ES2609414T3 - Alteraciones genéticas en la citrato deshidrogenasa y otros genes en gliomas malignos - Google Patents

Abstract

Procedimiento de caracterización de un tumor de glioblatoma multiforme (GBM) en un sujeto humano, que comprende: analizar una muestra de ensayo de un tumor GBM obtenida a partir del sujeto humano para identificar la presencia o ausencia de una mutación somática en: * el codón 132 en la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1); o * el codón 172 en la isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2).

Description

Alteraciones genéticas en la citrato deshidrogenasa y otros genes en gliomas malignos

5 La presente solicitud se ha realizado con fondos del gobierno de los Estados Unidos. Por lo tanto, el gobierno de los Estados Unidos conserva ciertos derechos en la presente invención bajo los términos de las subvenciones NIH CA 43460, CA 57345, CA 62924, R01CA118822, NS20023-21, R37CA11898-34 y CA 121113.

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

10 La presente invención está relacionada con el área del diagnóstico, la predicción, la selección de fármacos y la terapéutica del cáncer. En particular, se refiere a tumores cerebrales en general y, en particular, al glioblastoma multiforme.

15 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los gliomas, el tipo más habitual de los tumores cerebrales primarios, se clasifican como de grado I a grado IV utilizando criterios histopatológicos y clínicos establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS)1. Este grupo de tumores incluye una serie de histologías específicas, la más habitual de las cuales son los astrocitomas,

20 oligodendrogliomas y ependimomas. Los gliomas de grado I, considerados a menudo como lesiones benignas, son curables generalmente con extirpación quirúrgica completa y rara vez, o nunca, evolucionan hacia lesiones de grado superior2. Sin embargo, los tumores de grados II y III son tumores malignos que crecen de forma invasiva, progresan a lesiones de grado superior, y tienen de forma correspondiente un pronóstico negativo. Los tumores de grado IV (glioblastoma multiforme, GBM) son la forma más invasiva y tienen un pronóstico muy negativo3,4. Utilizando criterios

25 histopatológicos, es imposible distinguir un GBM secundario, que se define como uno que se produce en un paciente diagnosticado anteriormente con un glioma de grado inferior, de un GBM primario que no tiene ningún antecedente tumoral conocido5, 6 .

Se conocen diversos genes que se alteran genéticamente en gliomas, entre los que se incluyen TP53, PTEN,

30 CDKN2A, y EGFR7-12. Estas alteraciones tienden a ocurrir en un orden definido en la progresión a tumores de grado elevado. La mutación en TP53 parece ser un evento relativamente temprano durante el desarrollo del astrocitoma, mientras que la pérdida o mutación de PTEN y la amplificación de EGFR son característicos de los tumores de grado superior6,13,14. En oligodendrogliomas, las pérdidas alélicas de 1p y 19q se producen en muchos tumores de grado II mientras que las pérdidas de 9p21 se limitan esencialmente a tumores de grado III15 .

35 El documento de Sjöblom T. y otros (“The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers”. Science (2006) 314 (5797): 268-74) describe el análisis de mutaciones somáticas en cáncer de mama y de colon. En el cáncer de colon, se identificó una mutación R132C de la IDH1. Sin embargo, este documento no se relaciona con tumores de glioblastoma multiforme (GBM).

40 Existe una necesidad continua en la técnica de identificar las causas, los identificadores y los remedios para glioblastomas y otros tumores cerebrales.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

45 Según un aspecto de la presente invención, se da a conocer un procedimiento de caracterización de un tumor de glioblastoma multiforme (GBM) en un sujeto humano. Se analiza una muestra de ensayo de un tumor GBM obtenida del sujeto humano para identificar la presencia o ausencia de una mutación somática en el codón 132 en la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) o en el codón 172 en la isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2).

50 También se describe, como un aspecto de la divulgación, un anticuerpo aislado que se une específicamente a R132H de la IDH1 o R132C de la IDH1 o R132S de la IDH1 o R132L de la IDH1 o R132G de la IDH1, pero no a R132 de la IDH1; o a R172M de la IDH2 o R172G de la IDH2 o R172K de la IDH2, pero no a R172; es decir, formas mutantes de la IDH1 o la IDH2 que se encuentran en GBM. También se da a conocer un anticuerpo aislado que se une

55 específicamente a R132 de la IDH1 o R172 de la IDH2, es decir, los sitios activos de tipo salvaje de la IDH1 o la IDH2.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de inmunización de un mamífero. Se administra a un mamífero un polipolipéptido de la IDH1 mutante que comprende, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína IDH1 humana o un polipolipéptido de la IDH2 mutante que comprende, como mínimo, 8

60 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína IDH2 humana que se encuentran en un tumor humano. Los, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos comprenden el residuo 132 de la IDH1 o el residuo 172 de la IDH2. El residuo 132 o el residuo 172 no es arginina. Se producen anticuerpos y/o células T que son inmunorreactivos con los epítopos que se encuentran en el polipéptido mutante de la IDH1 o la IDH2 pero que no se encuentran en las IDH1 o IDH2 normales.

También se da a conocer, como otro aspecto de la presente invención, un polipéptido mutante de la IDH1 o la IDH2 aislado que comprende, como mínimo 8, pero menos de 200 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína IDH1 o IDH2 humana que se encuentra en un tumor humano. Los, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos comprenden el residuo 132 de la IDH1 o el residuo 172 de la IDH2. Los residuos 132 ó 172 no son R. El residuo 132 no es C.

Un aspecto adicional de la presente invención es un polinucleótido aislado que comprende, como mínimo 18, pero menos de 600, residuos de nucleótidos contiguos de una secuencia codificante de una proteína IDH1 humana o IDH2 humana que se encuentran en un tumor humano. Los, como mínimo, 18 residuos de aminoácidos contiguos comprenden los nucleótidos 394 y/o 395 de la IDH1 o el nucleótido 515 de la IDH2. Los nucleótidos 394 y/o 395 de la IDH1 no son C y/o G, respectivamente. El residuo 515 de la IDH2 no es G.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de inmunización de un mamífero. Se administra a un mamífero un polipéptido de la IDH1 que comprende, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína IDH1 humana o un polipéptido de la IDH2 que comprende, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína IDH2 humana. Los, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos comprenden el residuo 132 de la IDH1 o el residuo 172 de la IDH2. El residuo 132 o el residuo 172 es arginina. Se producen anticuerpos y/o células T que son inmunorreactivos con los epítopos que se encuentran en el polipéptido de la IDH1

o de la IDH2.

También se da a conocer, como otro aspecto de la presente invención, un polipéptido de la IDH1 o la IDH2 que comprende, como mínimo 8, pero menos de 200, residuos de aminoácidos contiguos de una proteína IDH1 o IDH2 humana. Los, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos comprenden el residuo 132 de la IDH1 o el residuo 172 de la IDH2. Los residuos 132 ó 172 son R.

Aún otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de detección o diagnóstico de glioblastoma multiforme (GBM) o enfermedad mínima residual de GBM o recaída molecular de GBM en un ser humano. Se determina una mutación somática en un gen o su ARNm o proteína codificados en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano. El gen se selecciona entre el grupo que comprende los que se enumeran en la figura 10, tabla S7. El ser humano se identifica como probable que tenga glioblastoma multiforme, enfermedad residual mínima o recaída molecular de GBM cuando se determina la mutación somática.

Aún otro aspecto de la presente invención es un procedimiento de caracterización de un glioblastoma multiforme en un ser humano. Se determina una firma mutacional de un gen CAN de un glioblastoma multiforme mediante la determinación en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en, como mínimo, un gen o su ADNc o proteína codificados. El gen se selecciona entre el grupo que comprende los que se enumeran en la figura 10, tabla S7. El glioblastoma multiforme se asigna a un primer grupo de tumores de glioblastoma multiforme que tienen la firma mutacional del gen CAN.

Otro procedimiento dado a conocer por la divulgación es para la caracterización de un tumor de glioblastoma multiforme en un ser humano. Se identifica una ruta mutada seleccionada entre el grupo que comprende TP53, RB1 y PI3K/PTEN en un tumor glioblastoma multiforme mediante la determinación de, como mínimo, una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano. La, como mínimo, una mutación somática está en uno o más genes seleccionados entre el grupo que comprende TP53, MDM2, MDM4, RB1, CDK4, CDKN2A, PTEN, PIK3CA, PIK3R1 e IRS1. El glioblastoma multiforme se asigna a un primer grupo de tumores de glioblastoma multiforme que tienen una mutación en una de dichas rutas. El primer grupo es heterogéneo con respecto a los genes en la ruta que tienen una mutación somática y homogéneo con respecto a la ruta que tiene una mutación somática.

También se da a conocer un procedimiento para detectar o diagnosticar el glioblastoma multiforme o la enfermedad mínima residual de GBM o la recaída molecular de GBM en un ser humano. La expresión se determina en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S5 o S9 (cerebro que sobreexpresa genes de SAGE). La expresión de los uno o más genes en la muestra clínica se compara con la expresión de los uno o más genes en una muestra correspondiente de un ser humano de control o grupo de control de seres humanos. Se identifica una muestra clínica con expresión elevada respecto a un control como probable que tenga glioblastoma multiforme o enfermedad residual mínima de GBM o recaída molecular de GBM en un ser humano.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para controlar la carga de glioblastoma multiforme. Se determina la expresión en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S5 o S9 (cerebro que sobreexpresa genes de SAGE). La etapa de determinación se repite una o más veces. Se identifica un nivel de expresión aumentado, disminuido o estable con el tiempo.

Aún otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para controlar la carga de glioblastoma multiforme. Se determina una mutación somática en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S7. La etapa de determinación se repite una o más veces. Se identifica un nivel aumentado, disminuido o estable de dicha mutación somática con el tiempo.

Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar o diagnosticar glioblastoma multiforme. Se determina la expresión, en una muestra clínica, de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S6 (eliminaciones homocigóticas). La expresión de los uno o más genes en la muestra clínica se compara con la expresión de los uno o más genes en una muestra correspondiente de un ser humano de control o grupo de control de seres humanos. Se identifica una muestra clínica con una expresión reducida respecto a un control como probable que tenga glioblastoma multiforme.

Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento para controlar la carga de glioblastoma multiforme. Se determina la expresión en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S6 (eliminaciones homocigóticas). La etapa de determinación se repite una o más veces. Se identifica un nivel de expresión aumentado, disminuido o estable con el tiempo.

Estas y otras realizaciones, que resultarán evidentes para los técnicos en la materia al leer la memoria descriptiva, dan a conocer a la técnica nuevas herramientas para el análisis, la detección, la estratificación y el tratamiento de GBM.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Alteraciones de la secuencia en IDH1. Ejemplos representativos de mutaciones somáticas en el codón 132 del gen IDH1. El cromatograma de secuencia superior se obtuvo a partir del análisis de ADN a partir de tejido normal, mientras que los cromatogramas inferiores se obtuvieron de las muestras de GBM indicadas. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones de sentido erróneo heterocigóticas recurrentes C394A (en tumor Br104X) y G395A (en tumor Br129X) que dan como resultado los cambios de aminoácidos indicados.

Figura 2. Estructura del sitio activo de IDH1. La estructura cristalina de la IDH humana citosólica dependiente de NADP(+) se muestra en forma de cinta (PDBID: 1T0L) (42). La hendidura activa de la IDH1 comprende un sitio de unión de NADP y el sitio de unión de iones isocitrato-metal. El oxígeno del carboxilato alfa y el grupo hidroxilo del isocitrato quelan el ion Ca2+. La NADP se colorea de naranja, isocitrato de violeta y el Ca2+ de azul. El residuo Arg132, que se muestra en amarillo, forma interacciones hidrófilas, que se muestran en rojo, con el carboxilato alfa del isocitrato.

Figura 3. Supervivencia global entre los pacientes mayores de 45 años de edad según el estado de mutación de la IDH1. La proporción de riesgo de muerte entre los pacientes con la IDH1 mutada, en comparación con aquellos con la IDH1 de tipo salvaje, fue de 0,19 (intervalo de confianza del 95 por ciento, 0,08 a 0,49; P <0,001). La mediana de supervivencia fue de 3,8 años para los pacientes con la IDH1 mutada, en comparación con 1,5 años para los pacientes con la IDH1 de tipo salvaje.

Figura 4A-4B. Mutaciones de la IDH1 y la IDH2 en gliomas humanos. Figura 4A. Diagrama esquemático de las mutaciones en el codón R132 en la IDH1 (abajo) y R172 en la IDH2 (arriba) identificados en los gliomas humanos. Se muestran los codones 130 a 134 de la IDH1 y 170 a 174 de la IDH2. El número de pacientes con cada mutación

(n) aparece en la parte derecha de la figura. Figura 4B. Número y frecuencia de las mutaciones de la IDH1 y la IDH2 en gliomas humanos y otros tipos de tumores. Los cánceres fuera del SNC incluyen 35 cánceres de pulmón, 57 cánceres gástricos, 27 cánceres de ovario, 96 cánceres de mama, 114 cánceres colorrectales, 95 cánceres de páncreas, siete cánceres de próstata, así como muestras de sangre periférica de 4 leucemias mielógenas crónicas, 7 leucemias linfocíticas crónicas, siete leucemias linfoblásticas agudas y 45 leucemias mielógenas agudas.

Figuras 5A-5B. La supervivencia para los pacientes con gliomas malignos según el estado de mutación de la IDH1 y la IDH2. Para los pacientes con astrocitomas anaplásicos (figura 5A), la mediana de supervivencia fue de 65 meses para los pacientes con la IDH1 o la IDH2 mutada, en comparación con 19 meses para los pacientes con la IDH1 y la IDH2 de tipo salvaje. Para los pacientes con GBM (figura 5B), la mediana de supervivencia fue de 39 meses para los pacientes con la IDH1 o la IDH2 mutada, en comparación con 13,5 meses para los pacientes con la IDH1 y la IDH2 de tipo salvaje.

Figura 6. Modelo de desarrollo de glioma maligno. Para cada tipo de tumor se indican las alteraciones genéticas comunes (mutación de IDH1/IDH2, mutación de TP53, pérdida de 1p 19q y pérdida de CDKN2A). Las frecuencias detalladas de las alteraciones genéticas están contenidas en la tabla 1 y 2 o en la referencia1. En general, los tumores de la derecha adquieren alteraciones del IDH, mientras que los de la izquierda no lo hacen.

Figura 7. Alteraciones de la secuencia en la IDH1 y la IDH2. Los ejemplos representativos de mutaciones somáticas en el codón 132 del gen de IDH1 (arriba) y del codón 172 del gen de IDH2 (parte inferior). En cada caso, el cromatograma de la secuencia de la parte superior se obtuvo a partir del análisis de ADN a partir del tejido normal, mientras que los cromatogramas inferiores se obtuvieron de las muestras del tumor indicado. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones de sentido erróneo y que dan como resultado cambios de aminoácidos en la IDH1 en el tumor TB2604 (astrocitoma anaplásico), 640 (astrocitoma anaplásico) y 1088 (oligodendroglioma anaplásico), y en la IDH2 en el tumor H883 (astrocitoma anaplásico) y H476 (anaplásico oligodendroglioma).

Figura 8. Alteraciones de secuencia en la IDH1 en gliomas progresivos. Los ejemplos representativos de mutaciones somáticas en el codón 132 de la IDH1 se indican en tres casos representativos. El cromatograma de la secuencia superior se obtuvo a partir del análisis de ADN a partir de tejido normal, mientras que los cromatogramas inferiores se obtuvieron a partir de las muestras de tumor cerebral indicado. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones y los cambios resultantes de aminoácidos en la IDH1. En todos los casos, se encontraron mutaciones idénticas de la IDH1 en los tumores de grado inferior y superior de cada paciente.

Figuras 9A-9B. Distribución por edades de los pacientes de glioma con IDH de tipo salvaje y mutada. Distribución por edades de oligodendroglioma (O), oligodendroglioma anaplásico (AO), astrocitoma difuso (DA), astrocitoma anaplásico (AA) y glioblastoma multiforme (GBM) en pacientes con genes de IDH de tipo salvaje (figura 9A) o genes de IDH mutados (figura 9B).

Figura 10. Compendio de tablas S3-S10. Tabla S3 (mutaciones somáticas identificadas en el cribado de detección de GBM). Tabla S4 (mutaciones somáticas en el cribado de prevalencia), tabla S5 (genes amplificados), tabla S6 (genes homocigóticos eliminados), tabla S7 (mejores genes candidatos CAN), tabla S8 (conjuntos de genes candidatos que se enriquecen de alteraciones genéticas en GBM), tabla S9 (genes sobreexpresados en SAGE) y tabla S10 (subconjunto extracelular de genes sobreexpresados en SAGE).

Figura 11. Resumen de las características genéticas y clínicas de los tumores cerebrales.

Figura 12. Evaluación de la frecuencia de las alteraciones genéticas comunes en gliomas con IDH1/IDH2 mutadas y de tipo salvaje.

Un listado de secuencias es parte de la presente solicitud.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un análisis de todo el genoma de GBM, se identificaron mutaciones somáticas del codón 132 del gen de la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) en, aproximadamente, el 12% de los GBM analizados16. Estas mutaciones se encontraron en una frecuencia más elevada en GBM secundarios (5 de 6 pacientes evaluados). Una interpretación de estos datos es que las mutaciones de la IDH1 se producen en un subconjunto de gliomas de grado inferior, llevándolos a progresar a GBM. Para evaluar esta posibilidad, se ha analizado un gran número de gliomas de varios tipos. Sorprendentemente, se han encontrado mutaciones de la IDH1 en la mayoría de los gliomas malignos tempranos. Además, muchos de los gliomas sin mutaciones de la IDH1 tenían mutaciones análogas en el gen de la IDH2 estrechamente relacionado. Estos resultados sugieren que las mutaciones de la IDH desempeñan un papel temprano y esencial en el desarrollo de glioma maligno.

Las mutaciones somáticas son mutaciones que se producen en un clon particular de células somáticas durante la vida del organismo individual. De este modo, la mutación no se hereda ni será traspasada. La mutación aparecerá como una diferencia respecto a las otras células, tejidos y órganos. Cuando se evalúa una mutación somática en un tejido cerebral que se sospecha que es canceroso, se puede hacer una comparación con el tejido cerebral normal, que parece ser no neoplásico, o con una muestra no cerebral, tal como células de la sangre, o con una muestra de un sujeto no afectado.

El aminoácido habitual en el codón 132 de la IDH1 y el codón 172 de la IDH2 en los tejidos sanos es arginina (R). Se han encontrado codones mutantes con sustituciones de histidina (H), serina (S) cisteína (C), leucina (L) y glicina (G) del codón 132 de la IDH1 y de metionina (M), lisina (K) y glicina (G) del codón 172 de la IDH2. Las mutaciones en el codón 132 y el codón 172 se pueden detectar utilizando cualquier medio conocido en la técnica, entre los que se incluyen los niveles de ADN, ARNm o de proteína. Se pueden utilizar anticuerpos que se unen específicamente a la forma arginina-132 de la enzima, la forma histidina-132 de la enzima, la forma serina-132 de la enzima, la forma leucina-132 de la enzima, la forma glicina-132 de la enzima o la forma cisteína-132 de la enzima en ensayos para la detección de mutaciones. De la misma manera, se pueden utilizar anticuerpos que se unen específicamente a las formas arginina-172, metionina-172, lisina-172, o glicina-172 de la IDH2 en ensayos para la detección de mutaciones. Del mismo modo, se pueden utilizar sondas que contienen codones para estos residuos de aminoácidos en el contexto de la secuencia codificante de la IDH1 o la IDH2 para detectar el gen o el ARNm de las diferentes formas. Se pueden utilizar también cebadores que contienen la totalidad o parte de estos codones para la amplificación o extensión específica de alelo. Los cebadores que se hibridan con regiones que rodean estos codones se pueden utilizar para amplificar los codones, seguido por el posterior análisis de la región amplificada que contiene el codón 132 de la IDH1 o el codón 172 de la IDH2.

