ES2605816T3

ES2605816T3 - Nueva composición para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios

Info

Publication number: ES2605816T3
Application number: ES09787621.3T
Authority: ES
Inventors: Johannes Gislason; Jon M. Einarsson; Chuen How Ng
Original assignee: Genis Hf
Current assignee: Genis Hf
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-20
Publication date: 2017-03-16
Anticipated expiration: 2029-07-20
Also published as: MX338123B; CA2731201A1; CN102159218B; EP2318014A1; PT2318014T; DK2318014T3; US20110212186A1; JP2011528348A; CN102159218A; EP2318014B1; WO2010007631A1; CA2731201C; MX2011000706A

Abstract

Una composición para el tratamiento de la artritis reumatoide que comprende: - quitooligómeros terapéuticamente activos de N-acetilglucosamina (A) y glucosamina (D), en que los quitooligómeros comprenden heteroquitooligómeros que cumplen los criterios siguientes: - dichos oligómeros tienen una longitud de cadena en el intervalo de 5-20 restos monoméricos, - cada cadena oligomérica puede tener dos restos de N-acetilglucosamina (AA) en uno o en los dos extremos de la cadena oligomérica, - la parte interna restante del oligómero tiene al menos una cantidad suficiente de restos D para evitar que la secuencia de dicha cadena interna comprenda un resto de N-acetilglucosamina (A) adyacente a otro resto de Nacetilglucosamina (como AA), - en combinación con glucosamina, - en que la relación entre monómeros y oligómeros está en el intervalo de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1, y - en que el grado de desacetilación (DD) de dichos quitooligómeros terapéuticamente activos está en el intervalo del 30-60 %.

Description

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(D) sobre el dolor y la inflamación en un paciente con artritis reumatoide (AR). La calificación es de 0 (sin alivio) a 10 (alivio total). Las dosis diarias fueron Oligomin: 2.200 mg, T-ChOS: 700 mg, N-acetilglucosamina (A) o glucosamina (D): 1.500 mg. Las flechas indican cuándo se añadieron los monómeros a los T-ChOS.

5 EJEMPLOS

Ejemplo1: Efectos regenerativos de aminoazúcares específicos en explantes de cartílago bovino y humano en condiciones anabólicas y catabólicas

10 [0037] El objetivo de estos experimentos fue evaluar el efecto de aminoazúcares sobre la formación de cartílago en un cartílago articular en condiciones de ausencia de estimulación. Estos experimentos pudieron identificar posibles efectos condroanabólicos de estos azúcares como fármacos potenciales para la osteoartritis. El factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), 100 ng/ml, sirvió como control positivo de estimulación anabólica de los explantes de cartílago.

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MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS

[0038] Todos los reactivos usados fueron de calidad analítica. El medio de cultivo fue medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM) con penicilina y estreptomicina (Life Technologies, EE. UU.). La oncostatina M

20 (OSM) recombinante humana fue de Sigma Aldrich (Reino Unido), mientras el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) recombinante humano fue de R&D Systems (Reino Unido).

AMINOAZÚCARES: PRODUCCIÓN Y ANÁLISIS

25 [0039] Oligomin. Los quitooligosacáridos fueron producidos por Genis a escala de prueba (lote G061023). Brevemente, la quitina parcialmente desacetilada (DDA 45 %) se hidrolizó casi totalmente mediante quitinasa. La disolución se ultrafiltró (10 kDa) para eliminar la quitinasa y las sustancias insolubles y se secó por atomización.

[0040] T-ChOS. Las composiciones quitooligoméricas con una cantidad muy reducida de DP1-4 fueron

30 producidas por Genis a partir de Oligomin a escala de prueba (lote G051128). El monómero (DP1 o Nacetilglucosamina) se eliminó y la cantidad de oligómeros de menor tamaño se redujo por ultrafiltración. El producto se secó por atomización. La N-acetilglucosamina (A) y la glucosamina (D) se adquirieron a YSK, Japón. Para el análisis de todos los aminoazúcares empleados se usó HPLC, con un sistema Beckman Gold. Se usó una columna TSK-oligo (TosoHaas, Japón), que separa los ChOS por su peso molecular (DP1, DP2, etc.). El disolvente fue

35 hidróxido de amonio 5 mM, pH 10,0, la tasa de flujo de 0,5 ml/min, la absorbancia óptica de 205 nm, el volumen de inyección de 20 µl y la concentración de los aminoazúcares de 10 mg/ml.

