KR20150018835A

KR20150018835A - 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20150018835A
Application number: KR1020147036227A
Authority: KR
Inventors: 첸렁 린
Original assignee: 웰 리소시스 리미티드
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2015-02-24
Also published as: KR101853254B1; AU2012380940B2; TWI570136B; CN104321337A; CA2874258C; JP2015519341A; TW201402615A; PT2855506T; NZ702151A; US9422336B2; HUE033389T2; TW201615657A; CA2874258A1; US20160375092A1; EP2855506A4; EP2855506B1; JP6097824B2; ES2627933T3; TWI549969B; WO2013173941A1

Abstract

DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 통증과 관련된 증상의 치료 및 인플루엔자 바이러스의 활성의 억제를 위한 상기 펩타이드의 용도, 및 상기 펩타이드를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

펩타이드 및 그의 용도{PEPTIDE AND THE USE THEREOF}

본 명세는 단백질 식별 및 약학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 명세는 효능있는 진통 효과 및 인플루엔자 바이러스 억제 효과를 갖는 천연 펩타이드, 그의 암호화 폴리뉴클레오타이드, 그의 제조 및 용도, 및 상기 펩타이드를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

통증은 강한 자극 또는 손상성 자극에 의해 종종 유발되는 불쾌한 느낌이다. 국제통증연구협회는 '통증'을 "실제적이거나 잠재적인 조직 손상과 관련되거나, 또는 상기와 같은 손상에 의해 기술되는 불쾌한 감각 및 감정적 경험"으로서 광범위하게 정의하고 있다(Pain 1979;6:247-8). 통증은 미국에서 의사에게 진찰받는 가장 흔한 이유이다(Raj PP. Taxonomy and classification of pain. In: Niv D, Kreitler S, Diego B, Lamberto A. The Handbook of Chronic Pain. Nova Biomedical Books 2007). 통증은 많은 의학적 상태들에서 주요 증상이며, 사람의 삶의 질 및 일반적인 직무를 중대하게 방해할 수 있다(Breivik H, Borchgrevink PC, Allen SM, Rosseland LA, Romundstad L, Hals EK, Kvarstein G, Stubhaug A. Assessment of pain. Br J Anaesth. 2008;101(1):17-24). 대부분의 사례에서, 통증은 대개 일시적이며, 이는 오직 유해한 자극이 제거되거나 근원적인 손상 또는 병리가 치유될 때까지만 지속된다. 그러나, 일부 고통스러운 상태, 예를 들어 류마티스성 관절염, 말초 신경병증, 암 및 특발성 통증은 수년간 지속될 수도 있다. 오래 지속되는 통증을 '만성'이라 칭하며, 급속히 해소되는 통증은 '급성'이라 칭한다. 전통적으로, 급성과 만성 통증간의 구별은 개시로부터 임의적인 시간 구간에 따라 변하며; 2 개의 가장 통상적으로 사용되는 마커는 통증 개시로부터 3 개월과 6개월이지만(Turk DC, Okifuji A. Pain terms and taxonomies of pain. In: Bonica JJ, Loeser JD, Chapman CR, Turk DC, Butler SH. Bonica's management of pain. Hagerstwon, MD: Lippincott Williams & Wilkins; 2001), 일부 연구자들은 급성에서 만성 통증으로의 이행을 12 개월로 정하였다(Spanswick CC, Main CJ. Pain management: an interdisciplinary approach. Edinburgh: Churchill Livingstone 2000). 다른 연구자들은 '급성'을 30일 미만 지속되는 통증에 적용하고, '만성'을 6개월 넘게 지속되는 통증에 적용하며, '아급성'을 1 개월 내지 6개월까지 지속되는 통증에 적용한다(Thienhaus O, Cole BE. Classification of pain. In: Weiner R. Pain management: a practical guide for clinicians. Boca Raton: CRC Press; 2002).

인간에서, 말초 통증의 감지는 자유 신경 말단에서 시작한다. 다중양상 통증 수용기 및 고임계 기계적감각 수용기는 유해 자극, 예를 들어 강한 기계력, H⁺, K⁺, 화학물질, 및 온도를 감지한다. 상기 자극의 감지후, 통증의 감각은 말초에서부터 척수(즉 척수시상로)로 이동하고, 이어서 대측성으로 상승하기 전에 전백색질교련(척수중의)을 통해 열십자로 교차한다. 상기 척수시상로는 뇌에 도달하기 전에, 바깥쪽 신-척수시상로 및 안쪽 구-척수시상로로 갈라지고(Skevington, S. M. Psychology of pain. Chichester, UK: Wile 1995; p18), 후속으로 상기 시상의 배쪽뒤바깥쪽 핵에서 종결되며, 여기에서 이들은 체감각피질의 수지상 돌기상에서 접합한다. 통증을 유발하는 유해 자극과 별개로, 인간에서 말초 신경에 대한 손상은 종종 자발성을 특징으로 하는 지속적인 신경병성 통증 상태, 대개는 화상 통증, 이질통증(무해자극에 대한 통증 반응) 및 통각과민(유해 자극에 대한 과장된 통증 반응)을 생성시킨다. 교감신경차단 요법이 때때로 상기 통증의 완화에 유효하지만(이는 신경병성 통증이 교감신경계에서의 활성에 의해 적어도 부분적으로 유지됨을 가리킨다), 많은 환자들이 반응하지 않는다. 신경병성 통증에 대한 오피오이드의 유효성도 또한 제한적이며(Rowbotham MC. Ann Neurol 1994;35:S46-S49), 다소 논의의 여지가 있다.

급성 통증은 대개 진통제 및 마취제와 같은 약물치료로 관리된다. 그러나, 만성 통증 또는 신경병성 통증의 관리는 훨씬 더 어렵다. 많은 약물들이 급성 통증의 완화를 도우며, 일반적으로 이들 약물은 비-오피오이드와 오피오이드 약물로 나뉠 수 있다. 상기 비-오피오이드 약물은 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 예를 들어 아세틸살리실산(아스피린) 및 COX-2(사이클로옥시게나제-2) 억제제를 포함한다. NSAID에서 "비스테로이드성"이란 용어는 이들 약물을 스테로이드와 구별하는데 사용되며, 광범위한 다른 효과들 중에서도, 유사한 에이코사노이드-강하성 소염 작용을 갖는다. 진통제로서, NSAID는 비-마취성이라는 점에서 특이하다. NSAID는 대개 통증 및 염증이 존재하는 급성 또는 만성 상태의 치료에 사용이 지시된다.

