ES2596215T3 - Ciclohexilaminas - Google Patents
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Abstract
Un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en: Yoduro de N-[2-((2,6-dimetilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Cloruro de N-[2-(benzoiloxi)propil]-N,N-dietilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((2,4,6-trimetilbenzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2,6-dimetoxibenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2-fluorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2-clorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2,4-diclorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((2-metilbenzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2-isopropilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((4-clorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((3-fluorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((4-fluoro-2-(trifluorometil)benzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((3-(trifluorometil)benzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2-(trifluorometil)benzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((2-nitrobenzoilo)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((3,5-diclorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((4-etilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((4-(trifluorometil)benzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de (S)-N,N-dimetil-N-[2-((2,4,6-trimetilbenzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de (S)-N-[2-((2,6-dimetilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de (R)-N-[2-((2,6-dimetilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de (R)-N,N-dimetil-N-[2-((2,4,6-trimetilbenzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((3-isopropilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2,6-diclorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((2,4,6-trimetilbenzoil)oxi)propil]tetrahidro-2H-piran-4-aminio; Yoduro de N-[2-((2,3-diclorobenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((ciclohexanocarbonil)oxi)propil]-N,N-dietilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((3-clorobenzo[b]tiofeno-2-carbonil)oxi)propil]N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((tiofeno-2-carbonil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((4-isopropilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((tiofeno-3-carbonil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((1-metil-1H-pirrol-2-carbonil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((benzo[b]tiofeno-2carbonil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2,6-dimetilbenzoil)oxi)propil]-N,N,4-trimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((3-metil-tiofeno-2-carbonil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-N,N,4-trimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N,4-trimetil-N-[2-((2,4,6-trimetilbenzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2,6-dimetilbenzoil)oxi)etil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2,4,6-trimetilbenzoil)oxi)etil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((4-metilbenzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)etil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2-etilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de N-[2-((2,4-dimetilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de (S)-N-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Yoduro de (R)-N-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Bromuro de (S)-N-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Bromuro de (R)-N-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio; Bromuro de 1-ciclohexil-1-[2-((2-isopropilbenzoil)oxi)propil]pirrolidin-1-io; Bromuro de 1-ciclohexil-1-[2-((2-isopropilbenzoil)oxi)propil] piperidin-1-io; Bromuro de 1-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-1-ciclohexilpirrolidin-1-io; Bromuro de 1-[2-((4-(terc-butil)benzoil)oxi)propil]-1-ciclohexilpiperidin-1-io; Bromuro de 1-[2-((3-clorobenzo[b]tiofeno-2-carbonil)oxi)propil]-1-ciclohexilpirrolidin-1-io; y Bromuro de 1-[2-((3-clorobenzo[b]tiofeno-2-carbonil)oxi)propil]-1-ciclohexilpiperidin-1-io.
Description
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CH3CH2CH2CONH, CH3CH(CH3)CONH y similares.
"Éster" se refiere a imagen7 C(O)O(alquilo), que está unido a través del átomo de carbono. El grupo alquilo se define y está opcionalmente sustituido como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de éster incluyen, sin limitación, C(O)OCH3, C(O)O(CH2CH3), C(O)O(CH2CH2CH3), C(O)(O)(CH2CH2CH2CH3) y similares.
"Urea" se refiere a un grupo que tiene a imagen8 NHC(O)NH imagen9 en el que uno de los átomos de nitrógeno está unido a un grupo alquilo o heteroarilo. Los grupos alquilo o heteroarilo se definen y están opcionalmente sustituidos como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de urea incluyen, sin limitación, NHC(O)NHCH3, NHC(O)NHCH2CH3, NHC(O)NHCH2CH2CH3, NHC(O)NHCH2CH2CH2CH3 y similares.
"Alquilaminocarbonilo" se refiere a imagen10 C(O)NH(alquilo) o imagen11 C(O)N(alquil)(alquilo) en los que los grupos alquilo se definen independientemente y están opcionalmente sustituidos independientemente como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de alquilaminocarbonilo incluyen, pero no se limitan a, CH3NHCO, CH3CH2NHCO, CH3CH2CH2NHCO, CH3CH(CH3)NHCO y similares.
Un "paciente" o "sujeto" es un mamífero, por ejemplo, un ser humano o un paciente o sujeto veterinario, por ejemplo, ratón, rata, cobaya, perro, gato, caballo, vaca, cerdo o primate no humano, tal como un mono, chimpancé, babuino o gorila .
Los términos "comprende", "comprenden" y "que comprende" se han de interpretar inclusivamente en lugar de exclusivamente. Los términos "consiste", "que consiste en" y sus variantes, se han de interpretar exclusivamente, en lugar de inclusivamente.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa una variabilidad del 10 % de la referencia dada, a menos que se especifique lo contrario.
Los procedimientos útiles para la fabricación de los compuestos de fórmula (I) se exponen en los Ejemplos siguientes y se generalizan en los Esquemas 1-14. Un experto en la materia reconocerá que los Esquemas 1-14 pueden adaptarse para producir los otros compuestos de fórmula (I) de acuerdo con la presente invención.
Los siguientes procedimientos describen la síntesis de los compuestos de fórmula (I). Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar ciertas realizaciones de la presente invención, pero no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la presente invención.
El Esquema A describe un procedimiento para la preparación de los compuestos de fórmula (I). En este procedimiento, se hizo reaccionar la cetona cíclica A con un amino alcohol sustituido con R1 y borohidruro de sodio para proporcionar el compuesto C. En una realización, el amino alcohol sustituido con R1 era H2NCH2CH(OH)R1 (B). En otra realización, el amino alcohol sustituido con R1 era 1-amino-2-propanol. El átomo de nitrógeno del compuesto C se protegió después con un grupo protector para proporcionar el compuesto D. En una realización, el compuesto C se hizo reaccionar con un Boc-anhídrido. Después, el compuesto D se convirtió en el compuesto de éster F. En una realización, el compuesto D se hizo reaccionar con un cloruro de acilo. En una realización adicional, el compuesto D se hizo reaccionar con A-C(O)Cl (E). En una realización, la acilación puede realizarse en presencia de una base tal como hidruro de sodio. En otra realización, el compuesto D se hizo reaccionar con cloruro de 2,4,6trimetil-benzoílo. Después, el átomo de nitrógeno se desprotegió por tratamiento con una solución ácida. Después, el nitrógeno se sustituyó con R2 para proporcionar el compuesto G. En una realización, el átomo de nitrógeno se desprotegió con ácido clorhídrico en dioxano y la sustitución con R2 se realizó por reacción de la amina con un compuesto de carbonilo y triacetoxiborohidruro de sodio. En otra realización, la sustitución con R2 se realizó por
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reacción de la amina con un haluro, mesilato, naftalenosulfonato, bencenosulfonato, tosilato, canforsulfonato o trifluorometanosulfonato de alquilo. En una realización adicional, la sustitución con R2 se realizó usando yoduro de etilo, bromuro de etilo o trifluorometanosulfonato de etilo. Por último, el compuesto de fórmula (I) se formó sustituyendo con R2 de nuevo el átomo de nitrógeno del compuesto G. En una realización, la sustitución con R2 se realizó usando un haluro, mesilato, naftalenosulfonato, bencenosulfonato, tosilato, canforsulfonato o trifluorometanosulfonato de alquilo. En otra realización, la sustitución con R2 se realizó usando yoduro de metilo, bromuro de metilo, trifluorometanosulfonato de metilo, yoduro de etilo, bromuro de etilo o trifluorometanosulfonato de etilo. En otra realización más, una sal de trifluorometanosulfonato se convirtió en una sal de cloruro por tratamiento con una resina de intercambio de cloruro tal como la resina de cloruro Amberlite® IRA-400. En una realización adicional, la amina generada por la desprotección del compuesto F se trató con un 1,4-dihaloalcano o 1,5dihaloalcano, tal como 1,4-dibromobutano o 1,5-dibromopentano, para generar el compuesto de fórmula (I) en el que los dos grupos R2 se unieron entre sí para formar un anillo de 5 o 6 miembros.
