KR102000139B1 - 키토산-미네랄 복합체를 포함하는 보조사료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산-미네랄 복합체를 포함하는 보조사료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 특정 미네랄 조합과 특정 크기의 키토산을 소정의 비율로 혼합함으로써 키토산과 미네랄의 생체 흡수율 및 면역증강 효과가 상승된 보조사료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 보조 사료는 기존의 사료에 비해 온도 조건에 영향을 받지 않으면서 고용량의 활성화 미네랄의 용해성과 안정성이 일정하게 유지되기 때문에 음수에 첨가하여 축사에 공급함으로써 사료 첨가대비 2배 이상 체내 흡수율이 증가되는 우수한 효과가 있다.

Description

키토산-미네랄 복합체를 포함하는 보조사료 조성물 및 이의 제조방법{Composition of supplementary feed comprising chitosan-mineral complex and preparing method thereof}

본 발명은 킬레이트 공법을 이용한 키토산-복합미네랄 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

보조사료는 배합사료에 첨가하여 축산물의 소화력, 생리활성, 성장촉진, 면역증강 등 기능성을 개선하기 위하여 사용하는 첨가제 등을 말하는 것으로 축산업은 보편적으로 가축의 성장을 촉진하고 가축의 질병을 예방하거나 치료할 수 있는 항생물질을 사용하고 있으나(Guo, F. C. et al., 2004, Effect of a Chinese herb medicine formulation, as an alternative for antibiotics, on performance of broilers, Br Poult Sci., 45, 793-797), 항생 물질을 빈번하게 사용하게 되면 내성을 가지는 미생물이 증가하여 그 항생 물질의 효능이 떨어지거나, 축산물 중에 잔류하게 되어 인체에 악영향을 초래할 수 있다는 점에서, 항생제의 사용이 점차 규제되고 있다(Chae, M. H. et al., 2011, Antimicrobial resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from food animals and raw meats in slaughterhouse in Korea during 2010, Kor. J. Vet. Publ. Hilth., 35, 239-245).

인체나 가축에 절대적으로 필요한 5대 영양소 중 하나인 미네랄의 물리·화학적 및 생물학적 연구는 최근 가축의 사료연구에 초점을 두고 많은 연구가 이루어지고 있다. 과거에는 무기태 미네랄이 동물의 사료 첨가제로 많이 사용되었으나 가축 체내에서의 이용률은 20~30%에 불과하고 나머지는 분뇨로 배설되기 때문에 자원낭비 및 환경오염 문제를 초래하였다. 이에 단백질 또는 탄수화물과 같은 유기 화합물과 킬레이트 결합된 킬레이트화(chelated) 미네랄이 이용되어 왔고 이들의 체내 흡수 이용률은 70~80%로 상당히 높은 것으로 보고되었으며(Kratzer and Vohra, 1986) 이러한 킬레이트화 미네랄의 다양한 제조방법이 공지되어 있다(US2877253, US5061815, US5504055, US6458981 B1, US7087775 B2, US7375243 B2, US2008/0248583 A1).

한편, 키토산은 D-글루코사민과 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 선형 다당류로 항균작용, 혈중 콜레스테롤의 저하 작용, 지방의 저하 작용, 중금속 해독작용 면 증강작용 등 다양한 기능을 가지고 있기 때문에 의료용 재료나 기능성 식품 재료로 이용되고 있다. 그러나 키토산은 물에는 녹지 않는 불용성이어서 분말상태로 사용하면 동물이나 사람의 생체 내에서 쉽게 흡수되지 못하게 되어 키토산이 갖는 생리활성에 대한 효과가 미비하다는 문제점이 있다. 따라서 동물사료용이나 식품용으로 사용하기 위해서는 키토산을 수용화시켜 사용하는 것이 요구된다.

그러나 시판중인 대다수의 가축 면역증강제는 비타민, 미네랄, 생균제 등의 분말형태를 가지며 사료첨가용으로 사용되고 있어 음용수 투여 대비 흡수율이 낮고, 음용수 투여를 위해 물에 용해 시킬 경우 낮은 용해도 및 불균일성으로 인해 생체 흡수력 저하, 니플 막힘 등의 문제점을 내포하고 있다.

키토산 및 미네랄을 이용한 관련 기술을 보면 특허문헌 0001(KR 10-2001-0066982)은 저분자키토산을 유기산에 용해시킨 용액에 아연, 구리 또는 크롬을 첨가하여 킬레이트하여 키토산-금속킬레이트 물질을 합성하는 방법을 제시하고 있다. 그러나 상기 특허문헌 0001에 의해 제조된 고형화된 제제는 음용수 투여 방식으로 적용시 낮은 용해도 때문에 분산제, 현탁제 또는 안정화제가 추가적으로 요구된다는 단점이 있다.

