PT2318014T - Nova composição para tratar doenças autoimunes - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "NOVA COMPOSIÇÃO PARA TRATAR DOENÇAS AUTOIMUNES"

Dominio do Invento 0 presente invento refere-se a uma nova composição quitooligomérica para uso médico. Mais especifi-camente o invento refere-se a biomateriais e medicamentos feitos a partir de quitina que promovem sinergisticamente efeitos regenerativos e anti-inflamatórios in vivo e in vitro.

Antecedentes técnicos e técnica anterior 0 desenvolvimento da primeira geração de biomateriais, embora possuindo resistência mecânica aceitável, resultou numa contribuição passiva para a cura do tecido, dado que a sua função era confinada ao apoio à substituição do tecido. Esta primeira geração de biomateriais libertava residuos de degradação que, por sua vez, conduziam ao inicio da inflamação crónica, dor e efusão. 0 principal propósito do desenvolvimento da segunda geração de biomateriais biodegradáveis foi o de eliminar os problemas crónicos, de longo prazo, que resultavam da libertação continua das particulas de residuo originados pela primeira geração de materiais. Isto resultava em materiais biodegradáveis implantáveis oferecendo propriedades de suporte do tecido durante a desejada extensão de tempo (meses) e depois disto estes sofriam degradação local pelos tecidos circundantes e eram subsequentemente excretados para fora do corpo através da urina e/ou das fezes. Um exemplo desta tecnologia são as suturas vasculares biodegradáveis usadas hoje.

Apesar da boa biocompatibilidade da segunda geração de biomateriais, a sua contribuição para a promoção da cura do tecido é limitada, devido ao seu papel passivo nos processos biológicos envolvidos na cura e regeneração dos tecidos. A necessidade de desenvolver um conjunto mais moderno de uma terceira geração de resíduos de biomateriais reside no desejo de desenvolver compostos, que contribuirão ativamente para o processo da cura e regeneração dos tecidos. 0 anterior pedido de patente do autor deste pedido de patente WO 2006/134614 descreve um método para produzir material de quitina altamente purificado parcialmente desacetilado para aplicações terapêuticas. As composições oligoméricas produzidas através deste método são aqui referidas como "Quitooligossacáridos Terapêuticos" (T-ChOS). Os quitooligossacáridos terapêuticos são carac-terizados pelo seu comprimento de cadeia de resíduos de 4-20 monómeros e a sua sequência específica da D-glucosamina (D) e N-acetil-D-glucosamina (A), em que a parte interna do oligómero possuindo pelo menos suficientes resíduos de glucosamina (D) para evitar que um resíduo de N-acetil-glucosamina (A) seja adjacente a outro resíduo de N-acetilglucosamina (tal como AA).

Existem basicamente duas vias para que um tecido danificado ou doente se repare ou cure. Um é através de fibrose conduzindo à formação de cicatriz. Uma vez que os fibroblastos envolvidos na formação do tecido fibrótico não possui as funções das células do tecido original, esta via de reparação conduz a uma função de tecido prejudicada. As citoquinas estão usualmente envolvidas na fibrose.

Pensa-se que o YKL-40 desempenha um papel na fibrose através da quimiotaxia e estimulação do crescimento dos fibroblastos. A via alternativa da reparação do tecido é a regeneração do tecido ou a reparação do tecido funcional. Nesta via, as células funcionais do tecido particular são regenerados, provavelmente a partir de células progenitoras específicas do tecido, resultando na regeneração de um tecido funcional saudável.

No tecido ósseo, os materiais ou dispositivos osteogénicos e osteoindutivos promovem o crescimento ósseo induzindo a proliferação das células progenitoras capazes de se desenvolverem em cartilagem e/ou tecido ósseo e são caracterizados como materiais que não apenas enchem os espaços vazios como também apresentam propriedades intrín secas que provocam ou induzem o corpo a produzir novo osso dentro do suporte proporcionado pela composição de biomaterial. Estes materiais não apenas atuam como um suporte, como também contêm proteínas ou outras substâncias que induzem a formação de novo osso. Autoenxertos têm sido usados em procedimentos cirúrgicos ortopédicos desde há muitos anos e são o método mais comum de auxiliar a capacidade regenerativa do corpo. Apenas um produto comercialmente disponível demonstra verdadeiras propriedades osteoindutivas, o dispositivo recentemente apresentado pela Medtronic designado InFUSE® incorporando uma versão recombinante da proteína morfogenética de osso humano (BMP). Para além disso, a Glucosamina tem sido intensamente usada para tratar a osteoartrite.

Os agentes capazes para promover a regeneração do tecido através de administração sistémica (tal como oralmente, subcutaneamente, intramuscularmente, intravenosamente etc.) não foram até agora desenvolvidos.

Sumário do invento

Num pedido de patente anterior (WO 2006/057011) os inventores demonstraram que os derivados de quitina parcialmente desacetilados, implantados num osso defeituoso, são capazes de induzir ossificação endocondral. O presente invento demonstra o efeito regenerativo do T-ChOS e T-ChOS + glucosamina em modelos in vitro e in vivo demonstrando o efeito dos aminoaçúcares específicos através da administração sistémica. Adicionalmente é demonstrado que os dimeros e trimeros de glucosamina e N-acetilglu-cosamina (DP2 e DP3) apresentam um efeito inibidor. 0 presente invento descreve também um surpreendente efeito sinergistico do T-ChOS e glucosamina como composição bioativa facilitando a anti-inflamação e a a regeneração dos tecidos na artrite reumatoide (RA). É ainda demonstrado nos exemplos que a combinação de T-ChOS e glucosamina constitui um agente ativo para promover e aumentar a formação de colagénio do tipo II em explantes de cartilagem, aparentemente através da interação com o YKL-40, um membro da familia das proteínas CLP. É um objeto do presente invento proporcionar uma composição, uso e um método para reduzir a inflamação e promover a reparação dos tecidos ou a regeneração dos tecidos através de um efeito sinergistico de T-ChOS e glucosamina e/ou N-acetilgluco-samina sistemicamente ou localmente administrados em humanos e outros mamíferos que disso necessitem.