아스피린은 종종 가벼운 동통 및 통증을 완화시키기 위한 진통제로서, 열을 내리기 위한 해열제로서, 또는 소염 약물로서 사용된다. 아스피린은 둔한, 욱신거리는 통증에 잘 듣지만, 대부분의 근육 경련, 복부 팽창, 복부 팽만, 및 급성 피부자극에 의해 유발되는 통증에는 효과가 없다. 수술후 진통제로서, 아스피린은 NSAID 중 하나인 이부프로펜보다 열등하며, 보다 높은 위장독성을 갖는다. 더욱 또한, 아스피린은 다수의 금기 및 바람직하지 못한 효과도 또한 가지며; 예를 들어 소화성궤양, 순한 당뇨병, 또는 위염이 있는 사람들에서 아스피린의 사용은 주의를 요한다. 이러한 상태 중 어느 것도 존재하지 않는다 하더라도, 여전히 위장출혈의 증가된 위험성이 존재한다. NSAID의 다른 범주는, 염증과 통증의 원인 효소인 COX-2를 직접 표적화하는 COX-2 선택성 억제제이다. COX-2에 대한 표적화 선택성은 소화성궤양의 위험성을 감소시키며, 이는 셀레콕시브, 로페콕시브 및 상기 약물 범주의 다른 구성원들의 주요 특징이다. COX-2 억제제는 또한 부작용, 가장 현저하게는 신부전의 증가된 위험성을 가지며, 일부는 심장마비, 혈전증 및 트롬복산의 상대적인 증가에 의한 발작 위험성의 증가를 나타내었다. 중요하게는, 로페콕시브(Vioxx로서 통상적으로 공지됨)는 이러한 우려로 인해 2004년도에 시장에서 사라졌다.

진통제의 또 다른 범주는 오피오이드 약물이다. 오피오이드는, 주로 중추 및 말초 신경계 및 위장관에서 발견되는 오피오이드 수용체의 결합에 의해 작용하는 향정신성 화학물질이다. 이들 기관계에서 상기 수용체는 오피오이드의 이로운 효과와 부작용을 모두 매개한다. 오피오이드의 진통 효과는 통증의 감소된 지각작용, 통증의 감소된 반응뿐만 아니라 증가된 통증 관용에 기인한다. 오피오이드는 오랫동안 급성 통증(예를 들어 수술후 통증)을 치료하는데 사용되어 왔으며, 종말 상태, 예를 들어 암, 및 퇴행성 상태, 예를 들어 류마티스성 관절염의 심한 만성, 불능성 통증을 경감시키기 위한 완화성 치유에 매우 귀중하다. 그러나, 오피오이드는 만성적인 비-암 통증에 매우 조심스럽게 사용되어야 한다. 진행된 또는 말기 질병의 통증을 억제하기 위해서 반드시 고용량이 필요한 것은 아니다. 관용(신체를 진통제 및 다른 효과에 덜 반응성으로 만드는 물리적 반응)이 일어나기 매우 쉬우며, 이는 상기 오피오이드를 통증 조절의 마지막 선택권으로 만든다.

상기 논의로부터, 중증 급성 통증 및 만성 통증 모두를 억제하기 위한 새로운 부류의 유효한 비-관용성 및 비-진정성 진통제를 개발할 필요가 시급하다.

칼리크레인-키닌 시스템에 대한 억제제를 함유하는 바이러스 백시니아 바리올라에(Vaccinia variolae)의 접종에 의해 유도된 염증을 갖는 토끼의 피부 조직으로부터 추출된 생물활성제들의 혼합물이 통증 치료에 수십년간 사용되어 왔다(K. Ono, A. Inoue, and M. Nakamuro. Jpn Pharmacol Ther, 1981;9:299-307). 약물학적 및 임상적 실험들은 상기 토끼 피부로부터 제조된 상기와 같은 생물활성제들의 혼합물이 모든 종류의 징후성 신경통, 방산통, 담낭산통, 협심증, 동맥 색전증 통증, 상처, 화상으로부터의 급성 통증, 수술 또는 수술후 통증, 소화성 궤양 통증, 생리통, 분만후 산통, 두통, 다양한 종양에 의해 유발된 통증 등에 대해 진통 효과를 가짐을 입증하였다. 연구들은 또한 상기 생물활성제들의 혼합물이 대식세포의 활성화를 유효하게 촉진하고, II형 알러지 반응에서 항-보체의 활성을 현저하게 억제할 수 있음을 입증하였다. 상기 효과들은 용량과 직선의 상관성을 갖는다. 따라서, 상기 약물은 면역성과 상관된 염증 반응의 억제 및 면역 기능의 개선에 효과를 갖는다. 더욱 또한, 래트에서 상기 토끼 피부로부터 제조된 약물을 연속해서 28일 복강내 투여한 후, 래트는 죽지 않았으며 소변, 눈, 혈액 생화학, 병리학 및 해부학의 검사에서 상기 약물에 의해 유발된 변화는 존재하지 않았다. 따라서, 상기와 같은 진통 약물은 독성 효과가 거의 없다(미국 특허 출원 제 20110003009 호를 참조하시오). 그러나, 약물 설계 및 약물 발견에 대한 펩타이드 연구가 신약 개발에 가장 유망한 분야 중 하나이지만, 이 분야의 연구가들이, 비록 상기와 같은 화합물이 수십년간 시중에 존재하였고 통각상실증에 양호한 효과를 가졌다 하더라도, 상기 혼합물 중의 활성 단백질 성분들의 연구에 초점을 두었다는 보고서는 없다. 따라서, 상기 활성 성분(들)의 식별은 작용 기전(들)의 이해에 도움이 될 것이며 진통 효과의 원인인 정확한 성분들의 정제는 임상용으로 잘-기술된 약물(들)의 제조를 촉진할 것이다.

인플루엔자바이러스 A는 바이러스의 오쏘믹소비리다에과의 한 속이다. 인플루엔자 A 바이러스의 모든 하위유형 균주들이 야생 조류로부터 단리되었지만, 질병은 드물다. 인플루엔자 A 바이러스의 일부 단리물들은 가금류 및 드물게는 인간에서 중증 질병을 유발한다("조류 인플루엔자("조류 독감")-자료표", WHO). 때때로, 바이러스는 야생 수생 조류로부터 가금류로 전염되며, 이는 인간 인플루엔자 유행병의 창궐을 일으키거나 생기게 할 수 있다(Klenk, et al. (2008). "Avian Influenza: Molecular Mechanisms of Pathogenesis and Host Range". Animal Viruses: Molecular Biology. Caister Academic Press & Kawaoka Y, ed. (2006). Influenza Virology: Current Topics. Caister Academic Press). 인플루엔자 A 바이러스는 음의 센스, 단일-가닥, 분절된 RNA 바이러스이다. H 수(헤마글루티닌 유형에 대한) 및 N 수(뉴라미니다제 유형에 대한)에 따라 표지되는 다수의 하위유형들이 존재한다. 16 개 이상의 상이한 H 항원(H1 내지 H16) 및 9 개의 상이한 N 항원(N1 내지 N9)이 존재한다. 상이한 인플루엔자 바이러스들은 상이한 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 단백질을 암호화한다; 예를 들어 H5N1 바이러스는 5형 헤마글루티닌(H) 단백질과 1형 뉴라미니다제(N) 단백질을 갖는 인플루엔자 A 하위유형을 가리킨다. 더욱 또한, 각각의 바이러스 하위유형은 상이한 병원성 프로파일을 갖는 다양한 균주들로 돌연변이되었으며; 일부는 하나의 종에 병원성이지만 다른 것들에는 아니며, 일부는 다수의 종들에 병원성이다. 이론적으로, 이들 단백질의 144 개의 상이한 조합들이 가능하다("Influenza Viruses". Centers for Disease Control and Prevention. November 18, 2005). 일부 변체들이 식별되었으며 이들이 닮은 단리물에 따라 명명되었고, 따라서 이들의 전형적인 숙주(예를 들어 인간 독감 바이러스), 이들의 하위유형(예를 들어: H3N2), 및 이들의 치명성(예를 들어: LP, 낮은 병원성)에 따라 계통(예를 들어 푸젠 독감 바이러스-유사)을 공유하는 것으로 추정된다. 따라서 단리물 A/푸젠/411/2002(H3N2)와 유사한 바이러스로부터의 독감을 푸젠 독감, 인간 독감 또는 H3N2 독감이라 칭한다.

