunoglobulina humana y es deficiente en la produccion de anticuerpos de raton (Green at al., 1994, Nature Genetics, 7:13-21). El XENOMOUSE™ produce un repertorio humano del tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos especffico para el antfgeno. Una segunda generacion XENOMOUSE™ contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483-495).

Cualquier otra tecnica conocida por el experto en la materia, tal como la tecnica de exhibicion de fagos, tambien puede utilizarse para la generacion de anticuerpo humano de acuerdo con la invencion.

El anticuerpo de la invencion, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste preferentemente en un anticuerpo humanizado.

Mediante la expresion “anticuerpo humanizado”, se pretende indicar un anticuerpo el cual contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molecula del anticuerpo son derivadas de uno (o de varios) anticuerpos humanos. Asimismo, algunos de los residuos de los segmentos del esqueleto (denominado FR) pueden ser modificados con el fin de conservar la afinidad de la union (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

Los anticuerpos humanizados de acuerdo con la invencion o sus fragmentos pueden prepararse mediante tecnicas conocidas por el experto en la materia (tales como, por ejemplo, aquellas descritas en los documentos Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).

El experto en la materia conoce otros metodos de humanizacion como, por ejemplo, el metodo “CDR Grafting” (“Injerto de CDR”) descrito por Protein Design Lab (PDL) en las solicitudes de patente EP 0 451261, EP 0 682 040, EP 0 9127, EP 0 566 647 o las patentes US n° 5.530.101, US n° 6.180.370, US n° 5.585.089 y US n° 5.693.761. Tambien pueden mencionarse las siguientes solicitudes de patentes: US n° 5.639.641; US n° 6.054.297; US n° 5.886.152 y US n° 5.877.293.

Mas particularmente dicho anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional, comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4,

SEC. ID. n° 4: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLAN YAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSS

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y un dominio variable de cadena ligera humanizado seleccionado del grupo de secuencias que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 8, 9 o 10.

SEC. ID. n° 8: DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDR FSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR

SEC. ID. n° 9: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR

SEC. ID. n° 10: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGV PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR

Es divulgado que el anticuerpo o su fragmento o derivado funcional divalente, segun la invencion y denominado [224G11] [IgG2Hz1], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 8, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 22.

Es divulgado que el anticuerpo o su fragmento o derivado funcional divalente, segun la invencion y denominado [224G11] [IgG2Hz2], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 9, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 22.

Es divulgado que el anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, segun la invencion y denominado [224G11] [IgG2Hz3], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 10, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido o su fragmento funcional divalente, segun la invencion y denominado [224G11] [TH7Hz1], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 8, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 28.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido o su fragmento funcional divalente, segun la invencion y denominado [224G11] [TH7z2], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 9, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 28.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido o su fragmento funcional divalente, segun la invencion y denominado [224G11] [TH7Hz3], que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 10, y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 28.

En otro aspecto, los anticuerpos de la invencion pueden describirse por sus cadenas pesadas y ligeras totales, respectivamente.

Como ejemplo, se divulga que el anticuerpo [224G11] [IgG2quim] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 50, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 50, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Es divulgado que el anticuerpo [224G11] [TH7quim] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 51, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 51, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C1] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 88, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 88, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C2] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 89, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de

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alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 89, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C3] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 90, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 90, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C5] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 91, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 91, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C6] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 92, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 92, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C7] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 93, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 93, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C9] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 94, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 94, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [D1-3] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 95, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 95, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C7D6] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 96, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 96, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C6D9] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 97, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 97, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C2D5-7] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 98, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 98, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C5D2-6] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 99, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 99, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [C9D2-7] comprende una cadena pesada completa que comprende la

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secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 100, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [D5-6-7-8] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 101, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [IgG1/IgG2] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 102, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 102, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [IgG2Hz1] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 38, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 38.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [IgG2Hz2] de la invencion comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 39, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 39.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [IgG2Hz3] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 40, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 40.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11 ] [TH7Hz1 ] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 38, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 38.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11 ] [TH7Hz2] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 39, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 39.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11 ] [TH7Hz3] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 40, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad despues de alineacion optima con la secuencia SEC ID n° 40.

Otros ejemplos de anticuerpos, o sus derivados, comprenden cadenas pesadas completas que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo formado por SEC ID n° 88 a 102 (secuencias nucleotfdicas correspondientes son SEC ID n° 103 a 117).

Por “fragmento funcional” de un anticuerpo de acuerdo con la invencion, tiene el proposito de indicar en particular un fragmento de anticuerpo, tal como fragmentos Fv, scFv (sc por cadena simple), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento del cual el tiempo de vida media se habrfa incrementado mediante modificacion qufmica, tal como la adicion de poli(alquilen)glicol tal como poli(etilen)glicol (“PEGilacion”) (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) (“PEG” por Poli(Etilen) Glicol), o mediante la incorporacion en un liposoma, teniendo dichos fragmentos por lo menos una de las CDR caracterfsticas de secuencia SEC ID n° 1 a 3 y de 5 a 7 de acuerdo con la invencion, y, especialmente, en que es capaz de ejercer en forma general una actividad parcial uniforme del anticuerpo del cual desciende, tal como, en particular, la capacidad de reconocer y de unirse al c-Met, y, en caso necesario, inhibir la actividad del

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c-Met.

Preferentemente, dichos fragmentos funcionales estaran constituidos por o comprenderan una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual derivan, siendo dicha secuencia parcial suficiente para retener la misma especificidad de union que el anticuerpo del cual desciende y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, en un modo mas preferido hasta por lo menos 1/10, de la del anticuerpo del cual desciende, con respecto al c-Met. Ese tipo de fragmento funcional contendra por lo menos 5 aminoacidos, preferentemente 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 50 y 100 aminoacidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual desciende.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales seran fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, los cuales generalmente tienen la misma especificidad de union que el anticuerpo del cual descienden. En una forma de realizacion mas preferida de la invencion, estos fragmentos son seleccionados entre fragmentos divalentes tales como fragmentos F(ab')2. De acuerdo con la presente invencion, los fragmentos de anticuerpo de la invencion pueden obtenerse comenzando de anticuerpos tales como los descritos anteriormente mediante metodos tales como digestion por enzimas, tal como pepsina y/o papafna y/o por disociacion de los puentes disulfuro mediante reduccion qufmica. De otro modo, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente invencion pueden obtenerse mediante tecnicas de recombinacion genetica asimismo bien conocidas por el experto en la materia o de otro modo mediante sfntesis peptfdica por medio de, por ejemplo, sintetizadores peptfdicos automaticos tales como aquellos suministrados por la companfa Applied Biosystems, etc.

Por “fragmento divalente”, debe entenderse cualquier fragmento de anticuerpo que comprende dos brazos y, mas particularmente, fragmentos F(ab')2.

Por “derivados” de un anticuerpo segun la invencion, se hace referencia a una protefna de union que comprende una estructura proteica y por lo menos una de las CDR seleccionadas del anticuerpo original con el fin de mantener la capacidad de union. Dichos compuestos son bien conocidos por el experto en la materia y seran descritos con mayor detalle en la siguiente memoria.

Es divulgado que el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, esta caracterizado por que dicho derivado consiste en una protefna de union que comprende una estructura en la cual por lo menos una CDR ha sido injertada para la conservacion de las propiedades de reconocimiento paratopicas del anticuerpo original.

Una o varias secuencias a traves de las 6 secuencias de CDR descritas en la invencion pueden presentarse en una estructura proteica. En este caso, la estructura proteica reproduce el armazon proteico con pliegue apropiado de las CDR(s) injertada(s), permitiendole(s) mantener sus propiedades de reconocimiento paratopicas del antfgeno.

El experto en la materia sabe como seleccionar la estructura proteica sobre la cual por lo menos una CDR seleccionada del anticuerpo original podrfa ser injertada. Mas particularmente, es conocido que, para ser seleccionada, dicha estructura deberfa exhibir diversas caracterfsticas como sigue (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187):

- filogeneticamente buena conservacion,

- arquitectura robusta con una organizacion molecular tridimensional bien conocida (tal como, por ejemplo, cristalograffa o RMN),

- tamano pequeno,

- ningun grado o solamente bajo grado de modificaciones postraduccion,

- facil de producir, expresar y purificar.

Dicha estructura proteica puede ser, aunque sin limitarse a, una estructura seleccionada del grupo formado por fibronectina y preferentemente el decimo dominio del tipo III de fibronectina (FNfn10), lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), el derivado de protefna Z del dominio B de la protefna A estafilococcica, tioredoxina A o cualquier protefna con dominio repetido tal como “repeticion de anquirina” (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No.4, 1700-1705), “repeticion de armadillo”, “repeticion rica en leucina” o “repeticion de tetratricopeptido”.

Tambien puede mencionarse el derivado de estructura de toxinas (tales como, por ejemplo, toxinas de escorpion, insecto, planta o molusco) o inhibidores proteicos de la sintasa de oxido nftrico neuronal (PIN).

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Como un ejemplo no limitativo de dichas construcciones hfbridas, puede mencionarse la insercion de la CDR-H1 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-CD4, es decir, el anticuerpo 13B8.2, en uno de los lazos expuestos de la PIN. Las propiedades de union de la protefna de union obtenida siguen siendo similares al anticuerpo original (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). Tambien puede mencionarse el injerto de la CDR-H3 (cadena pesada) de un anticuerpo VHH anti-lisozima en un lazo de neocarzinostatina (Nicaise et al., 2004).

Segun lo mencionado anteriormente, dicha estructura proteica puede comprender entre 1 y 6 CDR(s) del anticuerpo original. En una forma de realizacion preferida, pero sin limitacion alguna, el experto en la materia seleccionarfa por lo menos una CDR de la cadena pesada, sabiendo que dicha cadena pesada esta particularmente implicada en la especificidad del anticuerpo. La seleccion de la(s) CDR(s) de interes sera evidente para el experto en la materia con metodo conocido (BES et al., FEBS letters 508, 2001,67-74).

Como una evidencia, estos ejemplos no son limitativos y cualquier otra estructura conocida o descrita debe estar incluida en la presente memoria descritiva.

Segun un nuevo aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico aislado, caracterizado por que se selecciona entre los siguientes acidos nucleicos:

a) un acido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la invencion;

b) una secuencia de acidos nucleicos que comprende las secuencias SEC ID n° 11, SEC ID n° 12, SEC ID n° 13 y las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 17;

c) una secuencia de acidos nucleicos que comprende las secuencias SEC ID n° 14 y SEC ID n° 18, 19 o 20;

d) los correspondientes acidos nucleicos de ARN de los acidos nucleicos de ADN segun lo definido en b) o c); y

e) los acidos nucleicos complementarios de los acidos nucleicos segun lo definido en a), b) y c); y

Segun todavfa otro aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico aislado, caracterizado por que se selecciona entre los siguientes acidos nucleicos:

- un acido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la presente invencion y donde la secuencia de acidos nucleicos que codifica para la region bisagra de dicho anticuerpo comprende o tiene una secuencia seleccionada entre el grupo formado por las secuencias SEC ID n° 29, 30, 31,33, 35, 74 a 78 y 80 a 86.

Por acido nucleico, nucleico o secuencia de acido nucleico, polinucleotido, oligonucleotido, secuencia de polinucleotidos, secuencia de nucleotidos, terminos que seran empleados en forma indistinta en la presente invencion, se pretende indicar una ligacion precisa de nucleotidos, los cuales estan modificados o sin modificar, permitiendo la definicion de un fragmento o una region de un acido nucleico, que contiene o no contiene nucleotidos no naturales, y pudiendo corresponder tambien con un ADN de doble hebra, un ADN de hebra simple como a los productos de transcripcion de dichos ADN.

Debe entenderse tambien en este punto que la presente invencion no se ocupa de las secuencias nucleotfdicas en su entorno cromosomico natural, es decir, en el estado natural. Se refiere a secuencias las cuales han sido aisladas y/o purificadas, es decir, han sido seleccionadas en forma directa o indirecta, por ejemplo por copia, habiendo sido su entorno por lo menos parcialmente modificado. Por lo tanto, asimismo se pretende indicar en este punto los acidos nucleicos aislados obtenidos por recombinacion genetica por medio de, por ejemplo, celulas hospedadoras u obtenidos por sfntesis qufmica.

Una hibridacion bajo condiciones de elevada severidad significa que las condiciones de temperatura y las condiciones de resistencia ionica se seleccionan de modo tal que permiten el mantenimiento de la hibridacion entre dos fragmentos de ADN complementario. A modo de ilustracion, las condiciones de elevada severidad de la etapa de hibridacion para los propositos de definir los fragmentos polinucleotfdicos antes descritos son ventajosamente las siguientes.

La hibridacion de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridacion a 42°C durante 3 horas en tampon de fosfato (20 mM, pH 7,5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solucion de NaCl 0.15 M + citrato sodico 0.015 M), 50% de formamida, 7% de dodecilsulfato sodico (SDS), 10 x Denhardt's, 5% de sulfato de dextrano y 1% de ADN de esperma de salmon; (2) hibridacion real durante 20 horas a una temperatura dependiente del tamano de la sonda (es decir,: 42°C , para un tamano de sonda > 100 nucleotidos) seguido por 2 lavados de 20 minutos a 20°C en 2 x SsC + 2% de SDS , 1 lavado de 20 minutos a 20°C en 0,1 x SSC + 0,1% de SDS. El ultimo lavado se lleva a cabo en 0,1 x SSC + 0,1% de SDS durante 30 minutos a 60°C para un tamano

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de sonda de > 100 nucleotidos. Las condiciones de hibridacion de elevada severidad antes descritas para un polinucleotido de tamano definido pueden adaptarse por el experto en la materia para oligonucleotidos de tamano mayor o menor, de acuerdo con las ensenanzas de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

La invencion se refiere asimismo a un vector que comprende un acido nucleico segun la presente invencion.

La invencion se refiere a vectores de clonacion y/o expresion que contienen una secuencia nucleotfdica segun la invencion.

Los vectores segun la invencion preferentemente contienen elementos los cuales permiten la expresion y/o la secrecion de las secuencias nucleotfdicas traducidas en unas celulas hospedadoras determinadas. Por lo tanto, el vector debe contener un promotor, senales de iniciacion y terminacion de la traduccion, asf como tambien regiones apropiadas de regulacion de la transcripcion. Debe poder mantenerse en forma estable en la celula hospedadora y puede opcionalmente tener senales particulares las cuales especifican la secrecion de la protefna traducida. Estos elementos diferentes son seleccionados y optimizados por el experto en la materia en funcion de la celula hospedadora utilizada. Con este fin, las secuencias nucleotfdicas de acuerdo con la invencion pueden insertarse en vectores de replicacion autonomos en el hospedador seleccionado, o pueden ser vectores integrativos del hospedador seleccionado.

Ese tipo de vectores son preparados mediante metodos actualmente utilizados por el experto en la materia, y los clones resultantes pueden ser introducidos en un hospedador apropiado mediante metodos convencionales, tales como lipofeccion, electroporacion, choque termico, o metodos qufmicos.

Los vectores segun la invencion son, por ejemplo, vectores de origen plasmfdico o viral. Son utiles para transformar celulas hospedadoras con el fin de clonar o expresar las secuencias nucleotfdicas de acuerdo con la invencion.

La invencion se refiere asimismo a unas celulas hospedadoras transformadas mediante o que comprenden un vector segun la invencion.

La celula hospedadora puede seleccionarse entre sistemas procarioticos o eucarioticos, por ejemplo, celulas bacterianas pero asimismo celulas de levadura o celulas animales, en particular celulas de mamffero. Es asimismo posible utilizar celulas de insecto o celulas vegetales.

La invencion se refiere asimismo a animales, excepto el hombre, que comprenden por lo menos una celula transformada de acuerdo con la invencion.

Segun otro aspecto, un objeto de la invencion es un proceso para la produccion de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales segun la invencion, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar en un medio y unas condiciones de cultivo apropiadas una celula hospedadora segun la invencion; y

b) recuperar dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, producidos de ese modo a partir del medio de cultivo o dichas celulas cultivadas.

Las celulas transformadas segun la invencion pueden utilizarse en procesos para la preparacion de polipeptidos recombinantes de acuerdo con la invencion. Los procesos para la preparacion de un polipeptido segun la invencion en forma recombinante, caracterizado por que emplean un vector y/o una celula transformada mediante un vector segun la invencion, estan comprendidos en la presente invencion. Preferentemente, una celula transformada por un vector segun la invencion se cultiva bajo condiciones que permiten la expresion de dicho polipeptido y se recupera dicho peptido recombinante.