De forma interesante, se ha descubierto que las mutaciones del codón 132 de la IDH1 y las mutaciones del codón 172 de la IDH2 están fuertemente asociadas con GBM secundarios y con un pronóstico favorable. Se pueden evaluar fármacos contra grupos de pacientes de glioblastoma que se estratifican en relación con el 132º residuo de aminoácido de la IDH1 y/o el 172º residuo de aminoácido de la IDH2. Los grupos pueden comprender el tipo salvaje (arginina) y variantes (combinadas) o variantes (cada una por separado). La sensibilidad a los fármacos puede ser determinada para cada grupo para identificar fármacos que serán o no serán eficaces en relación con una mutación

en particular o con el tipo salvaje (arginina). Tanto la sensibilidad como la información de la resistencia son útiles para guiar las decisiones de tratamiento.

Una vez que una mutación del codón 132 ó 172 se identifica en un tumor, los inhibidores de la IDH1 o la IDH2 se pueden utilizar terapéuticamente. Estos inhibidores pueden ser específicos para una mutación en el tumor o pueden ser simplemente un inhibidor de la IDH1 o la IDH2. Se pueden utilizar inhibidores de tipo moléculas pequeñas así como anticuerpos y derivados de anticuerpos. Entre estos anticuerpos se incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos scFv y otras construcciones que comprenden uno o más fragmentos de anticuerpos Fv. Los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, humanizados, humanos o quiméricos. Los anticuerpos pueden estar armados o desarmados. Los anticuerpos armados se pueden conjugar con toxinas o restos radiactivos, por ejemplo. Los anticuerpos desarmados pueden funcionar uniéndose a las células tumorales y participar en los procesos inmunológicos del huésped, tales como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos se unen preferentemente a las IDH1 o IDH2 mutantes frente a las de tipo salvaje, se unen específicamente a las IDH1 o IDH2 mutantes frente a las de tipo salvaje, o se unen por igual tanto a las IDH1 o IDH2 mutantes como a las de tipo salvaje. Preferentemente, los anticuerpos se unirán a un epítopo en el sitio activo que puede incluir el codón 132 o el codón 172. Los epítopos pueden ser continuos o discontinuos a lo largo de la secuencia primaria de la proteína. Los inhibidores pueden incluir isocitrato de alfa-metilo, iones de aluminio u oxalomalato. Pueden utilizarse otros inhibidores y, opcionalmente, identificarse, utilizando ensayos enzimáticos conocidos en la técnica, entre los que se incluyen ensayos espectrofotométricos (Kornberg, A., 1955) y ensayos bioluminiscentes (Raunio, R. y otros, 1985). Como alternativa, los inhibidores se pueden identificar mediante ensayos de unión, por ejemplo, en ensayos de unión in vitro o in vivo. También se pueden utilizar como inhibidores los péptidos y proteínas que se unen a la IDH1 o la IDH2.

Se pueden utilizar moléculas de ARN inhibidoras para inhibir la expresión. Estas pueden ser, por ejemplo, ARNsi, microARN u oligonucleótidos o construcciones antisentido. Éstos se pueden utilizar para inhibir la expresión de la IDH1 o la IDH2, según sea apropiado en un ser humano.

La eficacia terapéutica potencial se puede evaluar para un anticuerpo, polinucleótido, proteína, molécula pequeña o anticuerpo mediante el contacto con células, tejidos, animales enteros o proteínas. Las indicaciones de eficacia incluyen la modulación de la actividad enzimática, la inhibición de crecimiento de células cancerosas, la prolongación de la esperanza de vida, la inhibición de la proliferación celular del cáncer, la estimulación de la apoptosis de células de cáncer y la inhibición o el retraso del crecimiento del tumor. Se puede utilizar cualquier ensayo conocido en la técnica, sin limitación. Se pueden evaluar también combinaciones de candidatos y combinaciones de los candidatos con agentes conocidos. Entre los agentes conocidos se pueden incluir, por ejemplo, agentes anticancerígenos quimioterapéuticos, agentes anticancerígenos biológicos, tales como anticuerpos y hormonas, radiación.

Con el fin de generar o aumentar una respuesta inmunitaria a un glioblastoma en una persona o un mamífero con un tumor, en una persona con riesgo de desarrollar un tumor o en un sujeto aparentemente sano, se puede administrar un polipéptido a la persona o mamífero. El polipéptido comprenderá habitualmente, como mínimo, 6, como mínimo, 8, como mínimo, 10, como mínimo, 12, o, como mínimo, 14 residuos de aminoácidos contiguos de la proteína IDH1 humana que incluye el residuo 132 o la IDH2 que incluye el residuo 172. De forma habitual, pero no siempre, el polipéptido contendrá un residuo diferente de arginina en el residuo 132 de IDH1 o el residuo 172 o de IDH2. En la situación en la que la persona o el mamífero ya tienen un tumor, el aminoácido en el residuo 132 se puede ajustar al residuo en el tumor. El polipéptido puede comprender la totalidad de IDH1, pero puede comprender menos de 200, menos de 150, menos de 100, menos de 50, menos de 30 residuos de aminoácidos. Aunque los solicitantes no desean quedar limitados por ningún mecanismo de acción, la inmunización mediante un polipéptido puede actuar a través de una respuesta de anticuerpo y/o células T. Los polipéptidos se pueden administrar con adyuvantes inmunes o conjugarse con fragmentos que estimulan una respuesta inmunitaria. Estos son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar según sea apropiado.

Los anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo en la IDH1 o la IDH2 lo hacen con una mayor avidez o una tasa de asociación más elevada que cuando se unen a otras proteínas. Preferentemente, la avidez o la tasa de asociación más elevada es, como mínimo, aproximadamente 2 veces, 5 veces, 7 veces o 10 veces en relación a otras proteínas que no contienen el epítopo.

Se puede utilizar un polinucleótido aislado para codificar y administrar el polipéptido para la inmunización. El polinucleótido se puede utilizar para fabricar el polipéptido en una célula huésped en un cultivo, o se puede utilizar en un contexto de terapia génica para aumentar una respuesta inmune in vivo después de la expresión en el receptor de la vacuna. Los polinucleótidos se pueden utilizar también como cebadores o sondas, que pueden estar marcados o no con un marcador detectable. Los cebadores se pueden utilizar para la extensión con cebador, por ejemplo, utilizando un cebador que es complementario a los nucleótidos adyacentes, pero que no incluye los nt 394

o nt 395 de la IDH1 o el nucleótido 515 de la IDH2. Los productos se pueden detectar y distinguir utilizando nucleótidos marcados como reactivos. Se pueden utilizar diferentes marcadores en diferentes nucleótidos, de modo que la identidad del analito se puede determinar fácilmente. Habitualmente, el polinucleótido para su utilización como un cebador o sonda comprenderá, como mínimo, 10, como mínimo, 12, como mínimo, 14, como mínimo, 16, como mínimo, 18, como mínimo, 20 nucleótidos contiguos de la secuencia codificante de la IDH1 o la IDH2.

Habitualmente, el polinucleótido comprenderá menos de 600, menos de 500, menos de 400, menos de 300, menos de 200, menos de 100 nucleótidos de la secuencia codificante de la IDH1 o la IDH2.

Los datos de los presentes inventores identifican a la IDH1 como una diana importante de la alteración genética en los pacientes con GBM. Todas las mutaciones en este gen dan como resultado sustituciones de aminoácidos en la posición 132, un residuo conservado evolutivamente situado dentro del sitio de unión de isocitrato (42). Además, la única mutación que se ha notificado anteriormente de la IDH1 era otra mutación de sentido erróneo que afectaba a este mismo residuo en un paciente de cáncer colorrectal (10). El efecto funcional de estas mutaciones de la IDH1 no está claro. La naturaleza recurrente de las mutaciones es una reminiscencia de alteraciones de activación en otros oncogenes, tales como BRAF, KRAS y PIK3CA. La predicción de que esta mutación sería activante se ve reforzada por la falta de cambios de inactivación observados (es decir, mutaciones de desplazamiento del marco de lectura o de detección, alteraciones del sitio de empalme), la falta de alteraciones en otros residuos clave del sitio activo y por el hecho de que todas las mutaciones observadas hasta la fecha han sido heterocigóticas (sin ninguna evidencia de la pérdida del segundo alelo a través LOH). Curiosamente, los estudios enzimáticos han demostrado que la sustitución de arginina en el residuo 132 con glutamato da como resultado una enzima catalíticamente inactiva, lo que sugiere que este residuo juega un papel crítico en la actividad de la IDH1 (46). Sin embargo, la naturaleza de las sustituciones observadas en GBM es cualitativamente diferente, con arginina cambiada a histidina o serina. La histidina forma interacciones de enlaces de hidrógeno con carboxilato como parte de la actividad catalítica de muchas enzimas (47) y podría cumplir una función análoga a la interacción conocida de la Arg132 y el carboxilato α del isocitrato. Es concebible que las alteraciones R132H puedan conducir a una mayor actividad catalítica en general. Se esperaría que el aumento de la actividad de la IDH1 diera lugar a mayores niveles de NADPH, proporcionando defensas celulares adicionales contra las especies reactivas de oxígeno, impidiendo la apoptosis y aumentando la supervivencia celular y el crecimiento tumoral. Se necesitan más análisis bioquímicos y moleculares para determinar el efecto de las alteraciones de la IDH1 sobre la actividad enzimática y los fenotipos celulares.

Independientemente de las consecuencias moleculares específicas de las alteraciones de la IDH1 y la IDH2, resulta claro que la detección de mutaciones en la IDH1 y la IDH2 será clínicamente útil. Aunque un esfuerzo importante se ha centrado en la identificación de lesiones genéticas características en GBM primarios y secundarios, los genes alterados identificados hasta la fecha están lejos de ser ideales para este propósito. Por ejemplo, en la comparación de GBM primarios frente a secundarios, TP53 está mutado en, aproximadamente, el 30% frente al 65%, respectivamente, la amplificación de EGFR está presente en, aproximadamente, el 35% frente al 5 -10% y la mutación de PTEN está presente en, aproximadamente, el 25% frente a, aproximadamente, el 5% (5). El estudio de los presentes inventores reveló que la mutación de la IDH1 es un marcador nuevo y significativamente más específico para GBM secundario, teniendo 5 de la 6 (83%) muestras de GBM secundarios analizados una mutación en este gen, mientras que sólo 7 de 99 (7%) pacientes de GBM primarios tienen estas alteraciones (P <0,001, examen binomial). La única muestra de paciente con GBM secundario que no tenía una mutación de la IDH1 era tanto genética como clínicamente inusual, albergando mutaciones de PTEN pero no de TP53, y que se produjo en un paciente de edad avanzada (edad 56 años) con un diagnóstico anterior de ganglioglioma (que se conoce que rara vez experimenta la transformación maligna) (48). Es posible que este paciente tuviera dos tumores del SNC distintos que estaban completamente no relacionados y que el GBM en este caso fuera en realidad un tumor primario.

Una hipótesis intrigante es que las alteraciones de la IDH1 identifican un subgrupo biológicamente específico de pacientes de GBM, que incluye tanto a pacientes que serían clasificados como GBM secundarios, así como una subpoblación de pacientes con GBM primario con una biología del tumor similar y una evaluación clínica más prolongada (tabla 4). Curiosamente, los pacientes con mutaciones de la IDH1 tenían una frecuencia muy elevada de mutación de TP53 y una frecuencia muy baja de mutaciones en otros genes alterados habitualmente por GBM. Por ejemplo, dichos pacientes tenían mutación de TP53 sin ninguna mutación detectada de EGFR, PTEN, RB1, o NF1 en el 83% de los casos (10 de 12 pacientes); en contraste, sólo el 12% de los pacientes con la IDH1 de tipo salvaje (11 de 93) tenía el mismo patrón de mutaciones (figura 12) (P <0,001, examen binomial). Además de esta relativa uniformidad genética, los pacientes con la IDH1 mutada tenían características clínicas distintas, incluyendo una edad más joven y un pronóstico clínico significativamente mejorado (tabla 4), incluso después de ajustar por la edad y el estado de la mutación de TP53 (que ambos están asociados con una supervivencia mejorada). Tal vez lo más sorprendente, todos compartían la mutación de un único residuo de aminoácido de la IDH1, una proteína que antes no tenía vínculo genético con GBM u otros tipos de cáncer. Este resultado imprevisto claramente valida la utilidad del cribado de todo el genoma para alteraciones genéticas en el estudio de los cánceres humanos.

Las mutaciones que se han encontrado en los tumores de GBM se muestran en la figura 10, tabla S7. Estas mutaciones se pueden detectar en muestras de ensayo, tales como muestras sospechosas de tejido tumoral, sangre, LCR, orina, saliva, linfa, etc. Una mutación somática se determina habitualmente mediante la comparación de una secuencia en la muestra de ensayo con una secuencia en una muestra de control normal, tal como de tejido cerebral sano. Se pueden utilizar para este propósito una o más mutaciones. Si el paciente ha sido sometido a cirugía, se puede utilizar la detección de la mutación en el margen del tumor o en el tejido restante para detectar la enfermedad mínima residual o la recaída molecular. Si el GBM ha sido diagnosticado anteriormente, la mutación puede servir para ayudar al diagnóstico, por ejemplo, en conjunción con otros hallazgos físicos o resultados de laboratorio, entre los que se incluyen, sin que constituyan limitación, descubrimientos de marcadores bioquímicos y radiológicos.

Las firmas de genes CAN pueden ser determinadas con el fin de caracterizar un GBM. Una firma es un conjunto de una o más mutaciones somáticas en un gen CAN. Los genes CAN de GBM se enumeran en la figura 10, tabla S7. Una vez que esta firma ha sido determinada, un GBM puede ser asignado a un grupo de GBM que comparten la firma. El grupo se puede utilizar para asignar un pronóstico, para asignar a un grupo de ensayos clínicos, para asignar un régimen de tratamiento y/o para asignar para su posterior caracterización y estudio. En un grupo de ensayo clínico, los fármacos se pueden evaluar para su capacidad de afectar de forma diferencial a GBM con y sin la firma. Una vez que se determina un efecto diferencial, la firma se puede utilizar para asignar a los pacientes a regímenes de fármacos o para evitar el tratamiento innecesario de pacientes en los que el fármaco no tendrá un efecto beneficioso. En un ensayo clínico, el fármaco puede ser uno que se conozca anteriormente para otro propósito, conocido anteriormente para el tratamiento del GBM, o desconocido anteriormente como agente terapéutico. Una firma de gen CAN puede comprender, como mínimo, 1, como mínimo, 2, como mínimo, 3, como mínimo, 4, como mínimo, 5, como mínimo, 6, como mínimo, 7, como mínimo, 8, como mínimo, 9, como mínimo, 10 genes. El número de genes o mutaciones en una firma particular puede variar dependiendo de la identidad de los genes CAN en la firma. Se pueden utilizar análisis estadísticos estándar para lograr la sensibilidad y especificidad deseadas de una firma genética CAN.

El análisis de los genes mutados en los tumores GBM analizados ha revelado la implicación interesante de las rutas. Ciertas rutas llevan con frecuencia mutaciones en GBM. Una mutación de un solo gen parece excluir la presencia de una mutación en otro gen en esa ruta en un tumor particular. Las rutas mutadas frecuentemente en GBM son las rutas TP53, RB1, PI3K/PTEN. Las rutas pueden ser definidas utilizando cualquiera de las bases de datos de referencia estándar, como la base de datos MetaCore de ontología de genes (GO), base de datos de mapas de rutas genéticas canónicas MetaCore (MA), la base de datos MetaCore GeneGo (GG) y las bases de datos de Panther, TRMP, KEGG y SPAD. Los grupos pueden estar formados sobre la base de la presencia o ausencia de una mutación en una determinada ruta. Estos grupos serán heterogéneos con respecto al gen mutado, pero homogéneos con respecto a la ruta mutada. Al igual que con las firmas de genes CAN, estos grupos se pueden utilizar para caracterizar un GBM. Una vez que se ha determinado una mutación en una ruta, un GBM puede ser asignado a un grupo de GBM que comparten la ruta mutada. El grupo se puede utilizar para asignar un pronóstico, para asignar a un grupo de ensayos clínicos, para asignar un régimen de tratamiento y/o para asignar para su posterior caracterización y estudio. En un grupo de ensayo clínico, los fármacos se pueden evaluar para su capacidad de afectar diferencialmente al GBM con y sin la ruta mutada. Una vez que se determina un efecto diferencial, la ruta se puede utilizar para asignar a los pacientes a regímenes de fármacos o para evitar el tratamiento innecesario de pacientes en los que el fármaco no tendrá un efecto beneficioso. En un ensayo clínico, el fármaco puede ser uno que se conozca anteriormente para otro propósito, conocido anteriormente para el tratamiento del GBM, o desconocido anteriormente como agente terapéutico. Entre los genes en las rutas que se pueden encontrar mutantes son: TP53, MDM2, MDM4, RB1, CDK4, CDKN2A, PTEN, PIK3CA, PIK3RI y IRS 1. Esta lista no es necesariamente exhaustiva.

Los niveles de expresión se pueden determinar y la sobreexpresión puede ser indicativa de un nuevo tumor GBM, recaída molecular o de la enfermedad residual mínima de GBM. La expresión muy aumentada que se encuentra en los tumores de GBM se muestra en la figura 10, tabla S5 y en la figura 10, tabla S9. Estos genes sobreexpresados se pueden detectar en muestras de ensayo, tales como muestras sospechosas de tejido tumoral, sangre, LCR, orina, saliva, linfa, etc. La expresión elevada se determina habitualmente mediante la comparación de la expresión de un gen en la muestra de ensayo a la expresión de un gen en una muestra control normal, tal como de tejido cerebral sano. La expresión elevada de uno o más genes se puede utilizar para este propósito. Si el paciente ha sido sometido a cirugía, se puede utilizar la detección de la expresión elevada en el margen del tumor o tejido restante para detectar la enfermedad mínima residual o recaída molecular. Si el GBM ha sido diagnosticado anteriormente, la expresión elevada puede servir para ayudar a diagnosticar, por ejemplo, en conjunción con otros hallazgos físicos o resultados de laboratorio, entre los que se incluyen, sin que constituyan limitación, los marcadores bioquímicos y hallazgos radiológicos. A estos efectos, se pueden utilizar cualquier medio conocido en la técnica para la cuantificación de la expresión, entre los que se incluyen SAGE o micromatrices para la detección de ARNm elevado y anticuerpos utilizados en diversos formatos de ensayo para la detección de la expresión elevada de proteínas. Para la detección de la expresión de proteínas, son particularmente útiles los genes enumerados en la figura 10, tabla S10.