"인간 인플루엔자 바이러스"는 대개 인간들 사이에서 널리 확산되는 하위유형의 것들을 지칭한다. 모든 균주들 가운데, H1N1, H1N2 및 H3N2가 현재 인간들 사이에서 돌고 있는 유일한 공지된 인플루엔자 A 바이러스 하위유형이다(CDC, USA: Key Facts About Avian Influenza (Bird Flu) and Avian Influenza A (H5N1) Virus). 인플루엔자에 대한 치료는 일련의 약물 투여 및 인플루엔자 질병에 응하여 사용되는 요법들을 포함한다. 치료는 상기 인플루엔자 바이러스 자체를 직접 표적화하거나; 또는 대신에 상기 질병의 증상에 단지 완화만을 제공할 수도 있으며, 이러는 동안 신체 자신의 면역계는 감염으로부터 회복하는 작용을 한다(Montalto NJ, Gum KD, Ashley JV (2000). "Updated treatment for influenza A and B". Am Fam Physician 62 (11): 2467-76). 인플루엔자 바이러스에 대해 사용되는 항바이러스 약물의 2 가지 주요 부류는 뉴라미니다제 억제제, 예를 들어 자나미비어 및 오셀타미비어, 또는 상기 바이러스 M2 단백질의 억제제, 예를 들어 아만타딘 및 리만타딘이다. 이들 약물은 감염후 바로 복용되는 경우 증상의 중증도를 감소시킬 수 있으며 또한 상기 감염 위험성을 감소시키기 위해 복용될 수 있다. 그러나, 바이러스 균주는 상기 두 부류의 약물 모두에 대해서 약물 내성을 나타내었다. 세균성 항생제 내성의 발생처럼, 이는 상기 약물의 과용으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 최근의 연구는 2009 H1N1 '돼지 독감' 뉴라미니다제(NA)가 현재 계절성 H1N1 균주에서 만연하고 있는 타미플루-내성(His274Tyr) 돌연변이를 획득했다는 시나리오에서 상기 약물들의 수행에 대한 평가를 근거로 자나미비어(렐렌자)를 포함한 추가적인 항바이러스 약물과 함께 오셀타미비어(타미플루) 비축량을 증대시킬 필요성이 시급함을 강조하였다(Venkataramanan Soundararajan, Kannan Tharakaraman, Rahul Raman, S. Raguram, Zachary Shriver, V. Sasisekharan, Ram Sasisekharan (2009). "Extrapolating from sequence - the 2009 H1N1 'swine' influenza virus". Nature Biotechnology 27 (6): 510-3). 또 다른 예는 아만타딘 치료의 사례인데, 이는 내성 바이러스의 급속한 생산을 도출할 수 있으며, 상기 약물의 과용은 아마도 내성 확산에 기여하는 듯하다(Lynch JP, Walsh EE (April 2007). "Influenza: evolving strategies in treatment and prevention". Semin Respir Crit Care Med 28 (2): 144-58).

그러나, 한편으로, 뉴라미니다제 억제제에 내성인 몇몇 균주들이 관련 약물의 다량 사용의 부재 하에서 출현하여 순환되었으며, 약물 내성 균주들이 출현하는 빈도는 이들 약물의 사용 수준과 거의 상관성을 보이지 않는다(Lackenby A, Thompson CI, Democratis J (December 2008). "The potential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza". Curr. Opin. Infect. Dis. 21 (6): 626-38). 실험실 연구는, 예방학적 수단으로서 상기 약물의 차선 용량의 사용이 가능하며, 이는 약물 내성의 발생에 기여함을 또한 입증하였다(Lackenby A, Thompson CI, Democratis J (December 2008). "The potential impact of neuraminidase inhibitor resistant influenza". Curr. Opin. Infect. Dis. 21 (6): 626-38).

효능있고 부작용이 적은, 보다 새로운 부류의 항-인플루엔자 바이러스에 대한 탐색은 생물-의학 사회에 하나의 도전이 되고 있다.

발명의 요약

본 명세의 하나의 목적은 DEAQETAVSSHEQD의 진통성 펩타이드, 그의 변체 및 유도체를 제공하는 것이다. 놀랍게도, 상기 펩타이드는 또한 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 나타낸다.

본 명세의 또 다른 목적은 상기 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 명세의 더욱 또 다른 목적은 상기 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체의 제조 및 용도를 제공하는 것이다.

하나의 태양에서, 본 명세는 DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩타이드, 그의 보존된 변체, 그의 활성 단편 및 그의 활성 유도체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 펩타이드는 DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열에 50% 이상의 상동성, 예를 들어 60% 이상의 상동성, 70% 이상의 상동성, 80% 이상의 상동성, 또는 90% 이상의 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고 진통 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 갖는 단리된 펩타이드를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열에 비해 1 내지 7 개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개)의 보존된 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 진통 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 갖는 단리된 펩타이드를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명에 개시된 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 화학 합성에 의해 수득한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는

(a) DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및

(b) (a)의 뉴클레오타이드 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드

로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열에 50% 이상의 상동성을 공유하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며; 여기에서

상기 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체는 진통 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 갖는다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 DEAQETAVSSHEQD 펩타이드의 활성을 갖는 펩타이드의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은

(a) 상기 형질전환된 숙주 세포를 발현 조건 하에서 배양하고;

(b) 본 발명의 펩타이드를 상기 배양물로부터 단리함

을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 DEAQETAVSSHEQD 펩타이드 활성을 자극하고, 촉진하고, 길항하는 화합물들을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 유효량의 본 발명의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물을, 환자에게서 통증과 관련된 질병 및/또는 증상을 치료하거나 완화시키기 위해 사용할 수 있다. 본 발명에서 통증과 관련된 질병 및/또는 증상은 비제한적으로 모든 종류의 징후성 신경통, 방산통, 담낭산통, 협심증, 동맥 색전증 통증, 상처, 화상으로부터의 급성 통증, 수술 또는 수술후 통증, 소화성 궤양 통증, 생리통, 분만후 산통, 두통, 다양한 종양에 의해 유발된 통증 중에서 선택되는 것들을 포함한다. 상기 약학 조성물을 또한, 환자에게서 인플루엔자 A 바이러스의 활성을 억제시키기 위해 사용할 수 있다. 본 발명에서 인플루엔자 A 바이러스는 바람직하게는 H5N1 및 H1N1 중에서 선택된다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 환자에게서 통증과 관련된 질병 및/또는 증상의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 본 발명의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 환자에게서 인플루엔자 A 바이러스의 활성의 억제 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 본 발명의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 환자에게서 통증과 관련된 질병 및/또는 증상의 치료 또는 경감을 위한 약제의 제조에서 본 발명의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체의 용도를 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 명세는 환자에게서 인플루엔자 A 바이러스의 활성의 억제를 위한 약제의 제조에서 본 발명의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 태양들은 상기 명세의 교시에 비추어 숙련가에게 자명할 것이다.