특허문헌 0002(KR 10-0814012)는 키토산을 이용하여 셀레늄을 결합시킨 후 키토산 분해효소로 분해하여 키토올리고당 형태의 키토산-셀레늄 복합체의 제조방법을 제시하고 있다. 그러나 이는 다양한 미네랄 원소에 대한 적용이 아니고, 제조 공정이 다소 복잡하고 많은 비용 및 노력이 소요되는 문제점을 내포하고 있다.

따라서 키토산과 다양한 미네랄을 생체 흡수율이 높은 상태로 공급하기 위한 수용성 키토산-복합 미네랄을 제공하는 방법이 요구되는 실정이다.

대한민국 공개특허공보 제10-2001-0066982호 대한민국 등록특허공보 제10-0814012호

본 발명자들은 항생제를 대체할 수 있는 가축용 면역증강제를 개발하고자 지속적으로 연구 노력한 결과, 특정 종류의 미네랄의 조합을 키토산으로 활성화 시켰을 때 수용액 상에서 높은 용해성과 안정성을 가짐과 동시에 세포독성 없이 가축의 질병을 억제하고 생장을 촉진한다는 것을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 음용수 투여를 목적으로 하는 액상 보조사료의 유효성분으로서 물에 대한 수용성 및 장기간 저장안정성이 우수할 뿐만 아니라 생체 흡수율 및 면역반응에 효율적인 구조를 갖는 키토산-미네랄 복합체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 키토산-미네랄 복합체를 유효성분으로 함유하는 액상의 보조사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코발트, 바나듐 및 셀레늄으로 이루어진 복합 미네랄 및 미네랄에 킬레이트된 키토산을 포함하는 보조사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 정제수를 교반하면서 키토산을 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 제1단계; 상기 제1단계에서 얻은 키토산 용액을 교반하면서 황산바나듐, 황산코발트 및 산화셀레늄을 순차적으로 투입한 후 반응시켜 복합이온미네랄과 키토산의 금속 킬레이트 반응을 유도하는 제2단계; 상기 제2단계가 진행된 용액에 유기산을 첨가하는 단계; 상기 제3단계가 진행된 용액의 상층부를 취하는 제4단계를 포함하는 보조사료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 3종 미네랄 복합체와 키토산을 포함하는 보조사료 조성물은 세포독성 없이 가금류의 질병을 예방하고 폐사율을 감소시키는 효과가 있다.

본 발명은 특정 비율로 복합이온미네랄과 키토산의 금속 킬레이트 반응이 진행된 용액 그 자체를 액상 제제로 사용함으로써 용해성, 균일성 및 안정성이 현저하게 우수한 효과를 나타낸다.

또한, 특정 분자량의 키토산을 선택 사용함으로써 수용액에서 킬레이트 반응성이 극대화되는 동시에 면역증강 효과를 극대화시킬 수 있게 된다.

아울러, pH와 온도 조건에 영향을 받지 않고 키토산-미네랄 복합체의 용해성과 균일성이 일정하게 유지되기 때문에 음용수에 첨가하더라도 니플 막힘 현상 없이 지속적으로 편리하게 축사에 적용할 수 있으며, 사료 첨가대비 2배 이상 체내 흡수율이 증가되는 우수한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 조성물을 음용수에 첨가하여 축사에 적용하기 위해 필요한 자동 투약 장치를 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 유기산의 첨가에 따른 키토산-복합 미네랄 킬레이트의 용해성 및 안정성을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 키토산-복합 미네랄 킬레이트의 합성 과정을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 보조사료 조성물과 비교예의 조성물의 세포독성을 비교한 그래프이다.

