ES2627933T3 - Péptido y el uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 5.

Description

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DESCRIPCION

Peptido y el uso del mismo Campo de la invencion

Esta divulgacion se refiere a un peptido natural que tiene efectos analgesicos potentes y efecto contra el virus de la gripe, su polinucleotido codificador, la preparacion y usos del mismo y una composicion farmaceutica que contiene dicho peptido.

Antecedentes de la invencion

El dolor es una sensacion desagradable causada a menudo por estimulos intensos o daninos. La Asociacion Internacional para el Estudio del Dolor ha definido de forma amplia "dolor" como "una experiencia sensorial y emocional desagradable asociada con una dano tisular real o potencial, o descrita en terminos de dicho dano". (Pain 1979;6:247-8). El dolor es el motivo mas comun para la consulta medica en los Estados Unidos (Raj PP. Taxonomy and classification of pain. En: Niv D, Kreitler S, Diego B, Lamberto A. The Handbook of Chronic Pain. Nova Biomedical Books 2007). Es un sintoma importante en muchas afecciones y puede interferir significativamente con la calidad de vida y el funcionamiento general de una persona (Breivik H, Borchgrevink PC, Allen SM, Rosseland LA, Romundstad L, Hals EK, Kvarstein G, Stubhaug A. Assessment of pain. Br J Anaesth. 2008;101(1):17-24). En la mayoria de los casos, el dolor es habitualmente transitorio, durando solamente hasta que el estimulo nocivo se retira o el dano o la patologia subyacente se ha curado. Sin embargo, algunas afecciones dolorosas, tales como artritis reumatoide, neuropatia periferica, cancer y dolor idiopatico, pueden persistir durante anos. El dolor que dura mucho tiempo se denomina "cronico" y el dolor que se resuelve rapidamente se denomina "agudo". Tradicionalmente, la distincion entre dolor agudo y dolor cronico se ha basado en un intervalo arbitrario de tiempo desde la aparicion; los dos marcadores mas comunmente usados son 3 meses y 6 meses desde el inicio del dolor (Turk DC, Okifuji A. Pain terms and taxonomies of pain. En: Bonica JJ, Loeser JD, Chapman CR, Turk DC, Butler SH. Bonica's management of pain. Hagerstwon, MD: Lippincott Williams y Wilkins; 2001), aunque algunos investigadores han colocado la transicion de dolor agudo a cronico a los 12 meses (Spanswick CC, Main CJ. Pain management: an interdisciplinary approach. Edimburgo: Churchill Livingstone 2000). Otros aplican "agudo" al dolor que dura menos de 30 dias, "cronico" al dolor de mas de seis meses y "subagudo" al dolor que dura de uno a seis meses (Thienhaus O, Cole BE. Classification of pain. En: Weiner R. Pain management: a practical guide for clinicians. Boca Raton: CRC Press; 2002).

En los seres humanos, la deteccion del dolor periferico comienza en las terminaciones nerviosas libres. Los nociceptores polimodales y mecanorreceptores de alto umbral detectan estimulos nocivos tales como fuerzas mecanicas fuertes, H+, K+, productos quimicos y temperatura. Tras la deteccion de los estimulos, la sensacion de dolor se desplaza desde la periferia hasta la medula espinal (es decir, la via espinotalamica), a continuacion hace decusacion y cruza a traves de la comisura blanca anterior (en la medula espinal) antes de ascender de forma contralateral. Antes de llegar al cerebro, la via espinotalamica se divide en la via neoespinotalamica lateral y la via paleoespinotalamica medial (Skevington, S. M. Psychology of pain. Chichester, Reino Unido: Wile 1995; pag.18), terminando posteriormente en el nucleo ventral posterolateral del talamo, donde hacen sinapsis con las dendritas de la corteza somatosensitiva. Aparte de los estimulos nocivos que causan dolor, las lesiones de un nervio periferico en los seres humanos a menudo dan como resultado una afeccion de dolor neuropatico persistente que se caracteriza por dolor espontaneo, generalmente ardor, alodinia (respuestas de dolor a estimulos no nocivos) e hiperalgesia (respuestas de dolor exagerado a estimulos nocivos). Aunque el tratamiento simpaticolitico a veces es eficaz para aliviar el dolor, lo que indica que el dolor neuropatico al menos en parte se mantiene por la actividad en el sistema nervioso simpatico, muchos pacientes no responden. La eficacia de los opioides para el dolor neuropatico tambien es limitada (Rowbotham MC. Ann Neurol 1994;35:S46-S49), y algo controvertida.

El dolor agudo generalmente se controla con medicamentos tales como analgesicos y anestesicos. El control del dolor cronico o del dolor neuropatico, sin embargo, es mucho mas dificil. Muchos farmacos ayudan a aliviar el dolor agudo, y en general, se pueden dividir en farmacos no opioides y opioides. Los farmacos no opioides incluyen farmacos antinflamatorios no esteroides (AINE), tales como acido acetilsalicilico (aspirina) e inhibidores de la COX-2 (ciclooxigenasa-2). El termino "no esteroide" en los AINE se usa para distinguir estos farmacos de los esteroides, que, entre una amplia gama de otros efectos, tienen una accion antinflamatoria depresora icosanoide similar. Como analgesicos, los AINE son no narcoticos inusuales. Los AINE estan indicados generalmente para el tratamiento de afecciones agudas o cronicas donde el dolor y la inflamacion estan presentes.

La aspirina se usa a menudo como analgesico para aliviar dolores y molestias menores, como antipiretico para reducir la fiebre o como medicamento antinflamatorio. La aspirina funciona bien para el dolor sordo y pulsatil, pero es ineficaz para el dolor causado por la mayoria de los calambres musculares, hinchazon, distension visceral e irritacion cutanea aguda. Como analgesico posquirurgico, la aspirina es inferior a uno de los AINE, el ibuprofeno, y tiene una mayor toxicidad gastrointestinal. Ademas, la aspirina tambien tiene muchas contraindicaciones y efectos indeseables; por ejemplo, el uso de aspirina debe ser cauteloso en personas con ulceras pepticas, diabetes leve o gastritis. Incluso si ninguna de estas afecciones esta presente, todavia hay un riesgo aumentado de sangrado

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estomacal. La otra categoria de AINE es el inhibidor selectivo de la COX-2 que selecciona como diana directamente a la COX-2, una enzima responsable de la inflamacion y el dolor. La selectividad de la seleccion como diana de la COX-2 reduce el riesgo de ulceracion peptica y es la funcion principal del celecobix, rofecoxib y otros miembros de esta categoria de farmacos. Los inhibidores de la COX-2 tambien tienen efectos adversos, sobre todo un riesgo aumentado de insuficiencia renal, y algunos resultados han mostrado un aumento en el riesgo de infarto de miocardio, trombosis y apoplejia por un aumento relativo de tromboxano. Cabe destacar que Rofecoxib (comunmente conocido como Vioxx) se retiro del mercado en 2004 debido a estas preocupaciones.