Num primeiro aspeto do invento é proporcionada uma composição para o tratamento da artrite reumatoide, compreendendo a composição quitooligómeros terapeuticamente ativos (T-ChOS) de N-acetilglucosamina (A) e glucosamina (D), em que os quitooligómeros compreendem hetero-quitooli-gómeros que têm que corresponder aos seguintes critérios: os oligómeros possuem um comprimento de cadeia na gama de residuos de 5-20 monómeros e cada cadeia oligomérica pode ter dois residuos N-acetilglucosamina (AA) em cada uma ou ambas as extremidades da cadeia oligomérica. A sequência da cadeia interna (a porção nos dois resíduos terminais em cada extremidade) é tal que um tal resíduo de N-acetil-glucosamina (A) não fica adjacente ao outro resíduo de N-acetilglucosamina (tal como AA) . A composição compreende ainda monómeros de glucosamina, em que a razão entre os monómeros e os oligómeros está na gama entre 1:5 a cerca de 5:1, e em que o grau de desacetilação (DD) dos referidos quitooligómeros terapeuticamente ativos está numa gama entre 30-60%. A composição de acordo com o primeiro aspeto do presente invento é um biomaterial que apresenta os principais critérios de biomateriais, nomeadamente biocom-patibilidade, biodegradabilidade e bioatividade. A razão adequada dos quitooligómeros terapeuticamente ativos (T-ChOS) e o monómero podem depender da indicação específica, aplicação, dispositivo e forma de dosagem. Em geral, a razão (peso/peso) entre os monómeros e os oligómeros pode estar na gama de cerca de 1:5 a cerca de 5:1, incluindo a gama de cerca de 1:1 a cerca de 5:1. Em certas formas de concretização, a razão em peso do monómero é superior e a gama pode estar entre cerca de 1:1 a cerca de 5:1, incluindo a gama de cerca de 1:1 até cerca de 4:1, tal como a razão de cerca de 2:1 até cerca de 4:1 e mais preferencialmente cerca de 3:1. Noutras formas de concretização, são usados mais oligómeros T-ChOS, de forma a que a razão de monómero em relação ao oligómero está na gama de cerca de 1:1 até cerca de 1:4, incluindo a razão de cerca de 1:1, até cerca de 1:2 e cerca de 1:3. 0 presente invento descreve também uma composição farmacêutica compreendendo quitooligómeros terapeuticamente ativos de N-acetilglucosdamina (A) e glucosamina (D) (T-ChOS) em sinergia com monómeros de glucosamnina ou N-acetilglucosamina adicionados. 0 componente de quitooli-gómero compreende hetero-quitooligómeros tal como definidos atrás, que possuem uma significativa distribuição do comprimento da cadeia na gama de resíduos de 4-20 monómeros e cada cadeia oligomérica pode ter dois ou mais resíduos de N-acetilglucosamina (AA) em cada ou ou ambas as extremidades da cadeia oligomérica. A sequência da cadeia interna é tal que um resíduo de N-acetilglucosamina (A) não fica adjacente ao outro resíduo de N-acetilglucosamina (tal como AA). A composição compreende ainda monómeros de glucosamina e/ou N-acetilglucosamina, preferencialmente na razão em peso tal como descrita atrás. Esta composição farmacêutica pode estar na forma de um pó, uma suspensão, um gel, aerossol, uma pasta, um filme, espuma, uma pílula e uma cápsula. A composição farmacêutica pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. O presente invento descreve também o uso das composições do invento para a produção de um biomate-rial/medicamento para anti-inflamação e regeneração dos tecidos. O presente invento descreve também um uso das composições do invento para a produção de um biomate-rial/medicamento para regular a síntese do colagénio de modo a evitar a formação de cicatriz na reparação do tecido. A composição compreende quitooligómeros terapeuti-camente ativos de N-acetilglucosamina (A) e glucosamina (D) (T-ChOS), de acordo com o primeiro aspeto do presente invento.

Descrição do presente invento A composição do presente invento é uma combinação de dois materiais de quitina que apresentam efeito sinergistico na regeneração dos tecidos. Foi demonstrado que os quitooligómeros terapeuticamente ativos (T-ChOS) se ligam a proteinas do tipo Quitanase (CLP) no corpo e os nossos dados mostram que as CLPs podem desempenhar um papel na sintese do colagénio no corpo como resultado da interação entre as CLPs e o T-ChOS, a sintese do colagénio é regulada. A sintese do colagénio do Tipo II na cartilagem articular é iniciada pela formação de procolagénio, que é sintetizada em duas formas alternativamente unidas PIIANP e PIIBNP, em que o PIIANP imobiliza TGF-βΙ, BMP-2 e BMP-4, da superfamilia dos TGF-β; isto potencialmente regula a sinalização do fator de crescimento durante o desenvolvimento e é um elemento chave para a regulação da formação óssea endocondral, a via natural de formação de osso (ossificação encocondral) envolvendo a formação de tecido de cartilagem, vascularização do tecido da cartilagem, aumento da mineralização e subsequente ossificação do tecido de cartilagem induzido que forma o osso lamelar. As Proteinas Morfogénicas do Osso (BMPs) são indesejadas durante a formação do colagénio articular e os primeiros passos de formação do osso mas são especificamente libertados quando o tecido é guiado através da via da formação óssea endocondral.

Uma vez que o presente invento mostra que a presença de DP2-3 bloqueia a desejada ação biológica da composição, o componente T-ChOS da composição do presente invento é ainda caracterizado pelo facto de as quantidades de monómeros, dimeros e trimeros (DPI, DP2 e DP3) serem grandemente reduzidas.

As composições oligoméricas do presente invento representam a otimização da atividade terapêutica das composições oligoméricas incluindo; biodisponibilidade, bioestabilidade e bioatividade. As composições oligoméricas aqui referidas como "Oligossacáridos Terapêuticos" (T-ChOS) têm sido produzidas através de um método descrito no documento WO 2006/134614 para recuperar o polimero de quitina parcialmente desacetilado altamente puro e completamente solúvel. Uma composição polimérica de quitina parcialmente desacetilada é tratada com a familia 18 de endo-quitinase e subsequentemente filtrada para dar origem à composição desejada com um comprimento de cadeia na gama de residuos de 4-20 monómeros e cada cadeia oligomérica pode ter dois residuos N-acetilglucosamina (AA) em qualquer uma ou ambas as extremidades da cadeia oligomérica. A sequência da referida cadeia interna é tal que um residuo de N-acetilglucosamina (A) não fique adjacente a outro resíduo de N-acetilglucosamina (ou seja, não se formam pares "AA" na porção interna da cadeia com os dois resíduos nas extremidades terminais que podem ser AA) . Como resultado desta contribuição a composição com o comprimento de cadeia de resíduos de 4-20 monómeros não pode ser quebrada pelas quitinases no corpo. O grau de desacetilação dos oligómeros está preferencialmente na gama de cerca de 30-60%, tal como cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50% ou cerca de 60%. O padrão sequencial dos quitooligómeros terapêuticos afeta diretamente a sua atividade biológica, ou seja, como é que estes são transportados através das membranas biológicas (biodisponibilidade) , quão rapidamente estes se decompõem nos sistemas vivos (bioestabilidade) e quanto é que interagem com proteínas como a quitinase e outros receptores específicos ligando a sequências quitinosas (bioatividade).

Biodisponibilidade, ou a capacidade de uma dada substância de passar através das membranas biológicas, está relacionada com a hidrofobicidade das moléculas. Uma vez que todas as membranas biológicas são predominantemente de natureza hidrofóbica, a regra geral aplica-se, a de que quanto mais hidrofóbica a substância melhor esta pode penetrar as tais membranas biológicas. A N-acetilglucosamina e os oligómeros de quitina completamente aceti-lados são mais hidrofóbicos do que o correspondente monómero de glucosamina ou o monómero de quitosano altamente desacetilado, sugerindo que os hetero-oligómeros quitinosos possuirão uma maior biodisponibilidade com acetilação aumentada. Assim as formulações de T-ChOS foram otimizadas para conter uma quantidade máxima de N-acetilglucosamina na sua estrutura molecular de modo a maximizar a sua biodisponibilidade, sem prejudicar a sua bioestabilidade.