본 발명은 종래 비타민, 미네랄, 식물추출물, 생균제 등의 고형화된 제제를 사료첨가용으로 사용하였던 통념을 깨고, 유기 활성화된 복합 미네랄이 안정적이고 균일하게 용해되어 있는 고농축 액상 제제를 음용수에 첨가 및 투여함으로써 기존의 사료를 통한 흡수율보다 2배 이상의 높은 흡수율을 보이며, 안정성(용해도, 균일성 등)이 높고 적용의 편리성과 질병방어 효능을 극대화 시킬 수 있는 새로운 개념의 면역증강용 보조사료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 킬레이트 공법을 이용하는 것에 특징이 있다. 무기질인 미네랄 외부를 고분자 유기질로 둘러싸 킬레이트화 시키면 세포가 무기질인 미네랄을 유기질로 인식하여 체내 흡수율을 높인다. 본 발명자들은 저분자 완충제와 단일 금속을 킬레이트화 시켰던 종래 기술과 달리 고분자 내에 복합 미량미네랄을 함유하도록 하여 음용수 제제로서 생체 내에 균일한 미네랄 공급이 가능한 새로운 개념의 보조사료 조성물을 개발하고자 하였다.

그런데 고분자 완충제는 세포독성과 킬레이트 반응을 위한 용해성과 반응 후 생체 흡수성의 문제, 특히 미네랄과 완충제의 비율에 따른 용해성과 흡수성이 고려되어야 한다. 이에 본 발명자들은 천연물질인 키토산을 킬레이트 반응을 위한 고분자 완충제로 선정하였다.

본 발명에서 사용되는 '키토산'은 게 껍질 등에 존재하는 키틴을 탈아세틸화하여 얻은 폴리글루코사민으로서 체내에서 거부반응이 일어나지 않으며, 성장촉진, 면역증강, 생리활성, 병원성 세균증식의 억제, 폐사율 감소, 소화기능 강화, 해독작용 등의 특성이 있어서 고분자의 세포독성 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라 미네랄과 함께 사용되어 면역증강 효과를 상승적으로 유도할 수 있게 된다.

일반적으로 키토산은 분자량과 탈아세틸화도, 수용성화 정도에 따라 그 효능의 차이가 매우 크다. 분자량이 그다지 크지 않는 키토산 올리고당의 경우에는 고분자량의 키토산에 비하여 면역 증강력이 떨어지는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 이러한 키토산의 분자량이 5,000 내지 50,000 Kda 인 것을 사용한다는 데에 특징이 있다. 키토산은 분자량이 작을 경우에는 면역증강 효능이 저하되고 미네랄과의 킬레이트 반응성이 저하되고, 너무 높은 경우에도 수용성화에 한계가 있어 미네랄과 킬레이트 반응성이 떨어지거나 체내흡수율이 저하될 수 있다. 가장 바람직하게는 5,000 내지 10,000의 분자량을 갖는 경우가 체내 흡수율과 이용율이 가장 극대화된다.

또한, 본 발명의 키토산은 탈아세틸화도가 60~80%인 것이 바람직하고 탈아세틸화도가 70%인 것이 가장 바람직하다.

한편, 본 발명의 보조사료 조성물의 성상은 액상이며 수용액이기 때문에 키토산이 물에 수용액 상태로 녹기 위해서는 전하 또는 극성 기능기가 필요하지만, 체내에 흡수될 때에는 지용성의 성질을 가지고 있어야 흡수가 잘된다. 구체적으로 키토산의 경우 미네랄과 킬레이트 할 수 있는 기능기는 약 30-40개 정도이므로 수용성과 지용성을 고려하여 모든 기능기를 사용하지 않고, 적당한 비율을 정하여 물에 대한 용해성과 체내흡수성을 조절할 필요가 있다.

이에 본 발명에서는 키토산의 용해성과 흡수성을 고려하여 키토산의 면역증강 효과를 상승시킬 수 있는 미네랄을 선정하기 위하여 미네랄 후보군으로 아연, 구리, 셀레늄, 철, 마그네슘, 망간, 인, 칼륨, 칼슘, 나트륨, 몰리브덴, 코발트 등의 각 특징 및 역할에 대해 문헌조사 및 현장조사를 통해 면역력 강화 물질을 탐색 및 선발하고자 노력하였다.

수용성 키토산-복합미네랄 킬레이트를 합성하기 위하여 미네랄의 조합을 선발하고 미네랄과 키토산의 비율을 정하는 방법은 다음과 같다.

1단계로 용해도 차이, 미네랄 함량 및 미네랄/완충제 비율을 정해야 한다. 미네랄의 용해도 차이를 비교하면 다음과 같았다. VOSO₄, CuSO₄(5H₂O) > MnSO₄ > NiSO₄(7H₂O) > CoSO₄(7H₂O) > ZnSO₄(7H₂O) > SeO₂ > CrSO₄(5H₂O) > MoO₃. 따라서 낮은 용해도 미네랄의 석출을 막기 위해 순차적으로 낮은 용해도의 미네랄부터 고분자 완충제와 반응을 시킨다. 미네랄 간의 함량은 일일 권장량에 준하여 보면 Zn(12mg), Mn(2mg), Cu(1.5mg), Se(0.05mg), Mo(0.025mg), V(0.015mg), Co(0.01mg)이므로 이 비율에 따라 선택된 복합미네랄제제를 정한 뒤, 그 복합미네랄과 고분자 완충제의 비율(미네랄: 키토산 = 0.3-0.5 : 1)에서 합성을 시작한다.

