BR102012023859A2 - Biofungicida à base de derivados anfifílicos catiônicos de quitosana e método de obtenção do mesmo - Google Patents
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Abstract
BIOFUNGICIDA A BASE DE DERIVADOS ANFIFÍLICOS CATIÔNICOS DE QUITOSANA E MÉTODO DE OBTENÇÃO DO MESMO. A presente invenção se refere a biofungicidas a base de derivados anfifílicos catiônicos de quitosana, com porporções crescentes de grupamentos dodecil, para serem utilizados contra o fungo Aspergillus flavus, bem com o método de obtenção do mesmo.
Description
BIOFUNGICIDA A BASE DE DERIVADOS ANFIFÍLICOS CATIÔNICOS DE QUITOSANA E MÉTODO DE OBTENÇÃO DO MESMO Caapo de aplicação:
A presente invenção se aplica no campo agricola e se 5 refere a biofungicidas a base de derivados anfifilicos catiônicos de quitosana, os quais apresentam proporções crescentes de grupos alquílicos hidrofóbicos do tipo ndodecil, para prevenir a contaminação e a proliferação de fungos Aspergillus, em particular o Aspergillus flavus, bem 10 como a contaminação da colheita por aflatoxinas.
Adicionalmente, a invenção se refere ao método de obtenção do respectivo biofungicida, o qual é desenvolvido a base de uma matéria prima natural, abundante e renovável e apresenta biodegradabilidade e baixa toxicidade.
Fundamentos da invenção:
A quitosana é um polissacarideo de cadeia linear, a qual é um produto da desacetilação da quitina e compreende unidades de 2-amino-2-desoxi-D-glicose e 2-acetamido-2- desoxi-D-glicose unidas por ligações β (l->4) , cuja estrutura molecular está demonstrada na Figura IA.
A quitina (cuja estrutura molecular é demonstrada na Figura 1B) é um polímero natural, presente em exoesqueletos de crustáceos, insetos, moluscos e fungos. Além disso, é o segundo polissacarideo mais abundante na natureza após a 25 celulose, sendo uma excepcional alternativa como fonte de biomassa, por ser econômica e ecologicamente viável.
0 parâmetro utilizado para diferenciar a quitina da quitosana é o grau de desacetilação (GD) das mesmas, sendo esse determinado por meio de técnicas analíticas, como a potenciometria, espectroscopia na região do infravermelho, condutometria, ressonância magnética nuclear de prótons (RMN-H), dentre outras.
Além disso, a quitosana, diferentemente da quitina, é solúvel em ácidos orgânicos diluídos (como o ácido acético, 5 ácido cítrico, ácido láctico e ácido fórmico) e em ácidos inorgânicos. A solubilidade da quitosana está diretamente relacionada com a quantidade de grupos amino presentes na estrutura do polímero, os quais podem ser protonados (NH3+) e, assim, aumentar a solubilidade em meio aquoso, 10 devido à repulsão eletrostática e ao aumento da solvatação das cadeias.
Assim, a solubilidade da quitosana está intimamente relacionada com o grau de desacetilação e força iônica, bem como a massa molar, concentração do biopolímero e do ácido. 15 A estrutura da quitosana permite inúmeras modificações químicas e confere a mesma a possibilidade de produção de diversos derivados com diferentes propriedades.
Dentre as propriedades da quitosana, destaca-se sua capacidade de inibir o crescimento de micro-organismos do reino fungi, como Fusarium, Alternaria, Helminthosporium, Botrytis cinerea e Rhizoctonia solani.
Pela inibição do crescimento dos micro-organismos, observou-se que os grupamentos amino são protonados quando em contato com o meio fisiológico. Desse modo, esses grupos 25 podem interagir com grupos aniônicos da membrana dos microorganismos, resultando no vazamento dos constituintes celulares e, consequentemente, na inibição do crescimento.
No que diz respeito a sua atividade antimicrobiana, a ação de quitosana é influenciada por fatores intrínsecos, como o tipo de quitosana, o grau de polimerização da mesma, o hospedeiro (micro-organismo alvo), a composição quimica dos substratos e as condições ambientais.
