CN107847550A - 用于脑血管疾病的治疗肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过使用从牛痘病毒致炎兔皮提取物分离的肽治疗或改善受试者的脑血管疾病的方法。本发明还涉及包含与SEQ ID NO:1具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽，或其变异体、突变体、衍生物或片段。

Description

用于脑血管疾病的治疗肽
发明领域
本发明涉及脑血管疾病的治疗。具体地，其涉及通过使用从牛痘病毒致炎兔皮提取物分离的肽而治疗或改善受试者的脑血管疾病的方法。
发明背景
脑血管疾病为局部脑血液供应异常引起的神经功能损伤。在大多数国家，脑血管疾病为所有死亡原因的前三位，可导致成年人脑损伤。脑血管疾病为危及中年和老年人的健康的主要原因，并且为大多数国家中年和老年人死亡或残疾的主要原因。
中风是急性脑血管疾病的一种，其为全世界人口死亡的第三个主要原因，在各种疾病中诱发最高的残疾率。脑血管疾病可严重影响老年人的生活质量，给患者家庭和社会带来巨大负担。其在年轻人群中也有上升趋势。
脑血管疾病主要分为两种类型，出血性和缺血性，其中后者占60-70%，为最常见的脑血管疾病类型。研究缺血性脑血管疾病的病理生理机制并寻找起神经保护功能的药物非常重要。
自二十世纪八十年代以来，对脑缺血病理生理机制的研究一直是神经科学领域的热点之一，至今提出了脑缺血的能量代谢、酸中毒、过氧化损伤、兴奋性氨基酸诱导的毒性损伤、钙超载等学说，其中后两者在缺血性神经元损伤和死亡中起重要作用。根据缺血性脑血管病的病理生理基础，目前临床上用于治疗脑缺血的药物主要包括钙离子拮抗剂(尼莫地平)、氧自由基清除剂(VitE、SOD)、神经营养因子(神经生长因子、神经营养因子)、兴奋性氨基酸拮抗剂、抗氧化剂和改善迟发性神经元损伤的药物。这些药物通过不同的作用机制发挥作用，但治疗作用不确定或特异性不强或伴有严重不良反应，因此尚不能满足临床需要。存在许多可用于改善脑循环、代谢和功能的市售可得的药物，例如吡拉西坦(piracetam)、氟桂利嗪(flunarizine)、卡兰(calan)、银杏提取物。尽管它们都具有某些特征，但其对脑血管疾病的治疗效果不确定。用于治疗缺血性脑血管疾病的新型药物的研究和开发在药学和药理学领域变得愈来愈重要。
牛痘病毒致炎兔皮提取物以商品名恩再适(analgecine)市售可得，其由VanworldPharmaceutical (Rugao) Co. Ltd制造。先前的实验证据显示接种牛痘病毒诱导的炎症性兔皮的粗提取物可对镇痛产生生理学效果。然而，促成该效果的恩再适的活性成分尚未有报道。因此，需要深入了解哪些组分涉及这一效果。
发明概述
在一个方面，本发明提供用于治疗或改善受试者的脑血管疾病的方法，其中所述方法包括给予受试者有效量的一种或多种包含与DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变异体、突变体、衍生物或片段。
在另一个方面，本发明提供一种或多种包含与SEQ ID NO: 1具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变异体、突变体、衍生物或片段在制造用于治疗受试者的脑血管疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，如本文所述的脑血管疾病为导致神经系统损伤伴随功能缺陷的脑血管疾病。在一个具体的实施方案中，如本文所述的脑血管疾病选自：缺血性脑损伤或出血性脑损伤。在一个更具体的实施方案中，所述脑血管疾病为中风。
表述“与SEQ ID NO: 1具有至少70%同一性”意在指与SEQ ID NO: 1具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性的氨基酸序列。
在进一步的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO: 1和/或DEAQETAVSSHEQD (SEQID NO: 2)。在一个更具体的实施方案中，所述肽由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2组成。
在多个实施方案中，所述肽包含至少一个氨基酸添加、缺失和/或置换，优选1-5个，优选1-3个氨基酸添加、缺失和/或置换。在另一个实施方案中，所述氨基酸添加、缺失和/或置换位于C-端和/或N-端。
在又一个实施方案中，所述疾病通过保护神经细胞而治疗或改善。
在一个具体的实施方案中，所述受试者为人。
在另一个方面，本发明涉及编码本发明肽的多核苷酸，包含这样的多核苷酸的载体，以及包含这样的多核苷酸或这样的载体的宿主细胞。
