ES2612205T3

ES2612205T3 - Derivados de pirazol y su uso como antagonistas de LPAR5

Info

Publication number: ES2612205T3
Application number: ES13723151.0T
Authority: ES
Inventors: Marc Nazaré; Detlef Kozian; Andreas Evers; Werngard Czechtizky
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2017-05-12
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: DK2882715T3; WO2013171317A1; US20150141477A1; US9346762B2; MX347615B; RU2645344C2; LT2882715T; BR112014028406A2; IL235221A; CN104302625B; CA2871542A1; CY1118618T1; EP2882715B1; HRP20170098T1; JP6257596B2; AU2013261718B2; AU2013261718A1; JP2015517514A; HUE032890T2; EP2882715A1

Abstract

Un compuesto de la fórmula I,**Fórmula** en el que R1 se selecciona de la serie que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C7), cicloalquil(C3-C7)- alquil(C1-C4)-, Ar y Ar-alquil(C1-C4)-; R2 y R3 se seleccionan independientemente uno de otro de la serie que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo (C1- C4), cicloalquilo (C3-C7), cicloalquil(C3-C7)-alquil(C1-C4)-, Ar, Ar-alquil(C1-C4)-, alquil(C1-10 C4)-O-, cicloalquil(C3-C7)-O-, cicloalquil(C3-C7)-alquil(C1-C4)-O-, Ar-O- y Ar-alquil(C1-C4)-O-, R4 y R5 se seleccionan independientemente uno de otro de la serie que consiste en hidrógeno, flúor y alquilo (C1-C6), o los grupos R4 y R5 junto con el átomo de carbono que los soporta forman un anillo de cicloalcano (C3-C7) que no está sustituido o está sustituido con uno o más sustituyentes idénticos o diferentes seleccionados de la serie que consiste en flúor y alquilo (C1-C4); R11, R12, R13 y R14 se seleccionan independientemente uno de otro de la serie que consiste en hidrógeno y alquilo (C1-C4); Ar se selecciona de la serie que consiste en fenilo, naftilo y un heterociclo monocíclico aromático de 5 miembros o 6 miembros que comprende uno o dos heteroátomos de anillo idénticos o diferentes seleccionados de la serie que consiste en N, O y S, que están todos no sustituidos o sustituidos con uno o más sustituyentes idénticos o diferentes seleccionados de la serie que consiste en halógeno, alquilo (C1-C4), cicloalquilo (C3-C7), cicloalquil(C3-C7)-alquil(C1- C4)-, ciano y alquil(C1-C4)-O-; V se selecciona de la serie que consiste en R12-N(R13)-, y en este caso G y M no están presentes, o V se selecciona de la serie que consiste en -N(R14)-, -N(R14)-alquil(C1-C4)-, -O- y -O-alquil(C1-C4)-, y en este caso G se selecciona de la serie que consiste en un enlace directo y fenileno que no está sustituido o está sustituido con uno o más sustituyentes idénticos o diferentes seleccionados de la serie que consiste en halógeno, alquilo (C1-C4), ciano y alquil(C1-C4)-O-, con la condición de que G no sea un enlace directo si V es -N(R14)- o -O-, y M se selecciona de la serie que consiste en R11-O-C(O)- y R12-N(R13)-C(O)-; en donde todos los grupos alquilo están no sustituidos o sustituidos con uno o más sustituyentes flúor, y todos los 30 grupos cicloalquilo están no sustituidos o sustituidos con uno o más sustituyentes idénticos o diferentes seleccionados de la serie que consiste en flúor y alquilo (C1-C4); en cualquiera de sus formas estereoisómeras o una mezcla de formas estereoisómeras en cualquier relación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con la condición de que los compuestos seleccionados del grupo ácido 4-[[[2-[[5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-1H-pirazol-3-il]metoxi]-2-metil-1- oxopropil]amino]metil]benzoico, ácido 4-[[[2-[[5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-1H-pirazol-3-il]metoxi]-1-oxobutil]amino]metil]benzoico, ácido 4-[[[2-[[5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-1H-pirazol-3-il]metoxi]acetil]amino]metil]benzoico, ácido 4-[[[2-[[1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-5-(4-metilfenil)-1H-pirazol-3-il]metoxi]-2-metil-1- oxipropil]amino]metil]benzoico, ácido 4-[[[2-[(1,5-bis(2,4-diclorofenil)-4-metil-1H-pirazol-3-il]metoxi]-2-metil-1-oxipropil]amino]metil]benzoico, ácido 4-[[[2-[[5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-1H-pirazol-3-il]metoxi]-1-oxopropil]amino]metil]benzoico, ácido 2-[[1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-5-[4-(trifluorometil)fenil]-1H-pirazol-3-il]metoxi]-2-metilpropanamida, 2-[[1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-5-[4-(trifluorometoxi)fenil]-1H-pirazol-3-il]metoxi]-2-metilpropanamida, ácido 4-[[[2-[[1-(2,4-diclorofenil)-4-metil-5-[4-trifluorometoxi)fenil]-1H-pirazol-3-il]metoxi]-2-metil-1- oxopropil]amino]metil]benzoico, y ácido 4-[[[2-[[5-(2,4-diclorofenil)-4-metil-1-[4-trifluorometil)fenil]-1H-pirazol-3-il]metoxi]-2-metil-1- oxopropil]amino]metil]benzoico no estén dentro de la reivindicación.

