ES2614474T3 - Composiciones que comprenden ketoprofeno y un antagonista de los canales de calcio para usar en procedimientos urológicos - Google Patents

Composiciones que comprenden ketoprofeno y un antagonista de los canales de calcio para usar en procedimientos urológicos Download PDF

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Jeffrey M. Herz
Wayne R. Gombotz
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Abstract

Una composición para administración local para uso en la inhibición del dolor/inflamación y del espasmo, que comprende ketoprofeno y un antagonista de los canales de calcio en un vehículo, que comprende un vehículo de irrigación líquido.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones que comprenden ketoprofeno y un antagonista de los canales de calcio para usar en procedimientos urologicos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas para administracion a las vfas urinarias durante los procedimientos de diagnostico, de intervencion, de cirugfa y otros procedimientos medicos urologicos y para el tratamiento terapeutico de estructuras urologicas.
Antecedentes de la invencion
Muchos procedimientos urologicos se realizan ahora utilizando tecnicas endoscopicas (por ejemplo, cistoscopicas o uteroscopicas) mfnimamente invasivas. Estas incluyen el examen de la uretra, la vejiga y los ureteres, los tratamientos terapeuticos para la hipertrofia prostatica benigna, la eliminacion o fragmentacion de calculos renales y vesicales, la colocacion de stents uretrales o ureterales para facilitar el paso de las piedras, la realizacion de biopsias y la extirpacion de tumores. Aunque menos invasivas que la cirugfa abierta, estas tecnicas implican irritacion y traumatismo procedimentales en las vfas urinarias que conducen a dolor, inflamacion y espasmo del musculo liso. Los sfntomas postoperatorios de las vfas urinarias bajas (LUTS) despues de procedimientos urologicos incluyen a menudo dolor, hiperreflexia (contracciones inestables de la vejiga), frecuencia urinaria, nicturia y tenesmo vesical, y en algunos casos retencion urinaria que requiere sondaje prolongado.
En algunos procedimientos quirurgicos, tales como la reseccion transuretral de la prostata (TURP), la miccion frecuente y otros sfntomas que resultan de la irritacion e inflamacion procedimentales pueden continuar durante un perfodo prolongado, resolviendose gradualmente durante las seis primeras semanas del postoperatorio. En los procedimientos urologicos que emplean laser, las complicaciones postoperatorias tales como la inflamacion y el espasmo muscular pueden continuar durante varias semanas. Frecuentemente, se prescribe a los pacientes medicacion anticolinergica oral para inhibir el espasmo postoperatorio y reducir la gravedad de las contracciones inestables. Sin embargo, no todos los pacientes responden adecuadamente a estos farmacos y los efectos secundarios pueden llevar a la suspension de estas medicaciones.
Los procedimientos urologicos se realizan a menudo con irrigacion concurrente de las vfas urinarias, para eliminar la sangre y restos de tejidos de manera que se mantenga limpio el campo de vision endoscopica. Las soluciones de irrigacion convencionales incluyen solucion salina, lactato de Ringer, glicina, sorbitol, manitol y sorbitol/manitol. Estas soluciones de irrigacion convencionales no contienen agentes farmaceuticos activos.
La patente de Estados Unidos 5.858.017 de Demopulos, et al., cuya descripcion se incorpora a esta memoria como referencia, describe soluciones y metodos de irrigacion quirurgica para la inhibicion del dolor, inflamacion y/o espasmo. Se describe el uso de soluciones de irrigacion que contienen inhibidores del dolor/inflamacion y agentes antiespasmodicos durante las intervenciones urologicas en general y especfficamente durante la reseccion transuretral de la prostata, que incluyen combinaciones de cinco farmacos y de nueve farmacos. Esta referencia no describe emparejamientos optimizados de un agente inhibidor del dolor/inflamacion con un agente antiespasmodico para intervenciones urologicas dadas.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona una composicion para administracion local para uso en la inhibicion del dolor/inflamacion y el espasmo, que comprende ketoprofeno y un antagonista de los canales de calcio en un vehfculo que comprende un vehfculo de irrigacion lfquido. Otros aspectos de la invencion se definen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripcion de los dibujos
La presente invencion se describira ahora con mayor detalle, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos en los cuales:
La Figura 1 proporciona un modelo de la accion de la actividad de la prostaglandina.
La Figura 2 presenta las curvas de concentracion-respuesta acumulativas a la bradicinina y sustancia P, obtenidas de animales normales en el Ejemplo I.
La Figura 3A presenta las curvas de concentracion-respuesta a bradicinina producidas en presencia de ketoprofeno 0,25, 1,0, 2,5 y 10 pM del Ejemplo I; La Figura 3B presenta el grafico de Schild para el analisis de la pA2 de ketoprofeno del Ejemplo I.
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La Figura 4A demuestra que la bradicinina induce rapidamente la formacion de PGE2 en las tiras de tejido de la vejiga de rata ensayadas en el Ejemplo I en los primeros minutos de estimulacion y alcanza un maximo antes de 30 minutos, con un t1^ para la formacion de aproximadamente 7,5 minutos. La Figura 4B presenta la cinetica rapida de la formacion de PGE2 detectada en unos minutos en el Ejemplo I.
La Figura 5A ilustra que la aspirina por via intravenosa (10 mg/kg) produjo una inhibicion gradual dependiente del tiempo de la reduccion inducida por acido acetico en el intervalo entre contracciones (ICI), y la Figura 5B ilustra los cambios paralelos en la capacidad de la vejiga, del Ejemplo I.
La Figura 6 muestra el efecto de concentraciones crecientes de nifedipino sobre la contractilidad de las tiras de vejiga de rata del Ejemplo II.
La Figura 7 muestra el efecto combinado de nifedipino (0,1 pM) y ketoprofeno (0,3-3,0 pM) sobre la contractilidad, estimulada por la bradicinina, de las tiras de vejiga de rata del Ejemplo III.
La Figura 8 muestra el efecto combinado de nifedipino (0,3 pM) y ketoprofeno (0,3-3,0 pM) sobre la contractilidad, estimulada por la bradicinina, de las tiras de vejiga de rata del Ejemplo III.
La Figura 9 muestra el efecto combinado de nifedipino (1,0 pM) y ketoprofeno (0,3-3,0 pM) sobre la contractilidad, estimulada por la bradicinina, de las tiras de vejiga de rata del Ejemplo III.
La Figura 10 ilustra la concentracion-superficie de respuesta (modelo reducido) de valores de tension individuales procedentes de las curvas de dosis-respuesta correspondientes a la tension inducida por bradicinina 30 pM en las tiras de vejiga de rata del Ejemplo III.
La Figura 11 muestra el efecto del ketoprofeno (10 pM) y nifedipino (1 pM), individualmente, sobre la tension, estimulada por multiples agonistas, en las tiras de tejido de vejiga de rata del Ejemplo IV.
La Figura 12 muestra el efecto del ketoprofeno (10 pM) y nifedipino (1 pM), individualmente, sobre la liberacion de PGE2, estimulada por bradicinina, de las tiras de tejido de vejiga de rata del Ejemplo IV.
La Figura 13 muestra un rastreo de cistometrfa de la vejiga de rata que demuestra el efecto del acido acetico perfundido como se describe en el Ejemplo V.
La Figura 14 demuestra el efecto del pretratamiento con ketoprofeno sobre la hiperactividad de la vejiga inducida por acido acetico del Ejemplo V.
La Figura 15 demuestra el efecto del pretratamiento con nifedipino sobre la hiperactividad de la vejiga inducida por acido acetico del Ejemplo V.
La Figura 16 ilustra los niveles plasmaticos medios de ketoprofeno para las ratas tratadas con ketoprofeno o con una combinacion de ketoprofeno y nifedipino en el estudio farmacocinetico del Ejemplo VI.
La Figura 17 ilustra los niveles plasmaticos medios de nifedipino para las ratas tratadas con nifedipino o con una combinacion de ketoprofeno y nifedipino en el estudio farmacocinetico del Ejemplo VI.
La Figura 18 ilustra los efectos de nifedipino, ketoprofeno y una combinacion de nifedipino y ketoprofeno sobre la PGE2 en las vejigas de rata del estudio farmacocinetico del Ejemplo VI.
La Figura 19 muestra un cromatograma de una formulacion F1 de nifedipino y ketoprofeno de acuerdo con el Ejemplo VIII despues de haber sido mantenida en condiciones extremas a 60 °C durante 1 mes.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
La presente invencion proporciona composiciones para uso en la inhibicion del dolor, inflamacion y/o espasmo durante las intervenciones urologicas mediante la administracion de tales composiciones localmente a las estructuras del tracto urologico durante la intervencion. Las composiciones incluyen al menos un agente que es un agente inhibidor del dolor/inflamacion o un agente inhibidor del espasmo, o que actua para inhibir tanto el dolor/inflamacion como el espasmo. Preferiblemente, las composiciones y metodos de la presente invencion incluyen dos o mas agentes inhibidores del dolor/inflamacion o inhibidores del espasmo que actuan sobre diferentes dianas moleculares (esto es, enzimas, receptores o canales ionicos) o que actuan a traves de diferentes mecanismos de accion. Mas preferiblemente, las composiciones de la presente invencion incluyen al menos un agente inhibidor del dolor/inflamacion y al menos un agente inhibidor del espasmo.
Como se utiliza en esta memoria, el termino "agente inhibidor del dolor/inflamacion" incluye agentes analgesicos (esto es, agentes antinociceptivos), agentes no esteroideos que inhiben la inflamacion [incluyendo tanto los "farmacos anti-inflamatorios no esteroides" (esto es, los AINE o inhibidores de la ciclooxigenasa) como otros agentes que no son esteroides que actuan para inhibir la inflamacion], corticosteroides y anestesicos locales.
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Como se utiliza en la presente memoria, el termino "agente inhibidor del espasmo" incluye agentes que inhiben el espasmo o contraccion del tejido muscular liso y agentes que inhiben el espasmo o la contraccion de otros tejidos musculares asociados con las vfas urinarias (por ejemplo, el tejido del musculo prostatico).
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a la administracion periprocedimental en las vfas urinarias de un inhibidor de la ciclooxigenasa (COX), adecuadamente un inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2, preferiblemente un inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 que es un derivado de acido propionico, mas preferiblemente ketoprofeno, solo o con al menos un agente adicional que inhibe el dolor/inflamacion y/o que inhibe el espasmo, tal como un antagonista de los canales de calcio.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a la administracion periprocedimental en las vfas urinarias de un antagonista de los canales de calcio (esto es, un bloqueador de los canales de calcio), adecuadamente un antagonista de calcio tipo L, preferiblemente un antagonista de los canales de calcio dihidropiridina, mas preferiblemente nifedipino, solo o con al menos un agente adicional que inhibe el dolor/inflamacion y/o que inhibe el espasmo, tal como un inhibidor de la COX.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a la administracion periprocedimental en las vfas urinarias de una combinacion de un inhibidor de la COX y un antagonista de los canales de calcio, preferiblemente un inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 en combinacion con un antagonista de calcio tipo L, mas preferiblemente ketoprofeno en combinacion con nifedipino. Los presentes inventores han encontrado que el ketoprofeno y el nifedipino proporcionan resultados mayores que aditivos o sinergicos en la inhibicion del espasmo vesical, como se describe en los ejemplos mas adelante.
Un aspecto de la presente invencion implica la administracion local de las composiciones de la presente invencion a la vejiga, el ureter, la uretra, u otras estructuras de las vfas urinarias para inhibir el dolor, la inflamacion y/o el espasmo del musculo liso durante el tratamiento, diagnostico, intervencion, operacion y otras intervenciones medicas urologicas.
Como se usa en la presente memoria, los terminos "vfas urinarias" y "sistema urinario" se refieren a los rinones, ureteres, vejiga, uretra y los nervios, vasos sangufneos y musculos asociados. El termino "vfas urinarias bajas" se refiere a la vejiga y la uretra y los nervios, vasos sangufneos y musculos asociados.
Un aspecto adicional de la presente invencion implica la administracion local de las composiciones de la presente invencion a las estructuras de las vfas urinarias para reducir los sfntomas de miccion irritativa postoperatoria (por ejemplo, frecuencia urinaria, nicturia, tenesmo vesical), dolor y/o otros sfntomas de las vfas urinarias bajas que siguen a dichos procedimientos urologicos.
Un aspecto adicional de la presente invencion implica la administracion local de las composiciones de la presente invencion a las estructuras de las vfas urinarias para mejorar la funcion urinaria postoperatoria (por ejemplo, disminuir la retencion urinaria indeseable) despues de tales procedimientos urologicos.
Las composiciones de la presente invencion se administran adecuadamente a las vfas urinarias, antes, durante y/o despues de los procedimientos urologicos, esto es, antes (pre-) del procedimiento, durante (intra-) el procedimiento, despues (post-) del procedimiento, pre- y intra-procedimentalmente, pre- y post-procedimentalmente, intra- y post- procedimentalmente o pre-, intra- y post-procedimentalmente.
Preferiblemente, las composiciones de la presente invencion se administran localmente a las vfas urinarias "periprocedimentalmente", lo que como se utiliza en la presente memoria significa intraprocedimentalmente, pre- e intraprocedimentalmente, intra- y postprocedimentalmente o pre-, intra- y postprocedimentalmente. La administracion periprocedimental puede ser continua o intermitente durante el procedimiento. Preferiblemente, las composiciones de la presente invencion se administran "continuamente" durante el procedimiento, lo que como se utiliza en esta memoria significa la administracion para mantener una concentracion aproximadamente constante del agente o agentes activos en el sitio de administracion local. Cuando se administra periprocedimentalmente durante un procedimiento quirurgico, se puede usar el termino "perioperativamente" de forma intercambiable con periprocedimentalmente en la presente memoria. Preferiblemente, las composiciones de la presente invencion se administran periprocedimentalmente durante el perfodo de tiempo en que el traumatismo e irritacion quirurgicos o de otros procedimientos estan siendo sufridos por el tejido de las vfas urinarias.
La administracion "local" de las composiciones de la presente invencion a las vfas urinarias, como se usa aquf se refiere a la administracion de las composiciones directamente a una o mas estructuras de las vfas urinarias. El agente o agentes terapeuticos contenidos en las composiciones administradas localmente no estan sujetos al metabolismo de primero y/o de segundo paso antes de alcanzar al sitio local del efecto terapeutico que se pretende (por ejemplo, inhibidor), en contraste con los farmacos administrados sistemicamente.
Efectos fisiopatologicos de los procedimientos urologicos
El traumatismo de los procedimientos urologicos da como resultado una respuesta inflamatoria aguda, localizada, en las estructuras urologicas asociadas. La inflamacion se asocia con un patron complejo de procesos bioqufmicos y
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celulares que se producen en el sitio local, que implican las interacciones de retroalimentacion positiva entre el sistema nervioso periferico, las celulas inmunitarias, la vasculatura local y el sistema nervioso central. La respuesta inflamatoria a un traumatismo procedimental en las vfas urinarias incluye liberacion de citocinas, migracion de celulas inflamatorias, edema, dolor e hiperalgesia.
En respuesta a la lesion tisular, se liberan rapidamente numerosos mediadores locales, lo que ocasiona la estimulacion nociceptiva de las fibras C sensoriales. La respuesta inflamatoria provocada por lesion periferica demuestra que, ademas de las citocinas, los mediadores inflamatorios ligados a los receptores de protemas G pequenas, tambien modulan la respuesta fisiopatologica rapida de la vejiga y de la uretra. En los modelos de inflamacion de la vejiga urinaria, se ha encontrado que se liberan de la vejiga, bradicinina, histamina, sustancia P (SP), leucotrienos y prostaglandinas. Lecci, A., et al., Pharmacological Analysis of the Local and Reflex Responses to Bradykinin on Rat Urinary Bladder Motility in Vivo, Br. J. Pharmacol., 114:708-14 (1995); Lecci, A., et al., Capsaicin Pretreatment Does Not Alter Rat Urinary Bladder Motor Responses Induced by a Kinin B1 Receptor Agonist After Endotoxin Treatment, Neurosci. Lett. 262:73-76 (1999); Vasko, M., et al., Prostaglandin E2 Enhances Bradykinin-Stimulated Release of Neuropeptides from Rat Sensory Neurons in Culture, J Neurosci. 14:4987-97 (1994). Ciertos mediadores inflamatorios, tales como las prostaglandinas y cininas, activan y sensibilizan las fibras C a traves de la interaccion con receptores espedficos sobre los terminales nerviosos. Otros mediadores inflamatorios que han sido descritos en las vfas urinarias bajas incluyen las taquicininas y ATP (de las fibras C) (Maggi, C, et al, Tachykinin Antagonists and Capsaicin-Induced Contraction of the Rat Isolated Urinay Bladder: Evidence for Tachykinin-Mediated Cotransmission, Br. J. Pharmacol. 103:1535-41 (1991), CGRP (peptido relacionado con el gen de la calcitonina) (de las fibras C), serotonina (de los mastocitos y plaquetas), y endotelina. Maggi, C, et al., Contractile Responses of the Human Urinary Bladder, Renal Pelvis and Renal Artery to Endothelins and Sarafotoxin S6b, Gen. Pharmacol. 21: 247-49 (1990). Estos mediadores operan juntos de una manera sinergica para aumentar la hiperalgesia, la inflamacion y el espasmo muscular posquirurgicos. El numero de mediadores implicados en la respuesta pone de relieve el origen multifactorial del proceso de dolor e inflamacion.