在另一个方面，提供包含有效量的本发明肽、如本文所述的多核苷酸、载体或宿主细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还涉及用作药物的如本文所述的肽、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物。具体地，本发明涉及包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2或由SEQ ID NO: 1和SEQ IDNO: 2组成的肽组合物，包含这样的组合物的药物组合，及其使用方法。
附图简述
图1为用于从接种牛痘病毒诱导的发炎兔皮的粗提取物筛选多肽/小肽-水平镇痛剂的程序的图示。
图2说明功能肽的鉴定。示出了双价离子m/z 772.745的MS/MS光谱。作为例子显示的一个氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)从y-和b-碎片离子系列的MS差异确定并与兔α1-抗蛋白酶F的残基1-14匹配。
图3说明肽-5在多个pH值下的稳定性。
图4显示样品的MALDI-TOF MS光谱。
图5显示肽5的CD (圆二色性)。
图6说明用或不用AGC 0.25、0.5或1 U/ml处理，暴露于H2O2 24 h的PC12细胞的细胞存活。**与无处理相比P<0.01。数据表示为来自3个实验的平均值± SD。
图7说明用或不用ACG 1U/ml或肽1 (10 µg/ml)、肽5 (10 µg/ml)或肽1和5组合(每种10 µg/ml)处理，暴露于H2O2 24 h的PC12细胞的细胞存活。**与单独使用肽1或5相比P<0.05。数据表示为来自3个实验的平均值± SD。
图8说明AGC对L-谷氨酸处理的PC12细胞的细胞存活的作用。
图9比较AGC、肽1和肽5之间对L-谷氨酸处理的PC12细胞的细胞存活的作用。
图10说明用或不用AGC 0.25、0.5或1 U/ml处理，PC12细胞在低血糖、缺氧或二者组合的条件下持续24 h的细胞存活。**与无处理相比P<0.01。数据表示为来自3个实验的平均值± SD。
图11说明用或不用AGC 1 U/ml或肽1 (SEQ ID NO: 1) (10 µg/ml)、肽5 (SEQ IDNO: 2) (10 µg/ml)或肽1和5组合(每种10 µg/ml)处理，PC12细胞在低血糖、缺氧或二者组合的条件下持续24 h的细胞存活。**与单独使用肽1或5相比P<0.01。数据表示为来自4个实验的平均值± SD。
图12显示注射肽1和5(左侧和右侧大鼠)使得15和30分钟内在脑中检测到高荧光强度(以黄色显示)，而注射对照肽没有(中)。数据代表3个实验。
图13显示注射肽1和5(左侧和右侧大鼠)使得30和60分钟内在脊髓中检测到高荧光强度(以黄色显示)，而注射对照肽没有(中)。数据代表3个实验。
发明详述
本发明人令人惊讶地发现从牛痘病毒致炎兔皮提取物分离的2种肽在体外和/或体内，在缺氧、低血糖条件或二者组合下，当暴露于H2O2或L-谷氨酸时明显保持神经细胞存活力。更令人惊讶地，肽1和肽5对抑制缺氧、低血糖条件或二者组合、H2O2和L-谷氨酸诱导的神经元细胞(PC12)的细胞毒性显示协同作用，具有与使用AGC (例如，1U/ml)所观察到的相似的效能。我们的数据因此成功鉴定了在AGC中作为活性成分的两种短肽，其可至少部分是AGC在缺血性中风中的神经保护作用的原因。
H2O2是重要的活性氧组分，与神经系统疾病例如脑缺血、创伤、脑老化、阿尔兹海默病等的发作有关。H2O2会使膜脂过氧化、降低细胞膜流动性、改变胞内蛋白的组分和活性、使染色质浓缩和DNA破碎，并最终导致细胞死亡。
兴奋性氨基酸，例如谷氨酸，在将会伴随神经元死亡的各种慢性或急性神经病的进程中发挥重要作用。谷氨酸可以以剂量依赖的方式损伤神经细胞系和原发神经细胞。其导致增加的细胞内钙离子和阻断的胱氨酸摄取，并且诱导细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的丢失、增加的氧自由基和神经细胞死亡。因此，H2O2或谷氨酸-诱导的神经细胞损伤模型可用作神经保护剂的筛选模型。
因此，在一个实施方案中，本发明肽用于在体外和/或体内保持暴露于H2O2时的神经细胞存活力，并且组合使用肽1和5时观察到预料不到的协同作用。在另一个实施方案中，本发明肽显示对L-谷氨酸-处理的PC12细胞的保护作用，并且组合使用肽1和5时观察到预料不到的协同作用。
神经元活性需要连续的氧和葡萄糖供应。氧化代谢的减损引起离子和代谢事件级联，导致神经元死亡。因此，在一个实施方案中，本发明肽用于在体外和/或体内保持低血糖和缺氧条件下的神经细胞存活力，并且组合使用肽1和5时观察到预料不到的协同作用。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在体外或体内保持当暴露于H2O2时的神经细胞存活力的方法，包括用肽1和/或5处理神经细胞或给予有需要的受试者肽1和/或5。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于在体外或体内保持低血糖和/或缺氧条件下的神经细胞存活力的方法，包括用肽1和/或5处理神经细胞或给予有需要的受试者肽1和/或5。
在又一个实施方案中，本发明涉及用于在体外和/或体内保护神经细胞免受谷氨酸-诱导的损伤的方法，包括用肽1和/或5处理神经细胞或给予有需要的受试者肽1和/或5。
除非另外定义，否则本文使用的所有科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。示例性的方法和材料在下文描述，尽管可使用其等同物。本文提及的所有出版物和其它参考通过引用以其整体结合。
现在将参考下列实施例进一步描述本发明，然而，这些实施例不意在限制本发明的范围。
实施例1 恩再适® (AGC)中活性成分的分离和表征
1.1. 恩再适活性成分的分离和结构分析
1.1.1.材料和方法
1) 样品制备
在真空离心机中干燥约200 μL从患有接种牛痘病毒所诱导的炎症的兔皮产生的生物剂混合物。
冻干的材料用100 μL包含8 M脲和0.5 M二硫苏糖醇(DTT)的0.5 M碳酸氢铵缓冲液(pH 8.5) 37℃复溶1 hr，当加入10 μL 0.5 M碘乙酰胺(IAM)以烷基化时在黑暗条件下4℃持续另外2 hr，然后用400 μL碳酸氢铵稀释。随后，所得溶液然后用0.2 μg胰蛋白酶37℃消化18 h，然后用10%三氟乙酸(TFA)/H2O将胰蛋白酶-消化的溶液酸化至pH 3.0值。反应之后，将完全酸化的溶液施用到用200 L 0.1% TFA/H2O (pH 3.0)预平衡的反相C18柱上。柱同样用200 μL 0.1% TFA/H2O (pH 3.0)洗涤，然后以在0.1% TFA中从50%至100%的分级乙腈梯度室温洗脱。作为nano-LC-MS/MS中的对照，除了胰蛋白酶消化，还通过如上所提及的还原、烷基化、脱盐和酸化处理从冻干产物复溶的液体。
2) Nano-LC-MS/MS分析
收集洗脱的级分，在真空离心机中干燥，然后复溶在25 μL 80% ACN/H2O中并通过LTQOrbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)分析。在Agilent 1200系列nanoflow系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)上实施反相nano-LC分离。将总共10 μL来自级分的样品上样到Agilent Zorbax XDB C18前置柱(0.35 mm, 5 μm)，接着使用C18柱(i.d. 75 μm Х 25-cm, 3 μm, Micro Tech, Fontana, CA)分离。使用的流动相为 (A) 0.1% FA和(B) 100% ACN中的0.1% FA。应用以300 nL/min的流速在90-min期间从5%至35% (B)的线性梯度。肽通过向注射针施加1.8 Kv电压以阳离子模式分析。MS以数据-依赖性模式操作，其中使用30 ms/扫描的速率在Orbitrap (R = 60 000 at m/z 400)中以m/z 300-2000进行一次全扫描。选择在LTQ中具有35%的标准化碰撞能量值的六个最强的峰用于片段化。应用重复的30 s持续时间以从为了片段化而重新选择中排除相同的m/z离子。
3) 数据库检索和鉴定
肽用从nanoLC-MS/MS光谱转换的峰列表，通过在Swiss-Prot数据库中针对动物分类学使用MASCOT检索程序(http://www.matrixscience.com; Hirosawa等人, 1993)检索精确匹配而鉴定。先驱离子和碎片离子的质量允许偏差分别设置为10 ppm和0.8 Da。进行检索以使脲基甲基化(C)作为固定修饰，并且无胰蛋白酶作为可变修饰。
如果肽的Mascot单个离子分值高于20 (p < 0.05)则认为其被鉴定。
1.1.2. 结果
先前的实验证据显示接种牛痘病毒诱导的炎症性兔皮的粗提取物可产生对镇痛的药理学作用。然而，这些提取物中的蛋白浓度极低并且在检出限以下，这证明蛋白-水平药剂很难在镇痛中发挥关键作用。为了深入了解哪种组分涉及该作用，我们利用蛋白组学方法通过使用nano LC-MS/MS测定质荷比(m/z)差异。用或不用胰蛋白酶消化所产生的蛋白片段的质谱模式然后用于与先前已知的数据控中留存的蛋白的质谱模式比较以确认肽，这可用于完整蛋白的鉴定(蛋白ID)。因此，我们可通过鸟枪法分析实现肽的广泛覆盖，阐明多肽或小肽的表达谱并鉴定序列以及生化特征。本工作中所使用的方法的流程图在图1中显示。本工作中鉴定的肽和生化表征在表1中列出。检测了来自MS/MS分析的代表性肽峰(图2)，得到确信的通过MASCOT检索的蛋白鉴定。示出了双价离子m/z 773.3192的MS/MS光谱。从y-和b-碎片离子系列中的MS差异确定的并且与兔α1-抗蛋白酶F的残基1-14匹配的氨基酸序列DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)在人、小鼠以及牛α1-抗蛋白酶F中不存在。尽管两种肽具有不同的长度，但它们具有相同来源，均来自兔α1-抗蛋白酶F的氨基酸序列。
表1：通过MS/MS光谱从nano-LC-MS/MS分析鉴定的两种小肽的表征
肽 鉴定的蛋白 pI /质量, Da
1 DEA-X1(DEAQETAVSSH) 4.13 /1173.16
5 DEA-X5(DEAQETAVSSHEQD) 3.83 /1545.49
1.2. AGC活性成分的化学性质
1.2.1. 材料和方法
1) 肽合成
肽通过使用预装载第一个氨基酸的王氏树脂、N-Fmoc氨基酸和PyBOP通过固相合成仪(PS3, Protein Technologies, Inc.)合成。粗肽用RP-18柱通过中压液相色谱(MPLC)纯化，其纯度通过高效液相色谱(HPLC)在220 nm波长UV检测下经确认>95%。进一步研究之前通过MALDI-TOF质谱仪(Autoflex III system, Bruker Daltonics)和核磁共振光谱学(Varian 400 MHz)进行这些肽的表征。肽-5亦从Mission Biotech Co. (M.B. Taipei,Taiwan)收到并呈现与我们所合成的肽-5相同的镇痛活性。
2) 稳定性检验
将肽-5溶解在具有不同pH值的一系列溶液中并静置3天。通过HPLC (Agilent 1100series)使用Nucleodur Pyramid C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 µm)和梯度洗脱(0 min:0.1% TFA/H2O; 10 min: 0.1% TFA/MeOH; 15 min: 0.1% TFA/MeOH)以0.2 mL/min流速分析适量的每一所得溶液。通过UV检测器在220 nm波长处监测信号。稳定性检验中收集的样品同样通过MALDI-TOF Mass (Bruker Daltonics, Autoflex III)以2,5-二羟苯甲酸(DHB)作为基质分析。此外，收集7.8 min时的信号所对应的部分并对其进行MALDI-MS分析。还在PBS中制备50 µM的肽-5并记录圆二色性(Jasco, J-810)。
1.2.2. 结果
如图3中所示，肽-5在具有不同pH值(pH 2.0-8.5)的溶液中静置3天。所得溶液通过HPLC分析并在UV检测器中记录色谱图。(蓝线：空白；红线：在pH 2.0中；绿线：在pH 4.0中；粉线：在pH 7.0中；黑线：在pH 8.5中。肽-5的保留时间为7.8 min)。这表明肽5本身是稳定的，甚至在非常酸性的环境中。
如图4中所示，肽-5在不同pH值(pH 2.0-8.5)的溶液中稳定。样品的MALDI-TOF MS光谱分别对应于在(a) pH 2、(b) pH 4、(c) pH 7和(d) pH 8.5的溶液中的样品。
如图5中所示，肽5 (在50 µM中)的CD显示肽5极其稳定。CD指左和右圆偏振光的差别吸收，可用作肽或蛋白的二级结构的指示器。
肽1的稳定性及其CD模式与肽5的稳定性及其CD模式相似(数据未示出)。
1.2.3. 总结
根据上述实验，至少根据溶剂中pH值的改变和CD模式，我们证实从AGC分离的肽确实是非常稳定的。因此，这些肽可在其结构和序列无显著变化下存在于体内。
实施例2
2.1 对过氧化氢处理的PC12细胞的保护作用
2.1.1 材料和方法
1) 当暴露于H2O2时分离的肽或AGC在PC12细胞存活中的作用
PC12细胞，衍生自显示神经节细胞的某些特征的大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤，从中国北京的中国医学科学院获得。为了检查当暴露于H2O2时的细胞存活，PC12细胞在96孔板中生长至汇合，将培养基更换为包含200 µM H2O2 (终体积100 µl)的无血清培养基持续24 h。在接受处理的细胞中，暴露于H2O2前向孔中提供分离的肽或AGC持续1 h。孵育24 h后，加入100µL MTT (终浓度0.5 mg/ml)另外孵育4 h，随后通过在Fluostar酶标仪(BMG, Germany)下540 nm处的吸光度评估细胞存活。
2) 统计分析
数据表示为平均值±标准误差(SE)并通过方差分析和Neuman–Keuls检验评估多重比较。P<0.05认为差异显著。神经缺损数据通过非参数Mann–Whitney检验评估。
2.1.2 结果
在实验中，我们证明了AGC在0.25u/ml、0.5u/ml和1u/ml时对H2O2-处理的神经细胞具有保护作用(图6; **p<0.01, n=4)并且肽1和肽5 (每种肽10 ug/ml)分别对H2O2-处理的神经细胞具有一定程度的保护作用。引人关注的是，当肽1和肽5组合用于处理时，组合处理发挥出与AGC相同程度的对神经细胞的保护作用(图7; p<0.01, n=3)。
2.1.3. 总结
根据保护细胞免受H2O2-诱导的细胞毒性的作用的筛选，我们提供证据表明(1) 在0.25-1 U/ml的浓度时，AGC确实具有对抗从PC12细胞暴露于H2O2衍生的细胞毒性的保护作用；(2) 肽1和5可有效防止，至少部分上，H2O2-诱导的PC12细胞神经元细胞的细胞毒性；和(3) 肽1和5的组合使用在保护PC12细胞免受H2O2-诱导的细胞毒性中具有协同作用，并且保护作用与使用1 U/ml AGC一样有效。
2.2 对L-谷氨酸处理的PC12细胞的保护作用
2.2.1 材料和方法
1) 当暴露于L-谷氨酸时鉴定的肽或AGC在PC12细胞存活中的作用
PC12细胞从中国北京的中国医学科学院获得。为了检查当暴露于L-谷氨酸时的细胞存活，PC12细胞在96孔板内于无血清RPMI-1640中生长至汇合。在接受处理的细胞中，向孔中加入给定剂量的鉴定的肽或AGC持续1 h，然后在包含1mM L-谷氨酸的无Mg2+ Eagle’s培养基中暴露于L-谷氨酸。孵育15 min后，将培养基更换为无血清RPMI-1640。孵育24 h后，加入100µL MTT (终浓度0.5 mg/ml)另外孵育4 h，随后通过在Fluostar酶标仪(BMG, Germany)下540 nm处的吸光度评估细胞存活。
2) 统计分析
数据表示为平均值±标准误差(SE)并通过方差分析和Neuman–Keuls检验评估多重比较。P<0.05认为差异显著。神经缺损数据通过非参数Mann–Whitney检验评估。
2.2.2. 结果
在该实验中，我们证明了不同浓度的AGC (0.25u/ml、0.5u/ml和1u/ml)对PC12细胞的细胞存活率具有积极效果(图8; *p<0.05, **p<0.01, n=4)并且肽1和肽5 (每种肽10 ug/ml)分别对L-谷氨酸-处理的PC12细胞具有一定程度的保护作用。引人关注的是，当肽1和肽5组合用于处理时，组合的处理发挥出与AGC相同程度的对神经细胞的保护作用(图9; *p<0.05, **p<0.01, n=3)。
2.2.3 总结
与从LC12细胞暴露于L-谷氨酸所得到的观察结果相似，根据保护细胞免受L-谷氨酸-诱导的细胞毒性的效果的筛选，我们提供证据表明(1) 在0.25-1 U/ml的浓度时，AGC确实具有对抗从PC12细胞暴露于L-谷氨酸衍生的细胞毒性的保护效果；(2) 肽1和5可有效防止，至少部分上，L-谷氨酸-诱导的PC12细胞神经元细胞的细胞毒性；和(3) 肽1和肽5的组合使用在保护PC12细胞免受L-谷氨酸-诱导的细胞毒性中具有协同作用，并且保护作用与使用1 U/ml AGC一样有效。
2.3 在低血糖、缺氧或低血糖-缺氧条件下对PC12细胞的细胞存活的保护作用
2.3.1 材料和方法
1) AGC和肽1或5在低血糖、缺氧或低血糖-缺氧条件下培养的PC12细胞存活中的作用
PC12细胞如上文所述增殖和培养。对于低血糖条件，当PC12细胞为单层时向培养基中加入125 µM二氯化钴(CoCl2, Sigma, USA)，如所描述的进一步孵育24 h。对于低血糖的诱导，当PC12生长至单层时将培养基更换为无葡萄糖Eagle’s培养基，另外孵育24 h。对于低血糖和缺氧条件，在添加125 µM CoCl2的无葡萄糖Eagle’s培养基中培养PC12细胞。24 h后，收集细胞并对其进行MTT测定。
2) 统计分析
数据表示为平均值±标准误差(SE)并通过方差分析和Neuman–Keuls检验评估多重比较。P<0.05认为差异显著。神经缺损数据通过非参数Mann–Whitney检验评估。
2.3.2 结果
本实验显示在低血糖和缺氧条件下AGC (0.5u/ml、1u/ml)对PC12免于细胞死亡具有保护作用(图10)。单独地，肽1和肽5 (每种肽10 ug/ml)也具有保护作用。然而，当组合这2种肽处理细胞时，它们显示与AGC相同程度的作用(图11)。
2.3.3 总结
在本实验中，我们提供数据表明(1) 在0.25-1 U/ml的浓度时，AGC确实具有对抗从PC12细胞暴露于缺氧、低血糖或(缺氧+低血糖)衍生的细胞毒性的保护作用；(2) 当分开使用时，肽1或肽5对抗缺氧诱导的细胞死亡的具有一些保护效果，但对抗低血糖或(缺氧+低血糖)所诱导的细胞毒性的没有保护效果；(3) 尽管如此，当组合使用时，肽1+5对于免受暴露于缺氧、低血糖或缺氧加低血糖的组合的PC12细胞死亡具有保护作用，并且其保护作用与使用1 U/ml AGC相比程度相似。
2.4 静脉注射后肽1和5的体内分布
2.4.1 材料和方法
C57B/L6小鼠(6~8周龄，雌性)购自台湾实验动物中心。对于光学成像，用与氧混合的2%异氟醚气体麻醉动物，静脉注射(i.v.) Cy5.5-缀合的肽1或Cy5.5-缀合的肽5 (35 nmole/小鼠)。给予后将小鼠俯卧或仰卧放置在暗盒中并首先以低光(暴露时间：5秒)获取摄影图像。在给予探针之后标明的时间点，使用热电冷却至-70°C的CCD照相机(Xenogen - IVIS® Spectrum Imaging System, Xenogen Technology)获得荧光信号。光子集成周期为1-2sec。荧光信号记录为最大照片/秒/厘米2/球面度(光子/sec/cm2/sr)并使用Xenogen'sLiving Image软件以假色显示并叠加在摄影图像上。
2.4.2 结果
使用体内成像系统(IVIS; Perkin Elmer, USA)，我们可观察到通过静脉注射到小鼠中的2种肽的分布(图12)。静脉注射入小鼠后15分钟，肽1和肽5穿过血脑屏障并到达脑部。观察到肽在注射后30分钟时到达脊髓。肽在小鼠中以IVIS可观察水平停留1-4小时。肽被代谢和排出。此外，在离体提取的器官中，我们也检测到肽的存在。
2.4.3 总结
我们因此证实肽1和5可在腹膜内给予后15-30 min时迅速从外周循环迁移通过血脑屏障到达脑和骨髓。
本发明包括可适用法律允许的所附权利要求书中所述的主题的所有修饰和等同物。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1. 用于治疗或改善受试者的脑血管疾病的方法，其中所述方法包括给予受试者有效量的一种或多种包含与DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变异体、突变体、衍生物或片段。
2. 权利要求1的方法，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 1具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1和/或DEAQETAVSSHEQD (SEQID NO: 2)。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肽基本上由SEQ ID NO: 1和/或SEQ IDNO: 2组成或由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2组成。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述肽包含至少一个氨基酸添加、缺失和/或置换。
6.权利要求5的方法，其中所述氨基酸添加、缺失和/或置换位于C-端和/或N-端。
7.权利要求5或6的方法，其中所述肽具有1-5个，优选1-3个氨基酸添加、缺失和/或置换。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脑血管疾病为导致神经系统损伤伴随功能缺陷的脑血管疾病。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脑血管疾病选自：缺血性脑损伤或出血性脑损伤。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述脑血管疾病为中风。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脑血管疾病通过保护神经细胞而治疗或改善。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者为人。
13. 一种或多种包含与SEQ ID NO: 1具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变异体、突变体、衍生物或片段在制造用于治疗受试者的脑血管疾病的药物中的用途。
14. 权利要求13的用途，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2。
15. 权利要求13或14的用途，其中所述肽基本上由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2组成，或由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2组成。

Claims (23)

1. 用于治疗或改善受试者的脑血管疾病的方法，其中所述方法包括给予受试者有效量的一种或多种包含与DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变异体、突变体、衍生物或片段。
2. 权利要求1的方法，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 1具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1和/或DEAQETAVSSHEQD (SEQID NO: 2)。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肽基本上由SEQ ID NO: 1和/或SEQ IDNO: 2组成或由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2组成。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述肽包含至少一个氨基酸添加、缺失和/或置换。
6.权利要求5的方法，其中所述氨基酸添加、缺失和/或置换位于C-端和/或N-端。
7.权利要求5或6的方法，其中所述肽具有1-5个，优选1-3个氨基酸添加、缺失和/或置换。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脑血管疾病为导致神经系统损伤伴随功能缺陷的脑血管疾病。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脑血管疾病选自：缺血性脑损伤或出血性脑损伤。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述脑血管疾病为中风。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脑血管疾病通过保护神经细胞而治疗或改善。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者为人。
13. 包含与SEQ ID NO: 1具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变异体、突变体、衍生物或片段，其用于治疗或改善受试者的脑血管疾病。
14. 权利要求13的肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2。
15. 权利要求13或14的肽，其基本上由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2组成，或由SEQID NO: 1或SEQ ID NO: 2组成。
16.编码权利要求13-15中任一项的肽的多核苷酸。
17.包含权利要求16的多核苷酸的载体。
18.包含权利要求16的多核苷酸或权利要求17的载体的宿主细胞。
19.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求13-15中任一项的肽、权利要求16的多核苷酸、权利要求17的载体或权利要求18的宿主细胞，和药学上可接受的载体。
20.用作药物的权利要求13-15中任一项的肽、权利要求16的多核苷酸、权利要求17的载体、权利要求18的宿主细胞或权利要求19的药物组合物。
21. 一种或多种包含与SEQ ID NO: 1具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽或其变异体、突变体、衍生物或片段在制造用于治疗受试者的脑血管疾病的药物中的用途。
22. 权利要求21的用途，其中所述肽包含SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2。
23. 权利要求21或22的用途，其中所述肽基本上由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2组成，或由SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO: 2组成。
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