2단계에서는 적합한 반응의 조건을 찾기 위해서 반응온도와 반응시간에 따르는 킬레이트 정도를 측정하여야 한다. 처음에는 상온에서 반응의 정도와 시간을 측정하고 온도를 높여야 하는 상황이면 15 ^oC씩 올리면서 반응의 정도를 알아본다. 그 반응의 정도는수용액 속에 남아있는 무기미네랄양이 많으면 여과나 dialysis를 통하여 고분자 완충제가 없는 수용액을 ICP-AES(유도결합플라즈마 원자방출분광기)로 미네랄의 양들을 측정하지만, 반응이 종료되는 시점에서는 수용액 속의 무기미네랄양은 너무 미량이라 고분자 완충제와 킬레이트 되어있는 미네랄 양을 측정해야 한다. 만약 고체가 석출이 되는 현상이 있으면 복합미네랄/고분자 완충제의 비율을 하향 조정하여 다시 실시하며, 그 반대의 경우인 고체 잔여물이 없다면 복합미네랄/고분자 완충제의 비율을 높여서 반응을 실시한다.

3단계로 반응이 종료되면 만약 미네랄들이 남아 있는지를 다시 한번 확인하기 위하여 여과나 dialysis를 통하여 잔여 무기미네랄을 제거한 후 ICP-AES로 미네랄의 양들을 측정하였으며 같은 조건하에서 수차례 실험을 통하여 확인하였다.

상기와 같은 과정을 통해 본 발명의 보조사료 조성물은 셀레늄, 코발트 및 바나듐으로 이루어진 복합 미네랄 및 미네랄에 킬레이트된 키토산을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 보조사료 조성물은 키토산 0.05~1.5 중량부, 코발트 0.1~0.3 중량부, 바나듐0.05~0.15 중량부, 셀레늄 0.1~0.35 중량부를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 보조사료 조성물의 함량비에 있어서, 키토산이 과량이면 키토산의 체내 흡수율이 저하되고, 키토산이 너무 소량이면 활성화되는 미네랄의 양이 줄어들어 미네랄의 생체 이용율이 떨어지게 된다. 또한, 복합 미네랄 중 어느 성분의 함량이 상기 범위를 벗어나면 키토산과 킬레이트 되지 않고 결정으로 석출되어 보조사료의 효율이 저하되는 문제가 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 보조사료 조성물은 구연산을 더 포함하는 것이 바람직하다. 키토산이 수용액 상에 완전히 용해되기 위해서는 액성이 pH4 이하로 유지될 필요가 있고, 이를 위해 초산, 옥살산, 구연산의 유기산을 사용할 수 있다. 일반적으로 키토산을 용해시키는 경우 아세트산을 사용하는 것이 가장 안정성이 높다고 알려져 있으나 본 발명의 실험예 1에 의하면 키토산을 완전하게 용해시키기 위해서는 아세트산이 과량 요구되었으며, 맑은 수용액 상태가 되더라도 시간이 지나면 침전물이 생성되었다. 또한, 옥살산은 과량 사용해도 맑은 수용액이 생성되지 않아 키토산을 완전하게 용해시키기 위해서는 구연산을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구연산의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.2~0.6 중량%인 것이 바람직하다. 상기 구연산의 함량이 너무 소량이면 키토산-복합 미네랄 킬레이트가 수용액 상에 충분히 용해되지 않아 침전물이 형성되어 액상 사료의 효율이 떨어지게 되고, 구연산의 함량이 너무 과량이면 키토산의 지용성 성질이 작아지게 되어 오히려 생체 흡수율이 저하되는 문제가 있다.

본 발명은 정제수를 교반하면서 키토산을 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 제1단계; 상기 제1단계에서 얻은 키토산 용액을 교반하면서 황산바나듐, 황산코발트 및 산화셀레늄을 순차적으로 투입한 후 반응시켜 복합이온미네랄과 키토산의 금속 킬레이트 반응을 유도하는 제2단계; 상기 제2단계가 진행된 용액에 유기산을 첨가하는 단계; 상기 제3단계가 진행된 용액의 상층부를 취하는 제4단계를 포함하는 보조사료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유기산은 구연산인 것이 바람직하고, 본 발명에서는 키토산 용액을 제조하는 제1단계가 아니라, 킬레이트 반응이 진행된 제2단계 용액에 유기산을 첨가하는 것에 특징이 있다.