La activacion inmediata de los nervios sensoriales (hiperalgesia primaria) desencadena una cascada de procesos que implica alteraciones en la vasculatura local, e influye en la contractilidad del musculo. La estimulacion de las fibras aferentes sensibles a la capsaicina provoca una respuesta eferente local, que se caracteriza por la liberacion de neuropeptidos (taquicininas y CGRP) de las terminaciones nerviosas. Esta liberacion produce una serie de respuestas locales, que son parte de los efectos fisiopatologicos en las vfas urinarias bajas. Estos incluyen: (1) efectos directos de los neurotransmisores liberados sobre la contraccion del musculo liso; (2) cambios en la permeabilidad microvascular que dan como resultado la extravasacion de plasma y el edema de la vejiga, la uretra y la prostata; (3) infiltracion de celulas inmunitarias; y (4) sensibilizacion de los nociceptores (hiperalgesia secundaria), que produce un aumento del dolor. Las consecuencias de estos procesos pueden afectar a la capacidad normal de la vejiga y a la frecuencia de miccion, y a menudo ocasionan hipersensibilidad, dolor y espasmo del musculo liso.
La respuesta fisiopatologica a un traumatismo procedimental de las vfas urinarias implica una cascada compleja de senalizacion molecular y cambios bioqmmicos que causa inflamacion, dolor, espasmo y smtomas de las vfas urinarias bajas. Estos se tratan preferiblemente de acuerdo con los metodos y composiciones de la presente invencion mediante la administracion local y periprocedimental de una combinacion de agentes farmacologicos que actuan sobre multiples dianas moleculares para inhibir el dolor, la inflamacion y/o el espasmo. Los agentes preferidos incluyen inhibidores de la ciclooxigenasa y antagonistas de los canales de calcio, mas preferiblemente en combinacion.
Inhibidores de la ciclooxigenasa
Las prostaglandinas se producen a lo largo de las vfas urinarias bajas y desempenan un papel en la neurotransmision, en la contractilidad de la vejiga y en las respuestas inflamatorias. Se ha encontrado que la mucosa de la vejiga humana contiene varios tipos de prostaglandinas, que se ha demostrado que contraen el musculo detrusor humano. La prostaglandina E2 (PGE2) es un potente mediador del dolor y el edema, y la administracion exogena de PGE2 induce respuestas contractiles en las vejigas inflamadas. La PGE2 intravesical produce tanto la necesidad imperiosa de orinar como las contracciones involuntarias de la vejiga. Lepor, H., The Pathophysiology of Lower Urinary Tract Symptoms in the Ageing Male Population, Br. J Urol., 81 Suppl 1 :29-33 (1998); Maggi, C, et al, Prostanoids Modulate Reflex Micturition by Acting Through Capsaicin-Sensitive Afferents, Eur. J. Pharmacol. 145: 105-12 (1988). La PGE2 administrada intravesicalmente puede estimular la miccion mediante la liberacion de taquicininas de los nervios en el urotelio y/o inmediatamente debajo del urotelio. Ishizuka, O., et al., Prostaglandin E2-Induced Bladder Hyperactivity in Normal, Conscious Rats: Involvement of Tachykinins?, J Urol. 153:2034-38 (1995). Los prostanoides pueden, a traves de la liberacion de taquicininas, contribuir tanto a la necesidad imperiosa de orinar como a la hiperactividad de la vejiga que se ven en las afecciones inflamatorias de las vfas urinarias bajas. Aunque no se desea limitarse a la teona, estas acciones estan muy probablemente mediadas por la activacion de los subtipos espedficos de receptores de prostanoides (EPlR) localizados en las fibras C y en el musculo liso de la vejiga (Figura 1).
En la vejiga inflamada, la produccion basal de PGE2 es significativamente mas alta que en las condiciones de control. Una serie de mediadores inflamatorios que actuan a traves de rutas de GPCR que estan ligados a la produccion de acido araquidonico puede regular por incremento los niveles de prostaglandinas en la mucosa y en el
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endotelio vascular. La bradicinina es un mediador de la inflamacion bien establecido, y los agonistas de los receptores de bradicinina estimulan una produccion mayor de PGE2 en las vejigas inflamadas que en las vejigas control. La aplicacion topica de bradicinina activa los nervios sensoriales de la vejiga. Lecci, A., et al., Kinin B1 Receptor-Mediated Motor Responses in Normal or Inflamed Rat Urinary Bladder in Vivo, Regul. Pept. 80:41-47 (1999); Maggi, C, et al., Multiple Mechanisms in the Motor Responses of the Guinea-Pig Isolated Urinary Bladder to Bradykinin, Br. J. Pharmacol. 98:619-29 (1989). Las respuestas contractiles provocadas por los agonistas selectivos de los receptores B1 y B2 ensayados en tiras de vejiga urinaria de rata aisladas mostraron que las respuestas contractiles a un agonista selectivo de B1 tambien se vieron aumentadas en las vejigas inflamadas. El papel de la bradicinina en la miccion refleja se ha investigado tambien en ratas normales utilizando cistometrfa de perfusion continua. La perfusion de bradicinina produjo una disminucion significativa en el intervalo entre contracciones (ICI) entre sucesos de miccion y un aumento en la amplitud de contraccion de la vejiga que es completamente bloqueado por un antagonista del receptor B2.
La fuga microvascular inducida por la administracion de la sustancia P que actua a traves del receptor NK1 implica tambien la liberacion de metabolitos de acido araquidonico por la ciclooxigenasa. Abelli, L., et al., Microvascular Leakage Induced by Substance P in Rat Urinary Bladder: Involvement of Cyclo-oxygenase Metabolites of Arachidonic Acid, J. Auton. Pharmacol. 12:269-76 (1992). Estos hallazgos demuestran que distintos mediadores inflamatorios actuan a traves de mecanismos de receptores independientes para desencadenar la produccion de prostaglandinas. Los AINEs que actuan en un objetivo comun aguas abajo de multiples GPCRs para inhibir las COX- 1/COX-2 tienen la capacidad de bloquear la formacion de prostaglandinas derivadas de multiples mediadores proinflamatorios.
Una serie de estudios han demostrado que tanto la COX-1 como la COX-2 estan implicadas en la produccion de PGE2 durante el traumatismo tisular y la respuesta inflamatoria aguda. Martinez, R., et al., Involvement of Peripheral Cyclooxygenase-1 and Cyclooxygenase-2 in Inflammatory Pain, J Pharm Pharmacol. 54:405-412 (2002); Mazario, J, et al., Cyclooxygenase-1 vs. Cyclooxygenase-2 Inhibitors in the Induction of Antinociception in Rodent Withdrawal Reflexes, Neuropharmacology. 40:937-946 (2001); Torres-Lopez, J., et al., Comparison of the Antinociceptive Effect of Celecoxib, Diclofenac and Resveratrol in the Formalin Test, Life Sci. 70:1669-1676 (2002). En vejigas normales, la activacion de los receptores B2 provoca la contraccion de la vejiga mediada por la actividad de la COX-1, mientras que la actividad de la COX-2 esta implicada en la produccion de PGE2 dirigida a traves de la estimulacion de los receptores B1 solamente. La COX-2 es la principal isoforma que se expresa rapidamente y se aumenta notablemente durante la inflamacion de la vejiga. Se cree que es responsable de los altos niveles de prostanoides liberados durante la inflamacion aguda y cronica de la vejiga. La COX-2 se regula por incremento en respuesta a las citocinas proinflamatorias y al tratamiento de la vejiga, con endotoxina o con ciclofosfamida, indistintamente. Ambas isoenzimas COX son por lo tanto objetivos moleculares adecuados para las composiciones de farmacos de la presente invencion.
Un aspecto de la presente invencion se refiere a composiciones terapeuticas, que incluyen un inhibidor de la ciclooxigenasa en un vehiculo adecuado para administracion local a estructuras urologicas en las vias urinarias. Para alcanzar la maxima inhibicion de la sintesis de prostaglandinas en los sitios de inflamacion aguda, se cree que es deseable inhibir ambas isoenzimas COX.
El inhibidor de las COX es por lo tanto preferiblemente no selectivo con respecto a la actividad en la COX-1 y en la COX-2, lo que para los fines de la presente invencion puede ser definido como un agente para el cual la relacion de
(a) la concentracion del agente eficaz para la inhibicion de 50 % (IC50) de la actividad de la COX-1 con respecto a
(b) la IC50 para la inhibicion de la actividad de COX-2 es mayor que o igual a 0,1 y menor que o igual a 10,0, y mas preferiblemente es mayor que o igual a 0,1 y menor que o igual a 1,0. Los ensayos adecuados para determinar el efecto inhibidor de COX-1 y COX-2 estan descritos en Riendau, D., et al., Comparison of the Cyclooxygenase-1 Inhibitory Properties of Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs) and Selective COX-2 Inhibitors, Using Sensitive Microsomal and Platelet Assays, Can. J. Physiol. Pharmacol. 75:1088-1095 (1997).
Los inhibidores no selectivos de COX-1/COX-2 adecuados incluyen, a fines de ilustracion, derivados del acido salicilico, incluyendo aspirina, salicilato de sodio, trisalicilato de colina y magnesio, salsalato, diflunisal, sulfasalazina y olsalazina, derivados de para-aminofenol tales como acetaminofeno, indol y acidos indeno-aceticos tales como indometacina y sulindac, acidos heteroaril-aceticos, incluyendo tolmetina, diclofenaco y ketorolaco, acidos arilpropionicos incluyendo ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, fenoprofeno y oxaprozina, acidos antranilicos (fenamatos), incluyendo acido mefanamico y acido meclofenamico, acidos enolicos, incluyendo oxicams tales como piroxicam y meloxicam y alcanonas, tales como nabumetona, asi como esteres, sales, isomeros, conjugados y profarmacos farmaceuticamente eficaces de los mismos.
Aun mas preferiblemente, el inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 es un acido arilpropionico, esto es, un derivado del acido propionico, tal como ketoprofeno, dexketoprofeno, ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno y oxaprozina. Lo mas preferiblemente, el agente es ketoprofeno.
En otro aspecto de la invencion, el inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 utilizado en las composiciones y metodos de la presente invencion se selecciona por tener una IC50 para la inhibicion de la contractilidad de la tira del musculo liso de la vejiga inducida por bradicinina (como se determina por el modelo de contractilidad de la vejiga descrito en
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esta memoria mas adelante) de menos de o igual a 100 pM, preferiblemente menos de o igual a 25 pM, mas preferiblemente menos de o igual a 5 pM, aun mas preferiblemente menos de 2 pM.
En un aspecto adicional de la invencion, el inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 utilizado en las composiciones y metodos de la presente invencion se selecciona por tener una IC50 para la inhibicion de la prostaglandina E2 (PGE2) inducida por bradicinina (como se determina por el modelo de analisis de PGE2 del tejido de vejiga descrito en esta memoria mas adelante) de menos de o igual a 100 pM, preferiblemente menos de o igual a 25 pM, mas preferiblemente menos de o igual a 5 pM, aun mas preferiblemente menos de 2 pM.
En un aspecto adicional mas de la invencion, el inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 utilizado en las composiciones y metodos de la presente invencion se selecciona por tener (a) una IC50 para la inhibicion de la contractilidad de una tira de musculo liso de la vejiga inducida por bradicinina (como se determina por el modelo de contractilidad de la vejiga que se describe en esta memoria mas adelante) de menos de o igual a 100 pM, preferiblemente menos de o igual a 25 pM, mas preferiblemente menos de o igual a 5 pM, aun mas preferiblemente menos de 2 pM, y ( b) una IC50 para la inhibicion de la PGE2 inducida por bradicinina (como se determina por el modelo de analisis de PGE2 de tejidos de la vejiga descrito en esta memoria mas adelante) de menos de o igual a 100 pM, preferiblemente menos de o igual a 25 pM, mas preferiblemente menos de o igual a 5 pM, aun mas preferiblemente menos de 2 pM.
Las concentraciones IC50 indicadas antes no se deben interpretar como limitaciones de las concentraciones de farmaco en las composiciones de la presente invencion, que pueden ser determinadas convenientemente por las concentraciones necesarias para alcanzar la maxima eficacia y que por lo tanto pueden ser mas altas que los niveles de IC50.
En un aspecto adicional mas de la invencion, el inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 utilizado en las composiciones y metodos de la presente invencion se selecciona por tener una pA2 (potencia antagonista) mayor que o igual a 7, en donde pA2 es el logaritmo negativo de la concentracion de antagonista que producirfa un aumento al doble en la curva concentracion-respuesta para un agonista, y es una medida logarftmica de la potencia de un antagonista. Esta potencia corresponde a una constante de disociacion en equilibrio Kd de menos de o igual a 100 nM.
En un aspecto adicional mas de la invencion, el inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2 utilizado en las composiciones y metodos de la presente invencion exhibe un 50 % de la respuesta inhibidora maxima en menos de o igual a 10 minutos en un estudio cinetico de respuesta de PGE2 estimulada por bradicinina, en el modelo de analisis de PGE2 en tejido de la vejiga descrito aquf mas adelante.
Ketoprofeno
A menos que se utilice en un contexto que haga tambien referencia a su isomero, las referencias en esta memoria para el uso de ketoprofeno (esto es, acido m-benzoilhidratropico o acido 3-benzoil-a-metilbencenoacetico) en la presente invencion, se debe entender que incluyen tambien los isomeros farmaceuticamente aceptables del mismo, incluyendo su S-(+)-enantiomero racemico, dexketoprofeno, sus sales o esteres farmaceuticamente aceptables, y sus profarmacos o conjugados farmaceuticamente aceptables. El ketoprofeno es un inhibidor de la COX preferido para uso en la presente invencion.
El ketoprofeno presenta acciones anti-inflamatorias, analgesicas, y antipireticas potentes que se asocian con la inhibicion de la sfntesis de prostaglandinas y el antagonismo de los efectos de la bradicinina. El ketoprofeno inhibe de forma no selectiva la actividad de COX-1 y COX-2, lo que da como resultado el bloqueo de la produccion de prostaglandinas, particularmente la de PGE2, evitando el desarrollo de hiperalgesia. El ketoprofeno tiene un valor de IC50 de 4-8 nM en un ensayo no selectivo de COX, siendo funcionalmente 6 - 12 veces mas potente que otros AINEs evaluados (por ejemplo, naproxeno o indometacina). Kantor, T., Ketoprofen: A review of its Pharmacologic and Clinical Properties, Pharmacotherapy 6:93-103 (1986). El ketoprofeno tiene tambien actividad funcional antagonista de la bradicinina, siendo sus efectos ocho veces mayores que los observados con el AINE clasico, indometacina. Julou, L., et al., Ketoprofen (19.583 R.P.) (2-(3-Benzoylphenyl)-propionic acid). Main Pharmacological Properties - Outline of Toxicological and Pharmacokinetic Data, Scand J Rheumatol Suppl. 0:33-44 (1976).
Ademas de inhibir la ciclooxigenasa, se cree que el ketoprofeno ofrece el beneficio anti-inflamatorio adicional de inhibir la lipoxigenasa. Se ha encontrado tambien que el ketoprofeno es sinergico con el nifedipino en la inhibicion del espasmo de vejiga, como se expone con mayor detalle en los ejemplos mas adelante.