Una categoria alternativa de analgesicos son los farmacos opioides. Un opioide es un producto quimico psicoactivo que actua uniendose a los receptores opioides, que se encuentran principalmente en el sistema nervioso central y periferico y en el tubo gastrointestinal. Los receptores en estos sistemas de organos median tanto los efectos beneficiosos como los efectos secundarios de los opioides. Los efectos analgesicos de los opioides se deben a una percepcion del dolor disminuida, reaccion al dolor disminuida, asi como a una tolerancia al dolor aumentada. Los opioides se han usado durante mucho tiempo para tratar el dolor agudo (tal como el dolor posoperatorio) y son muy valiosos en los cuidados paliativos para calmar el dolor intenso, cronico e incapacitante de afecciones terminales tales como el cancer y afecciones degenerativas tales como la artritis reumatoide. Sin embargo, los opioides se deben usar con mucha cautela en el dolor cronico no relacionado con el cancer. No se requieren necesariamente dosis altas para controlar el dolor de enfermedades avanzadas o en fase terminal. Es muy probable que se produzca tolerancia (una reaccion fisica que hace que el organismo responda menos a analgesicos y otros efectos), haciendo que el opioide sea la ultima opcion para controlar el dolor.

Del analisis anterior, esta claro que existe una necesidad urgente de desarrollar una nueva clase de analgesicos eficaces no tolerantes y no sedantes para controlar tanto el dolor agudo intenso como el dolor cronico.

Se ha usado una mezcla de agentes bioactivos extraidos del tejido cutaneo de conejos con inflamacion provocada por la inoculacion del virus de la variolovacuna, que contiene inhibidores contra el sistema calicrefno-cinfnico, para el tratamiento del dolor durante decadas (K. Ono, A. Inoue y M. Nakamuro. Jpn Pharmacol Ther, 1981;9:299-307). Los experimentos farmacologicos y clinicos mostraron que dicha mezcla de agentes bioactivos preparados a partir de la piel de conejo tiene efectos analgesicos contra todos los tipos de neuralgia sintomatica, lumbago, colecistalgia, angina, dolores de embolia arterial, dolores agudos de heridas, quemaduras y escaldaduras, dolores quirurgicos o posquirurgicos, dolor de ulcera peptica, dismenorrea, dolores de parto posteriores al parto, cefalea, dolores provocados por diversos tumores y asi sucesivamente. Los estudios tambien mostraron que esta mezcla de agentes bioactivos puede promover eficazmente la activacion de los macrofagos, inhibir significativamente la actividad anticomplemento en la reaccion alergica de tipo II. Los efectos tienen correlacion lineal con las dosis. Por tanto, los farmacos tienen efectos sobre la inhibicion de la reaccion inflamatoria correlacionada con la inmunidad y la mejora de la funcion de inmunidad. Ademas, despues de una administracion intraperitoneal continua de 28 dias de los farmacos preparados a partir de la piel de conejo en ratas, no murieron ratas y no hubo cambios provocados por los farmacos en examenes de orina, ojos, bioquimica sanguinea, patologia y anatomia. Por lo tanto, dichos analgesicos tienen pocos efectos toxicos (vease la solicitud de patente de EE. UU. numero: 20110003009). El documento WO 2005/019434 divulga fragmentos que incluyen fragmentos de extremo N de alfa-1-antitripsina de mamifero y su uso para aliviar o mejorar el dolor asociado con enfermedades bacterianas tales como carbunco. El documento US 2008/261869 divulga composiciones de peptidos derivadas de alfa-1-antitripsina que tienen actividad de alfa-1- antitripsina pero ninguna actividad inhibidora significativa de la serina proteasa para su uso en la inhibicion o tratamiento de una infeccion bacteriana incluyendo dolor asociado con la infeccion bacteriana o una infeccion virica tal como la gripe A.

Sin embargo, aunque la investigacion de peptidos sobre el diseno de farmacos y el descubrimiento de farmacos es uno de los campos mas prometedores en el desarrollo del nuevo farmaco, no hubo informes de que los investigadores en este campo se centraran en investigar los ingredientes proteinicos activos en la mezcla, aunque dicha mezcla ha estado en el mercado durante varias decadas y con buenos efectos de analgesia. Por lo tanto, la identificacion del/de los ingrediente(s) activo(s) ayudara a comprender el/los mecanismo(s) de actuacion y la purificacion de los componentes exactos responsables de los efectos analgesicos facilitara la preparacion de farmaco(s) bien delineado(s) para uso clinico.

El virus de la gripe A es un genero de la familia de virus Orthomyxoviridae. Se han aislado cepas de todos los subtipos del virus de la gripe A a partir de aves silvestres, aunque la enfermedad es infrecuente. Algunos aislados del virus de la gripe A causan una enfermedad grave tanto en las aves domesticas como, rara vez, en los seres humanos ("Gripe aviar ("peste aviar") - Cartilla informativa. OMS.) Ocasionalmente, los virus se transmiten de aves acuaticas silvestres a aves domesticas, y esto puede causar un brote o dar lugar a pandemias de gripe humana (Klenk et al. (2008). "Avian Influenza: Molecular Mechanisms of Pathogenesis and Host Range". Animal Viruses: Molecular Biology. Caister Academic Press y Kawaoka Y, ed. (2006).

Influenza Virology: Current Topics. Caister Academic Press). Los virus de la gripe A son virus de ARN segmentados, monocatenarios y de sentido negativo. Existen varios subtipos, marcados de acuerdo con un numero H (para el tipo de hemaglutinina) y un numero N (para el tipo de neuraminidasa). Existen al menos 16 antigenos H (HI a H16) diferentes y nueve antigenos N (N1 a N9) diferentes. Diferentes virus de la gripe codifican diferentes proteinas de

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hemaglutinina y neuraminidasa; por ejemplo, el virus H5N1 designa un subtipo de gripe A que tiene una proteina de hemaglutinina (H) de tipo 5 y una proteina de neuraminidasa (N) de tipo 1. Ademas, cada subtipo de virus ha mutado a una variedad de cepas con diferentes perfiles patogenos; algunos son patogenos para una especie pero no para otras y algunos son patogenos para multiples especies. Teoricamente, son posibles 144 combinaciones diferentes de estas proteinas ("Virus de la gripe". Centros para el Control y Prevencion de Enfermedades. 18 de noviembre de 2005). Algunas variantes se identifican y se nombran de acuerdo con el aislado al que se asemejan, por lo que se presume que comparten el linaje (ejemplo: similares al virus de la gripe de Fujian), de acuerdo con su huesped tipico (ejemplo: virus de la gripe humana), de acuerdo con su subtipo (ejemplo: H3N2) y de acuerdo con su mortalidad (ejemplo: PP, poco patogeno). Por tanto, una gripe de un virus similar al aislado A/Fujian/411/2002 (H3N2) se denomina gripe de Fujian, gripe humana o gripe H3N2.

"Virus de la gripe humana" se refiere generalmente a los subtipos que se propagan ampliamente entre los seres humanos. Entre todas las cepas, H1N1, H1N2 y H3N2 son los unicos subtipos conocidos de virus de la gripe A que circulan actualmente entre los seres humanos (CDC, EE. UU.: Datos clave sobre la gripe aviar (peste aviar) y el virus de la gripe aviar A (H5N1). Los tratamientos para la gripe incluyen una gama de medicamentos y tratamientos que se usan en respuesta a la enfermedad de la gripe. Los tratamientos pueden seleccionar directamente el propio virus de la gripe; o en su lugar solo pueden ofrecer alivio a los sintomas de la enfermedad mientras el propio sistema inmunologico del organismo actua para recuperarse de la infeccion (Montalto NJ, Gum KD, Ashley JV (2000). "Updated treatment for influenza A and B". Am Fam Physician 62 (11): 2467-76). Las dos clases principales de farmacos antiviricos usados contra los virus de la gripe son los inhibidores de la neuraminidasa, tales como zanamivir y oseltamivir, o los inhibidores de la proteina M2 virica, tales como amantadina y rimantadina. Estos farmacos pueden reducir la gravedad de los sintomas si se toman poco despues de la infeccion y tambien se pueden tomar para disminuir el riesgo de infeccion. Sin embargo, han surgido cepas viricas con resistencia a los farmacos para ambas clases de farmaco. Al igual que el desarrollo de la resistencia a antibioticos bacterianos, esto se puede resultar del uso excesivo de estos farmacos. Por ejemplo, en un estudio reciente se hizo hincapie en la necesidad urgente de potenciar las existencias de oseltamivir (Tamiflu) con farmacos antiviricos adicionales, incluido el zanamivir (Relenza), basandose en una evaluacion de la eficacia de estos farmacos en el supuesto de que la neuraminidasa (NA) de la "gripe porcina" H1N1 de 2009 adquiriese la mutacion de resistencia a tamiflu (His274Tyr) que esta actualmente extendida en cepas estacionales de H1N1 (Venkataramanan Soundararajan, Kannan Tharakaraman, Rahul Raman, S. Raguram, Zachary Shriver, V. Sasisekharan, Ram Sasisekharan (2009). "Extrapolating from sequence - the 2009 H1N1 'swine' influenza virus". Nature Biotechnology 27 (6): 510-3). Otro ejemplo es en el caso de tratamiento con amantadinas, que puede conducir a la rapida produccion de virus resistentes, y el uso excesivo de estos farmacos probablemente ha contribuido a la propagacion de la resistencia (Lynch JP, Walsh EE, abril de 2007). "Influenza: evolving strategies in treatment and prevention". Semin Respir Crit Care Med 28 (2): 144-58).

Mientras tanto, sin embargo, han surgido y circulado algunas cepas resistentes a los inhibidores de la neuraminidasa en ausencia de un gran uso de los farmacos involucrados, y la frecuencia con la que aparecen cepas resistentes a farmacos muestra poca correlacion con el nivel de uso de estos farmacos (Lackenby A, Thompson CI, Democratis J (diciembre de 2008). "The potential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza". Curr. Opin. Infect. Dis. 21 (6): 626-38). Los estudios de laboratorio tambien han mostrado que es posible contribuir al desarrollo de la resistencia a los farmacos por el uso de dosis suboptimas de estos farmacos como medida profilactica (Lackenby A, Thompson CI, Democratis J (diciembre de 2008). "The potential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza". Curr. Opin. Infect. Dis. 21 (6): 626-38). La busqueda de una clase mas nueva de virus contra la gripe con potencia y menos efectos secundarios se ha convertido en un reto para la comunidad biomedica.

Sumario de la invencion

Un proposito de la divulgacion es proporcionar un peptido analgesico que consiste en la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5, su variante y derivado. Sorprendentemente, este peptido tambien muestra actividad contra el virus de la gripe A.

Otro proposito de la divulgacion es proporcionar polinucleotidos que codifican el peptido.

Todavia otro proposito de la divulgacion es proporcionar la preparacion y usos del peptido.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un peptido aislado que comprende la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5, sus variantes conservadas, sus fragmentos activos y sus derivados activos. Preferentemente, dicho peptido tiene la secuencia de aminoacidos de DEAQETAVSSHEQd como se muestra en SEQ ID NO: 5.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un peptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos que comparte al menos un 50 % de homologia, por ejemplo, al menos un 60 % de homologia, al menos un 70 % de homologia, al menos un 80 % de homologia o al menos un 90 % de homologia, con la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5 y que posee la actividad analgesica y/o contra el virus de la gripe A.

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En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un peptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene de una a siete (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) sustituciones de aminoacidos conservadas en comparacion con la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5 y que posee la actividad analgesica y/o contra el virus de la gripe A.

En otro aspecto, el peptido divulgado en el presente documento, su variante y/o derivado se obtienen mediante sintesis quimica.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que comparte al menos un 50 % de homologia con una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleotidos que codifican un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5, su variante y/o derivado, y

(b) el polinucleotido complementario a la secuencia de nucleotidos de (a);

en el que dicho peptido, su variante y/o derivado posee la actividad analgesica y/o contra el virus de la gripe A.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un polinucleotido aislado que codifica un peptido que comprende la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un vector que comprende el polinucleotido anterior y una celula huesped transformada con el vector o polinucleotido.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para producir un peptido que tiene la actividad del peptido como se muestra en sEq ID NO: 5, que comprende:

(a) cultivar la celula huesped transformada anterior en las condiciones de expresion;

(b) aislar el peptido de la presente invencion a partir del cultivo.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona compuestos que estimulan, promueven y antagonizan la actividad del peptido como se muestra en SEq ID NO: 5.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del peptido en el presente documento, su variante y/o derivado, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Esta composicion farmaceutica se puede usar para tratar o aliviar las enfermedades y/o sintomas asociados con el dolor en un sujeto. Las enfermedades y/o sintomas asociados con el dolor en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, aquellos seleccionados de todos los tipos de neuralgia sintomatica, lumbago, colecistalgia, angina, dolores de embolia arterial, dolores agudos de heridas, quemaduras y escaldaduras, dolores quirurgicos o posquirurgicos, dolor de ulcera peptica, dismenorrea, dolores de parto posteriores al parto, cefalea, dolores provocados por diversos tumores. Esta composicion farmaceutica tambien se puede usar para inhibir la actividad del virus de la gripe A en un sujeto. El virus de la gripe A en el presente documento se selecciona preferentemente de H5N1 y H1N1.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un peptido en el presente documento, su variante y/o derivado, para su uso en el tratamiento de las enfermedades y/o sintomas asociados con dolor en un sujeto, que comprende la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de un peptido en el presente documento, su variante y/o derivado.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un peptido en el presente documento, su variante y/o derivado, para su uso en la inhibicion de la actividad del virus de la gripe A en un sujeto, que comprende la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de un peptido en el presente documento, su variante y/o derivado.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona el uso de un peptido en el presente documento, su variante y/o derivado, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o remision de las enfermedades y/o sintomas asociados con el dolor en un sujeto.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona el uso de un peptido en el presente documento, su variante y/o derivado en la preparacion de un medicamento para la inhibicion de la actividad del virus de la gripe A en un sujeto.

Los otros aspectos de la invencion seran evidentes para el experto a la luz de la ensenanza de la divulgacion.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes dibujos ilustran los modos de realizacion y no limitan el alcance de la invencion definido en las

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reivindicaciones.

Figura 1. Representacion esquematica de los procedimientos usados para el cribado de agentes analgesicos peptidicos/a nivel de peptidos pequenos a partir de extractos brutos de las pieles de conejo inflamatorias provocadas por inoculacion de la variolovacuna.

Figura 2. Identificacion de peptido(s) funcional(es). Se muestra el espectro de EM/EM del ion doblemente cargado m/z 772,745. La secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5 se determino a partir de diferencias de EM en las series de iones fragmento y y b y los residuos emparejados 1-14 de la a1-antiproteinasa de conejo.

Figura 3. El peptido 5 (SEQ ID NO: 5) tiene el efecto de alivio del dolor mas superior que otros peptidos y es comparable a 1 mg de morfina, como lo muestra un retraso significativo en el inicio del dolor provocado por la inyeccion intraperitoneal de acido acetico (n=6). Nota: p<0,005 entre el peptido 5 frente al peptido 1, 2, 3, 4 o 6; p>0,05 entre el peptido 5 frente a la morfina; y el control: agua sola.

Figura 4. El peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 tambien causo una reduccion significativa en el numero total de contorsiones 30 minutos despues de la inyeccion de acido acetico (n=6). Nota: p<0,01 entre el peptido 5 frente al peptido 1,2, 3, 4 o 6; p>0,05 entre el peptido 5 frente a la morfina. Control: agua sola.

Figura 5. El peptido 5 poseia efectos analgesicos potentes de origen neurogenico. En la estimulacion termica, el tratamiento con inyeccion intraperitoneal de 2 mg de peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 (DEAQETAVSSHEQD) redujo significativamente el dolor provocado por temperatura de la extremidad con lesion en el nervio ciatico (hiperalgesia). Los datos se expresan como la media ± DE en tiempo (segundos). N=6. Nota: **p<0,005 (por ANOVA) entre extremidad con lesion ipsilateral no tratada y tratada el dia 5, 10 o 30.

Figura 6. El peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 poseia efectos potentes sobre la alodinia termica de las extremidades con o sin lesion del nervio. En la estimulacion mecanica, el tratamiento con inyeccion intraperitoneal de 2 mg de peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 redujo significativamente la alodinia termica de la extremidad con lesion en el nervio ciatico. Los datos se expresan como la media ± DE en el valor umbral de pelos de von Frey (en gramos). N=6 por punto temporal. Nota: **p <0,005 (por ANOVA) entre extremidad con lesion ipsilateral no tratada y tratada el dia 5, 10 o 30.

Figura 7. El peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 tiene efectos potentes en la inhibicion de la replicacion de los virus H5N1 y H1N1 in vitro. El peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 se disolvio en agua pura y se anadio (0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 pM) a las celulas MDCK en monocapa que se infectaron simultaneamente por diversas cepas de virus H5N1 (panel izquierdo) o H1N1 (panel derecho) a 5.000 UFP/ml. Despues de 3 dias, se conto el numero de placas manualmente y se normalizo contra el control no tratado (es decir, 0 pM).

Nota:

Para A/Vietnam/1194/04(H5N1):

(1) No hubo significacion estadistica entre sin tratamiento y tratamiento con 0,1 pM

(2) p<0,01 entre sin tratamiento y tratamiento con 1 pM

(3) p<0,001 entre sin tratamiento y tratamiento con 10 pM

Mientras que tanto para A/Hong Kong/97(H5N1) como para A/ganso/Taichung/Q156/05(H5N1):

(1) p<0,05 entre sin tratamiento y tratamiento con 0,1 pM

(2) p<0,005 entre sin tratamiento y tratamiento con 1 pM

(3) p<0,001 entre sin tratamiento y tratamiento con 10 pM Para H1N1/2009 pandemico:

(1) no hubo significacion estadistica entre sin tratamiento y 0,01 pM

(2) p<0,05 entre sin tratamiento y tratamiento con 0,1 pM

(3) p<0,005 entre sin tratamiento y tratamiento con 1 pM

(4) p<0,001 entre sin tratamiento y tratamiento con 10 pM

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Para A/Taiwan/01/86(H1 N1):

(1) p<0,05 entre sin tratamiento y tratamiento con 0,01 pM

(2) p<0,01 entre sin tratamiento y tratamiento con 0,1 pM

(3) p<0,005 entre sin tratamiento y tratamiento con 1 pM

(4) p<0,001 entre sin tratamiento y tratamiento con 10 pM.

Descripcion detallada de la invencion

Como se usa en el presente documento, el peptido con la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5 es un fragmento de la a1-antiproteinasa F de conejo.

Como se usa en el presente documento, el termino "aislado" se refiere a una sustancia que ha sido aislada del entorno original. Para sustancias naturales, el entorno original es el entorno natural. Por ejemplo, el polinucleotido y el peptido en un estado natural en las celulas viables no se aislan o purifican. Sin embargo, si el mismo polinucleotido y peptido se han aislado a partir de otros componentes que los acompanan naturalmente, se aislan o purifican.

El peptido de la divulgacion puede ser un peptido recombinante, natural o sintetico, preferentemente un peptido recombinante. El peptido de la divulgacion puede ser un producto natural purificado o un producto sintetizado quimicamente. De forma alternativa, se puede producir partir de huespedes procarioticos o eucarioticos, tales como bacterias, levadura, plantas superiores, insectos y celulas de mamifero, utilizando tecnicas recombinantes. De acuerdo con el huesped usado en la produccion recombinante, el peptido puede ser glucosilado o no glucosilado.

Como se usa en el presente documento, los terminos "derivado" y "variante" quieren decir el peptido que esencialmente retiene las mismas funciones biologicas o actividad del peptido natural con la secuencia de aminoacidos que se muestra en SEQ ID NO: 5.

Como se usa en el presente documento, el termino "derivado" usado en el presente documento incluye, pero no se limita a, (i) uno en el que uno o mas de los residuos de aminoacidos incluyen un grupo sustituyente, (ii) uno en el que el peptido se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del peptido (por ejemplo, polietilenglicol), (iii) uno en el que los aminoacidos adicionales se fusionan al peptido, tal como una secuencia lider o secretaria o una secuencia usada para purificar peptido o proproteina, o (iv) uno en el que el peptido se modifica mediante algunas modificaciones. Dichos derivados son conocidos por los expertos basandose en las ensenanzas en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el termino "modificaciones" (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluye derivacion quimica in vivo o in vitro de peptidos, por ejemplo, acetilacion o carboxilacion. Tambien se incluyen modificaciones de la glucosilacion, por ejemplo, aquellas realizadas modificando los patrones de glucosilacion de un peptido durante su sintesis y procesamiento o en las etapas de procesamiento adicionales, por ejemplo, exponiendo el peptido a enzimas de glucosilacion (por ejemplo, enzimas glucosilantes o desglucosilantes de mamiferos). Tambien se incluyen secuencias que tienen residuos de aminoacidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina, fosfotronina, asi como secuencias modificadas para mejorar la resistencia a la degradacion proteolitica o para optimizar las propiedades de solubilidad.

Como se usa en el presente documento, el termino "variante" incluye, pero no se limita a, deleciones, inserciones y/o sustituciones de varios aminoacidos, preferentemente varias sustituciones de aminoacidos conservadas (tipicamente 1-7, preferentemente 1-6, mas preferentemente 1-5, incluso mas preferentemente 1-4, aun mas preferentemente 13, lo mas preferentemente 1-2), y adicion de uno o mas aminoacidos (tipicamente menos de 20, preferentemente menos de 10, mas preferentemente menos de 5) en el extremo C, el extremo N o dentro del peptido. Por ejemplo, las funciones proteicas generalmente no cambian cuando un residuo de aminoacido se sustituye por uno similar o analogo, por ejemplo, sustituido con un residuo de aminoacido conservado o no conservado (preferentemente un residuo de aminoacido conservado). Ademas, la adicion de uno o varios aminoacidos en el extremo C y/o el extremo N generalmente no cambia la funcion de la proteina.

Como se usa en el presente documento, el termino "sustituciones de aminoacidos conservadas" quiere decir un peptido formado sustituyendo como maximo 7, preferentemente como maximo 6, mas preferentemente 5 y lo mas preferentemente como maximo 3 aminoacidos teniendo los aminoacidos sustancialmente una propiedad igual o similar, en comparacion con la secuencia de aminoacidos de DEAQETAVSSHEQD. Preferentemente, estos mutantes conservados se forman mediante la sustitucion de acuerdo con la tabla 1.

Tabla 1

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Residuo inicial

Sustitucion representativa

Asp (D)

Glu

Glu (E)

Asp

Ala (A)

Val; Leu; He

Gln (Q)

Asn

Thr (T)

Ser

Val (V)

He; Leu; Met; Phe; Ala

Ser (S)

Thr

His (H)

Asn; Gln; Lys; Arg

El polinucleotido de la invencion puede estar en forma de ADN y ARN. El ADN incluye ADNc, ADN genomico y ADN sintetico, etc., en forma monocatenaria o bicatenaria. El polinucleotido de la invencion puede ser una secuencia degenerada. Como se usa en el presente documento, el termino "secuencia degenerada" quiere decir que hay secuencias diferentes que codifican la misma proteina debido a la degeneracion de codones.

El termino "polinucleotido que codifica el peptido" incluye el polinucleotido que codifica dicho peptido y el polinucleotido que comprende una secuencia adicional y/o no codificadora. El polinucleotido que codifica el peptido en el presente documento puede prepararse mediante amplificacion por PCR, procedimiento recombinante y procedimiento sintetico. Para la amplificacion por PCR, se pueden obtener dichas secuencias disenando cebadores basados en la secuencia de nucleotidos divulgada en el presente documento, especialmente el ORF, y usando una biblioteca de ADNc disponible comercialmente o preparada mediante tecnicas rutinarias en la tecnica como molde. Una vez que se obtiene la secuencia, se pueden producir lotes de las secuencias por procedimientos recombinantes. Generalmente, dicha secuencia se clona en un vector que se transforma a continuacion en una celula huesped. La secuencia se aisla a partir de las celulas huesped amplificadas usando tecnicas convencionales.

La divulgacion se refiere ademas a un vector que comprende el polinucleotido de la divulgacion, una celula huesped geneticamente modificada transformada con el vector o el polinucleotido de la divulgacion y el procedimiento para producir el peptido por tecnicas recombinantes.

Los peptidos recombinantes se pueden expresar o producir mediante tecnologia de ADN recombinante convencional (Science, 1984; 224: 1431), usando la secuencia polinucleotidica de la invencion. En general, comprende las siguientes etapas:

(1) transfectar o transformar las celulas huesped apropiadas con el polinucleotido que codifica el peptido o el vector que contiene el polinucleotido;

(2) cultivar las celulas huesped en un medio apropiado;

(3) aislar o purificar la proteina a partir del medio o celulas.

