CN110563859B

CN110563859B - 抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法及应用

Info

Publication number: CN110563859B
Application number: CN201910888397.5A
Authority: CN
Inventors: 王红梅; 朱秀连; 曾小华; 陈琴华; 黄慧敏; 魏英; 吴最
Original assignee: Hubei University of Medicine
Current assignee: Hubei University of Medicine
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110563859A

Abstract

本发明公开了一种抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法包括以下步骤：步骤1：将壳聚糖溶于甲酸溶液中，得到壳聚糖酸溶液；步骤2：向壳聚糖酸溶液中加入硫酸铜水溶液，在加热条件下络合反应1h后,调节pH值2‑3次，每次调至pH值为7，直至络合反应完全,pH值不再下降，得到产物I；步骤3：将产物I升温后，分批加入亚硒酸水溶液,反应生成产物Ⅱ；步骤4：将产物Ⅱ降温后，加入等体积乙醇至无沉淀产生为止，经过滤、洗涤、干燥，得到亚硒酸酯化壳聚糖铜。还公开了亚硒酸酯化壳聚糖铜在制备抗肿瘤药物中的应用。该方法溶液pH值变化不大，避免铜离子解离以及其他副反应的出现，保证壳聚糖6‑羟基的完全酯化，提高硒化量。

Description

抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法及应用

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法及应用。

背景技术

壳聚糖[chitosan,简称CTS，分子式(C₆H₁₁O₄N)_n，又名壳糖胺、几丁质糖，学名β(1,4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]，分子结构如下：

它是一种碱性生物多糖，具有抗肿瘤、降血脂、抗炎、抗菌等多种生物活性；在酸性条件下带正电，与肿瘤细胞表面的阴离子可以通过吸附放电进行中和，靶向性良好，且无毒性，没有其它不良反应，在食品添加剂中应用广泛。

硒是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，在体内特异地催化还原谷胱甘肽与过氧化物的氧化还原反应，从而保护生物膜免受损害，维持细胞的正常功能。足量硒对维持免疫系统正常是必需的，硒对体液免疫、细胞免疫和吞噬功能均有调节作用，增强机体的免疫功能。硒能增强动物和人的体液和细胞免疫功能，增强T细胞介导的肿瘤特异性免疫，有利于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导，并明显加强CTL的细胞毒活性，还能显著提高吞噬过程中吞噬细胞的存活率和吞噬率。

金属离子铜是人体和动物机体必需的微量元素，参与体内多种酶促反应，涉及蛋白质、核酸、脂肪、激素、能量等代谢，与生命过程密切相关；其作为铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的重要辅助因子和调节因子，以不同的机制在机体防御自由基损伤方面发挥着重要作用。实验表明，去除CuZn-SOD中的Cu后，酶活力全部丧失。

有研究表明壳聚糖的金属螯合物能显著增强壳聚糖的抗氧化、抗菌活性；且铜与硒具有相似的吸收途径和一定的协同作用。为此，本申请发明人利用其在合成有机金属配合物药物分子方面的优势，合成了亚硒酸酯化壳聚糖铜。首先通过铜离子的屏蔽作用，在壳聚糖2-NH₂和3-OH上引入铜离子进行环化，再单一对6-OH进行亚硒酸酯化，可以得到高含硒量和高生物活性的亚硒酸酯化壳聚糖铜。

但在分步反应过程中，第一步反应分离壳聚糖铜，需要消耗大量的乙醇进行沉淀与洗涤；而且在第二步反应，进行亚硒酸酯化过程中，又需要寻找合适的溶剂溶解，不仅造成溶剂的浪费，同时由于酸性条件溶解壳聚糖铜，后期又加入亚硒酸，酸性增加，必须寻找其平衡点，才能保证在酯化反应过程中，不会发生铜离子的解离以及其他副反应的出现。在反应探索阶段，还发现酯化过程中一旦有铜离子发生解离，则亚硒酸也不能反应完全。由此推断，铜离子的络合不仅可以保护氨基，而且还是活化6-羟基的主要因素。也进一步说明，壳聚糖直接与亚硒酸反应，2-氨基与6-羟基参与反应活性不够，不能达到高比例的接枝亚硒酸，因此，硒化量低。这也与现有技术中大部分报道的实验结果吻合。

鉴于试验探究过程中以及现有技术中所存在壳聚糖反应的副产物多，硒化量低的问题，本发明对制备亚硒酸酯化壳聚糖铜采用一锅合成法进行，克服了上述的技术问题；另外，随着副反应的降低，硒化量的提高，可以大大提高其对于肿瘤细胞的抑制作用，为利用亚硒酸酯化壳聚糖铜制备抗肿瘤细胞药物提供可行性。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，可减少酸性溶剂的使用，降低pH值的变化，避免铜离子解离以及其他副反应产生，利于壳聚糖6-羟基完全酯化。

