CN102159218B - 用于医学用途的新型几丁低聚物组合物 - Google Patents

Abstract

用于治疗自体免疫疾病的新型组合物，本发明涉及通过在有需要的人类和其它哺乳动物中全身或局部给予的T-ChOS和葡糖胺和/或N-乙酰基葡糖胺的协同效应来减少炎性并促进组织修复或组织再生的组合物、用途和方法。

Description

用于医学用途的新型几丁低聚物组合物

发明领域

本发明涉及用于医学用途的新型几丁低聚物(chitooligomer)组合物。更具体而言，本发明涉及从几丁质制造的生物材料和药物，它们协同地促进体内和体外的再生和抗炎作用。

技术背景和现有技术

第一代生物材料的开发，尽管具有可接受的机械强度，但是由于它们的功能限于支撑组织替代物，因此造成对于组织治愈的被动作用。这些第一代的生物材料释放降解的碎片，接下来导致慢性炎症、疼痛和渗漏的发生。开发第二代生物可降解的生物材料的主要目的是消除源于第一代材料的碎片颗粒的连续释放所致的慢性、长期问题。这就产生了能提供组织支持特性达所需时间长度(数月)的可植入的生物可降解的材料，并且它们此后经历由周围组织的局部降解并且随后通过尿和/或排泄物分泌到体外。这一技术的实例是目前使用的生物可降解的血管缝合线。

尽管第二代生物材料有良好的生物兼容特性，但是它们对于促进组织治愈的贡献有限，这是因为它们在参与组织治愈和再生的生物过程中的被动作用。开发更加现代的第三代生物材料的需求在于需要开发将主动作用于组织治愈和再生过程的化合物。

本申请人的早先申请WO2006/134614公开了制造用于治疗用途的高度纯化的部分去乙酰化的几丁质生物材料的方法。通过这一方法产生的低聚组合物在此称作“治疗性几丁低聚糖”(TherapeuticChitooligosaccharides，T-ChOS)。该治疗性几丁低聚糖的特征在于它们4-20个单体残基的链长度以及它们的D-葡糖胺(D)和N-乙酰基-D-葡糖胺(A)的特异序列，该低聚物的内部部分具有至少足够的葡糖胺(D)残基来避免N-乙酰基葡糖胺残基(A)与另一N-乙酰基葡糖胺残基相邻(例如AA)。

对于受损的或患病的组织基本上存在两种方式来修复或治愈。一种是通过纤维化造成疤痕形成。由于参与纤维化组织形成的纤维原细胞不具有原始组织细胞的功能，这一修复途径造成受损的组织功能。炎性细胞因子通常参与纤维化。认为YKL-40通过纤维原细胞生长的趋化性以及刺激在纤维化中起作用。

组织修复的替代途径是组织再生或功能性组织修复。在这一途径中，特定组织的功能细胞，可能来自组织特异性祖细胞得以再生，造成健康功能组织的再生。

在骨组织中，成骨生物材料或装置和骨诱导生物材料或装置通过诱导能够发育成软骨和/或骨组织的祖细胞的增殖来促进骨生长，并且表征为不仅在本发明生物材料组合物提供的支架内填充空隙而且也展现造成或诱导机体产生新骨的内在特性的材料。这些材料不仅用作支架，而且也含有诱导新骨形成的蛋白质或其它物质。自体移植已经在整形外科手术中使用多年，并且是辅助机体再生能力的最常见的方法。只有一种商品化可得的产品证明了真正的骨诱导特性，近来从Medtronic引入的称作InFUSE的装置整合了人骨形态发生蛋白(BMP)的重组形式。此外，已将葡糖胺大量用于治疗骨关节炎。

目前尚未发现能够通过全身给药(例如口服、皮下、肌下、静脉内等)来促进组织再生的试剂。

发明概述

在较早的专利申请(WO2006/057011)中，发明人已经证明了植入骨缺损中的部分去乙酰化的几丁质衍生物能够诱导软骨内的骨化。在证明特异氨基糖作用的体外和体内模型中，本发明证明了通过全身给药的T-ChOS和T-ChOS+葡糖胺的再生作用。另外，证明了葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺的二聚物和三聚物(DP2和DP3)展现抑制作用。本发明也公开了T-ChOS和葡糖胺作为生物活性组合物而在风湿性关节炎(RA)中促进抗炎作用和组织再生的出人意料的协同效应。在本发明的实例中进一步证明T-ChOS和葡糖胺的组合，明显地通过与CLP蛋白家族的成员YKL-40的相互作用，而构成促进和增强软骨外植体中II型胶原形成的活性剂。本发明的一个目的在于提供通过向有需要的人和其它哺乳动物全身或局部给予的T-ChOS和葡糖胺和/或N-乙酰基葡糖胺的协同效应来减少炎症并促进组织修复或组织再生的组合物、用途和方法。

在本发明的第一方面，提供一种组合物，该组合物包括由N-乙酰基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)组成的治疗有效的几丁低聚物(T-ChOS)，该几丁低聚物包括必需满足下面条件的杂几丁低聚物：所述低聚物具有在4-20个单体残基范围的有效的链长度分布并且每条低聚物链能够在低聚物链的任一端或两端具有两个N-乙酰基葡糖胺残基(AA)。该内部链的序列(在每端的末端两个残基内的部分)为使得一个N-乙酰基葡糖胺残基(A)不与另一N-乙酰基葡糖胺残基相邻(例如AA)。该组合物进一步包括葡糖胺单体和/或N-乙酰基葡糖胺。根据本发明第一方面的组合物是展现了生物材料的主要标准，即生物兼容性、生物降解性和生物活性的一种生物材料。