La carga tumoral se puede controlar utilizando las mutaciones enumeradas en la figura 10, tabla S7. Esto se puede utilizar en un modo de espera vigilante o, por ejemplo, durante la terapia para controlar la eficacia. La utilización de una mutación somática como un marcador y el ensayo de nivel detectable de ADN, ARNm o proteína en el tiempo, puede indicar carga tumoral. El nivel de la mutación en una muestra puede aumentar, disminuir o permanecer estable durante el momento del análisis. Los tratamientos terapéuticos y su cadencia pueden ser guiados por este control.

El análisis de los GBM reveló ciertos genes que se eliminan de forma homocigótica. Éstos se enumeran en la figura 10, tabla S6. La determinación de la pérdida de expresión de uno o más de estos genes puede utilizarse como un marcador de GBM. Esto puede realizarse en una muestra de sangre o de ganglio linfático o en una muestra de tejido cerebral. Se puede evaluar la expresión de uno o más de estos genes. Pueden utilizarse técnicas tales como ELISA

o IHC para detectar la disminución o pérdida de la expresión de proteínas en una muestra. Del mismo modo, los

genes eliminados de forma homocigótica que se enumeran en la figura 10, tabla S6 se puede utilizar para controlar la carga tumoral en el tiempo. La expresión puede controlarse repetidamente, de manera que puede determinarse un aumento, disminución o nivel estable de expresión.

Los datos resultantes de este análisis integrado de mutaciones y alteraciones en el número de copias han proporcionado una nueva visión del paisaje genético de los glioblastomas. La combinación de diferentes tipos de datos genéticos, entre los que se incluyen mutaciones puntuales, amplificaciones y eliminaciones, permite la identificación de genes CAN individuales, así como grupos de genes que pueden estar afectados preferentemente en las rutas y procesos celulares complejos en los GBM. La identificación de prácticamente todos los genes de los que se ha demostrado anteriormente que están afectados en los GBM por mutación, amplificación o eliminación valida el enfoque genómico amplio que se ha utilizado.

Cabe señalar, sin embargo, que el enfoque de los presentes inventores, al igual que todos los estudios de genoma completo, tiene sus limitaciones. En primer lugar no se evaluaron translocaciones cromosómicas, que es un tipo de alteración genética que podría desempeñar un papel importante en la tumorigénesis. Sin embargo, sólo raras veces se han reportado observaciones de translocaciones cromosómicas recurrentes en los estudios citogenéticos de GBM. Tampoco se evaluaron las alteraciones epigenéticas, aunque los estudios de los presentes inventores de expresión a gran escala deberían haber identificado los genes que se expresan de forma diferencial a través de este mecanismo (figura 10, tabla S9). Además, para los cambios de número de copias se han centrado en las regiones que verdaderamente se amplificaron o suprimieron de forma homocigótica ya que estas han sido históricamente las más útiles en la identificación de los genes del cáncer. La matriz de datos SNP que se ha generado para estas muestras, sin embargo, contiene información que puede ser analizada para determinar la pérdida de heterocigocidad (LOH, loss of heterozygosity) o pequeñas ganancias de número de copias debido a duplicaciones en lugar de verdaderos eventos de amplificación. El análisis de dichos datos para los genes del cáncer conocidos, tales como CDKN2A o NF1, identificaron tumores adicionales que tenían LOH en estas regiones, pero dada la fracción sustancial del genoma que se somete a LOH en GBM, no es probable que estas observaciones, en general, puedan ser útiles para identificar nuevos genes candidato del cáncer. Por último, los tumores primarios utilizados en el análisis de los presentes inventores contenían pequeñas cantidades de contaminación de tejidos normales, como es la norma para este tipo de muestra, lo que limita la capacidad de los mismos para detectar eliminaciones homocigóticas y en menor medida, mutaciones somáticas, en aquellos tumores específicos. Esto fue así a pesar de que se han seleccionado cuidadosamente estos tumores para que contuvieran un componente del estroma mínimo, por criterios histológicos y moleculares biológicos. Esta observación sirve como un importante recordatorio del valor de xenoinjertos y líneas celulares de paso temprano para estos estudios genómicos a gran escala.

A pesar de estas limitaciones, los estudios de los presentes inventores proporcionan una serie de importantes conocimientos genéticos y clínicos en el GBM. El primero de ellos es que las rutas conocidas que están alteradas en GBM afectan a una fracción más grande de miembros de genes y pacientes de lo previsto. La mayoría de los tumores analizados tenían alteraciones en los miembros de cada una de las rutas TP53, RB1 y PI3K. El hecho de que todos menos uno de los cánceres con mutaciones en los miembros de una ruta no tenían alteraciones en otros miembros de la misma ruta es significativo, y sugiere que estas alteraciones son funcionalmente equivalentes en la tumorigénesis. Estas observaciones apuntan también a distintas oportunidades para la intervención terapéutica potencial en estas rutas en los GBM. La segunda observación es que se identificaron una variedad de nuevos genes y rutas no implicados anteriormente en los GBM. Entre las nuevas rutas detectadas, varias de ellas parecen estar implicadas en el transporte de iones específico del cerebro y los procesos de señalización y representan aspectos interesantes y potencialmente útiles de la biología del GBM.

Estos datos plantean de inmediato preguntas con importantes implicaciones para el tratamiento y el asesoramiento a los pacientes con GBM, así como aquellos que tienen gliomas de grado inferior. Por ejemplo, ¿están las mutaciones en el IDH también presentes en un subconjunto de pacientes diagnosticados con gliomas de grado inferior (grado I-III de la OMS)? Si se descubre que las mutaciones en la IDH1 son de hecho un evento genético relativamente temprano en la progresión del glioma, ¿tienen estos pacientes un mayor riesgo de progresión a GBM? Dada la dificultad clínica significativa de decidir qué pacientes de glioma de grado inferior recibirán terapia adyuvante de radiación o quimioterapia (y cómo de agresivo debe ser el tratamiento), el conocimiento de que un paciente está en mayor riesgo de progresión maligna alteraría significativamente el análisis riesgo-beneficio de estas decisiones de tratamiento. Para los pacientes pediátricos, en los que la terapia de radiación puede tener efectos especialmente devastadores sobre el desarrollo y la función neurocognitivos, estas decisiones son particularmente difíciles y cualquier clasificación adicional de riesgo sería especialmente útil. Las mutaciones de la IDH también pueden proporcionar una explicación biológica para el GBM superviviente de largo plazo ocasional y podrían ayudar a identificar a los pacientes que recibirían un beneficio particular de las terapias específicas actualmente disponibles. La utilidad de la IDH como marcador clínico es probable que sea mayor por el hecho de que sólo se necesita examinar un solo codón del gen para determinar el estado de mutación. Por último, es concebible que los nuevos tratamientos se puedan diseñar para aprovechar estas alteraciones de la IDH, ya sea como monoterapia o en combinación con otros agentes. A lo largo de estas líneas, se ha demostrado recientemente que la inhibición de la IDH2 mitocondrial da como resultado un aumento de la sensibilidad de las células tumorales a una variedad de agentes quimioterapéuticos (49). En resumen, este descubrimiento de mutaciones de la IDH en un subconjunto de

pacientes con GBM y en, como mínimo, otro tipo de cáncer se abre una nueva ruta de investigación que podría iluminar un aspecto poco apreciado anteriormente de la tumorigénesis humana.

La divulgación anterior describe de forma general la presente invención. Todas las referencias descritas en el presente documento se incorporan expresamente por referencia. Una comprensión más completa puede obtenerse con referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en el presente documento con propósitos solamente de ilustración y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1

Materiales y procedimientos

Se extrajo ADN de muestras de tumor primario y xenoinjerto y linfocitos normales de la sangre de pacientes emparejados, obtenidos del Banco de Tejidos en el Centro de Tumores Cerebrales Preston Robert Tisch de Duke y los centros colaboradores, tal como se ha descrito anteriormente17. Todos los tumores cerebrales analizados fueron sometidos a una revisión por consenso de dos neuropatólogos. El panel de tumores cerebrales comprendió 21 astrocitomas pilocíticos y 2 gliomas de células gigantes subependimarios (grado I de la OMS); 31 astrocitomas difusos, 51 oligodendrogliomas, tres oligoastrocitomas, 30 ependimomas y siete xantoastrocitomas pleomórficos (grado II de la OMS); 43 astrocitomas anaplásicos, 36 oligodendrogliomas anaplásicos y siete oligoastrocitomas anaplásicos (grado III de la OMS); 178 GBM y 55 meduloblastomas (grado IV de la OMS). Las muestras de GBM incluyeron 165 casos primarios y 13 secundarios. Quince de los GBM eran de pacientes menores de 20 años). Los GBM secundarios fueron definidos como aquellos que se extirparon más de 1 año después de un diagnóstico anterior de un glioma de grado inferior (grado I-III de la OMS). Sesenta y seis de los 178 GBM, pero ninguno de los tumores de grado inferior, habían sido analizados en el análisis anterior de los presentes inventores de mutaciones de todo el genoma de GBM16. Además de los tumores cerebrales, se examinaron 494 cánceres no del SNC: 35 cánceres de pulmón, 57 cánceres gástricos, 27 cánceres de ovario, 96 cánceres de mama, 114 cánceres colorrectales, 95 cánceres de páncreas, siete cánceres de próstata, 4 leucemias mielógenas crónicas, 7 leucemias linfocíticas crónicas, 7 leucemias linfoblásticas agudas y 45 leucemias mielógenas agudas. Todas las muestras se obtuvieron según la Ley de Transferencia y Responsabilidad del Seguro de Salud. La adquisición de muestras de tejido fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del Sistema de Salud de la Universidad de Duke y los IRB e instituciones colaboradoras correspondientes.

Se amplificó el exón 4 del gen IDH1 por PCR y se secuenció el ADN tumoral y el normal emparejado para cada paciente tal como se ha descrito anteriormente16. En pacientes seleccionados sin una mutación de la IDH1 de R132 (aquellos con lesiones de grado II o III o GBM secundario), se secuenciaron los siete exones restantes de IDH1 y los 11 exones del IDH2 y se analizaron en busca de mutaciones. Todos los exones de codificación de TP53 y PTEN también se secuenciaron en el panel de oligodendrogliomas, oligodendrogliomas anaplásicos, astrocitomas anaplásicos y GBM. La amplificación de EGFR y la eliminación de CDKN2A/CDKN2B se analizaron por PCR cuantitativa en tiempo real en los mismos tumores18 . Se evaluaron muestras de oligodendroglioma y oligodendroglioma anaplásico en la pérdida de heterocigocidad (LOH) en 1p y 19q, tal como se ha descrito anteriormente15,19 .

La información clínica incluyó la fecha de nacimiento, la fecha en la que se obtuvo la muestra de estudio, la fecha de diagnóstico patológico, la fecha y la patología de cualquier diagnóstico anterior de un glioma de grado inferior, la administración de la radioterapia y/o quimioterapia antes de la fecha en la que se obtuvo la muestra de estudio, la fecha del último contacto con el paciente, y el estado del paciente en el último contacto. La información clínica para el análisis de supervivencia estaba disponible para todos los 482 pacientes con tumor cerebral primario. Se trazaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y las distribuciones de supervivencia se compararon mediante la prueba Mantel Cox de rango logarítmico y la prueba de Wilcoxon. La supervivencia global se calculó utilizando la fecha de diagnóstico y fecha de la muerte o el último contacto con los pacientes de GBM. Las correlaciones entre la aparición de mutaciones de IDH1/IDH2 y otras alteraciones genéticas se examinaron mediante la prueba exacta de Fisher.

EJEMPLO 2

Alteraciones de frecuencia elevada de IDH1 en pacientes con GBM jóvenes

La lista de genes CAN principales incluyó una serie de genes individuales que anteriormente no habían sido relacionados con GBM. El más frecuentemente mutado de estos genes, el IDH1, codifica la isocitrato deshidrogenasa 1, que cataliza la carboxilación oxidativa de isocitrato a α-cetoglutarato, lo que da como resultado la producción de NADPH. Cinco genes isocitrato deshidrogenasa se codifican en el genoma humano, con los productos de tres (IDH3 alfa, IDH3 beta, IDH3 gamma) formando un heterotetrámero (α2βγ en la mitocondria y que utiliza NAD(+) como un aceptor de electrones para catalizar la etapa de velocidad limitante del ciclo de ácidos tricarboxílicos. La cuarta isocitrato deshidrogenasa (IDH2) también se localiza en las mitocondrias, pero como IDH1, utiliza NADP(+) como aceptor de electrones. El producto de la IDH1, a diferencia del resto de las proteínas comunes de IDH, está contenido dentro del citoplasma y los peroxisomas (41). La proteína forma un homodímero asimétrico

(42) y se cree que actúa regenerando NADPH y α-cetoglutarato para procesos intraperoxisomales y biosintéticos

citoplasmáticos. La producción de NADPH citoplasmático por la IDH1 parece jugar un papel importante en el control celular de daño oxidativo (43) (44). No se encontró que ninguno de los otros genes de IDH, otros genes implicados en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos u otras proteínas peroxisomales estuviera alterado genéticamente en el análisis de los presentes inventores.

Se descubrió que la IDH1 estaba mutada somáticamente en cinco tumores de GBM en el cribado de detección. Sorprendentemente, los cinco tenían la misma mutación heterocigótica puntual, un cambio de una guanina por una adenina en la posición 395 del transcrito de la IDH1 (G395A), lo que conduce a una sustitución de una arginina con una histidina en el residuo de aminoácido 132 de la proteína (R132H). En el estudio anterior de los presentes inventores de los cánceres colorrectales, se había descubierto que este mismo codón estaba mutado en un solo caso a través de la alteración del nucleótido adyacente, lo que daba como resultado un cambio de amino ácido R132C (10). Se descubrió que cinco GBM adicionales evaluados en el cribado de prevalencia de los presentes inventores tenían mutaciones R132H heterocigóticas y otros dos tumores adicionales tenían una tercera mutación distinta que afectaba al mismo residuo de aminoácido, R132S (figura 1; tabla 4). El residuo R132 se conserva en todas las especies conocidas y se localiza en el sitio de unión del sustrato, formando la interacción hidrófila con el carboxilato alfa del isocitrato (figura 2) (42, 45).

Se hicieron varias observaciones importantes sobre las mutaciones de la IDH1 y su potencial importancia clínica. En primer lugar, las mutaciones en la IDH1 se produjeron preferentemente en pacientes más jóvenes con GBM, con una edad media de 33 años para los pacientes con la IDH1 mutada, en comparación con 53 años para los pacientes con IDH1 de tipo salvaje (P <0,001, prueba t, tabla 4. En pacientes menores de 35 años de edad, casi el 50% (9 de 19) tenían mutaciones en la IDH1. En segundo lugar, se encontraron las mutaciones en la IDH1 en casi todos los pacientes con GBM secundarios (mutaciones en 5 de 6 pacientes con GBM secundario, en comparación con 7 de 99 pacientes con GBM primario, p <0,001, prueba binomial), incluyendo los cinco pacientes con GBM secundario menores de 35 años de edad. En tercer lugar, los pacientes con mutaciones de la IDH1 tenían un pronóstico mejorado de forma significativa, con una mejora de la supervivencia global media de 3,8 años, en comparación con 1,1 años para los pacientes con la IDH1 de tipo salvaje (P <0,001, prueba de rango logarítmico). Aunque son conocidos que la juventud y la TP53 mutada son factores de pronóstico positivos para pacientes con GBM, esta asociación entre la mutación de la IDH1 y la mejora de la supervivencia se observó incluso en los pacientes menores de 45 años de edad (figura 3, P <0,001, prueba de rango logarítmico), así como en el subgrupo de pacientes jóvenes con mutaciones de TP53 (P <0,02 prueba de rango logarítmico).

EJEMPLO 3

Muestras de ADN con glioblastoma multiforme (GBM)

Se obtuvo ADN tumoral de xenoinjertos de GBM y tumores primarios, con el ADN normal emparejado para cada caso obtenido a partir de muestras de sangre periférica, tal como se ha descrito anteriormente (1). A todas las muestras se les dio el diagnóstico histológico de glioblastoma multiforme (GBM; grado IV de la Organización Mundial de la Salud), a excepción de dos muestras del cribado de detección que se registraron como "glioma de grado elevado, no especificado de otra manera". Las muestras se clasificaron como recurrentes para pacientes en los que un GBM había sido diagnosticado, como mínimo, 3 meses antes de la cirugía, cuando se obtuvo la muestra de GBM de estudio. Hubo 3 GBM recurrentes en el cribado de detección y 15 en el cribado de prevalencia. Las muestras se clasificaron como secundarias para pacientes en los que un glioma de grado inferior se había confirmado histológicamente, como mínimo, 1 año antes de la cirugía, cuando se obtuvo la muestra de estudio del GBM (grado I-III de la OMS). Una muestra del cribado de detección y 5 muestras del cribado de prevalencia se clasificaron como secundarias.

Se obtuvo la información clínica pertinente, incluyendo la fecha de nacimiento, la fecha de la muestra de GBM de estudio obtenida, la fecha de diagnóstico original del GBM (si es diferente a la fecha en la que se obtuvo la muestra de GBM, como en el caso de GBM recurrentes), la fecha y la patología del diagnóstico anterior del glioma de grado inferior (en los casos de GBM secundarios), la administración de radioterapia y/o quimioterapia antes de la fecha en la que se obtuvo la muestra de GBM, la fecha del último contacto con el paciente y el estado del paciente en el último contacto. Todas las muestras se obtuvieron según la Ley de transferencia y responsabilidad del seguro de salud (HIPAA). Todas las muestras se obtuvieron según la Ley de transferencia y responsabilidad del seguro de salud (HIPAA). Tal como se ha descrito anteriormente, se confirmó la coincidencia del par tumor-normal escribiendo nueve loci STR utilizando el sistema PowerPlex 2.1 (Promega, Madison, Wisconsin) y las identidades de las muestras se comprobaron a lo largo de los cribados de detección y prevalencia mediante la secuenciación del exón 3 del gen HLA-A. La PCR y la secuenciación se llevaron a cabo tal como se describe en (1).

EJEMPLO 4

Análisis estadístico de los datos clínicos

Se utilizó tejido normal y maligno emparejado de 105 pacientes de GBM para el análisis genético. La información clínica completa (es decir, toda la información clínica pertinente, como la fecha del diagnóstico inicial de GBM, fecha

de la muerte o el último contacto) estaba disponible para 91 de los 105 pacientes. De estos 91 pacientes, cinco (todos con la IDH1 de tipo salvaje) murieron durante el primer mes después de la cirugía y se excluyeron del análisis (Br308T, Br246T, Br23X, Br301T, Br139X), al igual que un solo paciente (Br119X) con una presunta cura quirúrgica (también con la IDHI de tipo salvaje) que estaba vivo en el último contacto, aproximadamente, 10 años después del diagnóstico. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se compararon mediante la prueba de rango logarítmico de Mantel Cox. Las proporciones de riesgo se calcularon utilizando el procedimiento de Mantel-Haenszel. Las siguientes definiciones se utilizaron en los cálculos de agrupación de los pacientes de GBM y el análisis de supervivencia: 1) La edad del paciente se refiere a la edad en la que se obtuvo la muestra del GBM paciente. 2) GBM recurrente designa un GBM que fue extirpado más de 3 meses después de un diagnóstico anterior de GBM. 3) GBM secundario designa un GBM que fue extirpado más de 1 año después de un diagnóstico anterior de un glioma de grado inferior (OMS I-III). 4) La supervivencia global se calcula utilizando la fecha de diagnóstico y fecha de la muerte o el último contacto con los pacientes de GBM. Todos los intervalos de confianza se calcularon al nivel del 95%.