本发明还有一个目的是提供一种由所述的一锅合成法制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜在制备抗肿瘤药物中的应用，相比现有技术，明显抗肝癌细胞的IC₅₀所使用的亚硒酸酯化壳聚糖铜的用量降低，并且大大提高抑制率。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，包括以下步骤：

步骤1：将壳聚糖溶于甲酸溶液中，得到壳聚糖酸溶液；

步骤2：向壳聚糖酸溶液中加入硫酸铜水溶液,在加热条件下络合反应1h后，调节pH值至7，继续反应，待pH值降低时再次调节，如此反复调节pH值2-3次，直至络合反应完全，pH值不再下降,得到产物Ⅰ；

步骤3：将步骤2得到的产物Ⅰ升温后,分批加入亚硒酸水溶液,反应生成产物Ⅱ；

步骤4：将步骤3的产物Ⅱ降温后,加入等体积乙醇至无沉淀产生为止,经过滤、洗涤、干燥，得到亚硒酸酯化壳聚糖铜。

优选的是，步骤1中所述甲酸溶液的质量分数为1％。

优选的是，步骤2中所述硫酸铜水溶液中硫酸铜与所述壳聚糖的摩尔比为1：1。

优选的是，步骤2中用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节。

优选的是,步骤2中的反应温度为60-70℃；

步骤3中升温之后的温度为75-85℃；

步骤4中降温至室温。

优选的是,步骤3中所述亚硒酸与所述壳聚糖的摩尔比为1：1。

优选的是,所述亚硒酸分5批滴加，每次滴加完毕后，保温反应30min，待所有亚硒酸滴加完毕，继续反应2-3h，直至亚硒酸反应完全。

优选的是，步骤4中用体积分数为50％乙醇洗涤沉淀2-3次。

本发明还提供一种由所述的一锅合成法制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜。

本发明还提供一种由所述的亚硒酸酯化壳聚糖铜在制备抗肿瘤药物中的应用，应用于制备抗肝癌细胞药物中，所述亚硒酸酯化壳聚糖铜抑制抗肝癌细胞的IC₅₀为20.3mg/L。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明以壳聚糖、硫酸铜为原料，甲酸为溶剂在加热反应条件下进行络合反应，可以将2-氨基和3-OH上引入铜离子进行环化保护，同时由于随着络合反应进行酸性降低，可能促使铜离子和氨基降解，而通过调节pH始终处于中性环境条件下，可以防止铜离子和氨基降解，利于单一对6-OH进行亚硒酸酯化反应；另外，络合反应后，不分离中间体，减少了酸性溶剂的溶解，并且通过分批缓慢滴加亚硒酸，以及前期络合反应中生成的甲酸/甲酸钠缓冲对的缓冲作用下，即使是加入亚硒酸后反应溶液的pH值变化也不大，避免酸性条件溶解壳聚糖铜，后期又加入亚硒酸，导致酸性增加，促进壳聚糖铜的解离，阻止亚硒酸的酯化反应。此外，亚硒酸酯化后的产物，加入等体积乙醇，还能保证只能沉淀与壳聚糖结合后的化合物，不会沉淀其他盐类产物，如溶液中可能存在的铜离子以及亚硒酸所成的盐类化合物或钠盐；并且通过反应完成后，必须鉴定溶液中没有游离的铜离子和亚硒酸(或亚硒酸根)存在，保证反应的充分进行，杜绝其他副反应的发生(如解离反应、以及解离后氨基参与亚硒酸化的反应等)，前后各步骤的协同作用，可充分保证壳聚糖6-OH的完全酯化，以及所形成的亚硒酸酯化壳聚糖铜的纯度。

本发明可以实现络合反应与酯化反应串联一锅进行，无中间体分离，减少溶剂和助溶剂使用量，溶液pH值更易控制，且酯化过程中不会发生络合铜离子的解离，导致副产物的出现，比分步反应更绿色，也更为省时省力，利于保证6-OH的完全酯化，该方法简便易操作，克服现有技术中副反应多、硒化量低的问题，可以得到大量的单一6-OH酯化的亚硒酸酯化壳聚糖铜，并且还能应用于制备肿瘤细胞的药物中，尤其是制备抗肝癌细胞药物中，可以大大降低抑制肝癌细胞所使用的亚硒酸酯化壳聚糖铜的用量，还提高了对肝癌细胞的抑制率。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明壳聚糖铜IR图；