[0041] Para los experimentos con explantes de cartílago, las concentraciones de aminoazúcares probadas fueron las siguientes. Oligomin y T-ChOS, 50, 100, 200 y 400 µg/ml en el medio. N-acetilglucosamina (A) y

40 glucosamina (D), 200 y 400 µg/ml en el medio. La combinación A + D, 200 µg/ml de cada uno en el medio.

EXPLANTES DE CARTÍLAGO

Condiciones anabólicas

45 [0042] Se usan cultivos de explantes de cartílago bovino como modelo de enfermedades degenerativas del cartílago, lo que permite llevar a cabo experimentos en un modelo de prueba/ensayo robusto y simple, en el que puede investigarse el efecto de factores de crecimiento y fármacos sobre el metabolismo del cartílago (Olsen, A. K., y col., Anabolic and catabolic function of chondrocyte ex vivo is reflected by the metabolic processing of type II

50 collagen. Osteoarthritis and Cartilage, 2007, 15(3): págs. 335-342).

PREPARACIÓN DE EXPLANTES DE CARTÍLAGO ARTICULAR

[0043] Las rodillas se abrieron en condiciones de semiesterilidad en una cámara de flujo laminar. Se retiraron

55 cortes de cartílago articular superficial en una maniobra de un solo movimiento, retirando solo la capa más externa. Cortes demasiado profundos contendrían hueso subcondral / material condrósteo. Se recogieron explantes uniformes del fémur y de la tibia. Se evitaron explantes del cartílago situado en los cóndilos. Los explantes se

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transfirieron a una placa de Petri que contenía PBS + pen/strep (penicilina/estreptomicina).

PREPARACIÓN Y CULTIVO

5 [0044] Los explantes se pesaron individualmente y se transfirieron a una placa de 96 pocillos estéril en condiciones de semiesterilidad en una cámara de flujo laminar. Previamente, los pocillos se llenaron con 200 µl de PBS + pen/strep, para mantener los explantes húmedos después de pesarlos. Después se eliminó el PBS y se añadió a los pocillos un medio que contenía diferentes tipos y concentraciones de aminoazúcares, 200 µl/pocillo, de acuerdo con el planteamiento. Para cada prueba se usaron cuatro réplicas de explantes. Las placas se incubaron a

10 37 °C y el 5 % de CO2, con agitación a 50 rpm. Las placas se cubrieron con una bolsa de plástico permeable al CO2 para limitar/evitar la contaminación por esporas. El medio de acondicionamiento se renovó cada segundo-tercer día y el sobrenadante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos que se almacenó a -20 °C hasta el final del experimento. Cada segundo-tercer día se añadió a los pocillos medio fresco con diferentes tipos y concentraciones de aminoazúcares, 200 µl/pocillo, de acuerdo con el planteamiento.

15 [0045] El último día del experimento (días 22-24), se retiraron los sobrenadantes y se midió la viabilidad celular mediante azul de Alamar, para investigar el número de células y su viabilidad. También el último día del experimento se procesó el cartílago para extraer las proteínas del mismo en diversos ensayos.

20 [0046] En los sobrenadantes se determinó la formación de colágeno de tipo II (PIINP) y la degradación de agrecano mediada por agrecanasa. Se usaron kits ELISA de Nordic Bioscience.

MEDICIONES DE LA VIABILIDAD CELULAR Y EL NÚMERO DE CÉLULAS

25 [0047] Para asegurar la acción específica y no tóxica de los aminoazúcares, se midió la actividad metabólica de los condrocitos mediante azul de Alamar, que previamente se ha demostrado que se correlaciona con el número de células y la viabilidad celular.

EVALUACIÓN DE LA RENOVACIÓN DEL CARTÍLAGO

30 [0048] Degradación de agrecano mediada por agrecanasa. Detección del fragmento de agrecano 374ARGS: el ensayo ELISA para detectar los fragmentos producidos por agrecanasa del extremo N-terminal 374ARGS combina dos anticuerpos monoclonales en un sistema ELISA sándwich. El procedimiento seguido es el descrito por Kardsal y col., Arthritis & Rheumatism, 2007, 56(5): págs. 1549-1558.

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CONTENIDO TOTAL DE PROTEOGLUCANO -MEDICIÓN DE SGAG

[0049] Para la detección de glucosaminoglucanos sulfatados (sGAG), es decir, la liberación de sulfato de condroitina, se usó el ensayo de unión cuantitativa de colorante para el análisis in vitro de la liberación de GAG de 40 acuerdo con las instrucciones del fabricante (Wieslab, Suecia).