Bioestabilidade de um composto orgânico refere-se à sua suscetibilidade aos enzimas endógenos num organismo vivo e à sua meia-vida (t1/2) nesse organismo. Quanto mais suscetivel menos bioestável é o composto. Em humanos, os enzimas quitinoliticos podem ser divididos em dois grupos; enzimas com elevado nivel de especificidade quinolitica como a Familia 18 das quitinases (AMCase, Quitotriosidase), possuindo elevada atividade especifica, ou enzimas com menos especificidade quitinolitica tal como lisozima e provavelmente algumas proteases que acontece degradarem a quitina e quitosano mas com menor atividade especifica. Através de desacetilação parcial, as composições T-ChOS foram otimizadas procurando a estabilidade máxima através de hidrólise com a Familia 18 de quitinase. Uma vez que estes enzimas requerem uma sequência de dois ou mais residuos de N-acetilglucosamina consecutivos como reconhecimento pela clivagem, as composições T-ChOS são especificamente otimizadas para excluir tais sequências na parte interna da molécula.

Bioatividade de uma substância orgânica ou de um ligando está diretamente ligada à afinidade do ligando em relação ao recetor alvo despoletando a resposta biológica. Pouco é sabido acerca do papel biológico dos compostos quitinosos no corpo humano, embora haja indicações de os oligómeros de quitina desempenharem um papel vital num desenvolvimento embriónico. Isto sugere que o genoma humano é capaz de expressar recetores específicos, que são espe-cificamente ativados quando se ligam aos oligómeros da quitina. As únicas proteínas de ligação à quitina conhecidas no corpo humano, são as proteínas como a quitinase (CLPs), pertencendo geneticamente à Família 18 das quitinases, embora uma maioria destes tenham perdido a sua atividade enzimática, mas preservando ainda o seu domínio de ligação à quitina. 0 termo " ossificação endocondral" refere-se a um processo de formação de osso, através do qual se desenvolve cartilagem dando origem primeiro à estrutura do osso final. 0 tecido cartilaginoso necessita de menos tensão de oxigénio local para o seu desenvolvimento e manutenção do que o tecido ósseo maduro e, por isso, sempre que o sistema de fornecimento de sangue não atingiu o seu estágio final de desenvolvimento, a cartilagem suplantará o osso. A cartilagem será apenas substituída pelo novo osso após a vascularização ter atingido o seu estado avançado, garantindo o fornecimento essencial de oxigénio aos tecidos em desenvolvimento. Este processo de formação de osso é também típico durante o passo embriónico, particularmente em vértebras, ossos compridos, externo, etc.

No presente contexto o termo "dispositivo médico" refere-se geralmente a um instrumento, utensilio, máquina, dispositivo, implante, reagente in vitro ou outro artigo semelhante ou relacionado, incluindo uma parte de componente, ou acessório que se pretenda utilizar no diagnóstico de uma doença ou outras condições, ou na cura, mitigação, tratamento ou prevenção da doença, em humanos ou outros animais, ou pretende afetar a estrutura ou qualquer função do corpo de humanos ou outros animais. Neste contexto, o termo "produto biomaterial" é usado interper-mutavelmente com o termo "dispositivo médico".

As composições farmacêuticas aqui descritas compreendem os quitooligómeros terapêuticos (T-ChOS) e em sinergia com a glucosamina e/ou N-acetilglucosamina. Estes podem ser administrados sistemicamente e ligados a CLPs endógenos, muitos dos quais foram demonstrados como, ou implicados como desempenhando um papel em várias doenças e condições. Entre as doenças e condições que estão associadas à elevada expressão de CLPs estão as doenças degenerativas (por exemplo, artrite reumatoide) e outras doenças incluindo osteoartrite. Verifica-se que as composições T-ChOS do invento são úteis para tratar e/ou remediar estas doenças assim como condições relacionadas com a formação de tecido ósseo e condições tal como a regeneração óssea após intervenções cirúrgicas ou trauma. Contudo, em conjunto com a glucosamina este efeito é aumentado. A razão adequada dos oligómeros e monómeros de T-ChOS é preferencialmente tal como descrita atrás. A composição pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável tal como um auxiliar de processamento ou agentes de estabilidade, diluentes, agentes de sabor, nutrientes, ou agentes de cor ou ingredientes apropriados adicionais biologicamente ativos ou não ativos. A composição farmacêutica deve estar preferencialmente na forma adequada para administração oral, tal como uma forma seca que pode ser prontamente dissolvida, por exemplo num copo de água. Tais formas incluem as formas de pó seco, uma suspensão, um gel, um filme, espuma, uma solução coloidal, aerossol, granular, floco, fibra e pasta. Contudo, a composição pode ser também contida em pilulas ou cápsulas. As composições farmacêuticas podem ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. São também descritas composições que são usadas para a produção de um biomaerial/medicamento para a regeneração óssea, tal como a melhoria da regeneração do osso na cura de um osso fraturado ou cortado num mamífero. Tal medicamento aumenta, por exemplo, a formação do osso através da ossificação endocondral por ativação das células progenitoras específicas do tecido. 0 biomaterial pode compreender um ou mars outro componente selecionado do grupo constituído por fosfatos de cálcio, incluindo hidroxipatite, sulfato de cálcio, tripolifosfato de sódio, alginato, colagénio, ácido hialurónico e polímero de quitosano. A composição pode estar numa forma adequada para outras formas de administração sistémica, tal como administração intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Tais formas adequadas são formas de solução com um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável de acordo com a prática farmacêutica corrente. As referidas formas de solução são estéreis e o pH é adequadamente ajustado e tamponado. Para uso intravenoso, a concentração total do soluto deve ser controlada para tornar a preparação isotónica. 0 T-ChOS só, pode ser usado como medicamento para conduzir a reparação do tecido danificado ou doente para longe da fibrose que conduz à formação de cicatriz, mas em vez disso para induzir a regeneração de tecido ou a reparação de tecido funcional, resultando na regeneração de um tecido funcional saudável. Esta regulação da via de reparação do tecido é efetuada através do controlo da sintese do colagénio no tecido ferido ou inflamado.

Numa forma de concretização do presente invento T-ChOS + glucosamina são usados como medicamento para a redução do peso na mulher pós-menopáusica.

No presente contexto o termo "dispositivo médico" refere-se geralmente a um instrumento.