A atividade antimicrobiana da quitosana ocorre para valores de pH inferiores a 6,0 e se deve, principalmente, a 5 carga positiva do grupo amino ligado ao carbono 2 do monômero de glucosamina. 0 mecanismo da ação antimicrobiana da quitosana é ainda desconhecido, mas é bem aceito que a interação das cargas positivas de quitosana com as membranas celulares negativamente carregadas dos fungos e 10 bactérias pode levar ao vazamento das proteínas e outros constituintes celulares.
A quitosana age, principalmente, na superfície externa da bactéria. Em baixas concentrações (inferiores a 0,2 mg mL’1) , acredita-se que a quitosana liga-se a superfície 15 bacteriana negativamente carregada, causando aglutinação, enquanto que, em altas concentrações, o grande número de cargas positivas pode conferir uma carga positiva líquida à superfície bacteriana, mantendo-a em suspensão.
Dentre os fatores que tem influência na atividade 20 bactericida e antifúngica da quitosana, a massa molecular é o fator mais importante. Estudos mostram que derivados quaternizados de quitosana com diferentes massas molares exibiram diferentes atividades antifúngicas, sendo esta atividade superior do que aquela observada para a quitosana 25 pura.
Além disso, a atividade antimicrobiana da quitosana ocorre, principalmente, em meio ácido devido a sua baixa solubilidade em pHs superiores a 6,5. Portanto, derivados de quitosana solúveis em água (meio ácido e alcalino) podem ser bons candidatos como biocidas policatiônicos. De acordo com Zhang et al. (2009), o fungo Aspergillus flavus é um dos mais atuantes na deterioração de grãos e frutos e está amplamente distribuído nas regiões tropicais e zonas subtropicais do mundo.
Este fungo, que infecta alimentos como o amendoim, o
milho, o centeio, a cevada, sementes oleaginosas, nozes, e a castanha-do-brasil, dentre outros, pode ainda produzir micotoxinas, substâncias metabólicas que podem ou não ser liberadas em seus substratos de crescimento, denominadas aflatoxinas.
As aflatoxinas destacam-se como umas das mais importantes micotoxinas devido a sua toxicidade ao homem e aos animais, por apresentarem atividade carcinogênica, teratogênica e mutagênica, em condições de umidade e 15 temperatura favoráveis, tais como a demora na colheita, devido ao período prolongado de chuvas, que dificulta a secagem após o arranquío.
Devido a essa problemática e a propriedade fungicida comprovada da quitosana e de seus derivados, a presente 20 invenção se refere a um biofungicida a base de derivados anfifílicos catiônicos de quitosana, com proporções crescentes de grupamentos dodecil, para ser utilizado contra o fungo Aspergillus flavus, bem como o método de obtenção do mesmo.
Os resultados dos ensaios microbiológicos demonstraram
a eficiência da quitosana modificada como biofungicida, com a introdução de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos na matriz polimérica da quitosana para propiciar uma maior interação com a membrana celular, aumentando a atividade antimicrobiana. Estado da técnica.:
O documento de anterioridade CN 101816678 descreve um fungicida médico hemostático de amplo espectro a base de quitosana, para tratamento de infecções de pele e membranas mucosas.
O documento de anterioridade CN 101781374 se refere a um fungicida agricola a base de derivados de quitosana, o qual apresenta atividade antibacteriana e pode prevenir e controlar doenças de colheitas e árvores frutiferas.
O documento de anterioridade CN 175157 6 descreve um
fungicida agricola contendo derivados de quitosana de alto peso molecular, o qual é utilizado para prevenir e eliminar doenças e pragas das plantações.
O documento de anterioridade JP 2004244324 relata um fungicida de baixa toxicidade, consistindo de Fe+2, ácido cítrico e quitosana, para uso agrícola.
O documento de anterioridade MX PA00011813 descreve um revestimento biológico, para efeito protetor e curativo de doenças no pós-colheita. 0 produto contém sais de quitosana e outros componentes, como micro-organismos antagonistas e um cátion.
O documento de anterioridade US 5633025 descreve um revestimento, contendo uma matriz de quitosana modificada, para a aplicação no pós-colheita.
O documento de anterioridade PI 0114449-9 descreve uma
composição aquosa de limpeza contendo quitosana, o qual apresenta uma atividade antifúngica melhorada.