治疗有效的几丁低聚物(T-ChOS)和单体的适当比例可取决于特定指征、应用、装置和剂型。广义地，单体和低聚物之间的比例(重量/重量)可以在约1∶10至约10∶1的范围，更优选在约1∶5至约5∶1的范围，包括约1∶1至约5∶1的范围。在某些实施方式中，单体的重量更高并且该范围可在约1∶1至约10∶1的范围，例如更优选在约1∶1至约5∶1的范围，包括约1∶1至约4∶1的范围，例如约2∶1，约4∶1和更优选约3∶1的比例。在其它实施方式中，更多地使用T-ChOS低聚物，使得单体和低聚物的比例在约1∶1至约1∶4的范围，包括约1∶1，约1∶2和约1∶3的比例。

在本发明的第二方面，提供一种药学组合物，包括与所添加的葡糖胺和/或N-乙酰基葡糖胺单体协同的由N-乙酰基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)组成的治疗有效的几丁低聚物(T-ChOS)。几丁低聚物组分包括上面限定的杂几丁低聚物，该杂几丁低聚物具有在4-20个单体残基范围的有效的链长度分布并且每条低聚物链能够在低聚物链的任一端或两端具有两个N-乙酰基葡糖胺残基(AA)。所述的该内部链的序列为使得一个N-乙酰基葡糖胺残基(A)不与另一N-乙酰基葡糖胺残基相邻(例如AA)。该组合物进一步包括葡糖胺单体和/或N-乙酰基葡糖胺，优选按上述的重量比。这一药学组合物可以为散剂、悬剂、凝胶、溶胶、气雾剂、糊剂、膜、泡沫剂、丸剂和胶囊的形式。药学组合物可以进一步包括药学可接受的赋形剂。

在本发明的第三方面，提供本发明的组合物在制造用于抗炎和组织再生的生物材料/药物的应用。

在本发明的第四方面，提供该组合物在制造用于调控胶原合成从而在组织修复时防止疤痕形成的生物材料/药物中的应用。该组合物包括根据本发明第一方面的由N-乙酰基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)组成的治疗有效的几丁低聚物(T-ChOS)。

发明说明

本发明的组合物是在组织再生中显示协同效应的两种几丁质材料的组合。已经证明治疗有效的几丁低聚物(T-ChOS)在机体中结合几丁质酶样蛋白(CLP)并且我们的数据显示CLP可以在机体中的胶原合成方面起作用并且作为CLP和T-ChOS间的相互作用的结果，胶原合成被上调。在关节软骨中II型胶原的合成是由形成原胶原起始的，该II型胶原是以两种替代的剪接形式PIIANP和PIIBNP来合成的，其中PIIANP使TGF-β超家族的TGF-β1、BMP-2和BMP-4固定化。这潜在地调控了发育期间的生长因子发出信号并且是调控软骨内的骨形成的关键要素，该软骨内的骨形成是涉及软骨组织形成、软骨组织的血管化的骨形成(软骨内的骨化)的天然途径，增强诱导的软骨组织的矿化和随后的骨化以形成板层骨。骨形态发生蛋白(BMP)在关节胶原形成以及骨形成的第一阶段期间是不想要的但是当组织被导向软骨内的骨形成途径时被特别地释放。

由于本发明显示出DP2-3的存在阻断了该组合物所需的生物作用，本发明组合物的T-ChOS组分的特征进一步在于单体、二聚体和三聚体(DP1、DP2和DP3)的量大大减少。

本发明的低聚组合物表现出该低聚组合物的治疗活性的优化，所述治疗活性包括：生物利用度、生物稳定性和生物活性。在此的低聚组合物指“治疗性几丁低聚糖”(T-ChOS)，它已经通过WO2006/134614公开的方法进行生产以回收高度纯化的且完全溶解的部分去乙酰化的几丁质聚合物。部分去乙酰化的几丁质聚合物组合物用18家族-内切几丁质酶来处理并且随后过滤以使所需的组合物的链长度在4-20个单体残基的范围内并且每条低聚物链可以在该低聚物链的任一端或者两端具有两个N-乙酰基葡糖胺残基(AA)。所述内部链的序列是使得一个N-乙酰基葡糖胺残基(A)不与另一N-乙酰基葡糖胺残基相邻(即，在具有可为AA的二-残基末端的链的内部部分没有形成“AA”对)。作为这一构造的结果，链长度在4-20个单体残基的组合物不能被机体内的几丁质酶所切割。

低聚物的脱乙酰作用程度优选在约30-60％的范围内，例如约30％，约40％，约50％或约60％。

治疗性几丁低聚物的顺序模式直接影响它们的生物活性，即它们如何在生物膜上运输(生物利用度)，它们如何在生命系统中快速分解(生物稳定性)，以及它们如何与几丁质酶样蛋白以及其它结合几丁质序列的特异受体相互作用(生物活性)。

生物利用度，或一给定物质通过生物膜的能力，是与分子的疏水性相关。由于所有的生物膜主要是疏水性质，适用的一般规则是一物质越疏水，则它越能够渗透此种生物膜。N-乙酰基-葡糖胺和完全乙酰化的几丁质低聚物比相应的葡糖胺单体或高度去乙酰化的壳聚糖低聚物更加疏水，这就暗示了几丁质的杂低聚物随着乙酰化作用增加将拥有增加的生物利用度。因此，优化了T-ChOS制剂以在它们的分子结构中含有最大量的N-乙酰基-葡糖胺以便使它们的生物利用度最大化，而不会危害它们的生物稳定性。