Os quitooligómeros terapêuticos deste invento são particularmente úteis em biomateriais para vários fins. Para além de apresentar todas as caracteristicas vantajosas do quitosano convencional (biocompatibilidade, capacidade de se misturar com outros componentes para produzir misturas adequadas para dispositivos médicos, tais como implantes mecânicos, dispositivos de administração de fármacos, etc.), estes possuem uma solubilidade significativamente aumentada e uma atividade biológica ou terapêutica devido à sua elevada afinidade com os CLPs no corpo, tal como descrito atrás. A formulação dos biomateriais pode incluir, adequadamente, outros componentes orgânicos e inorgânicos tais como vários biopolímeros (alginatos e outros polissacáridos etc.), colagénio, fosfatos de cálcio, incluindo hidroxiapatite, sulfato de cálcio, tripolifosfato de sódio, di-hidrogenofosfato de sódio, glicerol-fosfato de sódio, óxido de cálcio, hidróxido de cálcio e vários ácidos orgânicos ou carboxilicos etc.

Descrição detalhada de uma forma de concretização preferida 0 presente invento será agora descrito com mais detalhe usando exemplos e figuras para a capacitação do invento reivindicado.

Figuras

Figura 1. Análise HPLC (coluna TSK-Oligo; TosoHaas, Japão) da Oligomina e T-ChOS.

Figura 2. Efeito de vários aminoaçúcares na libertação de sulfato de condoitina acumulada nos dias 10-23. Oligomina a 200 e 400 yg/ml (01 200 e 01 400) assim como glucosamina a 400 yg/ml (D400) apresentam uma redução significativa da degradação do sulfato de condroitina. Valores médios e SEM (desvio padrão da medição). N(grupo)=24

Figura 3. Efeito de T-ChOS no propéptido N- terminal do colagénio do tipo II (PIINP) libertado no meio entre o dia 20 e o dia 22. Sem efeito exceto para T-ChOS a 50, 100, 200 e 400 yg/ml. Médias e SEM; N(grupo)=24

Figura 4. Efeito de T-ChOS + glucosamina (D) no propéptido N-terminal acumulativo do colagénio do tipo II (PIINP) libertado no meio (dia 20 e dia 24 reunidos) . Médias e SEM; N(grupo)=8

Figura 5. Efeito de T-ChOS + glucosamina (D), glucosamina e IGF-1 na libertação acumulada de sulfato de condroitina do dia 17 ao dia 24. Médias e SEM; N(grupo)=16. IGF-1 e T-ChOS + D apresentam um aumento significativo da libertação acumulada de sulfato de condroitina. Baseado nos dados mostrados na Figura 9.

Figura 6. A indução relacionada com a dose de T-ChOS no nivel de propéptido N-terminal do colagénio do tipo II (PIINP) no meio no dia 18 a dia 25 num explante de cartilagem AO humana. Apenas o T-ChOS mostrou indução. Os asteriscos indicam a significância de T-ChOS de 400 pg/ml a 0 yg/ml através do teste de t (*=p<0,05, **=p<0,01, * **=p<0,001) . Valores médios e SEM; N(grupo)=4

Figura 7. Efeito de três aminoaçúcares na expressão do YKL-40 para o periodo (N=4; valores médios e SEM) .

Figura 8. Expressão de YKL-40 relacionado com a expressão de PIINP para os grupos de controlo, glucosamina, Oligomina e T-ChOS nos dias 15-25. O grupo T-ChOS mostra uma expressão significativamente superior de PIINP (N=20).

Figura 9. Efeito da glucosamina, T-ChOS e combinação de T-ChOS + glucosamina no diâmetro do tornozelo acumulado (Acc AD) desde o dia 9 até ao dia 17. 0: sem tratamento, D21: 21 mg/kg/ratazana de glucosamina, T: 7,1 mg/kg/ratazana de T-ChOS, T-D14, 21 e 28: T: 7,1 mg/kg/ratazana de T-ChOS + 14, 21 e 28 mg/kg/ratazana de glucosamina respetivamente.

Figura 10. Efeito da glucosamina, T-ChOS (T) e T-ChOS + combinação de glucosamina (T+D21) na classificação de danos na cartilagem do tornozelo. Os números indicam doses diárias (mg/kg ratazana) . Os asteriscos indicam uma diferença significativa do 0 através do teste de t.

Figura 11. Efeito da glucosamina, T-ChOS (T) e T-ChOS + combinação de glucosamina (T+D21) na classificação da reabsorção do osso do tornozelo. Os números indicam doses diárias (mg/kg ratazana). Os asteriscos indicam uma diferença significativa do 0 através do teste de t.

Figura 12. Efeito da glucosamina, T-ChOS (T) e T-ChOS + combinação de glucosamina (T+D21) na classificação do pano do tornozelo. Os números indicam doses diárias (mg/kg ratazana) . Os asteriscos indicam uma diferença significativa do 0 através do teste de t.

Figura 13. Efeito da glucosamina, T-ChOS (T) e T-ChOS + combinação de glucosamina (T+D21) na classificação histopatológica total do tornozelo. Os números indicam doses diárias (mg/kg ratazana). Os asteriscos indicam uma diferença significativa do 0 através do teste de t.

Figura 14. Efeito da glucosamina, T-ChOS (T) e T-ChOS + combinação de glucosamina (T+D21) na formação do pano do joelho. Os números indicam doses diárias (mg/kg ratazana). Os asteriscos indicam uma diferença significativa do 0 através do teste de t.

Figura 15. Efeito da glucosamina, T-ChOS (T) e T-ChOS + combinação de glucosamina (T+D21) na reabsorção do osso do joelho. Os números indicam doses diárias (mg/kg ratazana). Os asteriscos indicam uma diferença significativa do 0 através do teste de t.

Figura 16. Efeito da glucosamina, T-ChOS (T) e T-ChOS + combinação de glucosamina (T+D21) na classificação histopatológica total do joelho. Os números indicam doses diárias (mg/kg ratazana) . Os asteriscos indicam uma diferença significativa do 0 através do teste de t.

Figura 17. Efeito da Oligomina, T-ChOS só e T-ChOS em combinação com N-acetilglucosamina (A) ou glucosamina (D) na dor e inflamação num doente com artrite reumatoide (RA). As classificações são de 0 (sem alivio) a 10 (alivio completo). As doses diárias foram Oligomina: 2200 mg, T-ChOS: 700 mg, N-acetilglucosamina (A) ou glucosamina (D): 1500 mg. As setas indicam quando é gue os monómeros foram adicionados ao T-ChOS.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Efeitos regenerativos de aminoaçúcares específicos em explantes de cartilagem bovina e humana sob condições anabólicas e catabólicas O objetivo destas experiências foi o de avaliar o efeito dos aminoaçúcares na formação de cartilagem em cartilagem articular sob condições não estimuladas. Estas experiências podem identificar possíveis efeitos condro- anabólicos destes aminoaçúcares como potenciais fármacos osteoartriticos. Fator 1 de Crescimento do tipo Insulina (IGF-1), 100 ng/ml serviu como controlo de estimulação anabólica positiva dos explantes de cartilagem.

MATERIAL E MÉTODOS

Todos os reagentes usados foram de grau analítico. 0 meio de cultura compreendia o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) contendo penicilina e estreptomicina (Life Technologies, EUA) . Oncoestatina M recombinante humana (OSM) foi obtida da Sigma Aldrich (Reino Unido), enquanto o fator α de necrose tumoral recombinante humano (TNF-α) foi obtido da R&amp;D Systems, Reino Unido.