Sumário da invenção:
A presente invenção se refere a biofungicidas a base de derivados anfifílicos catiônicos de quitosana, com proporções crescentes de grupamentos dodecil, para ser utilizado contra o fungo Aspergillus flavus, bem como o seu método de obtenção.
Breve descrição das figuras:
A Figura IA é uma representação da estrutura primária da quitosana.
A Figura IB é uma representação da estrutura primária da quitina.
A Figura 2 é uma representação esquemática do possivel mecanismo da ação antimicrobiana de polímeros catiônicos, no qual a interação destes leva à desestabilização da membrana celular.
A Figura 3 é um gráfico de titulação potenciométrica da quitosana desacetilada (CH).
A Figura 4 é o espectro de ressonância magnética nuclear de próton (RMN-H) da quitosana desacetilada (CH).
A Figura 5 consiste nos espectros de ressonância magnética nuclear de próton (RMN-H) das quitosanas modificadas com grupos dietiletilamina DEAE.
A Figura 6A é uma representação das estruturas dos derivados anfifílicos de quitosana sintetizados.
A Figura 6B é uma representação de outras possíveis estruturas dos derivados anfifílicos de quitosana.
A Figura 7A são os espectros de ressonância magnética nuclear de próton (RMN-H) dos derivados de quitosana, contendo 43% de DEAE, alquilados.
A Figura 7B são os espectros de ressonância magnética nuclear de próton (RMN-H) dos derivados de quitosana, contendo 30% de DEAE, alquilados.
A Figura 8A é um gráfico comparativo entre os índices de inibição em porcentagem para um fungicida comercialmente disponível (Thiram) e a seqüência de derivados de baixa massa molecular.
A Figura 8B é um gráfico comparativo entre os índices de inibição em porcentagem para um fungicida comercialmente disponível (Thiram) e a seqüência de derivados de alta massa molecular.
Descrição detalhada, da invenção:
A presente invenção descreve biofungicidas a base de 10 derivados anfifílicos catiônicos de quitosana, com proporções crescentes de grupos alquílicos hidrofóbicos do tipo n-dodecil, de baixa massa molecular, os quais apresentam solubilidade em pH neutro e alta atividade contra o fungo Aspergillus flavus.
- Método de obtenção dos derivados:
Para a obtenção dos biofungicidas, foram utilizados os seguintes reagentes para a síntese dos derivados:
- Quitosana comercial;
- Quitosana desacetilada (CH);
- Quitosana desacetilada e degradada (CHD);
- Cloreto de 2-cloro-N,W-dietiletilamina (DEAE);
- Dodecil aldeído (DD) 95% e
- Borociano hidreto de sódio.
A estrutura dos biofungicidas contêm, além dos grupos glucosamina da quitosana, grupos dietilaminoetilamina e grupos alquílicos hidrofóbicos do tipo n-dodecil.
A tabela 1 abaixo descreve o número de mols de CH, CHD, DEAE e DD utilizados na reação de obtenção dos derivados de quitosana.
Tabela 1: Número de mols (n) dos reagentes CHr CHD, DEAE e DD utilizados na obtenção dos derivados anfifílicos de
quitosana.
Derivados n ch Il DEAE n dd CH30DEAE2,7DD 5, OxlO'3 8, 4xl0"3 1, 8xl0"4 CH3ODEAE10DD 5, OxlO'4 CH3ODEAEl9DD 1, 3xl0"3 n CHD CHD43DEAE5DD 5, OxlO'3 8, 4xl0'3 1, 8xl0~4 CHD 4 3DEAE2 8DD 5, OxlO'4 CHD43DEAE39DD 1, 3xl0"3 Os derivados descritos na presente invenção são obtidos por meio do processo que compreende as seguintes etapas:
Preparação da quitosana:
A quitosana utilizada na síntese dos derivados é obtida pela desacetilação heterogênea da quitosana, na qual a quitosana disponível comercialmente é desacetilada a fim de se obter um grau de desacetilação superior a 90%.
Para isto, a quitosana é dispersa em água deionizada, sob agitação magnética, sendo, em seguida, solubilizada pela adição de ácido acético glacial.
