ES2626250T3 - Conservantes a partir de derivados de quitina - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de un derivado de quitosano mediante la activación de quitosano, suspendiendo dicho quitosano en alcohol que contiene un porcentaje de agua de 0% hasta un máximo de aproximadamente 30%, agitando con calentamiento durante un periodo de tiempo para obtener el quitosano activado o un precursor del quitosano, y después haciendo reaccionar dicho quitosano activado o dicho precursor activado con un reactivo capaz de formar complejos por medio de fuerzas físicas o fuerzas químicas para preparar un derivado.

Description

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DESCRIPCION

Conservantes a partir de derivados de quitina Campo tecnico

La invencion se refiere a composiciones, a procedimientos para la produccion de composiciones de quitosano que actuan como controladores de la respiracion, antimicrobianos, microbiostaticos, eliminadores eficaces de microbios y antioxidantes para mantener la frescura de frutas, verduras, flores cortadas, carne, pescado y otros productos alimentarios procesados, y a procedimientos/procesos para aplicarlas y a aplicadores para estas.

Antecedentes de la invencion

En el pasado, el quitosano se ha empleado como conservante tras la recoleccion de frutas y verduras frescas. El quitosano empleado se afsla a partir de cascaras de gambas, cascaras de cangrejos, cascaras de dafnias (pulgas de agua), calamares o cualquier otro recubrimiento de crustaceo, hongo e insecto, y se trata para obtener un grado variable de acetilacion y se disuelve en acido acetico al 1-2%.

El quitosano se ha empleado para mejorar la caducidad de diversas frutas y verduras, tales como cftricos [Magnetic Resonance Imaging, 22 (2004), 27-37], zanahorias [Food Control, 17 (2006), 336-41], lechuga y fresas [Food Microbiology, 21(2004), 703-714], y lichis [Postharvest Biology and Technology, 38 (2005), 128-36], en donde el quitosano empleado tiene un tamano mayor que kD (kilodaltons) y esta 93% desacetilado. La propiedad antioxidante del quitosano se ha estudiado en el salmon [Food Chem., 101 (2007), 308-311], en donde se ha empleado quitosano con tres pesos moleculares diferentes. Una disolucion (al 1%) de quitosano 30 kD mostro unos resultados equivalentes al antioxidante qmmico BHT, y estos resultados fueron mejores empleando quitosano de peso molecular 90 kD y 120 kD. Se ha indicado una actividad de conservacion util del quitosano obtenido de cascaras de gambas en diversos alimentos, tales como huevo, carne, salchichas, marisco, tofu, zumos, mayonesa, kimchi, fideos, torta de arroz, germinado de soja, gelatina de almidon, etc. En el caso de la leche, se ha descrito la conservacion con quitosano con un peso molecular que vana de 0,2-30 kD [Korean J. Food Sci. Tech., 32 (2000), 806-813]. En el caso del pan, se ha empleado con exito el quitosano con tres pesos moleculares diferentes, 2 kD [J. Chitin Chitosan, 7 (2002), 214-218], 120 kD [Korean J. Food Nutrition, 11 (2003), 309-315] y 493 kD [J. Chitin Chitosan, 7 (2002), 208-213] para extender su caducidad, mantener el peso y retrasar la degradacion del almidon. Se ha indicado la actividad antimicrobiana del quitosano contra diversas bacterias, levaduras y mohos, tales como Aeromonas, Bacillus, Bifidobacterium, Brochothrix, Clostridium, Enterococcus, Escerechia, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Micrococcus, Pediococcus, Photobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Vibrio, Candida, Cryptococcus, Saccharomyces, Schizosaccaromyces, Zygosaccharomyces, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Penicillium, Rhizopus, etc. y esta ha sido publicada [J. Food Sci., 72 (2007), R87-R100]. Excepto por los pocos ejemplos mencionados espedficamente, todos los procedimientos de la tecnica anterior han empleado quitosano de alto peso molecular obtenido a partir de cascaras de gamba con pesos moleculares y grados de desacetilacion variables y no definidos.

La patente de EE. UU. n.° 5.374.627 describe un procedimiento para controlar enfermedades de plantas y danos provocados por ciertas plagas en plantas agncolas con composiciones que contienen 1 parte en peso de hidrolizado de quitosano con un peso molecular promedio de 10.000 a 50.000, obtenido mediante la hidrolisis acida o la hidrolisis enzimatica del quitosano.

La solicitud de patente WO 03070008 desvela compuestos antimicrobianos y sus procedimientos de aplicacion, en los que el producto para el uso es un lfquido obtenido empleando acidos organicos de 3-30 atomos de carbono, y el producto reivindicado es util solo para la conservacion de alimentos acidos. En uno de los ejemplos se emplea la enzima quitosanasa para la degradacion del quitosano.

Aunque en la bibliograffa se conocen diversas modificaciones del quitosano que conducen a la solubilizacion del quitosano a un pH de neutro a alcalino, las aplicaciones del quitosano a los alimentos solo emplean disoluciones de quitosano en un acido organico, preferentemente acido acetico. La disolucion obtenida de este modo tiene un pH bajo (2,0-4,0) dependiendo de la concentracion del acido usado. El acido usado en dicha formulacion anade sabor al producto que se va a tratar y/o afecta de modo adverso a su caducidad. En el caso del platano, se sabe que el acido acetico provoca manchas senescentes [coloracion negra de la piel] que no son deseadas. Los acidos empleados en la formulacion del quitosano son responsables de que la leche y los productos lacteos se cuajen. La carga neta positiva desarrollada en la molecula de quitosano debido al pH bajo es responsable de la separacion de los componentes anionicos del producto que se va a tratar [tales como las sales inorganicas, los acidos grasos], que se adsorben sobre el quitosano cargado positivamente. Todas estas reacciones son indeseables y pueden evitarse fabricando la formulacion tal como se describe en la presente invencion.

Una clase de quitosano hidrosoluble que se describe en la bibliograffa esta formado por complejos de quitosano con los respectivos acidos organicos que generalmente se describen como acetato de quitosano, lactato de

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quitosano, etc. Son polvos secos del complejo de quitosano-acido, que se obtienen simplemente mezclando, seguido de la retirada del acido sin reaccionar y un secado. Estos complejos tienen una baja definicion qmmica, son bastante inestables y siguen presentando los problemas asociados con un pH bajo, como los de las disoluciones de quitosano.

Se sabe que los productos de la degradacion parcial de quito-oligosacaridos similares al quitosano son hidrosolubles. Sin embargo, estas moleculas tienen un grado variable de actividades biologicas, tales como control de la respiracion, microbiostasis, caractensticas de revestimiento, etc. En general son muy debiles a los niveles deseados de actividades, comparado con los productos desarrollados empleando el procedimiento o procedimientos reivindicados en la presente invencion.

Sumario de la invencion

La invencion comprende un procedimiento para producir un derivado de quitosano, y un producto preparado con este, mediante la activacion de quitosano suspendiendo dicho quitosano en alcohol que contiene agua del 0% hasta un maximo de aproximadamente 30%, agitando con calentamiento durante un periodo de tiempo para obtener el quitosano activado, y despues haciendo reaccionar dicho quitosano activado con un reactivo capaz de formar complejos por medio de fuerzas ffsicas o fuerzas qmmicas para preparar un derivado. Los derivados del quitosano desvelados por la presente invencion y el procedimiento para su preparacion producen derivados que tienen una gama de propiedades que comprenden, sin limitacion, una propiedad antimicrobiana, o microbiostatica, o antitranspirante, o antifungica, o de conservacion de la fruta, o sus combinaciones. Dichas fuerzas ffsicas incluyen la adsorcion, y dichas fuerzas qmmicas incluyen un enlace covalente.

Se ilustran aproximadamente 8 realizaciones del procedimiento y los productos resultantes y se describen como una segunda y cuarta a decima composicion, y los procedimientos para fabricarlas. Los productos de la presente invencion pueden derivatizarse aun mas para modificar o anadir propiedades a cada uno para cubrir un ambito de aplicacion mas amplio o diferente.

La adicion de quitosano a alcohol, la adicion de agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol para preparar una mezcla y la adicion posterior de acido lactico o cualquier otro acido inorganico o cualquier otro acido organico a dicha mezcla, la agitacion a una temperatura de aproximadamente menor que 30 °C, mas preferentemente a aproximadamente 25 °C, conduce a la formacion de una primera composicion en suspension, que es un derivado de acido que puede utilizarse tal cual o despues de secarse o puede derivatizarse aun mas.

La adicion de quitosano a alcohol, la adicion de agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol para preparar una mezcla y el calentamiento de dicha mezcla hasta aproximadamente 70 °C, la adicion de antudrido succmico a esta mezcla, la agitacion y el mantenimiento de la temperatura a aproximadamente 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, conduce a la formacion de una segunda composicion en suspension.

La preparacion de la primera composicion y la succinilacion de esta proporcionan la tercera composicion. Asf, la adicion de quitosano a alcohol, la adicion de agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol para preparar una mezcla y la adicion de acido lactico o cualquier otro acido inorganico o cualquier otro acido organico a dicha mezcla a una proporcion de aproximadamente una quinta o una decima parte del peso de la materia prima empleada y la agitacion durante 2 horas o durante un periodo de tiempo suficiente para mantener una temperatura de reaccion menor que 30 °C, mas preferentemente a aproximadamente 25 °C, para obtener un derivado de acido lactico u otro derivado de acido en suspension el aislamiento del derivado de acido lactico/otro acido, el sometimiento del derivado aislado, despues de una filtracion, a una reaccion posterior mediante su suspension en una mezcla de agua:alcohol, preferentemente una mezcla 20:80, la adicion de antudrido succmico en una cantidad en peso de hasta una decima parte del peso seco de dicho derivado de acido lactico/otro acido produce una tercera composicion en suspension que puede aislarse.

La preparacion de la segunda composicion y la preparacion de su derivado de acido con un acido, preferentemente con acido lactico, proporciona la cuarta composicion de la presente invencion. Asf, la adicion de quitosano a alcohol, la adicion de agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol para preparar una mezcla y el calentamiento de dicha mezcla hasta aproximadamente 70 °C, la adicion de antudrido succmico a una proporcion de aproximadamente 10% en peso seco de la materia prima a esta mezcla, la agitacion durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para mantener la reaccion a una temperatura de aproximadamente 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, para obtener un derivado succmico en suspension, el permitir que la suspension se enfne hasta por debajo de 30 °C, el sometimiento de dicho derivado succmico a otra reaccion con acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% al 20% del peso seco del derivado succmico, la agitacion de la mezcla durante aproximadamente 1 hora, la filtracion y el secado de los solidos conduce a la formacion de una cuarta composicion en suspension que puede aislarse.

La preparacion de la segunda composicion, su desacetilacion con la enzima xilano acil transferasa o cualquier otra

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enzima acetilante durante un periodo de tiempo, preferentemente de aproximadamente 6 a 7 horas, seguido de una quitinolisis mediante una enzima quitinolttica o, preferentemente, una enzima proteolftica ademas de quitinolttica que ademas preferentemente sea termoestable y mas preferentemente producida por Aspergillus niger MTCC 5572 (depositado en The Microbial Type Culture Collection (MTCC), Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India) durante un periodo de tiempo preferentemente durante aproximadamente una hora, proporciona la quinta composicion de la presente invencion en suspension que puede recuperarse. Asf, la suspension de quitosano en una mezcla de agua:alcohol 20:80, el mezclado a fondo de la suspension mediante agitacion preferentemente a 100 rpm durante un periodo suficiente para obtener una buena activacion, preferentemente durante 30 minutos, el calentamiento y el mantenimiento de dicha mezcla a aproximadamente 70°C, la adicion de anhfdrido succmico a esta mezcla, la agitacion durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para mantener la reaccion a una temperatura de aproximadamente 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, el permitir que la suspension se enfne hasta obtener un derivado succmico, el sometimiento de dicho derivado succmico a otra reaccion con acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% en peso del peso seco del derivado succmico, la adicion, por cada 5 gramos de peso seco del derivado succmico empleado, de aproximadamente 4000 U.I. de una enzima para la desacetilacion, la agitacion de la mezcla durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 7 horas, y la adicion posterior de una enzima quitinolttica, preferentemente a aproximadamente 500 U.I. por 5 g de peso seco del derivado succmico, la reanudacion de la agitacion durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 1 hora, y el permitir que la suspension se enfne proporciona una quinta composicion en suspension, que puede recuperarse y emplearse.

La reaccion de la quinta composicion en alcohol con un azucar y despues con formaldehudo proporciona la sexta composicion de la presente invencion. Asf, la adicion de quitosano a alcohol, la adicion de agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol para preparar una mezcla, el calentamiento y el mantenimiento de dicha mezcla a aproximadamente 70°C, la adicion de anhfdrido succmico a esta mezcla, la agitacion durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para mantener la reaccion a una temperatura de aproximadamente 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, el permitir que la suspension se enfne hasta obtener un derivado succmico, el sometimiento de dicho derivado succmico a otra reaccion con acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% en peso del peso seco del derivado succmico, la adicion, por cada 5 gramos de peso seco del derivado succmico empleado, de aproximadamente 4000 U.I. de una enzima para la desacetilacion, la agitacion de la mezcla durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 7 horas, y la adicion posterior de una enzima quitinolttica, preferentemente a aproximadamente 500 U.I. por 5 g de peso seco del derivado succmico, la reanudacion de la agitacion durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 1 hora, el permitir que la suspension se enfne para proporcionar una quinta composicion en suspension, la suspension del polvo seco de dicha quinta composicion en alcohol puro, la mezcla a fondo de la suspension mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min, el calentamiento y el mantenimiento de la temperatura a lo largo del procedimiento a 60 °C, la adicion de un azucar disuelto en agua en aproximadamente 10% en volumen al volumen del alcohol, la agitacion de la mezcla durante aproximadamente 15 minutos o a lo largo de un periodo de tiempo necesario para el mezclado, la adicion de formaldehudo gota a gota a lo largo de aproximadamente 30 minutos o a lo largo de un periodo de tiempo necesario para la adicion gradual con agitacion constante, el mantenimiento de la temperatura a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 1 a 6 horas o durante el periodo necesario hasta que la reaccion se complete, el permitir despues que la mezcla de reaccion se enfne hasta la temperatura ambiente, la recuperacion del producto, el lavado de los solidos con metanol acuoso u otro alcohol polar acuoso, proporciona la sexta composicion en suspension que pueden recuperarse, lavarse con 100 ml de metanol al 90% y secarse al aire.