Description

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En una realización, los compuestos de la fórmula I se definen como anteriormente y R1 se selecciona de la serie que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C7), cicloalquil(C3-C7)-alquil(C1-C4)-, Ar y Ar-alquil(C1-C4)-, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C6), Ar y Ar-alquil(C1-C4)-, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C4), Ar y Ar-alquil(C1-C4)-, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C6) y Ar, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C4) y Ar, en otra realización de la serie que consiste en Ar y Ar-alquil(C1-C4)-, en otra realización R1 es Ar, en donde todos los grupos Ar no están sustituidos o están sustituidos según se especifica. En una realización, un grupo Ar-alquil(C1-C4)-que representa R1 es un grupo Ar-(C1C2)-alquil-, en otra realización un grupo Ar-CH2-. En una realización un grupo Ar que representa R1 es un grupo fenilo que no está sustituido o está sustituido según se especifica. En una realización, un grupo Ar o grupo fenilo sustituido que representa R1 está sustituido con uno, dos o tres, en otra realización con uno o dos, en otra realización con uno, sustituyentes idénticos o diferentes, en donde en una realización los sustituyentes se seleccionan de la serie que consiste en halógeno, alquilo (C1-C4), ciano y alquil(C1-C4)-O-, en otra realización de la serie que consiste en halógeno, alquilo (C1-C4) y ciano, en otra realización de la serie que consiste en halógeno, alquilo (C1-C4) y alquil(C1-C4)-O-, en otra realización de la serie que consiste en halógeno y alquilo (C1-C4), y en otra realización son sustituyentes halógeno idénticos o diferentes, por ejemplo cloro.

En una realización, los compuestos de la fórmula I se definen como anteriormente y R2 y R3 se seleccionan independientemente uno de otro de la serie que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo (C1-C4), Ar, Ar-alquil(C1-C4)-, alquil(C1-C4)-O-, Ar-O-y Ar-alquil(C1-C4)-O-, en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C4), Ar, Ar-alquil(C1-C4)-, alquil(C1-C4)-O-, Ar-O-y Ar-alquil(C1-C4)-O-, en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C4), Ar, Ar-alquil(C1-C4)-y Ar-O-, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C4), Ar, Ar-alquil(C1-C4)-y Ar-O-, en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C4), Ar y Ar-O-, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C4), Ar y Ar-O-, en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C4) y Ar, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C4) y Ar, en donde todos los grupos Ar que se presentan en R2 y R3 están no sustituidos o sustituidos según se especifica.

En una realización, uno de los grupos R2 y R3 es el grupo Ar o contiene un grupo Ar, y el otro de los grupos R2 y R3 se selecciona de la serie que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C4) y Ar, en otra realización de la serie que consiste en alquilo (C1-C4) y Ar, en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno y alquilo (C1-C4). En una realización, un grupo Ar que está presente en R2 o R3 se selecciona de la serie que consiste en fenilo, naftilo y un heterociclo monocíclico aromático de 5 miembros o 6 miembros que comprende un heteroátomo de anillo seleccionado de la serie que consiste en N, O y S, en otra realización de la serie que consiste en fenilo y un heterociclo monocíclico aromático de 5 miembros o 6 miembros que comprende un heteroátomo de anillo seleccionado de la serie que consiste en N, O y S, en otra realización de la serie que consiste en fenilo, naftilo y tienilo, en otra realización de la serie que consiste en fenilo y tienilo, en otra realización de la serie que consiste en fenilo y naftilo, y en otra realización es un grupo fenilo, que están todos no sustituidos o sustituidos según se especifica. En una realización, el número de sustituyentes en un grupo Ar sustituido que está presente en R2 o R3 es uno, dos o tres, en otra realización es uno o dos, en otra realización es uno. En una realización, los sustituyentes en un grupo Ar sustituido que está presente en R2 o R3 se seleccionan de la serie que consiste en halógeno, alquilo (C1-C4), cicloalquilo (C3-C7), ciano y alquil(C1-C4)-O-, en otra realización de la serie que consiste en halógeno, alquilo (C1-C4), cicloalquilo (C3-C7) y alquil(C1-C4)-O-, en otra realización de la serie que consiste en halógeno y alquilo (C1-C4), en donde los sustituyentes alquilo (C1-C4) están no sustituidos o sustituidos con uno o más sustituyentes flúor. En una realización, un sustituyente alquilo (C1-C4) presente en un grupo Ar que está presente en R2 o R3 es un grupo perfluoroalquilo, por ejemplo un grupo trifluorometilo CF3. En una realización, los sustituyentes halógeno presentes en un grupo Ar que está presente en R2 o R3 son sustituyentes flúor y/o cloro.

En una realización, los compuestos de la fórmula I se definen como anteriormente y R4 y R5 se seleccionan independientemente uno de otro de la serie que consiste en hidrógeno, flúor y alquilo (C1-C4), en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno y alquilo (C1-C4), en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno y alquilo (C1-C3), en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo e isopropilo, en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno y metilo, y en otra realización al menos uno de los grupos R4 y R5 es diferente de hidrógeno, o los grupos R4 y R5 junto con el átomo de carbono que los soporta forman un anillo de cicloalcano (C3-C7), en una realización un anillo de cicloalcano (C4-C6), en otra realización un anillo de cicloalcano (C5-C6), anillos de cicloalcano que están todos no sustituido o sustituidos según se especifica.

En otra realización, los compuestos R4 y R5 se seleccionan independientemente uno de otro de la serie que consiste en hidrógeno, flúor y alquilo (C1-C4), en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno y alquilo (C1-C4), en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno y alquilo (C1-C3), en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo e isopropilo, en otra realización de la serie que consiste en hidrógeno y metilo. En una realización, uno de los grupos R4 y R5 es hidrógeno y el otro es como se define, en otra realización los grupos R4 y R5 son ambos hidrógeno, en otra realización al menos uno de los grupos R4 y R5 es diferente de hidrógeno, en otra realización los grupos R4 y R5 son ambos alquilo (C1-C4), en otra realización los grupos R4 y R5 son ambos alquilo (C1-C3), y en otra realización los grupos R4 y R5 se seleccionan ambos de la serie que consiste en metilo, etilo, n-propilo e isopropilo. En una realización, los grupos R4 y R5 son idénticos.