EJEMPLO 5

Mutaciones de la IDH1 y la IDH2

El análisis de secuencias de la IDH1 en 976 muestras de tumores reveló un total de 167 mutaciones somáticas en el residuo R132, incluyendo R132H (148 tumores), R132C (8 tumores), R132S (2 tumores), R132L (8 tumores) y R132G (1 tumor) (figura 4A, figura 7). Los tumores con mutaciones de R132 somáticas incluyeron 25 de 31 (81%) astrocitomas difusos (grado II de la OMS), 41 de 51 (80%) oligodendrogliomas (grado II de la OMS), 3 de 3 (100%) oligoastrocitomas (grado II de la OMS), uno de 7 (14%) xantoastrocitomas pleomórficos (grado II de la OMS), 41 de 61 (67%) astrocitomas anaplásicos (grado III de la OMS), 31 de 36 (86%) oligodendrogliomas anaplásicos (grado III de la OMS), 7 de 7 (100%) oligoastrocitomas anaplásicos (grado III de la OMS), 11 de 13 (85%) GBM secundarios y 7 de 165 (4%) GBM primarios (figura 1B, figura 11). En contraste, no se observaron mutaciones R132 en 21 astrocitomas pilocíticos (grado I de la OMS), dos astrocitomas subependimarios de células gigantes (grado I de la OMS), 30 ependimomas (grado II de la OMS), 55 meduloblastomas o en ninguna de las 494 muestras de tumores no del SNC. El análisis de secuencias de los exones restantes de la IDH1 no reveló otras mutaciones somáticas de la IDH1 en los tumores negativos en R132.

Si la IDH1 fue crítica para el desarrollo o la progresión de los oligodendrogliomas y astrocitomas, los presentes inventores razonaron que las alteraciones en otros genes con funciones similares a la IDH1 podrían encontrarse en aquellos tumores sin mutaciones de la IDH1. Por lo tanto, se analizó el gen IDH2, que codifica la única proteína homóloga humana para IDH1 que utiliza NADP+ como aceptor de electrones. La evaluación de la secuencia de todos los exones de la IDH2 en estas muestras, reveló ocho mutaciones somáticas, todas en el residuo R172: R172M en tres tumores, R172K en tres tumores, y R172G en dos tumores (figura 1A, figura 7). El residuo R172 en IDH2 es el análogo exacto del residuo R132 de la IDH1, que se encuentra en el sitio activo de la enzima y forma enlaces de hidrógeno con el sustrato isocitrato.

A fin de evaluar adicionalmente el tiempo de las alteraciones de la IDH en la progresión del glioma, se evaluaron mutaciones de la IDH1 en siete pacientes con gliomas progresivos en los que estaban disponibles muestras de tumores tanto de grado inferior como elevado. El análisis de la secuencia identificó mutaciones de la IDH1 tanto en los tumores de grado inferior como alto en los siete casos (figura 8, tabla 4). Estos resultados demuestran inequívocamente que las alteraciones de la IDH1 se producen en tumores de grado inferior y que los cánceres posteriores en estos pacientes se derivan directamente de estas lesiones tempranas.

También se examinaron los oligodendrogliomas, los oligodendrogliomas anaplásicos, astrocitomas anaplásicos y un subconjunto de GBM para las mutaciones de TP53 y PTEN, la amplificación del EGFR, la eliminación de CDKN2A/CDKN2B, y LOH de 1p/19q (figura 12). Las mutaciones TP53 eran mucho más comunes en los astrocitomas anaplásicos (63%) y GBM secundarios (60%) que en los oligodendrogliomas (16%) o los oligodendrogliomas anaplásicos (10%) (p <0,001, prueba exacta de Fisher). Por el contrario, se encontraron eliminaciones de 1p y 19q con más frecuencia en tumores oligodendrocíticos que en astrocíticos, tal como se esperaba15 .

La comparación de estas alteraciones con las de la IDH1 y la IDH2 reveló varias correlaciones sorprendentes. Casi todos los astrocitomas anaplásicos y GBM con las IDH1/IDH2 mutadas también tenían la mutación de TP53 (82%), pero sólo el 5% tenían alguna alteración de PTEN, EGFR o CDKN2A/CDKN2B (figura 12). Por el contrario, los astrocitomas anaplásicos y GBM con la IDH1 de tipo salvaje tenían pocas mutaciones de TP53 (21%) y alteraciones más frecuentes de PTEN, EGFR, o CDKN2A/CDKN2B (40%) (p <0,001, prueba exacta de Fisher). No se observó pérdida de 1p/19q en el 85% (45/53) de los tumores oligodendrocíticos con las IDH1 o IDH2 mutadas pero en ninguno (0/9) de los pacientes con genes de las IDH de tipo salvaje (p <0,001, prueba exacta de Fisher).

Los pacientes con astrocitomas anaplásicos y GBM con mutaciones de la IDH1 o la IDH2 eran significativamente más jóvenes que los que tenían genes de la IDH1 y la IDH2 de tipo salvaje (mediana de edad de 34 años frente a 58 años, p <0,001, prueba t de Student). Curiosamente, a pesar de la baja mediana de edad de los pacientes con mutaciones de la IDH1 o la IDH2, no se identificaron mutaciones en GBM de pacientes que tenían menos de 20 años de edad (0

de 18 pacientes, figura 9). En los pacientes con oligodendrogliomas y oligodendrogliomas anaplásicos, la mediana de edad de los pacientes con mutaciones de la IDH1 o la IDH2 fue de 39 años, con mutaciones en la IDH1 identificadas en dos adolescentes (14 y 16 años), pero no en los pacientes más jóvenes (0 a 4).

La observación anterior de los presentes inventores de un mejor pronóstico para los pacientes con GBM con IDH1 mutado16 se confirmó en este conjunto de datos más grande y se extendió para incluir a pacientes con mutaciones en la IDH2. Los pacientes con mutaciones en la IDH1 o la IDH2 tenían una mediana de supervivencia global de 39 meses, significativamente más larga que la supervivencia de 13,5 meses en los pacientes con la IDH1 de tipo salvaje (figura 5, p <0,001, prueba de rango logarítmico). Las mutaciones de los genes del IDH también se asociaron con un mejor pronóstico en pacientes con astrocitomas anaplásicos (grado III de la OMS), con mediana de supervivencia global de 65 meses para los pacientes con mutaciones y 19 meses para los que no las tenían (p <0,001, prueba de rango logarítmico). El análisis de supervivencia diferencial no pudo realizarse en pacientes con astrocitomas difusos, oligodendrogliomas u oligodendrogliomas anaplásicos porque había pocos tumores de este tipo sin mutaciones del gen IDH.

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La divulgación de cada referencia citada se incorpora expresamente en el presente documento. Las referencias en la lista siguiente se citan en el texto con números de referencia en superíndice.

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Las referencias en la lista siguiente se citan en el texto con números de referencia entre paréntesis. La divulgación de cada una se incorpora expresamente en el presente documento.

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EJEMPLO 6

Estrategia de secuenciación

Se ha ampliado la estrategia de secuenciación de los presentes inventores desarrollada anteriormente para la identificación de mutaciones somáticas para incluir 23.219 transcritos de 20.583 genes. Estos incluyen 2.783 genes adicionales de las bases de datos Ensembl que no estaban presentes en las bases de datos CCDS o RefSeq analizadas en estudios anteriores (10, 11). Además, se han rediseñado cebadores de PCR para las regiones del genoma que (i) eran difíciles de amplificar por PCR y se habían analizado por debajo de lo óptimo en estudios anteriores; o (ii) se descubrió que compartían una identidad significativa con otras secuencias de ser humano o de ratón. La combinación de estas secuencias de cebadores nuevas y rediseñadas y existentes dio lugar a un total de

208.311 pares de cebadores (tabla S1, disponible en línea en Science del 26 de Septiembre de 2008: vol. 321. no.

5897, págs. 1807 -1812) que se utilizó con éxito para el análisis de secuencia de los exones de codificación de estos genes.

Se seleccionaron veintidós muestras de GBM (figura 10, tabla S2) para el análisis de secuencias de PCR, que consta de 7 muestras extraídas directamente de tumores de pacientes y 15 muestras de tumores pasadas como xenoinjertos en ratones desnudos. Un tumor (Br27P) fue un GBM secundario obtenido de un paciente que anteriormente había sido tratado tanto con terapia de radiación como quimioterapia, incluyendo la temozolomida. El resto de los tumores se clasificaron como GBM primarios y no habían recibido tratamiento dirigido al tumor antes de la adquisición de la muestra de tumor estudiada.

En la primera etapa de este análisis, denominada cribado de detección, se utilizaron los pares de cebadores para amplificar y secuenciar 175.471 exones de codificación y secuencias donadoras y aceptoras de empalme intrónicas adyacentes en las 22 muestras de GBM y en una muestra normal emparejada. Los datos se reunieron para cada región amplificada y se evaluaron con criterios de calidad estrictos, lo que dio como resultado el éxito de amplificación y secuenciación del 95,0% de los amplicones y el 93,0% de las bases específicas en los 22 tumores. Un total de 689 Mb de datos de secuencias se generaron a través de este enfoque. Las trazas de amplicón se analizaron utilizando enfoques automatizados para identificar cambios en las secuencias tumorales que no estaban presentes en las secuencias de referencia de cada gen, a continuación, se eliminaron de análisis adicionales alteraciones presentes en la muestra de control normal y en bases de datos de polimorfismo de nucleótido único (SNP). Las trazas de secuencias restantes de alteraciones potenciales se inspeccionaron visualmente para eliminar las notificaciones de falsos positivos de mutación generados a través del software automatizado de los presentes inventores. Todos los exones que contienen mutaciones supuestas se reamplificaron posteriormente y se secuenciaron en las muestras afectadas por el tumor y en las de ADN normal emparejado. Este proceso permitió la confirmación de la mutación en la muestra de tumor y determinar si la alteración era somática (es decir, específica de tumor) o estaba presente en la línea germinal. Todas las mutaciones somáticas supuestas se examinaron computacionalmente y experimentalmente para confirmar que las alteraciones no surgen a través de la amplificación aberrante conjunta de secuencias de genes relacionados (12).

Tabla 1. Resumen de los análisis genómicos de GBM

Análisis de secuenciación

Número de genes analizados 20.583 Número de transcritos analizados 23.781 Número de exones analizados 184.292 Pares de cebadores diseñados para la amplificación 219.229 Fracción de amplicones de paso* 95,0% Número total de nucleótidos secuenciados 689.071.123 Fracción de secuencias de amplificación de paso analizadas con éxito# 98,4% Fracción de bases diana analizadas con éxito# 93,0% Número de mutaciones somáticas identificadas (n = 22 muestras) 2.328 Número de mutaciones somáticas (excluyendo Br27P) 996

Sentido erróneo 870 Finalización 43 Inserción 3 Eliminación 46 Duplicación 7 Sitio de empalme o UTR 27 Número promedio de alteraciones de la secuencia por muestra 47,4

Análisis del número de copias

Número total de loci SNP evaluados por cambios en el número de copias 1.069.688

Número de alteraciones del número de copias identificadas (n = 22 muestras) 281 Amplificaciones 147 Eliminaciones homocigóticas 134 Número promedio de amplificaciones por muestra 6,7 Número promedio de eliminaciones homocigóticas por muestra 6,1

* Amplicones de paso se definen por tener puntuaciones PHRED20 o mejores más del 90% de la secuencia diana en el 75% de las muestras analizadas. #Fracción de nucleótidos que tienen puntuaciones de PHRED20 o mejor (véase los Materiales de apoyo en línea para obtener información adicional).

EJEMPLO 7

Análisis de alteraciones de la secuencia

Se descubrió que 2.043 genes (el 10% de los 20.661 genes analizados) contenían, como mínimo, una mutación somática que se esperaría que alterara la secuencia de la proteína. La gran mayoría de estas alteraciones eran sustituciones de una sola base (94%), mientras que las otras eran pequeñas inserciones, eliminaciones o duplicaciones. La muestra de tumor Br27P obtenida del paciente tratado anteriormente con la terapia de radiación y quimioterapia (incluyendo la temozolomida), tenía 1332 mutaciones somáticas totales, 17 veces más que cualquiera de los otros 21 pacientes (figura 10, tabla S3). El espectro de mutaciones de esta muestra, que comprende un exceso de transiciones C > T en la citosina 5' de dinucleótidos CpC, fue radicalmente diferente de las de los otros pacientes de GBM, pero fue consistente con observaciones anteriores de un fenotipo de hipermutación en muestras de glioma de pacientes tratados con temozolomida (13, 14). En los pacientes notificados anteriormente, se pensó que la hipermutabilidad que se producía debido a la exposición prolongada de un agente alquilante en presencia de deficiencia de reparación de falta de coincidencia de genes MSH6; sin embargo, en BR27P, no se observaron alteraciones somáticas en MSH6 o en cualquiera de los otros genes de reparación de falta de coincidencia (MSH2, MLH1, MlH3, PMS 1, PMS2). En contraste con BR27P, no se conocía que ninguna de las otras muestras de los 21 tumores analizados en el cribado de detección hubiera recibido radioterapia o tratamiento quimioterapéutico anterior y ninguna tenía el espectro de mutación característico del CpC que se ha descubierto en este tipo de tumores pretratados.

Después de eliminar el Br27P de la consideración, se observó que las 993 mutaciones restantes estaban distribuidas de manera relativamente uniforme entre los 21 tumores restantes (figura 10, tabla S3). El número de mutaciones somáticas identificadas en cada tumor osciló entre el 17 y 79, con un promedio de 47 mutaciones por tumor, o 1,51 mutaciones por Mb del genoma secuenciado del tumor GBM. Seis muestras de ADN extraídas de tumores primarios tenían un número algo más pequeño de mutaciones que los obtenidos a partir de xenoinjertos, probablemente debido al efecto de enmascaramiento de células no neoplásicas en el primero. Anteriormente se había demostrado que las líneas celulares y xenoinjertos proporcionan la plantilla de ADN óptima para los análisis de secuenciación del genoma del cáncer (15) y que representan fielmente las alteraciones presentes en tumores primarios (16).

Tanto el número total como la frecuencia de alteraciones de la secuencia en GBM fueron sustancialmente más pequeños que el número y la frecuencia de estas alteraciones observadas en los cánceres de colon o de mama, y ligeramente menores que en el páncreas (10, 11, 17). La explicación más probable de esta diferencia es la reducción del número de generaciones de células en células gliales antes de la aparición de la neoplasia. Se ha sugerido que hasta la mitad de las mutaciones somáticas observadas en los cánceres colorrectales se producen en células madre epiteliales durante los procesos de renovación de células normales (16). Dado que las células madre gliales normales se producen con mucha menos frecuencia que las células epiteliales mamarias o del colon, se esperaría que contuvieran muchas menos mutaciones cuando tuviera lugar la mutación iniciadora del tumor (18).

Además, se evaluó un conjunto de 20 genes mutados identificados en el cribado de detección en un segundo cribado, denominado cribado de prevalencia, que comprende 83 GBM adicionales con historiales clínicos bien documentados (tabla S2, disponible en línea en Science, 26 Septiembre de 2008: vol. 321. no. 5897, págs. 1807 1812). Estos genes mutaron en, como mínimo, dos tumores y tenían frecuencias de mutación de más de 10 mutaciones por Mb de ADN tumoral secuenciado. Se identificaron mutaciones somáticas no silenciosas en 15 de estos 20 genes en las muestras tumorales adicionales (figura 10, tabla S4). La frecuencia de mutaciones de todos los genes analizados en el cribado de prevalencia fue de 24 mutaciones por Mb de ADN tumoral, aumentada notablemente desde la frecuencia de mutaciones global en el cribado de detección de 1,5 mutaciones por Mb (p <0,001, prueba binomial). Además, la proporción observada de mutaciones no silenciosas a silenciosas (NS:S) entre las mutaciones en el cribado de prevalencia fue 14,8:1, sustancialmente mayor que la proporción 3,1:1 que se observó en el cribado de detección (P <0,001, prueba binomial). El aumento de la frecuencia de mutaciones y el mayor número de mutaciones no silenciosas sugieren que los genes mutados en los cribados de prevalencia se enriquecieron en genes que contribuyeron activamente a la tumorigénesis.

Además de la frecuencia de mutaciones en un gen, el tipo de mutación puede proporcionar información útil para la evaluación de su papel potencial en la enfermedad (19). Las mutaciones de finalización, inserciones o eliminaciones fuera de marco de lectura y los cambios de sitio de empalme conducen generalmente a la inactivación de los productos de proteína. El efecto probable de las mutaciones de sentido erróneo se puede evaluar a través de la evaluación del residuo mutado por medios evolutivos o estructurales. Para evaluar las 21 mutaciones de sentido erróneo, se ha desarrollado un nuevo algoritmo que utiliza el aprendizaje automático de 56 características de predicción en base a las propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos implicados en la subestación y su conservación evolutiva en las posiciones equivalentes de proteínas conservadas (12). Se predijo que, aproximadamente, el 15% de las mutaciones de sentido erróneo identificadas en el presente estudio tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la función de la proteína cuando se evaluó por este procedimiento (figura 10, tabla S3). También se pudieron hacer modelos estructurales de 244 de las 870 mutaciones de sentido erróneo identificadas en este estudio (20). En cada caso, el modelo se basa en la cristalografía de rayos X o espectroscopia

de resonancia magnética nuclear de la proteína normal o un homólogo estrechamente relacionado. Este análisis mostró que 35 de las mutaciones de sentido erróneo se ubicaban cerca de una interfaz de dominio o sitio de unión al sustrato y era probable que afectaran a su función (enlaces a los modelos estructurales disponibles en (12)).

EJEMPLO 8

Análisis de los cambios del número de copias

A continuación, los mismos tumores se evaluaron en las alteraciones del número de copias a través de la hibridación genómica de las muestras de ADN a matrices de oligonucleótidos de alta densidad Illumina que contienen, aproximadamente, 1 millón de sondas de loci SNP (21). Recientemente se ha desarrollado un enfoque sensible y específico para la identificación de amplificaciones focales que dan como resultado 12 o más copias por núcleo (amplificación de 6 veces o más en comparación con el genoma diploide), así como las eliminaciones de ambas copias de un gen (eliminaciones homocigóticas) utilizando estas matrices (22). Estas alteraciones focalizadas se pueden utilizar para identificar genes candidatos subyacentes en estas regiones. Es imposible identificar de forma fiable estos genes candidatos en regiones con aberraciones cromosómicas más grandes, tales como las relacionadas con las ganancias o pérdidas de brazos cromosómicos enteros, que se producen con frecuencia en los tumores y que son de importancia desconocida.