본 명세서에서 언급한 모든 발행물들은 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 각각의 개별적인 발행물들이 그들의 내용 전체가 구체적이고 개별적으로 참고로 인용됨을 가리키는 바와 같은 정도로 본 발명에 참고로 인용된다.

하기의 도면들은 상기 실시태양들을 예시하며, 특허청구범위에서 한정된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
도 1은 우두 바이러스의 접종에 의해 유발된 염증성 토끼 피부의 조 추출물로부터 펩타이드/작은 펩타이드-수준 진통제의 선별에 사용되는 과정들을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 작용성 펩타이드(들)의 식별이다. 이중으로 하전된 이온 m/z 772.745의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 아미노산 서열 DEAQETAVSSHEQD을 토끼 α1-항프로테이나제의 y- 및 b-단편 이온 시리즈 및 합치된 잔기 1 내지 14에서 MS 차이로부터 측정하였다.
도 3은 아세트산의 복강내 주사(n=6)에 의해 유발된 통증의 개시에서 현저한 지연에 의해 나타난 바와 같이, 펩타이드 5가 다른 펩타이드들에 비해 가장 우수한 통증-완화 효과를 가지며 1 ㎎ 몰핀에 필적함을 나타낸다. 주: 펩타이드 5 대 펩타이드 1, 2, 3, 4 또는 6 사이에서 p<0.005; 펩타이드 5 대 몰핀 사이에서 p>0.05; 및 대조군: 물 단독.
도 4는 펩타이드 5가 아세트산 주사(n=6) 후 30 분째에 전체 몸부림 회수의 현저한 감소를 또한 야기하였음을 나타낸다. 주: 펩타이드 5 대 펩타이드 1, 2, 3, 4 또는 6 사이에서 p<0.01; 펩타이드 5 대 몰핀 사이에서 p>0.05; 대조군: 물 단독.
도 5는 펩타이드 5가 신경성 기원의 효능있는 진통 효과를 가졌음을 나타낸다. 열 자극에서, 2 ㎎ 펩타이드 5(DEAQETAVSSHEQD)의 복강내 주사에 의한 처리는 좌골신경 손상된 사지의 온도-유발된 통증(통각과민)을 현저하게 감소시켰다. 데이터를 시간(초)에 따른 평균±SD로서 나타낸다. N = 6. 주: 5, 10 또는 30일째에 처리되지 않은 손상된 동측 사지와 처리된 사지사이에서 ^**p<0.005(ANOVA에 의해).
도 6은 펩타이드 5가 신경손상이 있거나 없는 사지의 열성 이질통증에 대해 효능있는 효과를 가졌음을 나타낸다. 기계적 자극에서, 2 ㎎ 펩타이드 5(DEAQETAVSSHEQD)의 복강내 주사에 의한 처리는 좌골신경 손상된 사지의 열성 이질통증을 현저하게 감소시켰다. 데이터를 폰 폴리(von Foley) 모발 한계(그램)의 평균 SD로서 나타낸다. N = 시점당 6. 주: 5, 10 또는 30일째에 처리되지 않은 손상된 동측 사지와 처리된 사지사이에서 ^**p<0.005(ANOVA에 의해).
도 7은 펩타이드 5가 시험관내에서 H5N1 및 H1N1 바이러스의 복제를 억제함에 있어서 효능있는 효과를 가짐을 나타낸다. 펩타이드 5를 순수한 물에 용해시키고 이를 H5N1(좌측 패널) 또는 H1N1 바이러스(우측 패널)의 다양한 균주들에 의해 5,000 pfu/㎖로 동시에 감염시킨 단층 MDCK 세포에 첨가하였다(0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM). 3일 후에, 플라크 수를 손으로 카운트하고 처리되지 않은 대조군(즉 0 μM)에 대해 표준화하였다.
주: A/베트남/1194/04(H5N1)의 경우:
(1) 처리 없음과 0.1 μM 처리간에 통계학적 유의수준 없음
(2) 처리 없음과 1 μM 처리간에 p<0.01
(3) 처리 없음과 10 μM 처리간에 p<0.001
반면, A/홍콩/97(H5N1) 및 A/거위/타이중/Q156/05(H5N1) 모두의 경우:
(1) 처리 없음과 0.1 μM 처리간에 p<0.05
(2) 처리 없음과 1 μM 처리간에 p<0.005
(3) 처리 없음과 10 μM 처리간에 p<0.001
유행성 H1N1/2009의 경우:
(1) 처리 없음과 0.01 μM 처리간에 통계학적 유의수준 없음
(2) 처리 없음과 0.1 μM 처리간에 p<0.05
(3) 처리 없음과 1 μM 처리간에 p<0.005
(4) 처리 없음과 10 μM 처리간에 p<0.001
A/타이완/01/86(H1N1)의 경우:
(1) 처리 없음과 0.01 μM 처리간에 p<0.05
(2) 처리 없음과 0.1 μM 처리간에 p<0.01
(3) 처리 없음과 1 μM 처리간에 p<0.005
(4) 처리 없음과 10 μM 처리간에 p<0.001.

본 명세의 펩타이드, 약학 조성물, 용도 및 방법의 실시태양들은 예시이며 제한이 아니고자 한다. 변형 및 변화를, 상기 교시, 구체적으로 진통제 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 억제 효과에 관하여 거의 고유한 작용을 유지하는 상기 펩타이드들의 변경에 속할 수도 있는 것들에 비추어 당해 분야의 기술에 의해 수행할 수 있다. 따라서, 개시된 범위내에서 개시된 특정 실시태양들에서 변화를 수행할 수 있음은 물론이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 토끼 α1-항프로테이나제 F의 단편이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "단리된"이란 용어는 원래의 환경으로부터 단리된 물질을 지칭한다. 천연 물질의 경우, 상기 원래의 환경은 천연 환경이다. 예를 들어, 생육성 세포에서 천연 상태의 폴리뉴클레오타이드 및 펩타이드는 단리되거나 정제되지 않는다. 그러나, 상기 동일한 폴리뉴클레오타이드 및 펩타이드를, 이들을 천연으로 동반하는 다른 성분들로부터 단리한 경우, 이들은 단리되거나 정제된다.