El Esquema B proporciona otra vía para el compuesto de fórmula (I). En esta vía, el compuesto C se preparó usando los materiales de partida A y B como se ha mostrado y se ha descrito en el Esquema A. Después, el compuesto C puede sustituirse con R2 en el átomo de nitrógeno para proporcionar el compuesto P. Esta sustitución con R2 puede realizarse usando formaldehído u otro compuesto de aldehído, Na(OAc)3BH y ácido acético. Después, el compuesto P puede acilarse. En una realización, la acilación puede realizarse usando el agente de acilación A-C(O)Cl para proporcionar el compuesto G. En otra realización, la acilación se realizó en presencia de una base tal como hidruro de sodio. En otra realización más, la acilación se realizó usando cloruro de 2-isopropil-benzoílo. Por último, el compuesto G se convirtió en el compuesto de fórmula (I) usando los reactivos y el procedimiento descritos y mostrados en el Esquema A.
El compuesto G, un compuesto intermedio analizado en los Esquemas A y B, puede prepararse a partir del compuesto C como se muestra en el Esquema C. En una realización, el compuesto C se hizo reaccionar con un anhídrido mixto formado por tratamiento de un ácido carboxílico con un cloroformiato. En otra realización, el anhídrido mixto se preparó usando ácido 4-isopropilbenzoico y cloroformiato de isobutilo. Después, la sucesiva sustitución con R2 del compuesto G puede realizarse como se ha descrito anteriormente en los Esquemas A y B.
Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden dicho compuesto opcionalmente con otros ingredientes farmacéuticamente inertes o inactivos. En una realización, el ingrediente farmacéuticamente inerte o inactivo es uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. La presente invención también incluye la combinación de dicho compuesto con uno o más agentes terapéuticos, es decir, ingredientes activos, como se describe a continuación. En una realización adicional, dicho compuesto se combina con uno o más ingredientes inertes/inactivos y uno o más agentes terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen una cantidad de dicho compuesto que es eficaz para tratar el dolor, el picor, la cistitis intersticial o la vejiga hiperactiva en un sujeto. Específicamente, la dosificación del compuesto de fórmula (I) para conseguir un efecto terapéutico dependerá de factores tales como la formulación, la potencia farmacológica del fármaco, la edad, el peso y el sexo del paciente, la afección que se está tratando, la gravedad de los síntomas del paciente, el compuesto específico de fórmula (I), la vía de administración y el patrón de respuesta del paciente. También se considera que el tratamiento y la dosificación del compuesto de fórmula (I) pueden administrarse en una forma de dosificación unitaria y que un experto en la materia ajustará la forma de
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prepararse como una suspensión o solución acuosa.
Cuando se usa para la anestesia dérmica, la cantidad del compuesto de fórmula (I) puede ser de aproximadamente el 0,1 % p/p a aproximadamente el 10 % p/p. Cuando se usa para la administración tópica no ocular (por ejemplo, la administración oral, nasal, rectal, uretral, vaginal) la cantidad del compuesto de fórmula (I) puede ser de aproximadamente el 0,5 % p/p a aproximadamente el 5 % p/p. Cuando se usa como en una inyección, la cantidad del compuesto de fórmula (I) puede ser de aproximadamente el 0,25 % p/p a aproximadamente el 3 % p/p para inyecciones. Cuando se usa para infusiones (por ejemplo, para la anestesia epidural, espinal o local), la cantidad del compuesto de fórmula (I) puede ser de aproximadamente el 0,1 % p/p a aproximadamente el 3 % p/p.
En una realización, el compuesto de fórmula (I) puede administrarse tópicamente en el ojo, por ejemplo, como soluciones, suspensiones o pomadas. Los ejemplos de vehículos oftálmicamente compatibles que pueden usarse incluyen, sin limitación, una solución acuosa, tal como solución salina, una solución oleosa o pomadas que contienen los conservantes, tensioactivos, tampones y reguladores de la viscosidad oftálmicamente compatibles. Estas composiciones también pueden contener agentes estabilizantes, agentes antibacterianos y pueden fabricarse en diferentes unidades de dosificación, adecuadas para la administración ocular. También pueden usarse insertos de fármacos ya sean solubles o insolubles.
En otra realización, el compuesto de fórmula (I) puede administrarse por inyección. Las soluciones para inyección o infusión pueden prepararse como soluciones acuosas. De forma deseable, el compuesto de fórmula (I) está presente en una concentración de aproximadamente el 0,1 % p/p a aproximadamente el 3 % p/p. Estas soluciones pueden contener también agentes estabilizantes, agentes antibacterianos, tampones y pueden fabricarse en diferentes ampollas o frascos de dosificación unitaria.
En una realización adicional, el compuesto de fórmula (I) puede administrarse por vía rectal. Las unidades de dosificación para la administración rectal pueden prepararse en forma de pomadas o supositorios, que contienen el compuesto de fórmula (I) en una mezcla con una base grasa neutra, o pueden prepararse en forma de cápsulas rectales de gelatina que contienen el compuesto de fórmula (I) en una mezcla, por ejemplo, con un aceite vegetal o aceite de parafina. Las pomadas, los supositorios o las cremas que contienen al menos un compuesto de fórmula (I) son útiles para el tratamiento de las hemorroides.
En otra realización, el compuesto de fórmula (I) puede administrarse por vía transdérmica. Se conoce una diversidad de sistemas de administración transdérmica. Para su uso en estos sistemas, un compuesto de fórmula (I) puede mezclarse con una diversidad de excipientes que pueden incluir, por ejemplo, ajustadores del pH, conservantes y/o potenciadores de la penetración con el fin de formar una solución, pomada, crema, loción o gel. Dicha composición puede formar un componente de un sistema de administración transdérmica ("parches", etc.).
Puede seleccionarse un sistema de entrega transdérmica, que permita o ayude a un compuesto de la invención a pasar a través de la capa dérmica y hacia la zona objetivo, tal como tejidos musculares o un espacio perineural. Dichos sistemas pueden incluir la formulación con potenciadores de la penetración de la piel. Los ejemplos de potenciadores de la penetración de la piel incluyen los potenciadores físicos (ultrasonidos, iontoforesis, electroporación, magnetoforesis, microagujas), las vesículas, los sistemas de partículas (liposoma, niosoma, transferosoma, microemulsión, nanopartículas lipídicas sólidas) y potenciadores químicos (sulfóxidos, azonas, glicoles, alcanoles, terpenos, etc.). Los ejemplos adicionales de potenciadores químicos incluyen, por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, isopropanol, etanol, ácido oleico, N-metilpirrolidona, que aumentan la permeabilidad de la piel a los compuestos y permiten que los compuestos penetren a través de la piel hacia los tejidos más profundos. Véase, Sagie y Kohane, "Prolonged SensorySelective Nerve Blockade", PNAS, 2010 (8): 3740-3745, 2010.