有机化合物的生物稳定性指它在活体生物中对内源酶的敏感性以及它在该生物中的半衰期越敏感，该化合物的生物稳定性越差。在人类中，几丁质分解酶可以分成两类；具有高水平几丁质分解特异性、高的比活性的酶，像18家族几丁质酶(AMCase，壳三糖酶)；或者具有较差几丁质分解特异性的酶，如裂解酶和可能的一些蛋白酶，它们恰好降解几丁质和壳聚糖，只是比活性较低。通过部分去乙酰化，使T-ChOS组合物优化为对18家族几丁质酶的水解具有最大稳定性。由于这些酶需要两个或更多个连续的N-乙酰基-葡糖胺残基的序列作为切割识别位点，因此T-ChOS组合物被特别优化为在分子的内部部分排除此种序列。

有机物质或配体的生物活性与配体对引发生物反应的靶受体的亲和性直接关联。尽管有迹象表明几丁质低聚物在胚胎发育中起重要作用，但是对于几丁质化合物在人体内的生物作用仍旧了解不多。这表明人类基因组能够表达在结合几丁质低聚物时被特异活化的特异受体。人体中唯一已知的几丁质结合蛋白是几丁质酶样蛋白(CLP)，它们在遗传学上属于18家族几丁质酶，然而它们中的大多数已经丧失了它们的酶促活性，只是仍旧保留了它们的几丁质酶结合结构域。

术语“软骨内的骨化”指软骨首先发育，产生最终骨的框架的骨形成过程。软骨组织需要比成骨组织更少的局部氧张力用于它的发育和维持，因此，只要供血系统没有达到其发育的最终阶段，软骨就将取代骨。软骨将只在血管形成达到其后期后才被新骨代替，以保证向发育组织的必要氧供给。这一骨形成过程在胚胎阶段，特别是椎骨、长骨、胸骨等中也是典型的。

在这一上下文中，术语“医疗设备”通常指仪器设备、器具、仪器、工具、移植物、体外试剂或其它类似或相关的物体，包括组件部件，或旨在用于诊断疾病或其它症状，或治愈、减轻、治疗或预防疾病，特别是在人或其它动物中，或者旨在影响人或其它动物的机体的结构或任何功能的辅助物。在此的上下文中，术语“生物材料产品”与术语“医疗设备”互换使用。

在此所述的药学组合物包括与葡糖胺和/或N-乙酰基-葡糖胺协同的治疗性几丁低聚物(T-ChOS)。它们可以全身给药并且与内源CLP结合，它们中的许多已显示出或暗示了对若干疾病和症状起作用。在这些与CLP表达升高相关的疾病和症状中，有退行性疾病(例如风湿性关节炎)以及包括骨关节炎的其它疾病。发现本发明的T-ChOS组合物对于治疗和/或医治这些疾病以及与骨组织形成相关的症状以及诸如外科手术或外伤后的骨再生的症状是有用的。然而，和葡糖胺一起，这一作用被提高。T-ChOS低聚物和单体的适当比例优选如上所述。

该组合物可进一步包括药学可接受的赋形剂，例如加工助剂或稳定剂、稀释剂、调味剂、营养物、或着色剂或适当的其它生物活性或非活性成分。

药学组合物应优选地以适于口服给药的形式，例如可以容易地溶解例如在一瓶水中的干燥形式。此种形式包括干粉剂、悬剂、凝胶、膜、泡沫剂、溶胶、气雾剂、颗粒、薄片、纤维和糊剂形式。然而，该组合物也可以包含在片剂或胶囊中。药学组合物可进一步包括药学可接受的赋形剂。

在本发明的进一步的实施方式中，该组合物用于制造用于组织再生的生物材料/药物，例如增强骨再生来治愈哺乳动物的断裂的或切断的骨。此种药物通过活化组织特异的祖细胞进行软骨内的骨化来增强例如骨形成。

在本发明的实施方式中，生物材料包括选自磷酸钙(包括羟磷灰石)、硫酸钙、三聚磷酸钠、藻酸盐、胶原、透明质酸和壳聚糖聚合物中的一种或多种的其它组分。

在其它有用的实施方式中，本发明的组合物是适于其它形式的全身给药的形式，例如肌内、皮下或静脉内给药。根据标准药学实践，此种适当的形式是具有药学可接受的载体或赋形剂的溶液形式。所述溶液形式是无菌的，并且pH被适当调节及缓冲。对于静脉内使用，应控制溶解物的总浓度以使制剂是等渗的。

在本发明的一个实施方式中，T-ChOS单独被用作使受损或患病组织的组织修复远离会导致疤痕形成的纤维化的药物，而是诱导组织再生或功能性组织修复，因而产生健康功能组织的再生。这一组织修复途径的调控通过控制受伤或炎性组织中的胶原合成来完成的。在本发明的一个实施方式中，T-ChOS+葡糖胺被用作减少女性在更年期后体重增加的药物。

在本发明的上下文中，术语“医疗设备”通常指仪器。本发明的治疗性几丁低聚物尤其可用于多种目的的生物材料。除了展现常规壳聚糖的所有有益特征(生物兼容性、能与其它组分混合以生产适当的混合物用于医疗设备，如机械性植入物、药物递送装置等)外，如上所述，由于它们对机体内的CLP的高亲和性，它们拥有明显增加的溶解性以及生物或治疗活性。