FORMACIÓN DE COLÁGENO DE TIPO II: ELISA PARA PIINP

[0050] La formación de colágeno de tipo II se mide mediante un ensayo ELISA específico a base de un 45 anticuerpo que reconoce un epítopo en la molécula de PIINP por fuera del exón 2 (PIIANP). Por lo tanto, el ensayo ELISA no es específico para la forma IIA ni la forma IIB pero reacciona con las dos.

EXTRACCIÓN DEL CARTÍLAGO

50 [0051] El cartílago se sometió a extracción para determinar el contenido de diversas proteínas en el mismo, en comparación con las secretadas al medio.

[0052] Los explantes de cartílago se congelaron en nitrógeno líquido. Los explantes congelados se trituraron mediante un triturador de tejido Bessman de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. El polvo 55 se puso en un tubo de 14 ml mediante un escalpelo congelado. Se añadió un tampón de digestión helado (tampón Tris·HCl 50 mM, pH 7,4 con NaCl 0,1 M y Triton X-100 al 0,1 %) y la disolución se homogeneizó durante 30 segundos con un homogeneizador Polytron PT-MR 3000 (Brinkmann, Littau, Suiza). A continuación, el homogenado

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se centrifugó a 15.000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se recogió y se almacenó a -80 °C hasta su análisis posterior.

CONTENIDO DE COLÁGENO TOTAL: MEDICIONES DE HIDROXIPROLINA

5 [0053] El colágeno total se evalúa midiendo el contenido de hidroxiprolina en los explantes mediante una versión modificada del procedimiento descrito por Podenphant (Podenphant, J., N. Larsen y C. Christiansen, An easy and reliable method for determination of urinary hydroxyproline, Clinica Chimica Acta, 1984, 142: págs. 145148).

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Resultados

Análisis de aminoazúcares

15 [0054] La figura 1 muestra la comparación de los quitooligosacáridos Oligomin y T-ChOS. En el caso de Oligomin, el principal componente fueron monómeros a trímeros (DP1-DP3) (58,4 %) y el contenido de DP4 y oligómeros mayores fue del 41,6 %.

[0055] En el caso de T-ChOS, no se detectó ningún monómero (DP1) y la fracción DP1-DP3 fue solo del 6,1 20 %. El octámero (DP8) fue el principal oligómero en T-ChOS. La principal fracción, del 93,9 %, estuvo compuesta por DP4 y oligómeros mayores.

[0056] El análisis de N-acetilglucosamina (A) y glucosamina (D) mediante HPLC reveló que el monómero (DP1) era el principal componente y no se detectaron oligómeros (resultados no mostrados). 25

Estudios con explantes de cartílago bovino

Efecto de diferentes aminoazúcares

30 Condiciones anabólicas

[0057] La viabilidad de los explantes de cartílago no se vio afectada por los aminoazúcares, no se observó ninguna diferencia significativa entre los diversos aminoazúcares y los grupos de control de acuerdo con el ensayo del azul de Alamar al final del tratamiento.

35 [0058] La liberación de sulfato de condroitina (ChS) al medio de los explantes se midió desde el día 3 al día 23 en intervalos de 2-3 días. Se observó un efecto de disminución relacionado con la dosis de Oligomin para el periodo tardío (días 10-23; regresión lineal). Al analizar la liberación acumulada de ChS para los días 10-23 (figura 2), se observó una clara disminución de la liberación de ChS inducida por Oligomin en dicho periodo (p < 0,05 para

40 200 y 400 µg/ml de Oligomin; reducción del 51 %). La glucosamina (D, 400 µg/ml) mostró el mismo efecto (p < 0,05). T-ChOS y N-acetilglucosamina (A) no mostraron ningún efecto significativo sobre la liberación acumulada de sulfato de condroitina en este periodo (figura 2).