상기 명세의 펩타이드는 재조합, 천연, 또는 합성 펩타이드, 바람직하게는 재조합 펩타이드일 수 있다. 상기 명세의 펩타이드는 정제된 천연 생성물 또는 화학 합성된 생성물일 수 있다. 한편으로, 상기 펩타이드를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주, 예를 들어 세균, 효모, 고등식물, 곤충, 및 포유동물 세포로부터, 재조합 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 상기 재조합 생산에 사용된 숙주에 따라, 상기 펩타이드는 글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않을 수도 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "유도체" 및 "변체"란 용어는 DEAQETAVSSHEQD의 천연 펩타이드와 동일한 생물 작용 또는 활성을 필수적으로 유지하는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 본 발명에 사용된 "유도체"란 용어는 비제한적으로 (i) 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 것, (ii) 펩타이드가 또 다른 화합물, 예를 들어 상기 펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어 폴리에틸렌 글리콜)과 축합된 것, (iii) 추가적인 아미노산, 예를 들어 리더 또는 분비 서열, 또는 펩타이드 또는 프로단백질의 정제에 사용되는 서열이 펩타이드에 축합된 것, 또는 (iv) 펩타이드가 일부 변형에 의해 변형된 것을 포함한다. 상기와 같은 유도체는 본 발명의 교시를 근거로 숙련가에게 공지되어 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "변형"(1차 서열을 통상적으로 변경시키지 않는다)이란 용어는 펩타이드의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화, 예를 들어 아세틸화 또는 카복실화를 포함한다. 또한 글리코실화의 변형, 예를 들어 합성 및 가공 중 또는 추가적인 가공 단계에서 펩타이드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써, 예를 들어 상기 펩타이드를 글리코실화 효소(예를 들어 포유동물 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소)에 노출시킴으로써 수행된 변형들이 포함된다. 인산화된 아미노산 잔기, 예를 들어 포스포타이로신, 포스포세린, 포스포쓰로닌을 갖는 서열뿐만 아니라 단백질 분해에 대한 내성을 개선시키거나 또는 용해도 성질을 최적화하도록 변형된 서열이 또한 포함된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "변체"란 용어는 비제한적으로 펩타이드의 C-말단, N-말단 또는 내부에서 다수 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 바람직하게는 다수의 보존된 아미노산 치환(전형적으로, 1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 6, 보다 바람직하게는 1 내지 5, 훨씬 더 바람직하게는 1 내지 4, 훨씬 더 바람직하게는 1 내지 3, 가장 바람직하게는 1 내지 2), 및 하나 이상의 아미노산 첨가(전형적으로 20 미만, 바람직하게는 10 미만, 보다 바람직하게는 5 미만)를 포함한다. 예를 들어, 상기 단백질 작용은 대개 아미노산이, 유사하거나 닮은 것에 의해 치환되는 경우, 예를 들어 보존되거나 보존되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되는 경우 변하지 않는다. 더욱이, C-말단 및/또는 N-말단에서 하나 또는 다수의 아미노산의 첨가는 대개 상기 단백질 작용을 변화시키지 않는다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "보존된 아미노산 치환"이란 용어는 DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열에 비해, 7 개 이하, 바람직하게는 6 개 이하, 보다 바람직하게는 5 개 이하, 및 가장 바람직하게는 3 개 이하의 아미노산을 실질적으로 동일하거나 유사한 성질을 갖는 아미노산들로 치환시킴으로써 형성된 펩타이드를 의미한다. 바람직하게, 상기 보존된 돌연변이체는 표 1에 따른 치환에 의해 형성된다.

초기 잔기	전형적인 치환
Asp (D)	Glu
Glu (E)	Asp
Ala (A)	Val; Leu; Ile
Gln (Q)	Asn
Thr (T)	Ser
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala
Ser (S)	Thr
His (H)	Asn; Gln; Lys;Arg

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 및 RNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA 등을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 축퇴성 서열일 수도 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "축퇴성 서열"이란 용어는 코돈의 축퇴성으로 인해 동일한 단백질을 암호화하는 상이한 서열이 존재함을 의미한다.

"펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"란 용어는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 추가적인 및/또는 비-암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명에서 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 PCR 증폭, 재조합 방법 및 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. PCR 증폭의 경우, 본 발명에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하는 프라이머, 특히 ORF를 설계하고, 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 주형으로서 당해 분야의 통상적인 기법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리를 사용함으로써 상기 서열을 수득할 수 있다. 일단 상기 서열이 수득되면, 재조합 방법에 의해 다수의 상기 서열을 생성시킬 수 있다. 대개, 상기 서열을 벡터내로 클로닝하고, 이어서 상기 벡터를 숙주 세포내로 형질전환시킨다. 상기 서열을 통상적인 기법을 사용하여 상기 증폭된 숙주 세포로부터 단리한다.

본 발명은 또한 상기 명세의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 명세의 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 유전자 가공된 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 상기 펩타이드의 생성 방법에 관한 것이다.

상기 재조합 펩타이드를 통상적인 재조합 DNA 기술(Science, 1984; 224:1431)에 의해, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하여 발현시키거나 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 상기는 하기의 단계들을 포함한다:

(1) 적합한 숙주 세포를 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터로 형질감염시키거나 형질전환시키고;

(2) 상기 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양하고;

(3) 상기 배지 또는 세포로부터 단백질을 단리하거나 정제함을 포함한다.

본 발명에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 재조합 발현 벡터에 삽입할 수 있다. "발현 벡터"란 용어는 세균성 플라스미드, 박테리오파지, 효모 플라스미드, 식물 바이러스 또는 포유동물 세포 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 비히클들을 의미한다. 임의의 플라스미드 또는 벡터를, 이들이 복제될 수 있고 숙주에서 안정한 한, 상기 재조합 발현 벡터의 제작에 사용할 수 있다. 발현 벡터의 한 가지 중요한 특징은 상기 발현 벡터가 전형적으로 복제 기원, 프로모터, 마커 유전자뿐만 아니라 번역 조절 성분을 함유한다는 것이다.

본 발명의 서열 및 적합한 전사/번역 조절 성분을 함유하는 발현 벡터를 제작하기 위해 공지된 방법들을 사용할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, DNA 합성 기법, 생체내 재조합 기법 등을 포함한다. 상기 DNA 서열을 발현 벡터 중의 적합한 프로모터에 효율적으로 결합시켜 mRNA의 합성을 지시한다. 예시적인 프로모터는 에스케리키아 콜라이의 lac 또는 trp 프로모터; A 파지의 PL 프로모터; CMV 전초기 프로모터를 포함하는 진핵생물 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 말기 SV40 프로모터, 레트로바이러스의 LTR 및 원핵생물 세포, 진핵생물 세포 또는 바이러스에서 유전자 발현을 조절하는 일부 다른 공지된 프로모터이다. 상기 발현 벡터는 번역, 전사 종결자 등을 개시시키기 위한 리보솜-결합 부위를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 원핵생물, 예를 들어 세균; 원시 진핵생물, 예를 들어 효모; 고등 진핵생물, 예를 들어 포유동물 세포를 포함한다. 전형적인 예는 세균 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움; 진균 세포, 예를 들어 효모; 식물 세포; 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 S2 또는 Sf9; 동물 세포, 예를 들어 CHO, COS 또는 보우스 흑색종 등이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "진통 효과"란 용어는 "통각과민 억제 효과" 및 "이질통증 억제 효과"를 포함한다. 그러나, 이들 3 개의 용어는 이들 용어가 상이한 질병 또는 모델에서 통증 완화를 나타내기 때문에 별도로 사용될 수 있었다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "환자"란 용어는 인간, 비-인간 포유동물(예를 들어 소, 양, 토끼, 개, 마우스, 래트, 원숭이 등) 및 가금류를 포함한다.