Segun lo mencionado, la celula hospedadora puede seleccionarse entre sistemas procarioticos o eucarioticos. En particular, es posible identificar secuencias nucleotfdicas de acuerdo con la invencion, facilitando la secrecion en dicho sistema procariotico o eucariotico. Un vector de acuerdo con la invencion portador de ese tipo de secuencia puede, por lo tanto, utilizarse ventajosamente para la produccion de protefnas recombinantes, destinadas a ser secretadas. En efecto, la purificacion de estas protefnas recombinantes de interes sera facilitada por el hecho de que estan presentes en el sobrenadante del cultivo celular mas que en el interior de las celulas hospedadoras.

Es asimismo posible preparar los polipeptidos segun la invencion mediante sfntesis qufmica. Ese tipo de proceso de preparacion es asimismo un objeto de la invencion. El experto en la materia conoce los procesos de sfntesis qufmica, por ejemplo las tecnicas que emplean fases solidas [Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2da ed., (1984)] o tecnicas que utilizan fases solidas

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parciales, por condensacion de fragmentos o mediante una sfntesis clasica en solucion. Los polipeptidos obtenidos mediante sfntesis qufmica y que son capaces de contener aminoacidos no naturales correspondientes estan asimismo comprendidos en la invencion.

Los anticuerpos, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, pueden ser obtenidos mediante un procedimiento segun la invencion son comprendidos asimismo en la presente invencion.

La invencion se refiere asimismo a un anticuerpo de la invencion como un medicamento.

La invencion se refiere asimismo a una composicion farmaceutica que comprende a modo de principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales segun la invencion, preferentemente mezclado con un excipiente y/o un vehfculo aceptable para uso farmaceutico.

Otra forma de realizacion complementaria de la invencion consiste en una composicion tal como se describe con anterioridad la cual comprende, adicionalmente, como un producto de combinacion para el uso simultaneo, separado o consecutivo, un anticuerpo antitumoral.

Todavfa mas preferentemente, dicho segundo anticuerpo antitumoral podrfa seleccionarse entre los anticuerpos anti-IGF-IR, anti-EGFR, anti-HER2/neu, anti-VEGFR, anti-VEGF, etc.,o entre cualquiera de los otros anticuerpos antitumorales conocidos por el experto en la materia. Resulta evidente que el uso, como segundo anticuerpo, de fragmentos funcionales o derivados de los anticuerpos mencionados anteriormente forma parte de la invencion.

Como un anticuerpo mas preferido, los anticuerpos anti-EGFR se seleccionan tal como por ejemplo el anticuerpo C225 (Erbitux).

“Uso simultaneo” quiere decir la administracion de los dos compuestos de la composicion segun la invencion en una forma farmaceutica unica e identica.

“Uso por separado” se entiende que significa la administracion, al mismo tiempo, de los dos compuestos de la composicion segun la invencion en formas farmaceuticas distintas.

“Uso consecutivo” debe apreciarse que significa la administracion sucesiva de los dos compuestos de la composicion segun la invencion, cada uno en una forma farmaceutica distinta.

De manera general, la composicion segun la invencion aumenta considerablemente la eficacia del tratamiento del cancer. En otras palabras, el efecto terapeutico de los anticuerpos anti-c-Met segun la invencion de acuerdo con la invencion es potenciado en forma inesperada mediante la administracion de un agente citotoxico. Otra ventaja subsiguiente principal producida por una composicion segun la invencion se refiere a la posibilidad de utilizar dosis eficaces inferiores de principio activo, lo cual permite evitar los riesgos de aparicion de efectos secundarios o la reduccion de los mismos, en particular los efectos del agente citotoxico.

Ademas, esta composicion segun la invencion permitirfa el logro del efecto terapeutico esperado de manera mas rapida.

La composicion de la invencion tambien puede ser caracterizada por que comprende, adicionalmente, como un producto combinado para el uso simultaneo, separado o consecutivo, un agente citotoxico/citostatico.

Por “agentes terapeuticos anticancerfgenos” o “agentes citotoxicos/citostaticos”, se quiere decir una sustancia la cual, cuando se administra a un sujeto, trata o previene el desarrollo de cancer en el cuerpo del sujeto. Como un ejemplo no limitativo de ese tipo de agentes, puede mencionarse agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos antitumorales, inhibidores mitoticos, inhibidores de la funcion de cromatina, agentes antiangiogenesis, antiestrogenos, antiandrogenos o inmunomoduladores.

Dichos agentes son, por ejemplo, citados en la edicion 2001 de VIDAL, en la pagina dedicada a los compuestos vinculados con la columna de cancerologfa y hematologfa “Citotoxicos”, estos compuestos citotoxicos citados haciendo referencia a este documento son citados en la presente memoria como agentes citotoxicos preferidos.

Mas particularmente, los agentes siguientes son preferidos segun la invencion.

“Agente alquilante” se refiere a cualquier sustancia la cual puede entrecruzar o alquilar cualquier molecula, con preferencia, acido nucleico (por ejemplo, ADN), dentro de una celula. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostaza de nitrogeno tal como mecloretamina, clorambucol, melfalen, cloridrato, pipobromen, prednimustina, fosfato disodico o estramustina; oxazoforinas tales como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida o ifosfamida; aziridinas o imina-etilenos tales como tiotepa, trietilenamina o altetramina; nitrosourea tales como carmustina, estreptozocina, fotemustina o lomustina; alquilen-sulfonatos tales como busulfan, treosulfan o improsulfan; triacenos tales como dacarbazina; o complejos de platino tales como

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cis-platino, oxaliplatino y carboplatino.

“Anti-metabolitos” se refieren a sustancias que bloquean el crecimiento y/o el metabolismo celular interfiriendo con ciertas actividades, generalmente con la sfntesis del ADN. Los ejemplos de anti-metabolitos incluyen metotrexato, 5-fluoruracilo, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, arabinosido de citosina, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina y pentostatina.

“Antibioticos antitumorales” se refieren a compuestos los cuales pueden evitar o inhibir la sfntesis del ADN, ARN y/o protefna. Los ejemplos de antibioticos antitumorales incluyen doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina, y procarbazina.

“Inhibidores mitoticos” previenen la evolucion normal del ciclo celular y la mitosis. En general, los inhibidores microtubulares o taxoides tales como paclitaxel y docetaxel son capaces de inhibir la mitosis. Los alcaloides de la Vinca tales como vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina son tambien capaces de inhibir la mitosis.

“Inhibidores de la funcion de la cromatina” o “inhibidores de la topoisomerasa” se refieren a sustancias las cuales inhiben la funcion normal de las protefnas de modelado de la cromatina tales como topoisomerasa I o topoisomerasa II. Los ejemplos de los inhibidores de la funcion de la cromatina incluyen, para topoisomerasa I, camptotecina y sus derivados tales como topotecan o irinotecan, y, para la topoisomerasa II, etoposido, fosfato de etoposido y teniposido.

“Agente antiangiogenesis” se refiere a cualquier farmaco, compuesto, sustancia o agente el cual inhibe el crecimiento de los vasos sangufneos. Los agentes antiangiogenesis ejemplares incluyen, aunque sin limitarse a, razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina y vitaxin.

“Antiestrogeno” o “agente antiestrogenico” se refiere a cualquier sustancia la cual reduce, antagoniza o inhibe la accion de estrogeno. Los ejemplos de agentes antiestrogenicos son tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, anastrozol, letrozol, y exemestano.

“Antiandrogenos” o “agentes antiandrogenos” se refiere a cualquier sustancia la cual reduce, antagoniza o inhibe la accion de un androgeno. Los ejemplos de antiandrogenos son flutamida, nilutamida, bicalutamida, espironolactona, acetato de ciproterona, finasterida y cimitidina.

“Inmunomoduladores” son sustancias que estimulan el sistema inmunitario.

Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen interferon, interleucina tales como aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox y interleucina-2, factores de necrosis tumoral tales como tasonermina u otros inmunomoduladores tales como lentinan, sizofiran, roquinimex, pidotimod, pegademase, timopentina, poli I:C o levamisol en conjunto con 5-fluorouracilo.

Para mas detalle, el experto en la materia podrfa hacer referencia al manual editado por the “Association Franpaise des Enseignants de Chimie Therapeutique” y titulado “Traite de chimie therapeutique”, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edicion TEC & DOC, 2003.

Se pueden mencionar ademas como agentes qufmicos o agentes citotoxicos, todos los inhibidores de cinasa tales como, por ejemplo, gefitinib o erlotinib.

En una forma de realizacion particularmente preferida, dicha composicion como un producto de combinacion segun la invencion es caracterizada por que dicho agente citotoxico es acoplado qufmicamente a dicho anticuerpo para uso simultaneo.

Con el fin de facilitar el acoplamiento entre dicho agente citotoxico y dicho anticuerpo de acuerdo con la invencion, es especialmente posible introducir moleculas espaciadoras entre los dos compuestos que se van a acoplar, tales como poli(alquilen)glicoles tal como polietilenglicol, o sino aminoacidos, o, en otra forma de realizacion, para utilizar derivados activos de dichos agentes citotoxicos en los cuales se habrfan introducido funciones capaces de reaccionar con dicho anticuerpo segun la invencion. Estas tecnicas de acoplamiento son bien conocidas por el experto en la materia y no seran descritas con mayor detalle en la presente descripcion.

La invencion se refiere, en otro aspecto, a una composicion caracterizada por que uno, por lo menos, de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se conjuga con una toxina celular y/o un radioelemento.

Preferentemente dicha toxina o dicho radioelemento es capaz de inhibir por lo menos una actividad celular de

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celulas que expresan el c-Met, en un modo mas preferido capaz de prevenir el crecimiento o la proliferacion de dicha celula, especialmente o totalmente inactivando dicha celulas.

Preferentemente asimismo dicha toxina es una toxina enterobacteriana, especialmente la exotoxina A de Pseudomonas.

Los radioelementos (o radioisotopos) preferentemente conjugados a los anticuerpos empleados para la terapia son radioisotopos los cuales emiten rayos gamma y preferentemente yodo131, itrio90, oro199, paladio100, cobre67, bismuto217 y antimonio211. Los radioisotopos los cuales emiten rayos beta y alfa pueden asimismo utilizarse para la terapia.

Por toxina o radioelemento conjugado a por lo menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, segun la invencion, se pretende indicar cualesquier medios que permitan a dicha toxina o dicho radioelemento unirse a dicho por lo menos un anticuerpo, especialmente mediante acoplamiento covalente entre los dos compuestos, con o sin introduccion de una molecula de enlace.

Entre los agentes que permiten la union en una forma qufmica (covalente), electrostatica o no covalente de la totalidad o parte de los componentes del conjugado, puede mencionarse particularmente a la benzoquinona, carbodiimida y mas particularmente EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, acido ditiobis-nitrobenzoico (DTNB), N-succinimidil S-acetil tio-acetato (SATA), los agentes puente que tienen uno o mas grupos fenilazida que reaccionan con los ultravioletas (U.V.) y con preferencia N-[-4- (azidosalicilamino)butil]-3'-(2'-piridilditio)-propionamida (APDP), N-succinimid-il 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 6-hidrazino-nicotinamida (HYNlC).

Otra forma de acoplamiento, especialmente para los radioelementos, puede consistir en el uso de un quelante ionico bifuncional.

Entre estos quelatos, es posible mencionar los quelatos derivados de EDTA (acido etilendiaminatetraacetico) o de DTPA (acido dietilentriaminapentaacetico) los cuales han sido desarrollados para unir metales, especialmente metales radiactivos e inmunoglobulinas. Por lo tanto, DTPA y sus derivados pueden ser sustituidos por diferentes grupos en la cadena de carbono con el fin de aumentar la estabilidad y la rigidez del complejo de ligando -metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); patente US n° 4.831.175).

Por ejemplo, el acido dietilentriaminapentaacetico (DTPA) y sus derivados, los cuales han sido ampliamente utilizados en medicina y en biologfa durante un largo tiempo ya sea en su forma libre, o en la forma de un complejo con un ion metalico, tienen la caracterfstica notable de formar quelatos estables con iones metalicos y de ser acoplados con protefnas de interes terapeutico o de diagnostico tales como anticuerpos para el desarrollo de radioinmunoconjugados en terapia contra el cancer (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990).

Asimismo, preferentemente, dicho por lo menos un anticuerpo que forma dicho conjugado de acuerdo con la invencion se selecciona de entre sus fragmentos funcionales, especialmente los fragmentos amputados de su componente de Fc tales como los fragmentos scFv.

Como se ha mencionado anteriormente, en una forma de realizacion de la invencion, dicho agente citotoxico/ citostatico o dicha toxina y/o un radioelemento es acoplado qufmicamente a por lo menos uno de los elementos de dicha composicion para uso simultaneo.

La presente invencion comprende la composicion descrita como un medicamento.

La presente invencion comprende ademas el uso de la composicion segun la invencion para la preparacion de un medicamento.

En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, y/o de una composicion segun lo descrito anteriormente para la preparacion de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferacion de celulas tumorales.

Otro aspecto de la invencion consiste en el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales y/o de una composicion, segun lo descrito anteriormente o el uso mencionado anteriormente, para la preparacion de un medicamento destinado a la prevencion o al tratamiento del cancer.

Esta comprendido asimismo en la presente invencion un metodo destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferacion de celulas tumorales en un paciente que comprende la administracion a un paciente que lo necesita de un anticuerpo, o de uno de sus fragmentos o derivados funcionales segun la invencion, un anticuerpo producido por un hibridoma segun la invencion o una composicion segun la invencion.

La presente invencion comprende ademas un metodo para la prevencion o el tratamiento del cancer en un

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paciente que lo necesita, que comprende la administracion al paciente de un anticuerpo, o de uno de sus fragmentos o derivados funcionales segun la invencion, un anticuerpo producido por un hibridoma segun la invencion o una composicion segun la invencion.

En un aspecto preferido particular dicho cancer es un cancer seleccionado entre cancer de prostata, osteosarcomas, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de endometrio, glioblastoma o cancer de colon.

Como se ha explicado anteriormente, una ventaja de la invencion consiste en el tratamiento de la activacion de Met dependiente o independiente de HGF relacionada con canceres.

La invencion, todavfa en otro aspecto, comprende un metodo de diagnostico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresion o una expresion insuficiente del receptor c-Met comenzando a partir de una muestra biologica en la cual la presencia anormal del receptor c-Met es sospechada, estando dicho metodo caracterizado por que comprende un paso donde dicha muestra biologica se pone en contacto con un anticuerpo de la invencion, siendo posible que dicho anticuerpo sea etiquetado en caso de ser necesario.

Preferentemente, dichas enfermedades conectadas con una presencia anormal del receptor c-Met en dicho metodo de diagnostico seran canceres.

Dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, puede estar presente en la forma de un inmunoconjugado o de un anticuerpo etiquetado de modo de obtener una senal detectable y/o cuantificable.

Los anticuerpos etiquetados de acuerdo con la invencion o sus fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos denominados inmunoconjugados los cuales pueden ser conjugados, por ejemplo, con enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbonica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa o mediante una molecula tal como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina. Las etiquetas fluorescentes pueden asimismo conjugarse a los anticuerpos o a sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invencion y especialmente incluyen fluorescefna y sus derivados, fluorocromo, rodamina y sus derivados, GFP (GFP por “Green Fluorescent Protein” (Protefna Fluorescente Verde), dansilo, umbeliferona etc. En ese tipo de conjugados, los anticuerpos de la invencion o sus fragmentos funcionales pueden prepararse mediante metodos conocidos por el experto en la materia. Pueden acoplarse a las enzimas o a las etiquetas fluorescentes directamente o mediante el intermediario o un grupo espaciador o de un grupo de ligacion tal como un polialdehfdo, tal como glutaraldehfdo, acido etilendiaminatetraacetico (EDTA), acido dietilen-triaminapentaacetico (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento tales como aquellos antes mencionados para los conjugados terapeuticos. Los conjugados que contienen etiquetas de tipo fluorescefna pueden prepararse mediante reaccion con un isotiocianato.

Otros conjugados pueden incluir, asimismo, etiquetas quimiluminiscentes tales como luminol y los dioxetanos, etiquetas bio-luminiscentes tales como luciferasa y luciferina, o sino etiquetas radiactivas tales como yodo123, yodo125, yodo126, yodo133, bromo77, tecnetio99m, indio111, indio113m, galio67, galio68, rutenio95, rutenio97, rutenio103, rutenio , mercurio , mercurio , renio renio , renio , escandio , telurio , telurio , telurio , tulio165, tulio167, tulio168, fluor18, itrio199, yodo131. Los metodos conocidos por el experto en la materia existentes para acoplar los radioisotopos terapeuticos a los anticuerpos ya sea directamente o por medio de un agente quelante tales como EDTA, DTPA mencionados anteriormente pueden utilizarse para los radioelementos los cuales pueden utilizarse en diagnostico. Asimismo, es posible mencionar el marcado con Na[I125] mediante el metodo de cloramina T [Hunter W.M. y Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] o sino con tecnetio99m mediante la tecnica de Crockford et al. (patente US n° 4.424.200) o unido por medio de DTPA segun lo descrito por Hnatowich (patente US n° 4.479.930).