Las secuencias polinucleotidicas en el presente documento se pueden insertar en un vector de expresion recombinante. El termino "vector de expresion" quiere decir un plasmido bacteriano, bacteriofago, plasmido de levadura, virus de plantas o virus de celulas de mamifero, tal como adenovirus, retrovirus o cualquier otro vehiculo conocido en la tecnica. Se puede usar cualquier plasmido o vector para construir el vector de expresion recombinante siempre que pueda replicarse y sea estable en el huesped. Una caracteristica importante del vector de expresion es que el vector de expresion contiene tipicamente un origen de replicacion, un promotor, un gen marcador asi como los componentes reguladores de la traduccion.

Los procedimientos conocidos se pueden usar para construir un vector de expresion que contiene la secuencia en el presente documento y componentes reguladores de transcripcion/traduccion apropiados. Estos procedimientos incluyen tecnica de aDn recombinante in vitro, tecnica de sintesis de ADN, tecnica recombinante in vivo, etc. La secuencia de ADN esta ligada eficazmente al promotor apropiado en un vector de expresion para dirigir la sintesis de ARNm. Los promotores ejemplares son promotor lac o trp de E. Coli; promotor PL del fago A; promotor eucariotico que incluye promotor temprano inmediato de CMV, promotor de timidina-cinasa de VHS, promotor SV40 temprano y tardio, RTL de retrovirus y algunos otros promotores conocidos que controlan la expresion genica en las celulas procariotas, celulas eucariotas o virus. El vector de expresion puede comprender ademas un sitio de union al ribosoma para iniciar la traduccion, el terminador de la transcripcion y similares.

Como se usa en el presente documento, el termino "celula huesped" incluye procariota, por ejemplo, bacterias; eucariota primaria, por ejemplo, levadura; eucariotas avanzadas, por ejemplo, celulas de mamifero. Los ejemplos

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representatives son celulas bacterianas, por ejemplo, E. Coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; celulas fungicas, por ejemplo, levadura; celulas vegetales; celulas de insecto, por ejemplo, Drosophila S2 o Sf9; celulas de animales, por ejemplo, CHO, COS o melanoma Bowes, etc.

Como se usa en el presente documento, el termino "efecto analgesico" incluye "efecto antihiperalgesia" y "efecto antialodinia". Sin embargo, estos tres terminos se podrian utilizar por separado porque indican alivio del dolor en diferentes enfermedades o modelo.

Como se usa en el presente documento, el termino "el sujeto" incluye mamiferos humanos, no humanos (por ejemplo, vaca, oveja, conejo, perro, raton, rata, mono, etc.) y aves domesticas.

La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad segura y eficaz del peptido en el presente documento en combinacion con un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Dicho vehiculo incluye, pero no se limita a, solucion salina, solucion tampon, glucosa, agua, glicerina, etanol o la combinacion de los mismos. La formulacion farmaceutica debe ser adecuada para el procedimiento de administracion. La composicion farmaceutica puede estar en forma de inyecciones que se preparan por procedimientos convencionales, usando solucion salina fisiologica u otra solucion acuosa que contiene glucosa o sustancias auxiliares. Las composiciones farmaceuticas en forma de comprimido o capsula se pueden preparar mediante procedimientos rutinarios. Las composiciones farmaceuticas, por ejemplo, inyecciones, soluciones, comprimidos y capsulas, deben fabricarse en condiciones esteriles. El ingrediente activo se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz, por ejemplo, aproximadamente 1 ug-50 mg/kg de peso corporal o mas por dia. Ademas, el peptido de la invencion se puede administrar junto con otros agentes terapeuticos.

La evidencia del experimento anterior muestra que el extracto en bruto de las pieles de conejo inflamatorias provocadas por la inoculacion de la variolovacuna puede ejercer su efecto farmacologico sobre la analgesia. Para identificar los componentes exactos para el alivio del dolor, como se demuestra por su agente parental AGC®, se empleo un enfoque proteomico para determinar las diferencias en las proporciones de masa a carga (m/z) usando nano-CL-EM/EM. Mediante purificacion quimica sofisticada y busqueda de bases de datos, los inventores identificaron una secuencia peptidica de DEAQETAVSSHEQD que posee efectos potentes analgesicos, antihiperalgesicos, antialodinicos y contra el virus de la gripe A.

La invencion se ilustra ademas mediante los siguientes ejemplos. Para los procedimientos experimentales en los siguientes ejemplos, se realizaron en condiciones rutinarias, por ejemplo, las descritas por Sambrook. et al., en Molecule Clone: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, o segun instrucciones de los fabricantes, a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificacion del peptido

A. Preparacion de muestras

La mezcla de los agentes bioactivos extraidos a partir de los tejidos de la piel de conejos con inflamacion provocada por la inoculacion del virus de la variolovacuna se preparo como se describe (Y. Imai, K. Saito, S. Maeda et al. Inhibition of the release of bradykinin-like substances into the perfusate of rat hind paw by neurotropin. Jpn J Pharmacol 1984, 36:104-106) y se proporciono por Vanworld Pharmaceutical Co Ltd, Rugao, China, con un nombre comercial de AGC® (10 U/ml, 25 ml/vial). Se secaron aproximadamente 200 pl de la preparacion en bruto de AGC® en una centrifugadora de vacio. El material liofilizado se reconstituyo con 100 pl de tampon de bicarbonato de amoniaco 0,5 M (pH 8,5) que contenia urea 8 M y ditiotreitol (DTT) 0,5 M durante 1 hora a 37 °C y durante otras 2 horas a 4 °C en condiciones de oscuridad cuando se anadieron 10 pl de yodoacetamida 0,5 M (IAM) para alquilacion. Posteriormente, las soluciones resultantes se digirieron a continuacion con 0,2 pg de tripsina durante 18 h a 37 °C y a continacion las soluciones digeridas con tripsina se acidificaron con acido trifluoroacetico al 10 % (TFA)/H2O hasta un valor de pH 3,0. Despues de la reaccion, las soluciones totalmente acidificadas se aplicaron sobre la columna de fase inversa C18 previamente equilibrada con 200 pl de TFA al 0,1 %/H2O (pH 3,0). La columna tambien se lavo con 200 pl de TFA/H2O al 0,1 % (pH 3,0) y despues se eluyo con un gradiente de acetonitrilo por etapas de un 50 % a un 100 % en TFA al 0,1 % a temperatura ambiente.