Posteriormente, verte-se hidróxido de sódio (50% em 15 massa) à solução sob agitação, em atmosfera de nitrogênio, aquecimento a aproximadamente 100 0C e refluxo. Após 1 hora e 30 minutos, a reação é interrompida e a suspensão é transferida para um béquer contendo água deionizada a 70 °C, sob agitação.
O precipitado obtido é então decantado e lavado com
água deionizada até que a água de lavagem atinja pH neutro. Em seguida, o mesmo é isolado por filtração a vácuo e o procedimento de desacetilação é repetido.
Após a filtragem realizada no segundo procedimento de desacetilação, a quitosana é lavada com acetona e seca em estufa a 40 0C por 72 horas, sendo o polímero macerado até que se torne pó. O rendimento percentual obtido é de 65%.
O grau de desacetilação (GD) da quitosana (CH) é determinado por meio das técnicas de potenciometria e espectroscopia de ressonância magnética nuclear de próton (RMN-H), como mostrado nas Figuras 3 e 4, respectivamente.
Parte da quitosana desacetilada obtida é degradada para a obtenção de amostras de baixa massa molecular (CHD), utilizando-se nitrito de sódio 99% (0,18 mol L"1) em meio ácido (6 mL ácido acético glacial 2%).
As massas moleculares das quitosanas CH e CHD foram determinadas por viscosimetria e os valores obtidos se encontram na faixa que varia de 20 kDa a 400 Da, sendo que as massas viscosimétricas dos polímeros CH e CHD são 15,2 kDa e 611,0 Da, respectivamente.
Obtenção dos derivados de quitosana contendo o grupo dietiletilamina (DEAE):
Os derivados foram obtidos pela reação das quitosanas CH e CHD com cloreto de 2-cloro-W,N-dietiletilamina (DEAE). Os graus de substituição (GS) de grupos DEAE de CH e CHD foram determinados utilizando-se RMN-H (conforme mostrado na Figura 5) e os valores obtidos variaram de 30 a 43%, respectivamente.
As quitosanas obtidas (CH30DEAE e CHD43DEAE) foram alquiladas com dodecil aldeído seguido pela redução com borociano hidreto de sódio, obtendo-se derivados com diferentes graus de substituição. O grau de substituição pelos grupos dodecil (GDOd) variaram de 2,7 a 19% para o derivado de quitosana com 30% de DEAE e de 5 a 39% para o derivado de quitosana contendo
4 3% de DEAE.
O comportamento associativo dos derivados hidrofóbicos
foi estudado utilizando espectroscopia de fluorescência. Os resultados mostraram que, em baixas concentrações, os derivados anfifílicos se auto-associam para formar domínios hidrofóbicos.
Portanto, a quantidade de grupos amino terciários
(DEAE) e o conteúdo hidrofóbico foram variados com duas séries de quitosanas e, dessa forma, permitiram determinar composições específicas, na quais a massa molecular e os conteúdos foram ajustados para maximizar a atividade
antimicrobiana.
Preparação dos derivados com atividade biofungicida a partir da quitosana modificada com DEAE:
A alquilação dos derivados de quitosana associados ao DEAE consistiu em duas etapas: primeiramente a reação dos
grupos amino da quitosana com dodecil aldeído para formação da base de Schiff e, em seguida, uma reação de redução com borociano hidreto de sódio.
A reação foi realizada a 25 °C, pressão de 1 atm, pH
8, permanecendo sob agitação por 24 horas.
A partir deste processo, foram sintetizados derivados
apresentando a estrutura mostrada na Figura 6A. Os graus de substituição (Gnod) dos derivados de quitosana foram determinados por RMN-H, tal como demonstrado na Figura 7A e 7B.
Purificação dos derivados alquilados: A purificação dos derivados alquilados é realizada por meio de diálise contra água deionizada por 3 dias, no qual a água de diálise é trocada 3 vezes ao dia.
Em seguida, a fim de remover qualquer quantidade de aldeído não reagido, é feita uma extração em sistema soxhlet durante 48 horas a 60 °C, utilizando-se clorofórmio como solvente.
Exemplo específico da invenção:
Para a preparação dos derivados de quitosana contendo grupos DEAE, 2,7 g da quitosana apresentando massa molecular 500-10000 Daltons foi solubilizada em 112,5 mL de ácido clorídrico 0,1 mol L-1.