La suspension del quitosano en alcohol preferentemente en 20 volumenes, el mezclado a fondo con agitacion para lograr la activacion del quitosano, preferentemente a 100 rpm durante 30 min, el calentamiento de dicha mezcla hasta aproximadamente 60 °C, la adicion de acido fosforoso (H3PO3) disuelto en agua y la adicion gota a gota de esta mezcla con agitacion, la adicion de formaldehudo a un peso aproximadamente igual al peso seco del quitosano activado, o su derivado, gota a gota, el mantenimiento de la temperatura entre aproximadamente 60-65 °C, preferentemente a 63 °C, durante un periodo de tiempo de preferentemente 2-6 horas despues de completar la adicion, y el permitir que la suspension se enfne proporciona la septima composicion en suspension, que puede recuperarse. Dicha septima composicion puede ser soluble en un amplio intervalo de pH 7 a 10 y produce disoluciones de ligeramente turbias a transparentes.

La suspension del quitosano en alcohol preferentemente en 20 volumenes, el mezclado a fondo con agitacion para lograr la activacion del quitosano, preferentemente a 100 rpm durante 30 min, el calentamiento de la mezcla hasta aproximadamente 60 °C, la adicion de 750 ml de formaldehudo a lo largo de un periodo de unos pocos minutos, la adicion de aproximadamente 10% de un acido inorganico o acido fosforoso (H3PO3) disuelto en agua y la adicion gota a gota de esta mezcla con agitacion durante aproximadamente una hora o a lo largo de un periodo de tiempo necesario para que la mezcla sea eficaz, el mantenimiento de la temperatura entre aproximadamente 60-65 °C, preferentemente a 63 °C durante aproximadamente seis horas o durante un periodo de tiempo necesario para que la reaccion se complete, y el permitir que la suspension se enfne despues de completar la adicion proporciona la octava composicion en suspension, que puede recuperarse.

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La suspension del quitosano en alcohol preferentemente en 20 volumenes, el mezclado a fondo con agitacion para lograr la activacion del quitosano, preferentemente a 100 rpm durante 30 min, el calentamiento de la mezcla hasta 60 °C, la adicion de formaldetudo a lo largo de un periodo de unos pocos minutos, la adicion de aproximadamente 10% de un acido inorganico o acido fosforoso (H3PO3) disuelto en agua y la adicion gota a gota de esta mezcla con agitacion durante aproximadamente una hora o a lo largo de un periodo de tiempo necesario para que la mezcla sea eficaz, el mantenimiento de la temperatura entre aproximadamente 60-65 °C, y preferentemente a 63 °C durante aproximadamente seis horas o durante un periodo de tiempo necesario para que la reaccion se complete despues de completar la adicion, el permitir que la suspension se enfne, la recuperacion de la suspension como un polvo seco, la resuspension en 20 volumenes de metanol al 90% y 2 volumenes de HCl concentrado o cualquier otro acido organico o inorganico, la agitacion de la mezcla a temperatura ambiente durante una hora o durante un periodo de tiempo necesario para obtener una buena mezcla, la filtracion, y el lavado con 20 volumenes de metanol al 90% proporciona la novena composicion que puede recuperarse.

El mezclado de la quinta composicion en suspension con una molecula cargada en disolucion y la coprecipitacion de la misma, preferentemente en pH alcalino, proporciona la decima composicion de la presente invencion. Asf, la adicion de quitosano a alcohol, la adicion de agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol para preparar una mezcla, el calentamiento y el mantenimiento de dicha mezcla a aproximadamente 70°C, la adicion de antudrido succmico a esta mezcla, la agitacion durante 1 hora o durante un periodo de tiempo necesario para un mezclado a fondo, el mantenimiento de la temperatura entre 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para la reaccion, el permitir que la suspension se enfne hasta obtener un derivado succmico, la adicion de acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% del peso seco del derivado succmico, la adicion, por cada 5 gramos de peso seco del derivado succmico empleado, de aproximadamente 4000 U.I. de una enzima para la desacetilacion, la agitacion de la mezcla durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 7 horas, la adicion posterior de una enzima quitinolftica a 500 U.I. por 5 g de peso seco del derivado succmico empleado, y la reanudacion de la agitacion durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 1 hora, el permitir que la suspension se enfne para proporcionar una quinta composicion solida, la recuperacion y el secado al aire de la quinta composicion, la disolucion de la quinta composicion para obtener una disolucion al 1% en agua, la adicion de una disolucion acuosa de sulfato de cobre u otra molecula cargada capaz de adsorberse sobre la quinta composicion en un pH alcalino, en forma de una disolucion, la adicion de dicha disolucion de sulfato de cobre o la molecula cargada que puede estar al 1% con respecto al agua en una pequena cantidad, a aproximadamente 1% del volumen de agua empleada para disolver la quinta composicion y el mezclado durante unos pocos minutos, y la adicion de amoniaco ftquido para precipitar el quitosano con el sulfato de cobre unido, u otra partmula cargada unida, proporciona un derivado de la decima composicion.

La presente invencion tambien comprende una composicion que comprende al menos una de las composiciones de la segunda y cuarta a decima composicion, y sus derivados, que se emplea como ingrediente fundamental. Las composiciones pueden prepararse en un acido organico diluido, habitualmente acido acetico, o en agua. Dicha composicion puede ser una composicion para la conservacion de frutas, verduras, alimentos y piensos ingeribles, para retrasar la maduracion, para retrasar el envejecimiento y para retrasar la senescencia de productos naturales, que incluyen frutas, verduras y flores, o puede actuar como un vehmulo para el transporte de una molecula activa o un grupo funcional a su sitio de accion. Dicha composicion puede tener una concentracion eficaz de aproximadamente 0,1%, y dicho acido acetico puede estar aproximadamente al 2% cuando se emplea.

La enzima quitinolftica empleada en la presente invencion puede ser una enzima proteolftica ademas de quitinolftica. La realizacion ilustrada de esta enzima tiene un peso molecular de 50 kilodaltons en una electroforesis de tipo SDS-PAGE, una actividad quitinolftica optima a pH 2 y una actividad quitinolftica optima a una temperatura de 80 °C. En una realizacion de la presente invencion, se ha identificado a Aspergillus niger como fuente de este tipo de enzima, aunque tambien pueden estar presentes otras fuentes y estas se incluyen dentro del ambito de la presente invencion. Se ha identificado a Aspergillus niger MTCC 5572 como el organismo capaz de producir esta enzima en una buena cantidad. Tambien es posible que los mutantes derivados de esta cepa posean tambien una capacidad para producir la proteo-quitinasa util para producir los productos de la presente invencion. La enzima se precipito a partir de un filtrado de cultivo bruto mediante su saturacion con sulfato de amonio y su fraccionamiento en Sephadex®, recuperandose la enzima proteo-quitinasa bruta mediante precipitacion con sulfato de amonio.

La presente invencion tambien comprende un procedimiento para mejorar la caducidad de frutas, carne, pescado, flores, verduras, que comprende un tratamiento de aplicacion mediante inmersion, pulverizacion, nebulizacion u otro procedimiento de aplicacion externa, asf como la adicion a un producto alimentario, de una composicion que comprende una o mas de la segunda y cuarta composicion a la decima composicion. Dicho procedimiento tambien puede ser un procedimiento para retrasar la maduracion y/o la descomposicion microbiana, que puede aplicarse a productos naturales que pueden incluir, sin limitacion, platanos, mangos, manzanas, fresas, naranjas, limas y similares, y las aplicaciones pueden incluir una aplicacion externa mediante revestimiento o una "aplicacion interna" para detener los procesos en las frutas o para detener los procesos en productos naturales.

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La enzima desacetilante, la xilano acil transferasa, de la presente invencion se aislo de Bacillus sp. MTCC 5571. Sin embargo, cualquier otra enzima desacetilante de cualquier otro microbio puede producir los mismos resultados.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona nuevas composiciones de quitosano para tratamientos como antirrespiratorio, antimicrobiano y antioxidante para mantener la frescura de productos naturales, procedimientos para la produccion de dichas nuevas composiciones, nuevos procedimientos/procesos para dicho tratamiento de dichos productos naturales para potenciar o mejorar su caducidad o estabilidad durante el almacenamiento. La presente invencion proporciona ademas una nueva enzima microbiana proteolttica termoestable que tiene una accion quitinasa incluso en presencia de un disolvente organico, y su uso para desarrollar nuevas composiciones de quitosano de la presente invencion. La presente invencion proporciona ademas el uso de una enzima para la desacetilacion del quitosano.

La invencion tambien proporciona procedimientos/procesos para mantener la frescura de productos naturales durante mas tiempo. La invencion proporciona ademas procedimientos/procesos para la aplicacion de dichas composiciones y el equipo util para aplicar dichas composiciones a los productos naturales que comprenden, sin limitacion, frutas, verduras, carne, pescado y otros productos alimentarios. Una lista ilustrativa de productos naturales incluidos en el ambito de la presente invencion incluye productos alimentarios y productos vivos o no vivos naturales no alimentarios que incluyen, sin limitacion, frutas, verduras, carne, pescado, flores cortadas, leche y productos alimentarios en general.

Puesto que el quitosano esta formado por moleculas polidispersas con una amplia diversidad de posibilidades de desacilacion, sustitucion, sitios de hidrolisis, composicion del hidrolizado, etc., las propiedades que determinan sus propiedades antimicrobianas, antimaduracion, conservantes, de solubilidad, su capacidad como molecula vetuculo, etc., seran diferentes segun la composicion final del quitosano tratado. La eficacia y el grado de cambio en la molecula de quitosano obtenidos por un tratamiento concreto tambien dependeran en gran medida del grado en que los sitios vulnerables a un cambio qrnmico o ffsico (adsorcion) se encuentren disponibles, que son distintos segun el tratamiento suministrado para la "activacion" de la molecula de quitosano antes de iniciar cualquier tratamiento para su derivatizacion. Puesto que el efecto de cualquier tratamiento de sustitucion o modificacion dependera de la composicion de grupos funcionales de la materia prima de quitosano, por ejemplo, una hidrolisis enzimatica del quitosano no tratado y activado producira una composicion diferente de hidrolizado enzimatico que una hidrolisis realizada sobre una molecula de quitosano que ya esta modificada mediante una sustitucion y del grado en que esta modificada por una sustitucion, puesto que las enzimas son vulnerables a cambios en el entorno de sus sitios activos. Las propiedades de un quitosano sustituido con respecto a las propiedades antimicrobianas, conservantes, propiedades que afectan a procesos fisiologicos, etc., dependen del tratamiento que se le haya dado, de la distribucion del peso molecular del producto, de la combinacion de grupos funcionales que porta y del grado de sustitucion global, lo cual abre innumerables posibilidades de propiedades de los productos y de los propios productos, que pocas veces pueden predecirse a menos que se descubran de modo experimental. El trabajo de lograr el objetivo de mejorar mediante una experimentacion constante es desalentador, puesto que las permutaciones y las combinaciones que deben determinarse son infinitas, y quizas esta es la razon por la cual el alcance completo de esta explicacion aun no ha sido cubierto.

Aunque es habitual activar el quitosano mediante su tratamiento con un acido, en la presente invencion se descubrio, de modo sorprendente, que el quitosano se activa con el fin de obtener un derivado simplemente calentando una suspension de este en alcohol que contiene agua del 0% hasta un maximo de aproximadamente 30%, agua segun sea necesaria, y una agitacion durante un periodo de tiempo para obtener el quitosano activado, y despues hacer reaccionar dicho quitosano activado con un reactivo capaz formar complejos por medio de fuerzas ffsicas o fuerzas qmmicas para preparar un derivado. Una composicion de quitosano preparada de esta manera, mediante un posterior tratamiento y derivatizacion, ofrece una serie de vehfculos que pueden unirse por medio de enlaces ffsicos o qmmicos con grupos funcionales/moleculas activas para mejorar su eficacia.