Antagonistas de los canales de calcio
En respuesta a las lesiones tisulares se liberan en la vejiga multiples mediadores inflamatorios, incluyendo la bradicinina, que pueden desencadenar la contraccion y el espasmo del musculo liso. El tono del musculo liso de la vejiga urinaria esta regulado por numerosos sistemas de receptores que promueven la contraccion. Estos incluyen sistemas bien establecidos, tales como los receptores muscarfnicos, purinergicos y receptores de taquicininas
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[Anderson, K., et al., Pharmacolgy of the Lower Urinary Tract: Basis for Current and Future Treatments for Urinary Incontenance Pharmacol Rev. 56:581-631 (2004)], e incluyen tambien los receptores de endotelina [Afiatpour, P., et al., Development Changes in the Functional, Biochemical and Molecular Properties of Rat Bladder Endothelin Receptors, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 367:462-72 (2003)], los receptores activados por proteasas y los receptores de la bradicinina [Kubota, Y., et al., Role of Mitochondria in the Generation of Spontaneous Activity in Detrusor Smooth Muscles of the Guinea Pig Bladder, J. Urol. 170:628-33 (2003); Trevisani, M., et al., Evidence for In Vitro Expression of B1 Receptor in the Mouse Trachea and Urinary Bladder, Br. J. Pharmacol. 126:1293-1300 (1999)]. Debido a que muchos de estos receptores se acoplan prototfpicamente a traves de las protefnas Gq para la activacion de una fosfolipasa C (PLC), es probable que la contraccion de la vejiga provocada por dichos receptores este mediada parcialmente por la movilizacion, ligada a PLC, del Ca2+ de los depositos intracelulares. [Ouslander, J. G., Management of Overactive Bladder, N. Engl. J. Med., 350:786-99 (2004)].
Las contracciones, mediadas neuralmente, del musculo liso de la vejiga y de la uretra requieren la movilizacion del Ca2+ intracelular, asf como una afluencia de Ca2+ extracelular. La entrada de Ca2+ a traves de los canales de calcio tipo L puede contribuir a las contracciones musculares al provocar la liberacion intracelular de Ca2+, que abre los canales de liberacion de Ca2+ sensibles a la rianodina en el retfculo sarcoplasmico. La apertura de los canales de calcio tipo L en el musculo de la vejiga sirve tambien para reemplazar los depositos de Ca2+ intracelular despues de la contraccion. Estudios recientes concluyen que la contraccion de vejigas de ratas inducida por carbacol, mediada por la senalizacion de subtipos de receptores muscarfnicos, depende en gran medida de la entrada de Ca2+ a traves de los canales de calcio tipo L y, quizas, los canales de Ca2+ operados por PLD, PLA2 y por los depositos. Schneider, T., et al., Signal Transduction Underlying Carbachol-induced Contraction of Rat Urinary Bladder: I. Phospholipases and Ca2+ sources, J Pharmacol Exp Ther (2003). Por lo tanto, el bloqueo de los canales de Ca2+ tipo L tiene el potencial de deprimir las contracciones provocadas en el musculo neural, urotelial y liso de las tiras de vejiga, mediadas por una multiplicidad de agonistas de GPCR endogenos. El canal de calcio tipo L representa un punto de integracion para la convergencia de multiples mediadores inflamatorios que pueden llevar a la contractilidad del musculo liso hiperactivo.
Los canales de Ca2+ localizados en los terminales nerviosos aferentes y eferentes de las vfas urinarias bajas son importantes tambien para la regulacion de la liberacion de neurotransmisores. de Groat, W., et al., Pharmacology of the Lower Urinary Tract, Annu. Rev. Pharmacol Toxicol. 41: 691-721 (2001). Una serie de agentes activos producen la afluencia de Ca2+ y la liberacion de transmisores desde las terminaciones nerviosas perifericas de las neuronas aferentes sensibles a la capsaicina a traves de canales de Ca2+ sensibles al voltaje. Bajo ciertas condiciones, los canales de Ca2+ tipo L pueden contribuir tambien a la liberacion de transmisores.
El importante papel del canal de Ca2+ tipo L en la iniciacion de la contraccion del musculo liso hace que este canal sea una diana terapeutica potencial para el tratamiento de problemas de las vfas urinarias bajas que implican hiperactividad o espasmo de los tejidos de musculo liso. En presencia de mediadores inflamatorios, la senalizacion a traves de estos mismos canales puede mediar la hiperactividad y el espasmo de la vejiga.
Un aspecto de la presente invencion se dirige por lo tanto a composiciones terapeuticas que incluyen un antagonista de los canales de calcio en un vehfculo adecuado para administracion a estructuras urologicas de las vfas urinarias. El antagonista de los canales de calcio es preferiblemente un antagonista de canales de calcio tipo L, tal como verapamilo, diltiazem, bepridil, mibefradil, nifedipino, nicardipino, isradipino, amlodipino, felodipino, nisoldipino y nimodipino, asf como los esteres, sales, isomeros, conjugados y profarmacos farmaceuticamente eficaces de los mismos. Aun mas preferiblemente, el antagonista de los canales de calcio es una dihidropiridina, tal como nifedipino, nicardipino, isradipino, amlodipino, felodipino, nisoldipino y nimodipino, asf como los esteres, sales, isomeros, conjugados y profarmacos farmaceuticamente eficaces de los mismos. Mas adecuadamente, el agente es nifedipino.
Nifedipino
Las referencias de la presente memoria a nifedipino, ester dimetflico del acido 1,4-d ihidro-2,6-d imetil-4-(2-n itrofe nil)- 3,5-piridindicarboxflico, se debe entender que incluyen tambien sus isomeros farmaceuticamente aceptables, sus sales o esteres farmaceuticamente aceptables, y sus profarmacos o conjugados farmaceuticamente aceptables. El nifedipino es un antagonista preferido de los canales de calcio para uso en la presente invencion.
El nifedipino es un miembro de la clase de las dihidropiridinas de antagonistas de los canales de calcio con especificidad farmacologica para el canal tipo L (alternativamente denominado subunidad a Cav1.2). El nifedipino tiene un inicio de accion rapido (menos de 10 minutos), lo que es deseable para su uso en procedimientos urologicos, y por ello es mas preferido que ciertos antagonistas de los canales de calcio de dihidropiridina estrechamente relacionados (por ejemplo, amlodipino) que requieren perfodos mas largos para la accion inicial. El tiempo de respuesta para la inhibicion en estado estacionario de la contraccion muscular se produce idealmente antes de 10-15 minutos de la administracion de farmaco inicial local, y el nifedipino cumple este criterio.
Vehfculos
Los agentes de dolor/inflamacion y/o de espasmo de la presente invencion se administran adecuadamente en solucion o en suspension en un vehfculo lfquido, el cual tal como se usa en esta memoria, se pretende que incluya
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disolventes, suspensiones, geles polimerizables y no polimerizables, pastas y pomadas biocompatibles. Preferiblemente, el vehnculo es una solucion para irrigacion acuosa que puede incluir o no electrolitos fisiologicos, tales como solucion salina, agua destilada, solucion lactato de Ringer, soluciones de glicina, soluciones de sorbitol, soluciones de manitol o soluciones de sorbitol/manitol. El vetnculo puede incluir tambien un vetnculo para administracion de liberacion sostenida, tal como micropartfculas, microesferas o nanopartfculas compuestas de protemas, liposomas, hidratos de carbono, compuestos organicos sinteticos, o compuestos inorganicos.
Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden recubrir sobre stents ureterales y uretrales, cateteres, semillas radiactivas, espaciadores de semillas y otros dispositivos implantables y sobre instrumentos quirurgicos, para la administracion local desde tales dispositivos e instrumentos a las vfas urinarias, como se describe mas adelante. Los pohmeros que se pueden emplear adecuadamente para formar un stent o cualquier otro dispositivo implantable impregnado de farmaco, incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, copohmeros de bloque de poli(acido D,L-lactico) (PDLLA), poli(lactida-co-gliocida) (PLGA), poli(acido L-lactico) (PLLA), poli(acido glicolico), poli(acido 6-hidroxicaproico), poli(acido 5-hidroxivalerico), poli(acido 4-hidroxibutmco), poli(etilenglicol), poli(oxido de etileno)-poli(oxido de propileno)-poli(oxido de etileno) (PEO-PPO-PEO, PluronicsTM), y copolfmeros y mezclas de los anteriores.
Los materiales adecuados para uso en la produccion de los stents, cateteres, otros dispositivos e instrumentos implantables, recubiertos de farmaco, incluyen pohmeros e hidrogeles polimericos biodegradables, tales como a modo de ejemplo no limitativo, copohmeros tribloque Pluronics™, PLLAs o sus copoliesteres, poli(acido glicolico) o sus copoliesteres, hidrogeles de poli(oxido de etileno) - ciclodextrina (polirotaxan), hidrogeles de poli[(R)-3- hidroxibutirato]-poli(oxido de etileno) - ciclodextrina, acetato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato propionato de celulosa, y nitrato de celulosa; resinas de poliuretano, incluyendo el producto de reaccion de diisocianato de 2,4-tolileno, diisocianato de 4,4'-difenilmetano, isocianato de polimetilenpolifenilo, o diisocianato de 1,5-naftileno con 1,2-polipropilenglicol, politetrametilenglicol eter, 1,4-butanodiol, 1,4-butilen-glicol, 1,3-butilen-glicol, poli(1,4-oxibutilen)glicol, caprolactona, esteres del acido ad^pico, anhidrido ftalico, etilenglicol, 1,3-butilenglicol, 1,4- butilenglicol o dietilenglicol; pohmeros acnlicos tales como acrilato y metacrilato de etilo y metilo; pohmeros de condensacion tales como los producidos por sulfonamidas tales como toluenosulfonamida y aldehndos tales como formaldel'ndo; compuestos de isocianato; poli(orto-esteres); poli(anl'ndridos); poliamidas; policianoacrilatos, poli(aminoacidos), policarbonato), poli(alcohol vimlico) reticulado, poliacetales, policaprolactona. Ademas de estos polfmeros biodegradables, los pokmeros no biodegradables adecuados incluyen poliacrilatos, poliestirenos, cloruro de polivinilo, copohmeros de etileno-acetato de vinilo, fluoruro de polivinilo, poli(vinil imidazol) y poliolefinas clorosulfonadas.
Las composiciones inhibidoras del dolor/inflamacion y/o del espasmo de la presente invencion tambien pueden incluir excipientes o adyuvantes para aumentar la absorcion, liberacion, solubilidad y estabilidad. Aspectos de la formulacion de las composiciones de la presente invencion se exponen mas adelante.
Agentes adicionales
Las composiciones de inhibidor de la ciclooxigenasa, antagonista de los canales de calcio o una combinacion de inhibidor de la ciclooxigenasa mas antagonista de los canales de calcio de la presente invencion, pueden incluir agentes alternativos o adicionales que inhiben el dolor, la inflamacion y/o el espasmo. Los agentes adecuados incluyen los descritos en la patente de Estados Unidos 5.858.017 de Demopulos.
En particular, los agentes anti-inflamacion/anti-dolor adecuados alternativos o adicionales incluyen antagonistas de los receptores de serotonina, (por ejemplo, amitriptilina, imipramina, trazodona, desipramina, ketanserina, tropisetron, metoclopramida, cisaprida, ondansetron, yohimbina, GR127935, metiotepina), agonistas de los receptores de serotonina (por ejemplo, buspirona, sumatriptan, dihidroergotamina, ergonovina), antagonistas de los receptores de histamina (por ejemplo, prometazina, difenhidramina, amitriptilina, terfenadina, mepiramina (pirilamina), tripolidina), antagonistas del receptor de bradicinina (por ejemplo, [Leu8] des-Arg9-BK, derivado [des- Arg10] de HOE 140, [leu9] [des-Arg10]kalliden, [D-Phe7]-BK, NPC 349, NPC 567, HOE 140), inhibidores de kallikrien (por ejemplo, aprotinina), antagonistas de los receptores de taquicininas, incluyendo antagonistas de subtipos de receptores de neurocinina1 (por ejemplo, GR 82334, CP 96.345, RP 67580) y antagonistas de subtipos de receptores de neurocinina2 (por ejemplo, MEN 10.627, L 659.877, (±)-SR 48968), antagonistas del receptor del peptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) [por ejemplo, aCGRP- (8-37)], antagonistas del receptor de la interleucina (por ejemplo, Lys-D-Pro-Thr), inhibidores de la fosfolipasa, incluyendo inhibidores de la isoforma PLA2 (por ejemplo, manoalida) e inhibidores de la isoforma PLCy (por ejemplo, 1-[6-((17p-3-metoxiestra-1,3,5(10)-trien-17- il)amino)hexil]-1H-pirrol-2,5-diona), inhibidores de la lipooxigenasa, (por ejemplo, AA 861), antagonistas de los receptores prostanoides que incluyen antagonistas de subtipos de receptores eicosanoides EP-1 y EP-4 y antagonistas de subtipos de receptores de tromboxano (por ejemplo, SC 19220), antagonistas de los receptores de leucotrienos, incluyendo antagonistas de subtipos de receptores B4 de leucotrieno y antagonistas de subtipos de receptores D4 de leucotrieno, (por ejemplo, SC 53228 ), agonistas de los receptores opioides, incluyendo los agonistas de subtipos de receptores p-opioides, 6-opioides y K-opioides, (por ejemplo, DAMGO, sufentanilo, fentanilo, morfina, Pl 017, DPDPe, U50,488), agonistas y antagonistas de purinoceptores incluyendo antagonistas de los receptores P2x y agonistas de los receptores P2y, (por ejemplo, suramina, PPADS), abridores del canal de potasio -sensible a trifosfato de adenosina (ATP), (por ejemplo, cromakalim, nicorandil, minoxidil, P 1075, KRN 2391,
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Los agentes inhibidores del espasmo alternativos o adicionales apropiados incluyen antagonistas de los receptores de serotonina (por ejemplo, amitriptilina, imipramina, trazodona, desipramina, ketanserina, tropisetron, metoclopramida, cisaprida, ondansetron, yohimbina, GR127935, metiotepina, oximetazolina), antagonistas de los receptores de taquicininas, incluyendo los antagonistas de subtipos de receptores de neurocinina1 (por ejemplo, GR 82334, CP 96.345, RP 67580) y antagonistas de subtipos de receptores de neurocinina2 (por ejemplo, MEN 10.627, L 659.877, (±)-SR 48968), abridores de los canales de potasio sensibles a trifosfato de adenosina (ATP), (por ejemplo, cromakalim, nicorandil, minoxidil, P 1075, KRN 2391, (-)pinacidil), donantes de oxido nftrico, (por ejemplo, nitroglicerina, nitroprusiato de sodio, SIN-1, SNAP, FK 409 (NoR-3), FR 144420 (NOR-4), antagonistas del receptor de la endotelina, (por ejemplo, BQ 123, FR 139317, BQ 610) y anticolinergicos, incluyendo los antimuscarfnicos (por ejemplo, ditropan, tropicamida, ciclopentolato, escopolamina, atropina, homatropina y oxibutinina), antinicotfnicos (por ejemplo, trimetafan, macamilamina, pentolinio, pempidina y hexametomio) y antihistamfnicos de primera generacion (por ejemplo, difenhidramina).
Metodos de uso
Administracion periprocedimental
Se espera que la administracion perioperatoria local de las composiciones de la presente invencion inhiba de manera preventiva el dolor, la inflamacion y el espasmo del musculo liso, asociados en general con los procedimientos urologicos. Las composiciones de la presente invencion actuan sobre dianas moleculares, esto es, receptores, enzimas y canales ionicos, que inician las rutas y mecanismos del dolor, la inflamacion y el espasmo. La presente invencion emplea la administracion periprocedimental local para inhibir estos procesos fisiopatologicos en el momento en que se inician. Por ejemplo, multiples peptidos proinflamatorios estimulan la liberacion de PGE2 del tejido de la vejiga en los primeros cinco minutos de exposicion, como se muestra en los ejemplos mas adelante. Unicamente los agentes terapeuticos administrados postprocedimentalmente pueden tener efecto solamente una vez que estos procesos han comenzado.
Administracion local
La administracion local de farmacos de acuerdo con la presente invencion permite la utilizacion de una dosis mucho mas baja de la que serfa necesaria si los mismos farmacos se administraran por via sistemica (por ejemplo, oralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente) para alcanzar el mismo nivel local predeterminado de efecto inhibidor en las vfas urinarias. La administracion local, enfocada, de la presente invencion da como resultado un nivel plasmatico del farmaco significativamente mas bajo que el que resultana de la administracion sistemica del farmaco para alcanzar el mismo nivel local predeterminado de efecto inhibidor en las vfas urinarias, reduciendo de este modo el potencial de efectos secundarios sistemicos indeseables. La administracion local permite la inclusion en las composiciones de la presente invencion de farmacos tales como los peptidos que no son susceptibles de administracion sistemica debido a la degradacion durante el metabolismo de primero y segundo paso.
La administracion local de composiciones de farmacos de acuerdo con la presente invencion proporciona una concentracion terapeutica inmediata y segura en el sitio local de las vfas urinarias, que no depende de variaciones en el metabolismo o en la funcion del organo. Se puede mantener una concentracion constante de los farmacos durante el perfodo de administracion de la composicion durante el procedimiento.