该生物材料的制剂可以适当地包括其它有机和无机组分，例如各种生物聚合物(藻酸盐和其它多糖等)、胶原、磷酸钙(包括羟磷灰石)、硫酸钙、三聚磷酸钠、磷酸二氢钠、甘油磷酸钠、氧化钙、氢氧化钙和各种有机酸或羧酸等。

优选实施方式的详细说明

现在将使用用于实现所主张发明的实施例和附图更具体地公开本发明。

附图

图1、Oligomin和T-ChOS的HPLC分析(TSK-Oligo柱；TosoHaas，Japan)。

图2、对于第10-23天，各种氨基糖对积累的硫酸软骨素释放的影响。200和400μg/ml的Oligomin(Ol200和Ol400)以及400μg/ml葡糖胺(D400)显示出硫酸软骨素分解的显著下降。平均值和SEM(测量的标准差)；N(组)＝24。

图3、在第20天和第22天之间，T-ChOS对释放到培养基中的II型胶原的N-末端前肽(PIINP)的影响。除了50、100、200和400μg/ml的T-ChOS以外，没有影响。平均值和SEM；N(组)＝4。

图4、在合并的第20天和第24天之间，T-ChOS+葡糖胺(D)对释放到培养基中的累积的II型胶原的N-末端前肽(PIINP)的影响。平均值和SEM；N(组)＝8。

图5、从第17天到第24天，T-ChOS+葡糖胺(D)、葡糖胺和IGF-1对累积的硫酸软骨素释放的影响。平均值和SEM；N(组)＝16。IGF-1和T-ChOS+D显示出累积的硫酸软骨素释放的显著增加。基于图9示出的数据。

图6、在人OA软骨外植体中，在第18天至第25天，T-ChOS对培养基中II型胶原的N-末端前肽(PIINP)水平的剂量相关诱导。只有T-ChOS显示出诱导。星号表示通过t-检验400μg/ml至0μg/ml的T-ChOS的显著性(^*＝p＜0.05，^**＝p＜0.01，^***＝p＜0.001)。平均值和SEM；N(组)＝4。

图7、对于该时期，三种氨基糖对YKL-40表达的影响(N＝4；平均值和SEM)。

图8、在第15-25天，对于对照、葡糖胺、Oligomin和T-ChOS组，与PIINP表达相关的YKL-40的表达。只有T-ChOS组显示出明显更高的PIINP表达(N＝20)。

图9、从第9天到第17天，葡糖胺、T-ChOS以及T-ChOS+葡糖胺组合对积累的踝直径(AccAD)的影响。0：未处理，D21：21mg/kg/大鼠的葡糖胺，T：7.1mg/kg/大鼠的T-ChOS，T+D14、21、28：T：分别地，7.1mg/kg/大鼠的T-ChOS+14、21和28mg/kg/大鼠的葡糖胺。

图10、葡糖胺、T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺组合(T+D21)对踝软骨损伤分数的影响。数字表示每日剂量(mg/kg大鼠)。星号表示通过t检测与0的显著差异。

图11、葡糖胺、T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺组合(T+D21)对踝骨吸收分数的影响。数字表示每日剂量(mg/kg大鼠)。星号表示通过t检测与0的显著差异。

图12、葡糖胺、T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺组合(T+D21)对踝关节翳分数的影响。数字表示每日剂量(mg/kg大鼠)。星号表示通过t检测与0的显著差异。

图13、葡糖胺、T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺组合(T+D21)对踝总组织病理学分数的影响。数字表示每日剂量(mg/kg大鼠)。星号表示通过t检测与0的显著差异。

图14、葡糖胺(D21)、T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺组合(T+D)对膝盖关节翳形成的影响。数字表示每日剂量(mg/kg大鼠)。星号表示通过t检测与0的显著差异。

图15、葡糖胺(D21)、T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺组合(T+D)对膝盖骨吸收的影响。数字表示每日剂量(mg/kg大鼠)。星号表示通过t检测与0的显著差异。

图16、葡糖胺(D21)、T-ChOS(T)以及T-ChOS+葡糖胺组合(T+D)对膝盖总组织病理学分数的影响。数字表示每日剂量(mg/kg大鼠)。星号表示通过t检测与0的显著差异。

图17、Oligomin、单独T-ChOS以及T-ChOS组合N-乙酰基葡糖胺(A)或葡糖胺(D)对风湿性关节炎(RA)病患的疼痛和炎症的影响。评级为0(未减轻)到10(彻底减轻)。每日剂量为Oligomin：2200mg，T-ChOS：700mg，N-乙酰基葡糖胺(A)或葡糖胺(D)：1500mg。箭头表示单体何时加入T-ChOS。

实施例

实施例1：在合成代谢和分解代谢条件下，特异氨基糖在牛和人软骨外植体中的再生作用

这些实验的目的是评估在非刺激条件下，氨基糖对关节软骨中的软骨形成的影响。这些实验可以将这些氨基糖的可能的软骨合成代谢效应鉴定为潜在的骨关节炎药物。100ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)用作软骨外植体的阳性合成代谢刺激对照。

材料和方法

所用所有试剂均为分析级。培养基包括含有青霉素和链霉素(LifeTechnologies，US)的Dulbecco’sModifiedEagleMedium(D-MEM)。人重组制瘤素M(OSM)来自SigmaAldrich(UK)，而人重组肿瘤坏死因子α(TNF-α)来自R&DSystems，UK。