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de sales diastereoisómeras obtenidas con ácidos o bases ópticamente activos. Compuestos de la fórmula I estereoquímicamente uniformes también se pueden obtener al emplear materias primas estereoquímicamente uniformes o al usar reacciones estereoselectivas.

Se entiende que las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I son sales atóxicas que son sales fisiológicamente aceptables y farmacéuticamente utilizables. Tales sales de compuestos de la fórmula I que contienen grupos ácidos, por ejemplo un grupo carboxilo COOH, son, por ejemplo, sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos tales como sales sódicas, sales potásicas, sales magnésicas y sales cálcicas, y también sales como iones amonio cuaternario farmacéuticamente aceptables tales como tetrametilamonio o tetraetilamonio, y sales por adición de ácido con amoníaco y aminas orgánicas farmacéuticamente aceptables, tales como metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, trietilamina, etanolamina o tris-(2-hidroxietil)amina. Los grupos básicos contenidos en los compuestos de la fórmula I forman sales por adición de ácido, por ejemplo con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico, o con ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido málico, ácido succínico, ácido malónico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido metanosulfónico o ácido p-toluenosulfónico. Los compuestos de la fórmula I que contienen simultáneamente un grupo básico y un grupo ácido también pueden estar presentes como iones híbridos (betaínas), que asimismo se incluyen en la presente invención.

Las sales de compuestos de la fórmula I se pueden obtener mediante métodos habituales conocidos por los expertos en la especialidad, por ejemplo al combinar un compuesto de la fórmula I con un ácido o base inorgánico u orgánico en un disolvente o dispersante, o en otras sales mediante intercambio catiónico o intercambio aniónico. La presente invención también incluye todas las sales de los compuestos de la fórmula I que, debido a la baja tolerabilidad fisiológica, no son directamente adecuadas para el uso en productos farmacéuticos pero son adecuadas, por ejemplo, como productos intermedios para llevar a cabo modificaciones químicas adicionales de los compuestos de la fórmula I o como materias primas para la preparación de sales farmacéuticamente aceptables.

Pueden ser útiles solvatos, derivados y modificaciones adicionales de los compuestos de la fórmula I, por ejemplo profármacos, formas protegidas y otros derivados farmacéuticamente aceptables. En particular, son útiles los profármacos y las formas protegidas de los compuestos de la fórmula I, que se pueden convertir en los compuestos de la fórmula I bajo condiciones fisiológicas. Profármacos adecuados para los compuestos de la fórmula I, es decir derivados químicamente modificados de los compuestos de la fórmula I que tienen propiedades que se mejoran de un modo deseado, por ejemplo con respecto a la solubilidad, la biodisponibilidad o la duración de acción, son conocidos por los expertos en la especialidad. Información más detallada relativa a los profármacos se encuentra en bibliografía estándar como, por ejemplo, Design of Prodrugs, H. Bundgaard (ed.), Elsevier, 1985; Fleisher y cols., Advanced Drug Delivery Reviews 19 (1996) 115-130; H. Bundgaard, Drugs of the Future 16 (1991) 443; Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, B. Testa, J. M. Mayer, Wiley-VCH, 2003,.

Profármacos adecuados para los compuestos de la fórmula I son especialmente profármacos de acilo y profármacos de carbamato de grupos que contienen nitrógeno acilables tales como grupos amino y profármacos de éster y profármacos de amida de grupos ácido carboxílico que pueden estar presentes en los compuestos de la fórmula I. En los profármacos de acilo y profármacos de carbamato un átomo de hidrógeno en un átomo de nitrógeno en tales grupos se reemplaza por un grupo acilo o un grupo éster, por ejemplo un grupo alquil(C1-C6)-O-C(O)-. Grupos acilo y grupos éster adecuados para profármacos de acilo y profármacos de carbamato son, por ejemplo, los grupos Rp1CO-y Rp2O-CO-, en los que Rp1 puede ser hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C7), cicloalquil(C3-C7)alquil(C1-C4)-, Ar, arilo (C6-C14), aril(C6-C14)-alquil(C1-C4)-o Ar-alquil(C1-C4)-, por ejemplo, y en los que Rp2 tiene los significados indicados para Rp1 con la excepción de hidrógeno. Se entiende que el término arilo (C6-C14) significa un residuo de un hidrocarburo aromáticos monocíclico, bicíclico o tricíclico que contiene de 6 a 14 átomos de carbono de anillo, por ejemplo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 átomos de carbono de anillo. Ejemplos son fenilo, naftilo, por ejemplo 1-naftilo y 2-naftilo, o bifenililo.

Además, con respecto a todas las realizaciones de la invención especificadas en la presente memoria, se aplica que los compuestos de la fórmula I comprendido son una materia de la invención en todas sus formas estereoisómeras y mezclas de formas estereoisómeras en cualquier relación, y en la forma de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos de la fórmula I se pueden preparar al utilizar procedimientos y técnicas que de por sí son muy conocidos y apreciados por un experto normal en la especialidad. Materias primas o unidades estructurales para el uso en los procedimientos sintéticos generales que se pueden aplicar en la preparación de los compuestos de fórmula I están fácilmente disponibles para un experto normal en la especialidad. En muchos casos, están disponibles comercialmente o se han descrito en la bibliografía. De otro modo, se pueden preparar a partir de compuestos precursores fácilmente disponibles análogamente a procedimientos descritos en la bibliografía, o mediante procedimientos o análogamente a procedimientos descritos en la presente memoria.

En general, los compuestos de la fórmula I se pueden preparar, por ejemplo en el transcurso de una síntesis convergente, al conectar dos o más fragmentos que se pueden derivar retrosintéticamente de la fórmula I. Más específicamente, se emplean derivados de pirazol de partida adecuadamente sustituidos como unidades

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10 10) T. Haque y cols., J. Med. Chem. (2002) 4669.