图2为本发明亚硒酸酯化壳聚糖铜IR图；

图3为本发明实施例1制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜对HepG2细胞体外增殖抑制作用；

图4为本发明亚硒酸酯化壳聚糖铜与硒酸壳聚糖对HepG2细胞体外增殖抑制作用对比图(48h)。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，其合成路线图如下：

实施例1抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法

将9.0g壳聚糖(分子式(C₆H₁₁O₄N·H₂O)n，相当于壳聚糖单体50mmol)溶解于700mL质量分数1％的甲酸溶液，再加入12.5g五水硫酸铜(即：50mmol五水硫酸铜)的水溶液，在60-70℃搅拌反应1h后，用质量分数10％的氢氧化钠水溶液调节反应液的pH值至7，搅拌反应1h待pH值降低后，再次用10％的氢氧化钠水溶液调节反应液的pH值至7，继续反应；如此反复2-3次，至pH值不再下降，络合反应完全(其鉴定方法为：取2mL溶液加2mL乙醇沉淀产物，取上层清液滴加氢氧化钠溶液鉴定无铜离子存在)；

络合反应完全后，升温至75-85℃，分批滴加亚硒酸(总量50mmol，含二氧化硒5.6g)的水溶液，分5次加入，每次滴加完毕，保温反应30min。待所有亚硒酸滴加完毕，继续反应2-3h，直至亚硒酸反应完全(其鉴定方法为：取2mL溶液加2mL乙醇沉淀产物，取上层清液滴加稀硫酸酸化的硫酸铁溶液鉴定无亚硒酸根存在)。降温后，加入等体积乙醇至无沉淀产生为止，过滤，用质量分数50％乙醇洗涤沉淀2-3次，干燥得18.3g亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品。

对比例1抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法

将9.0g壳聚糖(分子式(C₆H₁₁O₄N·H₂O)n，相当于壳聚糖单体50mmol)溶解于700mL质量分数1％的甲酸溶液，再加入12.5g五水硫酸铜(即：50mmol五水硫酸铜)的水溶液，控制反应温度在60-70℃，搅拌反应1h，并分批滴加亚硒酸(总量50mmol，含二氧化硒5.6g)的水溶液，分5次加入，每次滴加完毕，保温反应30min。待所有亚硒酸滴加完毕，继续反应2-3h，直至亚硒酸反应完全(其鉴定方法为：取2mL溶液加2mL乙醇沉淀产物，取上层清液滴加稀硫酸酸化的硫酸铁溶液鉴定无亚硒酸根存在)。降温后，加入等体积乙醇加入等体积乙醇至无沉淀产生为止，过滤，用质量分数50％乙醇洗涤沉淀2-3次，干燥得13.9g亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品。

对比例2抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法

将9.0g壳聚糖(分子式(C₆H₁₁O₄N·H₂O)n，相当于壳聚糖单体50mmol)溶解于700mL质量分数1％的甲酸溶液，再加入12.5g五水硫酸铜(即：50mmol五水硫酸铜)的水溶液，控制反应温度在75-85℃，搅拌反应1h，并分批滴加亚硒酸(总量50mmol，含二氧化硒5.6g)的水溶液，分5次加入，每次滴加完毕，保温反应30min。待所有亚硒酸滴加完毕，继续反应2-3h。降温后，加入等体积乙醇至无沉淀产生为止，过滤，用质量分数50％乙醇洗涤沉淀2-3次，干燥得14.3g亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品。

对比例3抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法

将将9.0g壳聚糖(分子式(C₆H₁₁O₄N·H₂O)n，相当于壳聚糖单体50mmol)溶解于700mL质量分数1％的甲酸溶液，再加入12.5g五水硫酸铜(即：50mmol五水硫酸铜)的水溶液，并加入亚硒酸(总量50mmol，含二氧化硒5.6g)的水溶液，控制反应温度在75-85℃，直至亚硒酸反应完全(其鉴定方法为：取2mL溶液加2mL乙醇沉淀产物，取上层清液滴加稀硫酸酸化的硫酸铁溶液鉴定无亚硒酸根存在)。降温后，加入等体积乙醇至无沉淀产生为止，过滤，用质量分数50％乙醇洗涤沉淀2-3次，干燥得11.5g亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品。

对比例4抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法

与实施例1的区别在于：控制反应温度在在60-70℃，搅拌反应1h(不调节pH值)，并分批滴加亚硒酸(总量50mmol，含二氧化硒5.6g)的水溶液，升温至75-85℃；其他步骤均同对比例1。