Em seguida, 1,4 g de DEAE foram adicionados à solução de quitosana e o pH foi ajustado para 8,0 com adição de NaOH 2 mol L-1.
A reação foi realizada sob agitação a 70 0C e o pH foi ajustado continuamente pela adição de NaOH. 0 produto foi purificado por diálise contra NaOH 0,05 mol L-1, por 24 horas e contra água deionizada por 3 dias utilizando-se uma membrana de 3000 Da.
O produto obtido foi recuperado por liofilização e o GS foi determinado por RMN-H.
Para a alquilação dos derivados de quitosana contendo grupos DEAE, uma massa de 0,8 g de quitosana associada ao DEAE foi solubilizada em 91,7 mL de ácido acético 2% e 63,1 mL de etanol.
O pH da solução foi ajustado para 5,1 e, em seguida, adicionaram-se 0,12 mL de dodecil aldeído. Após 1 hora sob agitação constante, adicionou-se borociano hidreto de sódio na razão 3:1 (NaCNBH3 : NH2). A mistura foi mantida sob agitação por 24 horas a temperatura ambiente.
A purificação dos derivados alquilados CH30DEAE2,7DD, CH3ODEAE10DD, CH3ODEAEl9DD, CHD43DEAE5DD, CHD4 3DEAE28DD e CHD43DEAE39DD foi realizada por meio de diálise contra água deionizada por 3 dias, trocando a água de diálise 3 vezes ao dia.
Em seguida fez-se a remoção do possível aldeído não reagido, por extração em sistema soxhlet durante 48 horas a 60°C, utilizando-se 250 mL de clorofórmio como solvente.
Os derivados obtidos estão descritos na Tabela 2
abaixo.
Tabela 2 - Valores de grau de substituição pelos grupos dodecil (G0od) para os derivados anfifílicos de
quitosana.
Quitosana GiDod% CH30DEAE2,7DD 2,7 CH3ODEAE10DD 10 CH30DEAE19DD 19 CHD43DEAE5DD 5 CHD43DEAE28DD 28 CHD43DEAE39DD 39 Avaliação da atividade biofungicida sobre Aspergillus
flavus:
- Inibição do crescimento fúngico:
A inibição do crescimento do fungo pelos diferentes polímeros foi determinada na placa de Petri contendo o meio de cultura (BDA).
Com o auxílio de um paquímetro milimetrado, mediu-se o crescimento radial da colônia nos terceiro, quinto e sétimo dias de incubação. Os resultados obtidos no sétimo dia de incubação foram utilizados para fins comparativos.
Os ensaios foram realizados em quadruplicata para cada concentração estudada, e, assim, as medidas foram feitas também em quadruplicata.
Para análise da eficiência de inibição do crescimento
fúngico pela quitosana, calculou-se o índice de inibição de conforme a equação abaixo:
índice de inibição (%): (1-Da / Db) x 100 Onde: Da é o diâmetro da colônia das placas contendo quitosana;
Db é o diâmetro das placas controle.
Os resultados obtidos nos ensaios microbiológicos estão descritos na Tabela 2 e demonstram a baixa capacidade antifúngica natural da quitosana comercial (CC) para testes 15 in vitro. O processo de desacetilação potencializa essa capacidade, deixando mais monômeros com grupamentos amino livres.
Tabela 3 - índice de inibição do crescimento do fungo
Aspergillus flavus (em %)
Concentração do Polímero Polimero 0,05 g L-1 0,1 g L-1 0,5 g L'1 1,0 g L-1 CC - 5,1 ± 0,8 5 ± 2,4 5,1 ± 0,4 CH - 6, 3 ± 0,6 6,1 ± 0,6 9,14 ± 0,2 CHD 7,0 ± 1,8 - 7,5 ± 5,0 1,3 ± 1,5 7,4 ± 3,4 CH30DEAE - 4,8 ± 3,7 - 0,5 ± 2,9 - 1,8 ± 1,3 CH3ODEAE2,7DD 7,4 ± 2,6 14,8 ± 2,8 51, 7 ±5,6 94,5 ± 4,4 CH30DEAE10DD 13,7 ± 1,8 15,2 ± 3,2 27,6 ±0,4 79,4 ± 7,5 CH30DEAE19DD 2,8 ± 2,7 13, 1 ± 4,1 12,8 ±2,1 26,5 ± 2,3 CHD43DEAE 1,4 ± 2,2 - 0,5 ± 1,6 - 8,0 ± 1,5 CHD43DEAE5DD 14,4 ± 3,2 - 4,1 ± 4,3 - 27,0 ± 1,9 97,9 ± 1,7 CHD43DEAE28DD 7,9 ± 4,5 15, 1 ±3,1 59,2 ± 4,9 100,0 ± 0,0 CHD43DEAE39DD 6,9 ± 3,6 6,2 ± 2,2 CO 100,0 ± 0,0 M 1+ CO O O tracejado (-) indica que o ensaio não foi realizado naquela concentração.