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11) H. V. Patel, Synth. Commun. (1991) 21, 1583.

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y descarboxilación posterior de pirazol que soporta un grupo éster en la posición pertinente. Se pueden introducir átomos de halógeno, por ejemplo según procedimientos como los siguientes descritos en la bibliografía. Para la fluoración de pirazoles, se puede usar triflato de N-fluoro-2,4,6-trimetilpiridinio (T. Umemoto, S. Fukami, G. Tomizawa, K. Harasawa, K. Kawada, K. Tomita, J. Am. Chem. Soc. (1990) 112, 8563; véase también K. Manko y cols., J. Fluorine Chem. (1988) 39, 435; R. Storer y cols. Nucleosides Nucleotides (1999) 18; 203). También se pueden emplear otros reactivos de fluoración adecuados cuando sea apropiado. La cloración, la bromación o la yodación de pirazoles se puede efectuar mediante la reacción con halógenos elementales o mediante el uso de Nhalosuccinimidas como NCS, NBS o NIS y muchos otros reactivos muy conocidos por los expertos en la especialidad. Además, procedimientos adecuados son descritos, por ejemplo, por M. Rodríguez-Franco y cols., Tetrahedron Lett. (2001) 42, 863; J. Pawlas y cols., J. Org. Chem. (2000) 65, 9001; Y. Huang y cols., Org Lett (2000) 2, 2833; W. Holzer y cols., J. Heterocycl. Chem. (1995) 32, 1351; N. Kudo y cols., Chem. Pharm. Bull. (1999) 47, 857; G. Auzzi y cols., Farmaco, Ed Sci. (1979) 34, 743; K. Morimoto y cols., J. Heterocycl. Chem. (1997) 34, 537; D. Jeon y cols., Synth. Commun. (1998) 28, 2159. Dependiendo de las condiciones de reacción, el reactivo, la estequiometría y el patrón de sustitución, el halógeno se introduce en la posición 3 y/o la posición 4 y/o la posición 5. Mediante intercambio selectivo halógeno/metal o metalación mediante intercambio selectivo hidrógeno/metal y posterior reacción con una amplia gama de electrófilos, se pueden introducir diversos sustituyentes en el núcleo heterocíclico (M. R. Grimmett, Heterocycles (1994) 37, 2087; V. D. Gardner y cols., J. Heterocycl. Chem. (1984), 21, 121; D. Butler y cols., J. Org. Chem. (1971) 36, 2542). Entre otros, las pirazolonas correspondientes pueden ser precursores útiles para la introducción de átomos de halógeno. Por ejemplo, un 1H-pirazol-3-ol se puede convertir en un 5-cloro-1H-pirazol al usar oxicloruro de fósforo, por ejemplo. El 5-bromo-1H-pirazol se puede obtener a partir de 1H-pirazol-3-ol mediante procedimientos estándar similares usando oxibromuro de fósforo, tribromuro de fósforo o pentabromuro de fósforo.

Los halógenos, los grupos hidroxi (a través de triflato o nonaflato) o las aminas primarias (a través de la sal de diazonio), o después de la interconversión en los estannanos y ácidos bóricos correspondientes, presentes en la estructura del pirazol se pueden convertir en una variedad de otros grupos funcionales como, por ejemplo, -CN, -CF3, -C2F5, éteres, ácidos, amidas, aminas, grupos alquilo o arilo mediados por medio de metales de transición, tales como catalizadores de paladio o níquel o sales y reactivos de cobre, por ejemplo mencionados posteriormente

(F.: Diederich, P. Stang, Metal-catalyzed Cross-coupling Reactions, Wiley-VCH, 1998; M. Beller, C. Bolm, Transition Metals for Organic Synthesis, Wiley-VCH, 1998; J. Tsuji, Palladium Reagents and Catalysts, Wiley, 1996; J. Hartwig, Angew. Chem. 1998, 110, 2154; B. Yang, S. Buchwald, J. Organomet. Chem. 1999, 576, 125; T. Sakamoto, K. Ohsawa, J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1999, 2323; D. Nichols, S. Frescas, D. Marona-Lewicka, X. Huang, B. Roth,

G.: Gudelsky, J. Nash, J. Med. Chem, 1994, 37, 4347; P. Lam, C. Clark, S. Saubern, J. Adams, M. Winters, D. Chan,

A.: Combs, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 2941; D. Chan, K. Monaco, R. Wang, M. Winters, Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2933; V. Farina, V. Krishnamurti, W. Scott, The Stille Reaction, Wiley, 1994; F. Qing y cols. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 1997, 3053; S. Buchwald y cols. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7727; S. Kang y cols. Synlett 2002, 3, 427; S. Buchwald y cols. Organic Lett. 2002, 4, 581; T. Fuchikami y cols. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 91; Q. Chen y cols. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 7689; M. R. Netherton, G. C. Fu, Topics in Organometallic Chemistry 2005, 14, 85-108;

A.: F. Littke, G. F. Fu, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 4176-4211; A. R. Muci, S. L. Buchwald, Topics in Current Chemistry 2002, 219, 131-209).

Los grupos éster presentes en el núcleo de pirazol se pueden hidrolizar hasta los ácidos carboxílicos correspondientes, que después de la activación se pueden hacer reaccionar a continuación con aminas o alcoholes bajo condiciones estándar. Por otra parte, estos grupos éster o ácido se pueden reducir hasta los alcoholes correspondientes mediante muchos procedimientos estándar. Los grupos éter presentes en el pirazol, por ejemplo grupos benciloxi u otros grupos éter fácilmente escindibles, se pueden escindir para dar grupos hidroxi que se pueden hacer reaccionar a continuación con una variedad de agentes, por ejemplo agentes de eterificación o agentes activadores que permiten la sustitución del grupo hidroxi por otros grupos. Los grupos que contienen azufre se pueden hacer reaccionar análogamente.