AMINOAÇÚCARES: PRODUÇÃO E ANÁLISE

Oligomina. Quitooligossacáridos foram produzidos pela Genis à escala piloto (lote G061023). Resumidamente, quitina parcialmente desacetilada (DDA45%) foi hidrolisada pela quitinase até quase ficar completa. A solução foi ultrafiltrada (10 kDa) de modo a eliminar a quitinase e insolúveis e seca por pulverização. T-ChOS. Composições de quitooligómero com uma quantidade grandemente reduzida de DP1-4 foram produzidas a partir de Oligomina pela Genis à escala piloto (lote G051128) . O monómero (DPI ou N-acetilglucosamina) foi eliminado e os oligómeros mais curtos foram reduzidos por ultrafiltração. 0 produto foi seco por pulverização. N-acetilglucosamina (A) e glucosamina (D) foram adquiridas na YSK, Japão. Para análise de todos os aminoaçúcares usados, foi aplicada HPLC usando um sistema Beckman Gold. Foi usada uma coluna TSK-oligo (TosoHaas, Japão), separando o ChOS por peso molecular (DPI, DPs etc.). 0 solvente foi hidróxido de amónio 5 mM, pH 10,0, o caudal foi de 0,5 ml/min, a absorvância ótica foi de 205 nm, o volume de injeção foi de 20 μΐ e a concentração de aminoaçúcar foi de 10 mg/ml.

Para experiências de explantes de cartilagem, as concentrações de aminoaçúcares testadas foram as seguintes. Oligomina e T-ChOS, 50, 100, 200 e 400 pg/ml no meio. N- acetilglucosamina (A) e glucosamina (D), 200 e 400 yg/ml no meio. Combinação de A + D foi de 200 yg/ml cada no meio.

EXPLANTES DE CARTILAGEM

Condições anabólicas

Cultura de explantes de cartilagem articular bovina foram usadas como modelo para doenças degenerativas da cartilagem que permite experiências num modelo de teste/ensaio robusto e simples, em que o efeito dos fatores de crescimento e fármacos no metabolismo da cartilagem pode ser investigado [Olsen, A.K., et al., Anabolic and catabolic function of chondrocyte ex vivo is reflected by the metabolic processing of type II collagen. Osteoarthritis and Cartilage, 2007. 15(3): p. 335-342.].

PREPARAÇÃO DE EXPLANTES DE CARTILAGEM ARTICULAR

Os joelhos foram abertos sob condições semi-estéreis numa bancada LAF. Cortes na superfície da cartilagem articular foram removidos numa manobra num único movimento, removendo apenas a camada mais externa. Cortes muito profundos conterão material de osso subcon-dral/condrosteoso subjacente. Explantes uniformes foram recolhidos a partir do fémur e da tíbia. Explantes da cartilagem situada nos côndilos foram evitados. Os explantes foram transferidos para uma caixa de Petri contendo PBS + pen/strep (penicilina/estreptomicina).

PREPARAÇÃO E DESENVOLVIMENTO EM CULTURA

Os explantes foram indivudualmente pesados e transferidos para uma placa de 96 poços estéril sob condições semi-estéreis num banco de ensaio. Antes disso, os poços foram cheios com 200 μΐ PBS + pen/strep, para manter os explantes húmidos após pesagem. Então, o PBS foi removido e o meio contendo os diferentes tipos e concentrações de aminoaçúcares foram aplicados aos poços, 200 μΐ/poço, de acordo com a configuração. Quatro réplicas de explante foram usados em cada teste. As placas foram incubadas a 37 °C e 5% de CO2 com agitação a 50 rpm. As placas foram cobertas num saco de plástico permeável a CO2 para limitar/evitar a contaminação com esporos. 0 meio de condicionamento foi substituído a cada 2-3 dias, e o sobrenadante foi transferido para uma nova placa de 96 poços e armazenado a -20°C até ao fim da experiência. Diferentes tipos de meio fresco e concentração de aminoaçúcares foram aplicados nos poços, 200 μΐ/poço, de acordo com a configuração a cada 2-3 dias.

No último dia da experiência (22-24 dias) os sobrenadantes foram removidos e a viabilidade das células foi medida através de Alamar Blue, para investigar o número de células e a viabilidade. Também no último dia da experiência a cartilagem foi processada através de extrações de proteínas da cartilagem em vários ensaios.

Os sobrenadantes foram medidos no que se refere à formação de colagénio do tipo II (PIINP), em relação à degradação de agrecano mediado por agrecanase. Foram usados Kits ELISA da Nordic Bioscience.

MEDIÇÕES DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS E DO NÚMERO DAS CÉLULAS

Para assegurar a ação específica e não tóxica dos aminoaçúcares, a atividade metabólica dos condrócitos foi medida por Alamar Blue, que previamente tinha sido demonstrado como se relacionando com o número de células e viabilidade das células.

AVALIAÇÃO DO VOLUME DA CARTILAGEM

Degradação do agrecano mediada por agrecanase: Deteção do fragmento de agrecano 374ARGS: A deteção por ELISA dos fragmentos derivados de agrecanase do 374ARGS N-terminal combina dois anticorpos monoclonais num sistema ELISA sanduíche. 0 método descrito é seguido por Karsdal et al. Arthritis &amp; Rheumatism, 2007. 56(5): p. 1549-1558.

TEOR TOTAL DE PROTEOGLICANO - MEDIÇÕES DE SGAG

Para a deteção de glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) que é a libertação de sulfato de condroitina, o ensaio quantitativo de ligação ao corante para a análise in vitro da libertação GAG foi usada de acordo com as instruções do fabricante (Wieslab, S).

FORMAÇÃO DE COLAGÉNIO DO TIPO II: ELISA PIINP A formação do colagénio do tipo II é medida através de um ensaio ELISA específico baseado num anticorpo que reconhece um epítopo na molécula PIINP fora do exon 2 (PIIANP). Por isso o ELISA não é especificado para a forma IIA e IIB mas reage com ambas as formas.

EXTRAÇÃO DA CARTILAGEM A cartilagem foi extraída para determinar o conteúdo de cartilagem de várias proteínas, em comparação com a excretada para o meio.

Explantes de cartilagem foram congelados em azoto liquido. Os explantes congelados foram pulverizados usando um Bessman Tissue Pulverizer de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. 0 pó foi colocado num tubo de 14 ml usando um bisturi congelado. Tampão Digestivo arrefecido em gelo (tampão Tris HC1 50 mM, pH 7,4 contendo NaCl 0,1 M e Triton X-100 0,1%) foi adicionado e a solução homogeneizada durante 30 segundos usando um homogeneizador Polytron PT-MR 3000 (Brinkmann, Littau-Suíça). O homogenato foi então centrifugado a 15 000 rpm durante 20 min e o sobrenadante recolhido e armazenado a -80°C até outra análise. TEOR DE COLAGÉNIO TOTAL: MEDIÇÕES DE HIDROXI-

PROLINA O colagénio total é avaliado medindo o teor de hidroxiprolina nos explantes usando uma versão modificada do método descrito por Podenphant. (Podenphant, J., N. Larsen, e C. Christiansen, An easy and reliable method for determination of urinary hydroxyproline. Clinica Chimica Acta 1984. 142: p. 145-148).