본 발명은 또한 안전하고 유효한 양의 본 발명의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기와 같은 담체는 비제한적으로 염수, 완충 용액, 글루코스, 물, 글리세린, 에탄올 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 약학 제형은 전달 방법에 적합해야 한다. 상기 약학 조성물은 통상적인 방법에 의해, 생리식염수 또는 글루코스 또는 보조 물질을 함유하는 다른 수용액을 사용하여 제조된 주사액의 형태일 수 있다. 정제 또는 캡슐 형태의 상기 약학 조성물을 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 약학 조성물, 예를 들어 주사액, 용액, 정제 및 캡슐을 멸균 조건 하에서 제조해야 한다. 상기 활성 성분을 치료 유효량으로, 예를 들어 하루에 약 1 ug 내지 50 ㎎/㎏ 체중 이상으로 투여한다. 더욱이, 본 발명의 펩타이드를 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다.

선행의 실험 증거는 우두 바이러스의 접종에 의해 유발된 염증성 토끼 피부의 조 추출물이 통각상실증에 대한 그의 약물학적 효과를 발휘할 수 있음을 보인다. 통증 완화를 위한 정확한 성분들을 식별하기 위해서, 모 작용제 AGC(등록상표)에 의해 입증된 바와 같이, 우리는 나노 LC-MS/MS를 사용함으로써 질량 대 전하비(m/z)의 차이를 측정하는 프로테오믹스 접근법을 사용하였다. 정교한 화학적 정제 및 데이터베이스 탐색을 통해, 발명자들은 효능있는 진통, 통각과민 억제, 이질통증 억제 및 인플루엔자 A 바이러스 억제 효과를 갖는 DEAQETAVSSHEQD의 펩타이드 서열을 식별하였다.

본 발명을 하기의 실시예들에 의해 추가로 예시한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하고자 할뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는다. 하기 실시예들의 실험 방법들에 대해서, 이들 방법을 달리 나타내지 않는 한, 통상적인 조건 하에서, 예를 들어 문헌[Sambrook. et al., in Molecule Clone: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 개시된 조건들 하에서, 또는 제조사에 의해 설명된 대로 수행하였다.

실시예

실시예 1: 펩타이드 식별

A. 샘플 제조

바이러스 백시니아 바리올라에의 접종에 의해 유도된 염증을 갖는 토끼의 피부 조직으로부터 추출된 생물활성제들의 혼합물이 개시된 바와 같이 제조되고(Y. Imai, K. Saito, S. Maeda et al. Inhibition of the release of bradykinin-like substances into the perfusate of rat hind paw by neurotropin. Jpn J Pharmacol 1984, 36:104-106), 반월드 파마슈티칼 캄파니 리미티드(Vanword Pharmaceutical Co Ltd)(중국 루가오 소재)에 의해 상표명 AGC(등록상표)(10 U/㎖, 25 ㎖/바이알)로 제공되었다. 대략 200 ㎕의 AGC(등록상표)의 조 제제를 진공 원심분리기에서 건조시켰다. 상기 동결건조된 물질을 8 M 유레아 및 0.5 M 다이티오쓰레이톨(DTT)을 함유하는 0.5 M 암모니아 바이카보네이트 완충제(pH 8.5) 100 ㎕로 37 ℃에서 1 시간 동안 재조성하고, 10 ㎕의 0.5 M 요오도아세트아미드(IAM)를 알킬화를 위해 첨가하는 경우 어두운 조건 하에 4 ℃에서 추가로 2 시간 동안 재조성하였다. 후속으로, 상기 생성 용액을 37 ℃에서 18 시간 동안 0.2 ㎍의 트립신으로 절단하고, 이어서 상기 트립신-절단된 용액을 10% 트라이플루오로아세트산(TFA)/H₂O에 의해 pH 3.0 값으로 산성화시켰다. 상기 반응 후에, 상기 완전히 산성화된 용액을, 200 ㎕의 0.1% TFA/H₂O(pH 3.0)로 예비-평형화시킨 역상 C18 컬럼상에 적용하였다. 상기 컬럼을 또한 200 ㎕의 0.1% TFA/H₂O(pH 3.0)로 세척하고 이어서 실온에서 0.1% TFA 중의 50%에서 100%로의 단계적인 아세토나이트릴 구배로 용리시켰다.

B. 나노-LC-MS/MS 분석

상기 용리된 분획들을 수거하고, 진공 원심분리기에서 건조시키고, 이어서 H₂O 중의 10 ㎕의 0.1% 포름산(FA) 중에서 재조성하고, LTQ 오르비트랩(Orbitrap) XL(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 캘리포니아주 산호세 소재)에 의해 분석하였다. 역상 나노-LC 분리를 에이질런트(Agilent) 1200 시리즈 나노흐름 시스템(에이질런트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)상에서 수행하였다. 분획으로부터 총 10 ㎕ 샘플을 에이질런트 조르박스(Zorbax) XDB C18 프리컬럼(0.35 ㎜, 5 ㎛)상에 로딩한 다음, C18 컬럼(i.d. 75 ㎛ x 25-㎝, 3 ㎛, 마이크로 테크(Micro Tech), 미국 캘리포니아주 폰타나 소재)을 사용하여 분리시켰다. 사용된 이동상은 (A) 0.1% FA 및 (B) 100% ACN 중 0.1% FA이었다. 90-분 기간에 걸쳐 300 nL/분의 유량으로 5%에서 35%의 선형 구배(B)를 적용하였다. 상기 펩타이드를, 주사 바늘에 1.8 Kv의 전압을 적용시킴으로써 양이온 모드로 분석하였다. 상기 MS를, 30 ms/스캔의 속도를 사용하여 상기 오르비트랩(m/z 400에서 R = 60 000)에서 m/z 300 내지 2000의 1 회 전체 스캔으로, 데이터-의존적인 방식으로 실행시켰다. 상기 LTQ에서 35%의 표준화된 충돌 에너지값을 갖는 단편화에 대한 6 개의 가장 강한 피크들을 선택하였다. 30s의 반복 지속기간을 적용시켜 상기 단편화를 위한 재선택으로부터 동일한 m/z 이온을 제외시켰다. 환원, 알킬화 및 탈염에 의해 또한 처리된, 대조군으로서 상기 재조성된 액체를 산성화하고, 트립선 절단을 제외하고 상기 언급한 바와 같이 나노-LC-MS/MS 분석을 수행하였다.

C. 데이터베이스 탐색 및 식별

펩타이드를, MASCOT 탐색 프로그램(http://www.matrixscience.com; Hirosawa et al., 1993)을 사용하여 정확한 합치에 대해서 상기 NCBI 데이터베이스에서 동물 분류에 대해 탐색함으로써 상기 나노LC-MS/MS 스펙트럼으로부터 변환된 피크 목록들에 의해 식별하였다. 상기 전구체 이온 및 단편 이온 모두의 질량 오차범위를 0.8 Da으로 설정하였다. 카브아미도메틸화(C)로서 고정된 변형을 허용하도록, 효소로서 트립신 없이, 탐색을 수행하였다. 생성된 식별은 통계학적 유의수준(P≤0.05)의 펩타이드 점수(병행된 MS 및 MS/MS 스펙트럼에 근거하여) 및 최상의 이온 점수(MS/MS 스펙트럼에 근거하여)를 가졌다.

D. 결과

이어서 트립신 절단에 의해 또는 상기 절단 없이 생성된 단백질 단편의 질량 스펙트럼 패턴을, 완전한 단백질의 식별(단백질 ID)에 사용될 수 있는 펩타이드 서열을 확인하기 위해서 데이터뱅크에 기탁된 앞서 공지된 단백질들의 패턴들과 비교하기 위해 사용하였다. 따라서, 우리는 샷건 분석에 의해 펩타이드의 광범위한 커버리지를 성취하고, 펩타이드 또는 작은 펩타이드의 발현 프로파일을 밝히고, 서열뿐만 아니라 생화학적 특성화를 확인할 수 있다. 상기 연구에 사용된 방법들의 흐름도 및 그의 생화학적 특성화에 의해 식별된 모든 펩타이드들을 표 2에 나열한다. MS/MS 분석으로부터 전형적인 펩타이드 피크가 검출되었으며(도 2), MASCOT 탐색에 의해 단백질 식별이 확신되었다. 이중으로 하전된 이온 m/z 772.745의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다. 아미노산 서열 DEAQETAVSSHEQD을 y- 및 b-단편 이온 시리즈 중 MS 차이로부터 측정하였으며, 이는 인간, 마우스 또는 소의 것과 상이한 토끼 α1-항프로테이나제 F의 잔기 1 내지 14와 합치되었다. 또한, 상기는 오피오이드 작용물질 DAGO를 포함하여 다른 통각상실증-관련된 펩타이드와 또한 상동성을 공유하지 않는다. 계산적 예견에 따라, 상기는 선형이며 α-나선, β-시트, β-회전, 또는 굽힘 영역과 같은 구조들을 갖지 않는 듯하다.

[표 2]

나노LC-MS/MS 분석으로부터 MS/MS 스펙트럼에 의해 식별된 6 개의 작은 펩타이드들의 특성화

$(p.20)

(펩타이드 서열/펩타이드/질량)

실시예 2: 생체내 진통 효과

상기 펩타이드를 고상 Fmoc 화학을 사용하여 미션 바이오테크 캄파니(Mission Biotech Co.)(타이완 타이페이 MB 소재)의 상업적인 설비에서 합성하였으며 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 >90%의 순도로 정제시키고 MS에 의해 확인하였다. 최종 펩타이드 생성물을 실험용도를 위해서 DMSO에 용해시켰다.

마우스에서 급성 내장통 모델에 대해서, 20 내지 25 gm 중량의 C57BL/6 수컷 마우스에게 1 ㎎ 몰핀(양성 대조군으로서) 또는 합성 펩타이드 1, 2, 3, 4, 5 또는 6(각각 2 ㎎)을 복강내 주사하였다. 30분 후에, 마우스에게 후속으로 1 ㎖의 1% 아세트산을 복강내 주사하였다. 첫 번째 몸부림의 개시 및 다음 30 분 후 몸부림 횟수를 기록하였다.

상기 펩타이드 5(14-아미노산 펩타이드)는 앞발 움추림의 지연된 반응시간(도 3) 및 30분간 측정된 감소된 전체 움추림 에피소드(도 4)에 나타난 바와 같이 1 ㎎ 몰핀에 필적하는 유사한 통증-완화 효과를 갖는다.

실시예 3: 통각과민 억제 효과

20 내지 25 gm 중량의 C57BL/6 수컷 마우스를 사용하였다. 할로탄(2 내지 3%) 마취하에서 외과적 시술을 수행하였다. 문헌[Malmberg AB and Basbaum AI. Pain 1998;76:215-222]에 개시된 바와 같이, 좌골 신경의 직경 1/3 내지 1/2 둘레를 9-0 견사로 단단히 결찰 봉합하여 부분적인 좌골신경 손상을 생성시켰다. 모의 수술한 마우스에서, 상기 좌골신경은 노출되었으나 결찰되지 않았다. 상기 마우스를 후속으로, 열 시험 및 폰 폴리 모발 시험 전에, 1 시간 이상 시험 환경에 익숙하게 하였다. 열 시험에서, 상기 앞발 움추림 반응시간을 통증에 대한 지표로서 측정하였다. 상기 폰 폴리 시험에서, 자극 강도를 정상 마우스에서 10-초 움추림 반응시간을 제공하도록 조절한 반면, 반응의 부재 하에서 컷오프는 20초였다. 폰 폴리 모발에 의한 기계적 감도를 업-다운 패러다임에 의해 평가하였다(Chaplan et al, J Neurosci Methods 1994;53:53-66). 상기 시험 패러다임용 필라민트를 0.3-gm인 것으로 선택하였다.

상기 펩타이드 5를 좌골신경 결찰을 받은 마우스에서 그의 통각과민-억제 효과에 대해 시험하였다. 상기 모의 시술된 마우스와 신경 손상된 마우스의 열 시험으로부터의 결과를 상기 수술후 5, 10 및 30일째에 나란히 비교하였다. 결과는, 현저하게 감소된 앞발 움추림 반응시간에 의해 입증된 바와 같이, 신경 손상이 있는 사지가 대측성 사지 또는 모의-수술된 사지의 경우에 비해 통각과민을 가짐을 명백히 나타내었다(도 5). 더욱 또한, 2 ㎎ 펩타이드 5의 복강내 주사("처리된"으로 표지됨)는 실제로, 상기 앞발 움추림 반응시간의 증가에 의해 입증된 바와 같이(도 5), DMSO 용매가 제공된 대조용 마우스("처리되지 않은"으로 표지됨)에 비해 상기 열-유발된 통증에 대한 관용을 현저하게 증가시킬 수 있었다.

실시예 4: 이질통증 억제 효과

실시예 3의 동일한 동물 모델을 사용하였다. 상기 펩타이드 5를 좌골신경 결찰을 받은 마우스에서 그의 이질통증 억제 효과에 대해 시험하였다. 상기 모의 수술된 마우스 및 신경 손상된 마우스의 기계적 자극(폰 폴리 시험)으로부터의 결과를 상기 수술후 5, 10 및 30일째에 나란히 비교하였다. 결과는 현저하게 보다 낮은 폰 폴리 한계에 의해 입증된 바와 같이, 신경 손상이 있는 사지가 대측성 사지 또는 모의-수술된 사지의 경우에 비해 고-이질통증을 가짐을 명백히 나타내었다(도 6). 더욱 또한, 2 ㎎ 펩타이드 5의 복강내 주사("처리된"으로 표지됨)는 실제로, 상기 폰 폴리 한계의 증가에 의해 입증된 바와 같이(도 6), 순수한 물이 제공된 대조용 마우스("처리되지 않은"으로 표지됨)에 비해 상기 기계적 자극에 대한 관용을 현저하게 증가시킬 수 있었다.