Durante el transcurso de la síntesis a fin de modificar los grupos ligados al sistema anular de pirazol mediante la aplicación de una metodología de síntesis paralela, además de una variedad de reacciones, pueden ser extremadamente útiles los catalizadores de paladio, níquel o cobre. Tales reacciones se describen, por ejemplo, en

F. Diederich, P. Stang, Metal-catalyzed Cross-coupling Reactions, Wiley-VCH, 1998; M. Beller, C. Bolm, Transition Metals for Organic Synthesis, Wiley-VCH, 1998; J. Tsuji, Palladium Reagents and Catalysts, Wiley, 1996; J. Hartwig, Angew. Chem. 1998, 110, 2154; B. Yang, S. Buchwald, J. Organomet. Chem. 1999, 576, 125; P. Lam, C. Clark, S. Saubern, J. Adams, M. Winters, D. Chan, A. Combs, Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2941; D. Chan, K. Monaco, R. Wang, M. Winters, Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2933; J. Wolfe, H. Tomori, J. Sadight, J. Yin, S. Buchwald, J. Org. Chem. 2000, 65, 1158; V. Farina, V. Krishnamurti, W. Scott, The Stille Reaction, Wiley, 1994; S. Buchwald y cols., J. Am. Chem Soc. 2001, 123, 7727; S. Kang y cols., Synlett 2002, 3, 427; S. Buchwald y cols., Org. Lett. 2002, 4, 581.

Por otra parte, en general, las susodichas reacciones para la conversión de grupos funcionales se describen a fondo en libros de texto de la química orgánica como M. Smith, J. March, March's Advanced Organic Chemistry, Wiley-VCH, 2001 y en tratados como Houben-Weil, Methoden der Organischen Chemie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania; u Organic Reactions, John Wiley & Sons, Nueva York; R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH, 2ª ed., 1999; B. Trost, I. Fleming (eds.), Comprehensive Organic Synthesis, Pergamon,

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cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula I que se define en la reivindicación 7 y/o una sal farmacéuticamente aceptable, así como composiciones farmacéuticas para el mismo.

Como la inhibición del receptor de LPA LPAR5 influye en la activación de mastocitos, los compuestos de la fórmula I que se definen en la reivindicación 7 y/o sus sales farmacéuticamente aceptables generalmente son adecuados para reducir la activación de mastocitos, o para el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis, de afecciones y enfermedades en las que la actividad de los mastocitos representa un papel o tiene un grado no deseado, o que se pueden ver influidas favorablemente al reducir la activación de mastocitos, o para cuya prevención, alivio o curación se desea por parte del médico una disminución de la actividad del sistema mastocítico. Una materia específica de la presente invención es así la reducción o inhibición de la activación no deseada de mastocitos, en particular en un individuo, al administrar una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula I que se define en la reivindicación 7 y/o una sal farmacéuticamente aceptable, así como composiciones farmacéuticas para el mismo.

Como la inhibición del receptor de LPA LPAR5 influye en la activación de microgliocitos, los compuestos de la fórmula I que se definen en la reivindicación 7 y/o sus farmacéuticamente aceptables generalmente son adecuados para reducir la activación de microgliocitos, o para el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis, de afecciones en las que la actividad de los microgliocitos representa un papel o tiene un grado no deseado, o que se pueden ver influidas favorablemente al reducir la activación de microgliocitos, o para cuya prevención, alivio o curación se desea por parte del médico una disminución de la actividad del sistema microgliocítico. Una materia específica de la presente invención es así la reducción o inhibición de la activación no deseada de microgliocitos, en particular en un individuo, al administrar una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula I que se define en la reivindicación 7 y/o una sal farmacéuticamente aceptable, así como composiciones farmacéuticas para el mismo.

La presente invención también se refiere a los compuestos de la fórmula I que se definen en la reivindicación 7 y/o sus sales farmacéuticamente aceptables para el uso en el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis, de enfermedades tromboembólicas, tales como trombosis venosa profunda, tromboembolia venosa y arterial, tromboflebitis, trombosis arterial coronaria y cerebral, embolia cerebral, embolia renal, embolia pulmonar, coagulación intravascular diseminada, trastornos cardiovasculares, tales como ataques isquémicos transitorios, apoplejías, infarto de miocardio agudo, angina inestable, angina estable crónica, enfermedad vascular periférica, preeclampsia/eclampsia y púrpura citopénica trombótica y desarrollo y avance de trastornos inflamatorios, tales como hiperalgesia, asma, esclerosis múltiple, dolor inflamatorio, angiogénesis, aterotrombosis o respuestas alérgicas, o reestenosis.

La presente invención también se refiere al uso de los compuestos de la fórmula I que se definen en la reivindicación 7 y/o sus sales farmacéuticamente aceptables para la fabricación de composiciones farmacéuticas o medicamentos para la inhibición del receptor de LPA LPAR5 o para influir en la activación de plaquetas, la agregación de plaquetas y la desgranulación de plaquetas y promover la desagregación de plaquetas, respuesta inflamatoria y/o para el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis de las enfermedades mencionadas anteriormente o posteriormente, por ejemplo para la producción de medicamentos para el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis, de trastornos cardiovasculares, enfermedades tromboembólicas o reestenosis, para el tratamiento de trombosis venosa profunda, tromboembolia venosa y arterial, tromboflebitis, trombosis arterial coronaria y cerebral, embolia cerebral, embolia renal, embolia pulmonar, coagulación intravascular diseminada, ataques isquémicos transitorios, apoplejías, infarto de miocardio agudo, angina inestable, angina estable crónica, enfermedad vascular periférica, preeclampsia/eclampsia, y púrpura citopénica trombótica y desarrollo y avance de trastornos inflamatorios, tales como hiperalgesia, asma, esclerosis múltiple, angiogénesis, respuestas alérgicas y otros.