氨基糖：生产和分析

Oligomin.由Genis以中试规模(lotG061023)生产几丁低聚糖。简言之，用几丁质酶使部分去乙酰化的几丁质(DDA45％)几乎彻底水解。对溶液进行超滤(10kDa)以除去几丁质酶和不溶物并进行喷雾干燥。

T-ChOS.由Genis以中试规模(lotG051128)从Oligomin生产具有极大降低的DP1-4量的几丁低聚物组合物。通过超滤除去单体(DP1或N-乙酰基葡糖胺)以及减少较短的低聚物。将产物喷雾干燥。N-乙酰基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)购自YSK，Japan。对于所有氨基糖的分析，使用BeckmanGold体系来应用HPLC。使用TSK-oligo柱(TosoHaas，Japan)，通过分子量来分离ChOS(DP1、DP2等)。溶剂是5mM氢氧化铵，pH10.0，流速为0.5ml/min，光吸收为205nm，注射体积为20μl并且氨基糖浓度为10mg/ml。

对于软骨外植体实验，所检测的氨基糖浓度如下。Oligomin和T-ChOS在培养基中为50、100、200和400μg/ml。N-乙酰基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)在培养基中为200和400μg/ml。在每种培养基中，A+D组合为200μg/ml。

软骨外植体

合成代谢条件

将牛关节软骨外植体培养物用作软骨退行性疾病的模型，其使得实验处于稳健且简单的检测-模型/检测法中，而可以调查生长因子和药物对软骨代谢的影响[Olsen，A.K.等人，AnabolicandcatabolicfunctionofchondrocyteesvivoisreflectedbythemetabolicprocessingoftypeIIcollagen.OsteoarthritisandCartilage，2007.15(3)：第335-342页]。

关节软骨外植体的制备

在LAF工作台中于半灭菌条件下打开膝盖。在一步移动策略中除去表面关节软骨的切口，只除去最外层。太深的切口将包含下面的软骨下骨/软骨架构材料(subchondralbone/chondrosteousmaterial)。从股骨和胫骨收获均一的外植体。避免在髁处来自软骨的外植体。将外植体转移到含有PBS+pen/strep(青霉素/链霉素)的Petri-盘中。

制备和培养

对外植体单独称重并在半灭菌条件下，在气流工作台中转移至灭菌的96孔板。之前，用200μLPBS+pen/strep填充孔并在称重之后保持外植体湿润。然后除去PBS，并且根据计划，以200μL/孔将含有不同类型和浓度的氨基糖的培养基施加到孔中。对于每个实验使用4个外植体重复。将板在37℃和5％CO₂下以50rpm振荡孵育。用CO₂可渗透的塑料袋盖住板以限制/避免孢子污染。每两天-三天替换条件培养基，并将上清转移到新的96孔板中并于-20℃储存直到实验最后。根据每两天-三天的计划，以200μL/孔将不同类型和浓度的氨基糖的新鲜培养基施加到孔中。

在实验的最后日期(22-24天)，除去上清液并且通过AlamarBlue来测量细胞存活率以调查细胞数和存活率。也在实验的最后日期，处理软骨来以多种检测法从软骨提取蛋白质。

测量上清液中的II型胶原形成(PIINP)，用于聚蛋白多糖酶介导的聚蛋白多糖的分解(aggrecanase-mediatedaggrecandegradation)。使用来自NordicBioscience的ELISA试剂盒。

细胞存活率和细胞数测量

为了确保氨基糖的特异且非毒性作用，通过AlamarBlue测量软骨细胞的代谢活性，之前已显示出该活性与细胞数和细胞存活率相关。

软骨TURNOVER的评估

聚蛋白多糖酶介导的聚蛋白多糖的分解：聚蛋白多糖片段374ARGS的检测：在夹心ELISA体系中，将检测N-末端374ARGS的聚蛋白多糖酶源片段的ELISA与两种单克隆抗体组合。下面的方法描述于Karsdal等人，Arthritis&Rheumatism，2007.56(5)：第1549-1558页。

总蛋白聚糖含量-SGAG的测量

为了检测硫酸葡糖氨基葡聚糖(也就是硫酸软骨素，sGAG)释放，根据制造商的说明书(Wieslab，S)使用用于体外分析GAG释放的定量染料结合检测法。

II型胶原形成：PIINPELISA

基于识别PIINP分子外显子2(PIIANP)外的表位的抗体，通过特异的ELISA检测法测量II型胶原形成。因此，ELISA对于IIA或IIB形式并非特异的而是与这两种形式反应。

软骨提取：

提取软骨来测定相比于分泌到培养基中的软骨，不同蛋白质的软骨含量。

在液氮中冷冻软骨外植体。使用BessmanTissuePulverizer根据制造商提供的说明书研磨该冷冻的外植体。使用冷冻的手术刀将粉末放14ml试管中。加入冰冷却的DigestiveBuffer(50mM含有0.1MNaCl和0.1％TritonX-100的Tris·HCl缓冲液，pH7.4)并且使用PolytronPT-MR3000均质器(Brinkmann，Littau-Switzerland)使溶液均质化30sec。然后在15,000rpm离心分离该均质物20min并且收集上清并在进一步分析前于-80℃储存。