Procedimientos urologicos
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Las composiciones de la presente invencion se pueden administrar localmente antes, durante y/o despues de la cistoscopia, esto es, el examen endoscopico de la uretra y de la vejiga a traves de un cistoscopio insertado en las vfas urinarias bajas con el fin de examinar las estructuras de las vfas urinarias, preferiblemente periprocedimentalmente durante dichos procedimientos. Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden usar antes, durante y/o despues de (preferiblemente periprocedimentalmente durante) otros procedimientos de diagnostico, intervencion, medicos y quirurgicos realizados conjuntamente con la cistoscopia, mediante la insercion de instrumentos quirurgicos a traves del cistoscopio, tales como para extraccion de tejido para biopsia, eliminacion de tumores, eliminacion de cuerpos extranos, separacion de piedras del rinon o de la vejiga, colocacion, retirada y manipulacion de stents uretrales, reseccion transuretral de tumores de vejiga (TURBT), tratamiento de tumores con electrocauterizacion o laser o compuestos quimioterapeuticos locales, tratamiento de hemorragias en la vejiga o para aliviar las obstrucciones en la uretra.
Las composiciones de la presente invencion se pueden administrar localmente a las vfas urinarias antes, durante y/o despues de la ureteroscopia, esto es, el examen endoscopico de los ureteres y tejidos renales a traves de un ureteroscopio insertado a traves de la uretra y la vejiga y en un ureter con el fin de examinar las estructuras de las vfas urinarias, preferiblemente perioperativamente durante tales procedimientos. La ureteroscopia se realiza a menudo para la toma de muestras de orina de cada rinon, para la colocacion, retirada y manipulacion de los stents ureterales, como parte del tratamiento de los calculos renales, o para colocar un cateter en el ureter para una pielograffa retrograda, y las composiciones de la presente invencion se pueden administrar antes, durante y/o despues de tales procedimientos, preferiblemente periprocedimentalmente durante tales procedimientos. Se puede utilizar para capturar las piedras, un cestillo u otro instrumento empleado a traves del ureteroscopio, se puede romper la piedra por laser o litotricia por ondas de choque a traves del ureteroscopio o se puede emplear el ureteroscopio para desplazar una piedra atrapada de nuevo hacia el rinon para la subsiguiente rotura y eliminacion, tal como mediante el uso de laser o litotricia extracorporea por ondas de choque (ESWL).
Las composiciones de la presente invencion se administran de forma adecuada localmente a las vfas urinarias antes, durante y/o despues de procedimientos que normalmente dan lugar a un espasmo ureteral, tales como la separacion de calculos renales utilizando tratamiento con laser, la cistoscopia, la ureteroscopia o la litotricia, y preferiblemente periprocedimentalmente durante los procedimientos de separacion de dichos calculos.
Las composiciones de la presente invencion se pueden administrar tambien localmente a las vfas urinarias, antes, durante y/o despues de (preferiblemente periprocedimentalmente) procedimientos urologicos que causan traumatismo termico al tejido de las vfas urinarias y/o asociado con ellas. Estos incluyen el tratamiento con laser para fragmentar las piedras o causar la ablacion del tejido, la ablacion por microondas de tejido (por ejemplo, termoterapia transuretral con microondas (TUMT) para separar el tejido prostatico), la ablacion de tejidos por radiofrecuencia (por ejemplo, la ablacion transuretral con aguja (TUNA) para separar el tejido prostatico), electrocauterizacion o vaporizacion de tejido o crioablacion de tejido.
Las composiciones de la presente invencion se pueden administrar tambien localmente a las vfas urinarias, antes, durante y/o despues de (preferiblemente periprocedimentalmente) procedimientos urologicos que emplean laser para la reseccion de tejido, incluyendo las terapias con laser de "luz verde" de holmio: itrio-aluminio-granate (Ho: YAG), neodimio:itrio-aluminio-granate (Nd: YAG) y potasio-titanilo-fosfato (KTP). Tales procedimientos con laser pueden incluir el tratamiento de la hiperplasia prostatica benigna (BPH) y los tumores de vejiga, a modo de ejemplo no limitativo.
La composicion de ketoprofeno, la composicion de la combinacion de antagonista de los canales de calcio y ketoprofeno y la composicion de combinacion preferida de ketoprofeno y nifedipino de la presente invencion tambien se pueden administrar localmente a las vfas urinarias, antes, durante y/o despues de (preferiblemente periprocedimentalmente) la reseccion transuretral de la prostata (TURP).
Ademas de los procedimientos transuretrales, tales como los indicados anteriormente, las composiciones de la presente invencion se pueden emplear tambien adecuadamente para la administracion local durante otros procedimientos urologicos mfnimamente invasivos. Estos incluyen, a modo de ejemplo, la administracion transrectal o transperitoneal de las composiciones de la presente invencion a la prostata y estructuras anatomicas circundantes durante la implantacion de semillas radiactivas y espaciadores de semillas para tratar el cancer de prostata o la prostatitis, y la administracion transrectal o transperitoneal de las composiciones de la presente invencion a la prostata para tratar la prostatitis.
Los composiciones de la presente invencion se administran de manera adecuada localmente a las vfas urinarias antes, durante y/o despues de (preferiblemente periprocedimentalmente) procedimientos que incluyen irrigacion, tales como la TURP, incision transuretral de la prostata (TUIP), prostatectomfa con laser, cistoscopia, ureteroscopia y otros procedimientos en los que se utiliza la irrigacion para ayudar a la visualizacion mediante la eliminacion de sangre y restos de tejidos del campo operatorio. Las composiciones de la presente invencion se pueden anadir a la solucion de irrigacion utilizada de forma estandar en tales procedimientos, por ejemplo, solucion salina, agua destilada, solucion lactato de Ringer, glicina, sorbitol, manitol, sorbitol/manitol, a niveles diluidos, sin que sea necesario ningun cambio en el procedimiento estandar del urologo.
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Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden administrar localmente mediante el recubrimiento de stents ureterales, stents uretrales, cateteres, semillas radiactivas, espaciadores de semillas u otros dispositivos implantables o instrumentos quirurgicos, o impregnando o incorporando de otra manera los agentes terapeuticos en el cuerpo de los stents, cateteres, semillas radiactivas, espaciadores de semillas u otros dispositivos implantables o instrumentos quirurgicos construidos de un material o red polimerica. Los metodos para recubrir dispositivos con farmacos e impregnar dispositivos con farmacos son bien conocidos por los expertos en la tecnica, y se pueden disenar recubrimientos o materiales polimericos que permitan que los farmacos (por ejemplo, un inhibidor de la COX y un antagonista de los canales de calcio) se empiecen a liberar en las vfas urinarias despues de la implantacion y continuen durante un perfodo de tiempo despues de la implantacion.
Formulacion
Un aspecto de la invencion se dirige a una composicion que incluye un inhibidor de la ciclooxigenasa y un antagonista de los canales de calcio, preferiblemente ketoprofeno y nifedipino, que se disuelven en una solucion acuosa para administracion parenteral, preferiblemente para administracion intravesical. Alternativamente tales composiciones se pueden fabricar en una forma liofilizada y se pueden reconstituir despues con un disolvente acuoso antes de la administracion.
El inhibidor de la ciclooxigenasa y el antagonista de los canales de calcio estan incluidos adecuadamente en una relacion molar (inhibidor de la ciclooxigenasa:antagonista de los canales de calcio) de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5, mas preferiblemente de 4:1 a 1:1 y lo mas preferiblemente 3:1. Similarmente, en una composicion preferida el ketoprofeno y el nifedipino estan incluidos adecuadamente en una relacion molar (ketoprofeno:nifedipino) de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5, mas preferiblemente de 4:1 a 1:1, y lo mas preferiblemente aproximadamente (esto es, ± 20 %) 3:1.
Para las composiciones formuladas para ser administradas localmente en un vehfculo lfquido, el inhibidor de la ciclooxigenasa tal como ketoprofeno se incluye adecuadamente a una concentracion (diluida para administracion local) no superior a 500.000 nanomolar, preferiblemente no superior a 300.000 nanomolar, mas preferiblemente no superior a 100.000 nanomolar y lo mas preferiblemente inferior a 50.000 nanomolar. El antagonista de los canales de calcio tal como nifedipino se incluye adecuadamente a una concentracion (diluida para administracion local) no superior a 200.000 nanomolar, preferiblemente no superior a 100.000 nanomolar, mas preferiblemente no superior a 50.000 nanomolar y lo mas preferiblemente inferior a 25.000 nanomolar.
Las composiciones de la presente invencion se pueden formular en un disolvente acuoso u organico, pero preferiblemente se formulan en un disolvente acuoso. Cuando se utilizan soluciones acuosas, se pueden incluir adecuadamente un disolvente o disolventes adicionales (esto es, co-disolventes o agentes solubilizantes) para ayudar a la disolucion de los farmacos. Los ejemplos de disolventes adecuados incluyen polietilenglicol (PEG) de diferentes pesos moleculares (por ejemplo, PEG 200, 300, 400, 540, 600, 900, 1000, 1450, 1540, 2000, 3000, 3350, 4000, 4600, 6000, 8000, 20.000, 35.000), propilenglicol, glicerina, alcohol etflico, aceites, oleato de etilo, benzoato de bencilo, y dimetil sulfoxido (DMSO). Un codisolvente preferido para las composiciones de la presente invencion es PEG, lo mas preferiblemente PEG 400.
En un aspecto adicional de la presente invencion, la composicion incluye ketoprofeno y nifedipino en una solucion acuosa que incluye al menos un agente estabilizante. El termino agente estabilizante se utiliza en esta memoria para referirse a un agente que inhibe la degradacion de los ingredientes farmaceuticos activos y/o extiende la duracion de la estabilidad de la solucion cuando se almacena en condiciones ya sea de refrigeracion (por ejemplo, 2-8 °C) o de temperatura ambiente, e incluye tanto agentes antioxidantes como agentes quelantes. La solucion puede incluir tambien adecuadamente uno o mas co-disolventes o agentes tampon. Preferiblemente, la solucion acuosa de ketoprofeno y nifedipino incluye uno o mas antioxidantes como agente o agentes estabilizantes, un codisolvente y un agente tampon. La formulacion de la solucion de ketoprofeno y nifedipino preferida es estable cuando se almacena entre 2 °C y 25 °C durante un perfodo de al menos seis meses, preferiblemente un ano, mas preferiblemente dos anos, lo mas preferiblemente mas de dos anos, y se puede diluir facilmente con las soluciones estandar de irrigacion urologica para la administracion intravesical local durante los procedimientos urologicos.
Los ejemplos de antioxidantes adecuados para uso como agentes estabilizantes en las composiciones de la presente invencion incluyen antioxidantes solubles en agua tales como bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, sulfoxilato formaldehfdo de sodio, acido ascorbico, acetilcistefna, cistefna, tioglicerol, acido tioglicolico, acido tiolactico, tiourea, dititreitol, y glutation, o antioxidantes solubles en aceite, tales como galato de propilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, palmitato de ascorbilo, acido nordihidroguaiaretico y a-tocoferol. Un agente estabilizante preferido para la presente invencion es el galato de propilo. Cuando se incluye en una composicion acuosa, se incluye un codisolvente que solubiliza los antioxidantes solubles en aceite tales como el galato de propilo. Una composicion acuosa preferida de ketoprofeno y nifedipino de la presente invencion incluye PEG 400 como co-disolvente y galato de propilo como agente estabilizante, y puede incluir tambien mas preferiblemente un segundo agente estabilizante tal como un antioxidante soluble en agua, lo mas preferiblemente metabisulfito de sodio. Un intervalo de concentracion adecuado para el antioxidante o antioxidantes es tfpicamente de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 5 %, preferiblemente de
aproximadamente 0,002 % a aproximadamente 1,0 %, y mas preferiblemente de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 0,5 %, por peso de la composicion.
Debido a la participacion de cationes divalentes en la catalisis de las reacciones de oxidacion, la inclusion de un agente quelante como un agente estabilizante puede ser util en las composiciones de la presente invencion. Los 5 ejemplos de agentes quelantes adecuados para uso en las composiciones de la presente invencion incluyen las diferentes sales de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido p-hidroxietilendiaminotriacetico (HEDTA), acido dietilentriamino-pentaacetico (DTPA) y nitrilotriacetato (NTA).
Las composiciones de la presente invencion incluyen adecuadamente un agente tampon para mantener el pH. Los ejemplos de agentes tampon adecuados para su inclusion en las composiciones de la presente invencion incluyen 10 acido acetico y sus sales, acido cftrico y sus sales, acido glutamico y sus sales y acido fosforico y sus sales. El acido cftrico tambien tiene la capacidad de quelar cationes divalentes y por lo tanto tambien puede evitar la oxidacion, sirviendo de este modo para dos funciones, como un agente tampon y como un agente estabilizante antioxidante. Una composicion acuosa preferida de ketoprofeno y nifedipino de la presente invencion incluye acido cftrico (tal como en la forma de citrato de sodio) como un agente tampon y antioxidante, y en una composicion mas preferida 15 incluye tambien PEG 400 como codisolvente y galato de propilo y metabisulfito de sodio como agentes estabilizantes.
Las composiciones de la presente invencion pueden incluir tambien excipientes y adyuvantes adicionales. Los excipientes pueden incluir un conservante para proteger contra el crecimiento microbiano, especialmente para envases de dosis multiples. Los excipientes adecuados incluyen agentes antimicrobianos tales como alcohol 20 bencflico, clorobutanol, timiserol, metilparabeno y propilparabeno. Los excipientes pueden incluir tambien un tensioactivo para reducir la tension superficial y facilitar con ello la humectacion para disolucion. Los ejemplos de tensioactivos adecuados incluyen monooleato de sorbitan polioxietilenado y monooleato de sorbitan. Los excipientes pueden incluir tambien agentes para ajustar la tonicidad para hacer que la solucion sea iso-osmotica con los fluidos fisiologicos. Los ejemplos de agentes de tonicidad adecuados incluyen cloruro de sodio, sulfato de sodio, manitol, 25 glucosa, sacarosa, trehalosa, y sorbitol. Excipientes adicionales pueden incluir un colorante para dar color, tales como los pigmentos color azul FD & C No. 1, color rojo FD & C No. 4, oxido ferrico rojo, oxido ferrico amarillo, dioxido de titanio, negro carbon, y anil alquitran.
Tabla 1
Composicion ejemplar de ketoprofeno/nifedipino para administracion a las vfas urinarias (concentraciones de la 30 solucion stock antes de la dilucion)
Ingrediente
Funcion Ejemplo de concentracion/cantidad
Ketoprofeno
Inhibidor de COX 7,63 mg/mL (30 mM)
Nifedipino
Antagonista de canales de Ca 3,46 mg/mL (10 mM)
Solucion acuosa de citrato de sodio
Disolvente tampon Solucion 20 mM (pH 6,2 ± 0,5)
PEG 400
Agente solubilizante (codisolvente) PEG 400 al 60 %: Sol de citrato de sodio al 40 % (v:v)
Metabisulfito de sodio
Antioxidante (estabilizante) 0,02 %
Galato de propilo
Antioxidante (estabilizante) 0,01 %
La solucion concentrada anterior se diluye, por ejemplo, a una relacion de 1:1000 (v:v) con solucion estandar de irrigacion tal como solucion salina o solucion lactato de Ringer. La solucion diluida final procedente de la formulacion ejemplar anterior incluye asf, PEG40 al 0,06 %, metabisulfito de sodio al 0,00005 % y galato de propilo al 0,00001 % 35 (todos en volumen). Los ingredientes activos estan presentes en la solucion diluida final en concentraciones de 0,00763 mg/mL (30.000 nM) para el ketoprofeno y 0,00346 mg/mL (10.000 nM) para el nifedipino.
Ejemplos
La presente invencion se puede ilustrar por los siguientes estudios que demuestran los efectos de ketoprofeno y otros inhibidores de la ciclooxigenasa, nifedipino y combinaciones de estos agentes en modelos urologicos, y que 40 demuestran la estabilidad de ciertas formulaciones de tales composiciones.
Ejemplo I
El efecto de los inhibidores de la COX sobre la produccion de PGE2 inducida por bradicinina en vejigas de rata
Los siguientes estudios ponen en evidencia que la bradicinina induce la produccion inmediata de prostaglandina E2 (PGE2) en la vejiga, y demuestran los efectos de los inhibidores de la ciclooxigenasa sobre este proceso. Se eligio la 45 bradicinina como el agonista de activacion a ensayar en este sistema porque sus acciones sobre el sistema de tejido de la vejiga de rata han sido bien caracterizadas y porque su papel como agente proinflamatorio en la fisiopatologfa
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aguda ha sido estudiado. Tambien es sabido que la bradicinina estimula la contraccion del musculo liso de la vejiga cuando se administra intravesicalmente por la activacion de los subtipos de receptores B1 y B2.