该对比例经干燥后得干燥的12.1g亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品。

对比例5抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法

与实施例1不同之处在于：络合反应完全后，升温至75-85℃，加入亚硒酸(总量50mmol，含二氧化硒5.6g)的水溶液(即不分批加入亚硒酸)，直至亚硒酸反应完全；其他步骤均同实施例1的步骤。

该对比例经干燥后得干燥的12.7g亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品。

从上述的实施例1以及对比例1-4可以看看出，分阶段升温、络合反应阶段pH值、添加亚硒酸的时机及方式等因素，都直接影响着亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品含量的提高，间接也能反映其各因素对于减少副反应发生的作用，副反应减少也就相应提高了主反应壳聚糖6-OH的硒量化，因此，从上可看出本发明采用一锅合成法，克服了现有技术中副反应多、硒量化低的问题，使所得亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品可达18.7g，比现有技术的合成方法大有提升。

实施例2壳聚糖铜和实施例1中制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜的IR图谱比对

比较壳聚糖铜[按文献(王爱勤等，甲壳胺与Cu(Ⅱ)配合物的合成与表征[J],2000(03):297-300)制备壳聚糖铜的方法进行制备]和实施例1所制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品的IR图，结果如图1和图2所示，图2亚硒酸酯化壳聚糖铜IR图中易看出：相比图1壳聚糖铜的IR图谱，在713cm-1处观察到很强的亚硒酸酯的Se＝O双键的振动峰，游离羟基峰(3390cm-1)消失，并且在游离羟基被完全亚硒酸酯化后，没有游离羟基的影响，化合物中络合羟基与氢氧根可以清晰出峰(3502cm-1、3190cm-1和2897cm-1)，由此证实，壳聚糖铜的硒化位点在6-羟基；同时，也可确定壳聚糖铜的氨基在硒化反应过程中未发生去保护参与反应，防止了副反应的发生。这些进一步验证了6-羟基亚硒酸酯化壳聚糖铜的结构。通过进一步的铜、硒含量的测定发现，实施例1所制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品的铜含量为13.32％，硒含量为15.81％。说明产品不仅提高了硒化量，而且也保证了接枝铜硒摩尔比约为1:1。

从上述方法可看出，文献中制备壳聚糖铜的方法，是将络合反应与亚硒酸酯化反应分步进行，第一步反应分离壳聚糖铜，需要消耗大量的乙醇进行沉淀与洗涤，且产品中会附着铜离子，需要大量溶剂洗涤干净，后续还需要用丙酮洗涤产品；而且在第二步反应，进行亚硒酸酯化过程中，又需要用甲酸溶液溶解壳聚糖铜，不仅造成溶剂的浪费，同时由于酸性条件溶解壳聚糖铜，后期又加入亚硒酸，酸性增加，必须寻找其平衡点。因为在酯化过程中，我们发现一旦在加入亚硒酸时没有控制好量和加入速度，就会有铜离子发生解离，后期即使延长反应时间，亚硒酸也不能反应完全；而只有快速搅拌下，将亚硒酸溶液一次性快速全部倒入反应液中，才能保证酯化反应完全，且没有铜离子解离。而经过多次对比反应，特别是分批加入亚硒酸溶液或缓慢滴加亚硒酸溶液，都没能成功获得亚硒酸完全反应的产物，这也侧面反映本发明各步骤之间的协同作用，以及一锅法合成亚硒酸酯化壳聚糖铜的可避免上述问题的出现，可以更好的得到单一的6-OH酯化的亚硒酸酯化壳聚糖铜。

实施例3亚硒酸酯化壳聚糖铜的抗肝癌活性测试

将人肝癌细胞HepG2培养在含10％胎牛血清、青霉素链霉素各为100U/mL的DMEM培养基中，在CO2浓度为5％的37℃培养箱中培养[15]。每隔1天～2天或在培养基变为浅黄色时换一次液。当细胞生长至占瓶底面积的80％时，进行细胞传代。在超净台内操作，先弃去旧培养基，用生理盐水轻轻洗2次后，加入适量胰蛋白酶-EDTA消化，在显微镜下观察到细胞变圆后，迅速加入新的培养基，终止消化。用移液枪将细胞吹下，转于离心管中，在1 000r/min转速下离心5min，弃去上清，新培养基重悬后，用血球计数板进行细胞计数，最后按合适比例传代。