- Efeito da variação da concentração dos polímeros na inibição do crescimento fúngico:
Com a finalidade de observar o efeito da variação da
concentração dos polímeros na inibição do crescimento do fungo, foram testadas três concentrações crescentes para quitosana comercial (CC), para a quitosana desacetilada (CH) e para as quitosanas substituídas CH30DEAE e CHD4 3DEAE.
Para as quitosanas degradada (CHD de Mv = 611,00 Da) e substituídas (CH30DEAE2,7DD, CH3ODEAE10DD, CH30DEAE19DD, CHD4 3DEAE5DD, CHD4 3DEAE28DD e CHD4 3DEAE3 9DD) foram testadas quatro concentrações crescentes.
Os resultados obtidos estão demonstrados nas Figuras
8A e 8B, em que os índices de inibição dos derivados de quitosana são comparados com o fungicida comercialmente disponível Vitavax0-Thiram 200 SC. O Thiram é um fungicida para tratamento de sementes composto por 2 ingredientes 20 ativos distintos: um fungicida sistêmico (carboxina) e um fungicida de contato (tiram), que proporcionam uma proteção completa para a semente, por dentro e por fora.
Como é possível observar, a concentração de quitosana não modificada, bem como aquelas modificadas somente com DEAE (ou seja, as quitosanas CC, CH, CHD, CH30DEAE e CHD43DEAE) não interferiram de forma significativa no crescimento do fungo.
Os demais derivados apresentaram inibição crescente com o aumento da concentração do polímero. Esse aumento significativo do índice de inibição do fungo com o aumento da concentração dos derivados anfifílicos de quitosana está relacionado à presença crescente de grupos hidrofóbicos 5 ligados a cadeia de quitosana, permitindo uma maior interação com a parede celular do fungo.
A presença de grupamento hidrofóbico na estrutura da quitosana aumenta ainda mais a capacidade de inibição do A. flavus podendo, em alguns casos, inibir 100% do crescimento do fungo.
Nos derivados de quitosana não degradada (Mv = 15,2 kDa) contendo 30% de grupamentos DEAE (CH30DEAE), observase que não há inibição do fungo, quando comparado com aqueles que apresentam uma porção hidrofóbica. O aumento do 15 índice de inibição com o aumento da concentração de um mesmo polímero é evidente, indicando que a concentração do biopolímero é um fator determinante na inibição do A. flavus.
No que diz respeito aos ensaios envolvendo derivados de quitosana degradada (CHD de Mv = 611,0 Da), foram realizados ensaios com a CHD para avaliar o efeito da massa molecular do polímero sobre a capacidade de inibição do fungo.
Os resultados obtidos não mostram um aumento significativo do índice de inibição quando comparado à inibição da quitosana comercial (CC) e desacetilada (CH).
Ainda, A Figura 4 mostra claramente que para os ensaios com derivados CH30DEAE (0,05 e 0,1 g L’1) , CHD (0,1 g L"1), CHD43DEAE (0,1 g L'1) e CHD43DEAE5DD (0,1 g L'1), apresentaram índice de inibição negativo, sugerindo que nessas concentrações o A. flavus pode usar os derivados de quitosana como nutrientes.
- Efeito da presença do grupamento DEAE na quitosana:
A análise do efeito da presença do grupamento DEAE na quitosana degradada foi realizada com o derivado CHD43DEAE.
Os índices de inibição obtidos indicaram que o grupamento DEAE como única unidade ligada à cadeia não interfere significativamente na inibição do fungo.