Los derivados de quitosano, cuando estan completamente sustituidos, no muestran actividad antimicrobiana. El quitosano de peso molecular grande tiene una baja solubilidad. El quitosano de bajo peso molecular no sustituido muestra propiedades antimicrobianas y solubilidad. Por tanto, en general se cree que el quitosano de bajo peso molecular es mas util como conservante. Sin embargo, las composiciones de quitosano de bajo peso molecular no tienen una buena propiedad de revestimiento cuando se aplican a frutas frescas y objetos similares para una accion conservante. Un descubrimiento sorprendente de la presente invencion es que incluso el quitosano de alto peso molecular, cuando se derivatiza tal como se describe en la presente invencion, es un conservante eficaz y, ademas de propiedades antimicrobianas, tambien protege a las frutas del etileno y la perdida de agua debido a su mejor propiedad de revestimiento. Sin pretender quedar limitado por teona alguna, la actual interpretacion de la presente invencion es que las deseadas propiedades antimicrobianas, conservantes y que afectan a procesos fisiologicos son optimas solo en cierto intervalo de distribucion de peso molecular, combinado con un perfil de solubilidad y los grupos funcionales o las moleculas activas portados por los derivados del quitosano. Los procedimientos/procesos

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de produccion de derivados de quitina de la presente invencion estan dirigidos a lograr este equilibrio estrecho e intrincado.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, si no se mencionado por separado, a menos que el contexto no lo permita, en cualquier contexto de un tratamiento de derivatizacion, el quitosano es un producto que esta del 50 al 70% desacetilado y es de malla 60-100, aunque tambien pueden emplearse otros grados de desacetilacion y/o de tamano de malla dentro de unos lfmites razonables para obtener los mismos resultados. El quitosano siempre se activa antes de aplicar dicho tratamiento suspendiendo dicho quitosano en alcohol absoluto o con agua anadida que puede estar hasta aproximadamente 30% o menos, agitando durante un periodo tiempo para obtener el quitosano activado, y despues haciendo reaccionar dicho quitosano activado con un reactivo capaz de formar un derivado mediante la formacion de complejos por medio de fuerzas ffsicas o fuerzas qmmicas para preparar un derivado. Por tanto, el procedimiento/proceso de activacion de la presente invencion nunca se ha empleado en la tecnica anterior, y abre una plataforma completamente nueva para cualquier derivado de quitosano, que incluye derivados de acidos, derivados de succinilo, asf como hidrolizados enzimaticos procedentes de un quitosano activado mediante el procedimiento/proceso de la presente invencion.

Cuando se menciona el termino "alcohol" en la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto no lo permita, el alcohol preferido es un alcohol polar en el que el quitosano, o sus derivados, preparados en el transcurso del procedimiento de la presente invencion, son insolubles. El alcohol mas preferido es el metanol, aunque, dentro de las anteriores limitaciones, tambien pueden emplearse otros alcoholes.

Cuando se emplea el acido lactico, aunque es el acido mas preferido para ser empleado en estas reacciones, tambien puede emplearse cualquier otro acido, tanto inorganico como organico, aunque el acido organico es mas preferido y el acido lactico es el mas preferido.

La solubilidad de las composiciones en la presente memoria descriptiva se comprobo anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agito de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprobo visualmente. En una de las realizaciones, que produce la primera composicion de la presente invencion, el quitosano se disuelve en acido y la disolucion resultante muestra actividad antimicrobiana. La cantidad de acido empleada en relacion con el quitosano, asf como la eleccion del acido, resultan fundamentales para exhibir actividad. El acido util para este objetivo puede ser cualquier acido organico, aunque es preferible el acido lactico. De modo similar, en lugar del acido lactico, una opcion menos preferida podna ser cualquier acido inorganico. Sin pretender quedar limitado por teona alguna, la actuacion particularmente buena del acido lactico en estos procedimientos quiza pueda ser debida a la solubilidad limitada del quitosano en acido lactico a menos de una parte de acido lactico por cada parte de quitosano, que produce un fluido que presenta algo de viscosidad y que no es una disolucion totalmente acuosa, lo cual otorga al derivado una mezcla optima de carga sobre la partmula y el grupo funcional de modo que se logra una solubilidad suficiente sin perder sus propiedades antimicrobianas. Se descubrio, de modo sorprendente, que bajo las condiciones de reaccion de la presente invencion, en las que el quitosano se disuelve en acido a aproximadamente 10% en peso de quitosano, no se produjo solubilidad del derivado de acido (la primera composicion) en agua, y cuando se aumenta la proporcion de acido lactico, la primera composicion sf es soluble en agua, pero se forman muchos aglomerados que hacen que el producto sea diffcil de utilizar y, ademas, no tenga actividad antimicrobiana. Tambien resulto sorprendente descubrir que, por el contrario, empleando una proporcion de acido lactico menor que 10% en peso de quitosano se obtiene un producto hidrosoluble que tiene actividad antimicrobiana. Puesto que el acido lactico por debajo de 0,5 ml produce la disolucion completa sin la formacion de aglomerados durante la reaccion, esto se convirtio en la realizacion preferida que se empleo en los posteriores trabajos. Unos principios similares se aplican a otros acidos, y la cantidad real del acido empleada dependera de las propiedades del acido.

En otra realizacion de la presente invencion, que representa la segunda composicion, el quitosano activado se trata con anhudrido succmico para obtener un derivado succmico. El anhudrido succmico se anade en diferentes proporciones manteniendo la temperatura a aproximadamente 60-70 °C, preferentemente a 65 °C. Cuando la mezcla de alcohol y agua utilizada para la activacion tiene una proporcion de 20:80, el derivado succmico resultante es soluble en agua solo cuando mas de 0,5 g de anhudrido succmico se anade a 5 g de quitosano en dicha reaccion. Sin embargo, de forma sorprendente se descubrio que cambiando la proporcion de los disolventes empleados a 10 ml de agua por cada 90 ml de metanol, es posible obtener un producto hidrosoluble empleando el anhudrido succmico a una cantidad menor que 0,5 g hasta 0,05 g. Para objetivos practicos, se descubrio que una cantidad 0,1 g resulta preferible. Esta observacion tambien apoya el descubrimiento de que el tratamiento de activacion es crucial para determinar las propiedades de los productos, y el nuevo procedimiento/proceso de activacion de la presente invencion hara que todos los productos tengan propiedades diferentes de los productos de la tecnica anterior con el mismo reactivo, si la activacion del quitosano se produce mediante un procedimiento/proceso sustancialmente diferente.

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Otra realizacion de la presente invencion comprende la tercera composicion, en la que, en la primera etapa, se prepara la primera composicion empleando un acido, preferentemente acido lactico a una proporcion del 10 al 20% del peso seco del quitosano activado, y dicha primera composicion se toma como material de partida y se hace reaccionar con antudrido succmico anadido a una proporcion de aproximadamente 10% del peso seco de la primera composicion empleada. Esta composicion en un material de grano grueso que es soluble en agua.

Otra realizacion de la presente invencion comprende la cuarta composicion, en la que se prepara un derivado succmico del quitosano activado de la segunda composicion empleando antudrido succmico a aproximadamente 10% del peso seco del quitosano activado y, despues de finalizar la reaccion, se anade un acido, preferentemente acido lactico del 10 al 20% del peso seco del quitosano. No se forman aglomerados. El polvo seco es completamente soluble en agua a los 5 min bajo las condiciones de ensayo descritas.

En otra realizacion de la presente invencion, se ha descubierto que una clase de enzimas electroforeticamente homogeneas aisladas a partir de microorganismos tienen actividad proteolttica, asf como actividad quitinasa, las cuales pueden denominarse proteo-quitinasas. En una realizacion de la presente invencion, se emplean dichas proteo-quitinasas y enzimas capaces de una desacetilacion del quitosano para hidrolizar el quitosano, en un procedimiento para fabricar los productos de la presente invencion. Aunque las proteo-quitinasas y desacetilasas de la presente invencion se afslan de microbios, esta clase de enzimas, obtenidas de cualquier fuente, realizaran la misma funcion de hidrolisis del quitosano, y la presente invencion extiende su uso tambien para el objetivo de la hidrolisis del quitosano y tambien para desarrollar los productos de la presente invencion.

Se recogen muestras de suelo en Pune, India, y en territorios adyacentes, de diversos recursos naturales ricos en materia organica y se enriquecieron con el sustrato deseado, que incluye casema, quitosano, salvado de trigo lavado, celulosa. El enriquecimiento continuo durante 3 semanas, y las muestras se extendieron en estnas sobre un medio solido que contema el sustrato empleado para el enriquecimiento como unica fuente de carbono. Las colonias aisladas mostraron, en general, una zona aclarada, lo cual indica una fuerte produccion de la respectiva enzima degradativa.

Se aislaron aproximadamente 700 cultivos de diversas bacterias y hongos. Para descubrir los cultivos que tienen la actividad deseada, estos se cultivaron mediante el procedimiento de matraces de agitacion. El filtrado del cultivo microbiano bruto se concentro mediante una precipitacion con sulfato de amonio. Las fracciones de las protemas se separaron mediante una electroforesis en SDS-PAGE desnaturalizante. Las fracciones de las protemas se separaron sobre estos geles como bandas independientes homogeneas. Se selecciono un cultivo de Aspergillus niger MTCC 5572 como cultivo prometedor.

La banda electroforeticamente homogenea aislada del filtrado del cultivo de Aspergillus niger MTCC (depositado en The Microbial Type Culture Collection (MTCC), Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India) que demostro actividad proteinasa, asf como quitinasa, es una nueva enzima (una proteo-quitinasa) con un peso molecular de 50 kD, segun se determina por medio de marcadores de peso molecular en una SDS-PAGE, y tiene una actividad enzimatica optima a pH 2 y 80 °C. Aunque esta banda se empleo para hidrolizar enzimaticamente la segunda composicion desacilada de quitosano para desarrollar el producto de la presente invencion, cualquier otra proteo- quitinasa puede producir un hidrolizado con unas propiedades muy similares.

En otra realizacion de la presente invencion se obtiene un hidrolizado de quitosano empleando enzimas purificadas o una forma bruta de enzimas o una forma activa de un extracto de celulas microbianas. Dicho hidrolizado muestra una actividad antimicrobiana mejorada hasta un cierto lfmite de disminucion en el peso molecular promedio y dentro de un intervalo espedfico de grado de sustitucion del grupo amino libre por acetilo o por cualquier otro grupo anionico. En otra realizacion de la presente invencion, los derivados enzimaticamente hidrolizados del quitosano muestran una actividad antimicrobiana mejor que el producto obtenido solo por medios qmmicos. El hidrolizado que se modifica aun mas, concretamente se desacetila, empleando la xilano acil transferasa, muestra una propiedad antimicrobiana antioxidante aun mejor y actua tambien como agente antirrespiracion. Los hidrolizados obtenidos por medios qmmicos que tienen un peso molecular en el intervalo inferior de 8-100 kD son mas eficaces que los hidrolizados de mayor y/o menor peso molecular. Sin embargo, de modo sorprendente, despues de la desacetilacion enzimatica, los derivados de peso molecular aun mayor muestran una actividad antimicrobiana equivalente a la de los productos de 8-100 kD obtenidos por medio de un procedimiento qmmico. El procedimiento/proceso preferido de obtener las xilano acil transferasa en la presente invencion es a partir de microorganismos. Puede preverse que estas enzimas, aisladas como un extracto bruto o purificado a partir de cualquier otra fuente, tendran las mismas propiedades desacilantes y produciran los mismos productos que los preparados en las realizaciones preferidas de la presente invencion a partir de microorganismos. Esta realizacion de la invencion que comprende hidrolizados enzimaticos comprende la quinta composicion que es util como conservante tras la cosecha. Dicha quinta composicion se prepara preparando, en primer lugar, un derivado succmico de la segunda composicion al cual se le anade antudrido succmico, el derivado se desacila por la enzima en presencia de un acido, preferentemente acido lactico, anadido a aproximadamente 10% en peso seco de la segunda composicion succinilada durante un periodo de tiempo para lograr una desacetilacion limitada,

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preferentemente durante un periodo de 7 horas, y despues se somete durante aproximadamente una hora a un tratamiento con la enzima quitinolttica. El polvo de la quinta composicion es soluble en agua cuando se anaden mas de 0,5 g de antudrido succmico a 5 g de quitosano en dicha reaccion, y muestra actividad antimicrobiana. La quinta composicion muestra de tres a cuatro veces menos consumo por per kg de platano y tomate que la disolucion de quitosano en acido acetico, muestra una mayor actividad antimicrobiana, asf como microbiostatica, comparado con una disolucion de quitosano en acido acetico y la primera, segunda y cuarta composicion. La quinta composicion tambien es util para mejorar la caducidad de frutas. Platanos verdes recien recolectados (<30 h de la recoleccion) pueden tratarse utilizando una disolucion al 0,1% de la quinta composicion. El tratamiento tambien puede administrarse sumergiendo los platanos en dicha disolucion durante nominalmente 10-15 s, o mediante pulverizacion directa de la disolucion sobre los platanos con un dispositivo adecuado para que la superficie de los platanos se humedezca, o haciendo pasar los platanos a traves de una camara cerrada que esta saturada con una nebulizacion de dicha disolucion (nebulizacion indirecta). Los platanos tratados se secan al aire. Estos platanos se almacenan a temperatura ambiente (20-32 °C) y una humedad relativa del 40-60%. En los experimentos, los platanos tratados mantuvieron el color verde y el peso, mientras que los platanos sin tratar perdieron peso y desarrollaron decoloracion. Los platanos tratados mostraron una mejor condicion fisiologica, ensayados por medios qmmicos, mediante la determinacion de su contenido en solidos totales (contenidos BRIX), azucares reductores y perdida de peso al menos hasta 12 dfas despues de la inmersion (vease la figura 1). Otra realizacion de la invencion consiste en que, despues del almacenamiento durante 8-15 dfas, cuando se maduran mediante la aplicacion de etileno, los platanos tratados maduran con normalidad, mientras que los platanos control no tratados se pusieron duros y no maduraron o se volvieron negros y blandos y no fueron adecuados para el consumo humano.

Se trataron tomates enteros y manzanas cortadas con el producto del ejemplo 10, exactamente como se describe en el ejemplo 14 para los platanos. Los tomates tratados mantuvieron su peso, textura y frescura durante 30 dfas frente a los tomates control sin tratar, que se arrugaron en 12-15 dfas, dando como resultado una perdida de peso. Los cambios fisiologicos en los tomates tratados y control se controlaron en el 7° dfa de almacenamiento empleando una tecnica de escaneado de MRI. La piel pulposa de los tomates tratados era mas uniforme en su densidad de color. La piel pulposa de los tomates no tratados mostraba manchas oscuras que son indicativas de un secado no uniforme y mayor. El escaneado de MRI de los tomates representativos se incluye en la figura 2.