1. Introduccion
Se provocan por traumatismo quirurgico respuestas inflamatorias agudas, localizadas, incluyendo el espasmo, en las vfas urinarias bajas. En respuesta a la lesion tisular, se liberan en la vejiga multiples mediadores inflamatorios, incluyendo la bradicinina y la sustancia P (SP). La aplicacion exogena de estos peptidos pro-inflamatorios o la activacion de los nervios de la vejiga pueden desencadenar la produccion de prostaglandinas (PG) en la vejiga. El objetivo de este estudio fue caracterizar la trayectoria temporal de produccion de las PG en respuesta a un mediador inflamatorio y evaluar los efectos de los inhibidores de COX-1/COX-2 sobre la contractilidad del tejido de la vejiga in vitro e in vivo. El sistema de tira de tejido de la vejiga de rata representa un sistema bien establecido para la caracterizacion de las acciones farmacologicas de numerosos agentes sobre la contractilidad del musculo liso de la vejiga. [Edwards, G., et al., Comparison of the Effects of Several Potassium-Channel Openers on Rat Bladder and Rat Portal Vein In Vitro, Br. J. Pharmacol. 102:679-80 (1991); Birder, L., et al., p-adrenoceptor Agonists Stimulate Endothelial Nitric Oxide Synthase in Rat Urinary Bladder Urothelial Cells, J. Neurosci. 22:8063-70 (2002)].
2. Contractilidad de la tira de vejiga Metodo
Se obtuvieron tiras de musculo liso de vejiga aisladas de 1x2x15 mm de dimension de ratas machos o hembras derivadas de Wistar con un peso de 275 ± 25 g que fueron sacrificadas por sobreexposicion a CO2. Se coloco cada tira bajo una tension de 1 g en un bano de 10 mL que contenfa solucion de Krebs con acido enalaprflico (MK-422) 1 pM, con la composicion (g/L): NaCl 6,9, KCl 0,35, KH2PO4 0,16, NaHCO3 2,1, CaCh 0,28, MgSO 4,7, H2O 0,29, (+) glucosa 1,8, pH 7,4, y se burbujeo con 95 % de O2/5 % de CO2 a 32 °C. Cada tira se conecto a un transductor isometrico (Harvard, # 50-7293) y un registrador de dos plumas y se dejo equilibrar durante 60 minutos. Antes de comenzar el experimento, los tejidos montados fueron validados para su aceptacion por enfrentamiento con metoxamina 100 pM para obtener un mfnimo de 1 g de tension, lo que se considero como el 100 %. Los tejidos calificados se lavaron repetidamente cada 15 minutos durante 60 minutos. Se genero entonces una curva de contraccion-respuesta acumulativa a la bradicinina mediante la aplicacion de 3 concentraciones de bradicinina (0,01 pM, 0,1 pM y 1 pM) a intervalos de 1 minuto durante un total de 3 minutos. A continuacion, se lavo el tejido periodicamente hasta que la tension volvio al valor de la lfnea base. Dos horas mas tarde, se determino la capacidad para inhibir la respuesta a la dosis acumulativa de bradicinina (0,01 pM, 0,1 pM y 1 pM) despues de un pretratamiento de 10 minutos con ketoprofeno. Cada concentracion de la sustancia de ensayo se probo en cuatro preparaciones separadas.
Resultados
La Figura 2 ilustra las curvas de concentracion-respuesta acumulativas de los animales normales a los agonistas de bradicinina y SP. La EC50 para la bradicinina fue de 8,5 nM y para la SP fue de 6,5 nM. Esto proporciono un sistema validado para analizar los efectos de la actividad inhibidora de los AINE (inhibidores de COX).
La Figura 3A ilustra las curvas de concentracion-respuesta de bradicinina producidas en la presencia de ketoprofeno 0,25, 1,0, 2,5 y 10 pM. La respuesta agonista maxima no pudo ser determinada experimentalmente para todas las concentraciones de ketoprofeno, aunque el ajuste de la curva utilizando una ecuacion estandar de Hill no revelo ningun cambio en la respuesta maxima a concentraciones de saturacion del agonista. Se utilizo el analisis de Schild para calcular el valor de pA2 de 7,26 para el ketoprofeno, equivalente a una Kd para ketoprofeno en su sitio de accion de 5,52 x 10-8 M (vease la Figura 3B). Este hallazgo demuestra que la potencia para la inhibicion en este sistema de ensayo de tejido es bastante comparable a los valores obtenidos de ensayos directos de inhibicion enzimatica.
3. Determinacion de PGE2:
Metodos
La liberacion de PGE2 de las tiras de vejiga urinaria a 10 mL de bano de tejidos se midio utilizando un inmunoensayo enzimatico especffico (EIA) segun las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech) para las muestras basales, las inducidas por bradicinina y de tratamiento con inhibidor de la COX mas las inducidas por bradicinina. Los inhibidores de la COX ensayados fueron ketoprofeno, flurbiprofeno, 5-bromo-2-(4-fluorofenil)-3-(4- metilsulfonil)tiofeno (esto es, DUP-697) y 1-[(4-metilsufonil)fenil]-3-tri-fluorometil-5-(4-fluorofenil)pirazol (esto es, SC- 58125). Se recogio 1 mL de fluido del bano de tejidos de 10 mL despues de 10 minutos de enfrentamiento a bradicinina para determinacion de PGE2. Las muestras se congelaron inmediatamente y se conservaron a -4 °C hasta el ensayo. Las tiras de vejiga se secaron suavemente por adsorcion y despues se pesaron. Los resultados se expresan como picogramos de PGE2 liberados por miligramo de tejido.
Resultados
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La Figura 4A indica que la bradicinina induce rapidamente la formacion de PGE2 en tiras de tejido de vejiga de rata dentro de los primeros minutos de estimulacion y alcanza un maximo antes de 30 minutos. El t1X para la formacion fue aproximadamente 7,5 minutos. La Figura 4B ilustra la rapida cinetica de formacion de la PGE2 detectada antes de los diez primeros minutos.
La inhibicion por el ketoprofeno de la contraccion de la tira de vejiga inducida por bradicinina estaba estrechamente correlacionada con la inhibicion de la formacion de PGE2, como se muestra en la Tabla 2. Se encontro que los inhibidores no selectivos de COX-1/COX-2 eran eficaces en el bloqueo de la PGE2 estimulada por bradicinina, mientras que los agentes selectivos de la COX-2 no eran eficaces. Esto corresponde a una falta de actividad inhibidora de COX-2 bajo los parametros de cistometrfa normales inducida por bradicinina.
Tabla 2
Inhibicion de la contraccion inducida por bradicinina (BK) con inhibidores de la COX
Farmaco
Contraccion inducida por bradicinina IC50 (pM) PGE2 inducida por bradicinina IC50 (pM)
Ketoprofeno
0,97 0,58
Flurbiprofeno
24,8 1,65
DUP-697
>25 >25
SC-58125
>25 >25
La Figura 1 (descrita anteriormente) proporciona un modelo para la accion de la actividad de la prostaglandina. La activacion de los receptores de bradicinina en las celulas uroteliales puede producir prostaglandinas en el urotelio, que a su vez pueden activar los nervios de la vejiga (fibra C y fibras AS) que afectan a la contractilidad de la vejiga y controlan los reflejos de miccion. El ketoprofeno inhibe la formacion de PGE2.
4. Modelo de cistometrfa en la rata in vivo
Metodos
Se anestesiaron las ratas con uretano a 1,2 g/kg i.p. en 5 mL/kg. Se implanto un cateter de polietileno (PE50) en la vejiga para perfusion de solucion salina o de acido acetico a traves de una llave de paso de 3 vfas. Se conecto un transductor de presion para las medidas de la presion intravesical. Se perfundio solucion salina caliente (37 °C) a la vejiga a una velocidad constante de 16,7 mL/min (1 mL/hora) hasta que la cistometrfa fue estable (no menos de 60 minutos). Despues, se perfundio acido acetico al 0,2 % a la vejiga urinaria. Se administraron aspirina (10 mg/kg i.v.) y vehfculo por via intravenosa a traves de un cateter de PE-10 en la vena femoral a los 5 minutos despues de iniciar la perfusion de acido acetico y al final del primer ciclo de miccion. Se aplico la prueba de Dunnett para comparacion entre el tiempo antes y despues de tratamiento con la sustancia de ensayo o con el vehfculo. Para determinar las diferencias entre el grupo de la sustancia de ensayo y el grupo de control con vehfculo, se utilizo la prueba t de Student para muestras independientes. Las diferencias se consideran significativas a p <0,5.
Resultados
La Figura 5A ilustra que la aspirina intravenosa (10 mg/kg) produjo una inhibicion gradual, dependiente del tiempo, de la reduccion, inducida por acido acetico, en el intervalo entre contracciones (ICI), y la Figura 5B ilustra los cambios paralelos en la capacidad de la vejiga. La presion liminar y la presion de miccion no fueron afectadas por el tratamiento con aspirina (no se muestran datos).
6. Discusion
Estos estudios demuestran que la PGE2 se produce rapidamente en el tejido de la vejiga de rata tras la estimulacion con bradicinina y que su formacion es inhibida por una pre-incubacion de 10 minutos con ketoprofeno. Se demostro que los inhibidores no selectivos de COX-1/COX-2 habfan bloqueado simultaneamente la rapida produccion de las Pg en el tejido de la vejiga y la contractilidad del tejido. La aspirina y otros inhibidores no selectivos de COX-1/COX- 2 inhibieron eficazmente los cambios cistometricos inducidos por la estimulacion con acido acetico intravesical. Estos estudios dan a entender que la administracion de ketoprofeno a las vfas urinarias puede ser terapeuticamente beneficiosa para la hiperactividad periprocedimental de la vejiga.
Ejemplo II
Efectos de ketoprofeno y nifedipino individualmente sobre la contractilidad inducida por bradicinina en tiras de tejido de vejiga de rata
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El fin de este estudio fue caracterizar los efectos del ketoprofeno, un inhibidor no selectivo de COX-1/COX-2, y del nifedipino, un antagonista de los canales de Ca2+ tipo L, sobre la contractilidad de la vejiga de rata estimulada por un agonista, utilizando bradicinina como agonista estimulante.
1. Metodos
Se disolvieron ketoprofeno USP y nifedipino USP en DMSO antes de dilucion hasta la concentracion final. Se prepararon tiras de tejido de vejiga de ratas derivadas de Wistar, se transdujeron y se equilibraron, utilizando el metodo de contractilidad de las tiras de vejiga descrito en el Ejemplo I anterior. El tejido ensayado se incubo con los farmacos de ensayo durante 10 minutos antes de que se determinaran las actividades.
Se genero una curva de contraccion-respuesta acumulativa para la bradicinina mediante la aplicacion de 7 concentraciones de bradicinina en incrementos al triple que van desde 0,001 pM a 1 pM a intervalos de 1 minuto durante un total de 7 minutos para establecer la respuesta maxima de control del 100 %. El tejido se lavo despues periodicamente hasta que la tension volvio al valor de la lfnea base. En 24 tejidos separados, se llevaron a cabo determinaciones similares de concentracion de bradicinina-respuestas en presencia de cada compuesto de ensayo respectivo (ketoprofeno: 0,25 pM, 1 pM, 2,5 pM y 10 pM; nifedipino: 0,125 pM, 0,5 pM, 1,25 pM y 5 pM) despues de un perfodo de incubacion de 10 min. Se utilizaron siempre tiras de tejido en parejas para el estudio de la accion del antagonista (bradicinina) solo y en presencia de una concentracion de antagonista (ketoprofeno o nifedipino). Se obtuvieron graficos de Schild utilizando programas informaticos (Pharmacology Cumulative Systen, Version 4) y se determinaron los valores de pA2.
2. Resultados
Se encontro que el nifedipino presenta un tipo no competitivo de antagonismo sobre las respuestas contractiles inducidas por bradicinina en la preparacion de vejiga de rata in vitro. Esto se demostro por una depresion de la respuesta maxima al agonista y un pequeno desplazamiento no paralelo hacia la derecha de las curvas de respuesta-concentracion de agonista (Figura 6). Por contraste, como se ha descrito previamente en el Ejemplo I, concentraciones crecientes de ketoprofeno (0,25-10 pM) produjeron una serie de curvas concentracion-respuesta (vease la Figura 3A) en las que la respuesta del agonista EC50 se desplazo progresivamente a concentraciones mas altas de bradicinina (desplazamiento hacia la derecha de mas de 2 ordenes de magnitud) sin ningun efecto aparente sobre la tension maxima. Este patron de inhibicion es coherente con un mecanismo competitivo para ketoprofeno y fue analizado adicionalmente por analisis de regresion de Schild.
Para el nifedipino, los criterios para la aplicacion del analisis de regresion de Schild no se cumplen debido al patron de inhibicion no competitivo. Incluso la concentracion mas baja de nifedipino (0,125 pM) se tradujo en una gran reduccion de la respuesta al agonista (a aproximadamente 50 % del maximo). Estos estudios de ketoprofeno y nifedipino revelan dos patrones muy diferentes de inhibicion de la tension contractil estimulada por la bradicinina.
Ejemplo III
Efectos de la combinacion de ketoprofeno y nifedipino sobre la contractilidad inducida por bradicinina en tiras de tejido de vejiga de rata
El presente estudio evaluo los efectos de nifedipino y ketoprofeno administrados en combinacion sobre la respuesta de la tension contractil en un modelo de tira de tejido de vejiga de rata.
1. Metodos
Se prepararon tiras de tejido de la vejiga de ratas derivadas de Wistar, se transdujeron y se equilibraron utilizando el metodo de contractilidad de la tira de vejiga descrito en el Ejemplo I anterior dejando que las tiras transducidas se equilibraran durante 45 minutos. Con el fin de evitar los efectos de la desensibilizacion del receptor de bradicinina debidos al protocolo de dosificacion acumulativa, se recogieron dos tiras de tejido de cada animal. El grupo control consistio en 12 tiras y para los grupos de tratamiento se utilizaron 54 tiras.
Antes de iniciar el experimento, cada par de tiras de tejido fue calificado por tratamiento con bradicinina 0,03 pM para determinar si la diferencia inicial en la contraccion maxima entre las tiras estaba dentro de ± 15 %. Despues de este procedimiento, los tejidos calificados se lavaron repetidamente cada 15 minutos durante 60 minutos. Se generaron curvas de concentracion-respuesta acumulativas mediante la aplicacion de bradicinina para establecer la respuesta maxima. Para el grupo control (n = 12), se genero entonces una curva de concentracion-respuesta acumulativa a la bradicinina mediante la aplicacion de nueve concentraciones de 0,1 nM a 1,0 pM en pasos triples en intervalos de un minuto, durante un total de nueve minutos para establecer la respuesta maxima de control 100 %. Las curvas de respuesta para los grupos de tratamiento incluyeron la preincubacion del tejido de la vejiga durante un perfodo de diez minutos (n = 6), seguido por la generacion de curvas dosis-respuesta acumulativas de bradicinina mediante la aplicacion de 12 concentraciones de bradicinina (0,1 nM - 30 pM).
El intervalo de concentracion que se eligio para cada uno de los agentes activos se baso en los resultados de estudios farmacologicos anteriores in vitro de cada agente individual descrito en los Ejemplos I y II anteriores. Esos
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estudios demostraron que el ketoprofeno en el intervalo 0,3-3 pM tenia efectos medibles sobre la EC50 para la activacion de la bradicinina. El ketoprofeno 3 pM era casi maximo en su capacidad para cambiar la EC50 de las curvas de respuesta de bradicinina activada sobre la contractilidad del musculo. De modo similar, el ensayo anterior de nifedipino identifico un intervalo de concentraciones (0,05 a 5 pM) eficaces en la inhibicion de la tension inducida por bradicinina. Un diseno factorial caracterizo los efectos de nueve combinaciones diferentes de dos farmacos, de ketoprofeno y nifedipino, en las siguientes concentraciones de (i) ketoprofeno: 0,3, 1,0, o 3,0 pM; y (ii) nifedipino: 0,1, 0,3 o 1,0 pM. Los grupos de tratamiento (grupos 2-10) ensayados se resumen en la Tabla 3 a continuacion:
Tabla 3
Combinaciones de ketoprofeno-nifedipino ensayadas
Grupo
Concentracion de ketoprofeno (pM) Concentracion de nifedipino (pM)
1 (Control)
- -
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0,3 1,0
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Los datos de concentracion de bradicinina-respuesta se ajustaron a una ecuacion sigmoidal de pendiente variable, conocida tambien como la funcion de respuesta logistica de 3 parametros (3PL), para obtener la tension maxima, la EC50, y la pendiente de Hill en la que se fijo el fondo de la curva a 0. La fuerza de contraccion en la presencia de inhibidores se expreso como un porcentaje de los efectos maximos de bradicinina observados dentro de la misma tira antes de la adicion de un inhibidor.
2. Resultados
Los datos experimentales para todas las curvas permitieron el ajuste de la curva para definir con precision la tension maxima y los valores de la EC50. La curva de control en la Figura 7 demostro que la bradicinina aumentaba de manera dependiente de la concentracion la fuerza de contraccion con una pEC50 de 8,14 o 72 nM (n = 12 tiras). Una pendiente de Hill moderada de 0,65 caracterizo la curva de activacion. Todos los datos adicionales de contraccion se expresaron como un porcentaje del efecto maximo de la bradicinina obtenido de un conjunto de 12 tiras de tejido sin ninguna tension y sin ningun antagonista presente.
Los resultados para nueve combinaciones distintas de nifedipino y ketoprofeno utilizadas para inhibir la contraccion de la vejiga inducida por bradicinina se muestran en las tres tablas y tres figuras siguientes. A la concentracion mas baja de nifedipino y ketoprofeno ensayada, 0,1 pM y 0,3 pM respectivamente, se observo una reduccion del 38 % de la tension de control maxima (Tabla 4). Las concentraciones crecientes de ketoprofeno (1,0 y 3,0 pM) en presencia de la misma concentracion de nifedipino disminuyeron aun mas la tension de contraccion maxima de tal modo que solo permanecio el 30 y el 23,4 % de la tension de control, respectivamente. Todas las curvas de concentracion- respuesta para la bradicinina se desplazaron a la derecha en presencia de nifedipino y ketoprofeno (0,3 a 3,0 pM), con el mayor efecto observado en la concentracion mas alta de ketoprofeno. Esta combinacion fue acompanada por un cambio de 1,0 unidades logaritmicas en la pEC50 frente al control. Los cambios en el parametro EC50 no parecieron correlacionados con los cambios en la tension maxima. Los resultados se presentan graficamente en la Figura 7, que compara el grupo control y el grupo que tiene una concentracion constante de nifedipino 0,1 pM con un intervalo de concentraciones de ketoprofeno. El porcentaje de contraccion para cada combinacion de farmacos se expresa como el porcentaje de la respuesta maxima para el control de bradicinina. El patron general de inhibicion refleja predominantemente una disminucion sustancial en la tension maxima, demostrando que la combinacion de nifedipino y ketoprofeno actua conjuntamente en combinacion mecanicamente de una manera antagonista no competitiva frente a las contracciones inducidas por bradicinina.
Tabla 4
Parametros de ajuste de la curva concentracion-respuesta para nifedipino (NIF) 0,1 pM mas ketoprofeno (KET) 0,33,0 pM
Concentracion de farmaco
T max Log EC50 Pendiente de Hill
Est.
SEM Est. SEM Est. SEM
Control
100,00 4,17 -8,14 0,09 0,65 0,07
Nifedipino 0,1 pM + ketoprofeno 0,3 pM
62,11 3,90 -7,61 0,18 0,69 0,16
Nifedipino 0,1 pM + ketoprofeno 1,0 pM
30,13 1,92 -7,95 0,17 1,02 0,35
Nifedipino 0,1 pM + ketoprofeno 3,0 pM
23,38 2,24 -7,02 0,24 0,62 0,16
Est. = Estimado
5 SEM = error estandar de la media
T max = tension maxima determinada por ajuste de la curva
En la presencia de nifedipino 0,3 pM, las concentraciones crecientes de ketoprofeno presentes en el tratamiento de combinacion dieron como resultado una disminucion progresiva de la tension maxima, de 36,4 a 16,0 %. Las combinaciones que utilizan la concentracion mas alta de nifedipino (0,3 pM) dieron como resultado una mayor 10 reduccion de la tension maxima con respecto a las concentraciones correspondientes de ketoprofeno en presencia de nifedipino 0,1 pM. Los niveles de tension maxima para combinaciones de nifedipino 0,3 pM se determinaron para tres combinaciones, en relaciones de concentracion de nifedipino:ketoprofeno de 1:1, 1:3,3 y 1:10. Los datos de los parametros de ajuste de la curva obtenidos se presentan en la Tabla 5.
La comparacion con los datos correspondientes a las concentraciones de ketoprofeno de la Tabla 4, muestra que, 15 en todos los casos, las mayores reducciones de la tension maxima estuvieron asociadas con la mayor concentracion de nifedipino. El mayor cambio fue evidente a la concentracion mas baja de ketoprofeno, 0,3 pM, que redujo de 62,11 a 36,41 %. Las concentraciones mas altas de ketoprofeno dieron como resultado una reduccion aun mayor de la tension, de tal manera que solo se mantuvo el 16 % a 3,0 pM. Asociado con estos cambios en la tension, fue evidente un cambio similar en la EC50 con respecto al control de 0,5 unidades logarftmicas para todas las 20 concentraciones de ketoprofeno a esta concentracion de nifedipino, como se puede ver en la Figura 8. Como en el caso de nifedipino 0,1 pM, no hubo diferencias aparentes entre los valores de EC50 para esta concentracion de nifedipino. Las pequenas diferencias en las pendientes de Hill para las respuestas del agonista bradicinina en el intervalo de concentraciones del inhibidor no fueron significativas. El efecto de las concentraciones crecientes de ketoprofeno en el tratamiento de combinacion sobre las curvas de concentracion-respuesta es similar al grafico de 25 los datos de nifedipino 0,1 pM y diferentes concentraciones de ketoprofeno. Estos datos graficos demuestran tambien la naturaleza no competitiva del antagonismo de la respuesta a bradicinina, que se observa para la combinacion de esta concentracion mas alta de nifedipino.
Tabla 5
Parametros de ajuste de la curva concentracion-respuesta para nifedipino (NIF) 0,3 pM mas ketoprofeno (KET) 0,330 3,0 pM
Concentracion de farmaco
T max Log EC50 Pendiente de la curva
Est.
SEM Est. SEM Est. SEM
Control
100,00 4,17 -8,14 0,09 0,65 0,07
Nifedipino 0,3 pM + ketoprofeno 0,3 pM
36,41 3,84 -7,49 0,29 0,66 0,24
Nifedipino 0,3 pM + ketoprofeno 1,0 pM
28,88 2,24 -7,69 0,22 0,72 0,21
Nifedipino 0,3 pM + ketoprofeno 3,0 pM
15,96 1,82 -7,59 0,29 0,94 0,51
Est. = estimado
SEM = error estandar de la media
T max = tension maxima determinada por ajuste de la curva
Las formas globales de las curvas de respuesta observadas en presencia de nifedipino 1,0 pM fueron similares en 35 todas las concentraciones de ketoprofeno. Para nifedipino 1,0 pM, los niveles maximos de tension fueron menores que los correspondientes valores para nifedipino 0,3 pM (Tabla 6 y Figura 9), y la magnitud del cambio adicional debido a la presencia de ketoprofeno es menor con respecto a las concentraciones mas bajas de nifedipino. Los valores de EC50 se desplazaron de manera uniforme aproximadamente 0,51 unidades para todas las concentraciones de ketoprofeno y no se correlacionaron con la tension maxima. Este patron fue consistente con las 40 observaciones en todas las demas concentraciones de la combinacion. Se observo un pequeno aumento adicional
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en la inhibicion de la tension maxima, debido al cambio de ketoprofeno de 1,0 a 3,0 pM, a esta concentracion mas alta de nifedipino. A las concentraciones mas altas (nifedipino 1,0 pM mas ketoprofeno 3,0 pM), se alcanzo una inhibicion del 89 % del nivel de la tension de control.
Tabla 6
Parametros de ajuste de la curva concentracion-respuesta para nifedipino (NIF) 1,0 pM, mas ketoprofeno (KET) 0,33,0 pM
Concentracion de farmaco
T max Log EC50 Pendiente de la curva
Est.
SEM Est. SEM Est. SEM
Control
100,00 4,20 -8,14 0,09 0,65 0,07
Nifedipino 1,0 pM + ketoprofeno 0,3 pM
21,60 1,00 -7,50 0,12 0,93 0,20
Nifedipino 1,0 pM + ketoprofeno 1,0 pM
12,30 1,00 -7,48 0,20 0,96 0,35
Nifedipino 1,0 pM + ketoprofeno 3,0 pM
10,80 0,80 -7,34 0,16 1,08 0,37
Est. = estimado
SEM = error estandar de la media T max = tension maxima determinada por ajuste de la curva
3. Analisis de superficie de respuesta
Las concentraciones de los dos agentes (nifedipino y ketoprofeno) utilizadas en este experimento de combinacion representan variables independientes. La tension maxima es un efecto que resulta de la combinacion y es la variable de respuesta de interes principal para el analisis de superficie de respuesta. La relacion entre las combinaciones de farmacos y la variable de respuesta se puede representar en un grafico tridimensional en el que las concentraciones se representan como coordenadas cartesianas en el plano x-y, y la variable de respuesta (por ejemplo, la tension maxima) se traza como la distancia vertical por encima del punto planar. La coleccion de puntos espaciales trazados de esta manera proporciona una vista que representa la relacion combinada de concentracion-respuesta. Las ventajas de este metodo de diseno experimental incluyen el hecho de que la respuesta biologica medida no se limita a un nivel especffico de respuesta (efecto) del sistema. De este modo, se puede ensayar una serie de combinaciones de concentracion de proporcion fija sobre un amplio intervalo de concentraciones para definir la eficacia de la interaccion de los dos farmacos.
Como en el caso de las relaciones de concentracion-efecto biologico de un unico farmaco en el que una curva suave (o lfnea) puede ser el mejor ajuste para los datos segun un modelo especffico, una superficie suave puede ser el ajuste para los datos en un grafico tridimensional de una relacion concentracion-respuesta de una combinacion de dos farmacos. Esta superficie representa la aditividad o interaccion de la combinacion. El grafico de esta superficie de respuesta se convierte en la superficie de referencia para la visualizacion de los efectos reales de la combinacion y permite la visualizacion y la prediccion de los efectos en regiones de la curva para las que no se pudiera generar ningun dato.
Se realizo un analisis de superficie de respuesta estandar sobre la tension maxima estimada y los valores de EC50. El modelo de superficie de respuesta se ajusto utilizando como variable de respuesta los valores de tension a la concentracion mas alta del agonista en cada curva individual de dosis-respuesta, que era la tension correspondiente a bradicinina 30 pM. La Figura 10 muestra la superficie de respuesta ajustada para el modelo reducido como una funcion de la concentracion de ketoprofeno y nifedipino. La curva de respuesta de la combinacion cae bruscamente con las concentraciones crecientes tanto de ketoprofeno como de nifedipino. La superficie se vuelve bastante plana ya que se obtiene la respuesta maxima a medida que las concentraciones se aproximan a nifedipino 1 pM + ketoprofeno 3 pM. La combinacion de concentraciones que da como resultado el 90 % de inhibicion maxima del efecto de la bradicinina es ketoprofeno 3 pM + nifedipino 1 pM.
4. Discusion
El estudio de este Ejemplo III evaluo los efectos de nifedipino en combinacion con ketoprofeno utilizando la bradicinina como un agonista para estimular la contraccion del musculo liso. La bradicinina se utilizo en el sistema de ensayo de tira de tejido de la vejiga de rata (Ejemplos I - III) para servir como un mediador endogeno de la contraccion. El patron general de inhibicion observado con todas las combinaciones de concentraciones de nifedipino y ketoprofeno fue caracterfstico de antagonismo no competitivo. El nifedipino, que evita la afluencia de iones calcio a traves de la membrana celular al actuar sobre los canales tipo L dependientes del voltaje, atenua la contraccion del musculo liso, activada por el receptor de bradicinina, sin inhibir directamente el receptor. Como agente unico, la inhibicion del nifedipino se demostro anteriormente (Ejemplo II) que causa una reduccion en las respuestas maximas de bradicinina que no fueron acompanadas por cambios estadfsticamente significativos en la potencia agonista de la respuesta restante.
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Este estudio revelo el sorprendente hallazgo de que la magnitud de la inhibicion aumenta en gran medida por la adicion de ketoprofeno a la concentracion mas baja ensayada de nifedipino y es evidente en todas las concentraciones de las combinaciones ensayadas. A bajas concentraciones de nifedipino, esta inhibicion es mas que aditiva, es decir, es de naturaleza sinergica. En contraste, se observo que el tratamiento con ketoprofeno solo a las mismas concentraciones no disminuye la tension de contraccion maxima, con ningun efecto significativo sobre los valores de la EC50 para las nueve combinaciones y ninguna dependencia de la concentracion del ketoprofeno. Por lo tanto, esta interaccion sinergica sobre la tension maxima y la falta de un efecto fuerte sobre la EC50 fue un resultado inesperado en base al estudio de la accion del ketoprofeno cuando se ensaya como agente unico en este sistema de ensayo.
Tomados en conjunto, estos datos indican que los efectos del agonista proinflamatorio, bradicinina, pueden ser mediados en parte por la activacion simultanea de los canales de calcio tipo L y la induccion de metabolitos araquidonicos que juntos aumentan la contraccion del musculo liso. Si bien no se desea limitarse a la teorfa, este efecto puede ser debido a un bucle de retroalimentacion positiva que opera a un nivel celular y tisular. Las prostaglandinas generadas intracelularmente como resultado de la activacion del receptor de bradicinina se pueden mover al entorno extracelular, donde pueden interactuar y, a su vez activar los subtipos de receptores prostanoides. Hay al menos cuatro subtipos conocidos de receptores prostanoides, denominados EP1, EP2, EP3 y EP4. De estos subtipos, se cree que los receptores EP1 se acoplan a traves de las protefnas G para la estimulacion de la hidrolisis de fosfoinositido y/o afluencia de calcio independiente de PLC. Los receptores EP1 han sido identificados previamente en el musculo liso, donde pueden funcionar para mediar en la actividad contractil. Por lo tanto, el descubrimiento de las acciones sinergicas combinadas de ketoprofeno y nifedipino sobre la actividad contractil puede ser el resultado de bloquear simultaneamente la movilizacion del calcio y la inhibicion concurrente de un bucle de realimentacion positiva que implica la activacion, impulsada por la PGE2, de los receptores prostanoides.
En conclusion, cada combinacion de nifedipino y ketoprofeno mostro una mayor inhibicion de la contraccion maxima inducida por bradicinina en comparacion con cualquier farmaco solo en el ensayo de la tira de tejido de vejiga de rata. Por otra parte, las multiples combinaciones de nifedipino y ketoprofeno ensayadas permitieron un analisis de superficie de respuesta para definir las concentraciones optimas. Se identifico una combinacion de relacion fija que contiene ketoprofeno 3,0 pM y nifedipino 1,0 pM que produjo una inhibicion de ~ 90 %.
Ejemplo IV
Inhibicion por nifedipino y ketoprofeno de la tension contractil y liberacion de PGE2 inducida por multiples agonistas en el tejido de la vejiga de rata
El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de ketoprofeno y nifedipino sobre la contractilidad de la vejiga de ratas y la produccion de PGE2 estimulada por agonistas utilizando multiples agonistas. La bradicinina, sustancia P, histamina y ATP son mediadores endogenos que pueden ser liberados como parte de la respuesta inflamatoria aguda y activan los receptores de la bradicinina (subtipos B1 y B2), los receptores de taquicinina (NK1-3) y los receptores de histamina (todos los subtipos) y los receptores purinergicos P2X y P2Y, respectivamente. La carbamilcolina es un agonista que puede activar los subtipos de receptores nicotfnicos de acetilcolina musculares y neuronales o los subtipos de receptores muscarfnicos de acetilcolina (M1-5) presentes en la vejiga, mientras que la metoxamina es especffica para los receptores a1-adrenergicos. El primer objetivo fue evaluar el efecto del ketoprofeno (10 pM) y del nifedipino (1 pM) individualmente, cada uno a una concentracion fija, sobre la tension contractil inducida por cada uno de los seis agonistas (bradicinina, sustancia P, carbamilcolina, metoxamina, histamina y ATP) en el modelo de tira de tejido de la vejiga de rata. El segundo objetivo fue determinar la cantidad de PGE2 liberada del tejido de la vejiga en respuesta a la estimulacion por cada agonista en presencia de ketoprofeno o de nifedipino durante las mismas condiciones de ensayo empleadas para medir la tension contractil del musculo liso.