Resultados

Análise de aminoaçúcar A Figura 1 mostra a comparação dos quito-oligossacáridos de Poligomina e T-ChOS. Para o monómero de

Oligomina o trímero (DP1-DP3) era o principal componente (58,4%) e DP4 e superior era 41,6%.

Para o T-ChOS não foi detetado monómero (DPI) e a fração DP1-DP3 era de apenas 6,1%. 0 octadamero (DP8) foi o principal oligómero em T-ChOS. 0 DP4 e oligómeros mais compridos eram a fração principal ou 93,9%. A análise de HPLC da N-acetilglucosamina (A) e a glucosamina (D) revelaram que o monómero (DPI) era o componente principal e não foram detetados oligómeros (resultados não mostrados).

Estudos de explante de cartilagem bovina

Efeito de diferentes aminoaçúcares

Condições anabólicas A viabilidade de explantes de cartilagem não foi afetada pelos aminoaçúcares, não foi observada diferença significativa entre os vários aminoaçúcares e os grupos de controlo analisados pelo ensaio de Alamar Blue no final do tratamento. A libertação de sulfato de condroitina (ChS) no meio de explante foi medida a partir do dia 3 até ao dia 23 com um intervalo de 2-3 dias. Não houve um efeito de diminuição relacionada com a dose de Oligomina para o último periodo (dia 10-23; regressão linear). Quando a libertação de ChS acumulada para os dias 10-23 foi analisada (Figura 2) não havia uma clara diminuição induzida pela Oligomina da libertação de ChS para o período (p<0,05 para Oligomina 200 e 400 yg/ml; redução de 51%). A glucosamina (D 400 yg/ml) tinha o mesmo efeito (p<0,05). O T-ChOS e a N-acetilglucosamina (A) não tiveram um efeito significativo da libertação de sulfato de condroitina acumulada para o período (Figura 2).

Propéptido N-terminal do colagénio tipo II (PIINP)

De todos os biomarcadores testados, a formação de colagénio do tipo II (concentração de PIINP) foi mais claramente afetada pelos aminoaçúcares. Esta foi medida como libertada pelos explantes de cartilagem no meio ao longo do intervalo de 2-3 dias. Apenas o T-ChOS tinha um forte efeito relacionado com a dose. Este efeito foi apenas observado no último período da incubação do aminoaçúcar. No dia 20 ex vivo não havia efeito observado pelos diferentes aminoaçúcares. A concentração de PIINP era entre 0,1 a 0,2 ng/ml mg cartilagem. No dia 22 não havia um claro aumento de PIINP relacionado com a dose mas apenas pelo T-ChOS (Figura 3) . O efeito era significativamente diferente de zero (M) para todas as concentrações (50, 100, 200 e 400 yg/ml) e o efeito máximo foi de 0,62 ng/ml mg cartilagem ou 17 vezes o controlo. Não houve efeito pela Oligomina na mesma gama de concentração. Os monossacáridos glucosamina (D) e N-acetilglucosamina (A) não tiveram efeito (Figura 3) . Por isso de todos os aminoaçúcares testados apenas o T-

ChOS tinha um forte efeito relacionado com a dose na expressão de PIINP.

Para o teor de proteina na cartilagem extratada, não houve diferença significativa entre os vários aminoaçúcares (ou suas concentrações) e o controlo. Contudo, não houve uma diminuição linear significativa de teor de proteina na cartilagem com uma concentração aumentada de Oligomina (p=0,027; N=20). Para a Oligomina houve um aumento linear do teor de proteina da cartilagem com uma libertação aumentada acumulada de sulfato de condroitina (ChS) (p=0,019; N=20).

Combinação de T-ChOS e glucosamina (T-ChOS+D)

Neste conjunto de experiências de explantes bovinos a glucosamina (200 pg/ml) foi testada em combinação com T-ChOS (50 e 400 yg/ml). Os controlos foram T-ChOS apenas (50 e 400 yg/ml) , Oligomina apenas (50 e 400 pg/ml) ou glucosamina apenas. O Fator 1 de Crescimento do tipo Insulina (IGF-1), 100 ng/ml serviu como controlo de estimulação anabólica positiva.

Propéptido N-terminal de colagénio do tipo II (PIINP)

Houve uma forte indução de T-ChOS na libertação de PIINP e T-ChOS + glucosamina (400 yg/ml + 200 yg/ml) induziu ainda mais o PIINP. Isto torna-se evidente quando se olha para o efeito acumulativo (Figura 4) . O teste t- student revelou uma diferença significativa entre T-ChOS e T-ChOS+D na libertação acumulada de PIINP (Figura 4) . A glucosamina só não tinha efeito. A oligomina 50-400 pg/ml com ou sem 200 yg/ml de glucosamina (D) não teve qualquer efeito na libertação de PIINP no dia 20 a 24. O efeito de T-ChOS, T-ChOS+D e IGF-1 da libertação acumulada de sulfato de condroitina (dias 17-24) é mostrado na Figura 5. Ambos o IGF-1 e T-ChOS+D tinham um aumento significativo na libertação acumulada de sulfato de condroitina (dias 17-24) mas nenhum de T-ChOS e de glucosamina só, tinha qualquer efeito significativo (Figura 5). O ensaio de proteina de cartilagem extratada no dia 24 não revelou qualquer efeito significativo do T-ChOS, T-ChOS+D ou IGF-1.

Estudos de explante de cartilagem humana

Explantes de cartilagem foram obtidos a partir de um joelho de uma mulher de 40 anos que sofria de osteoartrite. Os explantes foram mantidos em meio de crescimento sob condições anabólicas durante 25 dias. Meio fresco foi adicionado a cada 2-3 dias. Os aminoaçúcares (Oligomina, T-ChOS, A e D; concentração diferente) , foram mantidos no meio a partir do dia 0 até ao dia 25. A degradação do agrecano mediada pela agrecanase (fragmento de agrecano 374ARGS-ELISA) não foi afetada pelos diferentes aminoaçúcares no dia 9. A formação de colagénio do tipo II (concentração de PIINP) foi muito claramente afetada pelos aminoaçúcares. Eata foi medida à medida que foi libertada a partir dos explantes de cartilagem para o meio ao longo de um intervalo de 2-3 dias (dias 18-25). Apenas T-ChOS tinha um forte efeito relacionado com a dose. Este efeito foi apenas observado no último período de incubação de aminoaçúcar (dias 18, 20, 22 e 25; Figura 6) . O efeito máximo foi no dia 22, 1,37 ng/ml mg cartilagem ou 3,9 vezes o controlo. Não se verificou efeito com a Oligomina na mesma gama de concentração. A glucosamina (D) não teve efeito. Por isso, de todos os aminoaçúcares testados apenas o T-ChOS tinha um forte efeito relacionado com a dose na expressão de PIINP.