Por lo tanto, el anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, segun la invencion, puede emplearse en un proceso para la deteccion y/o la cuantificacion de una sobreexpresion o de una expresion insuficiente, preferentemente una sobreexpresion, del receptor c-Met en una muestra biologica, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo, o con su fragmento o derivado funcional, de acuerdo con la invencion; y

b) la demostracion del complejo de c-Met/anticuerpo posiblemente formado.

En una forma de realizacion particular, anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, segun la invencion, puede emplearse en un proceso para la deteccion y/o la cuantificacion del receptor c-Met en una muestra biologica, para la monitorizacion de la eficacia de un tratamiento profilactico y/o terapeutico de cancer dependiente de c-Met.

Mas generalmente, el anticuerpo o un fragmento o derivado funcional del mismo segun la invencion puede

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emplearse ventajosamente en cualquier situacion donde la expresion del receptor c-Met debe ser observada en forma cualitativa y/o cuantitativa.

Preferentemente, la muestra biologica es formada mediante un fluido biologico, tal como suero, sangre entera, celulas, una muestra de tejido o biopsias de origen humano.

Puede emplearse cualquier procedimiento o ensayo convencional con el fin de llevar a cabo ese tipo de deteccion y/o dosificacion. Dicho ensayo puede ser un ensayo de competicion o sandwich, o cualquier ensayo conocido por el experto en la materia dependiente de la formacion de un complejo inmune de tipo anticuerpo- antfgeno. Tras las aplicaciones de acuerdo con la invencion, el anticuerpo o un fragmento o derivado funcional del mismo puede ser inmovilizado o marcado. Esta inmovilizacion puede llevarse a cabo en numerosos soportes conocidos por el expertos en la materia. Estos soportes pueden incluir, especialmente, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, o celulas naturales o modificadas. Estos soportes pueden ser solubles o insolubles.

A tftulo de ejemplo, un metodo preferido implica procesos inmunoenzimaticos de acuerdo con la tecnica ELISA, por inmunofluorescencia, o tecnica de radio-inmunoensayo (RIA) o equivalente.

Por lo tanto, la presente invencion comprende asimismo los kits o conjuntos necesarios para llevar a cabo un metodo de diagnostico de enfermedades inducidas por una sobreexpresion o una expresion insuficiente del receptor c-Met o para llevar a cabo un proceso para la deteccion y/o la cuantificacion de una sobreexpresion o de una expresion insuficiente del receptor c-Met en una muestra biologica, preferentemente, una sobreexpresion de dicho receptor, caracterizado por que dicho kit o conjunto comprende los siguientes elementos:

a) un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, segun la invencion;

b) opcionalmente, los reactivos para la formacion del medio favorables para la reaccion inmunitaria;

c) opcionalmente, los reactivos que permiten la demostracion de complejos de c-Met/anticuerpo producidos mediante la reaccion inmunitaria.

Un objeto de la invencion es asimismo la utilizacion de un anticuerpo o una composicion segun la invencion para la preparacion de un medicamento destinado al direccionamiento especffico de un compuesto biologicamente activo hacia celulas que expresan o que sobreexpresan el receptor c-Met.

Se pretende en la presente memoria indicar por compuesto biologicamente activo cualquier compuesto capaz de modular, especialmente de inhibir, la actividad celular, en particular su crecimiento, su proliferacion, transcripcion o traduccion genetica.

Un objeto de la invencion es asimismo un reactivo de diagnostico in vivo que comprende un anticuerpo segun la invencion, o un fragmento o derivado funcional del mismo, preferentemente marcado, especialmente radioetiquetado, y su uso en la obtencion de imagenes medicas, en particular para la deteccion del cancer en conexion con la expresion o la sobreexpresion por una celula del receptor c-Met.

La invencion se refiere asimismo a una composicion como un producto combinado o a un conjugado anti-c- Met/toxina o radioelemento, segun la invencion, como un medicamento.

Preferentemente, dicha composicion como un producto combinado o dicho conjugado de acuerdo con la invencion se mezclara con un excipiente y/o un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

En la presente descripcion, vehfculo aceptable para uso farmaceutico tiene el proposito de indicar un compuesto o una combinacion de compuestos que entran en una composicion farmaceutica sin provocar reacciones secundarias y el cual permite, por ejemplo, la facilitacion de la administracion del o de los compuestos activos, un aumento en su vida util y/o en su eficacia en el cuerpo, un aumento de su solubilidad en solucion o sino una mejora en su conservacion. Estos vehfculos aceptables para uso farmaceutico son bien conocidos y seran adaptados por el experto en la materia en funcion de la naturaleza y del modo de administracion del compuesto o de los compuestos activos seleccionados.

Preferentemente, estos compuestos seran administrados por la ruta sistemica, en particular mediante la ruta intravenosa, por la ruta intramuscular, intradermica, intraperitoneal o subcutanea, o por la ruta oral. En una forma mas preferida, la composicion que comprende los anticuerpos segun la invencion sera administrada varias veces, en forma consecutiva.

Sus modos de administracion, dosificaciones y formas farmaceuticas optimas pueden determinarse de acuerdo con los criterios generalmente tomados en cuenta en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente tal como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la seriedad de su condicion general, la

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tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios observados.

Otras caracterfsticas y ventajas de la invencion aparecen a continuacion en la descripcion con los ejemplos y las figuras en las que:

figura 1: Efecto de Mabs de IgG1 irrelevantes de origen murino y humano y PBS sobre la fosforilacion del receptor c-Met sobre celulas A549.

Figuras 2A y 2B: Efecto de Mabs 224G11 murinos y humanizados producidos como un isotipo humano de IgG1/kappa sobre la fosforilacion del receptor c-Met sobre las celulas A549.

Figura 2A: efecto agonista calculado como porcentaje versus estimulacion maxima de la fosforilacion de c- Met por HGF [100 ng/ml].

Figura 2B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibicion de la estimulacion maxima de fosforilacion de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figuras 3A y 3B: Comparacion entre Mab 224G11 murino y Mabs 224G11 quimericos que contienen diversas regiones bisagra genomanipuladas, sobre la fosforilacion del receptor c-Met sobre las celulas A549.

Figura 3A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulacion maxima de la fosforilacion de c- Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 3B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibicion de la estimulacion maxima de la fosforilacion de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 4A y 4B: Comparacion entre Mab 224G11 murino y Mabs 224G11 quimericos y humanizados producidos como un isotipo de IgG2/kappa humano, sobre la fosforilacion del receptor c-Met en celulas A549.

Figura 4A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulacion maxima de la fosforilacion de c- Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 4B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibicion de la estimulacion maxima de fosforilacion de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 5A y 5B: Comparacion entre Mab 224G11 murino y Mabs 224G11 quimericos y humanizados producidos como un mutante bisagra genomanipulado TH7IgG1/kappa, sobre la fosforilacion del receptor c- Met en celulas A549.

Figura 5A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulacion maxima de la fosforilacion de c- Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 5B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibicion de la estimulacion maxima de fosforilacion de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 6A y 6B, figuras 7A y 7B, figuras 8A y 8B, figuras 9A y 9B, figuras 10A y 10B: modelos de BRET con figuras A: modelo de dimerizacion de c-Met; y figuras B: modelo de activacion de c-Met.

Figura 11: reconocimiento de c-Met mediante formas de 224G11 quimericas y humanizadas.

Figura 12: Efecto de anticuerpos murinos y quimericos sobre la proliferacion inducida por HGF de celulas NCI-H441 in vitro. Las celulas NCI-H441 fueron plaqueadas en medio libre de suero. 24 horas despues de colocacion en placas, se agregaron m224G11 y [224G11]quim ya sea en ausencia o en presencia de HGF. Las flechas negras indican los pocillos plaqueados con celulas solas ya sea en ausencia £ o en presencia ^ de HGF. Una IgG1 murina (mIgG1) se introdujo como un control de isotipo.

Figura 13: Comparacion in vivo de Mabs de 224G11 quimericos de IgG1 y murinos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441.

Figuras 14A y 14B: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quimericas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferacion inducida por hGf de celulas NCI-H441 in vitro. Las celulas NCI-H441 se colocaron en placas en medio libre de suero. Veinticuatro horas despues de colocacion en placa, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron ya sea en ausencia o en presencia de HGF. En el panel (figura 14A), Las versiones m224G11 murino, IgG1 quimerica [224G11]quim, IgG1 humanizada [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3] se mostraron. En el panel (figura 14B), se presentaron las formas de m224G11 murino y diversas formas de IgG1 quimericas ([224G11] quim, [224G11] [MH quim], [224G11]

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[MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim]). Las flechas negras indican los pocillos plaqueados con celulas solas ya sea en ausencia £ o en presencia ^ de HGF. Se introdujo una IgG1 murina como un control negativo para la actividad agonista. El m5D5 se utilizo como un control agonista completo dosis-dependiente.

Figura 15: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quimericas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferacion inducida por HGF de celulas NCI-H441 in vitro. Las celulas NCI-H441 se plaquearon en medio libre de suero. 24 Horas despues de la colocacion en placas, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron ya sea en ausencia o en presencia de HGF. Se presentaron las formas m224G11 murina, [224G11] quim, [224G11] [TH7 quim]) IgG1 quimericas y [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3]). Las flechas negras indican los pocillos con celulas solas ya sea en ausencia £ o en presencia ^ de HGF. Se introdujo una IgG1 murina como un control negativo para la actividad agonista. Se utilizo el m5D5 como un control agonista completo dependiente de la dosis.

Figura 16: Comparacion in vivo de Mabs 224G11 murinos, quimericos y humanizados en el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

Figura 17A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulacion maxima de la fosforilacion de c- Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 17B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibicion de la estimulacion maxima de fosforilacion de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 18: Modelos de BRET con modelo de activacion de c-Met.

Figura 19: Efecto de m224G11 y h224G11 sobre la degradacion de c-Met en celulas A549. A) Media de 4 experimentos independientes +/- s.e.m. B) Imagen de transferencia western representativa de los 4 experimentos independientes realizados.

Figura 20: Efecto de m224G11 y h224G11 sobre la degradacion de c-Met en celulas NCI-H441. A) Media de 4 experimentos independientes +/- s.e.m. B) Imagen de transferencia Western representativa de los 4 experimentos independientes realizados.

Figura 21: Configuracion de un ELISA para evaluar la eliminacion de c-Met.

Figura 22: Evaluacion in vitro de eliminacion de c-Met en celulas NCI-H441 tratadas durante 5 dfas con m224G11. mIgG1 es un anticuerpo irrelevante utilizado como un control de isotipo.

Figura 23: Evaluacion in vitro de eliminacion de c-Met en lfneas celulares Hs746T, MKN45 y EBC-1 amplificadas tratadas durante 5 dfas con m224G11. mIgG1 es un anticuerpo irrelevante utilizado como un control de isotipo. PMA es un inductor de eliminacion utilizado como un control positivo.

Figura 24: Evaluacion in vitro de eliminacion de c-Met en NCI-H441 y lfneas celulares Hs746T, MKN45 y EBC-1 amplificadas tratadas durante 5 dfas con m224G11. mIgG1 es un anticuerpo irrelevante utilizado como un control de isotipo. PMA es un inductor de la eliminacion utilizado como un control positivo.

Figura 25: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en lfnea celular Hs746T.

Figura 26: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en lfnea celular NCI-H441. A) fosfo-ELISA y B) analisis Western.

Figura 27: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en lfnea celular Hs578T. A) fosfo-ELISA y B) analisis Western.

Figura 28: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en lfnea celular NCI-H125. A) fosfo-ELISA y B) analisis Western.

Figura 29: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en lfnea celular T98G. A) fosfo-ELISA y B) analisis Western.

Figura 30: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en lfnea celular MDA-MB-231. A) fosfo-ELISA y B) analisis Western.

Figura 31: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en lfnea celular PC3. A) fosfo-ELISA y B) analisis Western.

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Figura 32: Estudio de fosforilacion intrfnseca de h224G11 en celulas HUVEC.

Figura 33: Comparacion in vivo del anticuerpo 224G11 murino de tipo salvaje con Mabs del 224G11 quimerico con genomanipulacion en la region bisagra [C2D5-7] en el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

Figura 34: Induccion ADCC por h224G11 en celulas Hs746T y NCI-H441. Se mezclaron celulas Hs746T marcadas con 51Cr (A) o NCI-H441 (B) cargadas (cuadrados llenos) o no (cuadrados vacfos) con h224G11 con relacion diferente de celulas NK humanas y se incubaron durante 4 horas. Se cosecharon las celulas y se realizo el recuento de cpm de 51Cr liberado por lisis. Los resultados se representaron como la lisis porcentual frente a la relacion de efector/celulas objetivo. NL corresponde a las celulas sin carga.

Figura 35: Tincion con h224G11 en xenoinjerto tumoral que expreso diversos niveles de c-Met (A : lfnea celular amplificada Hs746T para c-Met, B : alto nivel de expresion c-Met en NCI-H441 y C : bajo nivel de c- Met en MCF-7).

Ejemplo 1: Generacion de anticuerpos contra c-Met

Para generar anticuerpos anti-c-Met se inmunizaron ratones BALB/c de 8 semanas de edad ya sea 3 a 5 veces subcutaneamente con una lfnea celular transfectada CHO que expresa c-Met en su membrana plasmatica (20x106 celulas/dosis/raton) o 2 a 3 veces con una protefna de fusion de dominio extracelular de c-Met (10-15 pg/dosis/raton) (R&D Systems, Catalogo # 358MT) o fragmentos de esta protefna recombinante mezclada con adyuvante completo de Freund para la primera inmunizacion y adyuvante incompleto de Freund para las siguientes. Los protocolos mixtos en los cuales los ratones recibieron tanto celulas CHO-cMet como protefnas recombinantes tambien se llevaron a cabo. Tres dfas antes de la fusion celular, los ratones fueron estimulados i.p. o i.v. con la protefna recombinante o fragmentos. A continuacion, los bazos de ratones se recolectaron y fusionaron a celulas de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC) y se sometieron a seleccion de HAT. Se llevaron a cabo cuatro fusiones. En general, para la preparacion de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a tecnicas las cuales son descritas en particular en el manual “Anticuerpos” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la tecnica de preparacion de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los hibridomas obtenidos fueron inicialmente cribados por ELISA sobre la protefna recombinante de c-Met y luego mediante analisis FACS en lfneas celulares A549 NSCLC, BxPC3 pancreatica, y U87-MG glioblastoma para asegurarse de que los anticuerpos producidos seran capaces de reconocer tambien al receptor nativo en celulas tumorales. Los reactores positivos en estos 2 ensayos fueron amplificados, clonados y un conjunto de hibridomas fue recuperado, purificado y cribado para determinar su capacidad de inhibir la proliferacion celular in vitro en el modelo BxPC3.

Para ese proposito 50.000 celulas BxPC3 se colocaron en placas de 96 pocillos en medio RPMI, 2 mM L. Glutamina, sin SVF. 24 Horas despues de colocacion en placas, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron a una concentracion final que oscilaba entre 0,0097 y 40 pg/ml 60 min antes de la adicion de 100 ng/ml de hHGF. Despues de 3 dfas, las celulas fueron pulsadas con 0,5 pCi de [3H]timidina durante 16 horas. La magnitud de [3H]timidina incorporada en ADN insoluble en acido tricloroacetico se cuantifico mediante recuento por centelleo lfquido. Los resultados fueron expresados como datos sin elaborar para realmente evaluar el efecto agonista intrfnseco de cada Mab.

A continuacion, los anticuerpos que inhiben por lo menos 50% de proliferacion celular se evaluaron para determinar su actividad en la dimerizacion de c-Met y analisis de BRET de activacion en celulas transfectadas. La actividad del receptor c-Met se cuantifico midiendo el reclutamiento de moleculas de senalizacion de Gab1 en c-Met activado. Para ese proposito, se generaron lfneas celulares estables CHO que expresan C-Met-Rluc o C- Met-Rluc y C-Met-K1100A-YFP para la dimerizacion de c-Met o C-Met-Rluc y una forma mutada de Gab1 [Maroun et al., Mol. Cell. Biol., 1999, 19:1784-1799] fusionada a YFP para la activacion de c-Met. Las celulas fueron distribuidas en microplacas de 96 pocillos blancas en DMEM-F12/FBS 5% de medio de cultivo uno o dos dfas antes de los experimentos de BRET. Las celulas fueron cultivadas, en primer lugar, a 37°^ con CO 2 5% con el fin de permitir la union celular a la placa. A continuacion, las celulas se matan de hambre con 200 pl de DMEM/pocillo durante la noche. Inmediatamente antes del experimento, DMEM se elimino y las celulas se lavaron rapidamente con PBS. Las celulas se incubaron en PBS en presencia o ausencia de anticuerpos a ser analizados o compuestos de referencia, 10 min a 37°C con anterioridad a la adicion de coelenterazina con o sin HGF en un volumen final de 50 pl. Despues de la incubacion durante otros 10 minutos a 37C, se inicio la adquisicion de emision de luz a 485 nm y 530 nm utilizando el luminometro Mithras (Berthold) (1 s/longitud de onda /pocillo repetido 15 veces).