Em relação aos ensaios realizados com os demais derivados (CHD4 3DEAE5DD, CHD43DEAE28DD e CHD43DEAE39DD), é possível observar um aumento considerável do índice de inibição do micro-organismo, chegando a 100% para dos derivados CHD43DEAE28DD e CHD43DEAE39DD na concentração de
I g L-1 (vide Tabela 3 e Figura 8) .
Esse fato pode ser explicado considerando o tamanho do
oligômero, dímero ou talvez trímero, que pode fazer com que a formação dos agregados não se dê de forma efetiva, permitindo assim a interação da cadeia hidrofóbica com a membrana celular do micro-organismo.
Dessa forma, as quitosanas oligoméricas apresentaram
um melhor efeito antifúngico em relação aos outros polímeros.
Os resultados obtidos permitem concluir que o procedimento de síntese utilizado é viável para obtenção de derivados de quitosana, tanto com o DEAE quanto com dodecil aldeído, com diferentes graus de substituição e com alto rendimento.
O pH é um parâmetro importante que deve ser controlado para maximizar o rendimento da reação. Além disso, os graus de substituição podem ser determinados com boa precisão utilizando-se a técnica de RMN-H.
Os estudos em solução mostraram que em baixas concentrações os derivados anfifílicos se auto-associam para formar domínios hidrofóbicos. A Concentração de
Agregação Crítica (CAC) depende do grau de substituição dos grupos hidrofóbicos presentes na estrutura polimérica e independe da massa molecular do polímero e do pH da solução.
Os resultados dos ensaios contra o fungo A. flavus demonstraram a eficiência dos derivados de quitosana como biofungicidas, sendo a concentração do polímero e o grau de substituição por grupos dodecil fatores determinantes na inibição do micro-organismo.
Embora a versão preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, deve ser compreendido que a invenção não é limitada. Diversas modificações, mudanças, variações, substituições e equivalentes poderão ocorrer, sem desviar do escopo da presente invenção.
Claims (13)
1. Biofungicida a base de derivados anfifílicos catiônicos de quitosana caracterizado por apresentar a estrutura: <formula>formula see original document page 19</formula> em que: Rl corresponde a dietilaminoetilamina e R2 corresponde a grupos alquílicos de natureza hidrofóbica, aromático ou alifático, selecionados dentre <formula>formula see original document page 19</formula> em que n é igual a 4, 5, 7, 9 ou 11 e m é igual a 1, 2, 3, 4 ou 5, sendo que os grupamentos Rl e R2 estão associados às glucosaminas da quitosana.
2. Biofungicida, de acordo com a reivindicação 1, carac ter i z ado pelo fato de que a quitosana utilizada é desacetilada e apresenta um grau de desacetilação superior a 90%.
3. Biofungicida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os grupos alquílicos hidrofóbicos são grupos alquílicos hidrofóbicos variáveis do tipo n-dodecil.
4. Biofungicida, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os grupos alquílicos hidrofóbicos do tipo n-dodecil são proveniente da reação dos grupos amino da quitosana com dodecil aldeído.
5. Biofungicida, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o grupo dietilaminoetilamina é proveniente do cloreto de 2-cloro-N,W-dietiletilamina.
6. Método de obtenção do biofungicida conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender as etapas de: a) Desacetilação da quitosana; b) Obtenção dos derivados de quitosana; e c) Purificação dos derivados alquilados.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que, na etapa (a), a quitosana é desacetilada e parte da mesma é degradada para a obtenção de quitosana desacetilada de baixa massa molecular.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as quitosanas desacetiladas apresentam massas moleculares que variam na faixa de 20 kDa a 400 Da.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que, na etapa (b), as quitosanas reagem com o cloreto de 2-cloro-N,N-dietiletilamina.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as quitosanas obtidas apresentam graus de substituição que variam entre 30 e 43%.
11. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as quitosanas são então alquiladas com dodecil aldeído seguido pela redução com borociano hidreto de sódio.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as quitosanas alquiladas apresentam grau de substituição pelos grupos dodecil que variam de 2,7 a 39%.
13. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a purificação dos derivados alquilados é realizada por meio de diálise contra água deionizada por 3 dias seguida de extração em sistema soxhlet durante 48 horas a 60 °C, utilizando-se clorofórmio como solvente.
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