상술한 바와 같이 유기산을 첨가하는 이유는 키토산을 완전하게 용해시키기 위함인데, 본 발명에서는 유기산을 첨가하지 않은 키토산 용액과 미네랄을 먼저 킬레이트 반응시킴으로써 키토산이 미네랄과 킬레이트 반응할 수 있는 20~30개 정도의 기능기 중에서 적당한 정도만을 사용하여 복합미네랄과 완충제의 비율 조절을 통해 물에 대한 용해성과 체내 흡수성을 조절할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1단계의 키토산 용액을 24±1℃의 상온에서 제조하는 것이 바람직하다. 킬레이트 반응시 온도를 상온으로 유지하지 않는 경우에는 액상 조성물을 상온의 음용수에 적용할 때 킬레이트 반응이 역으로 일어나거나 침전이 형성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 보조사료 조성물은 축산업에서 가축의 면역증강 용도로 사용할 수 있다.

본 발명에서 미네랄과 함께 혼합사용으로 상승효과를 나타내는 순수 천연물질인 키토산은 항균, 면역증강 효과가 우수한 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 키토산과 킬레이트 반응을 통해 선택적으로 활성화된 바나듐, 코발트 및 셀레늄의 효능 및 결핍 현상은 다음과 같다.

바나듐(V)은 조혈기능을 촉진하고, 철의 재생작용, 심장 배당체의 근육에 대한 작용을 촉진하며 심근의 수축력을 증강시킨다. 따라서 바나듐의 결핍은 높은 콜레스테롤병, 혈청 지방의 대사 이상, 빈혈, 동맥경화 및 협심증에 영향을 준다.

코발트(Co)는 비타민 B12의 조성성분이고, 조혈로서 빈혈을 예방하며, 골격, 신경, 위장세포 등의 정상기능에 필수적이다. 코발트가 결핍되면 악성 빈혈증,설염, 식욕부진, 소화불량, 손발이 저리는 현상 및 신경과민을 일으킨다.

셀레늄(Se)은 글루타치온의 과산화물 효소의 조성성분, GSH-RH 활성을 증강, 지질과 산화 막아 세포보호, 항산화작용, 항노쇠 미네랄, 미용 미네랄, 발암 물질과 비소, 카드늄, 수은, 납 등 유독물질이 유기체에 대한 유해를 저항, 항암작용 등의 효능이 알려져 있으며, 암, 심장병, 당뇨, 극산병, 불임증 등 40 여종의 질병은 모두 셀레늄 결핍과 관계되고 셀레늄 결핍시 심근괴사, 장골 발육부진, 관절증조와 동통, 근육수축, 행동불편, 불면증, 암, 소아 급사, 심장병, 치근막염, 정신박약, 동맥경화, 소아심근염, 간세포괴사, 면역력하강, 성기능쇠약, 활력하강, 기관 쇠약, 근력하강, 콜레스테롤 증가를 일으킨다.

본 발명에서는 상기 미네랄들을 세포독성이 낮고 자체적으로도 면역증강 효과가 우수한 키토산을 완충제로 사용하여 유기태화시켜 미네랄의 생체 이용율을 극대화시킨 우수한 효과가 있다(도 4).

또한, 바나듐, 코발트 및 셀레늄으로 이루어진 복합 미네랄과 키토산을 특정 중량비로 킬레이트 반응시킴으로써 키토산과 미네랄의 반응성 및 키토산의 생체 흡수율을 조화시킴으로써 미네랄과 키토산의 면역증강 효과를 상승적으로 유도할 수 있다.

아울러, 본 발명의 액상 조성물에 용해되어 있는 미네랄은 키토산의 완충작용으로 유기태화 되고, 활성화된 상태로 균일하게 음용수에 용해되어 축사에 지속적으로 공급됨으로써 가축의 면역력을 증강시키는 데 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 가금류에 키토산-미네랄 복합체를 포함하는 액상의 보조사료 조성물을 급수에 첨가하여 투여할 수 있고, 바람직하게는 급수 1톤당 3만~ 6만:1의 비율로 첨가하여 투여할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

제조예. 미네랄을 첨가한 음용수의 제조

도 1에 도시된 자동 투약 장치를 사용하여 급수 1톤당 실시예의 조성물을 6만:1의 비율로 첨가혼합한 음용수를 제조하고, 이와 비교하기 위하여 기존의 분말 형태의 미네랄을 혼합한 음용수를 제조한 후 각각의 음용수를 직접 축사에 적용하여, 그 결과를 비교 평가하고 이를 하기 표 1에 나타내었다.