总胶原含量：羟脯氨酸的测量

使用Podenphant(Podenphant，J.，N.Larsen，andC.Christiansen，Aneasyandreliablemethodfordeterminationofurinaryhydroxyproline.ClinicaChimicaActa1984.142：第145-148页)所述方法的改良版本，通过测量外植体中的羟脯氨酸含量来评估总胶原。

结果

氨基糖分析

图1示出Oligomin和T-ChOS几丁低聚糖的比较。对于Oligomin，单体至三聚物(DP1-DP3)是主要组分(58.4％)并且DP4以及更高的低聚物是41.6％。

对于T-ChOS，没有检测到单体(DP1)并且DP1-DP3部分只有6.1％。八聚物(DP8)是T-ChOS中的主要低聚物。DP4和更长的低聚物是主要的部分或为93.9％。

N-乙酰基葡糖胺(A)和葡糖胺(D)的HPLC分析揭示单体(DP1)是主要组分并且没有检测到低聚物(结果未示出)。

牛软骨外植体研究

不同氨基糖的影响

合成代谢条件

软骨外植体存活率没有受到氨基糖的影响，通过AlamarBlue检测法在处理后期判断，在各种氨基糖和对照组之间没有观察到显著差异。

从第3天到第23天以2-3天的间隔测量在外植体培养基中的硫酸软骨素(ChS)释放。对于后期(第10-23天；线性回归)，存在oligomin剂量相关的减少影响。当分析第10-23天的积累的ChS释放时(图2)，对该时期存在清楚的Oligomin诱导的ChS释放的减少(对于Oligomin200和400μg/ml，p＜0.05；51％减少)。葡糖胺(D400μg/ml)具有相同的影响(p＜0.05)。T-ChOS和N-乙酰基葡糖胺(A)对于该时期积累的硫酸软骨素释放没有显著影响(图2)。

II型胶原的N-末端前肽(PIINP)

在所有检测的生物标记中，II型胶原形成(PIINP浓度)是受氨基糖影响最明显的。这是随着在2-3天的间隔从软骨外植体释放到培养基中来测量的。只有T-ChOS具有强剂量相关效应。这一效应仅在氨基糖孵育的后期被观察到。在第20天，在活体外没有观察到不同氨基糖的影响。PIINP浓度在0.1和0.2ng/mlmg软骨之间。在第22天，存在明显的PIINP剂量相关的增加，但仅仅是通过T-ChOS(图3)。该影响在所有浓度(50，100，200和400μg/ml)下都与零(M)显著不同并且最大影响为0.62ng/mlmg软骨或者对照的17倍。在相同浓度范围下，没有发现通过Oligomin的影响。单糖葡糖胺(D)和N-乙酰基葡糖胺(A)没有影响(图3)。因此，在所有检测的氨基糖中，仅有T-ChOS对PIINP表达具有强剂量相关效应。

对于提取的软骨蛋白含量，在各种氨基糖(或它们的浓度)和对照之间没有发现显著差异。然而，随着Oligomin浓度增加，软骨蛋白含量存在显著的线性减少(p＝0.027；N＝20)。对于Oligomin，随着积累的硫酸软骨素(ChS)释放增加，存在软骨蛋白含量的线性增加(p＝0.019；N＝20)。

T-ChOS和葡糖胺的组合(T-ChOS+D)

在这一组牛外植体实验中，葡糖胺(200μg/ml)与T-ChOS(5和400μg/ml)组合来检测。对照是仅有T-ChOS(5和400μg/ml)，仅有Oligomin(5和400μg/ml)或仅有葡糖胺。100ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)用作阳性合成代谢刺激对照。

II型胶原的N-末端前肽(PIINP)

存在对PIINP释放的强T-ChOS诱导并且T-ChOS+葡糖胺(400μg/ml+200μg/ml)进一步诱导PIINP。这在观察积累效应时明显(图4)。Student’s检验揭示了T-ChOS和T-ChOS+D之间对积累的PIINP释放的显著差异(图4)。单独的葡糖胺没有影响。在第20和24天，具有或没有200μg/ml葡糖胺(D)的50-400μg/mlOligomin对PIINP释放没有任何影响。

T-ChOS，T-ChOS+D和IGF-1对积累的硫酸软骨素释放(第17-24天)的的影响示出于图5。IGF-1和T-ChOS+D都具有积累的硫酸软骨素释放(第17-24天)的显著增加，但是单独的T-ChOS或者单独的葡糖胺的确都没有任何显著效应(图5)。

在第24天提取的软骨蛋白检测法没有揭示T-ChOS，T-ChOS+D或IGF-1的任何显著影响。

人软骨外植体研究

从罹患骨关节炎的40岁女性的膝盖获得软骨外植体。将外植体在合成代谢条件下于生长培养基中保持25天。每2-3天施加新鲜培养基。从第0到第25天将氨基糖(Oligomin，T-ChOS，A和D；不同浓度)保持在培养基中。

在第9天，聚蛋白多糖酶介导的聚蛋白多糖分解(聚蛋白多糖片段374ARGS-ELISA)未受到不同氨基糖的影响。

II型胶原形成(PIINP浓度)是受氨基糖影响最明显的。这是随着在2-3天的间隔(第18-25天)从软骨外植体释放到培养基中来测量的。只有T-ChOS具有强剂量相关效应。这一效应仅在氨基糖孵育的后期被观察到(第18、20、22和25天；图6)。最大效应是在第22天为1.37ng/mlmg软骨或者对照的3.9倍。在相同浓度范围下，没有发现通过Oligomin的影响。葡糖胺(D)没有影响。因此，在所有检测的氨基糖中，仅有T-ChOS对PIINP表达具有强剂量相关效应。