Se han identificado un total de 147 amplificaciones (figura 10, tabla S5) y 134 eliminaciones homocigóticas (figura 10, tabla S6) en las 22 muestras utilizadas en el cribado de detección, con 0 a 34 amplificaciones y 0 a 14 eliminaciones encontradas por muestra tumoral. Aunque el número de amplificaciones fue similar entre las muestras primarias y aquellos tumores que habían sido pasados como xenoinjertos, las últimas muestras permitieron la detección de un mayor número de eliminaciones homocigóticas (promedio de 8,0 eliminaciones por xenoinjerto frente a 2,2 por muestra primaria). Estas observaciones son consistentes con los informes anteriores que documentan la dificultad de identificar eliminaciones homocigóticas en las muestras que contienen la contaminación de ADN normal (23) y ponen de manifiesto la importancia de la utilización de las células tumorales humanas purificadas, tales como las presentes en xenoinjertos o líneas celulares, para el análisis genómico.

EJEMPLO 9

Integración de los análisis de secuenciación, número de copias y expresión

Las mutaciones que surgen durante la tumorigénesis pueden proporcionar una ventaja selectiva a la célula tumoral (mutaciones conductoras) o no tienen ningún efecto neto sobre el crecimiento tumoral (mutaciones pasajeras). Los datos de mutaciones obtenidos a partir de la secuenciación y el análisis de las alteraciones del número de copias se integraron con el fin de identificar los genes candidatos del cáncer de GBM (genes CAN) que serían más propensos a ser conductores y, por lo tanto, merecedores de mayor investigación. El enfoque bioinformático utilizado para determinar si un gen era susceptible de albergar mutaciones conductoras implicó la comparación de la cantidad y el tipo de mutaciones observadas en cada gen con el número que se esperaría debido a las tasas de mutaciones pasajeras. Para alteraciones de la secuencia, se calcularon los límites superior e inferior de las tasas de pasajeras. El límite superior se calculó de forma conservadora como el número total de alteraciones observadas menos aquellas mutaciones que se producen en los genes del cáncer conocidos, dividido por la cantidad de ADN tumoral secuenciado, mientras que el límite inferior se determinó sobre la base de las mutaciones silenciosas observadas y las estimaciones de las relaciones esperadas NS:S (12). Para los cambios de número de copias, se ha realizado la suposición muy conservadora de que todas las amplificaciones y eliminaciones eran pasajeras cuando se determinó la tasa de base. Para el análisis de cada gen, todos los tipos de alteraciones (cambios de secuencia, amplificaciones y eliminaciones homocigóticas), posteriormente se combinaron para estimar la probabilidad de pasajeras para aquel gen (véase (12) para una descripción más detallada de los procedimientos estadísticos).

Los genes CAN mejor clasificados, junto con sus probabilidades de pasajeras, se enumeran en la figura 10, tabla S7. Los genes CAN incluyen una serie de genes que habían sido bien establecidos con respecto a su participación en los gliomas, entre los que se incluyen TP53, PTEN, CDKN2A, RB1, EGFR, NF1, PIK3CA y PIK3R1 (24-34). De estos genes, entre los más frecuentemente alterados en los análisis de los presentes inventores se incluyeron CDKN2A (alterado en el 50% de los GBM), TP53, EGFR, y PTEN (alterados en el 30-40%), NF1, CDK4 y RB1 (alterados en el 12-15%), y PIK3CA y PIK3R1 (alterados en el 8-10%). En general, estas frecuencias, que son similares a las que se han notificado anteriormente, o en algunos casos superiores a éstas, validan la sensibilidad del enfoque de los presentes inventores para la detección de alteraciones somáticas.

Tabla 2. Genes CAN alterados con mayor frecuencia en GBM Eliminaciones

Mutaciones puntuales^ Amplificaciones& homocigóticas&

Gen

Número de tumores Fracción de tumores Número de tumores Fracción de tumores Número de tumores Fracción de tumores Fracción de tumores con cualquier alteración Probabilidad de pasajeras

CDKN2A

0/22 0% 0/22 0% 11/22 50% 50% 0,00

TP53

37/105 35% 0/22 0% 1/22 5% 40% 0,00

EGFR

15/105 14% 5/22 23% 0/22 0% 37% 0,00

PTEN

27/105 26% 0/22 0% 1/22 5% 30% 0,00

NF1

16/105 15% 0/22 0% 0/22 0% 15% 0,04

CDK4

0/22 0% 3/22 14% 0/22 0% 14% 0,00

RB1

8/105 8% 0/22 0% 1/22 5% 12% 0,01

IDH1

12/105 11% 0/22 0% 0/22 0% 11% 0,00

PIK3CA

10/105 10% 0/22 0% 0/22 0% 10% 0,10

PIK3R1

8/105 8% 0/22 0% 0/22 0% 8% 0,14

Se enumeran los genes CAN alterados más frecuentemente; todos los genes CAN están enumerados en la tabla S7. ^Fracción de tumores con mutaciones puntuales indica la fracción de GBM mutados de las 105 muestras en los cribados de detección y prevalencia. En el cribado de prevalencia, no se analizaron CDKN2A y CDK4 en mutaciones puntuales porque no se detectaron alteraciones de secuencia en estos genes en el cribado de detección. &Fracción de tumores con amplificaciones y eliminaciones indica el número de tumores con estos tipos de alteraciones en las 22 muestras del cribado de detección. ‘Probabilidad de pasajera indica la probabilidad de pasajeras -Mid (12)

El análisis de los miembros de genes adicionales dentro de las rutas afectadas por estos genes identificó alteraciones de genes críticos en la ruta TP53 (TP53, MDM2, MDM4), la ruta RB1 (RB1, CDK4, CDKN2A) y la ruta PI3K/PTEN (PIK3CA, PIK3R1, PTEN, IRS1). Estas alteraciones dieron lugar a rutas aberrantes en la mayoría de los tumores (64%, 68% y 50%, respectivamente) y en todos los casos excepto uno, las mutaciones dentro de cada tumor afectaron sólo a un miembro único de cada ruta de una manera mutuamente exclusiva (P <0,05) (tabla 3). El análisis sistemático de los grupos y las rutas de genes funcionales contenidos dentro de la base de datos MetaCore bien anotada (35) identificó el enriquecimiento de genes mutados en miembros adicionales de las rutas TP53 y PI3K/PTEN, así como en una variedad de otros procesos celulares, entre los que se incluían la regulación de la adhesión celular, así como las rutas celulares específicas del cerebro, tales como las que implican la transmisión sináptica, la transmisión de los impulsos nerviosos y los canales implicados en el transporte de iones de sodio, potasio y calcio (figura 10, tabla S8). Curiosamente, no se observó que ninguna de estas últimas rutas se enriqueciera en los estudios a gran escala sobre los cánceres de páncreas (17) y puede representar una subversión de los procesos de las células gliales normales para promover el crecimiento y la invasión no regulados. No se habían apreciado que muchos miembros de las rutas detectadas tuvieran ningún papel en GBM o cualquier otro tipo de cáncer humano y se requerirá un esfuerzo sustancial para determinar su papel en la tumorigénesis.

Los patrones de expresión de genes pueden informar al análisis de las rutas, ya que pueden reflejar alteraciones epigenéticas no detectables por el análisis de la secuenciación o del número de copias. También pueden apuntar a los efectos cadena abajo en la expresión génica resultante de las rutas alteradas descritas anteriormente. Para analizar el transcriptoma del GBM, se realizó SAGE (análisis en serie de la expresión génica) (36) en todas las muestras de GBM utilizadas para el análisis de mutaciones para los que se disponía de ARN (un total de 18 muestras), así como dos controles de ARN cerebral normales independientes. Cuando se combina con procedimientos paralelos masivos de secuenciación por síntesis (37-40), SAGE proporciona una medida altamente cuantitativa y sensible de la expresión génica.

El análisis del transcrito se utilizó por primera vez para ayudar a identificar los genes diana de las regiones amplificadas y eliminadas que se identificaron en el presente estudio. Aunque algunas de estas regiones contenían un gen tumoral supresor u oncogén conocido, muchas contenían varios genes que anteriormente no habían sido implicados en el cáncer. En las tablas S5 y S6, se pudo identificar un gen diana candidato dentro de varias de estas regiones a través de la utilización de las mutaciones, así como los datos del transcrito.

En segundo lugar, se ha intentado identificar genes que se expresaron diferencialmente en los GBM en comparación con el cerebro normal. Hubo un número elevado (143) de genes que se expresaron a un nivel, en promedio, 10 veces mayor en 18 GBM analizados (en comparación con las muestras normales de cerebro). Entre los 143 genes sobreexpresados, hubo 16 que se secretaron o se expresaron en la superficie celular. Muchos de éstos se sobreexpresaron en los xenoinjertos, así como en los tumores cerebrales primarios, lo que sugiere nuevas oportunidades para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

EJEMPLO 10

Alteraciones de alta frecuencia de IDH 1 en pacientes jóvenes con GBM

La lista superior de genes CAN (figura 10, Tabla S7) incluye una serie de genes individuales que anteriormente no habían sido relacionados con el GBM. El más frecuentemente mutado de estos genes, IDH1, codifica isocitrato deshidrogenasa 1, que cataliza la carboxilación oxidativa de isocitrato a α-cetoglutarato, lo que da como resultado la producción de NADPH. Cinco genes de isocitrato deshidrogenasa se codifican en el genoma humano, formando los productos de tres (IDH3 alfa, IDH3 beta, IDH3 gamma) un heterotetrámero (2 en la mitocondria y utilizando NAD(+) como un aceptor de electrones para catalizar la etapa limitante de velocidad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La cuarta isocitrato deshidrogenasa (IDH2) también se localiza en las mitocondrias, pero como la IDH1, utiliza NADP(+) como aceptor de electrones. El producto de la IDH1, a diferencia del resto de las proteínas comunes de IDH, está contenido dentro del citoplasma y los peroxisomas (41). La proteína forma un homodímero asimétrico (42), y se cree que funciona regenerando NADPH y cetoglutarato para los procesos intraperoxisomales y biosintéticos citoplasmáticos. La producción de NADPH citoplasmático por la IDH1 parece jugar un papel importante en el control celular del daño oxidativo (43) (44). No se encontró que ninguno de los otros genes de IDH, otros genes implicados en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos u otras proteínas peroxisomales estuviera alteradas genéticamente en el análisis de los presentes inventores.

Se encontró que la IDH1 estaba mutada somáticamente en cinco tumores de GBM en el cribado de detección. Sorprendentemente, los cinco tenían la misma mutación heterocigótica puntual, un cambio de una guanina a una adenina en la posición 395 del transcrito de la IDH1 (G395A), lo que conducía a una sustitución de una arginina con una histidina en el residuo de aminoácido 132 de la proteína (R132H). En el estudio anterior de los presentes inventores de los cánceres colorrectales, se había descubierto que este mismo codón mutaba en un solo caso a través de la alteración del nucleótido adyacente, lo que daba como resultado un cambio del aminoácido R132C (10). Se descubrieron cinco GBM adicionales evaluados en el cribado de prevalencia de los presentes inventores con mutaciones R132H heterocigóticas y otros dos tumores adicionales con una tercera mutación distinta que afectaba al mismo residuo de aminoácido, R132S (figura 1; tabla 4). El residuo R132 se conserva en todas las especies conocidas y se localiza en el sitio de unión del sustrato, formando la interacción hidrófila con el carboxilato alfa del isocitrato (figura 2) (42, 45).

Se hicieron varias observaciones importantes sobre las mutaciones de la IDH1 y su potencial importancia clínica. En primer lugar, las mutaciones en la IDH1 se produjeron preferentemente en pacientes más jóvenes con GBM, con una edad media de 33 años para los pacientes con la IDH1 mutada, en comparación con 53 años para los pacientes con la IDH1 de tipo salvaje (P <0,001, prueba t, tabla 4). En pacientes menores de 35 años de edad, casi el 50% (9 de 19) tenían mutaciones en la IDH1. En segundo lugar, las mutaciones en la IDH1 se encontraron en casi todos los pacientes con GBM secundarios (mutaciones en 5 de 6 pacientes con GBM secundaria, en comparación con 7 de 99 pacientes con GBM primarias, p <0,001, prueba binomial), incluyendo los cinco pacientes con GBM secundario menores de 35 años de edad. En tercer lugar, los pacientes con mutaciones de la IDH1 tenían un pronóstico mejorado de forma significativa, con una mediana de supervivencia global de 3,8 años, en comparación con 1,1 años para los pacientes con IDH1 de tipo salvaje (P <0,001, prueba de rango logarítmico). Aunque la juventud y el TP53 mutado son conocidos por ser factores de pronóstico positivo para pacientes con GBM, esta asociación entre la mutación de la IDH1 y la mejora de la supervivencia se observó incluso en los pacientes menores de 45 años de edad (figura 3, P <0,001, prueba de rango logarítmico), así como en el subgrupo de pacientes jóvenes con mutaciones de TP53 (P <0,02, prueba de rango logarítmico).

Referencias y Notas

La divulgación de cada referencia citada se incorpora expresamente en el presente documento.

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EJEMPLO 11

Materiales y procedimientos

Selección de gen

Se realizó la secuenciación de exones codificantes de proteínas de 23.781 transcritos que representan a 20.735 genes únicos. Este conjunto comprendió 14.554 transcritos de la base de datos de la secuencia codificante de consenso altamente conservada (CCDS) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/), otras 6.019 transcritos de la base de datos de secuencia de referencia (RefSeq) (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/RefSeq/) y 3.208 transcritos adicionales con marcos de lectura abierta intactos de la base de datos Ensembl (http://www.ensembl.org/). Se excluyeron los transcritos de los genes que se encuentran en el cromosoma Y o se duplicaron con precisión dentro del genoma. Tal como se detalla a continuación, se secuenciaron con éxito 23.219 transcritos que representan a

20.661 genes.

Recursos bioinformáticos

Se adquirieron las coordenadas de genes y secuencias de la Secuencia codificante de consenso (Release 1), RefSeq (versión 16, marzo de 2006) y Ensembl (versión 31) del sitio de Bioinformática Genómico Santa Cruz UCSC (http://genome.ucsc.edu). Las posiciones que se mencionan en las tablas complementarias corresponden a hg17 Santa Cruz UCSC, versión 35.1. Los polimorfismos de nucleótido único utilizados para eliminar SNP conocidos fueron los presentes en dbSNP (versión 125) que había sido validada por el proyecto HapMap. Se utilizó BLAT y PCR informáticamente (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPer) para realizar búsquedas de homología en los genomas humanos y de ratón.

Diseño de cebadores

Se utilizó el software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) para generar cebadores a no menos de 50 pares de bases de los límites de diana, generando de productos de 300 a 600 pb. Los exones superiores a 350 pb se dividieron en varios amplicones superpuestos. Se utilizaron PCR informática y BLAT para seleccionar pares de cebadores que producen un solo producto de PCR a partir de una posición genómica única. Los pares de cebadores para regiones duplicadas que dan múltiples resultados de PCR informático o BLAT se rediseñaron en las posiciones que eran máximamente diferentes entre la diana y las secuencias duplicadas. Se añadió un cebador universal (M13F, 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3’; SEQ ID NO: 136) en el extremo 5’ del cebador con el menor número de repeticiones de mononucleótidos o dinucleótidos o entre él mismo y la región diana. Las secuencias de los cebadores utilizadas en este estudio se enumeran en la tabla S1 disponible en línea en Science, 26 Septiembre de 2008: vol. 321. no. 5897, págs. 1807 -1812.

Muestras de ADN de glioblastoma multiforme (GBM)

Se obtuvo ADN tumoral de xenoinjertos de GBM y tumores primarios, con el ADN normal emparejado para cada caso obtenido a partir de muestras de sangre periférica, tal como se ha descrito anteriormente (1). El cribado de detección comprendió 22 muestras de tumores (15 xenoinjertos y 7 tumores primarios), incluyendo el cribado de prevalencia otras 83 muestras (53 xenoinjertos y 30 tumores primarios). Información clínica adicional con respecto a las muestras del cribado de detección y prevalencia está disponible en la tabla S2, disponible en línea en Science, 26 de Septiembre 2008: vol. 321. no. 5897, págs. 1807 – 1812. A todas las muestras se les dio el diagnóstico histológico de glioblastoma multiforme (GBM; grado IV de la Organización Mundial de la Salud), a excepción de dos muestras del cribado de detección que se registraron como "glioma de grado elevado, no especificado de otra manera". Las muestras se clasificaron como recurrentes para pacientes en los que un GBM había sido diagnosticado, como mínimo, 3 meses antes de la cirugía, cuando se obtuvo la muestra de GBM de estudio. Hubo 3 GBM recurrentes en el cribado de detección y 15 en el cribado de prevalencia. Las muestras se clasificaron como secundarias para pacientes en los que un glioma de grado inferior (grado I-III de la OMS) se había confirmado histológicamente, como mínimo, 1 año antes de la cirugía, cuando se obtuvo la muestra de GBM de estudio. Una muestra del cribado de detección y 5 muestras de cribado de prevalencia se clasificaron como secundarias.

Tabla 5. Visión de conjunto de las muestras de GBM utilizadas en los cribados de prevalencia y detección Detección Validación Total

Número de muestras

22 83 105

Edad del paciente

Edad media (años)

48,6 51,7 51,0

Mediana de edad (años)

45 53 52

Sexo del paciente

Hombre

14 55 69

Mujer

8 28 36

Fuente de la muestra

Xenoinjerto

15 53 68

Tumor primario

7 30 37

Subclase de GBM

Recurrente

3 15 18

Recurrente con quimioterapia anterior

1 10 11

Secundario

1 5 6

Se obtuvo la información clínica pertinente, incluyendo la fecha de nacimiento, la fecha de la muestra de GBM de estudio obtenida, la fecha de diagnóstico original del GBM (si es diferente a la fecha en la que se obtuvo la muestra de GBM, como en el caso de GBM recurrentes), la fecha y la patología del diagnóstico anterior del glioma de grado inferior (en los casos de GBM secundarios), la administración de radioterapia y/o quimioterapia antes de la fecha en la que se obtuvo la muestra de GBM, la fecha del último contacto con el paciente y el estado del paciente en el último contacto. Todas las muestras se obtuvieron según la Ley de transferencia y responsabilidad del seguro de salud (HIPAA). Todas las muestras se obtuvieron según la Ley de transferencia y responsabilidad del seguro de salud (HIPAA). Tal como se ha descrito anteriormente, se confirmó la coincidencia del par tumor-normal escribiendo nueve loci STR utilizando el sistema PowerPlex 2.1 (Promega, Madison, Wisconsin) y las identidades de las muestras se comprobaron a lo largo de los cribados de detección y la prevalencia mediante la secuenciación del exón 3 del gen HLA-A. La PCR y la secuenciación se llevaron a cabo tal como se describe en (1).