구 분	무기태 또는 고형화 킬레이트 제제	활성화 미네랄 함유 액상 제제
급여형태에 따른 흡수율	-대다수 배합사료 급여 -흡수율 낮음	-음용수적용으로 흡수율 극대화
사용의 편리성 및 지속성	-간헐적 음용수투여 -니플막힘, 낮은 지속성	-365일 지속적인 투여 -물사용량에 비례하여 급여 -전 축사적용의 쉽고 빠른 편리성
물에 대한 용해도	-물에 대한 낮은 용해도 -과다사용 발생초래	-활성화 미네랄이 용해된 액상 제제를 이용하여 상온에서 용해도 및 균일성이 우수
활성화	-처리대상의 벽, 바닥에 대부분 그대로 침전 -저니현상 발생	-물에 대한 용해도 및 저장 안정성이 우수하여 미네랄의 활성화도가 높음
균일성	분균일성	-pH와 온도 조건에 관계없이 균일성 유지
생체 흡수율	-무기태 형태인 경우 흡수방법, 흡수장소, 장내 pH, 음이온 물질과의 결합에 의해 생체 흡수율 낮음 -유기태 형태의 미네랄이더라도 물에 대한 용해도가 낮아 생체 흡수율이 낮음	-활성흡수, 확산흡수, 흡수율 높음 -별도의 이온화 과정없이 위장을 통과한 후 소장에서 최대로 흡수되며, 세포막을 통과하여 혈장으로 흡수 -장내 pH나 기타 방해물질의 영향을 적게 받음

상기 결과로부터 활성화 미네랄을 액상으로 제조한 면역증강용 조성물의 경우 음용수투여를 기반으로 하여 사료를 통한 흡수율보다 2배 이상의 높은 흡수율을 보이며, 기존의 미네랄 분말을 음용수에 적용한 경우에 비해 용해성, 균일성, 생체 흡수력 및 적용의 편리성 등에서 매우 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.

실시예 .

정제수를 배합기에 넣고 서서히 교반 하면서 표 2에 기재된 조성으로 키토산을 첨가하여 용해시킨 후 금속염을 소량씩 첨가하여 키토산-복합 미네랄 킬레이트가 용해된 수용액을 제조한 후 구연산을 첨가하여 키토산-복합 미네랄 킬레이트가 완전히 용해된 수용액을 제조하고자 하였다. 제조된 실시예 1 내지 5의 조성물의 특성은 하기 표 3과 같다.

	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	비교예 1	비교예 2
키토산(키토올리고당)	0.05	1.0	1.0	1.5	1.5	0.05	1.5
황산코발트(CoSO4.7H2O)	0.1	0.2	0.2	0.3	0.3	0.1	0.3
황산바나듐(VOSO4.H2O)	0.05	0.1	0.1	0.15	0.15	0.05	0.15
산화셀레늄(Na2SeO3)	0.1	0.2	0.2	0.35	0.35	0.1	0.35
무수구연산(Citric acid)	0.2	0.3	0.4	0.4	0.5	0.1	0.6
정제수	잔부	잔부	잔부	잔부	잔부	잔부	잔부
합 계	100	100	100	100	100	100	100

(단위: 중량부)

키토산-미네랄 킬레이트
온 도	p H	비 중	성 상
23.2	4.5	1.01	맑은 갈색의 액체

실험예 1. 유기산의 종류에 따른 킬레이트 반응성 및 용해성 확인(도 2)

정제수에 키토산 및 키토산의 중량에 대해 50% 이상의 중량으로 미네랄을 첨가하여 키토산-미네랄 수용액을 제조하였다. 그러나 완전하게 킬레이트이 이루어지지 않고 불투명하고 침전물이 생기므로 하기 표 4과 같이 다양한 유기산을 첨가하여 맑은 수용액 상태로 용해성을 높이고자 하였다.

