KR20170137846A - 뇌혈관 질환에 대한 치료 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 백시니아 바이러스에 의해 염증이 생긴 토끼 피부 유래의 추출물로부터 단리된 펩타이드를 이용함으로써 개체에서 뇌혈환 질환을 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것이다. 또한, 서열번호 1과 70% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이의 변이체, 돌연변이, 유도체 또는 단편에 관한 것이다.

Description

뇌혈관 질환에 대한 치료 펩타이드
본 발명은 뇌혈관 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 백시니아 바이러스에 의해 염증이 생긴 토끼 피부 유래의 추출물로부터 단리된 펩타이드를 이용함으로써 개체에서 뇌혈환 질환을 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것이다
뇌혈관 질환은 국소 뇌로의 혈액 공급 이상으로 인해 야기되는 신경 기능 손상이다. 대부분의 국가에서, 전체 사망의 주된 3가지 요인에 속하는, 뇌혈관 질환은 성인에 뇌 손상을 일으킬 수 있다. 뇌혈관 질환은 중년 및 노년층의 건강을 위협하는 주된 요인이자, 대부분의 국가에서 중년 및 노년층의 주된 사망 또는 장애의 요인이다.
급성 뇌혈관 질환 중 하나인 뇌졸증은 전 인류에서 3번째를 차지하는 주 사망 원인이며, 다양한 질환들 중에서도 장애 유발율이 가장 높다. 뇌혈관 질환은 노년층의 삶의 질에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 환자의 가족과 사회에 막대한 부담을 지운다. 또한, 젊은 집단에서도 증가하는 경향이 있다.
뇌혈관 질환은 주로 2가지 타입, 즉 출혈성과 허혈성으로 분류되는데, 허혈성이 60-70%를 차지하고 있으며, 가장 발생율이 높은 타입의 뇌혈관 질환이다. 그래서 허혈성 뇌혈관 질환의 병리생리학적 기전을 연구하고, 신경보호로서 기능하는 약물을 연구하는 것이 중요하다.
뇌 허혈증의 병리생리학적 기전 연구는 1980년대 이래로 신경과학 분야에서 가장 집중을 받은 분야 중 하나이며, 지금까지 이러한 에너지 대사, 산 중독 (acid intoxication), 과산화 손상 (peroxidation injury), 자극성 아미노산 유발성 독성 손상 (excitatory amino acid induced toxicity injury) 및 칼슘 과잉 (calcium overload)과 같은 뇌 허혈증 관련 이론들이 제시되어 왔으며, 이중 마지막 2가지가 허혈성 신경 손상 및 사망에서 중요한 역할을 담당한다. 허혈성 뇌혈관 질환의 병리생리학적 토대에 따라, 뇌 허혈증을 임상으로 치료하기 위해 현재 사용되는 약물들은 칼슘 이온 길항제 (니모디핀), 산소 라디칼 스캐빈저 (VitE, SOD), 신경영양인자들 (신경 성장인자, 신경영양인자), 자극성 아미노산 길항제, 항산화제 및 후기-발병 신경 손상을 개선시키는 약물을 주로 포함하고 있다. 이들 약물은 다양한 작용 기전을 통해 기능하지만, 치료학적 효과가 불확실하고, 특이성이 거의 없거나 또는 심각한 부작용을 동반하여, 아직까지 임상적인 요건을 충족시키지 못하고 있다. 피라세탐 (piracetam), 플루나리진 (flunarizine), 칼란 (calan), 은행 추출물 (ginkgo extract)과 같이, 뇌 순환, 대사 및 기능을 개선시키기 위해 사용될 수 있는 상업적으로 이용가능한 약물들이 다수 존재한다. 이들 약물은 모두 특별한 특징들을 가지고 있지만, 뇌혈관 질환에 대한 이의 치료 효과는 불확실하다. 허혈성 뇌혈관 질환을 치료하기 위한 새로운 약물 연구와 개발이 약제학 및 약학 분야에서 점점 중요해지고 있다.
백시니아 바이러스로 인해 염증이 생긴 토끼 피부에서 유래된 추출물이, 제조사 Vanworld Pharmaceutical (Rugao) Co. Ltd.에 의해 상품명 Analgecine으로 시판되고 있다. 이전의 실험 증거를 통해, 백시니아 바이러스 접종에 의해 유발된 토끼 염증 피부의 조 추출물이 통각상실증 (analgesia)에 약리학적 효능을 발휘할 수 있는 것으로 입증되어 있다. 그러나, Analgecine에서 이러한 효능에 기여하는 활성 성분에 대해서는 아직까지 알려진 바 없다. 따라서, 이러한 효능에 관여하는 성분들에 대한 이해가 요구되고 있다.