Análisis estadístico de los datos clínicos

Se utilizó tejido normal maligno y emparejado de 105 pacientes de GBM para el análisis genético. La información clínica completa (es decir, toda la información clínica pertinente, como la fecha del diagnóstico inicial de GBM, fecha de la muerte o el último contacto) estaba disponible para 91 de los 105 pacientes. De estos 91 pacientes, cinco (todos con la IDH1 de tipo salvaje) murieron durante el primer mes después de la cirugía y se excluyeron del análisis (Br308T, Br246T, Br23X, Br301T, Br139X), al igual que un solo paciente (Br119X) con una presunta cura quirúrgica (también con la IDH1 de tipo salvaje) que estaba vivo en el último contacto, aproximadamente, 10 años después del diagnóstico. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se compararon mediante la prueba de rango logarítmico de Mantel Cox. Las proporciones de riesgo se calcularon utilizando el procedimiento de Mantel-Haenszel. Las siguientes definiciones se utilizaron en los cálculos de agrupación de los pacientes de GBM y el análisis de supervivencia: 1) La edad del paciente se refiere a la edad en la que se obtuvo la muestra del GBM del paciente. 2) GBM recurrente designa un GBM que fue extirpado más de 3 meses después de un diagnóstico anterior de GBM. 3) GBM secundario designa un GBM que fue extirpado más de 1 año después de un diagnóstico anterior de un glioma de grado inferior (OMS I-III). 4) La supervivencia global se calculó utilizando la fecha de diagnóstico y fecha de la muerte o el último contacto con los pacientes de GBM. Todos los intervalos de confianza se calcularon al nivel del 95%.

Cribado de detección de mutaciones

Se amplificaron genes CCDS, RefSeq y Ensembl en 22 muestras de GBM y una muestra de control de tejidos normales de uno de los pacientes de GBM. Todas las secuencias de codificación y los 4 pb colindantes se analizaron mediante Mutations Surveyor (SoftGenetics, State College, Pensilvania) acoplado a una base de datos relacional (Microsoft SQL Server). Para un amplicón que se va a analizar adicionalmente, se requiere que, como mínimo, tres cuartas partes de los tumores tengan el 90% o más de las bases en la región de interés con una puntuación de calidad de Phred de 20. En los amplicones que superaron este control de calidad, se eliminaron las mutaciones idénticas a las observadas en la muestra normal, así como polimorfismos de nucleótido único conocidos. A continuación se inspeccionó visualmente el cromatograma de secuenciación de cada mutación detectada, para eliminar los resultados de falsos positivos por el software. Cada mutación supuesta se reamplificó y secuenció en el ADN del tumor para eliminar artefactos. Se amplificó y se secuenció el ADN de tejidos normales del mismo paciente en el que se identificó la mutación para determinar si las mutaciones eran somáticas. Cuando se encontró una mutación, se utilizó BLAT para buscar exones relacionados en los genomas humanos y de ratón, con el objeto de garantizar que las mutaciones supuestas fueran el resultado de la amplificación de secuencias homólogas. Cuando había una secuencia similar con el 90% de identidad sobre el 90% de la región diana, se llevaron a cabo etapas adicionales. Las mutaciones que podían surgir de las duplicaciones humanas se reamplificaron utilizando cebadores

diseñados para distinguir entre las dos secuencias. Se excluyeron mutaciones no observadas utilizando el nuevo par de cebadores. El resto se incluyó siempre que la base mutante no estuviera presente en la secuencia homóloga identificada por BLAT. Las mutaciones observadas originalmente en xenoinjertos de ratón se reamplificaron en el ADN de los tumores primarios y se incluyeron si la mutación estaba presente en los tumores primarios o si el mutante no fue identificado en la secuencia homóloga de ratón identificada por BLAT.

Cribado de prevalencia de las mutaciones

Además, se evaluaron un conjunto de 20 genes mutados que se habían identificado en el cribado de detección en un segundo cribado (prevalencia), que incluía 83 GBM adicionales (tabla S2). Los genes seleccionados habían mutado en, como mínimo, dos tumores y tenían frecuencias de mutación de más de 10 mutaciones por Mb de ADN tumoral secuenciado. Los cebadores utilizados (tabla S1, disponible en línea en Science, 26 de Septiembre de 2008: vol. 321. no. 5897, págs. 1807 -1812) y los procedimientos de análisis y la duración de mutaciones potenciales fueron los mismos que en el cribado de detección. Todas las mutaciones somáticas que se observan en el cribado de prevalencia se presentan en la figura 10, tabla S4.

Análisis del número de copias

Se utilizó para analizar las muestras tumorales el ensayo Illumina Infinium II Whole Genome Genotyping Assay que utiliza la plataforma BeadChip en 1.072.820 (1M) de loci SNP. Todas las posiciones de SNP se basaron en la versión de la secuencia de referencia del genoma humano hg18 (NCBI Build 36, marzo de 2006). El ensayo de genotipado comienza con la hibridación a un oligonucleotido de 50 nucleótidos, seguido de una extensión de una sola base fluorescente de dos colores. Los archivos de imagen de intensidad de fluorescencia se procesaron utilizando software Illumina BeadStation para proporcionar valores de intensidad normalizados (R) para cada posición de SNP. Para cada SNP, se comparó el valor de intensidad experimental normalizado (R) con los valores de intensidad para aquel SNP a partir de un conjunto de entrenamiento de muestras normales y se representó como una proporción (denominada la "proporción de Log R") de log2 (conjunto Rexperimental/Rentrenamiento).

El conjunto de datos de SNP se analizó mediante modificaciones de un procedimiento descrito anteriormente (2). Se definieron las eliminaciones homocigóticas (HD) como tres o más SNP consecutivos con un valor de proporción de LogR de -2. Se consideró al primer y último SNP de la región HD los límites de alteración para los análisis posteriores. Para eliminar los artefactos de chip y los posibles polimorfismos de número de copias, se eliminaron todas las HD que se incluyeron en las bases de datos de polimorfismo de número de copias. Las eliminaciones homocigóticas adyacentes separadas por tres o menos SNP se consideraron parte de la misma eliminación, así como las HD dentro de 100.000 pares de bases entre sí. Para identificar los genes diana afectados por HD, se comparó la localización de exones de codificación en las bases de datos RefSeq, CCDS y Ensembl con las coordenadas genómicas de las HD observadas. Se consideró que cualquier gen con una parte de su región de codificación contenida dentro de una eliminación homocigótica estaba afectado por la eliminación.

Tal como se indica en (2), las amplificaciones se definen por las regiones que contienen tres SNP con una proporción de LogR promedio de 0,9, con, como mínimo, un SNP que tiene una proporción de LogR de 1,4. Al igual que con las HD, se excluyeron todas las amplificaciones supuestas que tenían límites idénticos en múltiples muestras. Dado que las amplificaciones focales son más propensas a ser útiles en la identificación de genes diana específicos, se utilizó un segundo conjunto de criterios para eliminar amplificaciones complejas, grandes regiones cromosómicas o cromosomas enteros que mostraron aumentos del número de copias. Amplificaciones de más de 3 Mb de tamaño y grupos de amplificaciones cercanas (dentro de 1 Mb) que también eran de más de 3 Mb de tamaño se consideraron complejas. Las ampliaciones o grupos de amplificaciones que se produjeron con una frecuencia de 4 amplificaciones distintas en una región de 10 Mb o 5 amplificaciones por cromosoma, se consideraron como complejas. Las amplificaciones que quedaron después de estas etapas de filtrado se consideraron amplificaciones focales y fueron las únicas incluidas en los análisis estadísticos posteriores. Para identificar los genes codificantes de proteínas afectados por las amplificaciones, se comparó la ubicación de las posiciones de inicio y final de cada gen dentro de las bases de datos RefSeq, CCDS y Ensembl con las coordenadas genómicas de las amplificaciones observadas. Dado que las amplificaciones que contenían sólo una fracción de un gen son menos propensas a tener una consecuencia funcional, sólo se consideraron los genes cuyas regiones de codificación enteras estaban incluidas en las amplificaciones observadas.

Estimación de las tasas de mutaciones pasajeras

A partir de las mutaciones sinónimas observadas en el cribado de detección, se estimó un límite inferior de la tasa de pasajeras. El límite inferior se definió como el producto de la tasa de mutaciones sinónimas y la proporción NS:S (1,02) observada en la base de datos HapMap de polimorfismos humanos. La tasa calculada de 0,38 mutaciones/Mb secuenciado con éxito es probablemente una subestimación, debido a que la selección contra mutaciones no sinónimas puede ser más estricta en la línea germinal que en las células somáticas. Un límite superior se calculó a partir del número total observado de mutaciones no sinónimas/Mb después de excluir los genes más altamente mutados, que se sabe de estudios anteriores que eran conductoras (TP53, PTEN y RB1). La tasa de mutaciones pasajeras resultante de 1,02 mutaciones no sinónimas/Mb representa una sobreestimación de la tasa de base, dado

que era probable que algunas de las mutaciones en genes distintos de TP53, PTEN,y RB1 fueran conductoras. Se obtuvo una medida “Mid” de 0,70 mutaciones/Mb a partir del promedio de las proporciones límite inferior y superior. Para las comparaciones de la cantidad y tipo de mutaciones somáticas identificadas en los cribados de detección y de prevalencia, se utilizaron pruebas t de dos muestras entre porcentajes.

Análisis de expresión

Se generaron marcas SAGE utilizando un kit de Digital Gene Expression-Tag Profiling (Illumina, San Diego, California) según lo recomendado por el fabricante. En resumen, se purificó el ARN utilizando isotiocianato de guanidina y se realizó el transcrito inversa con perlas magnéticas oligo-dT en, aproximadamente, 1 µg de ARN total de cada muestra. La síntesis de la segunda cadena se consiguió a través de mellado con ARNsa H y la extensión con ADN polimerasa I. El ADNc bicatenario se digirió con la enonucleasa de restricción Nla III y se ligó a un adaptador que contenía un sitio de restricción Mme I. Después de la digestión del Mme I, se ligó un segundo adaptador, y la construcción de ADNc ligado al adaptador se enriqueció con 18 ciclos de PCR y los fragmentos de 85 pb se purificaron a partir de un gel de poliacrilamida. El tamaño de la biblioteca se estimó mediante PCR en tiempo real y las marca se secuenciaron en un sistema Genome Analyzer (Illumina, San Diego, California).

Análisis estadístico

Visión general del análisis estadístico

Los análisis estadísticos se centraron en la cuantificación de la evidencia de que las mutaciones en un gen o un conjunto biológicamente definido de genes reflejan una tasa de mutaciones subyacente que es mayor que la tasa de pasajeras. En ambos casos, el análisis integra datos de mutaciones puntuales con datos sobre alteraciones del número de copias (CNA). La metodología para el análisis de mutaciones puntuales se basa en lo descrito en (3), mientras que la metodología para la integración a través de mutaciones puntuales y de la CNA se basa en (2). En el presente documento, se da a conocer un resumen de autocontenido en el mismo, ya que se requirieron varias modificaciones a los procedimientos descritos anteriormente.

Análisis estadísticos de los genes CAN

El perfil de la mutación de un gen se refiere al número de cada uno de los veinticinco tipos de mutaciones específicas de contexto definidas anteriormente (3). La evidencia sobre los perfiles de mutación se evaluó utilizando un análisis empírico de Bayes (4) comparando los resultados experimentales con una distribución de referencia que representa un genoma compuesto solamente de genes pasajeros. Esto se obtiene mediante la simulación de las mutaciones a la tasa de pasajeras de una manera que replica con precisión el plan experimental. En concreto, se consideraron uno por uno cada gen y se simuló el número de mutaciones de cada tipo a partir de una distribución binomial con probabilidad de éxito igual a la tasa de pasajeras específica del contexto. El número de nucleótidos disponibles en cada contexto es el número de nucleótidos secuenciados con éxito para ese contexto y gen particular en las muestras estudiadas. Al considerar las mutaciones no sinónimas que no sean “indel”, el enfoque se centró en los nucleótidos en situación de riesgo, tal como se ha definido anteriormente (3).

Utilizando estos conjuntos de datos simulados, se evaluaron las probabilidades de pasajeras para cada uno de los genes que se analizaron en este estudio. Estas probabilidades de pasajeras representan declaraciones acerca de genes específicos en lugar de grupos de genes. Cada probabilidad de pasajeras se obtiene a través de una lógica relacionada con la de las proporciones de probabilidad: se compara la probabilidad de observar una puntuación particular en un gen si ese gen es un pasajero con la probabilidad de observarlo en los datos reales. La puntuación específica de gen utilizado en el análisis de los presentes inventores se basa en la prueba de proporción de verosimilitud (LRT) para la hipótesis nula de que, para el gen en cuestión, la tasa de mutaciones sea la misma que la tasa de mutaciones pasajeras. Para obtener una puntuación, simplemente se transformó la LRT en s = log (LRT). Las puntuaciones más elevadas indican una evidencia de tasas de mutaciones por encima de las tasas de pasajeras. Este enfoque general para evaluar las probabilidades de pasajeras sigue el descrito por Efron y Tibshirani (4). En concreto, para cualquier puntuación s dada, F(s) representa la proporción de genes simulados con las puntuaciones más elevadas que s en los datos experimentales, F0 es la proporción correspondiente en los datos simulados, y p0 es la proporción total estimada de genes con pasajeras (descrita a continuación). La variación a través de las simulaciones es pequeña pero no obstante se generaron y cotejaron 100 conjuntos de datos para estimar F0. A continuación, se calcularon numéricamente las funciones de densidad f y f0 correspondientes a F y F0 y se calculó, para cada puntuación de s, la relación P0 • f0(s) /f(s), denominada también como "tasa de falsa detección local" (4). La estimación de la densidad se realizó utilizando la función de "densidad" en el lenguaje de programación estadística R con la configuración predeterminada. Los cálculos de probabilidad de pasajeras dependen de una estimación de p0, la proporción de pasajeras verdaderas. La implementación de los presentes inventores busca dar una cota superior a p0 y proporcionar de este modo estimaciones muy conservadoras de la probabilidad de pasajeras. Con este fin se ha establecido p0 = 1. También se ha limitado la probabilidad de pasajeras para que cambiara de forma monótona con la puntuación comenzando con los valores más bajos y estableciendo de forma recurrente valores que disminuyan en el siguiente valor a su derecha. De manera similar, se limitaron las probabilidades de pasajeras a cambiar de forma monótona con la tasa de pasajeras.

Un paquete de código abierto para la realización de estos cálculos en el entorno estadístico R, llamado CancerMutationAnalysis, está disponible en http://astor.som.jhmi.edu/~gp/software/CancerMutationAnalysis/cma.htm. Una explicación matemática detallada de la implementación de los presentes inventores específica se proporciona en (5) y las cuestiones analíticas generales se discuten en (6).

Análisis estadístico de CNA. Para cada uno de los genes implicados en las ampliaciones o eliminaciones, se ha cuantificado además la fuerza de la evidencia de que conducen a tumorigénesis a través de estimaciones de las probabilidades de pasajeras. En cada caso, se obtuvo la probabilidad de pasajeras como una probabilidad a posteriori que integra información del análisis de las mutaciones somáticas de (3) con los datos presentados en este artículo. Las probabilidades de pasajeras derivadas del análisis de mutaciones puntuales sirven de probabilidades a priori. Estas están disponibles para los tres escenarios diferentes de las tasas de mutaciones pasajeras y las puntuaciones se presentan por separado para cada uno en la figura 10, tabla S3. Posteriormente se evaluó, una proporción de probabilidad para "conductora" frente a "pasajera" utilizando como prueba el número de muestras en las que se ha descubierto que un gen se ha amplificado (o eliminado). El término pasajera es la probabilidad de que el gen en cuestión se amplifique (o elimine) a la frecuencia observada. Para cada muestra, se comenzó calculando la probabilidad de que las amplificaciones (y eliminaciones) observadas incluyeran el gen en cuestión por casualidad. Se requiere la inclusión de todos los SNP disponibles para la amplificación, mientras que cualquier superposición de SNP es suficiente para las eliminaciones. En concreto, si en una muestra específica N de SNP se escribe y se encuentran K amplificaciones, cuyos tamaños, en términos de SNP que participan, son: A1... AK, un gen con G SNP se incluirá al azar con probabilidad (A1 -G + 1)/N + .... + (AK -G + 1)/N para amplificaciones y (A1 + G -1)/N + .... + (AK + G -1)/N para las eliminaciones. A continuación, se calculó la probabilidad del número observado de amplificaciones (o eliminaciones) suponiendo que las muestras son independientes pero no variables aleatorias de Bernoulli idénticamente distribuidas, utilizando el algoritmo de Thomas y Traub (7). El enfoque de los presentes inventores para evaluar la probabilidad bajo la hipótesis nula es muy conservadora, ya que supone que todas las eliminaciones y amplificaciones observadas sólo incluyen pasajeras. El término conductora de la proporción de probabilidad se aproximó al término de pasajeras, después de multiplicar las tasas específicas de pasajeras de la muestra anterior por un factor específico que refleja el aumento de interés del gen (hipótesis alternativa). Este aumento se calcula por la relación entre la tasa de eliminación empírica del gen y la tasa de eliminación general.

Este enfoque combinatorio hace una suposición de aproximación de la independencia de las amplificaciones y eliminaciones. En realidad, los genes amplificados no se pueden eliminar, por lo que técnicamente se viola la independencia. Sin embargo, debido al número relativamente pequeño de acontecimientos de amplificación y eliminación, esta suposición es sostenible para los fines del análisis de los inventores. La inspección de la probabilidad, en una escala logarítmica, sugiere que es más o menos lineal en el número total de eventos, dando apoyo a la validez de esta aproximación como un sistema de puntuaciones.

Análisis de las rutas y los grupos de genes mutados

Se obtuvieron cuatro tipos de datos de la base de datos MetaCore (GeneGo, Inc., St. Joseph, Michigan): mapas de ruta, procesos de Ontología de genes (GO), redes de proceso GeneGo y las interacciones proteína-proteína. La pertenencia de cada uno de los 23.781 transcritos en estas categorías fue recuperada de las bases de datos utilizando identificadores RefSeq. En los mapas de ruta GeneGo, se identificaron 22.622 relaciones, que involucran a 4.175 transcritos y 509 rutas. Para los procesos de Ontología de genes, se identificaron un total de 66.397 relaciones de parejas, que involucran 12.373 transcritos y 4.426 grupos GO. Para las redes de proceso GeneGo, se identificaron un total de 23.356 relaciones de pares, que involucran 6.158 transcritos y 127 procesos. Se evaluaron también los productos proteicos predichos de cada gen mutado con respecto a sus interacciones físicas con las proteínas codificadas por otros genes mutados, tal como se deduce a partir de la base de datos MetaCore.

Para cada uno de los conjuntos de genes considerados, se cuantificó la fuerza de la evidencia de que incluían una proporción más elevada que el promedio de conductores de carcinogénesis después de considerar el tamaño del conjunto. Con este fin, se han ordenado los genes con una puntuación basada en la probabilidad de pasajeras combinada descrita anteriormente (teniendo en cuenta las mutaciones, eliminaciones homocigóticas y amplificaciones). Se comparó la clasificación de los genes contenidos en el conjunto con la clasificación de los que están fuera, utilizando la prueba de Wilcoxon, tal como se aplica en el paquete Limma en Bioconductor (8) y se corrigió a continuación para la multiplicidad por el método de valor de q con un alfa de 0,2 (9).

Análisis bioinformático

Visión general del análisis bioinformático

Se ha desarrollado una nueva fuente de software de bioinformática (que se muestra a continuación) para calcular:

(1) una puntuación para la clasificación de las mutaciones somáticas de sentido erróneo por la probabilidad de que sean pasajeras (LSMUT). Las puntuaciones se basan en propiedades derivadas de secuencias de proteínas,

cambios de residuos de aminoácidos y posiciones dentro de las proteínas; y (2) las anotaciones cualitativas de cada mutación, sobre la base de modelos de homología de estructura de proteínas.

