CN104894086B - 一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法 - Google Patents

一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，属于生物技术酶制剂技术领域首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌，搅拌完成后进行冷冻离心，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水浴中搅、冷冻离心获取沉淀物，将沉淀用Tris‑HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；将得到的粗酶液用Tris‑HCl缓冲液透析，然后用同样缓冲体系平衡的QSFF阴离子交换层析柱进行线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。本发明特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。

Description

一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，属于生物技术酶制剂技术领域。
背景技术
几丁质酶(Chitinase,EC3.2.1.14)是催化几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖或低聚合度几丁寡糖的水解酶(Henrissat,1999)，从而把不溶性几丁质变成可利用的碳源。几丁质酶在自然界中分布广泛，目前已从多种植物(Santos et al., 2004; Patel et al.,2010; Zhang et al., 2013)、真菌(Gruber et al., 2011; Narayanan et al., 2013)、细菌(Dai et al., 2011; Frederiksen et al., 2013)、昆虫(Arakane &Muthukrishnan, 2010)甚至脊椎动物动物中发现几丁质酶(Guan et al., 2009)。但每种几丁质酶所发挥的作用不径相同，细菌和真菌产几丁质酶主要是由于养分的需求，几丁质酶对于真菌除养分的需求外，在菌体生长及形态形成方面也起着重要的作用，而几丁质酶在动物及植物当中主要作用为抵御外界致病因素的侵入。研究发现在动物和植物当中，几丁质酶除了防御相关功能外，在生长及应激机制中均发挥着重要的作用（Kasprzewska,2003）。近年来，由于几丁寡糖制备、几丁质生物转化和生物防治等方面的应用，几丁质酶成为研究的热点和趋势。
众所周知，在酶法制备几丁寡糖过程中，需先用无机酸与粉末几丁质制得胶体几丁质，用水将其洗涤至适当的pH后加入几丁质酶反应，将反应产物通过膜过滤和层析等手段得到不同聚合度几丁寡糖以满足不同用途的需求，反应温度一般控制在40−90℃，pH一般控制在2.5−7.5范围内。制备几丁质寡糖普遍遇到的难题是高活力酶的获得和几丁质胶体大量制备这两大瓶颈，由此可以看出获得具有较高反应温度及较低反应pH的高效几丁质酶是提高几丁寡糖生产效率和降低生产成本的关键因素。
在至今发现的几丁质酶当中，来源于微生物的几丁质酶的最适温度一般在40−50℃，最适pH大部分在5左右(Lee et al., 2009; Li et al., 2010; Okay et al., 2013)，相对而言，植物来源的几丁质酶最适温度较高，一般在40−60℃，最适pH与微生物来源的几丁质酶相近，但部分植物来源的几丁质酶具有较低的最适pH（≤4）(Santos et al., 2004;Wang et al., 2012; Zhang et al., 2013)。但同时具有较高反应温度和较低反应pH特性的几丁质酶较为罕见，所以获得具有适宜工业化生产的优良特性的几丁质酶任是人们关注的热点。
由于几丁质与壳聚糖(脱乙酰几丁质)是许多病原真菌和昆虫的基本结构成份，所以几丁质酶在生物防治中发挥着重要作用。在抗真菌研究当中，人们已获得多种来源的具有抗真菌特性的几丁质酶，其中来源于植物的几丁质酶具有较广泛的抗真菌能力，研究证明提纯的烟草、马铃薯、黄瓜、菜豆、豌豆、鹰嘴豆、甜菜、水稻、小麦、大麦、玉米等的几丁质酶对20多种真菌的菌丝生长或抱子萌发具有抑制作用(Brogue et al., 1991)，但每种几丁质酶的抗菌谱是不同的。例如：膜夹黄芪来源的几丁质酶对茄病镰刀菌、灰霉病、尖孢镰刀菌和绿色木霉有抑制作用（Kopparapu et al., 2011）；而柿子来源的几丁质酶仅对绿色木霉有抑制作用（Zhang et al., 2013）。所以获得具有广泛抗真菌特性且抗菌能力强的几丁质酶将为生物防治提供有力的支持，减少农药残留给环境和人们所带来的危害。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法。本发明特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值，本发明通过以下技术方案实现。
一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其具体步骤如下：
步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌0.5~1h，搅拌完成后进行冷冻离心10~20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水浴中搅拌0.5~1h、冷冻离心10~20min获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；
步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF强阴离子交换柱，流速为1.0~2.0mL﹒min-1，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
所述步骤1和步骤2中的Tris-HCl缓冲液pH为7.4~8.5，步骤1和步骤2中Tris-HCl缓冲液的加入量分别为5~10mL、10~20个柱体积。
上述洗脱液收集的柱体积和缓冲液的柱体积所选择的规格一致。
上述制备得到的宝珠梨几丁质酶分子量为28.9kDa，最适pH为5.0，在pH2.5~6.0的范围内稳定，酶的最适反应温度为70°C，在低于70°C温度条件下稳定。
上述制备得到的宝珠梨几丁质酶可将胶体几丁质水解为几丁二糖、几丁三糖和N-乙酰葡萄糖胺，其中几丁二糖为主要降解产物中的应用，并能水解几丁二糖为N-乙酰葡萄糖胺的功能。
上述制备得到的宝珠梨几丁质酶能抑制尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、绿色木霉、水稻纹枯菌、腐皮镰孢菌等真菌致病。
本发明的有益效果是：本发明提供一种特异性高，工艺简单，蛋白不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低的宝珠梨几丁质酶纯化方法，同时研究了纯酶的酶学特性、水解特性及抑菌特性，为该酶的应用提供了一定的理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶纯化过程电泳图；
图2是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶最适pH测试图，
图3是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶pH稳定性测试图；
图4是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶最适温度测试图；
图5是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶温度稳定性测试图；
图6是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶水解胶体几丁质和几丁寡糖（几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖）的水解进程图；
图7是本发明实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶抑制尖孢镰刀菌（a）、灰葡萄孢（b）、绿色木霉（c）、水稻纹枯菌（d）、腐皮镰孢菌（e）致病真菌图。
上述图2、图3、图4和图5中◇为氯化钾/盐酸（pH1.0−2.0）、■为甘氨酸/盐酸缓冲液（pH2.0−3.5）、△为磷酸/柠檬酸缓冲液（pH2.5−5.0）、▲为MES缓冲液（pH4.5−7.0）、●为醋酸缓冲液（pH4.0−5.5）、○为MOPS冲液（pH6.5−8.0），◆为CHES缓冲液（pH8.0−10.0）；
上述图6中a为胶体几丁质水解进程TLC图，b，c，d分别为几丁二糖、几丁三糖及几丁四糖的水解进程TLC图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，对本发明作进一步说明。
下述实施例的主要原料及试剂：N-乙酰葡萄糖、几丁二糖、几丁三糖和几丁四糖购自Megazyme公司；粉末几丁质、壳聚糖和乙二醇壳聚糖（底物）均购自Sigma公司；KCl、MgSO4.7H2O、CaCl2、NaOH、苯酚、CuSO4.5H2O以及酒石酸钾钠等购自北京化工厂；3,5-二硝基水杨酸购自上海远帆制剂厂。
实施例1
该宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其具体步骤如下：
步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度40%，然后放入冰水浴中搅拌1.0h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速率为10000×g）10min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80%，放入冰水浴中搅拌1.0h、冷冻离心（离心速率为10000×g）10min获取沉淀物，将沉淀用20mM、pH7.4、5mL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；
步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF强阴离子交换柱，流速为1.0mL﹒min-1（前后均一致），用含0~100mM NaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液线性洗脱10个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
对实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物进行如下检测及测试：
（一）对上述实施例1制备得到的宝珠梨几丁质酶采用DNS法（Miller.1959）测定酶活力，采用Lowry法（Lowery et al.,1951）测定蛋白质含量，纯化表如表1所示（表中的比酶活=总酶活/总蛋白）。
表1 宝珠梨几丁质酶纯化表
其中酶活力测定方法：几丁质酶活力测定为100μL适当稀释的酶液加入到100μL浓度为10g﹒L-1的胶体几丁质（用50mM、pH5.0 MES缓冲液配置）中，70°C水浴反应30min后采用DNS法测定产生的还原糖量，以葡萄糖为标准。酶活力单位(U)定义为在以上条件下,每分钟反应生成1μmol N-乙酰葡萄糖所需要的酶量。
胶体几丁质参照Lee等（Lee et al.,2007）的方法自制：将10g几丁质称于烧杯中，搅拌着加入100mL浓盐酸，于4°C放置24 h。将被盐酸溶解的糊状几丁质置于研钵中，再加100mL浓盐酸，研磨均匀，加入500mL 50%乙醇，不断搅拌至胶体充分析出。将胶体置于低速离心机，3000rpm离心10min，倒去上清，在胶体中加蒸馏水，搅拌离心，重复此步骤直至pH至7左右。最后将胶体加蒸馏水至浓度4%，4°C保存。
从表1中可以看出纯化产物中几丁质酶含量较高，回收率也较高。
（二）SDS-PAGE法检测蛋白大小
将实施例1得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物用SDS-PAGE法检测蛋白纯度，结果如图1所示，其中泳道标记M为标准品，1为宝珠梨汁，2为40-80%饱和度的硫酸铵沉淀产物，3为经过QSFF纯化后收集的纯化产物，从图1可以看出3为较明显的单一条带，大小为28.9kDa，与已知的几丁质酶的大小一致，进一步说明，得到的纯化产物是几丁质酶。
（三）宝珠梨几丁质酶纯化产物的测序
质谱条件及测定方法：采用ESI-MS/MS法进行几丁质酶（纯化产物）的肽段序列分析，对几丁质酶（纯化产物）进行SDS-PAGE电泳，上样量为10μg，将几丁质酶（纯化产物）条带切下放入试样管中，送往国家生物医学分析中心进行质谱测定。获得的四个肽段的序列分别为，肽段1：VLLSIGGASGSYSLTSADDAR，肽段2：SQVLPTIK，肽段3：YGGVMLWSR，肽段4：WYDINSGYSASIK。经NCBI数据库比对，4个肽段与来源于Pyrus pyrifolia, Malus domestica,Citrullus lanatus等真菌的III型几丁质酶内部肽段具有较高的同源性。因此,该几丁质酶很可能属于III型几丁质酶。
（四）宝珠梨几丁质酶纯化产物的酶学性质、底物特异性及水解特性
1、宝珠梨几丁质酶纯化产物最适pH和pH稳定性检测
宝珠梨几丁质酶纯化产物最适pH的测定：将上述得到的宝珠梨几丁质酶（纯化产物）溶于不同pH值的7种不同缓冲液体系中（氯化钾/盐酸（pH1.0−2.0）、甘氨酸/盐酸（pH2.0−3.5）、磷酸/柠檬酸（pH2.5−5.0）、醋酸（pH4.0−5.5）、MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）（pH 4.5−7.0）、MOPS（3-（N-吗啉基）丙磺酸）（pH6.5−8.0）、CHES（N-2-环已胺基乙磺酸）（pH8.0−10.0）），然后在60°C条件下测定几丁质酶的酶活力，酶活力测定方法同上。
pH稳定性的测定：用上述不同的pH值缓冲液分别稀释纯酶液，将稀释好的酶液置于40°C水浴中分别处理30min，迅速将样品置于冰水中冷却30min，然后测定残余酶活力，酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为对照，最后计算残余酶活力占未处理对照酶活力的百分比。
最适pH及pH稳定性的结果如图2和3所示，从图2和3可以看出，测得宝珠梨几丁质酶纯化产物最适pH为5.0，该酶在pH2.5−6.0的范围内稳定，在pH2.0时，酶活力保持75%以上。说明该酶能够在极酸性pH范围下具有较高的催化能力，适用于几丁寡糖生产，简化几丁寡糖生产中胶体几丁质的处理步骤。
2、宝珠梨几丁质酶纯化产物最适反应温度和温度稳定性检测
宝珠梨几丁质酶纯化产物最适反应温度的测定：将上述得到的几丁质酶（纯化产物）适当稀释于50mM、pH5.0的MES缓冲液中，然后分别在30−90°C下按照上述方法测定几丁质酶的酶活力，酶活力测定方法同上。
宝珠梨几丁质酶纯化产物温度稳定性测定：将宝珠梨几丁质酶纯化产物分别在不同的温度下处理30min，缓冲液为50mM、pH5.0的MES缓冲液，然后置于冰水浴中冷却30min，最后按标准的方法测定残余酶活力，酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为对照。
宝珠梨几丁质酶纯化产物的最适温度及温度稳定性的结果如图4和5所示，该酶的最适温度为70°C，在≤70°C时保持稳定。
3、宝珠梨几丁质酶纯化产物底物特异性测定
底物特异性：选择壳聚糖、粉末几丁质、乙二醇几丁质、乙二醇壳聚糖和羧甲基纤维素为底物，测定酶活，底物终浓度采用1%（w/v）。结果表明该酶仅对胶体几丁质具有活性，对粉末几丁质、壳聚糖以及其衍生物和纤维素均不具有活性。
4、宝珠梨几丁质酶纯化产物水解特性
用50mM，pH5.0MES缓冲液配置1%（w/v）的各种相关底物，在底物中按照0.2UmL-1的量加入由一得到的宝珠梨几丁质酶纯化产物，65°C水解8h，每隔一定时间取样，样品煮沸5min终止水解反应，水解生成的产物通过Kieselgel60（Merck）薄层层析（TLC）法进行定性分析（图6，a为胶体几丁质水解进程TLC图，b，c，d分别为几丁二糖、几丁三糖及几丁四糖的水解进程TLC图，其中M为标准品：C1为N-乙酰葡萄糖胺；C2为几丁二糖；C3为几丁三糖；C4为几丁四糖）。薄层层析的展层系统为正丁醇:乙酸:水=2:1:1（v/v），样品点完后将硅胶板用展层剂展开两次，吹干后用显色。显色方法如下：试剂：对二甲氨基苯甲醛／乙酰丙酮，检出物：氨基糖类。
溶液I：5mL 50％氢氧化钾溶液与20mL无水乙醇混匀，取此溶液0.5mL，加乙酰丙酮0.5mL与正丁醇50mL的混合液10mL，此两种溶液均需新鲜配制，临用前混合；
溶液Ⅱ：1g对二甲氨基苯甲醛溶于30mL无水乙醇中，再加30mL浓盐酸，需要时此溶液可用正丁醇180mL稀释。
定性分析方法：先喷溶液I后于105°C加热5min，再喷溶液Ⅱ，然后于90°C干燥5min。
宝珠梨几丁质酶纯化产物水解特性如图6所示，结果表明水解胶体几丁质，主要产生N-乙酰葡萄糖胺及几丁二糖，并有少量几丁三糖生成。水解几丁三糖和几丁四糖主要产物与胶体几丁质类似，能够一定程度水解几丁二糖生成N-乙酰葡萄糖胺。说明此酶同时具有几丁二糖酶和N-乙酰胺基葡萄糖苷酶活性。
5、宝珠梨几丁质酶纯化产物抗菌特性
菌种绿色木霉（Trichoderma viride）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、腐皮镰孢菌 (Fusarium solani)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、水稻纹枯菌（Rhizoctonia solani）均购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。将真菌接种在直径为9cm的PDA培养皿中心，置于28°C培养，待菌丝向外蔓延的圆面直径约2−3cm时，在离菌丝生长边缘约0.5cm处放置灭菌的牛津杯，在牛津杯中分别滴加约不同量的待测样品（C为20mMol、pH5.0的MES缓冲液；A、B分别为相同缓冲液稀释的50µg和150µg的样品），置28°C下培养1−2d后观察并记录菌丝生长被抑制的情况。抑制致病真菌图如图7所示，宝珠梨几丁质酶对受试菌株均有抑制作用，其中对尖孢镰刀菌（a）有较强的抑制作用，对灰葡萄孢（b）、绿色木霉（c）、水稻纹枯菌（d）、腐皮镰孢菌（e）在几丁质酶含量为150µg时有明显的抑制作用。
实施例2
该制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其具体步骤如下：
步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度20%，然后放入冰水浴中搅拌0.5h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速率为10000×g）15min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为100%，放入冰水浴中搅拌0.5h、冷冻离心（离心速率为10000×g）15min获取沉淀物，将沉淀用20mM、pH8.0、10mL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；
步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF强阴离子交换柱，流速为1.5mL﹒min-1（前后均一致），用含0~100mM NaCl的20mM、pH8.0Tris-HCl缓冲溶液线性洗脱20个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
实施例3
该制备宝珠梨几丁质酶纯化产物的方法，其具体步骤如下：
步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度30%，然后放入冰水浴中搅拌0.75h，搅拌完成后进行冷冻离心（离心速率为10000×g）20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为90%，放入冰水浴中搅拌0.75h、冷冻离心（离心速率为10000×g）20min获取沉淀物，将沉淀用20mM、pH8.5、8mL的Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；
步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF强阴离子交换柱，流速为2.0mL﹒min-1（前后均一致），用含0~100mM NaCl的20mM、pH8.5Tris-HCl缓冲溶液线性洗脱15个柱体积，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物。
以上结合附图对本发明的具体实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (1)

1.一种宝珠梨几丁质酶的纯化方法，其特征在于具体步骤如下：
步骤1、粗酶液的制备：首先将除去梨皮和梨核的梨肉榨汁，榨汁后去除杂质加入固体硫酸铵至饱和度20%~40%，然后放入冰水浴中搅拌0.5~1h，搅拌完成后进行冷冻离心10~20min，取离心上清液并向离心上清液中添加硫酸铵粉末至饱和度为80~100%，放入冰水浴中搅拌0.5~1h、冷冻离心10~20min获取沉淀物，将沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，得到粗酶液；
步骤2、QSFF阴离子交换层析：将步骤1得到的粗酶液用Tris-HCl缓冲液透析，过QSFF强阴离子交换柱，流速为1.0~2.0mL﹒min-1，用含0~100mMNaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液线性洗脱，收集5个柱体积的洗脱液即为宝珠梨几丁质酶纯化产物；
所述步骤1和步骤2中的Tris-HCl缓冲液pH为7.4~8.5，步骤1和步骤2中Tris-HCl缓冲液的加入量分别为5~10mL、10~20个柱体积。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011004398A2 (en) * 2009-07-07 2011-01-13 Camlin Fine Chemicals Limited Preservatives from chitin derivatives
CN103275957A (zh) * 2013-06-09 2013-09-04 福建农林大学 一种扁座壳孢菌几丁质酶的分离纯化方法
CN103409394A (zh) * 2013-07-13 2013-11-27 福建农林大学 一种蜡蚧菌几丁质酶分离纯化的方法
CN103667218A (zh) * 2013-12-06 2014-03-26 中山奈德生物科技有限公司 链霉菌几丁质酶的分离纯化方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011004398A2 (en) * 2009-07-07 2011-01-13 Camlin Fine Chemicals Limited Preservatives from chitin derivatives
CN103275957A (zh) * 2013-06-09 2013-09-04 福建农林大学 一种扁座壳孢菌几丁质酶的分离纯化方法
CN103409394A (zh) * 2013-07-13 2013-11-27 福建农林大学 一种蜡蚧菌几丁质酶分离纯化的方法
CN103667218A (zh) * 2013-12-06 2014-03-26 中山奈德生物科技有限公司 链霉菌几丁质酶的分离纯化方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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植物几丁质酶纯化、测定及应用研究进展;杨海霞 等;《食品工业科技》;20110630;第32卷(第06期);431-434、438

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