Jiang, B. et al. Incidence and trends of stroke and its subtypes in China: results from three large cities. Stroke; a journal of cerebral circulation 37, 63-68, doi:10.1161/01.STR.0000194955.34820.78 (2006). Nedergaard, M., Goldman, S. A., Desai, S. & Pulsinelli, W. A. Acid-induced death in neurons and glia. J Neurosci 11, 2489-2497 (1991). Magistretti, P. J. Cellular bases of functional brain imaging: insights from neuron-glia metabolic coupling. Brain Res 886, 108-112 (2000). Manev, H., Favaron, M., Guidotti, A. & Costa, E. Delayed increase of Ca2+ influx elicited by glutamate: role in neuronal death. Mol Pharmacol 36, 106-112 (1989). Greene, L. A. & Tischler, A. S. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A 73, 2424-2428 (1976). Khan, S., Liu, S., Stoner, M. & Safe, S. Cobaltous chloride and hypoxia inhibit aryl hydrocarbon receptor-mediated responses in breast cancer cells. Toxicol Appl Pharmacol 223, 28-38 (2007).
일 측면에서, 본 발명은 개체에서 뇌혈관 질환을 치료 또는 개선하는 방법으로서, DEAQETAVSSH (서열번호 1)와 70% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이의 변이체, 돌연변이, 유도체 또는 단편 중 하나 이상을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 뇌혈관 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어 서열번호 1과 70% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 그 변이체, 돌연변이, 유도체 또는 단편 중 하나 이상의 용도를 제공한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 뇌혈관 질환은 기능적 결함 (functional deficit)을 동반한 신경계 손상을 유발하는 것이다. 구체적인 구현예에서, 본원에 기술된 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌 손상 또는 출혈성 뇌 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 구체적인 구현예에서, 뇌혈관 질환은 뇌졸증 (stroke)이다.
"서열번호 1과 70% 이상의 동일성을 가진"이라는 표현은 아미노산 서열이 서열번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진다는 것을 의미하는 것이다.
다른 구현예에서, 펩타이드는 서열번호 1 및/또는 DEAQETAVSSHEQD (서열번호 2)를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 펩타이드는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2로 구성된다.
다양한 구현예들에서, 펩타이드는 하나 이상의 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환, 바람직하게는 1-5개, 바람직하게는 1-3개의 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환은 C-말단 및/또는 N-말단에 위치한다.
또 다른 구현예에서, 질환은 신경 세포를 보호함으로써 치료 또는 개선된다.
특정 구현예에서, 개체는 인간이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 상기한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 측면에서, 유효량의, 본 발명에 따른 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 약제로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하거나 또는 이들로 구성되는 펩타이드 조성물; 상기한 조성물을 포함하는 약물 조합 (drug combination); 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.
도 1은 백시니아 바이러스 접종에 의해 유발된 토끼 염증 피부의 조 추출물로부터 폴리펩타이드/소형 펩타이드-수준의 진통성 물질 (analgesic agent)을 스크리닝하기 위해 사용된 공정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 기능성 펩타이드의 동정을 예시한 것이다. 이중 하전된 이온 m/z 772.745의 MS/MS 스펙트럼을 도시한다. 아미노산 서열들 중 예로서 나타낸 DEAQETAVSSHEQD (서열번호 2)는 y- 및 b-프래그먼트 이온 시리즈에서 MS 차이로부터 결정되었으며, 토끼 α1-안티프로테나제 F의 잔기 1-14와 매칭되었다.
도 3은 다양한 pH에서 펩타이드-5의 안정성을 나타낸 것이다.
도 4는 샘플의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 펩타이드 5의 CD (원편광이색성)를 도시한 것이다.
도 6은 PC12 세포를 24시간 동안 AGC 0.25, 0.5 또는 1 U/ml을 첨가하거나 또는 첨가하지 않은 조건에서 H2O2에 노출시켰을 때 세포의 생존성을 나타낸 것이다. ** 무처리 군 대비 P<0.01. 데이타는 실험 3번의 평균 ± SD로 나타낸다.
도 7은 PC12 세포를 24시간 동안 AGC 1 U/ml 또는 펩타이드 1 (10 ㎍/ml), 펩타이드 5 (10 ㎍/ml) 또는 펩타이드 1 + 5 조합 (각각 10 ㎍/ml)을 첨가하거나 또는 첨가하지 않은 조건에서 H2O2에 노출시켰을 때 세포의 생존성을 나타낸 것이다. ** 펩타이드 1 또는 5 사용 군 대비 P<0.05. 데이타는 실험 3번의 평균 ± SD로 나타낸다.
도 8은 L-글루탐산 처리된 PC12 세포의 세포 생존성에 대한 AGC 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 L-글루탐산 처리된 PC12 세포의 세포 생존성에 대한 AGC, 펩타이드 1 및 펩타이드 5의 효과를 비교한 것이다.
도 10은 PC12 세포를 저혈당, 저산소 또는 이들의 조합 조건 하에 AGC 0.25, 0.5 또는 1 U/ml을 처리하거나 또는 처리하지 않았을 때 24시간 동안의 세포 생존성을 나타낸 것이다. ** 무처리군 대비 P<0.01. 데이타는 실험 3번의 평균 ± SD로 나타낸다.