Propéptido N-terminal del colágeno de tipo II (PIINP)

45 [0059] De todos los biomarcadores probados, la formación de colágeno de tipo II (concentración de PIINP) fue la más claramente afectada por los aminoazúcares. Esta se midió como la liberada de los explantes de cartílago al medio en un intervalo de 2-3 días. Solo T-ChOS mostró un marcado efecto relacionado con la dosis. Este efecto solo se observó en el periodo tardío de la incubación con los aminoazúcares. El día 20 ex vivo, no se observó ningún

50 efecto con los diferentes aminoazúcares. La concentración de PIINP fue de entre 0,1 y 0,2 ng/ml por mg de cartílago. El día 22 se observó un claro aumento de PIINP relacionado con la dosis, pero solo para T-ChOS (figura 3). El efecto fue significativamente diferente de cero (M) a todas las concentraciones (50, 100, 200 y 400 µg/ml) y el efecto máximo fue de 0,62 ng/ml por mg de cartílago o 17 veces el control. No se observó ningún efecto para Oligomin en el mismo intervalo de concentraciones. Los monosacáridos glucosamina (D) y N-acetilglucosamina (A)

55 no mostraron ningún efecto (figura 3). Por lo tanto, de todos los aminoazúcares probados, solo T-ChOS mostró un marcado efecto relacionado con la dosis sobre la expresión de PIINP.

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[0079] Se pidió a la paciente que cambiara a T-ChOS (700 mg/día). Su estado empeoró gradualmente. El día 20, su puntuación de alivio se redujo a 5. El día 32 del consumo de T-ChOS se añadió N-acetilglucosamina (1.500 mg/día) a T-ChOS. Como resultado, su estado mejoró. A los 12 días de añadir N-acetilglucosamina a T-ChOS, su puntuación de alivio subió de 5 a 7 (figura 17). Trece días después, su estado seguía sin cambios (puntuación = 7). 5 Entonces cambió de N-acetilglucosamina a glucosamina (1.500 mg/día), todavía en combinación con T-ChOS (figura 17). A los 16 días, su estado mejoró ligeramente, lo que resultó en un aumento de 7 a 8. Ahora, ha estado usando esta combinación durante más de un año y su estado sigue siendo el mismo con una puntuación de alivio todavía de

8.

10 Conclusiones

[0080] Los ejemplos anteriores muestran que T-ChOS es una combinación específica de composiciones de quitooligosacáridos parcialmente desacetilados, en que los monómeros se han eliminado de la combinación y los dímeros y los trímeros se ha reducido a menos del 10 % con el fin de aumentar la afinidad de unión a las proteínas

15 similares a quitinasa. Esto se muestra en el análisis de aminoazúcares del ejemplo 1 (figura 1).

[0081] Oligomin, que es una mezcla cruda de ChOS con grandes fracciones de monómeros, dímeros y trímeros, no tiene las propiedades bioactivas mostradas por T-ChOS. La composición se muestra en el ejemplo 1, figura 1. En el ejemplo 1 se demuestra que Oligomin no induce la síntesis de colágeno de tipo II en explantes de

20 cartílago, mientras T-ChOS muestra un aumento de la liberación de PIINP de 15-20 veces.

[0082] Las composiciones de oligosacáridos tienen mayor actividad protectora/regeneradora de tejidos que otros aminoazúcares y composiciones de quitooligosacáridos. En el ejemplo 1 se muestra la liberación de PIINP de explantes de cartílago (figura 3).

25 [0083] La actividad de T-ChOS está mediada por su interacción con las quitinasas de mamíferos de la familia 18 (proteínas similares a quitinasa). Esto se demuestra en el ejemplo 1, T-ChOS ejerce su actividad de formación de colágeno a través de la interacción con YKL-40 (figuras 7 y 8). Oligomin no muestra un efecto semejante (figura 8) en el intervalo de concentraciones probado.

30 [0084] La actividad de T-ChOS puede reforzarse en combinación con el monómero glucosamina. Esto se demuestra en el ejemplo 1, en el que la liberación de PIINP de los explantes de cartílago es potenciada por T-ChOS. La combinación de T-ChOS y glucosamina también es significativamente más eficiente que T-ChOS solo (figura 4). En el ejemplo 1, en la liberación de sulfato de condroitina (ChS) de los explantes de cartílago, el efecto de T-ChOS +

35 glucosamina es similar al efecto del factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) (figura 5). Además, en el ejemplo 2, figuras 19-26, la administración por vía oral de T-ChOS y glucosamina conjuntamente en un modelo de artritis reumatoide en ratas es superior a T-ChOS o glucosamina solos.

[0085] T-ChOS y glucosamina ejercerán su actividad in vivo después de su administración por vía oral. Esto 40 se demuestra en el ejemplo 3, figuras 4-8, en que la administración por vía oral de T-ChOS y glucosamina conjuntamente tiene un efecto protector de tejidos significativo en el modelo de artritis reumatoide en ratas.

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Claims

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