由于YKL-40是推荐的T-ChOS的受体，在第4、11、15、20和25天，在用400μg/ml的T-ChOS，Oligomin和葡糖胺(D)处理的外植体中分析培养基中的细胞外YKL-40释放。图7示出对于该时期的不同氨基糖的影响。对于对照，在第10和20天之间存在YKL-40表达的显著降低。对于后期(第15-25天)，Oligomin在较小程度上以及T-ChOS都维持高YKL-40表达。在第15天检测到显著差异，其T-ChOS维持高YKL-40表达。葡糖胺没有影响(图7)。图8示出对于第15-25天期间，对所有检测组在YKL-40和PIINP表达之间的关系。只有T-ChOS诱导PIINP释放并且维持高YKL-40表达(明显的线性回归)。这一关系在从数据中排除T-ChOS组时消失(非线性回归)。

在第25天，总硫酸软骨素含量(硫酸软骨素的提取)未受到各种氨基糖的影响。在第25天，外植体中的总蛋白水平(BioRad蛋白检测法)和总羟脯氨酸水平都未受到影响。

在第25天，通过氨基糖诱导人OA关节软骨外植体的细胞存活率(AlamarBlue检测法)。在检测的所有三种氨基糖中都有剂量相关的效应(线性回归；p＜0.05)。通过Oligomin的效应最强，然后是通过T-ChOS以及最小是通过葡糖胺。

实施例2：使用II型胶原诱导的风湿性关节炎大鼠模型，T-ChOS组合葡糖胺对风湿性关节炎的影响

介绍

这一实施例使用RA大鼠模型描述了壳低聚糖的可能效应的动物研究。所检测的ChOS混合物是T-ChOS组合物。这一研究的目的是调查葡糖胺和T-ChOS的组合是否将比单独的T-ChOS具有更强的影响。

材料和方法

所用动物是对于关节炎诱导组为每组10只，对于非诱导对照组为每组4只，每笼住4-5只。对于关节炎诱导组，用异氟烷麻醉动物并且在第0和6天在尾巴基部以及背部两位点给予300μl含有2mg/ml的牛II型胶原(ElastinProducts，Owensville，MO)的Freund’sIncompleteAdjuvant(Difco，Detroit，MI)的皮下/皮肤内(SC/ID)注射。在研究的第0天开始通过口服途径服用各种低聚物和/或单体组合物(QD在24小时间隔)并且持续16天。实验组如表1所示：

表1

组	N	处理时期0-16天
			1	4	正常对照+水媒介
2	10	关节炎+水媒介
			3	10	关节炎+T-ChOS(7.1mg/kg)
4	10	关节炎+D(21.4mg/kg)
			5	10	关节炎+T-ChOS(7.1mg/kg)+D(21.4mg/kg)
6	10	关节炎+T-ChOS(7.1mg/kg)+D(14.3mg/kg)
			7	10	关节炎+T-ChOS(7.1mg/kg)+D(28.6mg/kg)

在研究第17天处死动物。

效率评价是基于踝卡尺测量，其表示为在曲线下的面积(AUC)，后期的后爪重以及踝和膝盖的组织病理学评估。对于统计分析，对踝直径数据进行各种炎症计算，根据软件指南(SigmaStat)来应用Anova和t-检验(变量或非变量检验)。所有动物在研究终止前均存活。

结果

媒介处理的疾病对照鼠具有14g的平均体重。处理组的体重与疾病对照没有显著差异。

相比于疾病对照，在用T-ChOS+21mg/kgD(第5组)(显著日12-13)，T-ChOS+14mgD(第6组)(d12)或T-ChOS+28mg/kgD(第7组)(d12，15)处理的大鼠中看到踝直径的显著减少。T-ChOS和葡糖胺对积累的踝直径的影响(第9-17天)示出于图9。T-ChOS单独以及在所有三种葡糖胺浓度组合中都是有效的。葡糖胺单独没有影响。T-ChOS+21mg/kg(第5组)具有最强的效应。

相比于疾病对照(图10)，在第5组中大鼠踝软骨损伤分数针对正常值显著降低(27％降低)。只有第5组大鼠显示出显著降低。

相比于疾病对照(图11)，在第5组中大鼠踝骨吸收分数针对正常值显著降低(22％降低)。只有第5组显示出显著降低。

相比于疾病对照(图12)，在第5组中大鼠踝关节翳分数针对正常值显著降低(24％降低)。只有第5组显示出显著降低。

对于用所有氨基糖组处理的动物，总计的踝组织病理学参数的抑制是显著的(图13)。第5组大鼠显示出最强的影响(21％；p＜0.01)，然后是单独T-ChOS(第3组)(14％；p＜0.05)，然后是第4组(12％；p＜0.05)，接下来是第6组(11％)，和第7组(10％)。参见图13。

相比于疾病对照(图14)，用T-ChOS+21mg/kgD处理的大鼠膝盖关节翳分数针对正常值显著降低(42％降低)。只有T-ChOS+21mg/kgD显示出显著降低。