La invención también se refiere a los compuestos de la fórmula I que se definen en la reivindicación 7 y/o sus sales farmacéuticamente aceptables para el uso en el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis, de las enfermedades mencionadas anteriormente o posteriormente, por ejemplo para el uso en el tratamiento de trastornos cardiovasculares, enfermedades tromboembólicas, aterotrombosis o reestenosis, y a métodos de tratamiento que se dirigen a tales propósitos incluyendo métodos para dichas terapias y profilaxis.

Debido al papel fundamental de los receptores de LPA LPAR5 en la activación de plaquetas mediada por LPA, la invención también se refiere a compuestos de la fórmula I que se definen en la reivindicación 7 y/o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el uso en el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis, de estados de enfermedad tales como formación anormal de trombos, infarto de miocardio agudo, angina inestable, tromboembolia, cierre agudo de vasos asociado con terapia trombolítica o angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA), ataques isquémicos transitorios, apoplejía, claudicación intermitente o injerto de derivación de las arterias coronarias o periféricas, estrechamiento luminal de los vasos, reestenosis después de angioplastia coronaria o venosa, mantenimiento de la permeabilidad de acceso vascular en pacientes de hemodiálisis a largo plazo, formación patológica de trombos que se presenta en las venas de las extremidades inferiores después de cirugía abdominal, de rodilla o cadera, un riesgo de tromboembolia pulmonar, o coagulopatía intravascular sistémica diseminada que se presenta en los sistemas vasculares durante el choque séptico, el choque, ciertas infecciones virales o el cáncer. La invención también se refiere al uso de un a compuesto de la fórmula I que se define en la reivindicación 7 y/o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, incluyendo la terapia y la profilaxis, de dichos estados de enfermedad.

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Ejemplo 3: Ácido 1-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-ciclopentanocarboxílico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 1. MS (ES-): m/e = 477, patrón de cloro.

Ejemplo 4: Ácido 2-[1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-5-(4-trifluorometil-fenil)-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metil-propiónico

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(i): 3-Etoxicarbonil-2-metil-3-oxo-1-(4-trifluorometil-fenil)-propan-1-olato de litio

Se añadieron gota a gota a lo largo de 15 min. 20 g de 1-(4-trifluorometil-fenil)-propan-1-ona en 51 ml de metilciclohexano a una solución de 118 ml de bis(trimetilsilil)amida de litio (hexametildisilazida de litio; 0,9 M en metilciclohexano) mientras se mantenía la mezcla de reacción a 15 -25°C. Después de agitar durante 2 h, se añadieron gota a gota a lo largo de 30 min. 15 ml de oxalato de dietilo y la mezcla de reacción se agitó durante 16 h. A continuación, el producto precipitado se recogió mediante filtración y se lavó con n-heptano. El producto en bruto aislado se usó en la siguiente etapa después de secar a vacío. Rendimiento: 19 g.

(ii): Ácido 1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-5-(4-trifluorometil-fenil)-1H-pirazol-3-carboxílico

Una solución de 10 g de 3-etoxicarbonil-2-metil-3-oxo-1-(4-trifluorometil-fenil)-propan-1-olato de litio, 6,9 g de hidrocloruro de (2,4-dicloro-fenil)-hidracina y 74 ml de ácido sulfúrico (50%) en 184 ml de etanol se calentó hasta reflujo durante 7 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, los disolventes orgánicos se retiraron bajo presión reducida y el residuo se diluyó con 100 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y el disolvente se retiró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en 100 ml de THF y se añadió a temperatura ambiente una solución de 1,4 g de LiOH en 20 ml de agua. La mezcla de reacción se calentó hasta 60°C durante 7 h. A continuación, después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se acidificó hasta pH 1 mediante la adición de ácido clorhídrico semiconcentrado. El producto que precipitaba se recogió mediante filtración y se lavó con agua. El residuo se codestiló dos veces con diclorometano y dos veces con tolueno. El producto en bruto aislado se usó en la siguiente etapa de reacción. Rendimiento: 13 g.

(iii) [1-(2,4-Dicloro-fenil)-4-metil-5-(4-trifluorometil-fenil)-1H-pirazol-3-il]-metanol

Se añadieron gota a gota 43 ml de una solución 1 M de borano en THF a temperatura ambiente a una solución de 4,5 g de ácido 1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-5-(4-trifluorometilfenil)-1H-pirazol-3-carboxílico en 30 ml de THF. A continuación, la mezcla de reacción se calentó hasta reflujo durante 10 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadieron cuidadosamente 20 ml de metanol. Los disolventes se retiraron bajo presión reducida y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con ácido clorhídrico 1 M, solución saturada de cloruro sódico y solución saturada de hidrogenocarbonato sódico. Las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El producto se obtuvo como un sólido blanco y se usó sin purificación adicional. Rendimiento: 4,3 g.

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Ejemplo 7: Ácido 2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-butírico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 5. MS (ES-): m/e= 452, patrón de cloro.

Ejemplo 8: Ácido 2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-propiónico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 5. MS (ES-): m/e= 439, patrón de cloro.

10 Ejemplo 9: Ácido 4-({2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metil-propionilamino}metil)-benzoico

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(i) [5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-il]-metanol

Se añadieron gota a gota 40 ml de una solución 1 M de borano en THF a temperatura ambiente a una solución de 5

15 g de ácido 5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-carboxílico en 130 ml de THF. A continuación, la mezcla de reacción se calentó hasta reflujo durante 10 h. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadieron cuidadosamente 20 ml de metanol. Los disolventes se retiraron bajo presión reducida y el residuo se disolvió en acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con ácido clorhídrico 1 M, solución saturada de cloruro sódico y solución saturada de hidrogenocarbonato sódico. Las capas orgánicas combinadas se secaron

20 sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El producto se obtuvo como un sólido blanco y se usó sin purificación adicional. Rendimiento: 4,6 g.