Como una realización adicional, el compuesto de fórmula (I) puede instilarse a través de la instilación directa en la vejiga y/o el urotelio. En un ejemplo, una composición farmacéutica que contiene un compuesto de fórmula (I) y uno
o más vehículos o excipientes se formula para la instilación. Por ejemplo, el compuesto de fórmula (I) puede instilarse en forma de una solución. En un ejemplo adicional, el compuesto infundido puede colocarse dentro de dicha vejiga o urotelio en forma de una formulación de liberación prolongada. Puede utilizarse una diversidad de formulaciones de liberación prolongada para este fin e incluyen, sin limitación, una solución, suspensión, gel u otros depósitos que contengan formas de dosificación sólidas, un material revestido con un fármaco, un material impregnado con un fármaco, una formulación liposomal de fármacos, entre otros.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de fórmula (I) pueden formularse puras o con uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticos para la administración. La cantidad de vehículo o vehículos farmacéuticos se determina por la solubilidad y la naturaleza química del compuesto de fórmula (I), la vía de administración elegida y la práctica farmacológica convencional. El vehículo o vehículos farmacéuticos pueden ser sólidos o líquidos y puede incorporar vehículos/matrices tanto sólidos como líquidos. Se conoce una diversidad de vehículos líquidos adecuados y pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la materia. Dichos vehículos pueden incluir, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), solución salina, solución salina tamponada, ciclodextrina, hidroxipropilciclodextrina (HPβCD), n-dodecil-β-D-maltósido (DDM) y mezclas de los mismos. De forma similar, una diversidad de vehículos y excipientes sólidos (rígidos o flexibles) son conocidos por los expertos en la materia. Dichos vehículos también pueden diseñarse con el fin de someterse a una transición de estado cuando se inyectan
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adicional, los inhibidores de los canales iónicos abiertos por voltaje, tales como el riluzol, mexilitina, fenitoína, carbamazepina, procaína, tocainida, prilocaína, diisopiramida, benciclano, quinidina, bretilio, lifarizina, lamotrigina, flunarizina, articaína, bupivacaína, mepivicaína, fluspirileno, orfenadrina, fenbenzamina, bepridilo, pimozida, penfluridol, fluspirileno, propiverina, disopiramida, metadona, tolterodina, sales de tridihexetilo, tripelennamina, mepiramina, bromfeniramina, clorfeniramina, dexclorfeniramina, carbinoxamina, acetato de levometadilo, galopamilo, verapamilo, devapamilo, tiapamilo, emopamilo, diclonina, pramoxina, lamotrigina, mibefradilo, gabapentina, amilorida, diltiazem, nifedipino, nimodipino, nitrendipino, cocaína, mexiletina, propafenona, quinidina, oxetazaína, articaína, riluzol, benciclano, lifarizina y estricnina, pueden combinarse con el compuesto de fórmula (I).
También pueden utilizarse inhibidores de los canales iónicos abiertos por voltaje que atraviesan la membrana en combinación con el compuesto de fórmula (I) en las composiciones, combinaciones o los procedimientos que se describen en el presente documento. En una realización, el inhibidor de los canales iónicos abiertos por voltaje que atraviesa la membrana incluye, pero no se limita a, la cocaína, carbamazepina, disopiramida, lamotrigina, procainamida, fenitoína, oxcarbazepina, topiramato, zonisamida, tetracaína, aminobenzoato de etilo, prilocaína, fosfato de disopiramida, acetato de flecainida, mexiletina, propafenona, gluconato de quinidina, poligalacturonato de quinidina, cloroprocaína, dibucaína, diclonina, mepivacaína, pramoxina, procaína, tetracaína, oxetazaína, propitocaína, levobupivacaína, bupivacaína, lidocaína, moricizina, tocainida, proparacaína, ropivacaína, sulfato de quinidina, encainida, ropivacaína, etidocaína, moricizina, quinidina, encainida, flecainida, tocainida, fosfenitoína, cloroprocaína, diclonine, L-(-)-1-butil-2',6'-pipecoloxilidida y pramoxina.
Adicionalmente, pueden usarse uno o más agentes normalmente utilizados para tratar el dolor, es decir, analgésicos, junto con una combinación de la invención en los procedimientos, composiciones y kits que se describen en el presente documento. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), opiáceos, antidepresivos tricíclicos, inhibidores del transportador de amina y anticonvulsivos (tales como gabapentinoides).
El compuesto de fórmula (I) puede administrarse junto con un vasoconstrictor (por ejemplo, epinefrina o vasopresina vaso) cuando se utiliza en soluciones inyectables.
El compuesto de fórmula (I) puede combinarse con glucosa o dextrosa cuando se utiliza para la infusión o como un analgésico o antipruriginoso local.
Además, el compuesto de fórmula (I) puede combinarse con agentes espesantes para formar una gelatina o también pueden contener potenciadores de la penetración, para su uso en aplicaciones tópicas o dérmicas tales como procedimientos tópicos urogenitales.
Las pulverizaciones para la anestesia tópica de la boca y la orofaringe pueden contener el compuesto de fórmula (I), sacarina y/o alcohol.
Por último, el compuesto de fórmula (I) puede formularse en forma de una pomada para la administración a las membranas mucosas accesibles.
Pueden usarse uno o más agentes adicionales utilizados normalmente para tratar el picor junto con una combinación de la invención en los procedimientos, composiciones y kits que se describen en el presente documento. Dichos agentes incluyen esteroides y antihistamínicos tópicos u orales.
Adicionalmente, pueden usarse uno o más agentes utilizados normalmente para tratar la cistitis intersticial o la vejiga hiperactiva, junto con una combinación de la invención en los procedimientos, composiciones y kits que se describen en el presente documento. En una realización, el agente adicional utilizado para tratar la vejiga hiperactiva puede ser un anticolinérgico, por ejemplo, darifenacina (fármaco Enablex®), fesoterodina (fármaco Toviaz®), oxibutinina (fármacos Ditropan®, Ditropan XL®, Oxytrol®, Gelnique®), solifenacina (fármaco Vesicare®), tolterodina (fármacos Detrol® y Detrol® lA) y/o Trospium (fármaco Sanctura®); un antidepresivo, por ejemplo, el antidepresivo tricíclico clorhidrato de imipramina (fármaco Tofranil®); la toxina botulínica, más habitualmente conocida por eliminar las arrugas; estrógeno; un bloqueante de OC, capsaicina y/o resiniferatoxina.
En otra realización, el agente adicional utilizado para tratar la cistitis intersticial puede ser un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, por ejemplo, ibuprofeno (fármacos Advil® o Motrin®), naproxeno (fármacos Aleve® o Anaprox®), un antidepresivo tal como un antidepresivo tricíclico, por ejemplo, amitriptilina o imipramina (fármaco Tofranil®), un antihistamínico, por ejemplo, difenhidramina (fármaco Benadril®) y loratadina (fármaco Claritin®), pentosano (fármaco Elmiron®), entre otros. El agente adicional puede, como alternativa, seleccionarse entre DMSO (fármaco Rimso-50®), lidocaína, bicarbonato de sodio, pentosano, heparina, ácido hialurónico, sulfato de condroitina y oxibutinina o combinaciones de los mismos.
También se proporcionan en el presente documento regímenes, kits o paquetes de formulaciones farmacéuticas que contienen los compuestos de fórmula (I) o las composiciones que se describen en el presente documento. Los kits pueden organizarse para indicar que se tome una única formulación o combinación de formulaciones en cada tiempo deseado.