실시예 5: 항-바이러스 효과

A. 바이러스 및 세포

H5N1 단리물 A/베트남/1194/04 및 A/홍콩/97을 홍콩 대학 미생물 학부로부터 수득하였다. 상기 바이러스를 실험을 위해 3 x 10⁵ TCID₅₀으로 사용하였다. A/타이완/01/86(H1N1)을 또한 실험을 위해 3 x 10⁵ TCID₅₀으로 사용하였다. 상기 H5N1 실험을 생물안전 수준(BSL) 3+ 격납 설비에서 수행하였다. 바이러스 모액의 분액들을 -80 ℃에서 보관하였다. 마딘 다비(Madin-Darby) 개 신장(MDCK) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 수득하고 10% 송아지 태아 혈청 및 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 유지시켰다. 상기 50% 조직 배양물 감염 용량(TCID₅₀)을 37 ℃에서 3일간 배양후 MDCK 세포에서 측정하고 그 값들을 문헌[Reed LJ, Muench H. A simple method for estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 1938;27:493-497]의 방법에 의해 계산하였다. 바이러스 복제의 억제에 있어서 펩타이드 5의 유효성을 측정하기 위해서, pfu/㎖을, 시딩되고 초기 역가(5 x 10³ pfu/㎖)의 백분율로서 발현된 초기 pfu/㎖(이에 의해 나누어)과 비교하였다.

B. 플라크 분석에 의한 바이러스 역가 측정

여기에 사용된 모든 바이러스를 처음에, 감염 역가(mL당 플라크 형성 단위, pfu/㎖)의 측정을 위해서 MDCK상에서 정량분석하였다. 간단히, 상기 MDCK 세포를 24-웰 플레이트에서 단층으로 증식시키고 펩타이드 5(0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM)로 처리후 상기 바이러스로 5 x 10³ pfu/㎖로 감염시킨다. 세포밀집된 MDCK 세포상에서 37 ℃에서 1 시간 결합시킨 후에, 결합되지 않은 바이러스를 PBS로 서서히 세척하고, 1:1 노블 아가(1.8%) 및 2x DME-F12(글루타맥스(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재), ITS(인비트로젠), 및 3 ㎍/㎖ 아세틸화된 트립신(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)이 보충됨)를 오버레이하였다. 아가를 고화시킨 후에, 상기 플레이트를 37 ℃에서 약 72 시간 동안 배양시킨 다음 크리스탈 바이올렛으로 고정시키고 각 희석비에서 플라크 수를 카운트하였다. 3일 후에, 상기 플라크 수를 손으로 카운트하고 처리되지 않은 대조군(즉 0 μM)에 대해 표준화하였다.

C. 펩타이드 5는 시험관내에서 인플루엔자 바이러스 H5N1 및 H1N1 복제를 억제한다

인플루엔자 바이러스 H5N1 및 H1N1의 복제에 대한 펩타이드 5의 억제 효과를 검사하기 위해서, 연속 희석된 합성 펩타이드 5를, 5000 pfu/㎖의 H5N1 A/베트남/1194/04, A/홍콩/97 및 A/거위/타이중/Q156/05, 또는 H1N1에 노출시킨 24-웰 플레이트 중의 단층 MDCK 세포의 배양물에 보충하였다. 3일 후에, 각각의 약물 농도를 갖는 바이러스 플라크의 수를 카운트하고 플라크 수를 처리되지 않은 대조군에 대해 표준화하였다(도 7). 상기는 펩타이드 5가 시험관내에서 H5N1 및 H1N1 바이러스의 복제를 억제함에 있어서 효능있는 효과를 가짐을 보였다.

본 발명에 개시된 실시태양들의 태양들을 본 발명의 진의 또는 필수적인 특징들로부터 이탈됨 없이 다른 형태로 실현하거나 또는 다른 방식으로 수행할 수도 있다. 따라서 본 명세는 모든 태양들에서, 예시되는 것이고 제한적이지 않은 것으로서 고려되어야 하며, 등가의 의미 및 범위내에 있는 모든 변화들을 이중에 포함시키고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> WELL RESOURCES LIMITED <120> A PEPTIDE AND THE USE THEREOF <130> FPCH12160031P <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> residues 1-14 of rabbit alpha1-antiproteinase F <400> 1 Asp Glu Ala Gln Glu Thr Ala Val Ser Ser His Glu Gln Asp 1 5 10

Claims

DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열, 그의 변체 및/또는 유도체를 포함하는 단리된 펩타이드.
제 1 항에 있어서,
펩타이드의 서열이 DEAQETAVSSHEQD인 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체.
DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열에 50% 이상의 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고 진통 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 갖는 단리된 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체.
DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열에 비해 1 내지 7 개의 보존된 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 진통 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 갖는 단리된 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
화학 합성에 의해 수득되는 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체.
(a) DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및
(b) (a)의 뉴클레오타이드 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드
로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열에 50% 이상의 상동성을 공유하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로,
상기 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체가 진통 및/또는 인플루엔자 A 바이러스 억제 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
제 6 항에 있어서,
DEAQETAVSSHEQD의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
유효량의 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
환자에게서 통증과 관련된 질병 및/또는 증상을 치료 또는 경감시키는 방법으로, 상기 환자에게 유효량의 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 투여함을 포함하는 방법.
제 9 항에 있어서,
통증과 관련된 질병 및/또는 증상이 모든 종류의 징후성 신경통, 방산통, 담낭산통, 협심증, 동맥 색전증 통증, 상처, 화상으로부터의 급성 통증, 수술 또는 수술후 통증, 소화성 궤양 통증, 생리통, 분만후 산통, 두통, 및 다양한 종양에 의해 유발된 통증 중에서 선택되는 방법.
환자에게서 인플루엔자 A 바이러스의 활성을 억제시키는 방법으로, 상기 환자에게 유효량의 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체를 투여함을 포함하는 방법.
제 11 항에 있어서,
인플루엔자 A 바이러스가 H5N1 및 H1N1 중에서 선택되는 방법.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자가 인간, 비-인간 포유동물 및 가금류 중에서 선택되는 방법.
환자에게서 통증과 관련된 질병 및/또는 증상을 치료 또는 경감시키기 위한 약제의 제조에서 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체의 용도.
제 14 항에 있어서,
통증과 관련된 질병 및/또는 증상이 모든 종류의 징후성 신경통, 방산통, 담낭산통, 협심증, 동맥 색전증 통증, 상처, 화상으로부터의 급성 통증, 수술 또는 수술후 통증, 소화성 궤양 통증, 생리통, 분만후 산통, 두통, 및 다양한 종양에 의해 유발된 통증 중에서 선택되는 용도.
환자에게서 인플루엔자 A 바이러스의 활성을 억제시키기 위한 약제의 제조에서 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드, 그의 변체 및/또는 유도체의 용도.
제 16 항에 있어서,
인플루엔자 A 바이러스가 H5N1 및 H1N1 중에서 선택되는 용도.
제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
환자가 인간, 비-인간 포유동물 및 가금류 중에서 선택되는 용도.