(ii) Éster etílico de ácido 2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metil-propiónico

Se añadieron 870 mg de hidruro sódico (60% en aceite mineral) a temperatura ambiente a una solución de 1,6 g de [5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-il]-metanol en 15 ml de DMF. Después de 15 min, se 25 añadieron 1,6 g de yoduro de tetrabutilamonio y 3,4 g de éster etílico de ácido 2-bromo-2-metil-propiónico y la mezcla de reacción se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. Después de la dilución con solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato sódico, la mezcla de reacción se filtró a través de un cartucho chem elut® eluyendo con acetato de etilo. Los disolventes se retiraron bajo presión reducida y el producto en bruto se purificó mediante

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cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de n-heptano/acetato de etilo. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y el disolvente se evaporó bajo presión reducida. Rendimiento: 1,3 g.

(iii) Ácido 2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metil-propiónico

Se añadió una solución de 130 mg de LiOH en 3 ml de agua a temperatura ambiente a una solución de 1,3 g de 2 éster etílico de ácido [5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metil-propiónico en 10 ml de THF. Después de 5 h, la mezcla se llevó hasta pH 2 mediante la adición de ácido clorhídrico 1 M. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y la capa acuosa se extrajo con diclorometano. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y los disolventes se retiraron bajo presión reducida. El producto en bruto aislado se usó en la siguiente etapa de reacción. Rendimiento: 1,5 g.

(iv) Ácido 4-({2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metil-propionilamino}-metil)benzoico

Se añadieron 360 mg de hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC), 345 mg de pentafluorofenol y 392 mg de NEM a una solución de 710 mg de ácido 2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metil-propiónico en 5 ml de DMF y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 353 mg de ácido 4-aminometil-benzoico y 540 mg de NEM en 5 ml de DMF. Después de 16 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua y se filtró a través de un cartucho chem elut® eluyendo con acetato de etilo. Los disolventes se retiraron bajo presión reducida y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (columna en fase inversa C18, elución con un gradiente de agua/MeCN con TFA al 0,1%). Las fracciones que contenían el producto se evaporaron y se liofilizaron para dar un sólido blanco. Rendimiento: 288 mg.

MS (ES-): m/e= 586, patrón de cloro.

Ejemplo 10: Ácido 4-({2-[1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-5-(4-trifluorometil-fenil)-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-2-metilpropionilamino}-metil)-benzoico

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Se añadieron gota a gota a lo largo de 15 min. 20 g de 1-(4-trifluorometil-fenil)-propan-1-ona en 51 ml de metilciclohexano a una solución de 118 ml de bis(trimetilsilil)amida de litio (hexametildisilazida de litio; 0,9 M en metilciclohexano) mientras se mantenía la mezcla de reacción a 15 -25°C. Después de agitar durante 2 h, se añadieron gota a gota a lo largo de 30 min. 15 ml de oxalato de dietilo y la mezcla de reacción se agitó durante 16 h. A continuación, el producto precipitado se recogió mediante filtración y se lavó con n-heptano. El producto en bruto aislado se usó en la siguiente etapa de reacción después de secar a vacío. Rendimiento: 19 g.

Una solución de 10 g de 3-etoxicarbonil-2-metil-3-oxo-1-(4-trifluorometil-fenil)-propan-1-olato de litio, 6,9 g de hidrocloruro de (2,4-dicloro-fenil)-hidracina y 74 ml de ácido sulfúrico (50%) en 184 ml de etanol se calentó hasta reflujo durante 7 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, los disolventes orgánicos se retiraron bajo presión reducida y el residuo se diluyó con 100 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y el disolvente se retiró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en 100 ml de THF y se añadió a temperatura ambiente una solución de 1,4 g de LiOH en 20 ml de agua. La mezcla de reacción se calentó hasta 60°C durante 7 h. A continuación, después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se acidificó hasta pH 1 mediante la adición de ácido clorhídrico semiconcentrado. El producto que precipitaba se recogió mediante filtración y se lavó con agua. El residuo se codestiló con diclorometano y dos veces con tolueno. El producto en bruto aislado se usó en la siguiente etapa de reacción. Rendimiento: 13 g.

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Ejemplo 17: Ácido 4-{2-[5-(4-cloro-fenil)-1-(2,4-dicloro-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-3-metil-butirilamino}benzoico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 16. MS (ES-): m/e= 584, patrón de cloro.

Ejemplo 18: Ácido 4-{2-[1-(4-cloro-fenil)-4-metil-5-(4-trifluorometil-fenil)-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-propionilamino}benzoico

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10 El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 16. MS (ES-): m/e= 556, patrón de cloro.

Ejemplo 19: Ácido 4-[2-(3-naftalen-2-il-1-fenil-1H-pirazol-4-ilmetoxi)-propionilamino]-benzoico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 16. MS (ES-): m/e= 590.

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Ejemplo 20: Ácido 4-{2-[1-(2-cloro-fenil)-4-metil-5-(4-trifluorometil-fenil)-1H-pirazol-3-ilmetoxi]-propionilamino}benzoico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 16. MS (ES-): m/e= 556, patrón de cloro.