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Una escala de Likert proporciona de manera similar una medición de una cantidad unidimensional. Generalmente, una escala de Likert tiene valores enteros discretos que van desde un valor bajo (por ejemplo, 0, que significa sin dolor) a un valor alto (por ejemplo, 7, que significa un dolor extremo). Se pide a un paciente que experimenta dolor que elija un número entre el valor bajo y el alto valor para representar el grado de dolor experimentado. Las escalas de Likert y su uso se describen, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. N.º 6.623.040 y 6.766.319, cuyas divulgaciones pertinentes se incorporan en el presente documento por referencia.
El índice de Lequesne y el índice de osteoartritis (OA) de las Universidades Western Ontario y McMaster (WOMAC) evalúan el dolor, la función y la rigidez en la rodilla y la cadera de los pacientes con OA usando cuestionarios autoadministrados. El WOMAC abarca tanto la rodilla como la cadera, mientras que hay un cuestionario de Lequesne para la rodilla y otro para la cadera. Estos cuestionarios son útiles ya que contienen más de contenido de información en comparación con la escala EVA o de Likert. Los cuestionarios tanto del índice WOMAC como del índice de Lequesne han sido ampliamente validados en la OA, incluso en los escenarios quirúrgicos (por ejemplo, artroplastia de rodilla y cadera). Sus características métricas no difieren significativamente.
El índice AUSCAN (artritis de la mano de Australia y Canadá) emplea un cuestionario válido, fiable y sensible autonotificado por el paciente. En un caso, este cuestionario contiene 15 preguntas dentro de tres dimensiones (dolor, 5 preguntas; rigidez, 1 pregunta y función física, 9 preguntas). Un índice AUSCAN puede utilizar, por ejemplo, una escala de Likert o EVA.
La puntuación de O'Leary-Sant y el índice de problemas de la CI son índices auto-administrados para medir los síntomas del tracto urinario inferior.
La escala de los síntomas del dolor-urgencia-frecuencia es una evaluación equilibrada de la disfunción urinaria, el dolor pélvico y los síntomas asociados al acto sexual y se usa con frecuencia junto con la administración intravesical de cloruro de potasio.
La UWI utiliza siete preguntas relacionadas con la CI acerca de la frecuencia, la urgencia, la nocturia y el dolor.
Otros índices adecuados que son útiles para la medición del dolor incluyen la escala descriptora del dolor (EDD), la escala descriptora verbal (EDV), la escala numérica de intensidad del dolor (ENID), la escala del dolor neuropático (EDN), el inventario de síntomas del dolor neuropático (ISDN), el inventario del dolor presente (IDP), la medición geriátrica del dolor (MGD), el cuestionario del dolor de McGill (CDM), la intensidad media del dolor (escala de diferencial descriptora), la escala numérica del dolor (END), puntuación de evaluación global (PEG), el cuestionario corto del dolor de McGill, el inventario de personalidad multifásico de Minnesota, el Perfil de Dolor y el Inventario de Dolor Multidimensional, el Cuestionario de Salud Infantil y el Cuestionario de Evaluación Infantil.
El picor también puede medirse mediante mediciones subjetivas conocidas por los expertos en la materia (EVA, Likert, descriptores y similares). Otro enfoque es medir el rascado que es un objetivo correlativo al picor usando un transductor de vibración o medidores sensibles al movimiento.
En una realización, los procedimientos de tratamiento que se describen en el presente documento incluyen la administración de un compuesto de fórmula (I) a un paciente. Pueden administrarse al paciente agentes opcionales adicionales, tales como los que se han descrito anteriormente para su uso en la combinación, antes, simultáneamente o después del compuesto de fórmula (I).
En otra realización, los procedimientos que se describen en el presente documento incluyen de este modo la administración de un compuesto de fórmula (I) y un activador del receptor TRPV1 a un paciente. En una realización, el compuesto de fórmula (I) se administra al paciente antes del activador del receptor TRPV1. En otra realización, el activador del receptor TRPV 1 se administra al paciente antes del compuesto de fórmula (I). En una realización adicional, el compuesto de fórmula (I) y el activador del receptor TRPV 1 se administran al paciente simultáneamente.
También se incluye en la presente invención la administración de un compuesto de fórmula (I) después de que el receptor TRPV 1 se ha activado. Específicamente, este procedimiento se realiza después de que se activa el receptor TRPV1. Dicha activación puede ser resultado de la administración de un compuesto o estímulo activador exógeno, o puede surgir como resultado de la activación endógena inducida por un estado fisiopatológico, tal como la inflamación, que activa los receptores TRPV1.
Una diversidad de ensayos in vivo y modelos animales son útiles para evaluar la capacidad de los compuestos para inhibir el dolor a través de la inhibición interna de los canales de sodio. Estos modelos pueden o no implicar la apertura (activación) de los canales de TRPV1 a través de la inducción del dolor por medios físicos, mecánicos o químicos (por ejemplo, la capsaicina). Los ejemplos de modelos adecuados incluyen, por ejemplo, los descritos en AM Binshtok y col., Anesthesiology, julio de 2009, 111(1):127-137; CR Reis y col., Anesthesiology, julio de 2009, 111(1):122-126; P Gerner y col., Anesthesiology, noviembre de 2008, 109(5):872-878; y AM Binshtok y otros, Nature, octubre de 2007, 449:607-610, el uso de preparaciones aisladas de músculo detrusor de la vejiga (Witte, Naunyn-Schmeideberg’s Arch. Pharmacol. 2011, 384:555-563), medición de la frecuencia y el volumen miccionales en animales con libertad de movimientos (Clouse, 2012, Urology 79:1410e1-1410e6), medición de la urodinámica de
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la vejiga usando cistometría en animales anestesiados (Shimizu, 2000, British Journal of Pharmacology 131:610616), que se incorporan en el presente documento por referencia. Sin embargo, por una diversidad de razones que serán fácilmente evidentes para los expertos habituales en la técnica, es deseable proporcionar ensayos in vitro que permitan la identificación de compuestos con las propiedades deseadas. Se describen en el presente documento varios ensayos in vitro de este tipo.
En una realización, se desarrolló un sistema de ensayo basado en un FLIPR® (lector de placas fluorimétrico de formación de imágenes) modificado que es capaz de discriminar entre la entrada de compuestos de ensayo no específica la mediada por hTRPV1. Ventajosamente, el sistema de ensayo utiliza la apertura activada por calor de los canales hTRPV1 seguida de una evaluación del bloqueo interno de canales de sodio. El ensayo permite que un compuesto cargado de forma permanente entre selectivamente a través de canales hTRPV1 abiertos y la potencia de ese compuesto en la inhibición de los canales de sodio desde el lado citoplasmático de la misma célula puede evaluarse y cuantificarse.
El ensayo de FLIPR® modificado utiliza células que expresan funcionalmente hTRPV1. Como se usa en el presente documento, el término "que expresan funcionalmente" incluye aquellas células que expresan la proteína TRPV1 humana y que responden a los estímulos que naturalmente abren este canal, incluyendo, por ejemplo, los medios térmicos (por ejemplo, calor) o químicos (por ejemplo, la capsaicina, lidocaína) que se describen en el presente documento. Los ensayos adecuados pueden incluir los ensayos de calcio o de potencial de membrana que se describen en el presente documento (véase, por ejemplo, el Ejemplo 49). Sin embargo, se conocen otros ensayos funcionales en la técnica (por ejemplo, la electrofisiología de fijación de voltaje tal como la que usaron Binshtok y col., Nature 449(4) 607-610, 2007).