La relacion de BRET ha sido definida previamente [Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:36843689] como: [(emision a 530 nm) - (emision a 485 nm) X Cf] / (emision a 485 nm), donde Cf corresponde a (emision a 530 nm) / (emision a 485 nm) para celulas que expresan protefna de fusion Rluc solamente en las

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mismas condiciones experimentales. La simplificacion de esta ecuacion muestra que la relacion de BRET corresponde a la relacion 530/485 nm obtenida cuando los dos socios estaban presentes, corregido por la relacion 530/485 nm obtenida bajo las mismas condiciones experimentales, cuando solamente el socio fusionado a R. reniformis luciferasa estaba presente en el ensayo. Por cuestiones de legibilidad, los resultados son expresados en unidades miliBRET (mBU); mBU corresponde a la relacion de BRET multiplicada por 1000.

Despues de este segundo ensayo in vitro, se selecciono el anticuerpo 224G11 i) sin actividad intrfnseca como una molecula entera en el ensayo funcional de proliferacion, ii) inhibiendo significativamente la proliferacion de BxPC3 y iii) inhibiendo la dimerizacion de c-Met. En los experimentos, el Mab 5D5, generado por Genentech, y disponible en la ATCC, se agrego como un control para la actividad agonista intrfnseca.

Ejemplo 2: Proceso de humanizacion de Mab 224G11 de raton por injerto de CDR

1°) Humanizacion del dominio variable (VL) de caden a ligera

Como una etapa preliminar, la secuencia nucleotfdica de 224G11 VL se comparo con las secuencias geneticas de lfnea germinal murinas incluidas en la base de datos de IMGT (
http://imgt.cines.fr). Los genes de lfnea germinal murinos IGKV3-5*01 y IGKJ4*01 que muestran una identidad de secuencia de 99,31% para la region V y 94,28% para la region J, respectivamente, han sido identificados. Considerando estas homologfas elevadas, la secuencia nucleotfdica 224G11VL ha sido utilizada directamente para buscar homologfas humanas, en lugar de lfneas germinales de raton correspondientes.

En una segunda etapa, el gen de lfnea germinal humano que exhibe la mejor identidad con el 224G11VL ha sido buscado para identificar el mejor candidato humano para el injerto de CDR. Para la optimizacion de la seleccion, se han llevado a cabo alineaciones entre las secuencias de aminoacidos. El gen de lfnea germinal humano IGKV4-1*01 produjo una identidad de secuencia de 67,30%, pero mostro una longitud diferente para CDR1 (10 aminoacidos en 224G11 VL y 12 aminoacidos en IGKV4-1*01). Para la region J, se selecciono el gen de lfnea germinal humano IGKJ4*02 (identidad de secuencia de 77,14%).

En una etapa siguiente, las regiones de CDR de 224G11 VL de raton se injertaron en las secuencias estructurales humanas seleccionadas anteriormente. Se analizo cada posicion de aminoacido para diversos criterios tales como participacion en la interfase VH/VL, en la union al antfgeno o en la estructura de CDR, localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, anclajes de CDR, residuos pertenecientes a la zona Vernier. Se construyeron tres versiones humanizadas, correspondientes a SEC ID n° 8, SEC ID n° 9 y SEC ID n° 10, y que contenfan respectivamente cuatro (4, 39, 40, 84), dos (39, 40) o un (40) residuos murinos en sus regiones FR y las CDR correspondientes a 224G11 VL de raton.

2°) Humanizacion del dominio variable de cadena pes ada (VH)

Como una etapa preliminar, la secuencia nucleotfdica del 224G11 VH se comparo con las secuencias de genes de lfnea germinal murinas incluidas en la base de datos de IMGT (
http://imgt.cines.fr).

Los genes murinos de lfneas germinales IGHV1-18*01, IGHD2-4*01 y IGHJ2*01 con una identidad de secuencia de 92,70% para la region V, 75,00% para la region D y 89,36% para la region J, respectivamente, han sido identificados. Conforme a estas homologfas elevadas, se ha decidido utilizar directamente las secuencias nucleotfdicas 224G11VH para buscar homologfas humanas, en lugar de lfneas germinales de raton correspondientes.

En una segunda etapa, el gen de lfnea germinal humano que exhibe la mejor identidad con el 224G11 VH ha sido investigado para identificar el mejor candidato humano para el injerto de CDR. Con este proposito, la secuencia nucleotfdica de 224G11 VH ha sido alineada con las secuencias de genes de lfneas germinales humanas pertenecientes a la base de datos de IMGT. La secuencia humana IGHV1-2*02 V exhibio una identidad de secuencia de 75.00% en el nivel nucleotfdico y 64,30% en el nivel de aminoacidos. Buscando homologfas para la region H se ha alcanzado la identificacion del gen de lfnea germinal IGHJ4*04 humano con una identidad de secuencia de 78,72%.

En una etapa siguiente, se injertaron regiones de CDR de 224G11 VH de raton en las secuencias estructurales humanas seleccionadas anteriormente. Se analizo cada posicion de aminoacido para diversos criterios tales como la participacion en la interfase VH/VL, en la union al antfgeno o en la estructura de CDR, localizacion del residuo en la estructura 3D del dominio variable, anclajes de CDR, residuos pertenecientes a la zona Vernier. Se construyo una forma completamente humanizada, correspondiente a SEC ID 4; contiene residuos exclusivamente humanos en su regiones FR y las CDR correspondientes a 224G11 VH de raton.

Ejemplo 3: Genomanipulacion de mutantes bisagra mejorados

Es bien conocido por el experto en la materia que la region bisagra participa fuertemente en la flexibilidad del

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dominio variable de inmunoglobulinas (vease Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997). Durante el proceso de quimerizacion de Mab 224G11, el dominio constante murino IGHG1 fue reemplazado por la porcion IGHG1 equivalente de origen humano. Puesto que las secuencias de aminoacidos de la region bisagra eran altamente divergentes, la “murinizacion” de la region bisagra se llevo a cabo con el fin de mantener su longitud y rigidez. Puesto que la region bisagra IGHG2 humana corresponde al homologo mas cercano de la bisagra IGHG1 murina, esta secuencia tambien fue considerada. Una serie de 7 secuencias bisagra diferentes fueron construidas (SEC ID n° 22 a 28) mediante la incorporacion de porciones de las bisagras IGHG1 de raton y la bisagra IGHG2 humana en la porcion bisagra IGHG1 humana.

Otra serie de mutantes bisagra fue disenada y construida (SEC ID n° 58 a 72) para evaluar la influencia de una cistefna adicional y su posicion a lo largo del dominio bisagra, la delecion de 1, 2, 3 o 4 aminoacidos a lo largo del dominio bisagra y una combinacion de estos dos parametros (adicion de cistefna y delecion de aminoacidos).

Ejemplo 4: Produccion de Mab 224G11 humanizado y formatos de Mab bisagra genomanipulados

Todas las formas de Mab descritas anteriormente que contenfan regiones bisagra quimericas, humanizadas y/o genomanipuladas fueron producidas luego de la transfeccion transitoria y utilizando el sistema HEK293/EBNA con un vector de expresion pCEP4 (InVitrogen, US).

Las secuencias nucleotfdicas enteras correspondientes a las versiones humanizadas del dominio variable de las cadenas ligera (SEC ID n° 18, SEC ID n° 19 y SEC ID n° 20) y pesada (SEC ID n° 14) de Mab 224G11 se sintetizaron mediante sfntesis genetica global (Genecust, Luxemburgo). Se subclonaron en un vector pCEP4 (InVitrogen, US) portando la secuencia codificante entera del dominio constante [CH1-Bisagra-CH2-CH3] de una inmunoglobulina IgG1 o IgG2 humana. La modificacion de la region bisagra se llevo a cabo intercambiando un fragmento de restriccion {Nhe1I-Bcl1} por la porcion equivalente que porta las modificaciones deseadas, siendo sintetizado cada fragmento {Nhe1-Bcl1} respectivo mediante sfntesis genetica global (Genecust, LU). Todos los pasos de clonacion se llevaron a cabo de acuerdo con tecnicas de biologfa molecular convencionales segun lo descrito en el manual de Laboratorio (Sambrook y Russel, 2001) o de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada constructo genetico fue completamente validado por secuenciamiento de nucleotidos utilizando el kit de secuenciamiento de ciclo terminador Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, US) y analizado utilizando un Analizador Genetico 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US).

Las celulas HEK293 EBNA adaptadas en suspension (InVitrogen, US) se cultivaron rutinariamente en frascos de 250 ml en 50 ml de medio libre de suero Excell 293 (SAFC Biosciences) suplementado con glutamina 6 mM en un agitador orbital (velocidad de rotacion 110 rpm). La transfeccion transitoria se llevo a cabo con 2.106 celulas/ml utilizando polietilenimina de 25 kDa lineal (PEI) (Polysciences) preparada en agua a una concentracion final de 1 mg/ml de ADN mixto y plasmido (concentracion final de 1,25 pg/ml para relacion de plasmido de cadena pesada a ligera de 1:1). A las 4 horas postransfeccion, el cultivo se diluyo con un volumen de medio de cultivo fresco para lograr una densidad celular final de 106 celulas/ml. El proceso de cultivo se monitoreo sobre la base de la viabilidad celular y produccion de Mab. Tfpicamente, los cultivos se mantuvieron durante 4 a 5 dfas. Los Mabs se purificaron utilizando un metodo de cromatograffa convencional en una resina de Protefna A (GE Healthcare, US).

Todas las formas diferentes de Mabs fueron producidas en niveles adecuados con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad fueron producidos a niveles adecuados con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad oscilan tfpicamente entre 15 y 30 mg/l de Mabs purificados.

Ejemplo 5: Evaluacion de estado de fosforilacion de c-Met mediante ensayo ELISA especffico para Fosfo- c-Met

Este ensayo funcional permite controlar la modulacion del estado de fosforilacion de c-Met ya sea por Mabs solos o en la presencia conjunta de HGF.

Se sembraron celulas A549 en una placa de 12MW en medio de crecimiento completo [F12K + 10 % FCS]. Las celulas se sometieron a inanicion durante 16 horas antes de la estimulacion con HGF [100 ng/ml], y cada Mab que se va a analizar se agrego en su concentracion final de 30 pg/ml 15 minutos antes de la estimulacion del ligando. Se agrego tampon de lisis enfriado con hielo 15 minutos despues de la adicion de HGF para detener la reaccion de fosforilacion. Las celulas se rasparon mecanicamente y los lisados celulares se recolectaron por centrifugacion a 13000 rpm durante 10 min. a 4°C y corresponden a la fase de sobrenadante. El contenido proteico se cuantifico utilizando un kit BCA (Pierce) y se almaceno a -20°C hasta su utilizacion. El e stado de fosforilacion de c-Met se cuantifico por ELISA. Se utilizo un Mab anti-c-Met de cabra (R&D, ref AF276) como un anticuerpo de captura (recubrimiento durante toda la noche a 4°C) y despues un paso de saturacion con un tampon de 5% de TBS-BSA (1 hora a temperatura ambiente (TA)), se agregaron 25 pg de lisados proteicos a cada pocillo de la placa de 96 MW recubierta. Despues de una incubacion de 90 minutos a TA, las placas se lavaron cuatro veces y se agrego el anticuerpo de deteccion (Mab anti-fosfo-c-Met, dirigido contra los residuos Tyr fosforilados en posicion 1230, 1234 y 1235). Despues de una incubacion adicional de 1 hora y 4 lavados, se

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agrego un anticuerpo anti-conejo acoplado a HRP (Biosource) durante 1 hora a TA, y se llevo a cabo la deteccion por luminiscencia agregando Luminol. Las lecturas de luminiscencia eran en un lector de placas multimodo Mithras LB920 (Berthold).

Tanto el nivel basal como el nivel de fosforilacion del receptor c-Met inducido por HGF [100 ng/ml] no se vieron afectados ni por el tratamiento con PBS, ni por la adicion de Mabs murinos o humanos los cuales no se dirigen contra el receptor c-Met humano (figura 1). Por otro lado, el Mab murino (m) 224G11 inhibio fuertemente la fosforilacion de c-Met inducida por HGF [100 ng/ml] (figura 2B) sin alterar por si mismo la fosforilacion del receptor (figura 2A). Sorprendentemente, la forma quimerica de Mab 224G11 (224G11quim/IgG1), lo que significa dominio variable (VH+VL) de m224G11 combinado con dominio constante humano IgG1/kappa proporciono actividad agonista fuerte (17% del efecto maximo de HGF, figura 2A) asociada con una eficacia antagonista reducida (54% de inhibicion del efecto maximo de HGF comparado con el m224G11 que produce 75% de inhibicion del efecto maximo de HGF, figura 2B). Tres formas humanizadas de Mab 224G11, [224G11]Hz1/IgG1, [224G11]Hz2/IgG1 y [224G11]Hz3/IgG1, tambien construidas en una estructura humana IgG1/kappa, produjeron tambien una disminucion de la eficacia antagonista y actividad agonista significativa (11 a 24% del nivel de HGF maximo) en comparacion con 224G11 murino (figuras 2A y 2B). Se construyo una serie de versiones genomanipuladas del dominio bisagra de cadena pesada y se analizaron en el ensayo de fosforilacion del receptor c-Met. Como se muestra en la figura 3A, se observo una importante reduccion del efecto agonista asociada con el isotipo de hIgG1/kappa tanto para el constructo basado en IgG2 como para los constructos de IgG1/kappa genomanipulados [MH, MUP9H y TH7]. Tambien se obtuvo un aumento concomitante de la eficacia antagonista. El mutante bisagra TH7 basado en hIgG1/kappa, con la secuencia mas humana, se selecciono para completar el proceso de humanizacion. En una etapa siguiente, se generaron tres versiones humanizadas de dominio variable de Mab 224G11 mediante combinacion con ya sea un IgG2/kappa humano o un dominio constante bisagra genomanipulado de TH7 basado en IgG1/kappa. Para los constructos humanizados de hIgG2/kappa, la version humanizada Hz3 produjo un fuerte agonismo (figura 4A), y para las tres versiones humanizadas, la eficacia antagonista estaba por debajo de aquella observada con Mab 224G11 murino y comparable con Mab basado en hIgG1 quimerico (56-57% de inhibicion de efecto de HGF, figura 4B). Por otro lado, la combinacion de las tres versiones humanizadas Hz1, Hz2 o Hz3 con el mutante IgG1/TH7 genomanipulado casi restauro por completo las propiedades del Mab murino 224G11 en terminos de actividad agonista debil (5-6% de efecto de HGF) y actividad antagonista fuerte (68 a 72% de inhibicion del efecto de HGF) de la fosforilacion del receptor c-Met (figuras 5A y 5B). Estas variantes fueron altamente mejoradas en comparacion con Mab 224G11 basado en IgG1 quimerico pero tambien con las formas humanizadas basadas en IgG2.

Una segunda serie de versiones genomanipuladas del dominio bisagra de cadena pesada se construyo y analizo en el ensayo de fosforilacion de receptor c-Met. Como se muestra en la figura 17A, todas esas versiones nuevas (c224G11 [C2], c224G11 [C3], c224G11[C5], c224G11[C6], c224G11[C7], c224G11[D1-3], c224G11[C7D6], c224G11 [C6D9], c224G11 [C2D5-7], c224G11 [C5D2-6], c224G11 [C9D2-7] y c224G11 [D5-6-7-8]) exhibieron efecto agonista mas debil que c224G11 puesto que sus actividades agonistas estan comprendidas entre el 6 y el 14% del efecto de HGF comparado con 23% para c224G11. Como c224G11[TH7], todas esas nuevas versiones exhibieron un aumento concomitante en la eficacia antagonista [figura 17B]. Dichos resultados mostraron que la construccion por ingenierfa genetica del dominio de cadena pesada por mutacion puntual y/o delecion podrfa modificar las propiedades agonistas/ antagonistas de un anticuerpo.

Ejemplo 6: analisis de BRET

En un primer grupo de experimentos, se habfa controlado que IgG1 murino, IgG1 humano e IgG2 humano irrelevantes no tuvieron efecto alguno de senal de BRET inducida por HGF en ambos modelos de BRET (experimento representativo de 12 experimentos independientes; figura 6). Estos Mabs son mencionados como controles.