도 11은 PC12 세포를 저혈당, 저산소 또는 이들의 조합 조건 하에 AGC 1 U/ml, 펩타이드 1 (서열번호 1) (10 ㎍/ml), 펩타이드 5 (서열번호 2) (10 ㎍/ml) 또는 펩타이드 1 + 5 (각각 10 ㎍/ml)을 처리하거나 또는 처리하지 않았을 때의 24시간 동안의 세포 생존성을 나타낸 것이다. ** 펩타이드 1 또는 5 사용 군 대비 P<0.01. 데이타는 실험 4번의 평균 ± SD로 나타낸다.
도 12는 펩타이드 1 및 5를 주사하였을 때 15분 및 30분 (좌 및 우측 랫)에 뇌에서 높은 형광 강도가 검출 (노란색)되지만, 대조군 펩타이드를 주사한 경우에는 그렇지 않다 (중앙)는 것을 나타낸 것이다. 데이타는 3가지 실험을 나타낸다.
도 13은 펩타이드 1 및 5를 주사하였을 때 30분 및 60분 (좌 및 우측 랫)에 척추에서 높은 형광 강도가 검출 (노란색)되지만, 대조군 펩타이드를 주사한 경우에는 그렇지 않다 (중앙)는 것을 나타낸 것이다. 데이타는 3가지 실험을 나타낸다.
본 발명자들은, 백시니아 바이러스에 의해 염증이 생긴 토끼 피부 추출물로부터 단리된 펩타이드 2종이 생체내 및/또는 생체내에서 H2O2 또는 L-글루탐산에 노출되었을 때 저산소, 저혈당 또는 이들의 조합 조건 하에 신경 세포의 생존성을 유의하게 보존한다는 것을, 놀랍게도 발견하게 되었다. 더욱 놀랍게도, 펩타이드 1과 펩타이드 5는 저산소, 저혈당증 또는 이들의 조합 조건, H2O2 및 L-글루탐산에 의해 유발되는 신경 세포 (PC12)의 세포독성을 저해하는데 상승적인 효과를 발휘하며, AGC (예, 1 U/ml)를 사용하였을 때 관찰되는 결과와 비슷한 효능을 가진다. 즉, 허혈성 뇌졸증에서 AGC의 신경-보호 역할에 일정 부분 이상 기여하는 것일 수 있는 활성 성분으로서 짧은 펩타이드 2개를 AGC에서 성공적으로 동정하게 되었다.
H2O2는 뇌허혈증, 외상, 뇌 노화, 알츠하이머 질병 등과 같은 신경계 질환의 발병에 관여하는 중요한 반응성 산소 물질이다. 이것은 막의 지질을 과산화하고, 세포 막의 유동성을 감소시키며, 세포내 단백질의 성분과 활성을 달라지게 하고, 염색질을 응축시키고, DNA를 파괴하여, 궁극적으로 세포 사멸을 일으킨다.
자극성 아미노산, 예를 들어, 글루탐산은 신경 사멸을 동반할 수 있는 다양한 만성 또는 급성 신경병증 진행에 중요한 역할을 담당한다. 글루탐산은 신경 세포주와 일차 신경 세포를 농도 의존적인 방식으로 손상시킬 수 있다. 이것은 세포내 칼슘 이온 증가 및 시스틴 흡수 차단에 원인이 될 수 있으며, 세포내 환원된 글루타티온 (GSH)의 감소를 유도하고, 산소 라디칼을 증가시키고, 신경 세포 사멸을 유도한다. 따라서, H2O2 또는 글루탐산-유발성 신경 세포 손상 모델은 신경보호제를 스크리닝하기 위한 모델로서 사용할 수 있다.
이에, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내에서 H2O2에 노출되었을 때, 신경 세포의 생존성을 보존하기 위해 사용되며, 펩타이드 1 및 5의 조합 사용시 예측하지 못한 상승 효과를 나타낸다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 L-글루탐산-처리된 PC12 세포에 보호 효과를 나타내며, 펩타이드 1 및 5의 조합 사용시 예측하지 못한 상승 효과를 나타낸다.
신경 활동에는 지속적인 산소 및 글루코스 공급이 필수적이다. 산화적 대사가 손상되면, 이온 및 대사성 케스케이드 현상들이 발생되어 신경 사멸에 이르게 된다. 이에, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내에서 저혈당 및 저산소 조건에서 신경 세포의 생존성을 보존하기 위해 사용되며, 펩타이드 1 및 5의 조합 사용시 예측하지 못한 상승 효과를 발휘한다.
일 구현예에서, 본 발명은 신경 세포에 펩타이드 1 및/또는 5를 처리하거나 또는 펩타이드 1 및/또는 5를 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서 H2O2 노출시 신경 세포의 생존성을 보존하는 방법에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 신경 세포에 펩타이드 1 및/또는 5를 처리하거나 또는 펩타이드 1 및/또는 5를 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서 저혈당 및/또는 저산소 조건에서 세포의 생존성을 보존하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 신경 세포에 펩타이드 1 및/또는 5를 처리하거나 또는 펩타이드 1 및/또는 5를 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서 글루탐산-유발성 손상으로부터 신경 세포를 보호하는 방법에 관한 것이다.