Puede seleccionarse una célula adecuada para la expresión de TRPV1 en cis o en trans y construido usando técnicas conocidas. En una realización, se selecciona una estirpe celular de neuroblastoma tal como N1E115 [CRL2263] o ND7/23 [Código de catálogo ECACC: 92090903] para la expresión de hTRPV1. Sin embargo, puede seleccionarse otra estirpe celular de neuroblastoma, por ejemplo, tal como IMR-32 [CRL-127]; Neuro-2a [CRL-131]; NB41A3 [CRL-147]; B104-1-1 [CRL-1887]; SK-N-AS [CRL-2137]; SK-N-F1 [CRL-2142]; SK-N-DZ [CRL-2149]; SH-SY5Y [CRL-2266]; BE(2)-M17 [CRL-2267]; BE(2)-C [CRL-2268]; MC-IXC [CRL-2270]; SK-N-BE(2) (CRL-2271); CHP-212 (CRL-2273];. B35 [CRL-2754], que están disponibles en la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia (EE.UU.). Igualmente pueden seleccionarse otras estirpes celulares.
Para una descripción general de la forma en que se producen las células, véase en general, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (EE.UU.) 2001. En una realización, una estirpe celular estable puede prepararse usando las técnicas en Sambrook y col., usando de secuencias de codificación de hTRPV1 de tipo natural (wt, del inglés wild tipe) o recombinantes. Por ejemplo, la preparación de una estirpe celular de este tipo se describe en detalle en el presente documento (véase el Ejemplo 32). La preparación de otra estirpe celular se describe en la Publicación de Patente Internacional N.º WO 2007/0066068; puede emplearse el procedimiento de Lipofectamina® para la transfección de TRPV1 y hTRPV1 en células embrionarias de riñón humano (HEK293) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Gibco). Para crear una estirpe celular que exprese de forma permanente, se pueden subclonar células HEK transfectadas con wt-TRPV1 en geneticina (0,6 mg/ml) que contengan medio (DMEM que contiene FCS al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml y anfotericina B 250 ng/ml) y propagar durante dos semanas para permitir la selección. Para obtener una única estirpe celular que exprese TRPV1 permanentemente, las células transfectadas pueden sembrarse en placas de 96 pocillos (1 célula por pocillo) y las colonias cultivadas a partir de células individuales se ensayaron posteriormente para determinar la capacidad de respuesta a la capsaicina mediante la medición de aumentos en el calcio intracelular. Los clones finales seleccionados, se llevaron a otras tres rondas de clonación de células individuales para asegurar que las estirpes celulares se derivan de una sola célula. Las variaciones sobre esta metodología serán fácilmente evidentes para un experto en la materia. En otra realización, las células pueden seleccionarse entre una estirpe celular que expresa establemente la hTRPV1, en trans, por ejemplo, a partir de un vector viral u otro elemento genético adecuado.
En una realización, se seleccionó la proteína hTRPV1 que tenía la secuencia de SEQ ID NO: 1: [Número de Referencia de NCBI NM_080706.3].
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Sin embargo, un experto en la materia es consciente de que pueden hacerse pequeñas modificaciones a esta secuencia al tiempo que se conserva la funcionalidad deseada de la proteína. Como alternativa, se podría seleccionar otra proteína TRPV1 (por ejemplo, de una cobaya, ratón u otras especies) y modificar la secuencia para su uso en la presente invención. Dichas modificaciones pueden hacerse por una diversidad de razones, incluyendo, por ejemplo, para mejorar el rendimiento o la purificación.
Con el fin de preparar una célula que expresara hTRPV1, se seleccionó una construcción que contenía la secuencia codificante de la secuencia de hTRPV1 identificada anteriormente. En una realización, la secuencia de codificación era cualquier secuencia que codificara la proteína identificada anteriormente. En otra realización, la secuencia de codificación se seleccionó entre uno de las cuatro variantes de transcrito notificados en NCBI para TRPV1 humano (TRPV1), (NM_018727.5, NM_080704.3, NM_080705.3 y NM_080706.3). La secuencia codificante de proteína funcional (ORF – Marco de lectura abierto, del inglés Open Reading Frame) era igual para los cuatro transcritos. En los ejemplos siguientes, la construcción solo contenía la secuencia de codificación de la proteína funcional. Sin embargo, en otra realización, puede utilizarse otra variante, incluyendo la variante más larga (variante 3, N.º de referencia de NCBI: NM_080706.3). En otra realización más, se seleccionó otro ORF, u otra secuencia que contenía el ORF. En una realización, la secuencia se clonó a partir de una construcción existente, como se describe en los ejemplos a continuación. En otra realización, se utilizó una secuencia recombinante.
Si bien es posible el uso de células que están infectadas o transfectadas de manera que expresan hTRPV1 en trans, es deseable el uso de una estirpe celular que expresa de forma estable el canal hTRPV1. Dichas estirpes celulares pueden ser generarse por un experto en la materia usando la información disponible en el presente documento y conocida en la técnica.
En una realización, con el fin de preparar la estirpe celular, se amplificó hTRPV1 por PCR a partir de ADNc IMR322 (una estirpe celular de neuroblastoma). El producto de PCR obtenido que contenía la proteína de secuencia de codificación de hTRPV1 se clonó en un vector de producción con el control de un promotor fuerte. Como se ilustra a continuación, se usó el promotor de citomegalovirus humano. Sin embargo, también puede utilizarse otro promotor con una fuerte expresión constitutiva en células huésped de mamífero. Opcionalmente, la secuencia puede verificarse mediante PCR. Las células que se iban a transducir (por ejemplo, las células N1E115) se prepararon usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, n.º del catálogo 11668-019), como se describe en el presente documento. Las células transducidas se pasaron usando procedimientos convencionales y técnicas de transfección convencionales cuando se utilizaron. Hacia el final de la segunda semana, aparecieron colonias estables transfectadas, que después se expandieron y se ensayaron funcionalmente. El candidato clonal final para el estudio se seleccionó basándose en los datos del ensayo funcional. Estos ensayos evaluaron la capacidad de la célula para expresar hTRPV1 de una manera funcional, es decir, de manera que tras ser puesta en contacto con al menos uno de los estímulos a los que responde wt-hTRPV1, el canal hTRPV1 se abrió. Por ejemplo, una célula que expresa un hTRPV1 funcional puede responder a la capsaicina o al calor o a otros estímulos químicos, mecánicos o físicos característicos de hTRPV1 en su entorno natural. Los ejemplos de ensayos adecuados se describen en el Ejemplo 49 a continuación e incluyen los ensayos de potencial de membrana y de calcio. Otros ensayos adecuados incluyen los enfoques de electrofisiología de fijación de voltaje de una sola célula convencional como los utilizados por Binshtok y col., Nature 449 (4) 607-610, 2007. El ensayo de TRPV1 se realizó utilizando una plataforma de medición de fluorescencia FLIPR®-384 (Molecular Devices, Inc.) operando en un modo de ensayo de potencial de membrana, u otro sistema adecuado, usando células que expresaban hTRPV1 tal como se describe en el presente documento. Los kits de ensayo de potencial de membrana FLIPR® (tanto azul como rojo) estaban disponibles en Molecular Devices Corp (Sunnyvale, CA, EE.UU.), que proporcionó muchos de los tintes y materiales utilizados en el siguiente ensayo. Sin embargo, pueden obtenerse materiales similares de otras fuentes, según sea necesario o se desee.