Puntuaciones de mutación

Se evaluaron varios algoritmos de aprendizaje automático supervisados para identificar uno que distinguiera de forma fiable entre los polimorfismos presumiblemente neutrales y las mutaciones asociadas con el cáncer. El mejor algoritmo era un “Bosque Aleatorio” (12), que se entrenó en 2.840 mutaciones asociadas con cáncer y 19.503 polimorfismos de páginas SwissProt Variant (13) utilizando software “Bosque Aleatorio paralelo” (PARF) [http: //www.irb.hrien/ CIR/projects/info/PARF]. Se identificaron las mutaciones asociadas con cáncer mediante el análisis de las palabras clave "cáncer" "carcinoma", "sarcoma", "blastoma", "melanoma", "linfoma", "adenoma" y "glioma". Para cada mutación o polimorfismo, se calcularon 58 características numéricas y categóricas (véase la tabla posterior). Se encontraron dos mutaciones presentes en las muestras tumorales de GBM en las páginas SwissProt Variant y se eliminaron de los datos de entrenamiento. Debido a que el conjunto de entrenamiento contenía, aproximadamente, 7 veces más polimorfismos que mutaciones asociadas con cáncer, se utilizaron coeficientes de ponderación para sobreponderar a la clase minoritaria (el coeficiente de ponderación de una mutación asociada al cáncer fue de 5,0 y el coeficiente de ponderación de un polimorfismo fue de 1,0). El parámetro “mtry” fue ajustado a 8 y el tamaño del bosque a 500 árboles. Los valores de características que faltaban se rellenaron utilizando el algoritmo de imputación basado en la proximidad del Bosque Aleatorio (12) con seis iteraciones. Todos los ajustes de parámetros completos y todos los datos utilizados para construir el Bosque Aleatorio están disponibles bajo petición.

A continuación se aplicó el bosque entrenado a 594 mutaciones de sentido erróneo del GBM y a un grupo de control de 142 mutaciones de sentido erróneo generadas aleatoriamente en los transcritos de 78 genes que se encontraron que no habían mutado en 11 cánceres colorrectales (5). Para cada mutación, se calcularon las 58 características de predicción tal como se ha descrito anteriormente y se utilizó el bosque entrenado para calcular una puntuación predictiva para la clasificación de las mutaciones. En concreto, las puntuaciones utilizadas son la fracción de árboles que “votaron” a favor de la clase "polimórfica" para cada mutación.

Para evaluar la hipótesis de que las puntuaciones de las mutaciones de sentido erróneo en los genes CAN mejor clasificados se distribuyeron de manera diferente que las mutaciones de sentido erróneo aleatorias, se aplicó una prueba modificada de Kolmogorov-Smirnov (KS), en la que los lazos se rompen mediante la adición de un número aleatorio muy pequeño para cada puntuación. Se descubrió que las puntuaciones de las mutaciones de sentido erróneo en los 13 primeros genes CAN fueron significativamente diferentes que las mutaciones en el conjunto de control (P <0,001).

Se estimó que las mutaciones con puntuaciones menores de 0,7 (aproximadamente el 15% de las mutaciones de sentido erróneo) es poco probable que fueran pasajeras. El umbral se basa en la similitud supuesta de las pasajeras a los polimorfismos neutros en el conjunto de SwissProt Variant, de los cuales sólo, aproximadamente, el 2% tenían puntuaciones menores de 0,7. Se obtuvieron las puntuaciones de SwissProt Variants mediante la partición aleatoria

en dos partes, entrenando un Bosque Aleatorio en cada una (tal como se ha descrito anteriormente) y posteriormente calificando cada parte con el Bosque Aleatorio entrenado en la otra.

Modelos de homología

5 Las traducciones proteicas de los transcritos de ARNm que se había descubierto que tenían mutaciones somáticas de sentido erróneo se introdujeron en el software de construcción de modelos de homología ModPipe 1.0/MODELLER 9.1 (14, 15). Para cada mutación, se identificaron todos los modelos que incluían la posición mutada. Si se produjo más de un modelo para una mutación, se seleccionó el modelo que tenía la identidad de

10 secuencia más alta con su estructura de plantilla. El modelo resultante se utilizó para calcular la accesibilidad al disolvente del residuo de tipo salvaje en la posición mutada, utilizando el software DSSP (16). Los valores de accesibilidad se normalizaron dividiendo por la accesibilidad de disolvente máxima del residuo para cada tipo de cadena lateral en un tripéptido Gly-X-Gly (17). Se consideraron que accesibilidades a disolventes superiores al 36% eran "expuestas", las que están entre el 9% y el 35% se consideraron "intermedias" y aquellas inferiores al 9% se

15 consideraron "enterradas". El DSSP también se utilizó para calcular la estructura secundaria de la posición mutada. Se utilizó las bases de datos LigBase (18) y PiBase (19) para identificar posiciones de residuos mutados en los modelos de homología que estaban cerca de ligandos o interfaces de dominio en las posiciones equivalentes de sus estructuras plantilla. Por último, para cada mutación, se generó una imagen de la mutación mapeada sobre su modelo de homología con UCSF Chimera (20). Las imágenes y la información asociada para cada mutación están

20 disponibles en http://karchinlab.org/Mutants/ CAN-genes/pancreatic/Pancreatic_cancer.html). Las coordenadas modelo están disponibles bajo petición.

Tabla 6. Las 58 características numéricas y categóricas utilizadas para entrenar al Bosque Aleatorio

#

Característica Descripción

1

Cambio de carga neta de residuos El cambio en la carga formal resultante de la mutación.

2

Cambio de volumen neto de residuos El cambio en el volumen de residuos resultante de la mutación (18).

3

Cambio hidrofobicidad neta de residuos El cambio en la hidrofobicidad de los residuos resultante de la sustitución (19).

4

Puntuación del modelo de conservación posicional oculto de Markov (HMM) Esta característica se calcula basándose en el grado de conservación del residuo estimado a partir de un alineamiento de secuencias múltiples construido con un software SAM-T2K (20), utilizando la proteína en la que la mutación se produce como la secuencia origen (21). Los alineamientos SAM-T2K son alineamientos grandes, de nivel superfamilia que incluyen homólogos relacionados de forma distante (así como homólogos cercanos y ortólogos) de la proteína de interés.

5

Entropía de alineamiento HMM La entropía de Shannon calculada para la columna del alineamiento de secuencias múltiples SAM-T2K, correspondiente a la ubicación de la mutación (21).

6

Entropía relativa de alineamiento HMM Diferencia en la entropía de Shannon calculada para la columna del alineamiento de secuencias múltiples SAM-T2K (correspondiente a la ubicación de la mutación) y la de una distribución de base de residuos de aminoácidos calculada a partir de una muestra grande de alineamientos de secuencias múltiples (21).

7

Puntuación de compatibilidad para la sustitución de aminoácidos en la columna de un alineamiento de secuencias múltiple de ortólogos. Estos alineamientos de secuencias múltiples se calculan utilizando grupos de proteínas ortólogas de la base de datos OMA (22), que están alineados con el software T-Coffee (23). La puntuación de compatibilidad para la mutación en la columna de interés se calcula como: (P (residuo más frecuente en la columna) -2*P (tipo salvaje) + P(mutante) + P(eliminación) -1) / (5 * número de residuos de aminoácidos únicos en la columna)

8

Puntuación de Grantham La puntuación de sustitución de Grantham para el tipo salvaje => transición mutante (24).

9-

Accesibilidad al disolvente Estas características comprenden la probabilidad de que el residuo de

11

predicha del residuo tipo salvaje sea enterrado, intermedio o expuesto según lo predicho por una red neuronal entrenada con el software Predict-2nd (20) en un conjunto de 1763 proteínas con estructuras cristalinas de rayos X de alta resolución que comparten menos del 30% de homología (25).

1214

Contribución predicha a la estabilidad proteica Estas características comprenden la probabilidad de que el residuo de tipo salvaje contribuya a la estabilidad global de las proteínas de una manera que es altamente estabilizante, promedio o desestabilizante, según lo predicho por una red neuronal entrenada con el software Predict-2nd (20) en un conjunto de 1763 proteínas con menos del 30% de homología. Las estimaciones de estabilidad para los datos de entrenamiento de la red neuronal se calcularon utilizando el campo de

fuerza FoldX (26).

1517

Flexibilidad predicha (Bfactor) Estas características comprenden la probabilidad de que la cadena principal del residuo de tipo salvaje sea rígida, intermedia o flexible, tal como se predijo por una red neuronal entrenada con el software Predict2nd (20) en un conjunto de 1763 proteínas con menos del 30% de homología. Se estimaron las flexibilidades para los datos de entrenamiento de la red neuronal basadas en los factores de temperatura normalizados, calculados utilizando el procedimiento de (27) a partir de los archivos de estructura cristalina de rayos X.

1820

Estructura secundaria predicha Estas características comprenden la probabilidad de que la estructura secundaria de la región en la que existe el residuo de tipo salvaje sea una hélice, bucle o hebra, tal como se predijo por una red neuronal entrenada con software Predict-2nd (20) en un conjunto de 1763 proteínas con estructuras cristalinas y con menos del 30% de homología.

21

Cambio en la hidrofobicidad Cambio en la hidrofobicidad del residuo debido a la transición tipo salvaje → mutante.

22

Cambio en el volumen Cambio en el volumen del residuo debido a la transición tipo salvaje → mutante.

23

Cambio en la carga Cambio en la carga formal del residuo debido a la transición tipo salvaje → mutante.

24

Cambio en la polaridad Cambio en la polaridad del residuo debido a la transición tipo salvaje → mutante.

25

Puntuación de sustitución EX Puntuación de la sustitución de aminoácidos a partir de la matriz EX (28)

26

Puntuación de sustitución PAM250 Puntuación de la sustitución de aminoácidos a partir de la matriz PAM250 (29)

27

Puntuación de sustitución BLOSUM 62 Puntuación de la sustitución de aminoácidos a partir de la matriz BLOSUM 62 (30)

28

Puntuación de sustitución MJ Puntuación de la sustitución de aminoácidos a partir de la matriz de energía de contacto Miyazawa-Jernigan (28, 31)

29

Recuento de mutaciones HGMD2003 Número de veces que la sustitución tipo salvaje → mutante se produce en la base de datos de Mutaciones del Genoma Humano, versión 2003 (28, 32).

30

Recuento de mutaciones VB Puntuación de la sustitución de aminoácidos a partir de la matriz VB (Venkatarajan y Braun) (28, 33)

3134

Probabilidad de ver el residuo de tipo salvaje en la posición primera, intermedia o última de una tripla de aminoácidos Calculada por frecuencias conjuntas de triplas de aminoácidos en proteínas humanas que se encuentran en UniProtKB (11)

3537

Probabilidad de ver el residuo mutante en la primera, intermedia o última posición de una tripla de aminoácidos Calculada por frecuencias conjuntas de triplas de aminoácidos en proteínas humanas que se encuentran en UniProtKB (11)

3840

Diferencia en la probabilidad de ver el tipo salvaje frente al residuo mutante en la posición primera, intermedia o última de una tripla de aminoácidos Calculada por frecuencias conjuntas de triplas de aminoácidos en proteínas humanas que se encuentran en UniProtKB (11)

41

Probabilidad de ver el tipo salvaje en el centro de una ventana de 5 residuos de aminoácidos Calculada por una cadena de Markov de quíntuplas de aminoácidos en proteínas humanas que se encuentran en UniProtKB (11)

42

Probabilidad de ver el mutante en el centro de una ventana de 5 residuos de aminoácidos Calculada por una cadena de Markov de quíntuplas de aminoácidos en proteínas humanas que se encuentran en UniProtKB (11)

4356

Características categóricas binarias de la tabla de características de la Base de Conocimientos UniProt para el producto proteico del transcrito Estas características dan anotaciones, conservadas a partir de la bibliografía, de los sitios de unión generales, sitios activos generales, sitios de unión de lípidos, metales, carbohidratos, ADN, fosfato y calcio, disulfuros, seleno-cisteínas, residuos modificados, residuos de propéptido, residuos de péptido señal, sitios mutagénicos conocidos, regiones transmembrana, regiones de composición parcial, regiones de repetición, motivos conocidos, y dedos de zinc. El número entero 1 indica que una característica está presente y el número entero 0 indica que está ausente en una posición mutada.

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D. K. Smith, P. Radivojac, Z. Obradovic, A. K. Dunker, G. Zhu, Protein Sci 12, 1060 (2003).

28.

L. Y. Yampolsky, A. Stoltzfus, Pac Symp Biocomput, 433 (2005).

29.

R. M. Schwartz, M. O. Dayhoff, Science 199, 395 (1978).

30.

S. Henikoff, J. G. Henikoff, Proc Natl Acad Sci U S A 89, 10915 (1992).

31.

S. Miyazawa, and Jernigan, R. L., Macromolecules, 534 (1985).

32.

P. D. Stenson y otros, Hum Mutat 21, 577 (2003).

33.

M. S. Venkatarajan, and Braun, W., Journal of Molecular Modeling, 445 (2001).

CLÁUSULAS

1. Procedimiento de caracterización de un tumor GBM en un sujeto humano, que comprende:

analizar un tumor GBM en un sujeto humano para identificar la presencia o ausencia de una mutación somática en

•

el codón 132 en la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1); o

•

el codón 172 en la isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2).

2.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R132H en la IDH1.

3.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R132S en la IDH1.

4.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R132C en la IDH1.

5.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R132L en la IDH1

6.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R132G en la IDH1.

7.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R172M en la IDH2.

8.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R172K en la IDH2.

9.

Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la mutación somática es R172G en la IDH2.

10. Procedimiento, según la cláusula 1, que comprende además la etapa de:

identificar el tumor como probable que sea un GBM secundario cuando la mutación somática está presente o un GBM primario cuando la mutación somática está ausente. 5

11. Procedimiento, según la cláusula 1, que comprende además la etapa de:

asignar un pronóstico más favorable (mayor esperanza de vida) cuando la mutación somática está presente o un pronóstico menos favorable (menor esperanza de vida) cuando la mutación somática está ausente. 10

12. Procedimiento, según la cláusula 1, que comprende además la etapa de:

asignar el sujeto a un grupo de ensayos clínicos sobre la base de presencia o ausencia de la mutación somática.

15 13. Procedimiento, según la cláusula 1, que comprende además la etapa de:

prescribir un inhibidor de la IDH1 o la IDH2 para tratar el tumor GBM.

14. Procedimiento, según la cláusula 1, que comprende además la etapa de:

20 administrar un inhibidor de la IDH1 o la IDH2 para tratar el tumor GBM.

15. Procedimiento, según la cláusula 13, en el que el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente a IDH1,

IDH2, o IDH1 e IDH2. 25

16. Procedimiento, según la cláusula 14, en el que el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente a IDH1, IDH2, o IDH1 e IDH2.

17. Procedimiento, según la cláusula 13, en el que el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente al 30 codón 132 de la IDH1, al codón 172 de la IDH2 o a ambos de dichos codones.

18. Procedimiento, según la cláusula 14, en el que el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente al codón 132 de la IDH1, al codón 172 de la IDH2 o ambos de dichos codones.

35 19. Procedimiento, según la cláusula 13, que comprende además: la prescripción de un agente de quimioterapia en concierto con el inhibidor de la IDH1.

20. Procedimiento, según la cláusula 14, que comprende además: la administración de un agente de quimioterapia

en concierto con el inhibidor de la IDH1. 40

21. Procedimiento, según la cláusula 1, que comprende: amplificar, como mínimo, una parte de:

• el gen IDH1 o el ADNc del ARNm de la IDH1, comprendiendo dicha parte el codón 132 o el nucleótido 394 ó 395 del transcrito de la IDH1; o

45 • el gen IDH2 o el ADNc del ARNm de la IDH2, comprendiendo dicha parte el codón 172 o el nucleótido 515 del transcrito de la IDH2.

22. Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la etapa de determinación utiliza un anticuerpo que se une

específicamente a la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), a la isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2), o a ambas IDH1 e 50 IDH2.

23. Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la etapa de determinación utiliza un anticuerpo que se une preferentemente a uno o más de R132H, R132C, R132S, R132L y R132G, de la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) y R172M, R172G y R172K de la IDH2, en relación a R132 de la IDH1 o a R172 de la IDH2.

24. Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la etapa de determinación utiliza la hibridación de una sonda de oligonucleótido que comprende:

• el codón 132 de la IDH1 o el nucleótido 394 ó 395 del transcrito de la IDH1 además de nucleótidos 60 adyacentes suficientes de la IDH1 para lograr la hibridación específica; o

• el codón 172 de la IDH2 o el nucleótido 515 del transcrito de la IDH2 además de nucleótidos adyacentes suficientes de la IDH2 para lograr la hibridación específica.

25. Procedimiento, según la cláusula 1, en el que la etapa de determinación comprende la utilización de extensión con cebador para generar un producto de reacción que comprende, como mínimo, una parte de:

5 • IDH1 que incluye el codón 132 o el nucleótido 394 ó 395 del transcrito de la IDH1; o

• IDH2 que incluye el codón 172 o el nucleótido 515 del transcrito de la IDH2.

26. Anticuerpo aislado que se une específicamente a:

10 • R132H de la IDH1, o R132C de la IDH1, o R132S de la IDH1, o R132L de la IDH1, o R132G de la IDH1, pero no R132 de la IDH1;

•

R172M de la IDH2, R172G, o R172K de la IDH2, pero no R172 de la IDH2;

•

R132 de la IDH1; o

• R172 de la IDH2. 15

27. Anticuerpo, según la cláusula 26, que es un anticuerpo monoclonal.

28. Anticuerpo, según la cláusula 26, que es una molécula de región variable monocatenaria. 20 29. Procedimiento de inmunización de un mamífero, que comprende la etapa de: administrar a un mamífero un polipéptido mutante que comprende, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos de:

25 • una proteína IDH1 humana que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el residuo 132, en la que el residuo 132 no es arginina; o

• una proteína IDH2 humana que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el residuo 172, en la que el residuo 172 no es arginina;

por el que se producen anticuerpos y/o células T que son inmunorreactivos con los epítopos que se encuentran en el 30 polipéptido mutante de la IDH1 pero no se encuentran en la IDH1 normal o se encuentran en el polipéptido mutante de la IDH2 pero no se encuentran en la IDH2 normal.

30.

Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R132H de la IDH1. 35 31. Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R132S de la IDH1.

32. Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R132C de la IDH1.

33.

Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R132G de la IDH1. 40

34. Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R132L de la IDH1.

35.

Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R172M de la IDH2. 45 36. Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R172K de la IDH2.

37. Procedimiento, según la cláusula 29, en el que el polipéptido mutante comprende un residuo R172G de la IDH2.

38.

Polipéptido mutante que comprende, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos de: 50

•

una proteína IDH1 humana que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el residuo 132, en la que el residuo 132 no es arginina; o

•

una proteína IDH2 humana que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el residuo 172, en la que el residuo 172 no es arginina;

55 39. Polipéptido mutante, según la cláusula 38, en el que el polipéptido es un polipéptido de la IDH1 y el residuo 132 se selecciona entre el grupo que comprende histidina, cisteína, leucina, serina y glicina.

40.

Polipéptido mutante, según la cláusula 38, en el que el polipéptido es un polipéptido de la IDH2 humana y el residuo 172 se selecciona entre el grupo que comprende glicina, lisina y metionina.

41.

Polinucleótido aislado que comprende, como mínimo, 18 pero menos de 600 residuos de nucleótidos contiguos

5 de una secuencia codificante de una proteína humana IDH1 o IDH2 que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos, como mínimo, 18 residuos de aminoácidos contiguos:

• los nucleótidos 394 y/o 395 de la IDH1, en el que dichos nucleótidos 394 y/o 395 no son C y/o G, respectivamente;

10 • el nucleótido 515 de la IDH2, en el que dicho nucleótido 515 no es una G.

42. Polinucleótido aislado, según la cláusula 41, en el que la secuencia codificante es la de una proteína IDH1 humana y el nucleótido 394 se selecciona entre el grupo que comprende T, A, y G o el nucleótido 395 se selecciona entre el grupo que comprende A y T.

43.

Polinucleótido aislado, según la cláusula 41, en el que la secuencia codificante es la de una proteína IDH2 humana y el nucleótido 515 se selecciona entre el grupo que comprende T y A o el nucleótido 514 es una G.

44.

Procedimiento de inmunización de un mamífero, que comprende la etapa de:

20 administrar a un mamífero un polipéptido que comprende, como mínimo, 8 y menos de 200 residuos de aminoácidos contiguos de:

• una proteína IDH1 humana, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el 25 residuo 132, en la que el residuo 132 es arginina; o

• una proteína IDH2 humana, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el residuo 172, en la que el residuo 172 es arginina;

por el que se producen anticuerpos y/o células T que son inmunorreactivos con los epítopos que se encuentran en el polipéptido de la IDH1 o se encuentran en el polipéptido mutante de la IDH2. 30

45. Polipéptido de la isocitrato deshidrogenasa que comprende, como mínimo, 8 y menos de 200 residuos de aminoácidos contiguos de:

• una proteína IDH1 humana, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el 35 residuo 132, en la que el residuo 132 es arginina; o

• una proteína IDH2 humana, comprendiendo dichos, como mínimo, 8 residuos de aminoácidos contiguos el residuo 172, en la que el residuo 172 es arginina;

46. Procedimiento de cribado de una sustancia de ensayo para el tratamiento del cáncer, que comprende:

40 poner en contacto una sustancia de ensayo con una proteína IDH1 o IDH2 humanas;

ensayar la actividad enzimática de la proteína IDH1 o IDH2 humanas;

identificar una sustancia de ensayo que modula la actividad de la enzima como un candidato a agente terapéutico;

45 poner a prueba el candidato a agente terapéutico en una célula, tejido o modelo animal completo de cáncer para determinar la inhibición del crecimiento de células cancerosas, la prolongación de la esperanza de vida, la inhibición de la proliferación de células cancerosas, la estimulación de la apoptosis o la inhibición del crecimiento tumoral.

50 47. Procedimiento, según la cláusula 46, en el que la proteína es la IDH1.

48. Procedimiento, según la cláusula 46, en el que la proteína es la IDH2.

49. Procedimiento, según la cláusula 46, en el que el modulador es un inhibidor. 55

50.

Procedimiento, según la cláusula 46 en el que el modulador es un potenciador.

51.

Procedimiento, según la cláusula 46, en el que la etapa de puesta a prueba se realiza en presencia de un

fármaco anticancerígeno quimioterapéutico. 60

52.

Procedimiento, según la cláusula 46, en el que la etapa de puesta a prueba se realiza en ausencia de un fármaco anticancerígeno quimioterapéutico.

53.

Procedimiento, según la cláusula 47, en el que la proteína tiene un aminoácido que no es arginina en el residuo

132.

54. Procedimiento, según la cláusula 48, en el que la proteína tiene un aminoácido que no es arginina en el residuo

172.

55.

Procedimiento, según la cláusula 46, en el que la enzima se ensaya utilizando un ensayo espectrofotométrico.

56.

Procedimiento, según la cláusula 46, en el que la enzima se ensaya utilizando un ensayo bioluminiscente.

57.

Procedimiento, según la cláusula 46, en el que la célula, tejido, o modelo animal completo de cáncer contiene un residuo que no es arginina en el codón 132 de la IDH1 o en el codón 172 de la IDH2.

58.

Procedimiento de detección o diagnóstico de glioblastoma multiforme (GBM) o enfermedad mínima residual de GBM o recaída molecular de GBM en un ser humano, que comprende las etapas de:

determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en un gen o su ARNm o proteína codificados, seleccionándose dicho gen entre el grupo que comprende los que se enumeran en la figura 10, tabla S7; identificar al ser humano como probable que tenga glioblastoma multiforme, enfermedad residual mínima o recaída molecular de GBM cuando se determina la mutación somática.

59.

Procedimiento, según la cláusula 58, en el que la mutación es en un gen seleccionado entre el grupo que comprende CDKN2A, TP53, EGFR, PTEN, NF1, CDK4, RB1, IDH1, PIK3CA y PIK3R1.

60.

Procedimiento, según la cláusula 58, en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido cerebral o sospechosa de metástasis de glioblastoma multiforme.

61.

Procedimiento, según la cláusula 58, en el que la muestra normal es una muestra de tejido cerebral.

62.

Procedimiento de caracterización de un glioblastoma multiforme en un ser humano, que comprende las etapas de:

determinar una firma mutacional en un gen CAN de un glioblastoma multiforme mediante la determinación en una muestra de ensayo, con respecto a una muestra normal del ser humano, de una mutación somática en, como mínimo, un gen o su o proteína o ADNc codificados, seleccionándose dicho gen entre el grupo que comprende aquellos que se enumeran en la figura 10, tabla S7; asignar el glioblastoma multiforme a un primer grupo de tumores de glioblastoma multiforme que tienen la firma mutacional del gen CAN.

63.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la mutación está en un gen seleccionado entre el grupo que comprende CDKN2A, TP53, EGFR, PTEN, NF1, CDK4, RB1, IDH1, PIK3CA y PIK3R1.

64.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la muestra de ensayo es una muestra de glioblastoma multiforme

o sospechosa de metástasis de glioblastoma multiforme.

65.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la muestra normal es una muestra de tejido cerebral.

66.

Procedimiento, según la cláusula 62, que comprende además las etapas de:

comparar la eficacia de una terapéutica anticancerígena candidata o conocida en el primer grupo con la eficacia en un segundo grupo de tumores de glioblastoma multiforme que tienen una firma mutacional de gen CAN diferente; identificar una firma mutacional del gen CAN que se correlaciona con el aumento o la disminución de la eficacia de la terapéutica anticancerígena candidata o conocida en relación a los otros grupos.

67.

Procedimiento, según la cláusula 66, en el que la, como mínimo, una mutación está en un gen seleccionado entre el grupo que comprende CDKN2A, TP53, EGFR, PTEN, NF1, CDK4, RB1, IDH1, PIK3CA y PIK3R1.

68.

Procedimiento, según la cláusula 66, en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido cerebral o una muestra de sangre.

69.

Procedimiento, según la cláusula 66, en el que la muestra normal es una muestra de tejido cerebral o una muestra de sangre.

70.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la firma mutacional del gen CAN comprende, como mínimo, 2 genes seleccionados de la figura 10, tabla S7.

71.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la firma mutacional del gen CAN comprende, como mínimo, 3 genes seleccionados de la figura 10, tabla S7.

72.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la firma mutacional del gen CAN comprende, como mínimo, 4 genes seleccionados de la figura 10, tabla S7.

73.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la firma mutacional del gen CAN comprende, como mínimo, 5 genes seleccionados de la figura 10, tabla S7.

74.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la firma mutacional del gen CAN comprende, como mínimo, 6 genes seleccionados de la figura 10, tabla S7.

75.

Procedimiento, según la cláusula 62, en el que la firma mutacional del gen CAN comprende, como mínimo, 7 genes seleccionados de la figura 10, tabla S7.

76.

Procedimiento de caracterización de un tumor de glioblastoma multiforme en un ser humano, que comprende las etapas de:

determinar una ruta mutada seleccionada entre el grupo que comprende TP53, RB1 y PI3K/PTEN en un tumor de glioblastoma multiforme mediante la determinación de, como mínimo, una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, en el que la, como mínimo, una mutación somática está en uno o más genes seleccionados entre el grupo que comprende TP53, MDM2, MDM4, RB1, CDK4, CDKN2A, PTEN, PIK3CA, PIK3R1 y IRS1; asignar el glioblastoma multiforme a un primer grupo de tumores de glioblastoma multiforme que tienen una mutación en una de dichas rutas, en el que el primer grupo es heterogéneo con respecto a los genes en la ruta que tienen una mutación somática y homogéneo con respecto a la ruta que tiene una mutación somática.

77.

Procedimiento, según la cláusula 76, que comprende además las etapas de:

comparar la eficacia de una terapéutica anticancerígena candidata o conocida en el primer grupo con la eficacia en un segundo grupo de tumores de glioblastoma multiforme que no tienen una mutación en dicha ruta; identificar una ruta que se correlaciona con el aumento o la disminución de la eficacia de la terapéutica anticancerígena candidata o conocida en el primer grupo en relación con los otros grupos.

78.

Procedimiento para detectar o diagnosticar glioblastoma multiforme o enfermedad mínima residual de GBM o recaída molecular de GBM en un ser humano que comprende:

determinar la expresión en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S5 o S9 (cerebro que sobreexpresa genes de SAGE); comparar la expresión de uno o más genes en la muestra clínica con la expresión de uno o más genes en una muestra correspondiente de un ser humano de control o grupo de seres humanos de control; identificar una muestra clínica con expresión elevada respecto a un control como probable que tenga un glioblastoma multiforme o enfermedad mínima residual de GBM o recaída molecular de GBM en un ser humano.

79.

Procedimiento, según la cláusula 78, en el que la muestra clínica es una muestra de sangre.

80.

Procedimiento, según la cláusula 78, en el que la muestra clínica es una muestra de tejido cerebral.

81.

Procedimiento, según la cláusula 78, en el que se determina la expresión proteica de los uno o más genes.

82.

Procedimiento, según la cláusula 78, en el que se determina la expresión del ARNm de los uno o más genes.

83.

Procedimiento, según la cláusula 78, en el que el uno o más genes se seleccionan entre los enumerados en la figura 10, tabla S10 (proteínas extracelulares que se encuentran por SAGE).

84.

Procedimiento para controlar la carga de glioblastoma multiforme, que comprende:

determinar de la expresión en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S5 ó S9 (cerebro que sobreexpresa genes de SAGE); repetir una o más veces dicha etapa de determinación, e identificar un aumento, disminución o nivel estable de expresión con el tiempo.

85.

Procedimiento, según la cláusula 84, en el que la muestra clínica es una muestra de sangre.

86.

Procedimiento, según la cláusula 84, en el que se determina la expresión proteica de los uno o más genes.

5 87. Procedimiento, según la cláusula 86, en el que los uno o más genes se seleccionan entre los enumerados en la figura 10, tabla S10 (proteínas extracelulares que se encuentran por SAGE).

88. Procedimiento para controlar la carga de glioblastoma multiforme, que comprende:

10 determinar una mutación somática en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S7; repetir una o más veces dicha etapa de determinación, e identificar un aumento, disminución o nivel estable de dicha mutación somática en el tiempo.

15 89. Procedimiento para detectar o diagnosticar un glioblastoma multiforme, que comprende:

determinar la expresión en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S6 (eliminaciones homocigóticas); comparar la expresión de los uno o más genes en la muestra clínica con la expresión de los uno o más genes en

20 una muestra correspondiente de un ser humano de control o grupo de seres humanos de control; identificar una muestra clínica con una expresión reducida respecto a un control como probable que tenga un glioblastoma multiforme.

90. Procedimiento, según la cláusula 89, en el que la muestra clínica es una muestra de sangre o de ganglio 25 linfático.

91.

Procedimiento, según la cláusula 89, en el que se determina la expresión proteica de los uno o más genes.

92.

Procedimiento para controlar la carga de glioblastoma multiforme, que comprende:

30 determinar la expresión en una muestra clínica de uno o más genes enumerados en la figura 10, tabla S6 (eliminaciones homocigóticas): repetir una o más veces dicha etapa de determinación, e identificar un aumento, disminución o nivel estable de expresión con el tiempo.

93. Procedimiento, según la cláusula 92, en el que la muestra clínica es una muestra de sangre o de ganglio linfático.

94. Procedimiento, según la cláusula 92, en el que se determina la expresión proteica de los uno o más genes. 40

95. Procedimiento, según la cláusula 89 ó 92 en el que la muestra se selecciona entre el grupo que comprende plasma, suero, sangre completa, heces y aliento.

LISTADO DE SECUENCIAS 45

<110> The Johns Hopkins University Duke University

<120> ALTERACIONES GENÉTICAS EN

LA ISOCITRATO DESHIDROGENASA Y

50 OTROS GENES EN

GLIOMA MALIGNO

<130> 001107.00788

55 <150> 61/093.739

<151>

<150> 61/110.397

<151>

<150> 61/162.737 5 <151>

<160> 136

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 10

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de caracterización de un tumor de glioblatoma multiforme (GBM) en un sujeto humano, que comprende:

   analizar una muestra de ensayo de un tumor GBM obtenida a partir del sujeto humano para identificar la presencia o ausencia de una mutación somática en:

   •

   el codón 132 en la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1); o

   •

   el codón 172 en la isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2).

2. 2.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la mutación somática es R132H en la IDH1, R132S en la IDH1, R132C en la IDH1, R132L en la IDH1, R132G en la IDH1, R172M en la IDH2, R172K en la IDH2 o R172G en la IDH2.

3. 3.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de identificar el tumor como probable que sea un GBM secundario cuando la mutación somática está presente o un GBM primario cunado la mutación somática está ausente.

4. 4.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de asignar un pronóstico más favorable (mayor esperanza de vida) cuando la mutación somática está presente o un pronóstico menos favorable (menor esperanza de vida) cuando la mutación somática está ausente.

5. 5.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de asignar el sujeto a un grupo de ensayos clínicos basándose en la presencia o ausencia de la mutación somática.

6. 6.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende amplificar, como mínimo, una parte del gen IDH1 o el ADNc del ARNm de la IDH1, comprendiendo dicha parte el codón 132 o el nucleótido 394 ó 395 del transcrito de la IDH1.

7. 7.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende amplificar, como mínimo, una parte del gen IDH2 o el ADNc del ARNm de la IDH2, comprendiendo dicha parte el codón 172 o el nucleótido 515 del transcrito de la IDH2.

8. 8.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación utiliza un anticuerpo que se une específicamente a la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), a la isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2), o a ambas IDH1 e IDH2.

9. 9.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación utiliza un anticuerpo que se une preferentemente a uno o más de R132H, R132C, R132S, R132L y R132G, de la isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1) y R172M, R172G y R172K de la IDH2, en relación a R132 de la IDH1 o a R172 de la IDH2.

10. 10.

    Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación utiliza la hibridación de una sonda de oligonucleótido que comprende el codón 132 de la IDH1 o el nucleótido 394 ó 395 del transcrito de la IDH1 además de nucleótidos adyacentes suficientes de la IDH1 para lograr la hibridación específica.

11. 11.

    Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación utiliza la hibridación de una sonda de oligonucleótido que comprende el codón 172 de la IDH2 o el nucleótido 515 del transcrito de la IDH2 además de nucleótidos adyacentes suficientes de la IDH2 para lograr la hibridación específica.

12. 12.

    Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende la utilización de extensión con cebador para generar un producto de reacción que comprende, como mínimo, una parte de la IDH1 que incluye el codón 132 o el nucleótido 394 ó 395 del transcrito de la IDH1.

13. 13.

    Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende la utilización de extensión con cebador para generar un producto de reacción que comprende, como mínimo, una parte de la IDH2 que incluye el codón 172 o el nucleótido 515 del transcrito de la IDH2.

14. 14.

    Polipéptido aislado mutante que comprende, como mínimo, 8 pero menos de 200 residuos de aminoácidos contiguos de:

    •

    una proteína IDH1 humana que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos residuos de aminoácidos contiguos el residuo 132, en la que el residuo 132 no es arginina o cisteína; o

    •

    una proteína IDH2 humana que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos residuos de aminoácidos contiguos el residuo 172, en la que el residuo 172 no es arginina.

15. 15.

    Polipéptido mutante, según la reivindicación 14, en el que el polipéptido es un polipéptido de la IDH1 y el residuo 132 se selecciona entre el grupo que comprende histidina, leucina, serina y glicina.

16. 16.

    Polipéptido mutante, según la reivindicación 14, en el que el polipéptido es un polipéptido de la IDH2 humana y el residuo 172 se selecciona entre el grupo que comprende glicina, lisina y metionina.

17. 17.

    Polinucleótido aislado que comprende, como mínimo, 18 pero menos de 600 nucleótidos contiguos de una secuencia codificante de una proteína humana IDH1 o IDH2 que se encuentra en un tumor humano, comprendiendo dichos nucleótidos contiguos:

    los nucleótidos 394 y/o 395 de la IDH1, en el que dicho nucleótido 394 de la IDH1 no es C o T y/o el nucleótido 395 noesG; el nucleótido 515 de la IDH2, en el que dicho nucleótido 515 no es G.

18. 18.

    Polinucleótido aislado, según la reivindicación 17, en el que la secuencia codificante es la de una proteína IDH1 humana y el nucleótido 394 se selecciona entre el grupo que comprende A y G o el nucleótido 395 se selecciona entre el grupo que comprende A y T.

19. 19.

    Polinucleótido aislado, según la reivindicación 17, en el que la secuencia codificante es la de una proteína IDH2 humana y el nucleótido 515 se selecciona entre el grupo que comprende T y A o el nucleótido 514 es G.

20. 20.

    Procedimiento de cribado de una sustancia de ensayo para el tratamiento del cáncer, que comprende:

    poner en contacto una sustancia de ensayo con una proteína IDH1 o IDH2 humanas; ensayar la actividad enzimática de la proteína IDH1 o IDH2 humanas; identificar una sustancia de ensayo que modula la actividad de la enzima como un candidato a agente terapéutico; poner a prueba el candidato a agente terapéutico en una célula, tejido o modelo animal completo de cáncer para determinar la inhibición del crecimiento de células cancerosas, la prolongación de la esperanza de vida, la inhibición de la proliferación de células cancerosas, la estimulación de la apoptosis o la inhibición del crecimiento tumoral, en el que la célula, tejido o modelo animal completo de cáncer contiene un residuo en el codón 132 de la IDH1 que no es arginina o cisteína, o contiene un residuo en el codón 172 de la IDH2 que no es arginina.

21. 21.

    Procedimiento, según la reivindicación 20, en el que:

    (1)

    la proteína es la IDH1;

    (2)

    la proteína es la IDH2;

    (3)

    el modulador es un inhibidor;

    (4)

    el modulador es un potenciador;

    (5)

    la etapa de puesta a prueba se realiza en presencia de un fármaco anticancerígeno quimioterapéutico;

    (6)

    la etapa de puesta a prueba se realiza en ausencia de un fármaco anticancerígeno quimioterapéutico;

    (7)

    la proteína es IDH1 y tiene un aminoácido que no es arginina en el residuo 132;

    (8)

    la proteína es IDH2 y tiene un aminoácido que no es arginina en el residuo 172;

    (9)

    la enzima se ensaya utilizando un ensayo espectrofotométrico; o

    (10)

    la enzima se ensaya utilizando un ensayo bioluminiscente.