1. Metodos
Se prepararon tiras de tejido de la vejiga de ratas derivadas de Wistar, se transdujeron y se equilibraron utilizando el metodo de la contractilidad de la tira de vejiga descrito en el Ejemplo I anterior. Se preincubo ketoprofeno 10 pM o nifedipino 1,0 pM individualmente con el tejido durante un perfodo de 10 minutos antes de la estimulacion con los siguientes agonistas a una concentracion equivalente a su respectiva ED75 para estimulacion de la tension: bradicinina 0,03 pM; sustancia P 0,03 pM; carbocol 3,0 pM; metoxamina 30 pM; histamina 25 pM; y ATP 20 pM. Se determino la actividad antagonista para una concentracion dada de un antagonista (nifedipino o ketoprofeno) como la capacidad de dicha concentracion del antagonista para reducir la respuesta inducida por el agonista indicado (por ejemplo, inducida por bradicinina 0,03 pM) en un 50 por ciento o mas (> 50 %). Cada concentracion de antagonista se ensayo en cuatro preparaciones de tejido separadas.
Los efectos de los dos farmacos sobre la liberacion de PGE2 en respuesta a multiples agonistas se compararon utilizando el mismo protocolo de pre-incubacion de 10 min y un perfodo de incubacion posterior de 30 min con agonista en presencia del compuesto de ensayo. Se determino la PGE2 producida despues de 30 minutos de tratamiento con cada agonista (por ejemplo, bradicinina 0,03 pM) en la ausencia y presencia de los compuestos de ensayo. Se tomo una muestra inicial de 1,0 mL del bano de tejidos despues de una incubacion de 30 minutos con el
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agonista. Posteriormente, se lavo el tejido con 10 mL de solucion de Krebs cada 15 minutos durante un perfodo de 2 horas. Se anadio el compuesto de ensayo y se pre-incubo durante un perfodo de 10 minutos antes de volver a enfrentar con el mismo agonista. Despues de un perfodo adicional de 30 minutos en presencia del antagonista de ensayo y agonista, se retiro 1,0 mL del bano para analisis. La liberacion de PGE2 de las tiras de la vejiga urinaria se midio utilizando un inmunoensayo enzimatico especffico (EIA). Las muestras se congelaron inmediatamente y se conservaron a -4 °C hasta el ensayo. Las tiras de vejiga se secaron suavemente por adsorcion, y despues se pesaron. Los resultados se expresan como picogramos de PGE2 liberados por miligramo de tejido.
2. Resultados
Todos los agonistas investigados estimularon la contraccion de las tiras de tejido de la vejiga, independientemente de su mecanismo de accion, demostrando que multiples mediadores pueden aumentar la tension contractil del musculo liso de la vejiga. El nifedipino (1 pM) produjo una inhibicion significativa (> 67 %) de cada incremento de la tension contractil inducido por el agonista (Figura 11). La respuesta contractil a la bradicinina se vio afectada tanto por el nifedipino como por el ketoprofeno (81 % de inhibicion y 67 % de inhibicion, respectivamente). En contraste, el aumento de la tension contractil inducido por la sustancia P, carbamilcolina y ATP no fue afectado por el ketoprofeno. El ketoprofeno tambien redujo solo ligeramente, la tension inducida por metoxamina e histamina (< 25 %).
La bradicinina provoco el mayor aumento de PGE2 con respecto a los otros agonistas ensayados. Esta liberacion provocada fue inhibida eficazmente por el ketoprofeno (81 %), pero se vio mfnimamente afectada por el pre- tratamiento con nifedipino (12 %) (Figura 12). Por lo tanto, el grado de inhibicion de la tension del musculo liso por el nifedipino no estaba ligado a las respuestas de PGE2 inducidas por el agonista y era distinto del efecto del ketoprofeno. Los niveles de PGE2 absolutos en la vejiga producidos en respuesta a la estimulacion por otros agonistas de GPCR fueron aproximadamente 10 veces menores que los observados con la bradicinina.
En resumen, el presente estudio indico que un aumento en la tension contractil del musculo liso puede ser inducido por una variedad de agonistas de GPCR en el tejido de la vejiga. Por otra parte, un mecanismo de senalizacion comun para estos agentes esta mediado en parte por la activacion de los canales de Ca2+ tipo L en la vejiga urinaria de la rata. La inhibicion de los canales de Ca2+ tipo L por el nifedipino sugiere un mecanismo eficaz para la inhibicion de numerosos mediadores fisiopatologicos que pueden llevar a un aumento de la tension del musculo liso de la vejiga asociado con espasmo o hiperactividad. El ketoprofeno inhibio la produccion de PGE2 estimulada por la bradicinina y la liberacion desde la vejiga, mientras que el nifedipino no presento ningun efecto sobre esta respuesta. Por lo tanto, el nifedipino y el ketoprofeno actuan a traves de distintos mecanismos para inhibir la tension contractil del musculo liso y para liberar prostaglandinas pro-inflamatorias en el tejido de la vejiga.
Ejemplo V
Efecto de ketoprofeno y nifedipino sobre la funcion de la vejiga de rata en un modelo de vejiga hiperactiva por acido acetico
El principal objetivo de este estudio fue medir el efecto de ketoprofeno y nifedipino durante la administracion local intravesical a ratas hembra con la funcion de la vejiga hiperactiva causada por perfusion con solucion salina que contenfa acido acetico al 0,2 % (solucion salina acidificada). Se sabe que la perfusion de acido acetico al 0,2 % a traves de la vejiga induce rapidamente un estado inflamatorio agudo que se refleja en cambios funcionales en la cistometrfa de la vejiga.
1. Metodos
El metodo utilizado en el presente estudio representa una adaptacion de un modelo ampliamente utilizado de vejiga hiperactiva de rata provocada por acido acetico. En este modelo, la inflamacion aguda de la vejiga se produce utilizando acido acetico al 0,2 % en solucion salina como fluido de perfusion de la vejiga y se realiza la cistometrfa con anestesia despues de un perfodo de recuperacion de la intervencion quirurgica. Se puede observar un intervalo regular de ciclos de miccion durante varias horas despues de que tiene lugar el perfodo de estabilizacion inicial. Se utilizo un cateter de vejiga conectado a una bomba de perfusion para administrar las soluciones de farmaco directamente a la vejiga a una velocidad definida, constante.
Se anestesiaron los animales y se implantaron quirurgicamente cateteres en la vejiga para permitir la irrigacion de los agentes de ensayo. Se monitorizaron los siguientes parametros de cistometrfa: intervalo entre contracciones (ICI), presion desencadenante (TP), presion de miccion (MP) y volumen de miccion (MV) utilizando una estacion de cistometrfa Med Associates y un programa de software. Solo fueron incluidas en el estudio las ratas que presentaron perfiles de cistometrfa normales y estables durante la etapa preliminar de perfusion con solucion salina (no menos de 15 min de estabilizacion de la lfnea base seguido por 7 intervalos ICI representativos regulares). Despues del perfodo de la solucion salina, la vejiga de rata se perfundio con el agente de ensayo en solucion salina que contenfa acido acetico al 0,2 % durante 20 min seguido por la recogida de 7 intervalos ICI representativos para analisis. Debido a las concentraciones fijas de las soluciones de irrigacion empleadas en el estudio y al uso de velocidades de perfusion constantes para tiempos constantes fijados, se administro a todos los animales una dosis fija, uniforme de cada agente.
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Se administro ketoprofeno solo a grupos de ratas hembras a concentraciones seleccionadas (0,01-25 pM) o nifedipino solo a concentraciones seleccionadas (0,1 a 10 pM). Se analizaron normalmente cinco a siete animales en cada grupo. La solucion salina acidificada sirvio como control. Todas las soluciones de perfusion se prepararon recientes el dfa del experimento antes de su uso. Para cada uno de los agentes de ensayo, se emplearon tres periodos distintos de irrigacion de la vejiga: 1) la lfnea base (solo solucion salina) durante 1 hora; 2) el farmaco en solucion salina solamente durante 15 minutos; y 3) el farmaco en solucion salina acidificada al 0,2 % durante 1 hora.
2. Resultados
En los animales control, se establecieron los niveles de la lfnea base de contracciones de la vejiga en respuesta a una velocidad de irrigacion constante de 0,1 pL/min de solucion salina durante la primera hora despues de la cirugfa. El tiempo entre contracciones (ICI, segundos) y el pico de la presion de miccion (MP, mm de Hg) parece que varfan algo entre animales, pero fueron bastante constantes en los animales despues de la estabilizacion. Despues de la adicion de acido acetico al 0,2 % al tampon de perfusion, aparecieron contracciones rapidas, dando como resultado una disminucion significativa en el ICI. Los aumentos en la presion contractil acompanaron tambien al acortamiento de tiempo entre las contracciones de la vejiga en muchos casos. Estos cambios en las respuestas funcionales de la vejiga podrfan medirse rutinariamente despues de la perfusion de la vejiga con solucion salina acidificada, como se muestra en la Figura 13. Un acortamiento de 40-50 % del ICI se vio tfpicamente en el grupo de control en respuesta a la irrigacion con acido acetico al 0,2 % (% medio de ICI = 58,4 % ± 6,8 %, n = 8).
La inclusion de ketoprofeno en el tampon de irrigacion lleva a una inhibicion, dependiente de la concentracion, del acortamiento del ICI (Figura 14). La inhibicion completa se observo con ketoprofeno aproximadamente 3 pM y las concentraciones mas altas tendieron a llegar por encima del 100 % (no se muestran datos).
La inclusion de nifedipino en el tampon de irrigacion tambien lleva a una inhibicion, dependiente de la concentracion, del acortamiento del ICI (Figura 15). No se observo inhibicion completa pero los efectos maximos parecio que estaban en el nifedipino 1 pM, y las concentraciones mas altas tendieron al estancamiento a aproximadamente 75 % de la lfnea de base.
Ejemplo VI
Farmacocinetica de la absorcion de una combinacion de nifedipino y ketoprofeno en un modelo con solucion salina de vejiga de rata
El objetivo principal de este estudio fue medir los niveles plasmaticos sistemicos de ketoprofeno y nifedipino durante y despues de la administracion intravesical, local, de una combinacion de estos farmacos a las ratas. Un objetivo secundario de este estudio fue determinar la velocidad de actuacion de ketoprofeno y nifedipino cuando se administran individualmente o en combinacion. Por ultimo, un tercer objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de la administracion local de farmacos sobre el contenido del mediador proinflamatorio, PGE2, en el tejido de la vejiga de la rata, despues de un traumatismo quirurgico en la vejiga y posterior perfusion intravesical de cada agente o de la combinacion.
1. Metodos
El estudio incluyo tres grupos principales de tratamiento de animales: una combinacion de ambos ketoprofeno (10 mM) y nifedipino (10 M); ketoprofeno (10 M) solo; y nifedipino (10 M) solo. Se utilizo un cateter de vejiga conectado a una bomba de perfusion para administrar las soluciones de farmacos directamente a la vejiga a una velocidad definida, constante.
Para cada uno de los tres grupos de tratamiento con farmacos, se emplearon tres periodos distintos de irrigacion de la vejiga que fueron definidos por la solucion de perfusion de la vejiga para cada periodo: 1) la lfnea base (solucion salina solamente) durante 1 hora; 2) farmaco en solucion salina solamente durante 1 hora; y 3) periodo de solucion salina posterior al farmaco durante 30 minutos (min). Los animales fueron anestesiados y la cupula de las vejigas fueron implantadas quirurgicamente con un cateter para permitir la perfusion de los agentes de ensayo con una bomba de perfusion a una velocidad constante de 100 pL/min. Durante el periodo 1, la solucion salina fue el lfquido de perfusion utilizado y no se recogieron muestras de plasma. A partir del periodo 2, se recogieron muestras de plasma en puntos de tiempo de 0, 15, 30, 45 y 60 min despues de la perfusion de los agentes de ensayo. Despues de 60 min de perfusion con los agentes de ensayo, se perfundio solamente solucion salina durante 30 minutos adicionales y se recogieron muestras a dos puntos de tiempo adicionales a t = 75 y 90 min para determinar la fase de post-perfusion aguda de los agentes de ensayo. Debido a las concentraciones fijas de las soluciones de irrigacion empleadas en el estudio y al uso de velocidades de perfusion constantes durante tiempos constantes fijos, se administro a todos los animales una dosis fija, uniforme de cada agente.
Se recogieron muestras de sangre entera en tubos con K2EDTA en los tiempos de recogida especificados. El volumen de sangre entera recogido fue aproximadamente 0,2 mL por muestra. La sangre se centrifugo en una centrffuga y se transfirio el plasma a tubos de polipropileno. Las muestras de plasma se almacenaron congeladas a - 80 °C hasta que se enviaron a analisis. Las ratas se sacrificaron por inhalacion de CO2 y la vejiga se diseco
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rapidamente y se congelo en nitrogeno liquido y se conservo congelada a -80 °C hasta su ensayo de contenido de PGE2 en el tejido.
La combinacion de ketoprofeno y nifedipino se formulo de acuerdo con un aspecto de la invencion para incluir ketoprofeno (10 mM), y nifedipino (10 mM) en una base de disolvente de 60 % de polietilenglicol 400 (PEG 400): 40 % de agua, incluyendo tampon de citrato de sodio 50 mM para una solucion de pH 7,5 en un vial de vidrio de 5 mL. Inmediatamente antes de su uso, la solucion de combinacion se diluyo en el fluido de irrigacion estandar en una proporcion de 1:1000 de tal manera que las concentraciones finales de los farmacos activos administrados directamente a la vejiga fueron cada una 10 pM. Para estos experimentos, se eligio una relacion fija de concentracion de nifedipino:ketoprofeno 1:1, y se mantuvieron las concentraciones finales de 10 pM para cada agente en el tampon de irrigacion.
2. Resultados
El estudio demostro un nivel muy bajo de absorcion sistemica de ketoprofeno despues de perfusion de la vejiga con solucion salina que contenfa ketoprofeno 10 pM durante 60 min. En cuatro de seis ratas, se observo un intervalo estrecho de Cmax entre 4,3-5,8 ng/mL a los 60 min. En el punto de tiempo de 60 min, se paro la perfusion con ketoprofeno 10 pM y se continuo la irrigacion con solucion salina normal durante un perfodo adicional de 30 min. Para el grupo de cuatro de seis ratas que mostraron picos de niveles plasmaticos de aproximadamente 5 ng/mL, los niveles plasmaticos disminuyeron a los 75 y 90 minutos despues del cese de la perfusion de ketoprofeno. Se observo absorcion retardada durante el intervalo de 75-90 minutos en los otros dos animales en el grupo de ketoprofeno solo.
Para comparacion, se determinaron tambien los niveles de ketoprofeno para la combinacion de ketoprofeno y nifedipino. El aumento en los niveles plasmaticos sistemicos fue aproximadamente lineal con el tiempo durante la fase de perfusion inicial del farmaco de 60 minutos y los niveles plasmaticos medios absolutos de 9,3 ng/mL (n = 6) a los 60 minutos estuvieron muy por debajo de la dosis diaria terapeutica aceptable de ketoprofeno. Como en el caso del grupo de ketoprofeno solo, se paro la perfusion con la combinacion y se continuo la irrigacion con solucion salina normal durante un perfodo adicional de 30 minutos. Los valores medios de ketoprofeno para todos los animales (n = 6) no fueron significativamente diferentes a los 60, 75 y 90 minutos.
Una comparacion de la media de los resultados de ketoprofeno en plasma se presenta graficamente en la Figura 16 para el grupo de ketoprofeno solo y el grupo de combinacion. Los valores de las medias (y los errores estandar de las medias, SEM) muestran claramente los niveles plasmaticos constantes para la combinacion despues de 60 minutos. Aunque son evidentes pequenas diferencias en la fase mas temprana de la trayectoria temporal, no se observaron diferencias significativas ni en los niveles picos ni en la cinetica de absorcion para los niveles plasmaticos de ketoprofeno en el grupo de combinacion frente al grupo de ketoprofeno solo despues de 30 minutos, ni en los niveles picos, lo que indica que no se presentaron interacciones aparentes de los farmacos ketoprofeno- nifedipino.
El perfil cinetico global observado para el nifedipino fue similar al observado para el ketoprofeno. En el grupo de plasma solo con nifedipino, los niveles plasmaticos de nifedipino aumentaron linealmente en 5 de 6 animales y se observo algun retraso en la absorcion solamente en 1 de 6 animales. El nivel plasmatico Cmax en el grupo de nifedipino estaba en el intervalo de 10,6-16,0 ng/mL a los 60 minutos para 5 de 6 animales. Las medias de los niveles plasmaticos picos observados a los 60 minutos estuvieron por debajo de la media aceptable de los niveles picos de 79 ± 44 ng/mL que se obtiene en el hombre como resultado de una dosis terapeutica diaria oral de nifedipino.
El aumento en los niveles plasmaticos sistemicos de nifedipino a partir de la combinacion de ketoprofeno y nifedipino tambien presento un aumento lineal con el tiempo durante el perfodo inicial de 60 minutos de perfusion del farmaco. Los niveles plasmaticos Cmax en el grupo de combinacion tuvieron un valor medio de 18,2 ng/mL y los valores oscilaron entre 8,2 - 34,6 ng/mL a los 60 minutos para los seis animales. Las medias de los niveles plasmaticos picos observados a los 60 minutos eran aproximadamente una cuarta parte de la media de los niveles picos que se obtienen como resultado de la dosis terapeutica diaria oral de nifedipino.
Como se muestra en la Figura 17, una comparacion de las medias de los picos de concentraciones plasmaticas de nifedipino (y los SEM representados) muestra el aumento lineal similar que se produce durante la fase de perfusion inicial de administracion intravesical. No se observaron diferencias significativas en los niveles plasmaticos de nifedipino en el grupo de nifedipino solo, cuando se compara con el grupo del producto farmacologico de combinacion de nifedipino y ketoprofeno.
Al final del periodo de perfusion de la vejiga de 90 min, se recogieron las vejigas de los animales y posteriormente se analizo la vejiga entera para determinar el contenido de PGE2 utilizando un sistema de inmunoensayo enzimatico. Los datos mostrados en la Figura 18 se expresan como la media de PGE2 utilizando unidades de pg/mg de protefna ± el error estandar de la media de seis animales por grupo de tratamiento. Cuando los animales fueron tratados con nifedipino, se observaron niveles de PGE2 en el tejido de la vejiga de 421 ± 97 pg/mg de protefna (n = 6) en comparacion con los niveles estadfsticamente significativamente (p <0,05) mas bajos en la presencia de ketoprofeno
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solo o ketoprofeno y nifedipino en el grupo de tratamiento de combinacion, 83 ± 22 (n = 6) y 115 ± 63 pg/mg (n = 5), respectivamente. No se observaron diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos de tratamiento con ketoprofeno o los grupos de tratamiento de combinacion. En resumen, el tratamiento con ketoprofeno solo o el tratamiento con la combinacion durante la perfusion de la vejiga inhibieron significativamente la PGE2 formada en la vejiga entera con respecto al grupo de tratamiento con nifedipino.
3. Discusion
Utilizando un metodo de perfusion intravesical para administracion local de farmacos, los farmacos ensayados en este estudio se pusieron directamente en contacto con el sitio de absorcion dentro de la vejiga. La perfusion continua mantuvo constantes las concentraciones de farmaco, de ketoprofeno, o de nifedipino o de la combinacion dentro de la vejiga durante el penodo de administracion de farmaco. En estas condiciones, la exposicion sistemica minima a los farmacos se produjo en ratas hembras durante una perfusion intravesical de 1 hora. Los bajos niveles de cada farmaco fueron detectables dentro del primer intervalo medido de 15 min, y la absorcion progreso gradualmente como una funcion aproximadamente lineal con el tiempo de perfusion del farmaco para cada agente.
Los farmacos y la combinacion de farmacos administrados localmente fueron expuestos a las estructuras de la vejiga, incluyendo el uroepitelio, aferentes de fibra C, eferentes y musculo liso. Los datos obtenidos en el estudio muestran que esta accion es local y no se puede atribuir a un efecto sistemico que podna ser mediado a traves de los mecanismos del sistema nervioso central porque los niveles iniciales en el plasma para ambos farmacos ensayados son muy bajos.
La comparacion de los niveles plasmaticos para cada agente ensayado a niveles humanos conocidos asociados con la administracion oral normal revela la magnitud de la diferencia observada. En el grupo de tratamiento con la combinacion, los niveles maximos para el ketoprofeno fueron aproximadamente 400 veces menores que los picos de los niveles plasmaticos (Cmax) en los seres humanos que se asocian con la dosis terapeutica diaria aceptable de ketoprofeno (nivel plasmatico medio de ketoprofeno en la rata de 9,29 ± 2,13 ng/mL en 60 min). En comparacion, el pico medio diario aceptado Cmax para un unico comprimido de 200 mg de ketoprofeno (una sola dosis oral) es 3900 ng/mL. Similarmente, los picos de niveles observados para nifedipino fueron de aproximadamente 15 ng/mL a 25 ng/mL. Los niveles maximos (Cmax) por lo general se produjeron al final del penodo de perfusion de farmacos de 60 minutos o dentro del siguiente penodo de muestreo de 30 minutos. Para comparacion con los niveles plasmaticos conocidos a partir de la administracion oral convencional, la Cmax diaria aceptada para un unico comprimido de 10 mg de nifedipino de liberacion inmediata, se informo que era 79 ± 44 ng/mL. La exposicion sistemica fue comparable para los niveles plasmaticos de ketoprofeno tanto si se administra solo como con nifedipino. Del mismo modo, los niveles plasmaticos de nifedipino fueron comparables tanto si se administra solo como con ketoprofeno.
Este estudio determino tambien el contenido de PGE2 de la vejiga para cada una de las condiciones de tratamiento del estudio. Un hallazgo adicional importante es el efecto de larga duracion del ketoprofeno que se midio en el ensayo de los niveles de PGE2 de la vejiga entera. Las bajas concentraciones del tratamiento con ketoprofeno solo o del tratamiento con la combinacion durante la perfusion de la vejiga inhibieron significativamente la PGE2 formada en el tejido de la vejiga con respecto al grupo de tratamiento con nifedipino. Los niveles de PGE2 del tejido de la vejiga en la presencia de ketoprofeno no fueron significativamente diferentes de los encontrados despues de un tratamiento con la combinacion. Puesto que la administracion del farmaco se paro a los 60 minutos en este estudio, y despues se utilizo solucion salina para irrigar durante 30 minutos mas, esto demostro que la inhibicion de la PGE2 se mantuvo activa en el penodo posterior a la administracion del farmaco. Por lo tanto, el ketoprofeno demostro un penodo prolongado de actividad anti-inflamatoria en este modelo de administracion local, intravesical, de farmacos.
Ejemplo VII
El proposito de este estudio fue evaluar la solubilidad del ketoprofeno y nifedipino en formulaciones en solucion lfquida acuosa.
1. Metodos
Se prepararon tres formulaciones lfquidas de combinacion de ketoprofeno y nifedipino, identificadas como F3/1, F10/3, y F30/10, segun la composicion mostrada en la Tabla 8 a continuacion. En las tres formulaciones de ensayo, se utilizo tampon acuoso de citrato de sodio 50 mM. Las solubilidades objetivo de ketoprofeno/nifedipino para F3/1, F10/3, y F30/10 fueron 3 mM/1 mM, 10 mM/3 mM, y 30 mM/10 mM respectivamente.
Tabla 8
Resultados de solubilidad para tres formulaciones de combinacion de nifedipino y ketoprofeno
Formulacion ID
Formulacion tampon PEG400 % (v/v) anadido al tampon Solubilidad objetivo (ketoprofeno/nifedipino) Solubilidad de saturacion aproximada (ketoprofeno/nifedipino)
F3/1
Tampon citrato Na 35 % 3 mM/1 mM 4,5 mM/1,5 mM
50 mM pH 5,5
F10/3
Tampon citrato Na 50 mM pH 5,5 50 % 10 mM/3 mM 15 mM/4,5 mM
F30/10
Tampon citrato Na 50 mM pH 5,5 60 % 30 mM/10 mM 45 mM/15 mM
2. Resultados
Con el fin de conseguir la disolucion completa de ambos ingredientes activos, ketoprofeno y nifedipino, en las formulaciones, se utilizaron como co-disolvente diferentes porcentajes de PEG 400, 35 % v/v de PEG 400 (F3/1), 50 5 % v/v de PEG 400 (F10/3), 60 % v/v de PEG 400 (F30/10). Con la ayuda de PEG 400 como agente solubilizante, la
solubilidad de saturacion aproximada de ketoprofeno y nifedipino en las tres formulaciones fue aproximadamente 1,5 veces su respectiva solubilidad objetivo. Los resultados de solubilidad de la Tabla 8 indican claramente que el PEG 400 es un agente mejorador de la solubilidad adecuado para ambos farmacos cuando se desea preparar formulaciones en solucion de la combinacion altamente concentradas.
10 Ejemplo VIII
El proposito de este estudio fue evaluar la estabilidad de formulaciones ejemplares en solucion lfquida acuosa de ketoprofeno y nifedipino en combinacion.
1. Metodos
Se prepararon cuatro formulaciones ejemplares en solucion de la combinacion de ketoprofeno y nifedipino, 15 identificadas como F1 a F4, de acuerdo con la composicion mostrada en la Tabla 9. En las cuatro formulaciones, las concentraciones de los farmacos activos fueron 3 mM para el ketoprofeno y 1 mM para el nifedipino. Las cuatro formulaciones emplearon tampon de citrato de sodio (pH 5,5) con un 35 % v/v de PEG 400. La fuerza ionica del tampon utilizado fue 50 mM para F1 y F2, y 20 mM para F3 y F4. No se anadio ningun antioxidante a la formulacion virgen F1, mientras que a las formulaciones de combinacion F2, F3, y F4, se anadieron respectivamente 0,05 % de 20 galato de propilo, 0,02 % de metabisulfito de sodio, y 0,05 % de galato de propilo mas 0,02 % de metabisulfito de sodio.
Tabla 9
Formulaciones ensayadas de combinacion de nifedipino y ketoprofeno
Formulacion ID
Concentracion de farmaco (ketoprofeno/nifedipino) Vehfculo de la formulacion Antioxidantes anadidos
F1
3 Mm/1 mM Tampon citrato Na 50 mM (pH 5,5) con 35 % v/v de PEG 400 Ninguno
F2
3 Mm/1 mM Tampon citrato Na 50 mM (pH 5,5) con 35 % v/v de PEG 400 0,05% de galato de propilo
F3
3 Mm/1 mM Tampon citrato Na 20 mM (pH 5,5) con 35 % v/v de PEG 400 0,02% de metabisulfito de sodio
F4
3 Mm/1 mM Tampon citrato Na 20 mM (pH 5,5) con 35 % v/v de PEG 400 0,05% de galato de propilo y 0,02% de metabisulfito de sodio
25 Se utilizo un metodo isocratico de cromatograffa de lfquidos de alta resolucion (HPLC) para cuantificar el ketoprofeno y el nifedipino y sus sustancias relacionadas en estas formulaciones de ensayo en solucion despues de almacenamiento durante diferentes perfodos de tiempo. Se tomaron muestras de la formulacion y se diluyeron en la fase movil para obtener una concentracion final de aproximadamente 0,76 mg/mL a 2,54 mg/mL para el ketoprofeno y de aproximadamente 0,35 mg/mL a aproximadamente 1,15 mg/mL para el nifedipino. Las condiciones 30 cromatograficas para el ensayo de sustancias relacionadas fueron las siguientes: (1) longitud de onda de deteccion: UV 241 nm; (2) columna: Zorbax SB-C18, 5 pM, 4,6 x 150 mm; (3) temperatura de la columna: 30 ± 1 °C; (4) caudal: 1,0 mL/min; (5) volumen de inyeccion: 20 pL; (6) tiempo de ejecucion: 27 minutos.
2. Resultados
La Figura 19 muestra un ejemplo de cromatograma de la formulacion en solucion de la combinacion F1 despues de 35 mantenimiento en condiciones extremas a 60 °C durante 1 mes. Los dos ingredientes activos, ketoprofeno y nifedipino, tienen un tiempo de retencion de 24,19 minutos y 19,31 minutos respectivamente. Hay cuatro sustancias relacionadas principales con los tiempos de retencion relativos (RRT) de 0,34, 0,58, 0,75, y 0,87 con respecto al pico de nifedipino. Estos datos de estabilidad se resumen en la Tabla 10.
Tabla 10
Sustancias relacionadas totales (%) de ketoprofeno y nifedipino en formulaciones analizadas despues de almacenamiento a diferentes temperaturas
Formulacion ID
Dias 4 °C 25 °C 40 °C 60 °C
F1
0 - 1,08 - -
14
1,17 4,17 8,83
28
1,49 3,39 6,69 16,45
F2
0 - 1,07 - -
14
1,57 - 2,89 3,63
28
1,89 5,46 3,18 4,75
F3
0 - 1,34 - -
14
1,76 2,86 4,54 8,39
28
2,11 3,51 5,44 12,68
F4
0 - 0,28 - -
14
0,29 0,31 0,34 0,81
28
0,30 0,33 0,51 1,49
5 Los datos de estabilidad de la Tabla 10 indican que la estabilidad qufmica de ketoprofeno y nifedipino, especialmente nifedipino, mejora significativamente en presencia de una pequena cantidad de galato de propilo (0,05 % p/v) o de metabisulfito de sodio (0,02 % p/v) a temperaturas elevadas, tales como 40 °C y 60 °C, siendo este efecto inesperadamente pronunciado para el galato de propilo. Cuando se anade una pequena cantidad tanto de galato de propilo (0,05 % p/v) como de metabisulfito de sodio (0,02 % p/v) a F4, la estabilidad de los dos farmacos a 10 todas las temperaturas mejora significativamente en comparacion con las otras tres formulaciones de combinacion sin antioxidante o con uno de los dos antioxidantes solos, lo que sugiere un efecto aditivo o sinergico de inhibicion de la degradacion de los dos antioxidantes.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion para administracion local para uso en la inhibicion del dolor/inflamacion y del espasmo, que comprende ketoprofeno y un antagonista de los canales de calcio en un vehfculo, que comprende un vehfculo de irrigacion lfquido.
  2. 2. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 1, en donde el antagonista de los canales de calcio comprende un antagonista de los canales de calcio tipo L; por ejemplo verapamilo, diltiazem, bepridil, mibefradil, nifedipino, nicardipino, isradipino, amlodipino, felodipino, nisoldipino o nimodipino; especialmente una dihidropiridina, tal como nifedipino, nicardipino, isradipino, amlodipino, felodipino, nisoldipino y nimodipino; y preferiblemente tiene un inicio de accion de menos de o igual a 10 minutos.
  3. 3. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 1, en donde el antagonista de los canales de calcio comprende nifedipino.
  4. 4. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 3, en donde el ketoprofeno y el nifedipino se incluyen en una relacion molar ketoprofeno:nifedipino de 10:1 a 1:10.
  5. 5. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 4, en donde la relacion molar de ketoprofeno:nifedipino es de 4:1 a 1:1 y es preferiblemente 3:1.
  6. 6. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 4, en donde el ketoprofeno esta incluido en la composicion a una concentracion no superior a 500.000 nanomolar y el nifedipino esta incluido en la composicion a una concentracion no superior a 200.000 nanomolar; adecuadamente en donde el ketoprofeno esta incluido en la composicion a una concentracion no superior a 300.000 nanomolar y el nifedipino esta incluido en la composicion a una concentracion no superior a 100.000 nanomolar; y preferiblemente en donde el ketoprofeno esta incluido en la composicion a una concentracion no superior a 50.000 nanomolar y el nifedipino esta incluido en la composicion a una concentracion no superior a 25.000 nanomolar.
  7. 7. Una composicion farmaceutica para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el vehfculo comprende un vehfculo acuoso.
  8. 8. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 7, en donde la composicion comprende al menos un agente estabilizante; por ejemplo, galato de propilo.
  9. 9. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 8, en donde la composicion comprende ademas metabisulfito de sodio; y/o comprende ademas como co-disolvente polietilenglicol 400 por ejemplo PEG400; y/o comprende ademas un tampon tal como un tampon de acido cftrico.
  10. 10. Una composicion farmaceutica para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el ketoprofeno es el S-(+)-enantiomero, dexketoprofeno.
  11. 11. Una composicion farmaceutica para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para inhibir el dolor/inflamacion y el espasmo en las vfas urinarias.
  12. 12. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 11, en donde el medicamento es administrable periprocedimentalmente a las vfas urinarias durante un procedimiento de diagnostico, de intervencion, quirurgico u otro procedimiento medico urologico; por ejemplo un procedimiento cistoscopico; o en donde el medicamento se administra periprocedimentalmente durante un procedimiento ureteroscopico; o en donde el medicamento se administra periprocedimentalmente durante un procedimiento para extraer, fragmentar o desalojar una piedra del rinon o de la vejiga; o en donde el medicamento se administra periprocedimentalmente durante un procedimiento que causa lesiones termicas al tejido de las vfas urinarias; por ejemplo en donde el medicamento se administra periprocedimentalmente durante un procedimiento de laser, ablacion por microondas, ablacion por radiofrecuencia, electrocauterizacion o crioablacion; o en donde la composicion se administra periprocedimentalmente durante una reseccion transuretral de la prostata; o en donde la composicion se administra periprocedimentalmente transrectalmente o transperitonealmente a la prostata; o en donde el antagonista de los canales de calcio en la composicion comprende nifedipino; o en donde el ketoprofeno en la composicion comprende el S-(+)-enantiomero, dexketoprofeno.
  13. 13. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 11, en donde el medicamento se administra periprocedimentalmente transrectalmente o transperitonealmente a la prostata.
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