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El ensayo que se describe en el presente documento utilizó un procedimiento de activación para el canal de TRPV1 que difiere del que se describe normalmente en la bibliografía y la técnica (es decir, la capsaicina). El uso de la capsaicina para abrir el canal de hTRPV1 en las células demostró ser inadecuado, ya que redujo la ventana de señal a ruido del componente de respuesta posterior del canal de sodio del ensayo en la estirpe celular hTRPV1-N1E115. Como alternativa, se prevé que esta estirpe celular podría sustituirse por otra estirpe celular preparada como se describe en el presente documento. Por tanto, tuvo que desarrollarse otro procedimiento para abrir el canal. Se ha descubierto que el procedimiento de activación de calor utilizado en el presente documento para produce un rendimiento robusto y reproducible.
El ensayo se realizó fácilmente en placas de ensayo de múltiples pocillos en los que se añadieron células en medio de crecimiento y se incubaron en condiciones que permitieron la formación de una monocapa confluente en un período de horas antes del comienzo del ensayo. Pueden utilizarse medios y condiciones de cultivo convencionales. Se prepararon placas de ensayo celular por duplicado para cada experimento.
Los medios agotados procedentes de las placas de células sembradas se retiraron el día del ensayo y se reemplazaron por colorante azul de potencial de membrana (Molecular Devices). El colorante se preparó en tampón de ensayo siguiendo las instrucciones del fabricante. La placa cargada con colorante se incubó a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ºC) durante aproximadamente 30 minutos con el fin de cargar previamente las células con colorante. Opcionalmente, las células pueden cargarse con el colorante de forma simultánea a la adición de los compuestos de ensayo.
Un tampón de ensayo ilustrativo se preparó utilizando agua purificada, desionizada de acuerdo con la Tabla 1. Si bien los componentes precisos pueden variar, la naturaleza iónica del tampón de ensayo es deseable para su uso en el ensayo. El pH se ajustó a 7,4 usando hidróxido de potasio y el volumen se compuso con agua Milli-Q® (Millipore) hasta 500 ml. A menos que se indique lo contrario, todas las diluciones se realizaron en tampón de ensayo.
Tabla 1
- Sal
- Concentración (mM)
- NaCl
- 150
- KCl
- 3,25
- CaCl2 2H2O
- 2
- MgCl26H2O
- 3
- HEPES
- 10
- Glucosa
- 11 (198 mg/100 ml)
Los compuestos de ensayo se diluyeron en el tampón de ensayo y se añadieron a cada pocillo de una 'placa de compuesto' específica de 384 pocillos, que sirvió como una placa fuente para la adición de compuesto usando la plataforma FLIPR®. La concentración de los compuestos en la placa de compuesto se ajustó para conseguir la concentración final deseada cuando se añade a las células en la 'placa de células'. Después de la terminación del período de incubación de colorante, las placas de células cargadas con colorante y las placas fuente de compuesto se insertaron en el dispositivo FLIPR® Tetra con una caja de puntas 384 FLIPR® (Molecular Devices, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los compuestos se añadieron robóticamente a las placas de células cargadas con colorante utilizando el software integrado en el instrumento FLIPR® Tetra.
Inmediatamente después de la adición del compuesto, se activó hTRPV1, en una de las placas de células por duplicado, por calentamiento. Específicamente, se incubó toda la placa de múltiples pocillos que contenía la mezcla compuesto-células a 47 ºC durante 10 minutos, después de lo cual se devolvieron a la temperatura ambiente (aproximadamente 25 ºC) durante 30 minutos. La activación por calor de hTRPV1 se omitió en la placa de células duplicada que simplemente se mantuvo a temperatura ambiente durante los 40 minutos.
Se desencadenó una respuesta de potencial de membrana en las células cargadas de tinte y en las cargadas de compuesto mediante la adición de veratridina que es un 'agonista' conocido del canal de sodio. Como se ilustra en un ejemplo en el presente documento, se preparó una placa agonista que contenía veratridina (Sigma) por adelantado y se insertó en los dispositivos adecuados tales como, por ejemplo, el dispositivo FLIPR® TETRA para una "2ª adición" de acuerdon con las instrucciones del fabricante. La concentración de veratridina en la "placa de agonista" se ajustó para lograr una concentración final de 100°µM cuando se añadiera a las células en la placa de células. También pueden usarse concentraciones finales de veratridina mayores o menores que 100°µM, pero la señal medida por el dispositivo FLIPR® TETRA u otro dispositivo adecuado puede variar en consecuencia.
La exposición de las células en la placa de células a la veratridina indujo que los canales de sodio de las células se abrieran y el flujo de iones resultante produjo un potencial de despolarización de la membrana que se detectó como una señal de fluorescencia por el dispositivo FLIPR® Tetra. La actividad de los compuestos de ensayo se determinó
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3. CLEM después del desarrollo de procedimientos en HPLC – las condiciones del gradiente son como las del HPLC.
Los datos de espectros de masas se obtuvieron usando lo siguiente:
Técnica de ionización: IEN (ionización por electronebulización) usando una fuente de IPA (ionización a presión atmosférica) Potencial de desagregación: 10-70 V dependiendo de la ionización del compuesto Intervalo de masas: 100-800 amu Tipo de exploración: Q1 Polaridad: +/-Fuente de iones: Turbo pulverización Potencial de la nebulización iónica: +5500 para el modo positivo -4500 para el modo negativo Temperatura de la fuente de masa: 200 ºC
El análisis por HPLC se realizó utilizando el Shimadzu® LC-2010, el Agilent® serie 1200 y los instrumentos Waters® Alliance® HT. El columnas incluyeron (i) la columna Zorbax® SB C18 (50 x 4,6°mm) de 1,8 µ, (ii) la columna Atlantis® dC18 (150 x 4,6°mm) de 5 µ, (iii) la columna Gemini® NX C18, (50 x 4,6°mm) de 3 µm, (iv) la columna XBridge® C18 (50 x 4,6°mm) 3 µ, (v) la columna XBridge® C18 (50 x 4,6°mm) de 5 µ y (iv) la columna XTerra® C18 (250 x 4,6°mm) de 5 µ, (v) la columna Gemini® C18, (50 x 4,6°mm) de 5 µ, (vi) la columna Zorbax® SB-C18 (4,6 x 50°mm) de 5 µ. Las fases móviles incluyeron las siguientes y los gradientes de fase móvil se cambiaron desde el 90% de A al 10% al 90%. El caudal fue de 1ml/min.
A. TFA al 0,05 % en agua, HCOOH al 0,05 % en agua, ácido acético al 0,05 % en agua, acetato de amonio 10°mM en agua (tampón ácido o básico) y
B. acetonitrilo o metanol (fase orgánica).
El análisis por UPLC se realizó usando Agilent serie 1100 e instrumentos de la serie 1200. Las columnas utilizadas fueron (i) Zorbax® SB C18 (50 x 4,6°mm, 1,8 µ) y (ii) Zorbax® XDB C18 (50 x 4,6°mm, 1,8 µ) operando a temperatura ambiente. La fase móvil incluyó las siguientes y los gradientes de fase móvil se cambiaron desde el 95% de A al 5% al 95%. El caudal varió de 0,8 a 1ml/min.
A. TFA al 0,05 % en agua, HCOOH al 0,05 % en agua
B. acetonitrilo
Ejemplo 1: Procedimiento general A -Preparación de yoduro de N,N-dimetil-N-[2-((2,4,6trimetilbenzoil)oxi)propil]ciclohexanaminio
I: 1-(Ciclohexilamino)propan-2-ol
A una solución de 1-amino-2-propanol (15 g, 0,199 mol) en etanol (300 ml) se le añadió ciclohexanona (31,4 ml, 299 mol). La mezcla de reacción se agitó a 0-10 ºC durante 10 minutos. Se añadió borohidruro de sodio (10,8 g, 0,285 mol) a 0 ºC, después se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de reacción resultante se inactivó con agua, se filtró a través del reactivo Celite® y se evaporó el disolvente. El residuo se disolvió en HCl 2 N se lavó con acetato de etilo; el pH de la capa acuosa se ajustó a 8 usando una solución saturada de bicarbonato de sodio. El compuesto se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se
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1. 1-(Ciclohexilamino)propan-2-ol (1)
A una solución agitada de 1-amino-2-propanol (1,0 ml, 13,31°mmol) en etanol (15 ml) se le añadió ciclohexanona (1,9 g, 19,9°mmol) a 0 ºC. La mezcla de reacción se agitó a 0 ºC durante 15 minutos y después se añadió NaBH4 (0,725 g, 19,17°mmol). La mezcla de reacción se agitó a ta durante 15 minutos y después se inactivó con agua. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite® y el filtrado se concentró. El residuo se disolvió en DCM, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para proporcionar 1-(ciclohexilamino)propan-2-ol Rendimiento: 2,6 g (en bruto). RMN 1H (DMSO-d6) δ 4,39-4,3 (m, 1 H), 3,61-3,57 (m, 1 H), 2,47-2,30 (m, 3 H), 1,78-1,75 (m, 2 H), 1,661,63 (m, 2 H), 1,55-1,52 (m, 1 H), 1,23-1,12 (m, 3 H), 1,03-0,89 (m, 5 H). También puede prepararse 1(ciclohexilamino)propan-2-ol siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1.
II. 1-(Ciclohexil(metil)amino)propan-2-ol (14)
A una solución agitada de 1-(ciclohexilamino)propan-2-ol (2,6 g en bruto) en DCE (30 ml) se le añadieron sucesivamente HCHO (al 35 % en agua, 2,1 ml, 24,8°mmol), Na(OAc)3BH (10,5 g, 49,6°mmol) y ácido acético (1 ml) en condiciones de enfriamiento con hielo. La mezcla resultante se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se basificó con NaOH 1 N. La fase orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El material en bruto se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (malla 230-400) eluyendo con MeOH al 5 %/DCM para proporcionar 1(Ciclohexil(metil)amino)propan-2-ol. Rendimiento: 1,0 g. RMN 1H (DMSO-d6) δ 4,11 (s ancho, 1 H), 3,65-3,57 (m, 1 H), 2,35-2,20 (m, 3 H), 2,19 (s, 3 H), 1,72-1,68 (m, 4 H), 1,57-1,54 (m, 1 H), 1,24-1,05 (m, 5 H), 1,01 (d, J = 6 Hz, 3 H).
III. 2-Isopropilbenzoato de 1-(ciclohexil(metil)amino)propan-2-ilo (15)
Se añadió cloruro de tionilo (0,8 ml, 10,52°mmol) a ácido 2-isopropilbenzoico (0,864 g, 5,26°mmol) a 0 ºC y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para proporcionar el cloruro de ácido. A una solución agitada del cloruro de ácido en tolueno seco (15 ml) se le añadió una solución de 1-(Ciclohexil(metil)amino)propan-2-ol (0,75 g, 4,38°mmol) en tolueno seco (10 ml) a 0 ºC y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y la fase orgánica se lavó con NaHCO3 saturado, agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El material en bruto se purificó mediante cromatografía Combiflash® eluyendo con acetato de etilo al 9-11 %/hexano, para proporcionar 2-Isopropilbenzoato de 1-(ciclohexil(metil)amino)propan-2-ilo. Rendimiento: 0,88 g (63,38 %). RMN 1H (DMSO-d6) δ 7,56 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,51-7,44 (m, 2 H), 7,26 (t, J = 7 Hz, 1 H), 5,15-5,12 (m, 1 H), 3,61-3,54 (m, 1 H), 2,67-2,59 (m, 1 H), 2,33-2,31 (m, 1 H), 2,23 (s, 3 H), 1,71-1,67 (m, 4 H), 1,57-1,54 (m, 1 H), 1,25 (d, J = 6 Hz, 3 H), 1,21-1,05 (m, 11 H). CLEM: m/z = 318,4 [M+H], TR = 2,51 min (Columna: Y, Programa: P1)
IV: Yoduro de N-[2-((2-isopropilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio
A una solución agitada de 2-Isopropilbenzoato de 1-(ciclohexil(metil)amino)propan-2-ilo (0,45 g, 1,41°mmol) en DCE (3 ml) se le añadió yoduro de metilo (0,35 ml, 5,67°mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas en un tubo sellado. La mezcla de reacción se concentró y el material en bruto se purificó mediante cromatografía Combiflash®, eluyendo con CH3OH al 3-4 %/DCM para proporcionar un sólido que se cristalizó en metanol-éter para proporcionar Yoduro de N-[2-((2-isopropilbenzoil)oxi)propil]-N,N-dimetilciclohexanaminio de color blanco. Rendimiento: 0,415 g (64 %). RMN 1H (DMSO-d6) δ 7,71 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,58-7,50 (m, 2 H), 7,31 (t, J = 7 Hz, 1 H), 5,57-5,54 (m, 1 H), 3,93-3,87 (m, 1 H), 3,67-3,57 (m, 2 H), 3,38-3,34 (m, 1 H), 3,05 (s, 3 H), 3,02 (s, 3 H), 2,17-2,08 (m, 2 H), 1,87-1,84 (m, 1 H), 1,75-1,72 (m, 1 H), 1,54-1,42 (m, 3H), 1,40 (d, J = 6 Hz, 3 H), 1,24-1,19 (m, 7 H), 1,13-0,99 (m, 2 H). CLEM: m/z = 332,0 [M+], TR = 3,01 min, (columna: Y, Programa: P1). UPLC: 98,43 % (200 nm), TR = 3,60 min (fase móvil A. TFA al 0,05 % en agua, B. acetonitrilo; Columna: Zorbax® SB-C18 (4,6 x 50°mm) 1,8 μ)
26
Se añadió tampón de ensayo a las células y se incubaron a temperatura ambiente (25 ºC) durante 10 minutos. Los
compuestos se diluyeron en tampón de ensayo. Se añadieron los compuestos y se incubaron a temperatura
ambiente (25 ºC) durante 10 minutos. Se añadió colorante Red FMP (MDC) a las células y la placa se incubó a
temperatura ambiente (25 ºC) durante 30 minutos. Se preparó solucióm madre de veratridina (20°mM; Sigma) en
5 DMSO; se añadió veratridina (concentración final de 30°µM) en tampón de ensayo a cada pocillo de las placas de
células sembradas en el FLIPR y se tomaron lecturas durante 10 minutos. La siguiente tabla proporciona los datos
que ilustran la actividad de los canales de sodio de los compuestos de ensayo en respuesta a la presencia o
ausencia de estimulación por calor en células que expresan hTRPV1. Los compuestos se ensayaron para
determinar la actividad diferencial a 25 ºC y 47 ºC y a dos concentraciones de ensayo. Se evaluaron ciertos 10 compuestos adicionalmente para determinar la CI50 en el ensayo a 47 ºC y los ejemplos se muestran en la siguiente
Tabla 6.