달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 과학 용어들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공통적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 예시적인 방법들과 재료들이 후술되지만, 이의 등가의 것도 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참조문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 그 전체 내용이 포함된다.
본 발명은 이제 아래 실시예들을 들어 추가로 기술되지만, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 Analgecine ® (AGC)에서 활성 성분 분리 및 규명
1.1. Analgecine 활성 성분의 분리 및 구조 분석
1.1.1. 재료 및 방법
1) 샘플 준비
백시니아 바이러스를 접종하여 유발된 염증을 앓고 있는 토끼 피부로부터 제조된 생물 물질들의 혼합물 약 200 ㎕를 진공 원심분리기에서 건조시켰다.
동결건조된 물질에 8 M 우레아 및 0.5 M 다이티오트레이톨 (DTT)이 함유된 0.5 M 암모니아 바이카보네이트 완충제 (pH 8.5) 100 ㎕를 첨가하여 재구성하고 1시간 동안 37℃에 둔 후, 4℃ 암 조건으로 옮겨 2시간 두고, 이때 0.5 M 요오도아세트아미드 (IAM) 10 ㎕를 첨가하여 알킬화 반응을 수행한 다음 암모늄 바이카보네이트 400 ㎕로 희석하였다. 그런 다음, 수득한 용액에 트립신 0.2 ㎍을 첨가하여 37℃에서 18시간 두어 효소 분해한 후, 트립신-처리된 용액에 10% 트리플루오로아세트산 (TFA) / H2O를 첨가하여 pH 3.0으로 산성화하였다. 반응 후, 산성화된 용액을 전부 0.1% TFA/H2O (pH 3.0) 2 L로 미리-평형화한 역상 C18 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 0.1% TFA/H2O (pH 3.0) 200 ㎕로 헹군 다음 0.1% TFA 중의 50% -> 100%의 단계적인 아세토니트릴 농도 구배를 사용해 실온에서 용출시켰다. nano-LC-MS/MS에서 대조군으로서, 동결건조된 산물로부터 재구성한 액체를 전술한 바와 같이 환원, 알킬화, 탈염 및 산성화를 처리하였으나, 트립신을 이용한 효소 분해는 수행하지 않았다.
2) Nano-LC-MS/MS 분석
용출된 분획들을 수집하여, 진공 원심분리기에서 건조한 다음 80% ACN/H2O 25 ㎕으로 재구성하고, LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)에 의해 분석하였다. 역상 nano-LC 분리는 Agilent 1200 series nanoow system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에서 수행하였다. 분획에서 취한 총 10 ㎕ 샘플을 Agilent Zorbax XDB C18 프리컬럼 (0.35 mm, 5 ㎛)에 로딩한 다음, C18 컬럼 (i.d. 75 ㎛ x 25-cm, 3 ㎛, Micro Tech, Fontana, CA)을 이용해 분리하였다. 사용한 이동상은 (A) 0.1% FA 및 (B) 0.1% FA/100% ACN이었다. 90분간 5% -> 35% (B)의 선형 농도 구배를 유속 300 nL/min로 이용하였다. 주입 니들에 전압 1.8 Kv를 인가함으로써 파지티브 이온 모드에서 펩타이드를 분석하였다. MS는, 1회 풀 스캔 (one full scan)을 Orbitrap (R = 60 000, m/z 400)에서 속도 30 ms/scan으로 수행하는, 데이타-의존형 모드에서 조작하였다. LTQ에서 표준화된 붕괴 에너지 값 35%로 프래그멘테이션 (fragmentation)에서 가장 센 피크 6개를 선별하였다. 반복 기간 30 s를 적용하여, 프래그멘테이션을 위한 재-선택에서 동일한 m/z 이온은 배제시켰다.
3) 데이타베이스 검색 및 동정
MASCOT 검색 프로그램을 이용한 정확한 매칭을 위해 Swiss-Prot 데이타베이스에서 동물 분류 (animal taxonomy)에 대해 검색함으로써, nanoLC-MS/MS 스펙트럼으로부터 변환된 피크 리스트로 펩타이드를 동정하였다 (http://www.matrixscience.com; Hirosawa et al., 1993). 프리커서 이온 및 프래그먼트 이온의 질량 허용치 (mass tolerance)는 각각 10 ppm 및 0.8 Da로 설정하였다. 카르브아미도메틸화 (C)를 고정 변형 (fixed modification)으로서 허용하고 가변 변형으로서 트립신을 허용하지 않도록, 검색을 수행하였다.
Mascot 개개 이온 스코어가 20 보다 높을 경우, 펩타이드가 동정된 것으로 간주하였다 (p < 0.05).
1.1.2. 결과
이전 실험 증거는, 백시니아 바이러스의 접종으로 유발되는 염증성 토끼 피부의 조 추출물이 통각상실증에 약리학적 효능을 발휘할 수 있다는 것을, 보여준다. 그러나, 이 추출물내 단백질 농도는 매우 낮고 검출 한계 미만이며, 이는 단백질-수준의 물질이 통각상실증에 중요한 역할을 수행하기 거의 어렵다는 것을 의미한다. 어떤 유형의 성분이 이러한 효능에 관여하는 지에 대한 식견을 얻기 위해, nano LC-MS/MS를 이용하여 단위 전하 당 질량 (mass-to-charge ratio) (m/z) 차이를 측정하는 프로테오믹 접근법을 적용하였다. 그런 후, 트립신 처리로 제조된 단백질 단편 또는 트립신 처리하지 않은 단백질 단편의 질량 스펙트럼 패턴을 사용해, 데이타은행에 등재된 기존에 공지된 단백질의 결과와 비교하여, 전체 (intact) 단백질 (단백질 ID)을 동정하는데 이용할 수 있는 펩타이드를 검증하였다. 따라서, 샷건 분석을 통해 펩타이드의 광범위 커버리지 (extensive coverage)를 달성하여, 폴리펩타이드 또는 소형 펩타이드의 발현 프로파일을 해명하고, 서열을 동정하고, 생화학적 특징을 규명할 수 있다. 이 작업에 사용된 방법의 흐름도를 도 1에 도시한다. 이 작업으로 동정된 펩타이드와 생화학적 특징을 표 1에 열거한다. MS/MS 분석에서 대표적인 펩타이드 피크를 검출하고 (도 2), MASCOT 검색을 통해 단백질을 확실하게 동정하였다. 이중 하전된 이온 m/z 773.3192의 MS/MS 스펙트럼을 도시한다. y- 및 b-프래그먼트 이온 시리즈에서 MS 차이로 확인되고 토끼 α1-안티프로테나제 F의 잔기 1-14와 매칭된, 아미노산 서열 DEAQETAVSSHEQD (서열번호 2)은, 인간, 마우스 및 보바인의 α1-안티프로테나제 F에는 존재하지 않는다. 이들 2종의 펩타이드는 길이 차이는 있지만, 토끼 α1-안티프로테나제 F의 아미노산 서열과 동일한 기원을 공유한다.
표 1: nano LC-MS/MS 분석의 MS/MS 스펙트럼에 의해 동정된 소형 펩타이드 2종의 특징
펩타이드 동정된 단백질 pI / 질량, Da
1 DEA-X1 (DEAQETAVSSH) 4.13 / 1173.16
5 DEA-X5 (DEAQETAVSSHEQD) 3.83 / 1545.49
1.2. AGC 활성 성분의 화학적 특성
1.2.1. 재료 및 방법
1) 펩타이드 합성
첫번째 아미노산이 미리 로딩된 Wang 수지, N-Fmoc 아미노산 및 PyBOP를 사용해 고상 합성기 (PS3, Protein Technologies, Inc.)에서 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드 조산물을 RP-18 컬럼을 이용해 중압 액체 크로마토그래피 (MPLC)에 의해 정제하였고, 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 UV 220 nm 파장에서 검출하여 순도 >95%를 검증하였다. 이들 펩타이드는, 추가적으로 연구하기 전에, MALDI-TOF 질량 분광측정기 (Autoflex III system, Bruker Daltonics)와 핵 자기 공명 분광측정 (Varian 400 MHz)을 수행하여 특징을 규명하였다. 펩타이드-5는 또한 Mission Biotech Co. (M.B. Taipei, Taiwan)로부터 입수하였으며, 본 발명에서 합성한 것과 동일한 진통 활성 (analgesic activity)이 확인되었다.
2) 안정성 검사
펩타이드-5를 여러가지 pH의 용액 시리즈에 용해하여, 3일간 세워두었다. 제조한 각 용액에서 적량씩 취하고, Nucleodur Pyramid C18 컬럼 (250 mm x 4.6 mm, 5 ㎛)과 유속 0.2 mL/min의 농도 구배 용출 (0분: 0.1% TFA/H2O; 10분: 0.1% TFA/MeOH; 15분: 0.1% TFA/MeOH)를 적용하여 HPLC (Agilent 1100 series)에 의해 분석하였다. UV 검출기에서 파장 220 nm에서 신호를 모니터링하였다. 안정성 검사에서 수집한 샘플을, 또한, 매트릭스로서 2,5-다이하이드록시벤조산 (DHB)을 이용해 MALDI-TOF Mass (Bruker Daltonics, Autoflex III)으로 분석하였다. 또한, 7.8분 신호에 대응되는 포션 (portion)을 수집하여, MALDI-MS 분석을 수행하였다. 또한, 펩타이드-5를 PBS 중에 50 μM로 준비하고, 원편광이색성 (Jasco, J-810)을 기록하였다.
1.2.2. 결과
도 3에 나타낸 바와 같이, 펩타이드-5를 3일간 다양한 pH (pH 2.0 내지 8.5)의 용액에 첨가하여 두었다. 제조 용액을 HPLC로 분석하고, UV 검출기에서 크로마토그램을 기록하였다 (청색 선: 블랭크; 적색 선: pH 2.0; 녹색 선: pH 4.0; 분홍색 선: pH 7.0; 검정색 선: pH 8.5). 펩타이드-5의 체류 시간은 7.8분이었다. 이는, 펩타이드-5 자체가 심지어 강 산성 환경에서도 안정적이라는 것을, 의미한다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 펩타이드-5는 다양한 pH (pH 2.0 내지 8.5)의 용액에서 안정적이다. 샘플의 MALDI-TOF MS 스펙트럼은 (a) pH 2, (b) pH 4, (c) pH 7 및 (d) pH 8.5 각의 용액내의 샘플에 대한 것이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 펩타이드 5 (50 μM)의 CD에서, 펩타이드 5는 매우 안정적인 것으로 드러났다. CD는 좌원편광과 우원편광의 차별적인 흡수를 의미하며, 이는 펩타이드 또는 단백질의 2차 구조의 지표로서 사용할 수 있다.
펩타이드 1의 안정성과 이의 CD 패턴은 펩타이드 5와 유사하였다 (데이타는 도시 안함).
1.2.3. 요약
상기한 실험들을 통해, AGC에서 단리된 펩타이드가 용매 중에서 적어도 pH 값 변동으로부터 매우 안정적이라는 것을 검증하였고 CD 패턴을 확인하였다. 그래서, 이들 펩타이드는 구조 및 서열에 유의한 변화없이 생체내에 제공될 수 있다.
실시예 2
2.1 과산화수소에 처리된 PC12 세포에 대한 보호 효과
2.1.1 재료 및 방법
1) H2O2 노출시 PC12 세포 생존에 있어, 단리된 펩타이드 또는 AGC
신경절 세포의 일부 특징을 나타내는 랫 부신수질의 갈색세포종으로부터 유래된 PC12 세포를 중국 베이징에 위치한 중국 의과학회에서 입수하였다. H2O2 노출시 세포 생존성을 조사하기 위해, PC12 세포를 96웰 플레이트에서 컨플루언시로 배양하고, 배지를 200 μM H2O2이 포함된 무혈청 배지 (최종 부피 100 ㎕)로 교체하여 24시간 두었다. 세포에 처리하는 경우, H2O2에 노출시키기 전 1시간 동안 단리된 펩타이드 또는 ACG를 웰에 첨가하였다. 24시간 인큐베이션한 다음, 100 ㎕ MTT (최종 농도 0.5 mg/ml)을 첨가하여 4시간 인큐베이션하고, 이후 Fluostar 마이크로플레이트 리더 (BMG, Germany)에서 540 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존성을 평가하였다.
2) 통계학적 분석
데이타는 평균 ± 표준 오차 (SE)로 나타내었으며, 분산 분석 및 Neuman-Keuls 검정을 통해 다중 비교를 수행하였다. P<0.05에서 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 신경학적 결함 데이타는 비-모수적 Mann-Whitney 검정으로 평가하였다.
2.1.2 결과
실험에서, AGC는 0.25 U/ml，0.5 U/ml 및 1 U/ml 농도에서 H2O2-처리된 신경 세포에 대해 보호 효과를 가지고 있으며 (도 6; **p<0.01, n=4), 펩타이드 1과 펩타이드 5 (각각 10 ㎍/ml)는 H2O2-처리된 신경 세포 각각에 대해 어느 정도 보호 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, 펩타이드 1과 펩타이드 5를 조합 처리하면, AGC와 동일한 수준의 신경 세포 보호 효과가 확인되었다 (도 7; p<0.01, n=3).
2.1.3. 요약
H2O2-유발성 세포독성으로부터 세포를 보호하는 효과를 스크리닝함으로써, (1) AGC가 0.25-1 U/ml 농도에서, PC12 세포의 H2O2 노출로부터 유래되는 세포독성에 대해 실제 보호 효과를 가지고 있으며; (2) 펩타이드 1 및 5가 신경 세포 PC12 세포의 H2O2-유발성 세포독성을 일정 부분 이상 효과적으로 예방할 수 있으며; (3) 펩타이드 1과 5의 조합 사용이 H2O2-유발성 세포독성으로부터 PC12 세포를 보호하는데 상승적인 효과를 발휘하며, 그 보호 효과가 AGC 1 U/ml을 이용한 경우와 같이 강력하다는, 증거를 제시해준다.
2.2 L-글루탐산 처리된 PC12 세포에 대한 보호 효과
2.2.1 재료 및 방법
1) L-글루탐산 노출시 동정된 펩타이드 또는 AGC가 PC12 세포 생존에 미치는 효과
PC12 세포를 중국 베이징에 위치한 중국 의과학회에서 입수하였다. L-글루탐산에 노출되었을 때 세포의 생존성을 조사하기 위해, PC12 세포를 96웰 플레이트에서 무혈청성 RPMI-1640 배지 중에 컨플루언스로 배양하였다. 세포에 처리하는 경우, 1 mM L-글루탐산이 함유된 Mg2 +-무함유 이글 배지에서 L-글루탐산에 노출시키기 전에, 동정된 펩타이드 또는 AGC를 소정의 농도로 웰에 첨가하여 1시간 두었다. 15분간 인큐베이션한 후, 배지를 무혈청 RPMI-1640으로 교체하였다. 24시간 인큐베이션한 후, 100 ㎕ MTT (최종 농도 0.5 mg/ml)를 첨가하여 다시 4시간 인큐베이션하였고, 이후 Fluostar 마이크로플레이트 리더 (BMG, Germany)에서 540 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존성을 평가하였다.
2) 통계학적 분석
데이타는 평균 ± 표준 오차 (SE)로 나타내었으며, 분산 분석 및 Neuman-Keuls 검정을 통해 다중 비교를 수행하였다. P<0.05에서 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 신경학적 결함 데이타는 비-모수적 Mann-Whitney 검정으로 평가하였다.
2.2.2. 결과
이 실험에서, AGC는 여러 농도 (0.25 U/ml, 0.5 U/ml 및 1 U/ml)에서 PC12 세포의 세포 생존율에 긍정적인 효과를 나타내며 (도 8; *p<0.05, **p<0.01, n=4), 펩타이드 1와 펩타이드 5 (각각 10 ㎍/ml)는 L-글루탐산-처리 PC12 세포에 각각 어느 정도의 보호 효과를 나타낸다는 것이 입증되었다. 흥미롭게도, 펩타이드 1과 5를 조합 처리하면, AGC와 동일한 수준의 신경 세포 보호 효과가 발휘되었다 (도 9; *p<0.05, **p<0.01, n=3).
2.2.3 요약
PC12 세포를 L-글루탐산에 노출시켰을 때 관찰되는 결과와 마찬가지로, L-글루탐산-유발성 세포독성으로부터 세포를 보호하는 효과를 스크리닝함으로써, (1) AGC가 0.25-1 U/ml 농도에서, PC12 세포의 L-글루탐산 노출로부터 유래되는 세포독성에 대해 실제 보호 효과를 가지고 있으며; (2) 펩타이드 1 및 5가 신경 세포 PC12 세포의 L-글루탐산-유발성 세포독성을 일정 부분 이상 효과적으로 예방할 수 있으며; (3) 펩타이드 1과 5의 조합 사용이 L-글루탐산-유발성 세포독성으로부터 PC12 세포를 보호하는데 상승적인 효과를 발휘하며, 그 보호 효과가 AGC 1 U/ml을 이용한 경우와 같이 강력하다는, 증거를 제시해준다.
2.3 저혈당, 저산소 또는 저혈당-저산소 조건에서 PC12 세포의 세포 생존성 에 대한 보호 효과
2.3.1 재료 및 방법
1) 저혈당, 저산소 또는 저혈당-저산소 조건에서 배양시, PC12 세포의 생존에 미치는 AGC 및 펩타이드 1 또는 5의 효과
PC12 세포를 전술한 바와 같이 증식 및 배양하였다. 저혈당 조건을 유도하는 경우, PC12 세포가 단층이 되었을 때 125 μM 염화코발트 (CoCl2, Sigma, USA)를 배양 배지에 첨가하여, 전술한 바와 같이 24시간 더 인큐베이션하였다. 저혈당 조건을 유도하는 경우, PC12 세포가 단층으로 증식되었을 때, 배양 배지를 글루코스-무함유성 이글스 배지로 교체하여, 24시간 더 배양하였다. 저혈당 및 저산소 조건을 유도하는 경우에는, PC 세포를 125 μM CoCl2가 첨가된 글루코스-무함유 이글스 배지에서 배양하였다. 24시간 후, 세포를 회수하여, MTT 분석을 수행하였다.
2) 통계학적 분석
데이타는 평균 ± 표준 오차 (SE)로 나타내었으며, 분산 분석 및 Neuman-Keuls 검정을 통해 다중 비교를 수행하였다. P<0.05에서 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. 신경학적 결함 데이타는 비-모수적 Mann-Whitney 검정으로 평가하였다.
2.3.2 결과
본 실험에서, AGC (0.5 U/ml, 1 U/ml)가 저혈당 및 저산소 조건에서 PC12 세포를 세포 사멸로부터 보호하는 효과가 있다는 것이 확인되었다 (도 10). 펩타이드 1과 펩타이드 5 (각각 10 ㎍/ml)도 각각 보호 효과를 나타내었다. 그러나, 이들 펩타이드 2종을 조합하여 세포에 처리한 경우, AGC와 동일한 수준의 효과가 발휘되었다 (도 11).