Uma vez que o YKL-40 é um recetor proposto para o T-ChOS, a libertação extracelular de YKL-40 foi analisada no meio, nos dias 4, 11, 15, 20 e 25 em explantes tratados com 400 pg/ml de T-ChOS, Oligomina e glucosamina (D) . A Figura 7 mostra o efeito dos diferentes aminoaçúcares para o período. Para o controlo não havia uma queda significativa na expressão de YKL-40 entre o dia 10 e 20. O R-ChOS e, numa menor extensão, a Oligomina mantiveram uma alta expressão de YKL-40 para o último período (dias 15-25). Houve uma diferença significativa detetada no dia 15 em que o T-ChOS manteve uma elevada expressão de YKL-40. A glucosamina não teve efeito (Figura 7). A Figura 8 mostra a relação entre a expressão de YKL-40 e de PIINP para o período dos dias 15-25 para todos os grupos testados. Apenas o T-ChOS induziu a libertação de PIINP e manteve uma alta expressão de YKL-40 (uma clara regressão linear). Esta relação desapareceu quando o grupo T-ChOS foi excluído dos dados (sem regressão linear). 0 teor total de sulfato de condroitina (extração de sulfato de condroitina) no dia 25 não foi afetado pelos vários aminoaçúcares. Nem foram os níveis totais de proteínas (ensaio de proteína BioRad) nem os níveis totais de hidroxiprolina nos explantes no dia 25. A viabilidade das células dos explantes de cartilagem articular OA humano no dia 25 (ensaio Alamar Blue) foi induzida pelos aminoaçúcares. Houve um efeito relacionado com a dose de todos os três aminoaçúcares testados (regressão linear; p<0,05). 0 efeito era mais forte pela Oligomina do que pelo T-ChOS e o menor pela glucosamina.

Exemplo 2: Efeito do T-ChOS em Combinação com a Glucosamina na Artrite Reumatóide, Usando o Modelo de Ratazana da Artrite Reumatóide Induzida pelo Colagénio do Tipo II

Introdução

Este exemplo descreve um estudo animal dos efeitos possíveis de oligossacáridos usando um modelo de Ratazana de RA. A mistura de ChOS testada é a composição T-ChOS. 0 objetivo deste estudo foi o de investigar se uma combinação de glucosamina e T-ChOS teria um efeito mais forte do que o T-ChOS só.

Materiais e Métodos

Os animais usados foram 10 por grupo para os grupos induzidos com artrite, 4/grupo para o grupo de controlo não induzido), guardados 4-5/gaiola. Para indução da artrite, os animais foram anestesiados com isoflorano e administrados com injeções subcutâneas/intradérmicas (SC/ID) de 300 μΐ de Auxiliar Incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI), contendo 2 mg/ml de colagénio do tipo II bovino (Elastin Products, Owensville, MO) na base da cauda e 2 locais nas costas nos dias 0 e 6. O doseamento das várias composições de oligómeros e/ou monómeros através de via oral (QD a intervalos de 24 h) foi iniciado no dia 0 do estudo e continuado até ao dia 16. Os grupos experimentais são mostrados na Tabela 1:

Tabela 1

Os animais foram dispensados no dia 17 do estudo. A avaliação da eficácia foi baseada em medições com paquímetro do tornozelo, expressa como área sob a curva (AUC), pesos terminais da pata traseira e avaliação histopatológica dos tornozelos e joelhos. Para análise estatística foram realizados vários cálculos de inflamação em relação aos dados do diâmetro do tornozelo, testes-t e Anova (testes paramétricos ou não paramétricos) foram aplicados de acordo com as diretrizes do software (SigmaStat). Todos os animais sobreviveram ao término do estudo.

Resultados

As ratazanas de controlo da doença tratados com veículo tiveram um aumento do peso corporal médio de 14 gramas. 0 ganho de peso corporal para os grupos de tratamento não diferiram significativamente dos controlos da doença.

Uma redução significativa do diâmetro do tornozelo foi verificada em ratazanas tratadas com T-ChOS + 21 mg/kg D (Grupo 5) (dias 12-13 significativos), T-ChOS + 14 mg/D (Grupo 6) (dl2) , ou T-ChOS + 28 mg/D (Grupo 7) (dl2, 15), em comparação com os controlos da doença. 0 efeito do T-ChOS e da glucosamina no diâmetro acumulado do tornozelo (dias 9-17) é mostrado na Figura 9. 0 T-ChOS foi eficaz só assim como em todas as três combinações de concentração de glucosamina. A glucosamina só, não tinha efeito. T-ChOS + 21 mg/kg (Grupo 5) tinha o efeito mais forte.

As classificações de danos na cartilagem do tornozelo foram significativamente reduzidas até ao normal em ratazanas no Grupo 5 (redução de 27%), em comparação com os controlos de doença (Figura 10). Apenas as ratazanas do Grupo 5 apresentaram uma redução significativa.

As classificações de reabsorção do osso do tornozelo foram significativamente reduzidas em relação ao normal em ratazanas no Grupo 5 (redução de 22%), em comparação com os controlos de doença (Figura 11) . Apenas o Grupo 5 mostrou uma redução significativa.

As classificações do pano do tornozelo foram significativamente reduzidas em relação ao normal em ratazanas no Grupo 5 (redução de 24%) , em comparação com os controlos de doença (Figura 12) . Apenas o Grupo 5 mostrou uma redução significativa. A inibição dos parâmetros somados de histopato-logia do tornozelo foi significativa para animais tratados com todos os grupos de aminoaçúcares (Figura 13) . As ratazanas do Grupo 5 mostraram o efeito mais forte (21%; p<0,01), então o T-ChOS só (Grupo 3) (14%; p<0,05), então o Grupo 4 (12%; p<0,05) seguido pelo Grupo 6 (11%) e Grupo 7 (10%) ver Figura 13.

As classificações do pano do joelho foram significativamente reduzidas em relação ao normal em ratazanas tratadas com T-ChOS + 21 mg/kg D (redução de 42%), em comparação com os controlos de doença (Figura 14) . Apenas o T-ChOS + 21 mg/kg D apresentou redução significativa.

As classificações de reabsorção do osso do joelho foram significativamente reduzidas em relação ao normal em ratazanas tratadas com T-ChOS + D21 (redução de 41%), em comparação com os controlos de doença. Apenas o T-ChOS + 21 mg/kg 21 apresentou redução significativa (Figura 15). A inibição dos parâmetros somados de histopa-tologia do joelho foi significativa para animais tratados com T-ChOS (26%; p<0,05), e significativa para aqueles tratados com T-ChOS+21 mg/kg D (32%; p<0,01), em comparação com os controlos de doença (Figura 16).

As classificações somadas dos joelhos aumentaram não significativamente por tratamento com 21 mg/kg D (aumento de 14%), T-ChOS+ 14 mg/kg D (10%) , ou T-ChOS + 28 mg/kg D (13%), em comparação com os controlos de doença. T-ChOS+ 21 mg/kg D tinha o efeito mais forte (Figura 16).