La quinta composicion tambien es eficaz para la "aplicacion interna", es decir, para la aplicacion para la conservacion y para mejorar la caducidad o para un tratamiento antimicrobiano o un tratamiento microbiostatico a las partes "internas" de las frutas o productos naturales, tales como fruta cortada, fruta procesada, productos de verduras procesadas y similares. Los trozos de manzanas cortadas se envasaron en una bolsa de politeno o un recipiente de plastico transparente y se almacenaron en la nevera a una temperatura de 4-9 °C. Las manzanas cortadas del control comenzaron a tomar un color marron desde el dfa 2 y se volvieron blandas para el dfa 3, mientras que las manzanas cortadas tratadas mantuvieron el color, el gusto y la textura dura durante 6 dfas. La fotograffa (figura 3) muestra la diferencia en el aspecto de las manzanas cortadas tratadas y no tratadas en el dfa 4.

Los trozos de manzanas cortadas tratadas y no tratadas se envasaron en un recipiente de plastico transparente y se almacenaron como se describio anteriormente durante hasta 25 dfas. Las manzanas cortadas no tratadas desarrollaron un crecimiento fungico [manchas negras en la fotograffa de la figura 4], mientras que las manzanas cortadas tratadas no desarrollaron crecimiento fungico ni microbiano. Los resultados se muestran en la siguiente fotograffa.

En otra realizacion de la presente invencion, la quinta composicion actua como vehfculo para grupos funcionales o moleculas para mejorar la eficacia a concentraciones mas bajas y/o como vehfculo para su transporte al sitio activo. Se proporcionan ilustraciones de esta realizacion con la sexta y decima composicion.

Manteniendo el mismo principio, son posibles varias realizaciones mas de la quinta composicion como vehfculo variando los grupos funcionales o las moleculas activas que son transportadas por la quinta composicion mediante enlaces ffsicos o enlaces qmmicos.

La sexta composicion comprende un derivado de azucar de succinato de quitosano que muestra una solubilidad variable en agua y tambien muestra una propiedad antimicrobiana variable. El azucar puede ser de cana de azucar o cualquier otro azucar. El procedimiento/proceso de la presente invencion para preparar la sexta composicion comprende fabricar un derivado de azucar de la quinta composicion, que despues se hace reaccionar con formaldetudo durante un periodo de tiempo variable, habitualmente de una a seis horas, para obtener dicha sexta composicion que tiene una hidrosolubilidad excelente y una actividad antimicrobiana que es mejor que la quinta composicion cuando la disolucion de azucar utilizada para la derivatizacion contiene 0,4 g por cada 100 g de peso seco de succinato de quitosano o menos. Una observacion sorprendente fue que si el azucar se emplea a mas de este nivel, el derivado de azucar de succinato de quitosano no es mas hidrosoluble. Esto apoya aun mas la nocion de que los derivados de quitosano, para ser utiles para aplicaciones, deben mostrar un control delicado del grado

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de sustitucion y de los grupos funcionales que se van a emplear para la sustitucion. Todos los productos hidrosolubles de la sexta composicion tienen un grado variable de actividad antimicrobiana a diversas concentraciones, que es constantemente mejor que los grados de actividad antimicrobiana del material de partida, la quinta composicion. Cuando el azucar empleado en el procedimiento/proceso anterior es glucosa o lactosa a una proporcion de 0,4 g por 100 g de succinato de quitosano y el periodo de reaccion con el formaldetndo es de aproximadamente 3 horas, los productos de estas reacciones son solubles en agua y muestran una actividad antimicrobiana del 100% contra E. coli mediante el procedimiento/proceso descrito en el ejemplo 11.

En otra realizacion de la presente invencion, el quitosano incluye los derivados preparados a partir de un acido inorganico. Esto es ejemplificado por la septima composicion, en la que se emplea el acido fosforoso para obtener un derivado, y comprende suspender el quitosano en alcohol (aproximadamente 99%), mezclar la suspension a fondo mediante agitacion a 100 rpm durante 30 minutos, calentar la mezcla y mantener la temperatura a aproximadamente 60 °C, anadir a esta mezcla gota a gota acido fosforoso (H3PO3) disuelto en agua a un volumen que es aproximadamente cuatro veces el peso del quitosano, acompanado de una agitacion durante aproximadamente 1 hora, anadir ademas 5 ml de formaldetndo gota a gota y, despues de completar la adicion, mantener la temperatura entre 60-65 °C y preferentemente a 63 °C durante 2-6 horas. En lugar del formaldetndo puede emplearse cualquier otro aldetndo. Las condiciones de temperatura, agitacion, etc., pueden variar para obtener un producto final con el nivel deseado de actividad antimicrobiana. La solubilidad de las partfculas fluidas se comprueba anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agita de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprueba visualmente. La solubilidad tambien se comprueba a pH 8, 9, y 10, ajustado empleando NaOH diluido, o tampon Tris. Los productos formados empleando quitosano y acido fosforoso en una proporcion de 1:1 y 1:2 mostraron solubilidad en un amplio intervalo de pH (7-10), y formaron disoluciones de ligeramente turbias a transparentes. Mientras que las composiciones antimicrobianas de quitosano, o sus derivados, de la tecnica anterior tienen un pH en el lado acido y precipitan a un pH cercano a 7 o en el intervalo alcalino, la septima composicion es soluble de pH 7 a 10 en el lado alcalino. Estas disoluciones muestran un grado variable de actividad antimicrobiana. Los productos de hasta 0,01% muestran un poco de actividad antimicrobiana, mientras que los productos por encima de esta concentracion muestran una inhibicion microbiana total. Es evidente que la septima composicion, siendo soluble y teniendo tambien una actividad microbiocida total a unas concentraciones razonablemente bajas y a un pH 7 y por encima hasta 10, proporciona nuevos ambitos de uso como conservante y antimicrobiano.

Otra realizacion de la presente invencion comprende la octava y novena composicion. El procedimiento/proceso para su preparacion comprende hacer reaccionar el quitosano suspendido en alcohol mmimo al 99%, mezclar la suspension a fondo mediante agitacion durante un periodo de tiempo suficiente para obtener una humectacion y activacion eficaces con el alcohol, preferentemente a 100 rpm durante 30 minutos, calentar y mantener la temperatura de la mezcla a aproximadamente 60 °C, anadir formaldetndo a una proporcion de aproximadamente 5% del volumen de alcohol empleado, anadir gota a gota una disolucion al 10% de acido fosforoso (H3PO3) en agua, siendo el peso del acido fosforico de aproximadamente 5% del volumen de alcohol empleado, y agitar despues durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 1 hora. La temperatura se mantiene entre 60-65 °C y preferentemente a 63 °C durante 6 horas despues de completar la adicion. Se deja enfriar la suspension y se filtra, los solidos se recuperan y se secan. La solubilidad de las partfculas fluidas se comprueba anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agita de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprueba visualmente. La solubilidad tambien se comprueba a pH 8, 9, y 10, ajustado empleando NaOH diluido, o tampon Tris. El producto se disuelve en agua, pero precipita cuando el pH aumenta hasta 7,0.

La novena composicion se obtuvo sometiendo el producto de la octava composicion a un tratamiento con HCl. Aunque en este caso se ha empleado HCl, este puede ser sustituido por cualquier otro acido organico o inorganico. El polvo seco obtenido en esta reaccion se resuspendio en 20 volumenes de metanol al 90% y 2 volumenes de HCl concentrado para obtener la novena composicion en suspension en la mezcla de reaccion. La mezcla se agito durante una hora a temperatura ambiente. El polvo se retiro mediante filtracion, se lavo con 20 vol de metanol al 90% 3 veces y se seco como se describio anteriormente. El producto resultante es soluble de pH 3 a 12. Esta solubilidad a traves de un intervalo amplio expande aun mas el ambito de aplicacion de este producto. Resulta pertinente indicar en este punto que el tratamiento con acido fosforico resulta fundamental para cebar el producto para la solubilidad a traves de un amplio intervalo de pH. Esto se ha demostrado por el hecho de que otras composiciones, en particular la quinta composicion y la septima composicion, cuando se tratan con HCl tal como se describe en este ejemplo, no alteraron su perfil de pH de solubilidad hasta el intervalo de pH 3 a 12.

La decima composicion es una realizacion mas ilustrativa de la quinta composicion, que actua como vetnculo para una molecula activa. En este caso, la molecula activa es sulfato de cobre y probablemente el mecanismo de formacion de los complejos es mediante adsorcion. El procedimiento/proceso para preparar la decima composicion comprende preparar una disolucion al 1% de la quinta composicion en agua, anadir aproximadamente 10% de su

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volumen a una disolucion (al 1%) de sulfato de cobre, mezclar las dos disoluciones durante algun tiempo, anadir amoniaco Uquido a una proporcion de una parte a cien partes del agua empleada, lo cual provoca la precipitacion del quitosano con el sulfato de cobre unido. El sulfato de cobre es soluble en amoniaco lfquido y la disolucion resultante tiene un color azul oscuro. El calculo del cobre se realiza mediante colorimetna y empleando una grafica patron de 0,02-0,1%. A partir de esto, se calculo que el quitosano unido al cobre era 90%. Este es un ejemplo del uso posible del derivado como vehnculo para todas las moleculas cargadas.

Sin pretender quedar limitado por teona alguna, los inventores creen que el quitosano tiene una carga positiva, y cualquier acido organico o inorganico formara un enlace coordinado con el grupo amino cargado sobre el quitosano. Estos complejos se han nombrado como las sales respectivas del quitosano, por ejemplo, clorhidrato de quitosano, acetato de quitosano, etc. Estas sales se disuelven en agua, y el pH de la disolucion en general es acido. Ademas, las sales no poseen actividad antimicrobiana. Cuando se intento aumentar al pH de estas disoluciones mediante la adicion de un alcali, generalmente NaOH, el quitosano precipita antes de que el pH alcance la neutralidad. Esto se debe a que la sal no es estable a dicho pH. En los procedimientos de la presente invencion, se realizan dos tipos de modificaciones que son exclusivas:

(1) La reaccion del quitosano se realiza en alcohol con agua al 0-30% que proporciona una hidratacion limitada y, por tanto, es importante para lograr la sustitucion controlada/limitada de los grupos laterales.

(2) Una reaccion mediada por formaldehndo y una reaccion mediada por anhudrido. Ambos productos de la reaccion en general son estables a pH alcalino. En este caso, la solubilidad del producto a pH alcalino es una funcion de las cargas netas sobre la molecula. Estas pueden anadirse en cualquiera de dichas 2 reacciones o mediante una simple interaccion ionica (formacion de sales) con cualquier acido. Generalmente se prefieren los acidos inorganicos, porque las sales son mas estables.

(3) Los derivados de quitosano solubles desarrollados por medio de los diversos procedimientos/procesos descritos en el presente documento presentan una sustitucion parcial y conservan tanto cargas positivas como negativas. Asf, diferentes moleculas cargadas se unen a la molecula de quitosano, haciendo que sea util como molecula vehnculo para grupos activos, tales como grupos antimicrobianos, o cualquier otro grupo activo que tenga algun fin funcional. El resultado es que la eficacia de un grupo funcional que esta unido a dicha molecula mejora a una concentracion muy pequena. En el presente documento, las composiciones de quitosano hidrosolubles, preparadas por medio de los procedimientos/procesos de la invencion, han demostrado ser vehnculos eficaces de restos de n-acetil cistema y sulfato de cobre, habiendose demostrado esto ultimo en el ejemplo 19. Se espera que se produzca la misma actuacion para cualquier otro grupo funcional cuyo resto pueda ser tan eficaz como cuando esta en un estado no unido cuando no es portado por la molecula de quitosano hidrosoluble. La molecula de quitosano hidrosoluble empleada en el presente documento se prepara mediante los procedimientos/procesos de la presente invencion. Sin embargo, la molecula de quitosano hidrosoluble preparada mediante cualquier otro procedimiento/proceso existente o de la presente invencion sera equivalente a esta molecula para los objetivos de su aplicacion como molecula vehnculo y se considera que esta dentro del ambito de la presente invencion a menos que exista cualquier razon para que no pueda portar cualquier otro principio activo por alguna razon.

Otra realizacion de la presente invencion describe un procedimiento/proceso para potenciar la estabilidad durante el almacenamiento de productos naturales mediante un tratamiento con derivados de quitina. Una realizacion de este aspecto de la invencion describe un procedimiento/proceso para potenciar la estabilidad durante el almacenamiento de productos naturales mediante un tratamiento con derivados de quitina que retrasa las actividades vitales que son responsables de reducir la estabilidad durante el almacenamiento o que conducen al envejecimiento, mediante el freno o la detencion de dichas actividades. Una lista ilustrativa de dichas actividades vitales incluye, sin limitacion, la respiracion, la oxidacion, la formacion de etileno, la transpiracion, asf como la detencion del envejecimiento de frutas frescas, verduras, carne, pescado, preparaciones de alimentos procesados y no procesados y similares. Los expertos en la tecnica podran extender esta lista a muchas otras actividades vitales que reducen la estabilidad durante el almacenamiento. Para lograr el anterior objetivo, los productos naturales pueden revestirse con las composiciones de la presente invencion mediante procedimientos que son muy conocidos por los expertos en la tecnica. Dicho revestimiento puede ser total o parcial y puede obtenerse mediante el uso de un procedimiento/proceso de aplicacion. Dicho procedimiento de aplicacion incluye, sin limitacion, la pulverizacion, la inmersion, la micropulverizacion o el uso de nanopartfculas, la nebulizacion indirecta y similares. En el caso de alimentos procesados, tales como pan, fideos, etc., dicha formulacion puede anadirse en la masa y/o aplicarse a la superficie del alimento procesado por medio de uno de los procedimientos listados anteriormente.

Cuando los platanos se almacenan durante un largo tiempo, la corona del racimo comienza a secarse. El tallo que une el fruto del platano a la corona se denomina pedicelo. Empieza a marchitarse. La marchitacion del pedicelo es el mejor indicador del secado. Una menor marchitacion significa la conservacion de la frescura. Se realizo un ensayo con 1000 kg de platano mediante el procedimiento convencional (control) de inmersion en 0,1% del producto de los inventores, y la pulverizacion del producto de los inventores. Esto se repitio en 2 granjas (total de

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6000 kg de platanos). El porcentaje muy bajo de marchitacion del pedicelo tras la inmersion y tambien tras la pulverizacion de la composicion de ensayo demuestra su buena eficacia para retrasar el secado y, en ultimo termino, para retrasar el envejecimiento y la senescencia y para mejorar la capacidad de almacenamiento.

Los resultados se presentan a continuacion en la tabla 6. Mediante el procedimiento de inmersion se observo una mejora significativa en la marchitacion (perdida de peso, o conservacion de la frescura).

A continuacion se describen experimentos realizados que sirven como ilustraciones no limitantes de la forma en que se realiza la invencion. Cualquier modificacion o variacion en los parametros, que incluyen, pero no se limitan a procedimientos para producir hidrolizados y posteriores modificaciones, procedimientos/procesos de uso de los productos y sus diversas etapas empleadas, son solo ilustrativas y cualquiera de sus equivalentes que seran obvios para los expertos en la tecnica y que sean capaces de lograr el mismo objetivo pueden utilizarse en su lugar y aun se consideran incluidas en el ambito de la presente memoria descriptiva.

Figuras y su descripcion

Figura 1: Fotograffa de platanos no tratados (izquierda) y tratados (derecha) en el 12° dfa de almacenamiento. Figura 2: Escaneado de MRI de los tomates representativos.

Figura 3: Fotograffa de la diferencia en el aspecto de manzanas cortadas tratadas y no tratadas en el dfa 4.

Figura 4: Las manzanas cortadas no tratadas (control) desarrollaron un crecimiento fungico visible en forma de manchas negras de crecimiento fungico en la fotograffa, mientras que las manzanas cortadas tratadas (ensayo) permanecieron sin crecimiento fungico despues de 25 dfas de almacenamiento en una bolsa de politeno.

Figura 5: Purificacion de proteo-quitinasa. Filtracion en gel en Sephadex G-100.

Figura 6: Determinacion del peso molecular de la proteo-quitinasa.

Figura 7: pH optimo de la proteo-quitinasa. El eje X muestra el pH y el eje Y muestra la actividad enzimatica (unidades/ml) de una unidad de volumen de una unica formulacion de enzima. La actividad maxima de 160 unidades/ml se observa a pH 2.

Figura 8: Temperatura optima de la proteo-quitinasa. El eje X muestra la temperatura y el eje Y muestra la actividad enzimatica (unidades/ml) de una unidad de cantidad de una unica formulacion de enzima. La actividad maxima se obtiene a una temperatura de 80 °C.

Figura 9: Accion de enzimas seleccionadas sobre el quitosano. Carril 1: Patron de glucosamina. Carril 2: Xilano acil transferasa (bruta), Carril 3: Proteasa y xilano acil transferasa (ambas puras). Carril 4: Xilano acil transferasa (pura). Carril 5: Quitosano sin enzima. Las manchas de acetato (resultado de la desacetilacion) estan marcadas con un cffculo.

Ejemplo 1: Produccion de lactato de quitosano hidrosoluble e hidroinsoluble

Se introducen 5 g de quitosano [70 DDA ("Degree of desacylation", grado de desacilacion), malla 100] en un matraz de fondo redondo y se anaden 20 ml de agua destilada y 80 ml de metanol (al 99%). En este caso puede utilizarse quitosano de cualquier otra calidad. La suspension se mezcla a fondo mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min. Se anade un acido, inorganico u organico, preferentemente acido lactico, en diferentes cantidades a esta mezcla y se continua la agitacion durante 2 horas. La temperatura se mantiene por debajo de 30 °C y preferentemente a 25 °C. La suspension se filtra y el solido se seca al aire. El polvo fluido y los aglomerados (si existen) se separan mediante tamizado. El polvo fluido despues se seca aun mas en una estufa de aire caliente [70 °C durante 3-6 horas]. Los aglomerados son parffculas elasticas que no se descomponen en parffculas fluidas de tamiz 100 o mas pequeno. La solubilidad de las parffculas fluidas se comprueba anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agita de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprueba visualmente. Los efectos de las diferentes concentraciones de acido lactico se indican en la tabla 1.

Tabla 1 - Efecto de diferentes cantidades de acido lactico empleadas con 5 g de quitosano

Acido lactico (ml)

Formacion de aglomerados durante la reaccion Solubilidad en agua

6,5

+ + + Se disuelve completamente

5,0

+ + Se disuelve completamente

3,5

+ Se disuelve completamente

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2,0

- Se disuelve completamente

1,0

- Forma aglomerados que se disuelven despues de 30 min

0,5

- Forma aglomerados que no se disuelven hasta 60 min

0,1

- Se disuelve completamente cuando la reaccion se realiza en metanol:agua 90:10

+++ indica 60% o mas de formacion de aglomerados ++ 35% de formacion de aglomerados + aproximadamente 15% de formacion de aglomerados y tamano pequeno de los aglomerados - no se forman aglomerados

Puesto que el acido lactico por debajo de 0,5 ml produce la disolucion completa sin la formacion de aglomerados durante la reaccion, esto se convirtio en la realizacion preferida que se empleo en los posteriores trabajos.

Ejemplo 2: Adicion del grupo succinato al quitosano

Se introducen 5 g de quitosano [70 DDA, malla 60] en un matraz de fondo redondo y se anaden 20 ml de agua destilada y 80 ml de metanol (al 99%). En este caso puede utilizarse quitosano de cualquier otra calidad. La suspension se mezcla a fondo mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min. La mezcla se calienta hasta 65 °C. Se anade anhfdrido succmico en diferentes proporciones que vanan de 15 g a 0,1 g a esta mezcla y se continua la agitacion durante 1 hora. La temperatura se mantiene entre 60-70 °C y preferentemente a 65 °C durante aproximadamente 1 hora.

La suspension se deja enfriar y se filtra, y el solido se seca al aire. El polvo fluido se forma disgregando los aglomerados sueltos de modo mecanico y tamizando con una malla 100. No se observo formacion de aglomerados. El polvo fluido despues se seca aun mas en una estufa de aire caliente a 85 °C durante 3-6 horas. La solubilidad de las partmulas fluidas se comprueba anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agita de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprueba visualmente. El polvo es soluble en agua cuando se anaden 0,5 g o mas de anhfdrido succmico a 5 g de quitosano en dicha reaccion.

Ejemplo 3: Derivatizacion en dos etapas con un acido y anhidrido succmico

La reaccion se realiza exactamente como se describe en el ejemplo 2, en la que el quitosano se sustituye por el producto de la reaccion obtenido en la reaccion descrita en el ejemplo 1 en el que se emplean 1,0 g o 0,5 g de acido lactico. En lugar del acido lactico podna utilizarse cualquier otro acido inorganico u organico. Se emplean 0,5 g mas de anhfdrido succion para cada 5 g del producto de la primera composicion. Se formo un material de grano grueso que era soluble en agua cuando se ensaya como se describio en el ejemplo 1.

Ejemplo 4: Adicion secuencial de succinato y lactato al quitosano

La reaccion se realizo como en el ejemplo 2, en la que se hacen reaccionar 5 g de quitosano con 0,5 g de anhfdrido succmico. Despues de completar la reaccion y de enfriar la mezcla de reaccion hasta 30 °C se anaden 0,5 o 1,0 ml de acido lactico. El acido lactico puede ser reemplazado por cualquier otro acido inorganico u organico. La mezcla se agito durante una hora, se filtro y se proceso como se describio en el ejemplo 1. No se formaron aglomerados. El polvo seco fue completamente soluble en agua en 5 min bajo las condiciones de ensayo descritas.

Ejemplo 5: Identificacion de la enzima que tiene actividad proteinasa principal y reactividad cruzada con la quitinasa

Se recogieron muestras de suelo en Pune, India, y en territorios adyacentes, de diversos recursos naturales ricos en materia organica. Las muestras de suelo, 10 g, se enriquecieron con el sustrato deseado (1 g), concretamente casema, quitosano, salvado de trigo lavado, celulosa, individualmente en distintos matraces de 250 ml que conteman 100 ml de agua destilada esteril. El enriquecimiento continuo durante 3 semanas, y las muestras se extendieron en estnas sobre un medio solido que contema el sustrato empleado para el enriquecimiento como unica fuente de carbono. Las colonias aisladas mostraron, en general, una zona aclarada, lo cual indica una fuerte produccion de la respectiva enzima degradativa. Se aislaron aproximadamente 700 cultivos de diversas bacterias y hongos.

Para descubrir los cultivos que tienen la actividad deseada, estos se cultivaron en matraces de 1 litro que conteman 200 ml de medio mediante el procedimiento de matraces de agitacion. El filtrado del cultivo microbiano bruto se

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concentro mediante una precipitacion con sulfato de amonio disuelto en SDS al 0,1%. Las fracciones de las protemas se separaron mediante una electroforesis en SDS-PAGE desnaturalizante. Las fracciones de las protemas se separaron sobre estos geles como bandas independientes homogeneas.

Estas bandas se caracterizaron segun su actividad por medio de tres procedimientos/procesos diferentes: tincion con azul de Coomassie para la deteccion de protema, ensayo de eliminacion de casema para la actividad proteinasa y ensayo de eliminacion de quitina con azul brillante de ramezol para la actividad quitinasa. Se detecto una banda electroforeticamente homogenea que mostraba actividad proteinasa asf como quitinasa, una proteo- quitinasa. Esta banda se empleo para desarrollar un hidrolizado de quitina para desarrollar el producto de la presente invencion. Se determino que el peso molecular total de la proteo-quitinasa seleccionada, purificada de Aspergillus sp. , era de 50 kD empleando un patron de peso molecular en una SDS-PAGE. El seguimiento del patron de la electroforesis en gel se muestra en la figura 6. Basandose en el ensayo, se selecciono Aspergillus niger MTCC 5572 (depositado en The Microbial Type Culture Collection (MTCC), Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India) por su actividad proteo-quitinasa, y se selecciono Bacillus sp. MTCC 5571 (depositado en The Microbial Type Culture Collection (MTCC), Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India) por su actividad de desacetilacion, y se tomaron para la produccion y el aislamiento de la enzima a gran escala.

Ejemplo 6: Produccion de una proteasa capaz de romper la quitina y el quitosano

Se identificaron cultivos microbianos que eran capaces de producir proteasas acidas o neutras y endoquitinasa. La fraccion enzimatica aislada a partir de los respectivos cultivos microbianos que tema actividad proteinasa, asf como quitinasa (proteo-quitinasa), se incubo con una disolucion de quitosano al 1% en acido acetico al 1%. La proteasa degrada al quitosano parcialmente, dando como resultado una reduccion en la viscosidad del sustrato. Los cultivos identificados por mostrar una reaccion proteasa, asf como endoquitinasa (proteo-quitinasa) prometedora se cultivaron a gran escala para la produccion de enzimas. Se selecciono espedficamente Aspergillus niger MTCC 5572, que se cultivo en condiciones de matraces de agitacion en medio de extracto de levadura y casema. El filtrado del cultivo se caracterizo para la actividad enzimatica, y la enzima proteo-quitinasa bruta se recupero mediante precipitacion en sulfato de amonio [90% de saturacion]. Se determino la actividad enzimatica del precipitado de sulfato de amonio mediante la determinacion de protemas por medio del procedimiento colorimetrico, y se anadio una cantidad conocida de enzima proteo-quitinasa al quitosano para su modificacion. La enzima bruta procedente de Aspergillus niger MTCC 5572 se concentro mediante precipitacion con sulfato de amonio en tampon fosfato, pH 7,0. Esto se sometio a una filtracion en gel empleando Sephadex® G-100. Las diferentes fracciones se recogieron y fueron ensayadas para el contenido en protemas y la actividad enzimatica.

Las fracciones n.os 89 a 104 se corresponden con un pico de una unica protema (vease la figura 5). Este procedimiento/proceso se empleo para la purificacion de la enzima a partir de 3-12 l de caldo de cultivo en un unico lote. Se determino el pH optimo y la temperatura optima para la proteo-quitinasa a lo largo de un intervalo de pH de 1-9 y un intervalo de temperatura de 30-100 °C. La enzima mostraba una actividad optima a pH 2 (figura 7) y 80 °C (figura 8).

Se identificaron los cultivos de Bacillus sp. que eran capaces de producir xilano transferasa acida, es decir, una enzima desacetilante, y se incubaron con una disolucion de quitosano al 1% en acido acetico al 1%. Los cultivos identificados por mostrar una actividad de desacetilacion prometedora se cultivaron a gran escala para la produccion de enzimas. Se selecciono espedficamente Bacillus sp. MTCC 5571, que se cultivo en condiciones de matraces de agitacion en medio de extracto de levadura y casema. El filtrado del cultivo se caracterizo para la actividad enzimatica, y la enzima proteo-quitinasa bruta se recupero mediante precipitacion en sulfato de amonio [90% de saturacion]. Se determino la actividad enzimatica del precipitado de sulfato de amonio mediante la deteccion de una mancha de acetato en una TLC mediante el tratamiento de la quitina con la fraccion enzimatica, y se anadio una cantidad conocida de enzima desacetilante al quitosano para su modificacion. La enzima bruta procedente de Bacillus sp. MTCC 5571 se concentro mediante precipitacion con sulfato de amonio y se disolvio en tampon fosfato, pH 7,0. Esto se sometio a una filtracion en gel empleando Sephadex® G-100. Las diferentes fracciones se recogieron y fueron ensayadas para el contenido en protemas y la actividad enzimatica. Este procedimiento/proceso se empleo para la purificacion de la enzima a partir de 3-12 l de caldo de cultivo en un unico lote.

Ejemplo 7: Produccion de una xilano acil transferasa capaz de desacetilar la quitina y el quitosano

Se identificaron y aislaron cultivos microbianos que son capaces de producir xilano acil transferasa. Estas enzimas realizan la desacetilacion del quitosano bajo las condiciones de ensayo. La mezcla de reaccion mostro una solubilizacion de la quitina a medida que aumenta la viscosidad de la disolucion. La aparicion de grupos acetilo libres se detecto mediante TLC. Los cultivos identificados por poseer una propiedad de desacetilacion de la quitina se cultivaron a gran escala para la produccion de enzimas. Los cultivos seleccionados fueron de Bacillus sp. MTCC 5571 y se cultivaron en condiciones de matraces de agitacion en medio de extracto de levadura y salvado de trigo. El filtrado del cultivo se caracterizo para la actividad enzimatica, y la enzima bruta se recupero mediante

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precipitacion en sulfato de amonio [90% de saturacion]. Se determino la actividad enzimatica del precipitado de sulfato de amonio, y se anadio una cantidad conocida de enzima al quitosano para su modificacion.

Ejemplo 8: Hidrolisis enzimatica del quitosano

Se anadieron 5 g de quitosano a 70 ml de metanol y 30 ml de agua destilada. La mezcla se agito de modo continuo a 100 rpm. Se anadio una enzima capaz de romper la quitina [descrita en el ejemplo 5] a 10-1000 U.I. por g de concentracion de quitosano. La reaccion se realizo a unas temperaturas que vanan de 25-95 °C durante 30 min a 5 horas. Las condiciones preferidas fueron de 100 U.I. de enzima por g de quitosano, una temperatura de 50 °C y un periodo de incubacion de 2 horas. El producto de la reaccion se recupero mediante filtracion y se seco como se describio en el ejemplo 2. El quitosano no modificado [1 g], cuando se disolvio en 100 ml de agua destilada acidificada empleando 2 ml de una disolucion de acido acetico, mostro una viscosidad de 80-100 cps. El quitosano modificado enzimaticamente [1 g], cuando se disuelve en 100 ml de agua destilada acidificada empleando 2 ml de una disolucion de acido acetico, mostro una viscosidad de 20-30 cps. Para demostrar que dicha enzima actua sobre el quitosano, se anadio la enzima purificada (al 0,1% en p/vol) a una disolucion de quitosano al 0,5% (preparada en acido acetico al 0,5% acuoso), y se incubo a 50 °C durante 16 h. La suspension se centrifugo, y el sobrenadante transparente se analizo mediante TLC (sistema disolvente de n-propanol:agua:amoniaco 7:2:1) empleando glucosamina como patron. La enzima que mostro actividad proteo-quitinasa produjo quito- oligosacaridos que se revelaron como manchas en la TLC de movimiento lento cuando se compara con la glucosamina. Las proteasas de diferentes organismos que no muestran actividad cruzada de quitinasa no produjeron manchas que se moviesen por la placa de TLC (figura 9).

Ejemplo 9: Desacetilacion enzimatica de la quitina

Se anadieron 5 g de quitina a 100 ml de agua destilada. Esta mezcla se agito de modo continuo a 100 rpm. Se anadio una enzima capaz de desacetilar la quitina [ejemplo 6] a 500-1000 U.I. por g de concentracion de quitina. La reaccion se realizo a unas temperaturas que vanan de 25-95 °C durante 8 a 24 horas. Las condiciones preferidas fueron de 800 U.I. de enzima por g de quitina, una temperatura de 50 °C y un periodo de incubacion de 8 horas.

El producto de la reaccion se recupero mediante filtracion y se seco como se describio en el ejemplo 2. La quitina no modificada era completamente insoluble en agua. La quitina modificada enzimaticamente [10 g], cuando se agito en 100 ml de agua destilada acidificada empleando 2 ml de una disolucion de acido acetico, mostro una viscosidad de 30-50 cps, lo cual indica una solubilizacion parcial de la quitina como resultado de la desacetilacion.

Ejemplo 10: Composicion de quitosano conservante de la cosecha y procedimiento preferido para su fabricacion

Se introducen 5 g de quitosano [50-70 DDA, malla 60] en un matraz de fondo redondo y se anaden 20 ml de agua destilada y 80 ml de metanol (al 99%). En este caso puede utilizarse quitosano de cualquier otra calidad. La suspension se mezcla a fondo mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min. La mezcla se calienta hasta 65 °C. Se anade anhfdrido succmico en diferentes proporciones que vanan de 15 g a 0,1 g a la mezcla y se continua la agitacion durante 1 hora. La temperatura se mantiene entre 60-70 °C y preferentemente a 65 °C. Se deja que la suspension se enfne. Se anaden 0,5 ml de acido lactico y 4000 U.I. de la enzima de desacetilacion producida a partir de Bacillus sp. MTCC 5571 y la mezcla se agito durante 7 horas. El acido lactico puede ser reemplazado por cualquier otro acido inorganico u organico.

Se anadio 500 U.I. de la enzima quitinolftica producida a partir de Aspergillus niger MTCC descrita en el ejemplo 5 y se continuo con la agitacion durante 1 hora. La suspension se dejo enfriar y se filtro, y el solido se seco al aire. El polvo fluido se forma disgregando los aglomerados sueltos de modo mecanico y tamizando con una malla 100. No se observo formacion de aglomerados. El polvo fluido despues se seca aun mas en una estufa de aire caliente a 70 °C durante 3-6 horas. La solubilidad de las partmulas fluidas se comprueba anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agita de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprueba visualmente. El polvo succinalado es soluble en agua cuando se anaden mas de 0,5 g de anhfdrido succmico a 5 g de quitosano en dicha reaccion.

Ejemplo 11: Produccion de un derivado de azucar-succinato de quitosano hidrosoluble e hidroinsoluble que porta restos formaldehido

Se introducen 5 g de succinato de quitosano, segun se describe en el ejemplo 10, en un matraz de fondo redondo y se anaden 100 ml de metanol (99%). La suspension se mezcla a fondo mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min. La mezcla se calienta hasta 60 °C. La temperatura se mantiene a lo largo de la reaccion. Se disuelve sacarosa en el intervalo de 1 g a 0,02 g (vease la tabla n.° 3) en 10 ml de agua, y esto se anade a la suspension.

La mezcla se agito durante 15 min. Se anadieron 5 ml de formaldehido a esta mezcla gota a gota a lo largo de 30 min. La reaccion continuo a 60 °C con agitacion constante durante 1 a 6 horas mas. Esto se denomina el tiempo de

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reaccion en la tabla n.° 3. La mezcla de reaccion se dejo enfriar hasta la temperatura ambiente. Despues, el producto se recupero mediante filtracion. Los solidos se lavaron con 100 ml de metanol al 90% y se secaron al aire. El producto se caracterizo como polvo fluido o aglomerados. Se determino la solubilidad del polvo al 0,5% en agua destilada (pH 6,5) y acido acetico al 1%. Los resultados de estos experimented se resumen a continuacion:

Tabla 3

Sacarosa en g

Tiempo de reaccion en h Forma del producto Solubilidad en agua Solubilidad en acido acetico al 1%

1

6 polvo insoluble insoluble

0,5

6 polvo insoluble insoluble

0,1

6 aglomerados/gel soluble insoluble

0,02

6 aglomerados/gel soluble insoluble

0,02

3 aglomerados/gel soluble soluble

0,02

1 polvo soluble soluble

Todos los productos hidrosolubles teman un grado variable de actividad antimicrobiana que es constantemente mejor que la actividad antimicrobiana del material de partida (producto del ejemplo 10).

La actividad antimicrobiana de estos productos se ensayo empleando E. col, y el protocolo descrito en el ejemplo 14. Los resultados del ensayo son los siguientes:

Tabla 4 - El recuento inicial de E. colifue de 4 x 107

Producto/concentracion

al 1% al 0,5% al 0,1% al 0,033%

Producto del ejemplo 10

2 x 103 2 x 103 4 x 103 1 x 104

Producto 10 con 0,1 g de sacarosa

7 x 102 4 x 102 4 x 102 1 x 103

Producto 10 con 0,02 g de sacarosa, 6 h

5 x 102 2 x 102 4 x 102 90

Producto 10 con 0,02 g de sacarosa, 1 h

2 x 102 2 x 102 4 x 102 109

Las reacciones se realizaron como se describio anteriormente, pero reemplazando la sacarosa por glucosa o lactosa a 0,02 g cada una durante 3 horas. Los productos de estas reacciones fueron solubles en agua y mostraron una actividad antimicrobiana del 100% contra E. coli cuando se ensayan mediante el procedimiento/proceso descrito anteriormente.

Ejemplo 12: Composicion de quitosano preparada empleando acido fosforoso y que porta restos formaldehido

Se introducen 5 g de quitosano [50-70 DDA, malla 60] en un matraz de fondo redondo y se anaden 100 ml de metanol (al 99%). En este caso puede utilizarse quitosano de cualquier otra calidad. La suspension se mezcla a fondo mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min. La mezcla se calienta hasta 60 °C. Se disuelve acido fosforoso (H3PO3) en diferentes proporciones que vanan de 0,5 g a 15 g en 20 ml de agua y esto se anade gota a gota a la mezcla con agitacion durante 1 hora. Despues se anaden 5 ml de formaldetedo gota a gota. La temperatura se mantiene entre 60-65 °C y preferentemente a 63 °C durante 2-6 horas despues de completar la adicion. La suspension se dejo enfriar y se filtro, y el solido se seco al aire. El polvo fluido se forma disgregando los aglomerados sueltos de modo mecanico y tamizando con una malla 100. No se observo formacion de aglomerados. El polvo fluido despues se seca aun mas en una estufa de aire caliente a 70 °C durante 3-6 horas.

La solubilidad de las partteulas fluidas se comprueba anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agita de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprueba visualmente. La solubilidad tambien se comprueba a pH 8, 9, y 10, ajustado empleando NaOH diluido, o tampon Tris.

Los productos formados empleando quitosano y acido fosforoso en una proporcion de 1:1 y 1:2 mostraron solubilidad en un amplio intervalo de pH (7-10), y formaron disoluciones de ligeramente turbias a transparentes.

Estas disoluciones muestran un grado variable de actividad antimicrobiana. Los estudios antimicrobianos se realizaron empleando Pseudomonas aeruginosa NCIM 2200 (ATCC 9027) capaz de crecer en un amplio intervalo de pH. Un cultivo realizado durante la noche en caldo de cultivo nutriente se inoculo (100 microlitros) de nuevo en

caldo de cultivo nutriente (10 ml) con pH variable (vease la tabla) sin adicion (control) y con adicion del producto de quitina-acido fosforoso. Los cultivos se incuban en un agitador a 25 °C durante 8 h, y el crecimiento se registra como la densidad optica (DO) del caldo de cultivo a 600 nm. Una densidad optica baja (mas baja que el control) indica menos crecimiento y algo de actividad antimicrobiana. Cuando no se produce crecimiento (DO de cero), esto 5 significa una inhibicion del 100% de los microbios.

Tabla 5 - Inhibicion de Pseudomonas a pH 8,5 C:P 1:1 C:P 1:2

pH 7 Control 1,74 0,01%

1,56 1,53

0,05%

0 0

0,10%

0 0

pH 8 Control 1,73 0,01%

1,39 0

0,05%

0 0

0,10%

0 0

pH 9 Control 1,74 0,01%

1,39 1,68

0,05%

0 0

0,10%

0 0

Cuando los platanos se almacenan durante un largo tiempo, la corona del racimo comienza a secarse. El tallo que une el fruto del platano a la corona se denomina pedicelo. Empieza a marchitarse.

10 La marchitacion del pedicelo es el mejor indicador del secado. Una menor marchitacion significa la conservacion de la frescura. Se realizo un ensayo con 1000 kg de platano mediante el procedimiento convencional (control) de inmersion en 0,1% del producto de los inventores, y la pulverizacion del producto de los inventores. Esto se repitio en 2 granjas (total de 6000 kg de platanos). El porcentaje muy bajo de marchitacion del pedicelo tras la inmersion y tambien tras la pulverizacion de la composicion de ensayo demuestra su buena eficacia para retrasar el secado y, 15 en ultimo termino, para retrasar el envejecimiento y la senescencia y para mejorar la capacidad de almacenamiento.

Los resultados se presentan a continuacion en la tabla 6.

Tabla 6 - Eficacia del producto C:P 1:1 en la conservacion de frutas

% de marchitacion del pedicelo/granja empleando el producto del ejemplo 12

n.° de granja

Granja n.° 1 Granja n.° 2

Inmersion

2,4 1,9

Pulverizacion

3,2 2,8

Control

2,7 2,4

20 Mediante el procedimiento de inmersion se observo una mejora significativa en la marchitacion (perdida de peso, o conservacion de la frescura).

Ejemplo 13: Aplicacion de la composicion conservante

Se prepararon disoluciones de 10 gramos de quitosano y su producto descrito en los ejemplos 1, 2, 4 y 10 disolviendo el quitosano en acido acetico al 2% y todos los demas derivados en agua para obtener un volumen de 25 1000 ml de disolucion en un recipiente con una capacidad de 15 l. Se sumergieron 3 kg de tomates o 2 kg de

platanos en la disolucion durante 15 s. Cuando el material se extrajo del recipiente, se dejo que el exceso de disolucion escurriese hacia el mismo recipiente durante 1 min. Esta accion de escurrir se repitio con los siguientes

cinco lotes de fruta fresca. Asf, se sumergieron un total de 15 kg de tomates o 10 kg de platanos en 10 l de disolucion.

Despues la disolucion remanente en el recipiente se midio con precision y se registro la perdida de Uquido como la diferencia entre el volumen inicial y final. Esto se dividio entre la cantidad total de fruta sumergida para obtener el 5 consumo de disolucion por kg de fruta sumergida. Los resultados de este experimento se indican en la tabla 7.

Tabla 7

Producto

Consumo en ml por kg de tomate Consumo en ml por kg de platano

Quitosano

12 19

Quitosano:acido lactico 1:0,4 como en el ejemplo 1

9 10

Quitosano:anl"ndrido succmico 1:0,1 como en el ejemplo 2

8 8

Producto del ejemplo 4

3 5

Producto del ejemplo 10

3 3

La quinta composicion mostro de tres a cuatro veces menos consumo por kg de platanos y tomates que la disolucion de quitosano en acido acetico.

10 Ejemplo 14: Actividad antimicrobiana de las composiciones de quitosano

Se disolvio quitosano en acido acetico al 2% y sus productos descritos anteriormente se disolvieron en agua. Se emplearon 300 mg del producto para preparar 10 ml de disolucion. Se cultivaron durante la noche E. coli NCIM 2065 y Bacillus subtilis NCIM 2063 (109 celulas/ml de densidad), se diluyeron en 100 veces con caldo de cultivo lfquido esteril y se emplearon para el ensayo antimicrobiano. El ensayo se puso en marcha mezclando los cultivos 15 diluidos con una disolucion madre de quitosano o producto como sigue:

Vol. del cultivo en ml

7 8, 5 9, 7 9,9

Vol. de quitosano/producto en

3 1, 0, 0,1

ml

5 3

Concentracion del producto (%)

1 0, 0, 0,03

5 1 3

La mezcla se incubo a 37 °C durante 20 min. Se determino el recuento viable total de la mezcla. Esto, cuando se compara con el recuento inicial del cultivo, indica la eficacia microbicida del producto. Los datos para E. coli y 20 Bacillus subtilis se indican en la tabla 8 y 9.

La mezcla se incubo a 37 °C durante 20 min. Se determino el recuento viable total de la mezcla. Esto, cuando se compara con el recuento inicial del cultivo, indica la eficacia microbicida del producto. Los datos para E. coli y Bacillus subtilis se indican en la tabla 8 y 9.

Tabla 8 - El recuento inicial de E. colifue de 4 x 107

Producto/concentracion

1% 0,5% 0,1% 0,033%

Quitosano

2 x 107 4 x 107 4 x 107 4 x 107

Quitosano:acido lactico 1:0,4

6 x 105 1 x 106 2 x 107 2 x 107

Quitosano:anl"ndrido succmico 1:0,1

8 x 106 2 x 107 2 x 107 2 x 107

Producto del ejemplo 4

9 x 105 2 x 106 9 x 106 3 x 107

Producto del ejemplo 9

3 x 107 9 x 106 3 x 106 7 x 105

Producto del ejemplo 10

2 x 103 2 x 103 4 x 103 1 x 104

Tabla 9 - El recuento inicial de Bacillus subtilis coli fue de 3 x 107

Producto/concentracion

1% 0,5% 0,1% 0,033%

Quitosano

3 x 107 3 x 107 4 x 107 4 x 107

Quitosano:acido lactico 1:0,4

4 x 105 3 x 106 1 x 107 7 x 106

Quitosano:anl"ndrido succmico 1:0,1

3 x 106 3 x 106 8 x 107 6 x 107

Producto del ejemplo 4

7 x 105 1 x 106 5 x 106 1 x 106

Producto del ejemplo 10

1 x 104 2 x 104 4 x 105 1 x 105

La mezcla (al 0,1%) se incubo en una nevera (a una temperatura de 4-10 °C) durante hasta 7 semanas. El aumento en la turbidez se detecto de modo visual y se puntuo como +. Si no se produce aumento en la turbidez (-), esto indica una actividad microbiostatica.

5 Tabla 10 - Actividad microbiostatica contra E. coli (NCIM 2065) y B. subtilis (NCIM 2063)

Producto/cultivo microbiano

Semanas E. coli B. subtilis

3

5 7 3 5 7

Quitosano

+ + + + + +

Quitosano:acido lactico 1:0,4

- + + - - +

Quitosano:anl"ndrido succmico 1:0,1

+ + + - + +

Producto del ejemplo 4

- - + - - +

Producto del ejemplo 9

- - - - - +

La quinta composicion muestra una alta actividad antimicrobiana, asf como una actividad microbiostatica, comparado con la disolucion de quitosano en acido acetico y la primera, segunda y cuarta composicion.

Ejemplo 15: Efecto de las composiciones conservantes sobre la estabilidad durante el almacenamiento

Con la disolucion de quitosano, el quitosano procesado mediante los ejemplos 6 y 7 se empleo para revestir 10 platanos y fresas (100 frutas en cada lote), observandose el numero mas bajo de descomposiciones microbianas (22 y 9 para las frutas respectivas) despues de 5 dfas de almacenamiento a temperatura ambiente, y de 25 para el quitosano procesado mediante el procedimiento/proceso del ejemplo 6.

Ejemplo 16: Mejora en la caducidad por el producto del ejemplo 10 (quinta composicion)

Se trataron platanos verdes recien recolectados (<30 h de la recoleccion) utilizando una disolucion al 0,1% del 15 producto del ejemplo 10 en agua. El tratamiento puede administrarse sumergiendo los platanos en dicha disolucion durante nominalmente 10-15 s, o mediante pulverizacion directa de la disolucion sobre los platanos con un dispositivo adecuado para que la superficie de los platanos se humedezca, o haciendo pasar los platanos a traves de una camara cerrada que esta saturada con una nebulizacion de dicha disolucion (nebulizacion indirecta). Los platanos tratados se secan al aire. Estos platanos se almacenan a temperatura ambiente (20-32 °C) y una 20 humedad relativa del 40-60%. Los platanos del mismo lote que son identicos a los platanos tratados se consideran el "control no tratado". Los platanos tratados y no tratados se conservaron en condiciones identicas durante hasta 15 dfas. Los platanos tratados mantuvieron el color verde y el peso, mientras que los platanos sin tratar perdieron peso y desarrollaron decoloracion. La fotograffa de platanos tratados y no tratados en el 12° dfa muestra las diferencias visuales. Los platanos tratados mostraron una mejor condicion fisiologica, ensayados por medios 25 qmmicos, mediante la determinacion de su contenido en solidos totales (contenidos BRIX), azucares reductores y perdida de peso. Los datos se muestran en la tabla 11 y la figura 1.

Tabla 11 - Resultados de los ensayos cuantitativos realizados en platanos tratados y no tratados control en el dfa 6°

de almacenamiento

Parametro

Tratado Control

Perdida de peso

2,6 8,7

BRIX

22-24 20-22

RS

800-1100 300-850

La fotograffa de platanos no tratados (izquierda) y tratados (derecha) en el 12° dfa de almacenamiento se muestra 30 en la figura 1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Despues del almacenamiento durante 8-15 dfas, los platanos tratados y no tratados control se trataron con etileno. Los platanos tratados maduraron con normalidad, mientras que los platanos no tratados control se pusieron duros y no maduraron o se volvieron negros y blandos. Ambos tipos de platanos del lote no tratado no fueron aceptables para el consumo.

Ejemplo 17: Cambios fisiologicos positivos y actividad microbiostatica

Se trataron tomates enteros y manzanas cortadas con el producto del ejemplo 10, exactamente como se describe en el ejemplo 14 para los platanos. Los tomates tratados mantuvieron su peso, textura y frescura durante 30 dfas frente a los tomates control sin tratar, que se arrugaron en 12-15 dfas, dando como resultado una perdida de peso. Los cambios fisiologicos en los tomates tratados y control se controlaron en el 7° dfa de almacenamiento empleando una tecnica de escaneado de MRI.

La piel pulposa de los tomates tratados era mas uniforme en su densidad de color. La piel pulposa de los tomates no tratados mostraba manchas oscuras que son indicativas de un secado no uniforme y mayor.

El escaneado de MRI de los tomates representativos se incluye en la figura 2.

Los trozos de manzanas cortadas se envasaron en una bolsa de politeno o un recipiente de plastico transparente y se almacenaron en la nevera a una temperatura de 4-9 °C. Las manzanas cortadas del control comenzaron a tomar un color marron desde el dfa 2 y se volvieron blandas para el dfa 3, mientras que las manzanas cortadas tratadas mantuvieron el color, el gusto y la textura dura durante 6 dfas. La fotograffa (figura 3) muestra la diferencia en el aspecto de las manzanas cortadas tratadas y no tratadas en el dfa 4.

Los trozos de manzanas cortadas tratadas y no tratadas se envasaron en un recipiente de plastico transparente y se almacenaron como se describio anteriormente durante hasta 25 dfas. Las manzanas cortadas no tratadas desarrollaron un crecimiento fungico [manchas negras en la fotograffa de la figura 4], mientras que las manzanas cortadas tratadas no desarrollaron crecimiento fungico ni microbiano. Los resultados se muestran en la siguiente fotograffa.

Ejemplo 18: Composicion de quitosano preparada empleando acido fosforoso y acido clorhidrico

Se introducen 750 g de quitosano [50-70 DDA, malla 100] en un matraz de fondo redondo y se anaden 15000 ml de metanol (99%). En este caso puede utilizarse quitosano de cualquier otra calidad. La suspension se mezcla a fondo mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min. La mezcla se calienta hasta 60 °C. Despues se anaden 750 ml de formaldehudo a lo largo de 1-2 min.

Se disuelven 750 g de acido fosforoso (H3PO3) en 7500 ml de agua y se anaden gota a gota a esta mezcla mediante agitacion durante 1 hora. La temperatura se mantiene entre 60-65 °C y preferentemente a 63 °C durante 6 horas despues de completar la adicion. La suspension se dejo enfriar y se filtro, y el solido se seco al aire. Se forma un polvo fluido con pequenos aglomerados. Estos se disgregan de modo mecanico y se tamizan empleando una malla 100. El polvo fluido despues se seca aun mas en una estufa de aire caliente a 70 °C durante 3-6 horas. La solubilidad de las partfculas fluidas se comprueba anadiendo 100 mg de polvo lentamente a 100 ml de agua destilada (pH 6,5) a lo largo de 5 min. La mezcla se agita de modo continuo durante la adicion y durante 10 minutos mas y despues la solubilidad se comprueba visualmente. La solubilidad tambien se comprueba a pH 8, 9, y 10, ajustado empleando NaOH diluido, o tampon Tris.

El producto se disuelve en agua, pero precipita cuando el pH aumenta hasta 7,0. El polvo seco obtenido en esta reaccion se resuspendio en 20 volumenes de metanol al 90% y se anadieron 2 volumenes de HCl concentrado. La mezcla se agito durante una hora a temperatura ambiente. El polvo se retiro mediante filtracion, se lavo con 20 vol de metanol al 90% 3 veces y se seco como se describio anteriormente. El producto resultante es soluble de pH 3 a 12.

Los productos de los demas ejemplos (en particular, los ejemplos 10, 12), cuando se tratan con HCl segun se describe en este ejemplo, no alteraron el pH de solubilidad maximo.

Ejemplo 19: Uso de quitosano hidrosoluble como vehfeulo

Se disolvio 1 g de quitosano hidrosoluble, derivado segun el ejemplo 10, en 100 ml de agua. A 9 ml de esta disolucion se le anadio 1 ml de una disolucion de sulfato de sodio (al 1%). Esto se mezclo a mano durante 2 min. Despues se anadio 1 ml de amoniaco lfquido. Esto produjo la precipitacion del quitosano. Junto con el quitosano tambien precipito el sulfato de cobre unido. El sulfato de cobre es soluble en amoniaco lfquido y la disolucion resultante tiene un color azul oscuro. El calculo del cobre se realiza mediante colorimetna y empleando una grafica patron de 0,02-0,1%. A partir de esto, se calculo que el quitosano unido al cobre era 90%.

Claims (18)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de produccion de un derivado de quitosano mediante la activacion de quitosano, suspendiendo dicho quitosano en alcohol que contiene un porcentaje de agua de 0% hasta un maximo de aproximadamente 30%, agitando con calentamiento durante un periodo de tiempo para obtener el quitosano activado o un precursor del quitosano, y despues haciendo reaccionar dicho quitosano activado o dicho precursor activado con un reactivo capaz de formar complejos por medio de fuerzas ffsicas o fuerzas qmmicas para preparar un derivado.
2. 2. Un procedimiento de la reivindicacion 1, en el que:

   a. dicho derivado tiene una propiedad que comprende una propiedad antimicrobiana o microbiostatica o antitranspirante o antifungica o de conservacion de la fruta o microbiostatica o de mejoramiento de la caducidad o una combinacion de estas propiedades.

   b. dichas fuerzas ffsicas incluyen la adsorcion y dichas fuerzas qmmicas incluyen un enlace covalente.
3. 3. Un procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho derivado se prepara sometiendo dicho quitosano suspendido en dicho alcohol al menos a una de las siguientes etapas:

   a. anadir agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol y calentar dicha mezcla hasta

   aproximadamente 70 °C, anadir anhfdrido succmico a esta mezcla,

   i. agitar durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para que se produzca la reaccion a una temperatura de entre aproximadamente 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, para obtener una segunda composicion en suspension,

   ii. y bien (I) recuperar dicha composicion con o sin secado, o bien (II) someter a otra reaccion con un reactivo para obtener otro derivado de dicha segunda composicion,

   b. anadir agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol y calentar dicha mezcla hasta

   aproximadamente 70 °C, anadir anhfdrido succmico a una proporcion de aproximadamente 10% en peso de la materia prima a esta mezcla,

   i. agitar durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para que la reaccion se mantenga a una temperatura de aproximadamente 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, para obtener un derivado succmico en suspension,

   ii. dejar que la suspension se enfne hasta aproximadamente 30 °C, someter dicho derivado succmico a otra

   reaccion con acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% al 20% del peso seco del derivado

   succmico, agitar la mezcla durante 1 hora, filtrar y secar los solidos para obtener una cuarta composicion en suspension,

   iii. y bien (I) recuperar dicha composicion con o sin secado, o bien (II) someter a otra reaccion con un reactivo para obtener otro derivado de dicha cuarta composicion, que comprende un material de grano grueso que es soluble en agua,

   c. anadir agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol y calentar y mantener dicha mezcla a aproximadamente 70 °C, anadir anhfdrido succmico a esta mezcla,

   i. agitar durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para que la reaccion se mantenga a una temperatura de entre 60 a aproximadamente 70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, durante un periodo de tiempo,

   ii. dejar que la suspension se enfne para obtener un derivado succmico, someter dicho derivado succmico a otra reaccion con acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% en peso del peso seco del derivado succmico, anadir, por cada 5 gramos de peso seco del derivado succmico empleado, una enzima para la desacetilacion a aproximadamente 4000 U.I., agitar la mezcla durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 7 horas, anadir despues una enzima quitinolttica, preferentemente a aproximadamente 500 U.I. por 5 g de peso seco del derivado succmico, continuar agitando durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 1 hora, dejar que la suspension se enfne para obtener una quinta composicion en suspension,

   iii. y bien (I) recuperar dicha composicion con o sin secado, o bien (II) someter a otra reaccion con un reactivo para obtener otro derivado de dicha quinta composicion,

   d. anadir agua a aproximadamente 20% del volumen de alcohol, calentar la mezcla de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 70 °C, anadir anhfdrido succmico a esta mezcla,

   i. agitar durante 1 hora o durante un periodo de tiempo suficiente para que se produzca la reaccion, mantener la temperatura entre 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, durante un periodo de tiempo,

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   ii. dejar que la suspension se enfne para obtener un derivado succmico, someter dicho derivado succmico a otra reaccion con acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% del peso seco del derivado succmico, y anadir, por cada 5 gramos de peso seco del derivado succmico empleado, una enzima para la desacetilacion a aproximadamente 4000 U.I., agitar la mezcla durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 7 horas, anadir despues una enzima quitinolttica a 500 U.I. por 5 g de peso seco del derivado succmico empleado, y continuar agitando durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 1 hora, dejar que la suspension se enfne para obtener una quinta composicion en suspension, recuperar dicha quinta composicion como un polvo solido,

   iii. suspender el polvo seco de dicha quinta composicion en alcohol puro, mezclar a fondo la suspension mediante agitacion a 100 rpm durante 30 min y calentar y mantener la temperatura durantel procedimiento a 60 °C, anadir un azucar disuelto en agua en aproximadamente 10% en volumen al volumen del alcohol, agitar la mezcla durante aproximadamente 15 minutos o durante un periodo de tiempo suficiente para el mezclado, anadir formaldehudo gota a gota durante aproximadamente 30 minutos o durante un periodo de tiempo necesario para la adicion gradual con agitacion constante, mantener la temperatura a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 1 a 6 horas o durante el periodo necesario hasta que la reaccion se complete,

   iv. dejar despues que la mezcla de reaccion se enfne hasta la temperatura ambiente,

   v. recuperar el producto, lavar los solidos con metanol acuoso u otro alcohol polar acuoso y recuperar una sexta composicion en suspension,

   vi. y bien (I) recuperar dicha composicion con o sin secado, o bien (II) someter a otra reaccion con un reactivo para obtener otro derivado de dicha sexta composicion que puede lavarse con 100 ml de metanol al 90% y secarse al aire,

   e. suspender el quitosano en alcohol preferentemente en 20 volumenes, mezclar a fondo con agitacion para lograr la activacion del quitosano, preferentemente a 100 rpm durante 30 min, calentar dicha mezcla hasta aproximadamente 60 °C, anadir acido fosforoso (H3PO3) disuelto en agua y anadir gota a gota a esta mezcla con agitacion, anadir formaldehudo a un peso aproximadamente igual al peso seco del quitosano activado, o su derivado, gota a gota, mantener la temperatura entre aproximadamente 60-65 °C, preferentemente a 63 °C, durante un periodo de tiempo de preferentemente 2-6 horas despues de completar la adicion, dejar que la suspension se enfne y recuperar la septima composicion en suspension, y bien (I) recuperar dicha composicion con o sin secado, o bien (II) someter a otra reaccion con un reactivo para obtener otro derivado de dicha septima composicion; y dicha septima composicion puede ser soluble en un amplio intervalo de pH 7 a 10 produciendo disoluciones de ligeramente turbias a transparentes,

   f. suspender el quitosano en alcohol preferentemente en 20 volumenes, mezclar a fondo con agitacion para lograr la activacion del quitosano, preferentemente a 100 rpm durante 30 min, calentar dicha mezcla hasta aproximadamente 60 °C, anadir 750 ml de formaldehudo durante un periodo de unos pocos minutos, anadir aproximadamente 10% de un acido inorganico o acido fosforoso (H3PO3) disuelto en agua, realizandose la adicion gota a gota a esta mezcla con agitacion durante aproximadamente una hora o durante un periodo de tiempo necesario para que la mezcla sea eficaz, mantener la temperatura entre aproximadamente 60-65 °C, preferentemente a 63 °C durante aproximadamente seis horas o durante un periodo de tiempo necesario para que la reaccion se complete, dejar que la suspension se enfne despues de completar la adicion y recuperar la octava composicion en suspension,

   i. y bien (I) recuperar dicha composicion con o sin secado, o bien (II) someter a otra reaccion con un reactivo para obtener otro derivado de dicha octava composicion,

   g. suspender el quitosano en alcohol preferentemente en 20 volumenes, mezclar a fondo con agitacion para lograr la activacion del quitosano, preferentemente a 100 rpm durante 30 min, calentar la mezcla hasta 60 °C, anadir formaldehudo durante un periodo de unos pocos minutos, anadir aproximadamente 10% de un acido inorganico o acido fosforoso (H3PO3) disuelto en agua, realizandose la adicion gota a gota a esta mezcla con agitacion durante aproximadamente una hora o durante un periodo de tiempo necesario para que la mezcla sea eficaz, mantener la temperatura entre aproximadamente 60-65 °C, y preferentemente a 63 °C durante 6 horas o durante un periodo de tiempo necesario para que la reaccion se complete y, despues de completar la adicion, dejar que la suspension se enfne, recuperar la suspension como un polvo seco, resuspender en 20 volumenes de metanol al 90% y 2 volumenes de HCl concentrado o cualquier otro acido organico o inorganico, agitar la mezcla a temperatura ambiente durante una hora o durante un periodo de tiempo necesarios para obtener una buena mezcla, filtrar, lavar con 20 volumenes de metanol al 90% y secar para recuperar la novena composicion,

   h. suspender el quitosano en alcohol preferentemente 20 volumenes, mezclar a fondo mediante agitacion para lograr la activacion del quitosano, preferentemente a 100 rpm durante 30 min, calentar dicha mezcla hasta 70 °C,

   i. anadir anhfdrido succmico a diferentes proporciones que vanan de 15 g a 0,1 g a esta mezcla, agitar durante una hora o durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir un buen mezclado, mantener la

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   temperatura entre 60-70 °C, y preferentemente a aproximadamente 65 °C, durante 1 hora o durante un periodo de tiempo necesario para la reaccion, dejar que la suspension se enfne para obtener un derivado succmico,

   ii. anadir acido lactico u otro acido a aproximadamente 10% en peso seco del derivado succmico, anadir, por cada 5 gramos de peso seco del derivado succmico empleado, una enzima para la desacetilacion a aproximadamente 4000 U.I., agitar la mezcla durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 7 horas, anadir despues una enzima quitinolttica a 500 U.I. por 5 g de peso seco del derivado succmico empleado y continuar agitando durante un periodo de tiempo, preferentemente durante 1 hora, dejar que la suspension se enfne para obtener una quinta composicion solida,

   iii. recuperar y secar al aire la quinta composicion,

   iv. disolver la quinta composicion para obtener una disolucion al 1% en agua, anadir una disolucion acuosa de sulfato de cobre u otra molecula cargada capaz de adsorberse sobre la quinta composicion a pH alcalino, como una disolucion,

   v. dicha disolucion de sulfato de cobre o la molecula cargada pueden estar al 1% con respecto al agua,

   vi. dicha disolucion de sulfato de cobre o la molecula cargada pueden suspenderse en una cantidad pequena, de aproximadamente 1% del volumen de agua empleado para disolver la quinta composicion, y

   vii. mezclar durante unos pocos minutos,

   viii. anadir amoniaco lfquido para precipitar el quitosano con el sulfato de cobre unido u otra partmula cargada para obtener un derivado de la decima composicion.
4. 4. Un derivado de quitosano producido mediante la activacion del quitosano suspendiendo dicho quitosano en alcohol que contiene un porcentaje de agua de agua de 0% hasta un maximo de aproximadamente 30%, agitando con calentamiento durante un periodo de tiempo para obtener el quitosano activado, o un precursor del quitosano, y despues haciendo reaccionar dicho quitosano activado o dicho precursor activado con un reactivo capaz de formar complejos por medio de fuerzas ffsicas o fuerzas qrnmicas para preparar un derivado.
5. 5. El derivado de quitosano de la reivindicacion 4, en el que dicho derivado tiene una propiedad que comprende una propiedad antimicrobiana o microbiostatica o antitranspirante o antifungica o de conservacion de la fruta, o una combinacion de estas propiedades.
6. 6. El derivado de quitosano de la reivindicacion 4, en el que dicho derivado se prepara mediante el procedimiento de la reivindicacion 3.
7. 7. La composicion que comprende, como ingrediente fundamental, al menos una de las composiciones de la reivindicacion 4 o 5 o 6.
8. 8. La composicion de la reivindicacion 7, que comprende un polvo o una disolucion de al menos una de dichas composiciones en agua a una concentracion eficaz para una accion deseada que comprende:

   a. la conservacion de frutas, verduras, alimentos y piensos ingeribles,

   b. retrasar la maduracion, retrasar el envejecimiento y retrasar la senescencia de productos naturales que incluyen frutas, verduras y flores.
9. 9. La composicion de la reivindicacion 8, que comprende al menos uno de los siguientes:

   a. dicha composicion comprende al menos una cualquiera de dicha segunda composicion y de dicha cuarta a decima composicion, o sus mezclas,

   b. dicha concentracion eficaz es del 0,1 %,

   c. el acido acetico esta al 2%.
10. 10. Un procedimiento para mejorar la caducidad de frutas, que comprende un tratamiento de inmersion, pulverizacion, nebulizacion u otro procedimiento de aplicacion externa o interna, o aplicaciones a frutas cortadas o procesadas y productos naturales procesados de una composicion que, como ingrediente fundamental, comprende una o mas de una composicion de la reivindicacion 4 o 5 o 6.
11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que dicho tratamiento es para retrasar la maduracion y/o la descomposicion microbiana.
12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que dicha fruta son plantanos, mangos, manzanas, fresas, naranjas, limas.
13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que:

    a. dicho alcohol es metanol o cualquier otro alcohol polar,

    b. dicha agitacion se realiza durante 30 min, preferentemente a 100 revoluciones por minuto.
14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 3, etapa c), etapa d) y etapa h), en el que dicha enzima quitinolftica que tiene actividad proteolftica, as^ como una accion quitinolftica, comprende una enzima que tiene al menos una de las siguientes propiedades: un peso molecular de 50 kilodaltons (kD) en una electroforesis de SDS-PAGE, una actividad quitinolftica optima a pH 2 y una actividad quitinolftica optima a una temperatura de 80 °C.

    5 15. El procedimiento de la reivindicacion 14, que comprende dicha enzima quitinolftica aislada de Aspergillus niger

    MTCC 5572 o mutantes derivados del mismo.
15. 16. El procedimiento de la reivindicacion 3, etapa c), etapa d) y etapa h), que comprende dicha enzima desacetilante aislada de Bacillus sp. MTCC 5571 o mutantes derivados del mismo.
16. 17. El procedimiento de la reivindicacion 3, etapa c), etapa d) y etapa h), en el que dicha enzima desacetilante es 10 una xilano acil transferasa preparada a partir de Bacillus sp. MTCC 5571, o mutantes derivados del mismo, o

    cualquier otra bacteria o cualquier otro microorganismo capaz de producir una enzima que tenga actividad desacetilante.
17. 18. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se emplea una enzima quitinolftica termoestable que tiene actividad proteolftica, asf como actividad quitinolftica, una proteo-quitinasa, para preparar un derivado hidrolizado.

    15 19. El procedimiento de la reivindicacion 18, en el que dicha proteo-quitinasa se prepara a partir de Aspergillus niger

    MTCC 5572 o de mutantes derivados del mismo, o de cualquier otro hongo o de cualquier otro microorganismo capaz de producir una actividad proteo-quitinolftica.
18. 20. El procedimiento de la reivindicacion 19, en el que dicha enzima quitinolftica tiene un peso molecular, segun una SDS-PAGE, de 50 kilodaltons y una actividad quitinolftica optima a pH 2 y a 80 °C.

    20