2.3.3 요약
본 실험에서, (1) AGC는, 0.25-1 U/ml 농도에서, 저산소증, 저혈당증 또는 조합 조건 (저산소증+저혈당증)에 PC12 세포가 노출됨으로써 발생되는 세포독성에 대해, 보호 효과를 실제 가지고 있으며; (2) 펩타이드 1 또는 5는, 각각 사용시, 저산소증에 의해 유발되는 세포 사멸에 대해 일부 보호 효과를 가지고 있지만, 저혈당 또는 (저혈당증+저산소증)으로 인해 유발되는 세포독성에 대해서는 보호 효과가 없다는 것을 보여주는 데이타를 제시한다. (3) 그러나, 펩타이드 2종을 조합 사용하였을 때, 펩타이드 1 + 펩타이드 5는 저산소증, 저혈당증 또는 저산소증 + 저혈당증에 노출시 PC12 세포를 사멸로부터 보호하였으며, 보호 효과는 AGC 1 U/ml을 사용한 경우와 비슷한 수준이었다.
2.4 i.v. 주사 후 펩타이드 1 및 펩타이드 5의 생체내 분포
2.4.1 재료 및 방법
C57B/L6 마우스 (6-8주령, 암컷)를 대만 국립 실험 동물 센터에서 구입하였다. 광학 영상 촬영을 위해, 동물을 산소가 혼합된 2% 이소프란 기체로 마취하였으며, Cy5.5-펩타이드 1 접합체 또는 Cy5.5-펩타이드 5 접합체 (35 nmole/마우스)를 정맥내 (i.v.)로 주입하였다. 투여 후, 마우스를 어두운 박스 안에 복와위 또는 앙와위 자세로 배치하고, 저조도에서 사진 이미지를 먼저 촬영하였다 (노출 시간: 5초). 프로브 (probe) 투여 후 지정된 시점에, 열전기적으로 -70℃로 냉각시킨 CCD 카메라 (Xenogen - IVIS ® Spectrum Imaging System, Xenogen Technology)를 사용해 형광 신호를 입수하였다. 프로톤 인테그레이션 기간 (photon integration period)은 1-2초였다. 최고 photon/sec/cm2/sr (photos/second/centimeter2/steradian)로서 형광 신호를 기록하고, 의사 색상 (pseudocolor)으로 표시하고, 제노겐의 리빙 이미지 소프트웨어를 사용해 사진영상에 오버랩하였다.
2.4.2 결과
생체내 이미징 시스템 (IVIS; Perkin Elmer, USA)을 이용하여, 마우스에 i.v.로 주사한 펩타이드 2종의 분포를 관찰할 수 있다 (도 12). 마우스에 1.v. 주사하고 15분 후, 펩타이드 1과 펩타이드 5는 혈액-뇌 장벽을 통과하여, 뇌에 도달하였다. 이들 펩타이드는 주사한 지 30분만에 척추에 도달한 것으로 관찰되었다. 펩타이드는 1-4시간 동안 IVIS 관찰가능한 수준으로 마우스 체내에 체류하였다. 펩타이드는 대사 및 배출되었다. 또한 생체외 추출한 장기에서도 펩타이드의 존재가 검출되었다.
2.4.3 요약
따라서, 본 발명자들은, 펩타이드 1 및 5가 복막내 투여 후 15 내지 30분 정도로 빨리 말초 순환계에서 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌와 척추까지 이동할 수 있음을, 검증하였다.
본 발명은 본원에 첨부된 청구항에 언급된 발명의 내용에 대해 적용가능한 법에 의해 허용가능한 모든 변형 및 등가를 포괄한다.
SEQUENCE LISTING <110> PRIME BIO-DRUG DEVELOPMENT LIMITED <120> THERAPEUTIC PEPTIDES FOR CEREBROVASCULAR DISEASES <130> FPCH14160101P <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <400> 1 Asp Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown <400> 2 Asp Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His Glu Gln Asp 1 5 10

Claims (15)

  1. 개체에서 뇌혈관 질환을 치료 또는 개선하는 방법으로서, DEAQETAVSSH (서열번호 1)와 70% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이의 변이체, 돌연변이, 유도체 또는 단편 중 하나 이상을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아미노산 서열이 서열번호 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩타이드가 서열번호 1 및/또는 DEAQETAVSSHEQD (서열번호 2)를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드가 서열번호 1 및/또는 서열번호 2로 실질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드가 하나 이상의 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환이 C-말단 및/또는 N-말단에 위치하는, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 펩타이드가 1-5개, 바람직하게는 1-3개의 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌혈관 질환이 기능적 결함 (functional deficit)을 동반한 신경계 손상을 유발하는 질환인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌혈관 질환이 허혈성 뇌 손상 또는 출혈성 뇌 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌혈관 질환이 뇌졸증 (stroke)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌혈관 질환이 신경 세포를 보호함으로써 치료 또는 개선되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가 인간인, 방법.
  13. 개체에서 뇌혈관 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 서열번호 1과 70% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 그 변이체, 돌연변이, 유도체 또는 단편 중 하나 이상의 용도.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 펩타이드가 서열번호 1 및/또는 서열번호 2를 포함하는, 용도.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 펩타이드가 서열번호 1 및/또는 서열번호 2로 실질적으로 구성되거나 또는 구성되는, 용도.
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