相比于疾病对照，用T-ChOS+D21处理的大鼠膝盖骨吸收分数针对正常值显著降低(41％降低)。只有T-ChOS+21mg/kg21显示出显著降低(图15)。

相比于疾病对照(图16)，总计的膝盖组织病理学参数的抑制对于用T-ChOS处理的动物是显著的(26％；p＜0.05)，并且对于用T-ChOS+21mg/kgD处理的动物也是显著的(32％；p＜0.01)。相比于疾病对照，通过21mg/kgD(14％增加)、T-ChOS+14mg/kgD(10％)或T-ChOS+28mg/kgD(13％)处理，总计的膝盖分数为非显著增加。T-ChOS+21mg/kgD具有最强效应(图16)。

综上，这一研究的结果表明用T-ChOS(7.1mg/kg)+D(21.4mg/kg)的每日口服处理有效地抑制踝软骨损伤、骨吸收和关节翳形成。T-ChOS(7.1mg/kg)+D(21.4mg/kg)也抑制膝盖关节翳形成和骨吸收，与在大鼠中产生II型胶原关节炎相关。其它剂量的T-ChOS组合D-葡糖胺对于踝卡尺测量具有个别的显著影响并且T-ChOS单独具有轻微的非显著效果。然而，D-葡糖胺单独没有有益影响。

总言之，在II胶原诱导的大鼠RA模型中，T-ChOS组合葡糖胺提高T-ChOS对RA的效应。在T-ChOS组合中的葡糖胺的最有效浓度为21mg/kg大鼠。

实施例3：Oligomin、T-ChOS、T-ChOS+N-乙酰基葡糖胺以及T-ChOS+葡糖胺对人风湿性关节炎病患的影响

对诊断为风湿性关节炎的女性使用由Genisehf(“Oligomin”)生产的几丁低聚物若干年以便减轻她的病痛。对她的病痛以及移动减轻分数进行评级，0是未减轻而10是彻底减轻。她对于Oligomin(2200mg/天)的减轻分数为7。

要求她换为T-ChOS(700mg/天)。逐渐地，她的状况变得更糟。在第20天，她的减轻分数下降至5。在T-ChOS消耗第32天，向T-ChOS加入N-乙酰基葡糖胺(1500mg/天)(图17)。结果她的状况变好。在将N-乙酰基葡糖胺加入T-ChOS的第12天，她的减轻分数从5升至7(图17)。13天后，她的状况未改变(分数＝7)。然后她从N-乙酰基葡糖胺换成葡糖胺(1500mg/天)，仍旧组合T-ChOS(图17)。在第16天，她的状况轻微改善，造成从7增至8。现在她使用这一组合一年以上并且她的状况仍旧如此且减轻分数仍旧为8。

结论

上面的实施例表明T-ChOS是部分去乙酰化的几丁低聚糖组合物的特异组合，其中单体被从组合中除去并且二聚体和三聚体降至小于10％，以便增加对几丁质酶样蛋白的结合亲和性。这示出于实施例1，氨基糖分析(图1)。

Oligomin是具有很大部分单体、二聚体和三聚体的ChOS的粗混合物，Oligomin没有T-ChOS所示的生物活性特性。该组合物如实施例1，图1所示。在实施例1中证明Oligomin不诱导软骨外植体中II型胶原合成，而T-ChOS显示出PIINP释放增加15-20倍。

该低聚糖组合物具有比其它氨基糖和几丁低聚糖组合物更出色的组织保护的/再生的活性。在实施例1中，示出来自软骨外植体的PIINP释放(图3)。

通过与F18哺乳动物几丁质酶(几丁质酶样蛋白)的相互作用来介导T-ChOS活性。这示出于实施例1，T-ChOS通过与YKL-40相互作用而介导它的胶原形成活性(图7和8)。在检测的浓度范围中，Oligomin未显示任何此种作用(图8)。

T-ChOS活性可以组合葡糖胺单体而增加。这示出于实施例1中，其中来自软骨外植体的PIINP释放被T-ChOS增强。ChOS和葡糖胺的组合也比单独T-ChOS明显更有效(图4)。在实施例1中，来自软骨外植体的硫酸软骨素(ChS)释放作为T-ChOS+葡糖胺的影响与胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的影响接近(图5)。此外在实施例2，图19-26中，在风湿性关节炎大鼠模型中，T-ChOS和葡糖胺一起口服给药比单独T-ChOS或单独葡糖胺更出色。

T-ChOS和葡糖胺将在口服给药后发挥它们的体内活性。这示出于实施例3，图4-8中，T-ChOS和葡糖胺一起的口服给药在大鼠风湿性关节炎中具有显著的组织保护的效应。

Claims (4)

1.一种用于口服给药来治疗风湿性关节炎的组合物，包括：

由N-乙酰基葡糖胺和D-葡糖胺组成的治疗有效的几丁低聚物，其中该几丁低聚物包括满足下面条件的杂几丁低聚物：

所述低聚物具有5-20个单体残基的链长，

每条低聚物链能够在低聚物链的任一端或两端具有两个N-乙酰基葡糖胺残基，

低聚物的剩余内部部分具有至少足量的D-葡糖胺残基以避免所述内部链的序列包括一个N-乙酰基葡糖胺残基与另一个N-乙酰基葡糖胺残基相邻，

与葡糖胺组合，其中所述葡糖胺和所述几丁低聚物的重量比为约3:1。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述治疗有效的几丁低聚物的脱乙酰化程度是在30-60％的范围内。

3.权利要求1的组合物，其中所述组合物是用于口服摄入的形式，其选自由粉剂、悬剂、凝胶、溶胶、糊剂、丸剂和胶囊组成的组。

4.权利要求3的组合物，包括药学可接受的赋形剂。