Se evaluo el efecto de una forma quimerica de IgG1 de Mab 224G11 de raton ([224G11 ]quim) tanto en el modelo BRET de dimerizacion de c-Met como de activacion de c-Met. Si bien el Mab 224G11 de raton inhibio 59,4% de la senal de BRET inducida por HGF en el modelo de dimerizacion de c-Met, el Mab [224G11]quim inhibio solamente 28,9% (figura 7A). El anticuerpo [224G11]quim tambien era menos eficaz en la inhibicion de la activacion de c-Met inducida por HGF puesto que los anticuerpos [224G11]quim y m224G11 inhibieron respectivamente 34,5% y 56,4% de la senal de BrEt inducida por HgF (figura 7B). Ademas, m224G11 solo no tuvo efecto alguno sobre la activacion de c-Met mientras que [224G11]quim tuvo un efecto agonista parcial sobre la activacion de c-Met correspondiente a 32,9% de la senal inducida por HGF. Este efecto agonista parcial del [224G11]quim tambien fue observado en el modelo BRET de dimerizacion de c-Met puesto que [224G11]quim solo indujo un aumento de BRET correspondiente a 46,6% de la senal inducida por HGF contra 21,3% para m224G11 (figura 7A).

En las figuras 8A y 8B, las formas quimericas mutadas bisagra de anticuerpo 224G11 mostraron un efecto inhibidor mayor sobre la senal de BRET inducida por HGF que [224G11]quim puesto que mostraron una inhibicion del 59,7%, 64,4%, 53,2% y 73,8% de la senal de BRET de activacion inducida por HGF (figura 8B) y

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61,8%, 64,4% 52,5% y 64,4% de inhibicion de la senal de BRET de dimerizacion de c-Met inducida por HGF (figura 8A) para [224G11][MH quim], [224G11][MUP9H quim], [224G11][MMCH quim] y [224G11][TH7 quim] respectivamente. En contrario a [224G11]quim, el cual tuvo un efecto agonista parcial sobre la activacion de c- Met, las formas quimericas mutadas bisagra del anticuerpo 224G11 no mostraron un efecto significativo sobre la activacion de c-Met solamente (5,1%, 7,6%, -2,0% y -6,9% respectivamente) segun lo observado para m224G11.

En la figura 9B, al igual que el [224G11 ] [TH7 quim], las 3 versiones humanizadas de anticuerpo de IgG1 224G11 con la bisagra TH7 no indujeron un aumento significativo de la senal de BRET en el modelo de activacion cuando se analizo solo y mostro una fuerte inhibicion de la senal de BRET inducida por HGF: 59,9%, 41,8% y 57,9% para las formas Hz1, Hz2 y Hz3 respectivamente. Asimismo, [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz2] y [224G11] [TH7 Hz3] inhibieron la senal de BRET inducida por HGF en el modelo de dimerizacion de 52,2%, 35,8% y 49,4% respectivamente (figura 9A).

Contrariamente a [224G11]quim, la forma quimerica del anticuerpo de IgG2 224G11 ([224G11] [IgG2 quim]) no mostro efecto agonista parcial alguno solo e inhibio 66,3% del efecto de HGF sobre el modelo de activacion de c- Met (figura 10B). En el modelo de dimerizacion de c-Met, [224G11] [IgG2 quim] inhibio 62,4% de la senal de BReT inducida por HGF (figura 10A).

La eficacia agonista de la segunda serie de versiones genomanipuladas del dominio bisagra de cadena pesada se evaluo en el modelo BRET de activacion del c-Met (figura 18). En contraste con c224G11, el cual tenia un efecto agonista parcial sobre la activacion del c-Met, las formas quimericas mutadas bisagra c224G11[C2], c224G11 [C3], c224G11 [C5], c224G11[C6], c224G11[C7], c224G11[D1-3], c224G11[C7D6], c224G11[C6D9], c224G11 [C2D5-7], c224G11[C5D2-6], c224G11[C9D2-7] y c224G11[D5-6-7-8] del anticuerpo 224G11 no mostraron efecto significativo alguno sobre la activacion del c-Met sola.

Ejemplo 7: Reconocimiento del c-Met por formas de 224G11 quimericas y humanizadas

Se ha llevado a cabo un ELISA directo para determinar la habilidad de union de las diversas formas quimericas y humanizadas en el c-Met recombinante. Brevemente, c-Met dimerico recombinante de R&D Systems fue recubierto a 1,25 pg/ml en placas de 96 pocillos Immunlon II. Despues de una incubacion durante toda la noche a 4C, los pocillos fueron saturados con una solucion de 0,5% de gelatina/PBS. A continuacion, las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C antes de la adicion de diluciones de 2 veces de anticuerpos que se van a analizar. Las placas se incubaron durante una hora mas antes de la adicion de un HRP de IgG de cabra anti- raton para detectar el anticuerpo murino y una HRP de cadena ligera Kappa anti-humana de cabra para el reconocimiento de anticuerpos quimericos y humanizados. Las placas se incubaron durante una hora y se agrego el sustrato de peroxidasa TMB Uptima durante 5 min antes de la neutralizacion con H2SO4 1M. Los resultados presentados en la figura 11 demostraron que todas las formas analizadas eran comparables para el reconocimiento del c-Met.

Ejemplo 8: Efecto de 224G11 murino y quimerico sobre la proliferacion inducida por HGF de celulas NCI- H441 in vitro

Se cultivaron de manera rutinaria celulas NCI-H441 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% FCS (Invitrogen Corporation), 1% L-Glutamina (Invitrogen corporation). Para los ensayos de proliferacion, las celulas se separaron 3 dias antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes del plaqueo. Las celulas NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de 3,75x104 celulas/pocillo en 200 pl de medio libre de suero (medio RPMI 1640 mas 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas despues de la colocacion en placas, se agregaron los anticuerpos que se van a analizar a NCI-H441 y se incubaron a 37°C durante treinta minutos antes del agregado de HGF a una concentracion final de 400 ng/ml (5 nM) durante 142 horas adicionales. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 pg/ml (concentracion final en cada pocillo). En este experimento, se agrego un Mab de IgG1 murino como un control de isotipo murino y los anticuerpos ensayados eran los siguientes: m224G11 y su forma quimerica de IgG1 humana identificada como [224G11]quim. Los pocillos plaqueados con celulas solas -/+ HGF tambien fueron incluidos. Luego, las celulas se pulsaron con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ADN insoluble en acido tricloroacetico se cuantifico por recuento por centelleo liquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la actividad agonista intrinseca potencial que podrfa ocurrir con Mabs anti-c-Met cuando se agregan solos a celula tumoral.

Los resultados descritos en la figura 12 demostraron que, segun lo esperado, el anticuerpo murino m224G11 no exhibio efecto agonista alguno cuando se agrego solo a celulas cancerfgenas cualquiera sea la dosis ensayada. No se observo inhibicion significativa alguna de la proliferacion inducida por HGF con el control de isotipo con respecto a las variaciones de cpm observadas para este compuesto en este experimento. Cuando se agrega solo, el anticuerpo m224G11 no mostro efecto agonista alguno en comparacion con el Mab control de isotipo de mIgG1 o las celulas solas. Se observo una actividad antiproliferativa dependiente de la dosis que alcanzo 78% para m224G11 (% de calculo de inhibicion: 100-[(cpm de celulas+Mab que va a ser ensayadas- cpm media de

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mIgGI “de fondo”) x 100 / (cpm media de celulas + HGF- cpm media celulas solas)]). Sorprendentemente, la forma quimerica de los Mabs 224G11 indujo un efecto agonista dependiente de la dosis, significativo, cuando se agrego sola. Este efecto agonista tuvo un impacto sobre la inhibicion in vitro de la proliferacion inducida por HGF que cambio de 78% para el 224G11 murino hasta 50% para su forma quimerica. Para determinar su dicha actividad agonista intrfnseca in vitro “inferior”’ era compatible con un efecto in vivo sin cambiar, se produjeron tanto m224G11 como [224G11]quim para el ensayo in vivo. Como, en estudios previos, la dosis de 30 pg/raton habfa demostrado una actividad in vivo significativa, esa dosis fue seleccionada para la evaluacion in vivo.

Ejemplo 9: Comparacion in vivo de Mabs 224G11 murinos y quimericos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441

NCI-H441 es derivado de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa altos niveles de c-Met, y demuestra fosforilacion constitutiva de c-Met RTK.

Para evaluar el efecto in vivo de anticuerpos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441, se alojaron ratones atfmicos de seis a ocho semanas de edad en jaulas esterilizadas con filtro superior, se mantuvieron en condiciones esteriles y se manipularon de acuerdo con las pautas francesas y europeas. Los ratones recibieron inyecciones subcutaneas con 9x106 celulas. A continuacion, seis dfas despues del implante de celulas, se midieron los tumores (aproximadamente 100 mm3), los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamano de tumores comparable y se trataron, en primer lugar, con una dosis de carga de 60 pg de anticuerpo/raton y luego dos veces por semana con 30 pg/dosis de cada anticuerpos que se va a analizar. Los ratones fueron monitoreados para la observacion del fndice de crecimiento del xenoinjerto. El volumen tumoral se calculo mediante la formula: p (Pi)/6 X largo X ancho X altura. Los resultados descritos en la figura 13 demuestran que el Mab murino desprovisto de actividad agonista se comporta, in vivo, segun lo esperado, como antagonista potente incluso a la dosis analizada baja. Contrariamente a lo observado con el Mab murino, el Mab quimerico exhibio una actividad in vivo muy transitoria y el tumo escapo completamente al tratamiento a la inyeccion de celulas luego de D20. Este experimento demuestra claramente que el aumento del efecto agonista in vitro que dio como resultado una disminucion de la actividad antagonista tambien fue responsable de una perdida in vivo significativa de actividad antagonista.

Ejemplo 10: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quimericas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferacion inducida por HGF de celulas NCI-H441 in vitro

Se cultivaron rutinariamente celulas NCI-H441 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1% de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferacion, las celulas se dividieron 3 dfas antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes de la colocacion en placas. Las celulas NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de 3,75x104 celulas/pocillo en 200 pl de medio libre de suero (medio RPMI 1640 mas 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas despues de la colocacion en placas, los anticuerpos que se van a ensayar fueron agregados a NCI-H441 e incubados a 37°C durante treinta minutos antes de agreg ar HGF a una concentracion final de 400 ng/ml (5 nM) durante 142 horas mas. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 pg/ml (concentracion final en cada pocillo). En este experimento, se agrego Mab de IgG1 murino como un control de isotipo murino y como un control negativo agonista. Los anticuerpos ensayados fueron los siguientes: i) m224G11, ii) sus formas quimericas de IgG1 humanas respectivamente identificadas como [224G11] quim, [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim],, [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim] iii) sus formas de IgG1 humanizadas respectivamente descritas como [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3]. Tambien se incluyeron pocillos plaqueados con celulas solas -/+ HGF. El anticuerpo entero 5D5 de Genentech disponible en el mercado en la ATCC como una lfnea de celulas de hibridoma se introdujo como un control positivo agonista completo y llamado a continuacion m5D5. Luego, las celulas fueron pulsadas con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ADN insoluble en acido tricloroacetico se cuantifico por recuento por centelleo lfquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la actividad agonista intrfnseca potencial que podrfa ocurrir con Mabs anti-c- Met cuando se agregan solos a celulas tumoral.

Los resultados descritos en la figura 14A demostraron que, segun lo esperado, ni el control de isotipo ni el m224G11 exhibieron actividad agonista alguna en la proliferacion de NCI-H441. El control isotipo no tuvo efecto alguno sobre la proliferacion celular inducida por HGF mientras que m224G11 mostro un 66% de inhibicion cuando se agrego a la concentracion final de 10 pg/ml. El m5D5 utilizado como control agonista mostro, segun lo esperado, un efecto completo agonista dependiente de la dosis cuando se agrega solo a las celulas. Como ya se ha observado, el Mab [224G11] quim exhibio un efecto agonista dependiente de la dosis significativo y, se observo una actividad inhibidora disminuida de esta forma quimerica: 19% en lugar de 66% para la forma murina. Cuando se agregan por si solos, los 3 Mabs humanizados de IgG1 demostraron efectos agonistas dependientes de la dosis comparados con la forma m224G11. [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2] y [224G11] [Hz3] tuvieron actividades antagonistas comparables aproximadamente 46, 30 y 35%. Estas actividades son significativamente inferiores que aquella observada para m224G11. En la figura 14B, se analizaron diversas formas quimericas de

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IgG1. Comparada con la forma [224G11 ] quim la cual exhibio un efecto agonista dependiente de la dosis cuando se agrego por si sola a celulas NCI-H441, las formas [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim] no tuvieron un efecto agonista intrfnseco significativo. Su actividad antagonista era superior a la observada para el Mab m224G11 (57%) con inhibiciones que alcanzan 79, 78, 84 y 93% respectivamente para [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim] y [224G11] [TH7 quim].

Ejemplo 11: Efecto in vitro de diversas formas humanizadas de IgG1 del Mab 224G11

Se cultivaron rutinariamente celulas NCI-H441 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1% de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferacion, las celulas se separaron 3 dfas antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes de la colocacion en placas. Las celulas NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de 3,75x104 celulas/pocillo en 200 pl de medio libre de suero (medio RPMI 1640 mas 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas despues de la colocacion en placas, se agregaron los anticuerpos que se van a analizar a NCI-H441 y se incubaron a 37C durante treinta minutos antes de ag regar HGF a una concentracion final de 400 ng/ml (5 nM) durante 142 horas adicionales. El rango de dosis analizado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 pg/ml (concentracion final en cada pocillo). En este experimento, se agrego Mab de IgG1 murino como un control negativo "de fondo” para la actividad agonista y los anticuerpos analizados eran los siguientes: i) m224G11, ii) sus formas quimericas de IgG1 humanas respectivamente identificadas como [224G11] quim, [224G11] [TH7 quim] iii) sus formas de IgG1 humanizadas respectivamente descritas como [224G11] [tH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3]. Tambien se incluyeron pocillos plaqueados con celulas solas -/+ HGF. El anticuerpo entero 5D5 de Genentech disponible en el mercado en la AtCc como una lfnea celular de hibridoma se introdujo como un control positivo agonista completo y luego se lo llamo m5D5. Luego, las celulas fueron pulsadas con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ADN insoluble en acido tricloroacetico se cuantifico mediante recuento por centelleo lfquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la potencial actividad agonista intrfnseca que podrfa producirse con Mabs antic-Met cuando se agregan por si solos a celulas tumorales.

La figura 15 mostro que el Mab m224G11 exhibio el efecto inhibidor usual (74% de inhibicion). La forma de IgG1 quimerica [224G11] quim tuvo, segun lo esperado, un efecto agonista intrfnseco dependiente de la dosis y un efecto antagonista inferior comparado con la forma murina: 33% contra 74% de inhibicion. El [224G11] [TH7 quim] tuvo una actividad agonista muy debil en este experimento. Sin embargo, exhibio un efecto inhibidor elevado (81%) proximo al observado para el Mab murino. Las 2 formas humanizadas no tuvieron efecto agonista intrfnseco alguno y tuvieron una actividad antagonista proxima a las observadas para el Mab murino o el [224G11] [TH7 quim] con respectivamente 67 y 76% de inhibicion para [224G11] [TH7 Hz1] y [224G11] [TH7 Hz3].

Ejemplo 12: Comparacion in vivo de Mabs 224G11 murinos, quimericos y humanizados que portan el tipo salvaje o la bisagra genomanipulada TH7 (modelo de xenoinjerto NCI-H441).

NCI-H441 es derivado de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa altos niveles de c-Met, y demuestra fosforilacion constitutiva de c-Met RTK.

Para evaluar la necesidad de genomanipulacion de bisagra para ahorrar actividad in vivo del anticuerpo murino 224G11, se alojaron ratones atfmicos de seis a ocho semanas de edad en jaulas esterilizadas con filtro superior, mantenidas en condiciones esteriles y manipuladas de acuerdo con las normas francesas y europeas. Los ratones recibieron inyecciones subcutaneas con 9x106 celulas NCI-H441. Luego, seis dfas despues de la implantacion celular, los tumores eran medibles (aproximadamente 100 mm3), los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamano tumoral comparable y se trataron, en primer lugar, con una dosis de carga de 2 mg de anticuerpo/ratones y luego dos veces a la semana con una dosis de 1 mg de cada anticuerpo que se va a ensayar. Se evaluaron diez anticuerpos en este experimento incluyendo el m224G11, la forma quimerica que exhibe la bisagra del tipo salvaje (c224G11), la forma quimerica construida por ingenierfa genetica TH7 (224G11[TH7 quim]), portando tres formas humanizadas la bisagra del tipo salvaje (224G11[IgG1 Hz1], 224G11[IgG1 Hz2] y 224G11 [IgG1 Hz3]) y las tres formas genomanipuladas TH7 correspondientes (224G11 [TH7 Hz1], 224G11[TH7 Hz2] y 224G11 [TH7 Hz3]). Se hizo un seguimiento a los ratones para la observacion del fndice de crecimiento de los xenoinjertos.

El volumen tumoral se calculo mediante la formula: p (Pi)/6 X largo X ancho X altura.

Los resultados descritos en la figura 16 demuestran que el Mab murino desprovisto de cualquier actividad agonista in vitro se comporto, segun lo esperado, como un potente antagonista in vivo. En contraste con lo observado con el Mab murino, ambas formas quimericas y humanizadas que portan la bisagra del tipo salvaje exhibieron solamente una actividad in vivo muy transitoria. En cualquiera de los casos, la sustitucion de la bisagra del tipo salvaje por la genomanipulada tH7 dio como resultado una completa restauracion de la actividad

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in vivo observada con anticuerpos murinos. Este experimento demuestra claramente que el aumento del efecto agonista in vitro que dio como resultado una reduccion de la actividad antagonista tambien fue responsable de una perdida in vivo significativa de la actividad antagonista. Tambien demuestra que el uso de una region genomanipulada TH7 en lugar de la del tipo salvaje es necesaria para mantener las propiedades in vivo del Mab murino.

Ejemplo 13: Efecto de m224G11 y su forma humanizada h224G11 sobre la regulacion descendente de c- Met in vitro

En los siguientes ejemplos, para que no haya lugar a duda alguna, la expresion h224G11 se refiere a la forma humanizada 224G11 [TH7 Hz3] del anticuerpo de la invencion.

Se han seleccionado dos lfneas celulares para ensayar la actividad de anticuerpos anti-c-Met en la degradacion del receptor c-Met. A549 (#HTB-174) y NCI-H441 (#CCL-185) son dos lfneas celulares NSCLC de la recoleccion ATCC. Las celulas NCI-H441 se sembraron en RPMI 1640 + 1% de L-glutamina + 10% de FBS inactivado por calor, a 3x104 celulas/cm2 en placas de seis pocillos durante 24 h a 37°C en una atmosfera de 5% de CO 2. Las celulas A549 se sembraron en F12K + 10% de FBS inactivado por calor, a 2x104 celulas/cirF en placas de seis pocillos durante 24 h a 37°C en una atmosfera de 5% de CO2.

A continuacion, las celulas se lavaron dos veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) antes de ser sometidas a privacion de suero durante 24 horas adicionales. Se agregaron los anticuerpos anti-c-Met (10 pg/ml), mIgG1(10 pg/ml) irrelevante, o HGF (400 ng/mL) en medio DMEM libre de suero a 37C. Despues de 4 horas o 24 horas de incubacion, el medio se retiro suavemente y las celulas se lavaron dos veces con PBS frfa. Las celulas se lisaron con 500 pL de tampon de lisis enfriado con hielo [50 mM de Tris-HCl (pH 7,5); NaCl 150 mM; 1% de Nonidet P40; 0,5% de desoxicolato; y 1 tableta de coctel de inhibidor de proteasa completo mas 1% de antifosfatasas]. Los lisados celulares se agitaron durante 90 min a 4C y se aclararon a 15.000 rpm du rante 10 minutos. En esta etapa, los lisados celulares pudieron almacenarse a -20°C hasta ser necesarios para e l analisis de transferencia western. Se cuantifico la concentracion proteica utilizando BCA. Se separaron los lisados de celulas enteras (5pg en 20 pl) por SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Las membranas se saturaron durante 1 h a TA con TBS-Tween 20 0,1%(TBST); 5% de leche en polvo descremada y se sondearon con anticuerpo anti-c-Met (dilucion 1/1000) durante toda la noche a 413 en TBST-5% de leche en polvo descremada. Los anticuerpos se diluyeron en solucion salina tamponada con TRIS -0,1% de tween 20 (v/v) (TBST) con 1% de leche en polvo descremada. A continuacion, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (dilucion 1:1000) durante 1 h a TA. Las protefnas inmunorreactivas se visualizaron con ECL (Pierce # 32209). Despues de la visualizacion de c-Met, las membranas se lavaron una vez mas con TBST y se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo anti-GAPDH de raton (dilucion 1/200 000) en TBST-5% de leche en polvo descremada. Luego, las membranas se lavaron en TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, durante 1 h a TA. Las membranas se lavaron y GAPDH se revelo utilizando ECL. Se midio la intensidad de banda por densitometrfa.

Los resultados presentados en las figuras 19A y 20A demostraron que tanto m224G11 como h224G11 son capaces de regular en forma descendente y significativamente c-Met, de un modo dependiente de la dosis, en lfneas de celulas A549 y NCI-H441. La regulacion descendente ya es significativa despues de un tiempo de incubacion de 4 horas y siguio aumentando a 24 horas. Los histogramas presentados en las figuras 19A y 20A corresponden a los valores medios o respectivamente 4 y 3 experimentos independientes. Se incluyeron las imagenes de transferencia Western correspondientes a un experimento significativo en las figuras 19B y 20B.

Ejemplo 14: Efecto de m224G11 y su forma humanizada h224G11 sobre la propagacion de c-Met in vitro

Las formas propagadas solubles del receptor c-Met se producen naturalmente en el suero de ratones con xenoinjerto de tumor humano o en suero de paciente humano con tumores que expresan c-Met. Adicionalmente, los anticuerpos dirigidos contra c-Met tales como el Mab DN30, son descritos como inductores de la propagacion de c-Met en experimentos in vitro. Para determinar si el m224G11 como ese tipo de propiedad, las celulas se sembraron en placas de seis pocillos en medio de FCS al 10%. Cuando alcanzaron aproximadamente 80% de confluencia, se retiro el medio y se agrego medio de cultivo completo fresco +/- los compuestos que se van a ensayar. Las celulas se incubaron 72 horas adicionales con m224G11, un control de isotipo mIgG1 o PBS. Se introdujo PMA (acetato de forbol meristato) como un inductor de la propagacion. Tambien se ensayo HGF en celulas para determinar el impacto del ligando de c-Met sobre la propagacion natural. Los sobrenadantes se recolectaron y filtraron en 0,2 pm antes del uso en un ensayo ELISA cuyas formas solubles de c-Met fueron capturadas con un anticuerpo anti-c-Met que no reconoce el mismo epftopo como m224G11 o el c11E1 (figura 21). Ademas, las celulas de cada pocillo se lavaron una vez con PBS y se lisaron para determinar la concentracion proteica. Para el ELISA, 224D10 se utilizo como un anticuerpo de captura y despues saturacion de placas, los sobrenadantes filtrados de placas de seis pocillo se agregaron en el ensayo ELISA. Se utilizo una forma de c-Met monomerica como un control positivo. Despues de la incubacion de los sobrenadantes, las placas se lavaron para eliminar el c-Met no unido y se utilizo c11E1 para detectar c-Met capturado por el Mab 224G11. La revelacion del ensayo se llevo a cabo finalmente mediante la adicion de un anticuerpo policlonal anti-

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hFc HRP-conjugado.

Los resultados mostrados en la figura 22 indican que se produjo una propagacion natural de c-Met cuando las celulas se cultivaron durante 72 horas in vitro. No se observo efecto alguno del mIgGI. Sin embargo, la adicion de m224G11 parecio inhibir la propagacion del c-Met. Estos resultados fueron confirmados para 3 otras lfneas celulares (Hs746T, EBC1 y MKN45) en la figura 23. En ese segundo experimento, el PMA, agregado como un inductor de propagacion positivo, aumento significativamente, segun lo esperado, la propagacion del c-Met por lo menos en 2 lfneas celulares (Hs746T y MKN45). Finalmente, en un tercer experimento (figura 24), se introdujo HGF como un control. No se indujo propagacion adicional por HGF en comparacion con celulas solas o celulas + mIgG1. Una vez mas, se observo una inhibicion significativa de la propagacion de c-Met con m224G11.

Ejemplo 15: Efecto intrfnseco de h224G11 Ab sobre diversas lfneas celulares

En experimentos previos descritos en esta patente, se ha demostrado que, en contraste con lo observado con otros anticuerpos tales como 5D5, el m224G11 y su forma humanizada h224G11 no exhiben actividad intrfnseca significativa en lfneas celulares tumorales. Para extender esta propiedad a otras lfneas celulares, se llevaron a cabo experimentos transferencia western y fosfo-ELISA con el anticuerpo por si solo, agregado en diversos momentos, en un conjunto de lfneas de celulas cancerfgenas, con niveles variables de expresion de c-Met, incluyendo Hs746T, NCI-H441, Hs578T, NCI-H125, T98G, MDA-MB-231, PC3. Tambien se llevo a cabo el mismo ensayo en una celula normal: HUVEC.

El metodo para el ensayo ELISA de fosfo cMet ya fue descrito en el ejemplo 5 de la presente solicitud de patente. Para el analisis western, se prepararon lisados proteicos a partir de celulas peletizadas mediante incubacion en tampon de lisis con proteasas e inhibidores de fosfatasas [10nM Tris (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1mM, EGTA 1mM, 0,5% de Nonidet P40, fluoruro sodico 100 mM, pirofosfato sodico 10 mM, ortovanadato sodico 2 mM, PMSF 2 mM, 10 mg/ml de leupeptina, 10 mg/ml de aprotinina] a 4°C. Se aclararon los lisados proteicos d e restos celulares por centrifugacion, se resolvieron por electroforesis en geles 8% SDS-PAGE, y se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Para los experimentos con c-Met, los lisados fueron inmunoprecipitados para protefna especffica de interes antes de la electroforesis y transferencia.

Los resultados presentados en las figuras 25 a 32 demuestran una vez mas que no se observo actividad intrfnseca alguna del anticuerpo h224G11 en las celulas ensayadas.

Ejemplo 16: Comparacion in vivo del anticuerpo 224G11 murino de tipo salvaje con una forma del 224G11 quimerico genomanipulada en bisagra descrita como 224G11[C2D5-7] (modelo de xenoinjerto NCI-H441).

El NCI-H441 deriva de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa niveles elevados de c-Met y demuestra fosforilacion constitutiva de c-Met RTK.

Para evaluar la necesidad de la genomanipulacion en la region bisagra para proteger la actividad in vivo del anticuerpo murino 224G11, se colocaron en jaulas tapadas con filtro esterilizado ratones atfmicos de seis a ocho semanas de vida, se los mantuvo en condiciones esteriles y se los manipulo de acuerdo con las normas francesas y europeas. A los ratones se les inyecto por via subcutanea 9x106 de celulas NCI-H441. Posteriormente, a los seis dfas del implante celular, fue posible medir los tumores (aproximadamente 100 mm3), se dividio a los animales en grupos de 6 ratones con tamano de tumor comparable y se los trato primero con una dosis de carga de 2 mg de anticuerpo/raton y luego dos veces por semana con 1 mg/dosis de cada anticuerpo a ser evaluado. Se llevo a cabo un seguimiento de los ratones con el fin de observar el fndice de crecimiento del xenoinjerto. El volumen tumoral fue calculado por medio de la formula: p (Pi)/6 X longitud X ancho X alto. Los resultados que se describen en la figura 33 demuestran que el Mab murino desprovisto de toda actividad agonista in vitro, se comporta, segun lo esperado, como un potente antagonista in vivo. Tal como lo sugieren los resultados obtenidos in vitro, en los ensayos de fosforilacion, el anticuerpo con genomanipulacion en la region bisagra 224G11[C2D5-7], que no demostraba un efecto agonista significativo, demuestra una fuerte actividad in vivo, comparable a la del m224G11 en el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

Ejemplo 17: Evaluacion de h224G11 en un ensayo ADCC

Puesto que h224G11 es del isotipo IgG1, el ADCC podrfa ser parte de su eficacia in vivo en seres humanos. Se llevo a cabo un ensayo in vitro de citotoxicidad de liberacion [51Cr] usando ya sea celulas Hs746T o NCI-H441 como celulas objetivo y celulas NK purificadas a partir de linfocitos mononucleares de sangre periferica humana.

En resumen, se incubaron un millon de celulas objetivo Hs746T o NCI-H441 con o sin 20 pg de h224G11 Ab en presencia de 100 pCi de 51Cromo (Perkin Elmer) durante 1 hr. A continuacion, se plaquetearon 4 X 103 celulas con una cantidad creciente de celulas asesinas naturales (NK) aisladas de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) usando una seleccion negativa (Stemcell Technologies). Las celulas se incubaron juntas durante un lapso adicional de 4 horas a 37^3. Se calculo el porcentaje de lisis celular siguiendo la formula: [(liberacion experimental de 51Cr - liberacion espontanea de 51Cr)/(liberacion total de 51Cr - liberacion espontanea

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51Cr)] X 100. La liberacion espontanea representa los recuentos obtenidos cuando las celulas objetivo fueron cultivadas en ausencia de celulas asesinas naturales. La liberacion total representa los recuentos obtenidos cuando las celulas objetivo fueron lisadas con 1% Triton X-100. El h224G11 aumento significativamente la lisis de tanto celulas Hs746T (figura 34A) como NCI-H441 (figura 34B) en un 62.9% y 63.2%, respectivamente, en una relacion de celulas NK/Objetivo de 100.

Ejemplo 18: Estudios Inmunohistoqufmicos (IHC)

Procedimientos para la tincion IHC de tumores incrustados en parafina: Se fraccionaron secciones de 8 a 12 pM de tumor congelado e inmediatamente se las fijo en acetona pre enfriada -20°C durante 3 minutos. Los cortes se enfriaron a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora. Luego de 2 lavados en PBS se bloqueo la actividad de peroxidasa endogena usando reactivo de bloqueo de peroxidasa (Dako K4007) durante cinco minutos. Las secciones fueron lavados con PBS y se incubaron en reactivo de bloqueo avidina/biotina (Dako X0590) inmediatamente antes de la saturacion de los sitios no especfficos en PBS-BSA 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuacion, se incubaron los cortes con h224G11 biotinilado (50 a 10 pg/ml) o IgG1/kappa biotinilado humano (50 a 10 pg/ml, el Sitio de Union) como control negativo durante 2 horas a temperatura ambiente.

Las secciones se lavaron con PBS y se incubaron con complejo universal estreptavidina-peroxidasa (Dako K0679) por espacio de 30 a 45 minutos. Se uso 3-amino-9-etilcarbazol para el desarrollo de un producto de reaccion de color rojo (Sigma). Los cortes fueron sumergidos en hematoxilina durante 4 minutos para contratenir (Dako S3309).

Los resultados estan representados en la figura 35.

El h224G11 tine diferencialmente la membrana celular de diversos tipos de tumor. En este procedimiento inmunohistoqufmico, el producto de reaccion rojo se correlaciona con la tincion positiva de la membrana celular y la falta de producto de reaccion rojo se correlaciona con la tincion negativa y la no visualizacion de la membrana celular. El control IgG, IgG1/kappa humano es un control correlacionado con el isotipo.