구분	키토산+3종미네랄+유기산	수용액 상태	비 고
1	키토산(10g)+3종미네랄+구연산	O	구연산 3.8g 첨가-> 맑은상태->Dialysis 결과 맑은 수용액상태
2	키토산(10g)+3종미네랄+아세트산	O -> X	아세트산 13.84ml 첨가-> 맑은상태-> Dialysis 결과 고체 생성
3	키토산(10g)+3종미네랄+옥살산	X	옥살산 39g 첨가-> 완전한 수용액상태가 아님

그 결과, 구연산을 첨가한 실험군이 적은 양으로도 맑은 수용액 상태로 개선이 되어 가장 좋은 결과를 얻었다(도 2).

실험예 2. 용해성 및 안정성 시험(도 3)

상기 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 및 2를 제조하여 성상을 육안으로 확인한 결과, 실시예 1 내지 5는 제조 직후 및 시간이 흐른 후에도 상온에서 침전없이 수용액상을 지속적으로 유지하고 있으나, 비교예 1 및 2는 침전물이 생성되었다.

	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	비교예 1	비교예 2
색상	맑은 갈색	맑은 갈색	맑은 갈색	맑은 갈색	맑은 갈색	불투명 황토색	불투명 황토색
성상	액상	액상	액상	액상	액상	액상	액상
결정 생성 유무	무	무	무	무	무	유	유

실험예 3. 세포독성 시험(도 4)

실시예 조성물이 닭의 PBMC 증식능과 세포에 미치는 영향(세포독성)을 확인하기 위해 Cell viability를 측정하였다. 키토산 대신 다른 완충제를 사용한 샘플을 비교예로 하여 키토산과 미네랄 함량이 가장 높은 실시예 5와 비교하였다. 또한, 실험조건을 설정하기 위하여 Control은 T cell activator인 Concanavalin A(con A)를 사용하여 실험에 알맞은 조건을 모색하기 위해서 진행한 결과 dose dependent, time dependent하게 처리한 결과에서는 con A 20μg, 3days에서 가장 높은 증가율을 보였고 (A, B), 세포 수는 1x10⁶에서 가장 좋은 결과가 나타났다(C). 실시예 5, 비교예 3 및 4도 동일한 조건으로 1x10^-2~ 5x10^-5까지 처리하여 세포생존률 확인과 활성을 MTT assay로 하였다.

성 분	실시예 5	비교예 3	비교예 4
키토산(키토올리고당)	1.5	-	-
황산	-	0.2	0.2
황산코발트(CoSO4.7H2O)	0.3	0.1	0.3
황산바나듐(VOSO4.H2O)	0.15	0.05	0.15
산화셀레늄(Na2SeO3)	0.35	0.1	0.35
무수구연산(Citric acid)	0.5	0.5	0.5
정제수	잔부	잔부	잔부
합 계	100	100	100

그 결과, 비교예 3 및 4는 1x10^-2~1x10^{- 3}농도에서 세포 독성을 보였고, 실시예 5는 큰 독성은 보이지 않았다. 전체적으로는 너무 고농도보다는 1x10^-4 이상으로 희석하였을 때 좋은 결과를 보였다(도 4).

비교예 5. 키토산과 복합 미네랄의 농도 탐색을 통한 용해성 확인

키토산에 대한 미네랄의 합성량이 어느 정도 이루어지는지 확인하기 위해 농도별로 다양하게 실험을 진행하였고, 키토산을 정제수에 용해시킨 결과 키토산(2mM)이 킬레이트 반응실험에 적절한 농도로 확인되었다. 킬레이트 결합이 잘 이루어지도록 하기 표 7과 같이 여러 가지 미네랄들을 수용액상태로 용해 시킨 후 천천히 주입하여 반응시킨 결과를 표 8에 나타내었다.

구 분	분자식	분자량	미네랄 원자량
1	고분자 키토산	10,000	-
2	저분자 키토산	5,000	-
3	CrCl36H2O	266.45	51.99
4	MgCl26H2O	203.3	24.3
5	FeC4H2O4	169.9	55.84
6	FeCl24H2O	198.81	55.84
7	Na2MoO42H2O	241.95	95.94
8	ZnSO47H2O	287.56	65.38
9	ZnO	81.38	65.38
10	CuSO45H2O	249.18	63.54
11	MnSO4H2O	169.01	54.9
12	CoSO47H2O	281.12	58.93
13	Na2SeO3	172.94	78.96
14	VOSO4H2O	181	50.94
15	MgO	40.3	24.3