96孔板培养：取对数生长期HepG2细胞加入96孔板中，每孔约4 000～5 000个细胞共100μL，待细胞生长至70％～80％并具有多于90％的细胞存活率时，向96孔板中加入亚硒酸酯化壳聚糖铜溶液或硒酸壳聚糖溶液，使终浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和500μg/mL(同时以不加亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品的细胞液为对照)，培养24h(或48h)，于培养结束之前4h加入20μL MTT，再培养4h后离心，终止后弃去孔内的上清液，每孔加入150μL DMSO，然后将其置于震荡器上震摇10min。待孔内的结晶物溶解之后，立即用酶标仪在波长490nm处对吸光度进行测定。计算抑制率及用SPSS软件计算IC₅₀值。抑制率计算如下：

抑制率/％＝(OD1-OD2)/OD1×100

式中：OD1为空白组细胞吸光值；OD2为加药组细胞吸光值。

结果如图3所示，随着时间和剂量的增加，当添加亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品的浓度为50ug/mL，培养48h时，肝癌细胞HepG2存活率仅有25％；当添加亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品的浓度为200ug/mL，培养24h或48h时，肝癌细胞HepG2存活率都在10％以下；由图3可看出，亚硒酸酯化壳聚糖铜纯品对于肝癌细胞HepG2体外增值具有较好的抑制作用，对于在制备抑制肝癌细胞的药物中的应用具有广阔的推广价值和指导意义。

实施例4

为了证实本发明所制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜具有更好的抑制肝癌细胞HepG2体外增值的作用，本发明将现有技术中常用的硒酸壳聚糖(制备方法及活性鉴定详见文献：纪海玉等，HepG2细胞滚瓶培养工艺优化及硒酸売聚糖对其抑制作用[J]，2018,(3),234-238.)进行比对，分别采用亚硒酸酯化壳聚糖铜和硒酸壳聚糖作用于肝癌细胞HepG2体外增值48h，结果如图4所示。

结果显示：作用48h，本发明实施例1所制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜抑制HepG2细胞的IC₅₀值为20.3mg/L，且其50mg/L的作用浓度对HepG2细胞的抑制率可达87％；而硒化壳聚糖抑制HepG2细胞的IC₅₀值为167.3mg/L，且其高达800mg/L的作用浓度对HepG2细胞的抑制率也仅有70％。

可见，相比现有技术中采用硒酸壳聚糖抑制肝癌细胞HepG2体外增值，本申请一锅合成法制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜能够大大提高对于HepG2细胞的抑制作用，对于将此化合物用于制备防治HepG2细胞增殖的药物中具有重要的临床依据和推广意义。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法,其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将壳聚糖溶于甲酸溶液中，得到壳聚糖酸溶液；

步骤2：向壳聚糖酸溶液中加入硫酸铜水溶液，在加热条件下络合反应1h后，调节pH值至7，继续反应，待pH值降低时再次调节,如此反复调节pH值2-3次，直至络合反应完全，pH值不再下降，得到产物Ⅰ；

步骤3：将步骤2得到的产物I升温后，分批加入亚硒酸水溶液，反应生成产物Ⅱ；

步骤4：将步骤3的产物Ⅱ降温后，加入等体积乙醇至无沉淀产生为止，经过滤、洗涤、干燥，得到亚硒酸酯化壳聚糖铜。

2.如权利要求1所述的抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，其特征在于，步骤1中所述甲酸溶液的质量分数为1％。

3.如权利要求1中所述的抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法,其特征在于，步骤2中所述硫酸铜水溶液中硫酸铜与所述壳聚糖的摩尔比为1：1。

4.如权利要求1中所述的抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，其特征在于，步骤2中用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节。

5.如权利要求1中所述的抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，其特征在于，步骤2中的反应温度为60-70℃；

步骤3中升温之后的温度为75-85℃；

步骤4中降温至室温。

6.如权利要求1中所述的抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，其特征在于，步骤3中所述亚硒酸与所述壳聚糖的摩尔比为1：1。

7.如权利要求1中所述的抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法,其特征在于,所述亚硒酸分5批滴加，每次滴加完毕后，保温反应30min，待所有亚硒酸滴加完毕，继续反应2-3h，直至亚硒酸反应完全。

8.如权利要求1中所述的抗肝癌药物亚硒酸酯化壳聚糖铜的一锅合成法，其特征在于，步骤4中用体积分数为50％乙醇洗涤沉淀2-3次。

9.一种由权利要求1-8任一项所述的一锅合成法制备的亚硒酸酯化壳聚糖铜。

10.一种由权利要求9所述的亚硒酸酯化壳聚糖铜在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，应用于制备抗肝癌细胞药物中，所述亚硒酸酯化壳聚糖铜抑制抗肝癌细胞的IC₅₀为20.3mg/L；所述肝癌细胞为HepG2细胞。