Listado de secuencias

<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT

<120> Nuevo anticuerpo anti-cMet

<130> B69202D27117

<140> EP09771324.2 <141 > 2009-12-02

<150> IB2008/055663 <151 > 2008-12-02

<160> 117

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 1

Gly Tyr lie Phe Thr Ala Tyr Thr 1 5

<210> 2 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 2

5

10

15

20

25

30

35

40

lie Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala 1 5

<210>3 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Ser Glu He Thr Thr Glu Phe Asp Tyr 15 10

<210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 4

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr lie Phe Thr Ala Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Glu lie Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 5

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Ala Asn Ser Phe 15 10

<210>6 <211>3 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 6

Arg Ala Ser 1

<210>7 <211>9

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25

30

<212> PRT <213> Mus musculus

<400>7

Gin Gin Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210>8 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 8

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Ala Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 110

<210>9 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 9

Asp 1

lie Val Met

Glu

Arg Ala Thr 20

Ala

Asn Ser 35 Phe

Lys

Leu 50 Leu lie

Arg 65

Phe Ser Gly

Ser

Leu Gin Ala

Glu

Asp Pro Leu 100

Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 5 10

lie Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val 25

Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 70 75

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 85 90

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 105

Ser

Leu 15 Gly

Asp 30

Ser Tyr

Gin

Pro Pro

Val

Pro Asp

Thr

He Ser 80

Gin

Ser 95 Lys

lie 110

Lys Arg

<210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

<400> 10

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Ala Asn Ser Phe Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly val Pro Asp 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 110

<210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 11

ggctacatct tcacagcata cacc 24

<210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 12

attaaaccca acaatgggct ggcc 24

<210> 13 <211> 33 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 13

gccaggagcg aaattacaac agaattcgat tac 33

<210> 14 <211> 354 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 14

5

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20

25

30

35

40

45

caggtccagc tggtgcaatc cggcgcagag gtgaagaagc caggcgcttc egtgaaggtg 60

agctgtaagg cctctggcta catcttcaca gcatacacca tgcactgggt gaggcaagct 120

cctgggcagg gactggagtg gatgggatgg attaaaeeca acaatgggct ggccaactac 180

gcccagaaat tccagggtag ggtcactatg acaagggata ccagcatcag caccgcatat 240

atggagctga gcaggctgag gtctgacgac actgctgtct attattgcgc caggagcgaa 300

attacaacag aattcgatta ctgggggcag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctct 354

<210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 15

gaatctgtgg actcttacgc aaacagcttt 30

<210> 16 <211>9 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 16

agggcttct 9

<210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 17

cagcagtcca aggaggaccc cctgact 27

<210> 18 <211>333 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 18

gacattgtgc tgacecagtc tcccgatagc ctggccgtgt ccctgggcga gagggctacc 60

atcaactgta aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttat gcactggtat 120

cagcaaaagc caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcbtctac cagggagagc 180

ggcgtgcccg ataggttcag oggatctggc agcaggaccg actttacact gaocatctcc 240

agcctgcagg ccgaagatgt ggcagtctat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg 300

actttcgggg gtggtactaa agtggagatc aag 333

<210> 19 <211>333 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

gacattgtga tgacccagtc tcccgatagc ctggccgtgt ccctgggcga gagggctacc 60

atcaactgta aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttat gcactggtat 120

cagcaaaagc caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcttctac cagggagagc 180

ggcgtgcccg ataggttcag cggatctggc agcggcaccg actttacact gaccatctcc 240

agcctgcagg ccgaagatgt ggcagtctat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg 300

actttcgggg gtggtactaa agtggagatc aag 333

<210> 20 <211>333 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 20

gacattgtga tgacccagtc tcccgatagc ctggccgtgt ccctgggcga gagggctacc 60

atcaactgta aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttct gcactggtat 120

cagcaaaagc caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcttctac cagggagagc 180

ggcgtgcccg ataggttcag cggatctggc agcggcaccg actttacact gaccatctcc 240

agcctgcagg ccgaagatgt ggcagtctat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg 300

actttcgggg gtggtactaa agtggagatc aag 333

<210> 21 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> secuencia proteica bisagra artificial de consenso <220>

<221 > MUTAGEN <222> (1)..(1)

<223> Xaa es P o R

<220>

<221 > MUTAGEN <222> (2)..(2)

<223> Xaa es K o R

<220>

<221 > MUTAGEN <222> (3)..(3)

<223> Xaa es S, D o ausente <220>

<221 > MUTAGEN <222> (5)..(5)

<223> Xaa es G, D o ausente <220>

<221 > MUTAGEN <222> (7)..(7)

<223> Xaa es K, H o V

<220>

<221 > MUTAGEN <222> (8)..(8)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<223> Xaa es E, P, T o ausente <220>

<221 > MUTAGEN <222> (10)..(10)

<223> Xaa es P o I

<220>

<221 > MUTAGEN <222> (11 )..(11)

<223> Xaa es P o ausente

<220>

<221 > MUTAGEN <222> (13)..(13)

<223> Xaa es P o T

<400> 21

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa 15 10

<210> 22 <211> 11 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG2 <400> 22

Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 15 10

<210> 23 <211> 12 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 23

Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr 15 10

<210> 24 <211> 12 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 24

Pro Lys Ser Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr 15 10

<210> 25 <211> 12 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 25

Pro Lys Ser Cys Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Pro 15 10

<210> 26 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 26

Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Pro Pro Cys Pro 15 10

<210> 27 <211> 13 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 27

Pro Arg Asp Cys Gly Cys His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 15 10

<210> 28 <211> 12 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 28

Pro Lys Ser Cys Asp Cys His Cys Pro Pro Cys Pro 15 10

<210> 29 <211> 33 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG2 <400> 29

aggaagtgct gtgtggagtg ccccccctgc cca

<210> 30 <211> 36 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia artificial derivada de IgG1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400> 30

ccccgggact gtgggtgcaa gccttgcatt tgtacc 36

<210> 31 <211> 36 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 31

cccaagagct gtgggtgcaa gccttgcatt tgtacc 36

<210> 32 <211> 36 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 32

ccaaag ag ct gcggctgcaa g ccttgtatc tgtccc 36

<210> 33 <211> 39 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 33

ccacgggact gtggctgcaa gccctgccct ccgtgtcca 39

<210> 34 <211> 39 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 34

cccagagact gtgggtgtca cacctgccct ccttgtcct 39

<210> 35 <211> 36 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> bisagra artificial derivada de IgG1 <400> 35

cccaaaag ct g cg attg cca ctgtcctcca tgtcca 36

<210> 36

<211>443 <212> PRT <213> Mus musculus

5 <400> 36

Gin Val Gin Leu Val Gin Sec Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

imagen1

10

Phe

Tyr 370 Pro Ser Asp He Ala 375 Val

Glu 385

Asn Asn Tyr Lys Thr 390 Thr Pro

Phe

Phe

Leu Tyr Ser 405 Lys Leu Thr

Gly

Asn Val Phe 420 Ser Cys Ser val

Tyr

Thr Gin 435 Lys Ser Leu Ser Leu 440

<210> 37 <211>445 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 37

Glu

Trp Glu Ser 380 Asn Gly Gin Pro

Pro

Met Leu 395 Asp Ser Asp Gly Ser 400

Val

Asp 410 Lys Ser Arg Trp Gin 415 Gin

Met 425

Bis Glu Ala Leu His 430 Asn His

Ser

Pro Gly

Gin 1

Val Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala

Ser

Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr lie Phe Thr 30 Ala Tyr

Thr

Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Met

Gly

Trp 50 lie Lys Pro Asn Asn 55 Gly Leu Ala Asn Tyr 60 Ala Gin Lys Phe

Gin 65

Gly Arg Val Thr Met 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 lie Ser Thr Ala Tyr 80

Met

Glu Leu Ser Arg 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 Cys

Ala

Arg Ser Glu 100 lie Thr Thr Glu Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr

Leu

Val Thr 115 Val Ser Ser Ala Ser 120 Thr Lys Gly Pro Ser 125 Val Phe Pro

Leu

Ala 130 Pro Ser Ser Lys Ser 135 Thr Ser Gly Gly Thr 140 Ala Ala Leu Gly

Cys 145

Leu Val Lys Asp Phe 150 Pro Glu Pro Val Thr 155 Val Ser Trp Asn Ser 160

Gly

Ala Leu Thr Ser 165 Gly Val His Thr Phe 170 Pro Ala Val Leu Gin 175 Ser

Ser

Gly Leu Tyr 180 Ser Leu Ser Ser Val 185 Val Thr Val Pro Ser 190

Ser

Ser

Leu

Gly Thr 195 Gin Thr Tyr lie Cys 200 Asn Val Asn His Lys 205 Pro Ser Asn

Thr

Lys 210 Val Asp Lys Arg Val 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Cys His Cys

Pro 225

Pro Cys Pro Ala Pro 230

Phe

Pro Pro Lys Pro 245 Lys

Val

Thr Cys Val 260

Val

Val

Phe

Asn Trp 275 Tyr Val Asp

Pro

Arg 290 Glu Glu Gin Tyr

Thr 305

Val Leu His Gin Asp 310

Val

Ser Asn Lys Ala 325 Leu

Ala

Lys Gly Gin 340 Pro Arg

Arg

Glu Glu 355 Met Thr Lys

Gly

Phe 370 Tyr Pro Ser Asp

Pro 385

Glu Asn Asn Tyr Lys 390

Ser

Phe Phe Leu Tyr 405

Ser

Gin

Gly Asn Val 420 Phe Ser

His

Tyr Thr 435 Gin Lys Ser

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 235 240

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 250 255

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 265 270

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 280 285

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 315 320

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 330 335

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 345 350

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 360 365

lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 375 380

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 395 400

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 410 415

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 425 430

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445

<210> 38 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 38

Asp 1

lie Val Leu Thr 5 Gin

Glu

Arg Ala Thr 20 lie Asn

Ala

Asn Ser 35 Phe Met His

Lys

Leu 50 Leu He Tyr Arg

Arg 65

Phe Ser Gly Ser Gly 70

Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 25 30

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 40 45

Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 55 60

Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 75 80

5

Ser

Leu Gin Ala Glu 85 Asp Val Ala

Glu

Asp Pro Leu 100 Thr Phe Gly Gly

Thr

val Ala 115 Ala Pro Ser val Phe 120

Leu

Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser 135 Val

Pro 145

Arg Glu Ala Lys Val 150 Gin Trp

Gly

Asn Ser Gin Glu 165 Ser Val Thr

Tyr

Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr

His

Lys Val 195 Tyr Ala Cys Glu val 200

Val

Thr 210 Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly

<210> 39 <211> 218 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 39

val

Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Lys

Gly 105

Thr Lys Val Glu lie 110 Lys Arg

He

Phe Pro Pro Ser 125 Asp Glu Gin

Val

Cys Leu Leu 14 0 Asn Asn Phe Tyr

Lys

Val Asp 155 Asn Ala Leu Gin Ser 160

Glu

Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr

Leu 185

Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys

Thr

His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro

Glu

Cys

Asp 1

lie val Met Thr 5 Gin Ser Pro Asp Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly

Glu

Arg Ala Thr 20 lie Asn Cys Lys Ser 25 Ser Glu Ser Val Asp 30 Ser Tyr

Ala

Asn Ser 35 Phe Met His Trp Tyr 40 Gin Gin Lys Pro Gly 45 Gin Pro Pro

Lys

Leu 50 Leu lie Tyr Arg Ala 55 Ser Thr Arg Glu Ser Gly 60 Val Pro Asp

Arg 65

Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Thr Leu Thr lie Ser 80

Ser

Leu Gin Ala Glu 85 Asp Val Ala Val Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Lys

Glu

Asp Pro Leu 100 Thr Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Glu lie 110 Lys Arg

Thr

Val Ala 115 Ala Pro Ser Val Phe 120 lie Phe Pro Pro Ser 125 Asp Glu Gin

Leu

Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser 135 Val Val Cys Leu Leu 140 Asn Asn Phe Tyr

Pro 145

Arg Glu Ala Lys Val 150 Gin Trp Lys Val Asp 155 Asn Ala Leu Gin Ser 160

5

Gly

Asn Ser Gin Glu 165 Ser Val Thr

Tyr

Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr

His

Lys Val 195 Tyr Ala Cys Glu Val 200

Val

Thr 210 Lys Ser Fhe Asn Arg 215 Gly

<210> 40 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 40

Glu

Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr

Leu 185

Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys

Thr

His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro

Glu

Cys

10

Asp 1

lie Val Met Thr 5 Gin Ser Pro

Glu

Arg Ala Thr 20 lie Asn Cys Lys

Ala

Asn Ser 35 Phe Leu His Trp Tyr 40

Lys

Leu 50 Leu He Tyr Arg Ala 55 Ser

Arg 65

Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly

Ser

Leu Gin Ala Glu 85 Asp Val Ala

Glu

Asp Pro Leu 100 Thr Phe Gly Gly

Thr

Val Ala 115 Ala Pro Ser Val Phe 120

Leu

Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser 135 Val

Pro 145

Arg Glu Ala Lys Val 150 Gin Trp

Gly

Asn Ser Gin Glu 165 Ser Val Thr

Tyr

Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr

His

Lys Val 195 Tyr Ala Cys Glu Val 200

Val

Thr 210 Lys Ser Phe Asn Arg 215 Gly

<210> 41 <211> 1332 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 41

Asp

Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly

Ser 25

Ser Glu Ser Val Asp 30 Ser Tyr

Gin

Gin

Lys Pro Gly 45 Gin Pro Pro

Thr

Arg Glu Ser 60 Gly Val Pro Asp

Thr

Asp Phe 75 Thr Leu Thr lie Ser 80

Val

Tyr 90 Tyr Cys Gin Gin Ser 95 Lys

Gly 105

Thr Lys Val Glu lie 110 Lys Arg

lie

Phe Pro Pro Ser 125 Asp Glu Gin

Val

Cys Leu Leu 140 Asn Asn Phe Tyr

Lys

Val Asp 155 Asn Ala Leu Gin Ser 160

Glu

Gin 170 Asp Ser Lys Asp Ser 175 Thr

Leu 185

Ser Lys Ala Asp Tyr 190 Glu Lys

Thr

His Gin Gly Leu 205 Ser Ser Pro

Glu

Cys

caggtccagc tggtgcaatc cggcgcagag agctgtaagg cctctggcta catcttcaca cctgggcagg gactggagtg gatgggatgg gcccagaaat tccagggtag ggtcactatg atggagctga gcaggctgag gtctgacgac attacaacag aattcgatta ctgggggcag accaagggcc caagcgtgtt cccgctagcg gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac agcggagccc tgaccagcgg cgtgcacacc tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgcca tgtaacgtgg accacaagcc cagcaacacc wGFby'byyay'L ^CCCCCCCuy CCC&yCGGCC

ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc

gtggacgtgt cccacgagga ccccgaggtg

gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag

tccgtgctga ccgtggtgca ccaggactgg

tccaacaagg gcctgccagc ccccatcgaa

agagagccac aggtctacac cctgcccccc

tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac

aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc

ttcttcctgt acagcaagct gacagtggac

agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac

tccccaggct ga

<210> 42 <211> 1341 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

gtgaagaagc

caggcgcttc cgtgaaggtg 60

gcatacacca

tgcactgggt gaggcaagct 120

attaaaccca

acaatgggct ggccaactac 180

acaagggata

ccagcatcag caccgcatat 240

actgctgtct

attattgcgc caggagcgaa 300

ggcaccctgg

tgaccgtgtc ctetgccagc 360

ccctgctcca

gaagcaccag cgagagcaca 420

ttccccgagc

ccgtgaccgt gtcctggaac 480

ttccccgccg

tgctgcagag cagcggcctg 540

agcagcaact

tcggcaccca gacctacacc 600

aaggtggaca

agaccgtgga gaggaagtgc 660

GGoyuyyGGy

yaGGGoyGyu QttCCt^utG f

agcagaaccc

ccgaggtgac ctgtgtggtg 780

cagttcaact

ggtacgtgga cggcgtggag 840

gagcagttta

acagcacctt ccgggtggtg 900

ctgaacggca

aggagtacaa gtgtaaggtc 960

aagaccatca

gcaagaccaa gggacagcca 1020

agcagggagg

agatgaccaa gaaccaggtg 1080

ccaagcgaca

tcgccgtgga gtgggagagc 1140

acccccccaa

tgctggacag cgacggcagc 1200

aagagcagat

ggcagcaggg caacgtgttc 1260

aaccactaca

cccagaagag cctgagcctg 1320

1332

<400> 42

10

caggtccagc

agctgtaagg

cctgggcagg

gcccagaaat

tggtgcaatc

cctctggcta

gactggagtg

tccagggtag

cggcgcagag

catcttcaca

gatgggatgg

ggtcactatg

gtgaagaagc

gcatacacca

attaaaccca

acaagggata

caggcgcttc

tgcactgggt

acaatgggct

ccagcatcag

cgtgaaggtg

gaggcaagct

ggccaactac

caccgcatat

60

120

180

240

5

10

atggagctga gcaggctgag gtctgacgac actgctgtct attattgcgc caggagcgaa 300

attacaacag aattcgatta ctgggggcag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctctgccagc 360

accaagggcc caagcgtgtt cccgctagcc ccgtcttcaa agagtacctc aggcggaact 420

gccgctcttg gttgccttgt gaaggactat tttcctgagc ccgtgacggt cagctggaac 480

tctggcgcac tgactagcgg cgtacacaca ttccctgcgg tgctccaaag ttccgggctg 540

tactcactgt cctccgttgt gaccgttcca tctagttccc tcgggacaca gacatacatc 600

tgtaatgtga atcataagcc ttcaaacacc aaggtcgaca aacgggtcga gcccaaaagc 660

tgcgattgcc actgtcctcc atgtccagcc cccgaactgt tgggcggacc gagcgtgttc 720

ttgtttccac ccaagcccaa agataccctc atgatcagca gaacccccga ggtgacctgt 780

Q A A

ua ^etu

gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtacaacag cacctacagg 900

gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgt 960

aaggtgtcca acaaggccct gccagcccca atcgaaaaga ccatcagcaa ggccaagggc 1020

cagccaagag agccccaggt gtacaccctg ccacccagca gggaggagat gaccaagaac 1080

caggtgtccc tgacctgtct ggrtgaagggc ttctacccaa gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac 1200

ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac 1260

gtgttcagct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaaco actacaccca gaagagcctg 1320

agcctgtcce caggcaagtg a 1341

<210> 43 <211>657 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 43

gacattgtgc

tgacccagtc tcccgatagc ccctgggcga gagggctacc 60

atcaactgta

aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttat gcactggtat 120

cagcaaaagc

caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcttctac cagggagagc 180

ggcgtgcccg

ataggttcag cggatctggc agcaggaccg actttacact gaccatctcc 240

agcctgcagg

ccgaagatgt ggcagtctat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg 300

actttcgggg

gtggtactaa agtggagatc aagcgtacgg tggccgctce cagcgtgttc 360

atcttccccc

caagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420

aacaacttct

accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 480

ggcaaoagcc

aggagagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540

agcaccctga

ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600

acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctga 657

<210> 44 <211>657 <212> ADN <213> Mus musculus

5

10

15

20

<400> 44

gacattgtga tgacccagtc tcccgatagc ctggccgtgt ccctgggcga gagggctacc 60

atcaactgta aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttat gcactggtat 120

cagcaaaagc caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcttctac cagggagagc 180

ggcgtgcccg ataggttcag cggatctggc agcggcaccg actttacact gaccatctcc 240

agcctgcagg ccgaagatgt ggcagtetat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg 300

actttcgggg gtggtactaa agtggagatc aagcgtacgg tggccgctcc cagegtgtte 360

atottccccc caagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420

aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 480

ggcaacagcc aggagagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540

agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600

acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctga 657

<210> 45 <211>657 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 45

gacattgtga tgacccagtc tcccgatagc ctggccgtgt ccctgggcga gagggctacc 60

atcaactgta aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttet gcactggtat 120

cagcaaaagc caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcttctac cagggagagc 180

ggcgtgcccg ataggttcag cggatctggc agcggcaccg actttacact gaccatctcc 240

agcctgcagg ccgaagatgt ggcagtetat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg 300

actttcgggg gtggtactaa agtggagatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360

atcttccccc caagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420

aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 480

ggcaacagcc aggagagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540

agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600

acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctga 657

<210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 46

Glu 1

Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser

Ser

Val Lys lie 20 Ser Cys Lys

Thr

Met His 35 Trp Val Arg Gin

Gly

Gly 50 He Lys Pro Asn Asn 55

Lys 65

Gly Lys Ala Thr Leu 70 Thr

Met

Asp Leu Arg Ser 85 Leu Thr

Ala

Arg Ser Glu 100 lie Thr Thr

Ala

Leu Thr 115 Val Ser Ser

<210> 47 <211> 112 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 47

Gly

Pro Glu 10 Leu Val Lys Pro Gly Ala 15

Thr

Ser 25 Gly Tyr lie Phe Thr 30 Ala Tyr

Ser 40

Leu Gly Glu Ser Leu 45 Asp Trp lie

Gly

Leu Ala Asn Tyr 60 Asn Gin Lys Phe

Val

Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80

Ser

Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Glu

Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr

10

15

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30

Ala Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Lys

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg 100 105 110

<210> 48 <211> 354 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 48

gaggtccagc tgcagcagag cgggccagaa

20

agctgtaaga ccagcggtta catctttaca ctgggggaat ctctggactg gatcggaggt aatcaaaaat tcaagggcaa agccacactg atggatctga gaagcctgac atccgaggac atcactaccg agttcgacta ttggggacag

ctggttaaac ctggcgccag cgtgaagatt 60 gcatatacca tgcactgggt gaggcagagt 120 attaagccca acaatggcct ggctaactat 180 accgtcgata agtcctcttc cacagcttac 240 agtgcagtgt actactgcgc ccggtctgag 300 ggcactgcac tgaccgtctc ctcc 354

<210> 49 <211>333 <212> ADN

5 <213> Mus musculus

<400> 49

gatattgtgc tgacacagtc tcccgcaagc ctcgctgtta gcctgggtca acgggocaca

60

attagttgtc gcgcctctga atccgtcgac tcttatgcta acagctttat gcactggtat

120

caacagaagc ccgggcagcc acctaaactg ctgatctaca gggccagcaa tctggagagt

180

ggcatcccag ctagatttag cggttccggg tccaggaccg acttcactct gaccatcaac

240

cccgtggagg cagacgacgt ggccacttac tactgccagc agtctaaaga ggatcccctc

300

10

15

acattcggct ccggaacaaa gctggaaatg aag

<210> 50 <211>443 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 50

333

Glu 1

Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Ala

Ser

Val Lys lie 20 Ser Cys Lys Thr Ser 25 Gly Tyr lie Phe Thr 30 Ala Tyr

Thr

Met His 35 Trp Val Arg Gin Ser 40 Leu Gly Glu Ser Leu 45 Asp Trp lie

Gly

Gly 50 He Lys Pro Asn Asn 55 Gly Leu Ala Asn Tyr 60 Asn Gin Lys Phe

Lys 65

Gly Lys Ala Thr Leu ■70 Thr Val Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80

Met

Asp Leu Arg Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Ala

Arg Ser Glu 100 He Thr Thr Glu Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr

Ala

Leu Thr 115 Val Ser Ser Ala Ser 120 Thr Lys Gly Pro Ser 125 Val Phe Pro

Leu

Ala 130 Pro Cys Ser Arg Ser 135 Thr Ser Glu Ser Thr 140 Ala Ala Leu Gly

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190

Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin 260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300

Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 325 330 335

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

Asn

160

Gin

Ser

Ser

Cys

Phe

240

Val

Phe

Pro

Thr

Val

320

Thr

Arg

Gly

Pro

Ser

400

Gin

His

<210> 51 <211>446 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 51

Claims (24)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Anticuerpo monoclonal, o fragmento funcional divalente del mismo, que puede inhibir la dimerizacion de c- Met, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n°: 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoacidos SEC ID n°: 5, 6 y 7, estando dicho anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo caracterizado ademas por que comprende asimismo una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 22, 23, 24, 26, 28, 59 a 63 y 65 a 71.
2. 2. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 1, caracterizado por que dicha region bisagra comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n°: 24, 26 y 28 y SEC ID n°: 59 a 63 y 65 a 71.
3. 3. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que consiste en un anticuerpo quimerico.
4. 4. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que consiste en un anticuerpo humanizado.
5. 5. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 4, caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 4; y un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 8, 9 o 10.
6. 6. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 5, caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 8; y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 28.
7. 7. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 5, caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 9; y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 28.
8. 8. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 5, caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 10; y una region bisagra que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 28.
9. 9. Anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo segun la reivindicacion 8, caracterizado por que comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n°: 40.
10. 10. Acido nucleico aislado, caracterizado por que es seleccionado de entre los acidos nucleicos siguientes:

    a) un acido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 9;

    b) un acido nucleico como se define en a) y que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID n°: 11, SEC ID n° 12, SEC ID n° 13 y las secuencias SEC ID n°: 15, SEC ID n°: 16 y SEC ID n°: 17;

    c) un acido nucleico como se define en a) o b) y que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID n°: 14 y SEC ID n°: 18, 19 o 20;

    d) los acidos nucleicos de ARN correspondientes de los acidos nucleicos de ADN como se definen en a), b) o c); y

    e) los acidos nucleicos complementarios de los acidos nucleicos como se definen en a), b) y c).
11. 11. Acido nucleico aislado segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la secuencia nucleica que codifica la region bisagra de dicho anticuerpo comprende la secuencia de acidos nucleicos de una de SEC ID n°: 29, 30, 31, 33, 35, 74 a 78 y 80 a 86 cuando dicha region bisagra presenta respectivamente una de las secuencias SEC ID n°: 22, 23, 24, 26, 28, 59 a 63 y 65 a 71.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40
12. 12. Vector que comprende un acido nucleico segun la reivindicacion 10 u 11.
13. 13. Celula hospedadora que comprende un vector segun la reivindicacion 12.
14. 14. Animal transgenico con la excepcion del ser humano que comprende por lo menos una celula transformada mediante un vector segun la reivindicacion 13.
15. 15. Procedimiento para la produccion de un anticuerpo, o un fragmento funcional divalente del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:

    a) cultivar en un medio y en las condiciones de cultivo adecuadas una celula segun la reivindicacion 13; y

    b) recuperar dicho anticuerpo, o un fragmento funcional divalente del mismo, producido asf a partir del medio de cultivo o dichas celulas cultivadas.
16. 16. Anticuerpo segun las reivindicaciones 1 a 9 como un medicamento.
17. 17. Composicion que comprende a modo de principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo, o un fragmento funcional divalente del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 9 o 16.
18. 18. Composicion segun la reivindicacion 17 como un medicamento.
19. 19. Anticuerpo, o fragmento funcional divalente del mismo, segun las reivindicaciones 1 a 9 o 16, o composicion segun las reivindicaciones 17 o 18, para la utilizacion en la inhibicion del crecimiento y/o la proliferacion de las celulas tumorales.
20. 20. Anticuerpo, o fragmento funcional divalente del mismo, segun las reivindicaciones 1 a 9 o 16, o composicion segun las reivindicaciones 17 o 18, para la utilizacion en la prevencion o el tratamiento del cancer.
21. 21. Anticuerpo, o fragmento funcional divalente del mismo, o composicion, para la utilizacion segun la reivindicacion 20, caracterizado/a por que dicho cancer es un cancer seleccionado de entre cancer de prostata, osteosarcomas, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de endometrio, glioblastoma o cancer de colon.
22. 22. Anticuerpo, o fragmento funcional divalente del mismo, o composicion, para la utilizacion segun la reivindicacion 20 o 21, caracterizado/a por que dicho cancer es un cancer relacionado con la activacion de Met dependiente o independiente de HGF.
23. 23. Metodo de diagnostico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresion o una subexpresion del receptor c-Met a partir de una muestra biologica en la que se sospecha de la presencia anormal del receptor c- Met, caracterizado por que dicho metodo comprende una etapa en la que dicha muestra biologica se pone en contacto con un anticuerpo segun las reivindicaciones 1 a 9.

    Luminiscencia (cpm)

    12 000 000 10 000 000 8 000 000 6 000 000 4 000 000 2 000 000 0-

    0 Solo

    ■+HGF[100 ng/ml]

    imagen1

    PBS

    lgG1 murina (irrelevante) lgG1/k humana (irrelevante)

    FIG. 1

    imagen2

    [224G11]Hz3/lgG1

    [224G11lHz2/lgG1

    f224G11lHz1/laG1

    [224G11]quim/lgG1

    m[224G11]

    HGF [100ng/ml]

    dOH 3P ouijX^UJ OJD3J3 ap %

    3

    imagen3

    [224G11]Hz3/lgG1 [224G11]Hz2/lgG1 [224G11]Hz1/tgG1 [224G11]quim/lgG1 rn[224G11 ]

    a

    C4

    d

    S

    dOH oujix^ui opap ap U9p;qmu; ap %

    104

    % de inhibicion de efecto

    imagen4

    % de inhibicidn de efecto

    imagen5

    107

    imagen6

    VS f)IJ

    m[224G11] [224G11] [224G11] [224011] [224G11] [224G11]

    PgG1-quim] [TH7-quim] [TH7-Hz1] [TH7-Hz2] [TH7-Hz3]

    imagen7

    108

    imagen8

    FIG. 6A

    £96|U ts6m i.E>6|W tMuga

    imagen9

    109

    imagen10

    FIG. 7A

    uiinbluot'ZZ) U-OfrZZUJ |0J}UO3

    imagen11

    imagen12

    HGF 500 ng/ml - + - + - + - + - + - +

    control [224G111quim [224<3i1] [224G11] (224G11) [224G111

    [MH quim] [MUP9H quimj [MMCH qulm] [TH7 qulm)

    imagen13

    FIG. 8B

    imagen14

    112

    imagen15

    FIG. 10A

    UOfrZZUi [uuinb 2o6|IuOfZZ] mmHllSKZl lofluoo

    imagen16

    113

    imagen17

    imagen18

    114

    2

    P

    6

    imagen19

    S

    P

    bJ

    uiinb(uor3d UOtZV* io6|ui

    CPMA

    ►o *«. Qa c

    c

    i|§!

    8 Q

    imagen20

    CPMA

    25000

    20000

    15000

    10000

    5000

    imagen21

    HQF * - + - + + - + -+ - +

    imagen22

    mlgG1

    A.

    Y"~

    m224G11

    [224G11]

    quim

    -A,

    _A.

    [224G11]

    [Hz1]

    —y—

    [224G11]

    [Hz2]

    A

    -----y—

    C224G11]

    [Hz3]

    A

    A

    m5D5

    J

    imagen23

    mlgGl m224G11

    ----V—

    J224G11}chim

    imagen24

    + - + - + - + - +

    imagen25

    (224611) (224611] [224611] (224611) mSDS

    (MHquimj [MUPflHquIml (MMCHquhn) (TH7t|irim]

    117

    imagen26

    m»flGl m3 74Q1 [324011] qulm [324011] [334011] [334011] m50S

    [TM7quJm] [TH7Hl1] [TH7Hz3]

    H + f +

    § i i i i i

    imagen27

    Volumen tumoral (mm3)

    imagen28

    M

    P

    f Hlft nun

    M M M ft N) ft

    | g | | | |

    1 i | - -

    ■** -s

    x 5 £

    imagen29

    £ I +

    I I I I

    imagen30

    t +

    £ £

    Volumen tumoral (mm3)

    imagen31

    % de efecto mix. de HGF

    §88

    P

    <1

    >

    C224G11 C224G11 [TH7] c224311 [G2] C224G11 [C3] C224G11 [C5] C224311 [06] C224G11 [C7] C224311 [A1-3] C224311 [C7A6] C224311 [C6A9] C224311 [C2A5-7] C224G11 [CSA2-6] C224G11 [C9A2-7] C224G11 [AS6-7-8]

    r

    c

    120

    imagen32

    81 OIJ

    control HGF [500 ng/ml] C224G11 C224G11 [TH7] C224G11 [C2] C224G11 [C3] C224G11 [C5] C224G11 [C6] C224G11 [C7] C224G11 [A 1-3] C224G11 [C7A6] C224G11 [C6A9] C224G11 [C2A5-7] C224G11 [C5A2-6] C224G11 [C9A2-7] C224G11 [A 5-6-7-8]

    imagen33

    imagen34

    FIG. 19

    imagen35

    imagen36

    ELISA

    anti-hFc conjugado con HRP

    Contro Positivo:

    Ensayo:

    c-Met monomerico 6 Sobrenadante celular

    Y 224D10

    ////////////////////

    FIG- 21

    NC -H441

    no lg

    m lgG1

    -&-m 224G11

    Dilucion

    FIG. 22

    125

    imagen37

    imagen38

    126

    NCI-H441

    imagen39

    Hs746T

    EBC-1

    m !gG1 m 224G11 PMA

    -*-HGF400ngfriL

    imagen40

    —•—sin Ig -m—m lgG1 —m 224G11 -*-HGF -*-PMA

    imagen41

    imagen42

    imagen43

    P

    imagen44

    imagen45

    Celulas

    hlgG1,2 min

    hlgG1,15 min

    hz224G11,2 min hz224G11,15 min HGF, 15 min

    t

    imagen46

    imagen47

    s

    imagen48

    w

    I

    ■o

    ■%

    I

    L

    i

    !

    oi
24. 3.

    Celulas

    imagen49

    C6lulas

    NJ

    CD

    imagen50

    PBS HGr hz2246U

    imagen51

    FIG. 28

    oe u

    imagen52

    Ensayo ELISA de fosfo c-Met

    Celulas

    A

    imagen53

    P8S HSF hz224&U

    imagen54

    C6lulas

    CO

    ro

    A

    12000 000 10000 000 eoooooo 6 000 000 4 000 000 2000 000 0

    imagen55

    2 min 15 min 2 min 15 min 2 min 15 min

    PBS H6F hz224Gll

    imagen56

    SFM hlgSl hz224Sll H&F

    @ Sombra en linea de Western Blot

    133

    B

    imagen57

    imagen58

    imagen59

    SFM

    pY«M-*/MET

    2 min

    15 min

    15 min

    HGF

    15 min

    hlgGl

    hz224£ll

    134

    imagen60

    ;hz224G11,15 min

    9i

    8 —

    imagen61

    2 min 2 min 15 min 2 min 15 min 15 min

    SFM hlgSl hz224611 HSF

    135

    FIG. 33

    tz-sazol worn*

    -xroco^cncD-vjcocoo oooooooooo oo ooooooooo

    imagen62

    136

    imagen63

    Relaci6n NK/HS-746T

    hz224Gll

    -n- nl

    60"

    SO-_

    40"

    20"

    10

    0" ■

    X

    % Lisis

    Relacidn NK/NCI-H441

    hz224Gll

    imagen64