B. Analisis de nano-CL-EM/EM

Las fracciones eludidas se recogieron, se secaron en una centrifugadora al vacio y despues se reconstituyeron en 10 pl de acido formico (AF) al 0,1 % en H2O y se analizaron mediante LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). La separacion de nano-CL de fase inversa se realizo en un sistema de nanoflujo Agilent serie 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Se cargo un total de 10 pl de muestra de la fraccion en una precolumna Agilent Zorbax XDB C18 (0,35 mm, 5 pm), seguido de separacion usando una columna C18 (d.i. 75 pm X 25 cm, 3 pm, Micro Tech, Fontana, CA). Las fases moviles usadas fueron (A) AF al 0,1 % y (B) AF al 0,1 % en AcN al 100 % .

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Se aplico un gradiente lineal de un 5 % a un 35 % (B) durante un periodo de 90 minutos a un caudal de 300 nl/min. Los peptidos se analizaron en el modo de iones positivos aplicando un voltaje de 1,8 kV a la aguja de inyeccion. El EM se opero en un modo dependiente de los datos, en el que se realizo una exploracion completa con m/z 300-2000 en el Orbitrap (R = 60.000 a m/z 400) usando una velocidad de 30 ms/exploracion. Se seleccionaron los seis picos mas intensos de fragmentacion con un valor energetico de colision normalizado de un 35 % en el LTQ. Se aplico una duracion de repeticion de 30 s para excluir los mismos iones m/z de la reseleccion para fragmentacion. El liquido reconstituido como control, tambien tratado por reduccion, alquilacion y desalacion, se acidifico y se sometio a analisis de nano-CL-EM/EM como se menciono anteriormente, excepto para la digestion con tripsina.

C. Busqueda e identificacion de bases de datos

Los peptidos se identificaron mediante listas de picos convertidas a partir de los espectros de nano-CL-EM/EM buscando en taxonomia animal en las bases de datos de NCBI, emparejamientos exactos usando el programa de busqueda MASCOT (
http://www.matrixscience.com, Hirosawa et a/., 1993). La tolerancia de la masa tanto del ion precursor como de los iones fragmento se fijo en 0,8 Da. Las busquedas se realizaron para permitir la modificacion fija como carbamidometilacion (C) y sin tripsina como enzima. La identificacion resultante tenia una puntuacion de peptidos estadisticamente significativa (P < 0,05) (basada en los espectros combinados de EM y EM/EM) y la mejor puntuacion de iones (basada en los espectros de EM/EM).

D. Resultados

Los patrones espectrales de masa de los fragmentos de proteina generados con o sin digestion con tripsina se usaron a continuacion para compararlos con los de las proteinas previamente conocidas depositados en bancos de datos para confirmar las secuencias peptidicas que se pueden usar para la identificacion de proteinas intactas. (ID de la proteina). Por lo tanto, se puede lograr una amplia cobertura de peptidos mediante analisis aleatorio, elucidar los perfiles de expresion de peptidos o peptidos pequenos e identificar secuencias asi como la caracterizacion bioquimica. Un diagrama de flujo de los procedimientos usados en este trabajo y todos los peptidos identificados con su caracterizacion bioquimica se enumeran en la tabla 2. Se detecto el pico peptidico representativo a partir del analisis de EM/EM (fig. 2), dando como resultado una identificacion confiable de proteinas mediante busqueda con MASCOT. Se muestra el espectro de EM/EM del ion doblemente cargado m/z 772,745. La secuencia de aminoacidos DEAQETAVSSHEQD como se muestra en SEQ ID NO: 5, se determino a partir de diferencias de EM en las series de iones fragmento y y b y se emparejo con los residuos 1-14 de la a1-antiproteinasa F de conejo, que es diferente de la del ser humano, raton o del ganado vacuno. Ademas, no comparte homologia con los otros peptidos relacionados con la analgesia, incluyendo el agonista opioide DAGO. De acuerdo con la prediccion computacional, es lineal y es poco probable que tenga estructuras como helice a, lamina p, giro p o region plegada.

Tabla 2. Caracterizacion de seis peptidos pequenos identificados mediante espectros de EM/EM a partir de analisis de nano-CL-EM/EM.

Secuencia peptidica

IP/Masa (Da)

SEQ ID NO:1: DEAQETAVSSH (peptido 1)

4,13/1173,16

SEQ ID NO:2: DEAQETAVSSHE (peptido 2)

4,00/1302,27

SEQ ID NO:3: DEAQETAVSSHEQ (peptido 3)

4,00/1430,40

SEQ ID NO:4: EAQETAVSSHEQD (peptido 4)

4,00/1430,40

SEQ ID NO:5: DEAQETAVSSHEQD (peptido 5)

3,83/1545,49

SEQ ID NO:6: AQETAVSSHEQD (peptido 6)

4,13/1304,29

Ejemplo 2: Efectos analgesicos in vivo

Los peptidos se sintetizaron en una instalacion comercial de Mission Biotech Co. (MB, Taipei, Taiwan) usando la quimica del Fmoc de fase solida y se purificaron mediante cromatografia de liquidos de alta resolucion de fase inversa hasta una pureza de un >90 % y se validaron mediante EM. Los productos peptidicos finales se disolvieron en DMSO para su uso experimental.

Para el modelo de dolor visceral agudo en ratones, a ratones machos C57BL/6 que pesaban 20-25 g se les inyecto intraperitonealmente 1 mg de morfina (como control positivo) o peptido sintetico 1-6 (SEQ ID NO: 1-6, 2 mg de cada uno). Treinta minutos despues, a los ratones se les inyecto posteriormente 1 ml de acido acetico al 1 % intraperitonealmente. Se registro el inicio de la1.a contorsion y la frecuencia de contorsion en los 30 minutos siguientes.

El peptido 5 como se muestra en la SEQ ID NO: 5 (un peptido de 14 aminoacidos) tiene efectos analgesicos similares comparables a 1 mg de morfina como se muestra en la latencia tardia de retirada de la pata (fig. 3) y redujo

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los episodios de contorsion totales medidos en 30 min (fig. 4).