Em resumo, os resultados deste estudo indicaram que o tratamento oral diário com T-ChOS (7,1 mg/kg) + D (21,4 mg/kg) inibiam eficazmente os danos na cartilagem do tornozelo, a reabsorção óssea e a formação de pano. T-ChOS (7,1 mg/kg) + D (21,4 mg/kg) inibia também a formação de pano e a reabsorção óssea no joelho associada ao desenvolvimento da artrite de colagénio do tipo II em ratazanas. Outras doses de T-ChOS em combinação com a D-glucosamina tiveram efeitos significativos esporádicos nas medições com paquímetro do tornozelo e o T-ChOS só tinha um ligeiro beneficio não significativo. Contudo, a D-glucosa-mina só não tinha efeito benéfico.

Em conclusão, o T-ChOS em combinação com a glucosamina melhorou os efeitos do T-ChOS contra a RA num modelo de ratazana induzido por colagénio II. A concentração mais eficaz de glucosamina na combinação de T-ChOS foi de 21 mg/kg ratazana.

Exemplo 3

Efeito da Oligomina, T-ChOS, T-ChOS+N-acetilglu-cosamina e T-ChOs+glucosamina num doente humano com artrite reumatóide

Uma mulher diagnosticada com artrite reumatóide tem usado quitooligómeros produzidos pela Genis ehf ("Oligomin") desde há vários anos de modo a aliviar a sua dor. Esta classificou o alivio da sua dor e mobilidade de modo a que 0 é sem alivio e 10 é alivio completo. O seu alivio para a Oligomina (220 mg/dia) era de 7.

Foi-lhe pedido para mudar para T-ChOS (700 mg/dia). Gradualmente as suas condições pioraram. No dia 20 a classificação do seu alívio tinha baixado para 5. No dia 32 do consumo de T-ChOS, N-acetilglucosamina (1500 mg/dia) foi adicionada ao T-ChOS (Fig. 17). Como resultado as suas condições melhoraram. Em 12 dias de adição de N-acetilglucosamina ao T-ChOS a sua classificação de alívio passou de 5 para 7 (Fig. 15) . Treze dias depois a sua condição estava inalterada (classificação = 7) . Então ela mudou de N-acetilglucosamina para glucosamina (1500 mg/dia) ainda em combinação com T-ChOS (Fig. 17) . Em 16 dias, as suas condições melhoraram ligeiramente resultando num aumento de 7 para 8. Ela tem usado agora esta combinação durante mars de um ano e a sua condição ainda é a mesma e a classificação de alívio é ainda de 8.

Conclusões

Os exemplos anteriores mostram que o T-ChOS é uma combinação específica de composições de quitooligossacárido parcialmente desacetilado em que os monómeros foram removidos da combinação e os dímeros e os trímeros reduzidos até menos de 10% de modo a aumentar a afinidade de ligação às proteínas tipo quitinase. Isto é mostrado no Ex. 1, análise dos aminoaçúcares (Fig. 1). A oligomina, sendo uma mistura bruta de ChOS com grandes frações de monómeros, dímeros e trímeros, não possui as propriedades bioativas mostradas por T-ChOS. A composição é mostrada no Ex. 1, Fig. 1. É demonstrado no

Ex. 1, que a Oligomina não induz a síntese de colagénio do tipo II em explantes de cartilagem enquanto o T-ChOS mostra um aumento de 15-20 vezes da libertação de PIINP.

As composições de oligossacárido possuem uma superior atividade protetora/regenerativa dos tecidos em relação a outras composições de aminoaçúcares e quitooligossacáridos. No Exemplo 1, a libertação de PIINP a partir de explantes de cartilagem é mostrada (Fig. 3). A atividade de T-ChOS é mediada através da interação com Quitinases de Mamífero F18 (Proteínas Tipo Quitinase) . Isto é mostrado no Ex. 1, o T-ChOS faz a mediação da sua atividade de formação de colagénio através da interação com o YKL-40 (Figs. 7 e 8) . A Oligomina não apresentou nenhum desses efeitos (Fig. 8) na gama de concentrações testada. A atividade de T-ChOS pode ser incrementada em combinação com o monómero de Glucosamina. Isto é mostrado no Ex. 1, em que a libertação de PIINP a partir de explantes de cartilagem é aumentada pelo T-ChOS. A combinação de ChOS e Glucosamina é também significativamente mais eficiente do que o T-ChOS só (Fig. 4) . No Ex. 1, a libertação de Sulfato de Condroitina (ChS) a partir de explantes de cartilagem, o efeito de T-ChOS + Glucosamina é próximo do efeito do fator I de crescimento tipo insulina (IGF-1) (Fig. 5). Para além disso, no ex. 2, Figs. 19-26, a administração oral de T-ChOS e glucosamina em conjunto num modelo de ratazana de Artrite Reumatoide é superior em relação à T-ChOS ou glucosamina só. T-ChOS e glucosamina exercerão a sua atividade in vivo após administração oral. Isto é mostrado no Ex. 3, Figs. 4-8, em que a administração oral de T-ChOS e glucosamina em conjunto tem um significativo efeito protetor dos tecidos num modelo de Artrite Reumatoide em ratazanas.

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição para tratamento da artrite reuma-toide, compreendendo: quitooligómeros terapeuticamente ativos de N-ace-tilgucosamina (A) e glucosamina (D) , em que os qui-toligómeros compreendem heteroquitooligómeros que respeitam os seguintes critérios: - os referidos oligómeros possuem um comprimento de cadeia na gama de resíduos de 5-20 monómeros - cada cadeia de oligómero pode ter dois resíduos de N-acetilglucosamina (AA) em qualquer uma ou em ambas as extremidades da cadeia oligomérica, - a parte interna remanescente do oligómero possui, pelo menos, uma quantidade suficiente de resíduos D para evitar que a sequência da referida cadeia interna compreenda um resíduo de N-acetilglucosamina (A) adjacente a outro resíduo de N-acetilglucosamina (tal como AA), - em combinação com glucosamina, - em que a razão entre os monómeros e os oligómeros está na gama entre cerca de 1:5 até cerca de 5:1, e - em que o grau de desacetilação (DD) dos referidos quitooligómeros terapeuticamente ativos está na gama entre 30 - 60%.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida razão entre monómeros e oligómeros está na gama entre cerca de 1:2 até cerca de 4:1.
3. 3. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o biomaterial compreende ainda um componente selecionado de qualquer um dos seguintes: fosfatos de cálcio, incluindo hidroxiapatite, sulfato de cálcio, tripolifosfato de sódio, alginato, colagénio ácido hialurónico e polímero de quitosano.
4. 4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 formulada numa forma selecionada do grupo constituído por um pó, uma suspensão, um gel uma solução coloidal, aerosol, uma pasta, um filme, uma espuma, uma pílula e uma cápsula.
5. 5. Composição da reivindicação 4 compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável.