CN104321337B - 肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开内容涉及肽、所述肽用于治疗与疼痛有关的症状的用途、所述肽用于抑制流感病毒活性的用途和含有所述肽的药物组合物。

Description

肽及其用途
技术领域
本公开内容涉及蛋白质鉴定和药学领域。特别地，它涉及具有强效镇痛作用和抗流感病毒作用的天然肽、编码其的多核苷酸、其制备及用途和含有所述肽的药物组合物。
发明背景
疼痛是通常由强烈或损害性刺激引起的不愉快的感觉。国际疼痛研究协会（International Association for the Study of Pain）将‘疼痛’广泛定义为“与实际或潜在组织损害相关的或根据此类损害描述的不愉快的感觉和情绪体验”（Pain 1979；6:247–8）。疼痛是美国医生会诊的最常见原因（Raj PP. Taxonomy and classification ofpain. In：Niv D，Kreitler S，Diego B，Lamberto A. The Handbook of Chronic Pain.Nova Biomedical Books 2007）。它是许多医学状况中的主要症状，并且可以显著干扰个人的生活质量和一般功能（Breivik H，Borchgrevink PC，Allen SM，Rosseland LA，Romundstad L，Hals EK，Kvarstein G，Stubhaug A. Assessment of pain. Br JAnaesth. 2008；101（1）:17–24）。在大多数情况下，疼痛通常是短暂的，仅持续直到伤害性刺激被去除或潜在损害或病理现象已痊愈。然而，一些疼痛状况例如类风湿性关节炎、周围神经病变、癌症和特发性疼痛可以持续数年。持续长时间的疼痛被称为‘慢性的’，并且快速消退的疼痛被称为‘急性的’。常规地，在急性和慢性疼痛之间的区别依赖于从发作开始的无固定的时段（arbitrary interval）；两个最常用的标记是自疼痛发作以后3个月和6个月（Turk DC，Okifuji A. Pain terms and taxonomies of pain. In：Bonica JJ，LoeserJD，Chapman CR，Turk DC，Butler SH. Bonica's management of pain. Hagerstwon，MD：Lippincott Williams & Wilkins；2001），尽管一些研究者已将从急性到慢性疼痛的过渡置于12个月（Spanswick CC，Main CJ. Pain management：an interdisciplinaryapproach. Edinburgh：Churchill Livingstone 2000）。其他人将‘急性’应用于持续少于30天的疼痛，‘慢性’应用于超过6个月的疼痛，以及‘亚急性’应用于持续一到六个月的疼痛（Thienhaus O，Cole BE. Classification of pain. In：Weiner R. Pain management：apractical guide for clinicians. Boca Raton：CRC Press；2002）。
在人中，外周疼痛（peripheral pain）的察觉在游离神经末梢开始。多型疼痛受体和高阈值机械感受器（mechanoreceptors）察觉伤害性刺激例如强机械力、H+、K+、化学物质和温度。在察觉刺激后，疼痛的知觉从外周传送到脊髓（即脊髓丘脑束），随后在对侧上行前经由前白连合（在脊髓中）交叉且穿过（decussate and cross）。在达到脑前，脊髓丘脑束分成横向新脊髓丘脑束和中间旧脊髓丘脑束（Skevington，S. M. Psychology of pain.Chichester，UK：Wile 1995；第18页），随后在丘脑的腹后外侧核终止，在其中它们在躯体感觉皮质的树突上形成突触。除了引起疼痛的伤害性刺激外，对于人的外周神经的损伤通常导致持续性神经性疼痛状况，其特征在于自发地、通常为灼痛、异常性疼痛（对于非伤害性刺激的疼痛应答）和痛觉过敏（对于伤害性刺激过大的疼痛应答）。尽管交感神经阻滞疗法有时对于疼痛缓解是有效的，指示神经性疼痛至少部分通过交感神经系统中的活性维持，但许多患者无应答。阿片类对于神经病理性疼痛的有效性也是有限的（Rowbotham MC. AnnNeurol 1994；35:S46-S49），并且存在一些争论。
急性疼痛通常用药物例如镇痛药和麻醉药进行控制。然而，慢性疼痛或神经性疼痛的控制困难得多。许多药物帮助缓解急性疼痛，并且一般而言，它们可以分成非阿片类和阿片类药物。非阿片类药物包括非类固醇抗炎药（NSAIDs）例如乙酰水杨酸（阿司匹林）和COX-2（环氧化酶-2）抑制剂。在NSAIDs中的术语“非类固醇”用于区分这些药物与类固醇，其在广泛范围的其他效应中具有类似的类花生酸抑制、抗炎作用。作为镇痛药，NSAIDs是罕见的，因为它们是非麻醉药。NSAIDs通常指示用于治疗其中存在疼痛和炎症的急性或慢性状况。
阿司匹林通常用作镇痛药以缓解较小病痛和疼痛，用作解热药以减轻发热，或用作抗炎药物。阿司匹林对于迟钝的搏动性疼痛作用良好，但它对于由大多数肌肉痉挛、胀气（bloating）、内脏膨胀（visceral distension）和急性皮肤刺激引起的疼痛是无效的。作为手术后止痛药，阿司匹林次于一种NSAID——布洛芬，并且具有更高的胃肠道毒性。此外，阿司匹林也具有许多禁忌和不希望的效应；例如，阿司匹林的使用在患有消化性溃疡、轻度糖尿病或胃炎的人中需要谨慎。即使不存在这些状况中的任何一个，仍存在胃出血的增加危险。NSAIDs的其他种类是COX-2选择性抑制剂，其直接靶向COX-2——负责炎症和疼痛的酶。关于COX-2的靶向选择性减少消化性溃疡的危险，并且是塞来考昔、罗非昔布和这类药物的其他成员的主要特点。COX-2抑制剂也具有不良作用，最主要是肾衰竭的危险增加，并且一些结果已显示通过血栓素的相对增加在心脏病发作、血栓形成和中风的危险中的增加。值得注意的是，罗非昔布（通常称为万络）由于这些考虑在2004年下市。
镇痛药的可替代种类是阿片类药物。阿片类是通过与阿片类受体结合起作用的影响精神的化学物质，所述阿片类受体主要在中枢和外周神经系统和胃肠道中发现。这些器官系统中的受体介导阿片类的有利作用和副作用。阿片类的镇痛作用是由于疼痛的感觉减少、对于疼痛的反应减少以及增加的疼痛耐受。阿片类已长期用于治疗急性疼痛（例如手术后疼痛），并且在姑息性护理中在减轻晚期状况例如癌症和变性状况例如类风湿性关节炎的严重、慢性、伤残性疼痛上是极其重要的。然而，阿片类应非常谨慎地用于慢性非癌症疼痛中。不一定需要高剂量以控制晚期或终末期疾病的疼痛。耐受（使得机体对镇痛和其他作用更少应答的身体反应）非常可能发生，使得阿片类成为用于疼痛控制的最后选择。
根据上文讨论，明确的是存在开发新类别的有效非耐受性和非镇静性镇痛药用于控制严重急性疼痛和慢性疼痛的迫切需要。
从具有由病毒痘苗病毒（Vaccinia variolae）接种引起的炎症的兔的皮肤组织中提取的生物活性剂的混合物，其含有针对激肽释放酶-激肽系统的抑制剂，已用于治疗疼痛数十年（K. Ono，A. Inoue和M. Nakamuro. Jpn Pharmacol Ther，1981；9:299–307）。药理学和临床实验显示由兔的皮肤制备的生物活性剂的此类混合物针对所有种类的有症状的神经痛，腰痛，胆绞痛（cholecystagia），咽痛，动脉栓塞疼痛，创伤、烧伤和烫伤引起的急性疼痛，手术中或手术后疼痛，消化性溃疡痛，痛经，分娩后的阵痛，头痛，由多种肿瘤诱导的疼痛等等具有镇痛作用。研究还显示生物活性剂的这种混合物可以有效促进巨噬细胞的激活，显著抑制II型变态反应中的抗补体活性。该效应与剂量具有线性相关。因此该药物对抑制与免疫关联的炎症反应和改善免疫功能具有作用。此外，在大鼠中连续28天腹膜内施用由兔的皮肤制备的药物后，没有大鼠死亡且在尿、眼、血液生物化学、病理学和解剖学检查中没有由药物诱导的变化。因此，此类镇痛药物具有很少的毒性作用（参见美国专利申请号：20110003009）。然而，尽管关于药物设计和药物开发的肽研究是新药开发中最有希望的领域之一，但不存在这个领域中的研究者集中于寻找混合物中的活性蛋白质成分的报道，即使此类混合物已进入市场数十年且具有用于止痛的良好作用。因此，一种或多种活性成分的鉴定将帮助理解一种或多种作用机制，并且负责镇痛作用的确切组分的纯化将促进用于临床使用的充分描绘的（well-delineated）一种或多种药物的制备。
甲型流感病毒是病毒的正粘病毒科中的属。甲型流感病毒的所有亚型的毒株已从野生鸟类中分离，尽管疾病是稀有的。甲型流感病毒的一些分离物在驯养家禽中和罕见地在人中引起严重的疾病（"Avian influenza（" bird flu"）— Fact sheet". WHO.） 。偶然地，病毒从野生水鸟传播到驯养家禽，并且这可能引起暴发或产生人流感流行（Klenk，等人（2008）. "Avian Influenza：Molecular Mechanisms of Pathogenesis and HostRange". Animal Viruses：Molecular Biology. Caister Academic Press & Kawaoka Y，ed.（2006）. Influenza Virology: Current Topics. Caister Academic Press）。甲型流感病毒是负义、单链、分段的RNA病毒。存在几个亚型，根据H数目（关于血凝素类型）和N数目（关于神经氨酸酶类型）标记。存在至少16种不同的H抗原（H1至H16）和九种不同的N抗原（N1至N9）。不同的流感病毒编码不同的血凝素和神经氨酸酶蛋白质；例如H5N1病毒指定甲型（A型）流感亚型，其具有5型血凝素（H）蛋白质和1型神经氨酸酶（N）蛋白质。此外，每个病毒亚型已突变成具有不同致病情况的多个毒株；一些对于一个物种是致病的但对于其他不是，并且一些对于多个物种是致病的。理论上，这些蛋白质的144个不同组合是可能的（"Influenza Viruses". Centers for Disease Control and Prevention. 2005年11月18日）。一些变体得到鉴定且根据它们类似的分离物，因此推测为共享谱系（例子：福建流行感冒病毒样（Fujian flu virus-like）），根据其一般宿主（例子：人流行感冒病毒），根据其亚型（例子：H3N2）以及根据其致命性（例子：LP，低致病性）进行命名。因此，来自类似于分离物A/福建/411/2002（H3N2）的流行感冒被称为福建流行感冒、人流行感冒或H3N2流行感冒。
“人流感病毒”通常指在人中广泛传播的那些亚型。在所有毒株中，H1N1、H1N2和H3N2是目前在人中循环的唯一已知的甲型流感病毒亚型（CDC，USA：Key Facts AboutAvian Influenza（Bird Flu）and Avian Influenza A（H5N1）Virus）。关于流感的治疗包括响应疾病流感而使用的一系列药物和疗法。治疗可以直接靶向流感病毒自身；或相反它们可以仅提供疾病症状的缓解，而机体自身的免疫系统作用于从感染恢复（Montalto NJ，GumKD，Ashley JV（2000）. "Updated treatment for influenza A and B". Am FamPhysician 62（11）：2467–76）。针对流感病毒使用的抗病毒药的两个主要类别是神经氨酸酶抑制剂，例如扎那米韦和奥司他韦，或病毒M2蛋白质抑制剂例如金刚烷胺和金刚乙胺。如果在感染后不久服用，这些药物可以减少症状的严重性，并且还可以服用以减少感染危险。然而，已出现对这两类药物具有药物抗性的病毒毒株。如同细菌抗生素抗性的发展，这可以起因于这些药物的过度使用。例如，基于这些药物在2009 H1N1‘猪流感’神经氨酸酶（NA）获得达菲抗性（His274Tyr）突变的情况下这些药物的表现评估，近期研究强调关于增加奥司他韦（达菲）库存与另外的抗病毒药物包括扎那米韦（Relenza）的迫切需要，所述达菲抗性（His274Tyr）突变目前在季节性H1N1毒株中是普遍的（Venkataramanan Soundararajan，Kannan Tharakaraman，Rahul Raman，S. Raguram，Zachary Shriver，V. Sasisekharan，Ram Sasisekharan（2009）. "Extrapolating from sequence — the 2009 H1N1 'swine'influenza virus". Nature Biotechnology 27（6）：510–3）。另一个例子是在金刚烷胺治疗的情况下，其可以导致抗性病毒的快速产生，并且这些药物的过度使用已可能促成抗性的扩展（Lynch JP，Walsh EE（April 2007）. "Influenza：evolving strategies intreatment and prevention". Semin Respir Crit Care Med 28（2）：144–58.）。
然而，与此同时，在不存在涉及药物的较多使用的情况下，已出现对于神经氨酸酶抑制剂抗性的少数毒株且传播，并且药物抗性毒株随之出现的频率显示与这些药物的使用水平的很少关联（Lackenby A，Thompson CI，Democratis J（December 2008）. "Thepotential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza". Curr. Opin.Infect. Dis. 21（6）：626–38.）。实验室研究也已显示可能是这些药物的亚最佳剂量作为预防措施的使用促成药物抗性的发展（Lackenby A，Thompson CI，Democratis J（December2008）. "The potential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza".Curr. Opin. Infect. Dis. 21（6）：626–38）。寻找具有效力和更少副作用的更加新的类别的抗流感病毒已成为生物医学团体的挑战。
发明概述
公开内容的一个目的是提供SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的镇痛肽、其变体和衍生物。令人惊讶的是，这种肽还显示抗甲型流感病毒活性。
公开内容的另一个目的是提供编码该肽、其变体和/或衍生物的多核苷酸。
公开内容的还另一个目的是提供该肽、其变体和/或衍生物的制备和用途。
在一个方面，本公开内容提供了包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的分离肽、其保守变体、其活性片段及其活性衍生物。优选地，所述肽具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。
在另一个方面，本公开内容提供了这样的分离肽，其与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列共享至少50%同源性，例如至少60%同源性、至少70%同源性、至少80%同源性或至少90%同源性，且具有镇痛和/或抗甲型流感病毒活性。
在另一个方面，本公开内容提供了这样的分离肽，其包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列相比较具有一到七个（例如一、二、三、四、五、六或七个）保守氨基酸置换的氨基酸序列，且具有镇痛和/或抗甲型流感病毒活性。
在另一个方面，本文公开的肽、其变体和/或衍生物通过化学合成获得。
在另一个方面，本公开内容提供了包含与选自下述的核苷酸序列共享至少50%同源性的核苷酸序列的分离多核苷酸：
（a）编码包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的肽、其变体和/或衍生物的核苷酸序列，和
（b）与（a）的核苷酸序列互补的多核苷酸；
其中所述肽、其变体和/或衍生物具有镇痛和/或抗甲型流感病毒活性。
在另一个方面，本公开内容提供了分离的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的肽。
在另一个方面，本公开内容提供了包含上述多核苷酸的载体、和用该载体或多核苷酸转化的宿主细胞。
在另一个方面，本公开内容提供了用于产生具有SEQ ID NO:5所示肽的活性的肽的方法，其包括：
（a）在表达条件下培养上述转化的宿主细胞；
（b）从培养物中分离本发明的肽。
在另一个方面，本公开内容提供了刺激、促进且拮抗SEQ ID NO:5所示肽活性的化合物。
在另一个方面，本公开内容提供了包含有效量的本文所述的肽、其变体和/或衍生物、以及药学可接受的载体的药物组合物。这种药物组合物可以用于治疗或缓解受试者中与疼痛相关的疾病和/或症状。在本文中，与疼痛相关的疾病和/或症状包括但不限于选自下述的那些：所有种类的有症状的神经痛，腰痛，胆绞痛，咽痛，动脉栓塞疼痛，创伤、烧伤和烫伤引起的急性疼痛，手术中或手术后疼痛，消化性溃疡痛，痛经，分娩后的阵痛，头痛，由多种肿瘤诱导的疼痛。这种药物组合物还可以用于抑制受试者中的甲型流感病毒活性。甲型流感病毒在本文中优选选自H5N1和H1N1。
在另一个方面，本公开内容提供了用于治疗受试者中与疼痛相关的疾病和/或症状的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本文所述的肽、其变体和/或衍生物。
在另一个方面，本公开内容提供了用于抑制受试者中的甲型流感病毒活性的方法，其中所述方法包括给受试者施用有效量的本文所述的肽、其变体和/或衍生物。
在另一个方面，本公开内容提供了本文所述的肽、其变体和/或衍生物在制备用于治疗或缓解受试者中与疼痛相关的疾病和/或症状的药物中的用途。
在另一个方面，本公开内容提供了本文所述的肽、其变体和/或衍生物在制备用于抑制受试者中的甲型流感病毒活性的药物中的用途。
本发明的其他方面根据公开内容的教导对于技术人员是显而易见的。
本说明书中提及的所有出版物引入本文作为参考，其程度与每个个别出版物特别地且个别地指出整体引入作为参考相同，除非另有具体说明。
附图简述
下述图举例说明了实施方案，并且不限制在权利要求中定义的本发明的范围。
图1. 用于从由痘苗病毒接种诱导的炎性兔皮肤的粗提取物中筛选肽/小肽水平的镇痛剂的流程的图示。
图2. 一种或多种功能肽的鉴定。显示了双倍带电离子m/z 772.745的MS/MS谱。氨基酸序列SEQ ID NO:5由在y-和b-片段离子系列中的MS差异测定，并且匹配兔α1-抗蛋白酶的残基1-14。
图3. 肽5（SEQ ID NO:5）具有优于其他肽的最好的疼痛缓解作用，并且可与1 mg吗啡相比较，如通过由乙酸的腹膜内注射诱导的疼痛发作的显著延迟所显示的（n=6）。注：在肽5相对于肽1、2、3、4或6之间p<0.005；在肽5相对于吗啡之间p<0.05；和对照：单独的水。
图4. 序列SEQ ID NO:5所示的肽5还引起在乙酸注射后30分钟内总扭体次数的显著减少（n=6）。注：在肽5相对于肽1、2、3、4或6之间p<0.001；在肽5相对于吗啡之间p<0.05；对照：单独的水。
图5. 肽5具有神经源性起源的强效镇痛作用。在热刺激中，用2 mg序列SEQ IDNO:5所示的肽5（DEAQETAVSSHEQD）腹膜内注射的处理显著降低温度诱导的坐骨神经损伤的肢体疼痛（痛觉过敏）。数据表示为时间（秒）中的平均值±SD。N=6。注：在第5、10或30天时在未处理和处理的受损同侧肢体之间**p<0.005（通过ANOVA）。
图6. 序列SEQ ID NO:5所示的肽5具有对于含或不含神经损伤的肢体的热异常性疼痛的有效作用。在机械刺激中，用2 mg序列SEQ ID NO:5所示的肽腹膜内注射的处理显著降低坐骨神经损伤的肢体的热异常性疼痛。数据表示为von Foley毛发（von Foley hair）阈值（以克表示）中的平均SD。N=6/时间点。注：在第5、10或30天时在未处理和处理的损伤同侧肢体之间**p<0.005（通过ANOVA）。
图7. 序列SEQ ID NO:5所示的肽5具有在体外抑制H5N1和H1N1病毒复制中的有效作用。将序列SEQ ID NO:5所示的肽5溶解于纯水中并且加入（0、0.001、0.01、0.1、1和10 μM）单层MDCK细胞中，所述MDCK细胞同时由5,000 pfu/ml的H5N1（左图）或H1N1病毒（右图）的多个毒株感染。在3天后，人工计数噬斑数目，并且针对未处理的对照（即0 μM）标准化。
注：
对于A/Vietnam/1194/04（H5N1）：
（1）在无处理和用0.1 μM处理之间无统计学意义
（2）在无处理和用1 μM处理之间p< 0.01
（3）在无处理和用10 μM处理之间p< 0.001
而对于A/Hong Kong/97（H5N1）和A/鹅/Taichung/Q156/05（H5N1）：
（1）在无处理和用0.1 μM处理之间p< 0.05
（2）在无处理和用1 μM处理之间p< 0.005
（3）在无处理和用10 μM处理之间p< 0.001
对于大范围流行的H1N1/2009：
（1）在无处理和0.01 μM之间无统计学意义
（2）在无处理和用0.1 μM处理之间p< 0.05
（3）在无处理和用1 μM处理之间p< 0.005
（4）在无处理和用10 μM处理之间p< 0.001
对于A/Taiwan/01/86（H1N1）：
（1）在无处理和用0.01 μM处理之间p< 0.05
（2）在无处理和用0.1 μM处理之间p< 0.01
（3）在无处理和用1 μM处理之间p< 0.005
（4）在无处理和用10 μM处理之间p< 0.001。
发明详述
本公开内容的肽、药物组合物、用途和方法的实施方案意图是举例说明而不是限制性的。修饰和变化可以通过本领域技术人员根据上述教导进行，特别是可以涉及维持就镇痛和/或抗甲型流感病毒效应而言的接近天然功能的肽中的变化的那些。因此，应当理解可以在描述的范围内公开的特定实施方案中做出变化。
如本文使用的，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的肽是兔α1-抗蛋白酶F的片段。
如本文使用的，术语“分离的”指已从原始环境中分离的物质。对于天然存在的物质，原始环境是天然环境。例如，在活细胞中以天然存在状态的多核苷酸和肽不是分离或纯化的。然而，如果相同多核苷酸和肽已与天然伴随其的其他组分分离，那么它们是分离或纯化的。
本公开内容的肽可以是重组、天然或合成肽，优选重组肽。本公开内容的肽可以是纯化的天然产物或化学合成的产物。可替代地，它可以使用重组技术由原核或真核宿主产生，例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产中使用的宿主，肽可以是糖基化或非糖基化的。
如本文使用的，术语“衍生物”和“变体”意指基本上保留与DEAQETAVSSHEQD的天然肽的相同生物功能或活性的肽。
如本文使用的，本文使用的术语“衍生物”包括但不限于（i）其中氨基酸残基中的一个或多个包括取代基的那种，（ii）其中肽与另一种化合物例如增加肽的半衰期的化合物（例如聚乙二醇）融合的那种，（iii）其中另外的氨基酸融合至肽的那种，例如引导或分泌序列或用于纯化肽或前蛋白的序列，或（iv）其中肽通过一些修饰进行修饰的那种。基于本文的教导，此类衍生物是本领域技术人员已知的。
如本文使用的，术语“修饰”（其通常不改变基本序列）包括肽的体内或体外化学衍生，例如乙酰化或羧基化。还包括的是糖基化的修饰，例如修饰肽的糖基化模式产生的那些，所述修饰在其合成或加工过程中或在进一步的加工步骤中，例如通过使肽暴露于糖基化酶（例如哺乳动物糖基化或去糖基化酶）。还包括的是具有磷酸化氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸的序列，以及为改善蛋白酶解降解的抗性或最佳化可溶性性质而修饰的序列。
如本文使用的，术语“变体”包括但不限于几个氨基酸的缺失、插入和/或置换，优选几个保守的氨基酸置换（一般为1-7、优选1-6、更优选1-5、甚至更优选1-4、还更优选1-3、最优选1-2个），和在肽的C末端、N末端或内部的一个或多个氨基酸（一般小于20、优选小于10、更优选小于5个）的添加。例如，当氨基酸残基由相似或类似残基置换，例如由保守或非保守的氨基酸残基（优选保守氨基酸残基）置换时，蛋白质功能通常是未改变的。进一步地，在C末端和/或N末端一个或多个氨基酸的添加通常不改变蛋白质功能。
如本文使用的，术语“保守氨基酸置换”意指与DEAQETAVSSHEQD的氨基酸序列相比较，通过用具有基本上相同或相似性质的氨基酸置换至多7、优选至少6、更优选5且最优选至多3个氨基酸形成的肽。优选地，这些保守突变体通过根据表1的置换形成。
表1
原始残基 代表性置换
Asp（D） Glu
Glu（E） Asp
Ala（A） Val；Leu；Ile
Gln（Q） Asn
Thr（T） Ser
Val（V） Ile；Leu；Met；Phe；Ala
Ser（S） Thr
His（H） Asn；Gln；Lys；Arg
本发明的多核苷酸可以以DNA和RNA的形式。DNA包括以单链或双链形式的cDNA、基因组DNA和合成DNA等。本发明的多核苷酸可以是简并序列。如本文使用的，术语“简并序列”意指由于密码子的简并性，编码相同蛋白质的不同序列。
术语“编码肽的多核苷酸”包括编码所述肽的多核苷酸和包含额外和/或非编码序列的多核苷酸。
编码本文所述的肽的多核苷酸可以通过PCR扩增、重组方法和合成方法进行制备。对于PCR扩增，通过基于本文公开的核苷酸序列尤其是ORF设计引物，且使用商购可得或通过本领域的常规技术制备的cDNA文库作为模板，可以获得所述序列。一旦获得序列，就可以通过重组方法产生许多序列。通常，将所述序列克隆到载体内，随后将其转化到宿主细胞内。使用常规技术从扩增的宿主细胞中分离序列。
本发明进一步涉及包含本公开内容的多核苷酸的载体、用本公开内容的载体或多核苷酸转化的遗传改造的宿主细胞、和通过重组技术用于产生肽的方法。
重组肽可以使用本发明的多核苷酸序列，通过常规重组DNA技术表达或产生（Science，1984；224:1431）。一般地，它包括下述步骤：
（1）用编码肽的多核苷酸或含有多核苷酸的载体转染或转化合适的宿主细胞；
（2）在合适的培养基中培养宿主细胞；
（3）从培养基或细胞中分离或纯化蛋白质。
在本发明中，本文所述的多核苷酸序列可以插入重组表达载体内。术语“表达载体”意指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物病毒或哺乳动物细胞病毒例如腺病毒、逆转录病毒或本领域已知的任何其他媒介物。任何质粒或载体都可以用于构建重组表达载体，只要它可以复制且在宿主中是稳定的。表达载体的一个重要特点是表达载体一般含有复制起点、启动子、标记基因以及翻译调节组分。
已知方法可以用于构建含有本文所述的序列和合适的转录/翻译调节组分的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。将DNA序列有效连接至表达载体中的合适启动子，以指导mRNA的合成。示例性启动子是大肠杆菌的lac或trp启动子；A噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子；HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒的LTRs和一些其他已知启动子，其控制原核细胞、真核细胞或病毒中的基因表达。表达载体可以进一步包含用于起始翻译的核糖体结合位点、转录终止子等。
如本文使用的，术语“宿主细胞”包括原核生物例如细菌；低等真核生物例如酵母；高等真核生物例如哺乳动物细胞。代表性例子是细菌细胞例如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞例如酵母；植物细胞；昆虫细胞例如果蝇S2或Sf9；动物细胞例如CHO、COS或Bowes黑素瘤等。
如本文使用的，术语“镇痛作用”包括“抗痛觉过敏作用”和“抗异常性疼痛作用”。然而，这三个术语可以分开使用，因为它们指示不同疾病或模型中的疼痛缓解。
如本文使用的，术语“受试者”包括人、非人哺乳动物（例如牛、绵羊、兔、犬、小鼠、大鼠、猴等）和驯养家禽。
本发明还提供了包含与药学可接受的载体组合的安全和有效量的本文所述的肽、其变体和/或衍生物的药物组合物。此类载体包括但不限于盐水、缓冲溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇或其组合。药物制剂应适合于递送方法。药物组合物可以以注射剂的形式，其通过常规方法进行制备，使用生理盐水或含有葡萄糖或辅助物质的其他水溶液。以片剂或胶囊形式的药物组合物可以通过常规方法进行制备。药物组合物例如注射剂、溶液、片剂和胶囊应在无菌条件下制造。活性成分以治疗有效量施用，例如约1 ug-50 mg/kg体重或更多/天。此外，本发明的肽可以连同其他治疗剂一起施用。
先前实验证据显示通过痘苗病毒接种诱导的炎性兔皮肤的粗提取物可以发挥其对镇痛的药理学作用。为了鉴定用于疼痛缓解的确切组分，如通过其亲本试剂AGC®证实的，我们通过使用纳米LC-MS/MS利用蛋白质组学方法以测定在质荷比（m/z）中的差异。通过复杂的化学纯化和数据库搜索，本发明人鉴定了DEAQETAVSSHEQD的肽序列，其具有强效镇痛、抗痛觉过敏、抗异常性疼痛和抗甲型流感病毒作用。
本发明进一步通过下述实施例举例说明。这些实施例仅意图为举例说明本发明，但不限制本发明的范围。对于下述实施例中的实验方法，它们在常规条件下执行，例如由Sambrook.等人在Molecule Clone：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989中描述的那些，或如通过制造商说明的，除非另有说明。
实施例
实施例1：肽鉴定
A. 样品制备
如Y. Imai，K. Saito，S. Maeda 等人 Inhibition of the release ofbradykinin-like substances into the perfusate of rat hind paw by neurotropin.Jpn J Pharmacol 1984，36:104–106所述制备从具有由病毒痘苗病毒(Vacciniavariolae)接种引起的炎症的兔皮肤组织中提取的生物活性剂的混合物，并且由VanworldPharmaceutical Co Ltd，如皋，中国提供，具有AGC®（10 U/mL，25 mL/小瓶）的商品名称。将约200 μL AGC®的粗制剂在真空离心管中干燥。将冻干材料用100 μL含有8 M尿素和0.5M二硫苏糖醇（DTT）的0.5 M碳酸氢铵缓冲液（pH 8.5）在37℃重构1小时，并且当加入10 μL0.5 M碘乙酰胺（IAM）用于烷基化时，在黑暗条件下在4℃重构另外2小时。接着，随后将所得到的溶液用0.2 μg胰蛋白酶在37℃消化18小时，并且随后通过10%三氟乙酸（TFA）/ H2O将胰蛋白酶消化的溶液酸化至pH 3.0值。在反应后，将完全酸化的溶液应用于用200μL 0.1%TFA/H2O（pH 3.0）预平衡的反相C18柱上。还将柱用200 μL 0.1% TFA/H2O（pH 3.0）洗涤，并且随后在室温用溶于0.1% TFA中从50%到100%的逐步乙腈梯度洗脱。
B. 纳米-LC-MS/MS分析
将洗脱组分收集，在真空离心机中干燥，并且随后在10 μL 0.1%甲酸（FA）的H2O溶液中重构，并且通过LTQ Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA）分析。反相纳米-LC分离在Agilent 1200系列纳米流（nanoflow）系统（Agilent Technologies，SantaClara，CA）上执行。将总共10 μL来自洗脱组分的样品装载到Agilent Zorbax XDB C18预处理柱（0.35 mm，5 μm）上，随后使用C18柱（i.d. 75 μm Х 25-cm，3 μm，Micro Tech，Fontana，CA）分离。使用的移动相是（A）0.1% FA和（B）0.1% FA的100% CAN溶液。应用以300nL/分钟的流速经过90分钟的时段从5%到35%（B）的线性梯度。肽通过将1.8 Kv的电压应用于注射针以阳离子模式进行分析。MS以数据依赖性模式操作，其中使用30毫秒/扫描的速率用在Orbitrap（R = 60 000以m/z 400）中的m/z 300-2000完全扫描。选择在LTQ中对于断裂具有35%的标准化碰撞能量值的六个最强烈峰。应用30秒的重复持续时间，以排除来自对于断裂的再选择的相同m/z离子。将同样通过还原、烷基化和脱盐处理的，作为对照的重构液体酸化且实施如上提及的纳米-LC-MS/MS分析，除了胰蛋白酶消化外。
C. 数据库搜索和鉴定
通过使用MASCOT搜索程序（http://www.matrixscience.com；Hirosawa等人，1993）在NCBI数据库中针对动物分类学搜索确切匹配，通过来自纳米LC-MS/MS谱转化的峰列表鉴定肽。前体离子和碎片离子的质量耐受设为0.8 Da。执行搜索以允许作为脲基甲基化（carbamidomethylation）（C）的固定修饰，并且不存在作为酶的胰蛋白酶。所得到的鉴定具有统计上显著的（P ≤ 0.05）肽得分（基于组合的MS和MS/MS谱）和最佳离子得分（基于MS/MS谱）。
D. 结果
伴随或不伴随胰蛋白酶消化生成的蛋白质片段的质谱模式随后用于与在数据库中保存的先前已知的蛋白质的质谱模式比较，其可以用于鉴定完整（intact）蛋白质（蛋白质ID）的肽序列。因此，我们可以通过鸟枪分析达到肽的广泛覆盖，阐明肽或小肽的表达概况，且鉴定序列以及生物化学表征。在这个工作中使用的方法的流程图和用其生物化学表征鉴定的所有肽在表2中列出。检测到来自MS/MS分析的代表性肽峰（图2），导致通过MASCOT搜索的确信蛋白质鉴定。显示了双倍带电离子m/z 772.745的MS/MS谱。SEQ ID NO:5所示氨基酸序列（DEAQETAVSSHEQD）由在y-和b-片段离子系列中的MS差异测定，并且匹配兔α1-抗蛋白酶的残基1-14，其不同于人、小鼠或牛中的α1-抗蛋白酶。此外，它还与其他镇痛有关肽包括阿片类激动剂DAGO不共享同源性。根据计算预测，它是线性的且不太可能具有如α-螺旋、β-片层、β-转角或弯曲区域的结构。
表2. 通过来自纳米LC-MS/MS分析的MS/MS谱鉴定的六个小肽的表征。
肽序列 PI/质量（Da）
SEQ ID NO:1: DEAQETAVSSH （肽1） 4.13/1173.16
SEQ ID NO:2: DEAQETAVSSHE（肽2） 4.00/1302.27
SEQ ID NO:3: DEAQETAVSSHEQ（肽3） 4.00/1430.40
SEQ ID NO:4: EAQETAVSSHEQD（肽4） 4.00/1430.40
SEQ ID NO:5: DEAQETAVSSHEQD（肽5） 3.83/1545.49
SEQ ID NO:6: AQETAVSSHEQD（肽6） 4.13/1304.29
实施例2：体内镇痛作用
肽使用固相Fmoc化学法在Mission Biotech Co.（MB，台北，台湾）的商业设施合成，且通过反相高效液相纯化至>90%的纯度且通过MS验证。最终肽产物溶解于DMSO中用于实验使用。
对于小鼠急性内脏疼痛模型，称重20-25克的C57BL/6雄性小鼠用1 mg吗啡（作为阳性对照）或合成肽1-6(SEQ ID NO:1-6,各2 mg）腹膜内注射。其后三十分钟，小鼠随后用1ml 1%乙酸腹膜内注射。记录第一次扭体的发作和在随后30分钟内的扭体频率。
序列SEQ ID NO:5所示的肽5（14个氨基酸的肽）具有可与1 mg吗啡比较的相似疼痛缓解作用，如缩爪的延迟潜伏期（图3）和在30分钟内测量的减少总扭体发作（图4）所示。
实施例3：抗痛觉过敏作用
使用称重20-25克的C57BL/6雄性小鼠。手术程序在氟烷（Halothane）（2-3%）麻醉下执行。如已描述的（Malmberg AB和Basbaum AI. Pain 1998；76:215-222），通过用9-0丝线系成约坐骨神经1/3至1/2直径的紧密结扎做出部分坐骨神经损伤。在具有假手术的小鼠中，使坐骨神经暴露但未结扎。随后在热测试和von Foley毛发测试前，使小鼠习惯于测试环境至少1小时。在热测试中，测定缩爪潜伏期作为疼痛指示剂。在von Foley测试中，调整刺激强度，以在正常小鼠中给出10秒缩回潜伏期，而在不存在应答的情况下的截止值是20秒。von Foley毛发的机械敏感性通过上下范例（up-down paradigm）进行评估（Chaplan等人，J Neurosci Methods 1994；53:53-66）。关于测试范例的纤维选择为0.3-克。
序列SEQ ID NO:5所示的肽5就其在接受坐骨神经结扎的小鼠中的抗痛觉过敏作用进行测试。平行比较在手术后第5、10和30天来自假手术小鼠和神经损伤小鼠的热测试的结果。结果明确证实具有神经损伤的肢体具有痛觉过敏，如通过与对侧肢体或假手术的肢体的缩爪潜伏期相比较，显著减少的缩爪潜伏期证实的（图5）。此外，2 mg序列SEQ ID NO:5所示的肽5的腹膜内注射（标记为“处理的”）确实可以显著增加对于热诱导的疼痛的耐受，如通过与给予DMSO溶剂的对照小鼠（标记为“未处理的”）相比较，缩爪潜伏期的增加证实的（图5）。
实施例4：抗异常性疼痛作用
使用实施例3中的相同动物模型。序列SEQ ID NO:5所示的肽5就其在接受坐骨神经结扎的小鼠中的抗异常性疼痛作用进行测试。平行比较在手术后第5、10和30天来自假手术小鼠和神经损伤小鼠的机械刺激（von Foley测试）的结果。结果明确证实具有神经损伤的肢体具有超异常性疼痛，如通过与对侧肢体或假手术的肢体相比较，显著降低的vonFoley阈值证实的（图6）。此外，2 mg序列SEQ ID NO:5所示的肽5的腹膜内注射（标记为“处理的”）确实可以显著增加对于机械刺激的耐受，如通过与给予纯水的对照小鼠相比较（标记为“未处理的”），von Foley阈值的增加证实的（图6）。
实施例5：抗病毒作用
A. 病毒和细胞
H5N1分离物A/Vietnam/1194/04和A/Hong Kong/97得自Department ofMicrobiology，the University of Hong Kong。使用3x105 TCID50病毒用于实验。A/Taiwan/01/86（H1N1）也以3x105 TCID50用于实验。H5N1实验在生物安全水平（BSL）3+防范设施中进行。病毒原种（stock viruses）的等分试样贮存于-80℃。Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞得自美国典型培养物中心（Manassas，VA，USA），且维持在补充有10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素/链霉素）的达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。50%组织培养感染剂量（TCID50）在37℃温育3天后的MDCK细胞中进行测定，并且该值通过Reed和Muench的方法进行计算（Reed LJ，Muench H. A simple method for estimating fifty percent endpoints.American Journal of Hygiene. 1938；27:493–497）。为了测定序列SEQ ID NO:5所示的肽5在抑制病毒复制中的有效性，将所得pfu/ml与接种的最初pfu/ml比较（除以接种的最初pfu/ml），且表示为最初滴度（其为5x103 pfu/ml）的百分比。
B. 通过噬斑测定的病毒滴度测定
此处使用的所有病毒最初在MDCK细胞上定量，以测定感染滴度（噬斑形成单位/mL，pfu/ml）。简言之，使MDCK细胞在24孔板中生长成单层，在用序列SEQ ID NO:5所示的肽5（0.001、0.01、0.1、1和10 μM）处理后用病毒以5x103 pfu/ml进行感染。在汇合的MDCK细胞上在37℃1小时结合后，将未结合的病毒用PBS轻轻洗涤，并且用1:1 Noble Agar（1.8%）和2x DME-F12（补充有Glutamax（Invitrogen，Carlsbad，CA）、ITS（Invitrogen）和3 µg/ml乙酰化胰蛋白酶（Sigma，St. Louis，MO））覆盖。在允许琼脂固化后，在用结晶紫固定且在每个稀释度计数噬斑数目前，将板在37℃温育~72小时。在3天后，人工计数噬斑数目，并且针对未处理对照（即0 μM）标准化。
C. 序列SEQ ID NO:5所示的肽5在体外抑制流感病毒H5N1和H1N1复制
为了检查序列SEQ ID NO:5所示的肽5针对流感病毒H5N1和H1N1复制的抑制作用，将系列稀释的序列SEQ ID NO:5所示的合成肽5补充到在24孔板中的单层MDCK细胞培养物，所述单层MDCK细胞培养物已暴露于5000 pfu/ml 的H5N1 A/Vietnam/1194/04、A/HongKong/97和A/鹅/Taichung/Q156/05或H1N1。在3天后，计数具有每个药物浓度的病毒噬斑数目，并且将噬斑数目针对未处理对照标准化（图7）。显示序列SEQ ID NO:5所示的肽5具有在体外抑制H5N1和H1N1病毒复制的有力效应。
本文描述的实施方案的方面可以以其他形式体现或以其他方式执行，而不背离其精神或基本特征。本公开内容因此在所有方面视为举例说明性的而不是限制性的，并且在等价意义和范围内的所有改变预期在其中包含。
序列表
<110> WELL RESOURCES LIMITED
<120> 肽及其用途
<130> FPCH12160031P
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 兔α1-抗蛋白酶F的残基1-11
<400> 1
Asp Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 兔α1-抗蛋白酶F的残基1-12
<400> 2
Asp Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> 兔α1-抗蛋白酶F的残基1-13
<400> 3
Asp Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His Glu Gln
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> 兔α1-抗蛋白酶F的残基2-14
<400> 4
Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His Glu Gln Asp
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> 兔α1-抗蛋白酶F的残基1-14
<400> 5
Asp Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His Glu Gln Asp
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 兔α1-抗蛋白酶F的残基3-14
<400> 6
Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His Glu Gln Asp
1 5 10

Claims (8)

1.一种由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成的分离肽。
2.权利要求1的肽，其中所述肽通过化学合成获得。
3.一种多核苷酸，其选自：
（a）多核苷酸，其表示为编码由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成的肽的核苷酸序列，和
（b）与（a）的核苷酸序列互补的多核苷酸；
其中所述肽具有镇痛和/或抗甲型流感病毒活性。
4.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-2中任一项的肽，和药学可接受的载体。
5.权利要求1-2中任一项的肽在制备用于治疗或缓解受试者中与疼痛相关的疾病和/或症状的药物中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述与疼痛相关的疾病和/或症状选自：
所有种类的有症状的神经痛，
腰痛，
胆绞痛，
咽痛，
动脉栓塞疼痛，
创伤、烧伤和烫伤引起的急性疼痛，
手术中或手术后疼痛，
消化性溃疡痛，
痛经，
分娩后的阵痛，
头痛，和
由多种肿瘤诱导的疼痛。
7.权利要求1-2中任一项的肽在制备用于抑制受试者中的甲型流感病毒活性的药物中的用途，其中所述甲型流感病毒选自H5N1和H1N1。
8.权利要求5-7中任一项的用途，其中所述受试者选自人、非人哺乳动物和驯养家禽。
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Application publication date: 20150128

Assignee: Weishi Pharmaceutical (Rugao) Co., Ltd.

Assignor: WELL RESOURCES LTD.

Contract record no.: 2019990000206

Denomination of invention: Short peptide for inhibiting Shiga toxin and application thereof

Granted publication date: 20170711

License type: Exclusive License

Record date: 20190625