Ejemplo 3: Efectos antihiperalgesicos

Se usaron ratones machos C57BL/6 que pesaban 20-25 g. Los procedimientos quirurgicos se realizaron bajo anestesia con halotano (2-3 %). La lesion parcial del nervio ciatico se realizo atando una ligadura ajustada con sutura de seda 9-0 alrededor de 1/3 a 1/2 del diametro del nervio ciatico, como se ha descrito (Malmberg AB y Basbaum AI. Pain 1998;76:215-222). En ratones con operacion simulada, el nervio ciatico se expuso pero no se ligo. Posteriormente, los ratones se habituaron al entorno de la prueba durante al menos 1 hora antes de la prueba termica y la prueba de pelos de von Frey. En la prueba termica, se determino la latencia de retirada de la pata como un indicador para el dolor. En la prueba de von Frey, se ajusto la intensidad del estimulo para dar una latencia de retirada de 10 segundos en el raton normal, mientras que el valor de corte en ausencia de una respuesta fue de 20 segundos. Se evaluo la sensibilidad mecanica con pelos de von Frey mediante el paradigma de ascenso-descenso (Chaplan et al, J. Neurosci Methods 1994;53:53-66). El filamento para el paradigma de la prueba se eligio para ser de 0,3 g.

El peptido 5 como se muestra en la SEQ ID NO: 5 se sometio a prueba para determinar sus efectos antihiperalgesia en ratones que recibian ligadura de nervio ciatico. Los resultados de la prueba termica de los ratones con operacion simulada y los ratones con lesion en el nervio se compararon en paralelo el dia 5, 10 y 30 despues de la cirugia. Los resultados demostraron claramente que las extremidades con lesion del nervio tenian hiperalgesia, como se demuestra por las latencias de retirada de la pata significativamente reducidas, en comparacion con la de la extremidad contralateral o las extremidades con operacion simulada (fig. 5). Ademas, la inyeccion intraperitoneal de 2 mg de peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 (marcados como "tratados") de hecho podria aumentar significativamente la tolerancia al dolor provocado por calor, como se demuestra por un aumento de la latencia de retirada de la pata (fig. 5), en comparacion con los ratones de control que recibieron disolvente DMSO (marcados como "no tratados").

Ejemplo 4: Efectos antialodinia

Se uso el mismo modelo animal que en el ejemplo 3. El peptido 5 como se muestra en la SEQ ID NO: 5 se sometio a prueba en cuanto a sus efectos antialodinia en ratones que recibian ligadura de nervio ciatico. Los resultados de la estimulacion mecanica (prueba de von Frey) de los ratones con operacion simulada y los ratones con lesion en el nervio se compararon en paralelo el dia 5, 10 y 30 despues de la cirugia. Los resultados demostraron claramente que las extremidades con lesion del nervio tenian hiperalodinia, como se demuestra por el valor umbral de von Frey significativamente mas bajo, en comparacion con el de la extremidad contralateral o las extremidades con operacion simulada (fig. 6). Ademas, la inyeccion intraperitoneal de 2 mg de peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 (marcados como "tratados") podria aumentar significativamente la tolerancia a los estimulos mecanicos, como se demuestra por un aumento del valor umbral de von Frey (fig. 6), en comparacion con los ratones de control que recibieron agua pura (marcados como "no tratados").

Ejemplo 5: Efectos antivirus

A. Virus y celulas

Los aislados A/Vietnam/1194/04 y A/Hong Kong/97 de H5N1 se obtuvieron del Departamento de Microbiologia de la Universidad de Hong Kong. Se uso el virus a 3x105 TCID50 para los experimentos. Tambien se uso A/Taiwan/01/86 (H1N1) a 3x105 TCID50 para los experimentos. Los experimentos H5N1 se llevaron a cabo en una instalacion de contencion de nivel de bioseguridad (BSL) 3+. Se almacenaron alicuotas de virus de reserva a -80 °C. Se obtuvieron celulas de rinon canino Madin-Darby (MDCK) de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Va, EE. UU.) y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10 % y antibioticos al 1 % (penicilina/estreptomicina) . Se determino la dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50 % (TCID50) en celulas MDCK despues de incubacion a 37 °C durante 3 dias y se calcularon los valores mediante el procedimiento de Reed y Muench (Reed LJ, Muench H. A simple method for estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 1938;27:493-497). Para determinar la eficacia del peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 en la inhibicion de la replicacion del virus, se comparo el UFP/ml con (dividido por) el UFP/ml inicial que se sembro y se expreso como porcentaje del valor cuantitativo inicial (que era 5x103 UFP/ml).

B. Determinacion del valor cuantitativo virico mediante ensayo de placa

Todos los virus usados aqui se cuantificaron inicialmente en celulas MDCK para determinar el valor cuantitativo infeccioso (unidades formadoras de placa por ml, UFP/ml). En resumen, las celulas MDCK que se hicieron crecer en monocapas en placas de 24 pocillos se infectaron con el virus a 5x103 UFP/ml despues del tratamiento con el peptido 5 como se muestra en SEQ ID NO: 5 (0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 pM). Despues de 1 h de union a 37 °C en celulas MDCK confluentes, el virus no unido se lavo suavemente con PBS y se recubrio con Agar Noble 1:1 (1,8 %) y 2x DME-F12 (suplementado con Glutamax (Invitrogen, Carlsbad, CA), ITS (Invitrogen) y 3 pg/ml de tripsina acetilada (Sigma, St. Louis, MO)). Despues de dejar solidificar el agar, las placas se incubaron durante ~72 horas a

Claims (11)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un peptido aislado que consiste en la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5.
2. 2. El peptido aislado de acuerdo con la reivindicacion 1, que posee actividad analgesica y/o contra el virus de la gripe A.
3. 3. El peptido de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que se obtiene por sintesis quimica.
4. 4. Un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en:

   (a) una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos como se muestra en SEQ ID NO: 5, y

   (b) el polinucleotido complementario a la secuencia de nucleotidos de (a);

   en el que dicho peptido posee actividad analgesica y/o contra el virus de la gripe A.
5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
6. 6. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso como medicamento.
7. 7. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento o remision de las enfermedades y/o sintomas asociados con el dolor en un sujeto.
8. 8. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que las enfermedades y/o sintomas asociados con el dolor se seleccionan entre todos los tipos de neuralgia sintomatica, lumbago, colecistalgia, angina, dolores de embolia arterial, dolores agudos de heridas, quemaduras y escaldaduras, dolores quirurgicos o posquirurgicos, dolor de ulcera peptica, dismenorrea, dolores de parto posteriores al parto, cefalea y dolores provocados por diversos tumores.
9. 9. El peptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en la inhibicion de la actividad del virus de la gripe A en un sujeto.
10. 10. El peptido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el virus de la gripe A se selecciona de H5N1 y H1N1.
11. 11. El peptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que el sujeto se selecciona de seres humanos, mamiferos no humanos y aves domesticas.