구 분	키토산	미네랄	수용액 유무	비 고
1	1g	Cu(640ppm)	O	수용액 상태
2	1g	Cu(892ppm)	X	고체 생성
3	1g	Cu(1,274ppm)	X	고체 생성
4	1g	Cu(1,530ppm)	X	고체 생성 -> 정제수 100ml 첨가(510ppm)했으나 수용액상태 X
5	1g	Cu(2,549ppm)	X	고체 생성
6	1g	Se(1,369ppm)	O	Se(1,369ppm)에서는 맑음(수용액 상태로 주입) 셀레늄 0.2g(파우더) 첨가 (2,282ppm)하였더니 고체 생성
7	10g	Se(4,150ppm)	O	수용액 상태
8	1g	Zn(128ppm), Mn(53ppm), Cu(46ppm), Se(12ppm), Mo(13ppm)	O	고체 생성->정제수500ml 첨가(6ppm) -> 고체 생성
9	1g	Zn(341ppm), Se(70ppm), Cu(97ppm)	O	수용액 상태
10	10g	Cu(13,000ppm)	X	3N H2SO4 7ml 첨가하였으나 고체 생성
11	10g	V(2,500ppm), Co(4,000ppm), Se(10,000ppm)	O	정제수 추가로 첨가 V(250ppm), Co(400ppm), Se(1,000ppm)
12	13g	V(500ppm), Co(800ppm), Se(2,000ppm)	X	키토산 13g으로 실험, Se를 첨가할 때 고체생성, Methionine 0.6g을 첨가->맑아지지않음, 여과 1.5g
13	10g	Mo(956ppm), Se(789ppm)	O	수용액 상태
14	1g	V(28ppm), Co(40ppm), Se(100ppm)	X	60℃ heat, 정제수 첨가 V(14ppm), Co(20ppm), Se(50ppm) -> 고체 생성
15	10g	V(25ppm), Co(40ppm), Se(100ppm)	X	상온 24h 교반, 정량펌프 8시간 주입, 여과 1g
16	10g	V(25ppm), Co(40ppm)	X	상온 24h 교반, 정량펌프 8시간 주입, 여과 0.2g

실험결과 키토산 2mM에 대한 50%인 Cu(640ppm, 1mM), Se(1,369ppm, 1mM)에서는 수용액 상태인 반면에, 키토산에 대한 50% 이상의 미네랄(1mM 이상), (Cu 892ppm, 1.4mM, Se 2,282ppm 2.8mM, Zn 1.5mM)이 첨가되면 대체적으로 고체화되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 개선하고자 온도(heat), 아미노산(Methionine), pH(H₂SO₄)로 변화를 주어서 실험한 결과 고체화된 것을 수용액 상태로 전환 가능성을 확인할 수 있었다. 키토산과 킬레이트 반응시킬 수 있는 미네랄의 함량이 낮았기 때문에 생체 내에서 요구량이 1ppm 이하인 바나듐, 코발트 및 셀레늄만 키토산으로 킬레이트 시키고 나머지 미네랄들은 아미노산과의 킬레이트 반응성을 추가적으로 검토하기로 하였다.

Claims (10)

1. 셀레늄, 코발트 및 바나듐으로 이루어진 복합 미네랄 및 상기 복합 미네랄에 킬레이트된 키토산을 포함하는 보조사료 조성물에 있어서,
   키토산 0.05~1.5 중량부, 코발트 0.1~0.3 중량부, 바나듐0.05~0.15 중량부, 셀레늄 0.1~0.35 중량부를 포함하는 것인, 보조사료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 조성물의 성상은 액상인 것인, 보조사료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 키토산은 5000~10,000 Kda의 크기 것인, 보조사료 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 구연산을 더욱 포함하는, 보조사료 조성물.
6. 제5항에 있어서, 구연산의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.2~0.6 중량%인, 보조사료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 보조사료 조성물은 가축의 면역증강용인, 보조사료 조성물.
8. 정제수를 교반하면서 키토산을 첨가하여 키토산 용액을 제조하는 제1단계;
   상기 제1단계에서 얻은 키토산 용액을 교반하면서 황산바나듐, 황산코발트 및 산화셀레늄을 순차적으로 투입한 후 반응시켜 복합이온미네랄과 키토산의 금속 킬레이트 반응을 유도하는 제2단계;
   상기 제2단계가 진행된 용액에 유기산을 첨가하는 제3단계 및
   상기 제3단계가 진행된 용액의 상층부를 취하는 제4단계를 포함하는 보조사료 조성물의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 유기산은 구연산인 것인, 제조방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 제1단계의 키토산 용액을 24±1℃의 상온에서 제조하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.

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