Ejemplo 21: Ácido 4-[2-(3,5-dimetil-1-fenil-1H-pirazol-4-ilmetoxi)-propionilamino]-benzoico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 16. MS (ES-): m/e = 392. 10 Ejemplo 22: Ácido 4-[2-(1,3-difenil-1H-pirazol-4-ilmetoxi)-propionilamino]-benzoico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 16. MS (ES-): m/e = 440. Ejemplo 23: Ácido 4-{2-[1-bencil-3-(3-metoxi-fenil)-1H-pirazol-4-ilmetoxi]-propionilamino}-benzoico

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El compuesto del epígrafe se preparó análogamente a como se describe en el ejemplo 16. MS (ES-): m/e = 440.

Prueba farmacológica

La capacidad de los compuestos de la fórmula I para inhibir o unirse al receptor de LPA LPAR5 se puede valorar al determinar el efecto sobre la función celular. Esta capacidad de tales compuestos se evaluó en un ensayo de agregación de plaquetas tal como el método de Born usando cubetas individuales para mastocitos y microgliocitos con el ensayo del lector de placas con obtención fluorométrica de imágenes (FLIPR) de Molecular Devices Inc.

A) Ensayo de agregación para plaquetas (trombocitos) humanas

Se recogió sangre entera de voluntarios sanos usando 3 jeringas de 20 ml que contenían cada una 1/10 del volumen de citrato tamponado. La sangre entera anticoagulada se transfirió a tubos cónicos de polipropileno de 50 ml (30 ml por tubo). Los tubos se centrifugaron durante 10 minutos a 150 x g a temperatura ambiente sin usar el freno de la centrífuga. Este procedimiento da como resultado una fase inferior de componentes celulares y un sobrenadante (fase superior) de plasma rico en plaquetas (PRP). La fase de PRP se recogió de cada tubo y se reunió para cada donante. Para evitar el arrastre de componentes celulares después de la primera centrifugación, se dejaron en el tubo aproximadamente 5 ml de PRP. La concentración de plaquetas se determinó usando un contador ABX Micros

60. La fase de PRP se transfirió a un nuevo tubo de 50 ml. Después de 10 minutos de reposo a temperatura ambiente, se añadieron 1 µl de PGI2 (1 mM en Tris-HCl / pH 8,8) y 180 µl de ACD/A por ml de PRP. El PRP se transfirió a continuación a un nuevo tubo de 10 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 500 x g. Después de la centrifugación, es visible una pella celular en el fondo del tubo. El sobrenadante se descartó cuidadosamente y la pella celular, que consistía en plaquetas humanas, se disolvió a continuación en 10 ml de tampón T (composición del tampón T: NaCl 145 mM, KCI 5 mM, MgCl2 0,1 mM x 6 H2O, HEPES 15 mM, glucosa 5,5 mM, pH 7,4). Se determinó la concentración de plaquetas en esta solución y se añadió tampón T para obtener una concentración final de 3,5 X 105 plaquetas por ml.

Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió 1 µl de PGI2 por ml de solución de plaquetas y se distribuyó en nuevos tubos de 10 ml. Después de una etapa de centrifugación, 10 minutos a 500 x g, el sobrenadante se descartó y las plaquetas se resuspendieron en tampón T hasta una concentración final de 3,5 x 105 plaquetas por ml de tampón T. Antes de uso, el tampón que contenía plaquetas se equilibró durante 30 minutos a temperatura ambiente. El ensayo de agregación de plaquetas humanas se realizó en cubetas de un solo usó usando el Platelet Aggregation Profiler® (PAP-4 o -8E, BIO/DATA Corporation). Para un experimento individual, 320 µl de solución de plaquetas se transfirieron a una cubeta de ensayo, se añadieron 20 µl de solución de citrato cálcico (10 mM en H2O) y 20 µl de solución de fibrinógeno (20 mg/ml de H2O). El ensayo de agregación se realizó en la cubeta de ensayo a 37°C y con agitación a 1.200 rpm. Para determinar la EC50, ocho cubetas de ensayo se cargaron como se describe anteriormente con diferentes concentraciones de LPA. La agregación se midió a lo largo de 6 minutos a 37°C con agitación a 1.200 rpm (revoluciones por minuto). Los resultados del ensayo se expresan como % de activación, y se calculan usando la agregación máxima (Tmáx) o el área bajo la curva (AUC) de la absorbancia a lo largo de 6 minutos. El efecto inhibidor (IC50) de los compuestos de prueba se determinó como la reducción de la agregación máxima. Se añadió compuesto de prueba antes de empezar el experimento con un tiempo de incubación del compuesto de prueba de 5 minutos a 37°C con una agitación a 1.200 rpm. Los datos de IC50 del ensayo de agregación de plaquetas descrito anteriormente que usa plaquetas humanas lavadas para compuestos ejemplares de la presente invención se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo: IC50 (µM) Ejemplo IC50 (µM)

7: 4,7 12 4,3

8: 4,1 15 6,5

9: 2,9 17 15,9

B) Uso del ensayo del lector de placas con obtención fluorométrica de imágenes (FLIPR) para la determinación de la liberación de Ca2+ intracelular en la línea de mastocitos humanos HMC-1 y la línea de microgliocitos murinos BV-2

La capacidad de los compuestos de la fórmula I para inhibir o unirse al receptor de LPA LPAR5 se puede valorar al determinar la liberación de Ca2+ intracelular en células de ser humano o animal. Para el análisis del potencial de activación de LPA y los efectos inhibidores de compuestos de la fórmula I, se usaron dos líneas celulares con alta expresión de LPAR5, la línea de mastocitos humanos HMC-1 y la línea de microgliocitos murinos BV-2 (Figura 1 y 2). Para el ensayo de FLIPR que usa mastocitos humanos en un formato de 96 pocillos, las células en suspensión HMC-1 procedentes del matraz de cultivo se recogieron, se resuspendieron y se contaron. 14 x 106 células HMC-1 se transfirieron a un nuevo tubo de 50 ml, se centrifugaron durante 3 minutos a 540 x g. La pella celular resultante en

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