Tabla 6
- Ej
- hTRPVl-NIE Nav 0,1°mM (% de inhibición) hTRPVl-NIE Nav 1°mM (% de inhibición) hTRPVl-NIE CI50 (μΜ)47 ºC
- 25 ºC
- 47 ºC 25 ºC 47 ºC
- 1
- 13 (N = 4) 73 (N = 4) 53 (N = 4) 92 (N = 4) A'
- 2
- 23 (N = 4) 77 (N = 4) 78 (N = 4) 89 (N = 4) Α'
- 3
- 14 (N = 2, 0,5°mM) 19 (N = 2, 0,5°mM) 52 (N = 2, 5°mM) 67 (N = 2, 5°mM) NE
- 4
- 24 (N = 4) 86 (N = 4) NE NE A'
- 5
- 45 (N = 4) NE NE NE A'
- 6
- 24 (N = 2, 0,5°mM) 80 (N = 2, 0,5°mM) 58 (N = 2, 5°mM) 92 (N = 2, 5°mM) B'
- 7
- 1 (N = 4) 28 (N = 4) 0 (N = 4) 70 (N = 4) NE
- 8
- 14 (N = 4) 38 (N = 4) 22 (N = 4) 53 (N = 4) NE
- 9
- 16 (N = 4) 67 (N = 4) NE NE NE
- 10
- 10 (N = 4) 59 (N = 4) 61 (N = 4) 95 (N = 4) B'
- 11
- 16 (N = 4) 40 (N = 4) NE NE B'
- 12
- 25 (N = 4) 84 (N = 4) 17 (N = 4) 88 (N = 4) A'
- 13
- 0 (N = 4) 44 (N = 4) 51 (N = 4) 89 (N = 4) A'
- 14
- 0 (N = 4) 31 (N = 4) 10 (N = 4) 66 (N = 4) NE
- 15
- 6 (N = 4) 45 (N = 4) 59 (N = 4) 92 (N = 4) B'
- 16
- 31 (N = 4) 60 (N = 4) 50 (N = 4) 83 (N = 4) B'
- 17
- 4 (N = 4) 54 (N = 4) 72 (N = 4) 96 (N = 4) B'
- 18
- 3 (N = 4) 41 (N = 4) 28 (N = 4) 66 (N = 4) NE
- 19
- 25 (N = 4) NE 12 (N = 4) 52 (N = 4) A'
- 20
- 14 (N = 4) 77 (N = 4) 46 (N = 4) 95 (N = 4) A'
- 21
- 11 (N = 4) 57 (N = 4) 35 (N = 4) 96 (N = 4) B'
- 22
- 33 (N = 4) NE 91 (N = 4) NE A'
- 23
- 38 (N = 4) NE 76 (N = 4) NE A'
- 24
- 22 (N = 4) NE 81 (N = 4) NE A'
- 25
- 48 (n = 4) NE 89 (n = 4) NE A'
- 26
- 4 (N = 4) 88 (N = 4) 57 (N = 4) 89 (N = 4) A'
- 27
- 23 (N = 4) 73 (N = 4) 74 (N = 4) 85 (N = 4) B'
- 28
- 0 (N = 4) 32 (N = 4) 5 (N = 4) 58 (N = 4) NE
- 29
- 36 (N = 4) 52 (N = 4) 50 (N = 4) 61 (N = 4) A'
- 30
- 28 (N = 4) 33 (N = 4) 58 (N = 4) 75 (N = 4) NE
- 31
- 27 (N = 4) 94 (N = 4) NE NE A'
- 32
- 4 (N = 4) 48 (N = 4) 1 (N = 4) 54 (N = 4) NE
- 33
- 3 (N = 4) 36 (N = 4) 23 (N = 4) 57 (N = 4) NE
- 34
- 35 (N = 4) 36 (N = 4) 35 (N = 4) 55 (N = 4) NE
- 35
- 35 (N = 4) 74 (N = 4) NE NE A'
- 36
- 50 (N = 4) 83 (N = 4) 84 (N = 4) 95 (N = 4) A'
- 37
- 15 (N = 4) 31 (N = 4) 20 (N = 4) 70 (N = 4) NE
- 38
- 75 (N = 4) 95 (N = 4) NE NE A'
- 39
- 41 (N = 4) 7 (N = 4) NE NE A'
- 40
- 10 (N = 4) 43 (N = 4) 12 (N = 4) 80 (N = 4) NE
- 41
- 13 (N = 4) 66 (N = 4) 22 (N = 4) 89 (N = 4) A'
- 42
- 8 (N = 4) 45 (N = 4) 16 (N = 4) 90 (N = 4) A'
- 43
- 13 (N = 4) 78 (N = 4) NE NE A'
- 44
- 56 (N = 4) 89 (N = 4) 81 (N = 4) 96 (N = 4) NE
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de inyección avanzada desde una dirección dorsolateral en un ángulo de 45 ° y la punta de la aguja tocando el isquion. Se usó para la inyección una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de tuberculina. El volumen de la inyección se empujó suavemente. Después de la inyección, los animales se mantuvieron en la cámara de recuperación y solo después de la recuperación completa de la anestesia se devolvieron a las jaulas. Se tuvo
5 cuidado de que la anestesia leve se administrara de manera que los animales permanecieran anestesiados durante un período de tiempo muy breve.
Los compuestos de ensayo se formularon a las concentraciones requeridas (0-15 %) en un vehículo de solución salina fisiológica normal (cloruro de sodio al 0,9 %) para proporcionar la formulación en solución. Después, se disolvió lidocaína.HCl en polvo (Sigma, EE.UU.) en la misma solución para proporcionar una formulación en solución
10 de combinación de compuesto de ensayo y lidocaína. Se utilizaron ultrasonidos para reducir el tamaño de partícula en caso necesario -según se juzga mediante inspección visual de la solución. La formulación final se esterilizó por filtración con filtros de jeringa (0,22°µm) antes de la administración.
El día 4, después de la inyección de compuesto/vehículo, se tomaron las dos lecturas de PWL a las 0,5 y 2 horas después de la inyección seguidas de lecturas a intervalos de 1 hora o 2 horas dependiendo de si la respuesta se
15 mantenía en valores de corte o mostraba signos de sensibilidad recuperada. Los registros continuaron hasta que la respuesta en gramos-fuerza se redujo a un nivel que no era significativamente diferente del valor basal antes del fármaco. De lo contrario, los registros continuaron hasta 14 horas, seguidos de la siguiente lectura en el día 5, 24 horas después de la inyección. Cuando todavía se observaba un efecto anti-nocicepción significativo a las 24 horas, los registros continuaban adicionalmente igual que el día 4.
20 Se usó el software estadístico GraphPad® Prism 5 para el análisis. En el análisis de las columnas, se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) para cada grupo, seguido del test de Dunnett para comprobar la significación de la diferencia entre los valores basales y las lecturas en diferentes puntos temporales.
A. Comparación de los compuestos con QX-314
Usando el resumen y el ensayo proporcionados anteriormente, se prepararon y ensayaron las formulaciones de la
25 siguiente Tabla 8. Los resultados de estos ensayos se proporcionan en las Figuras 1 y 2 y se resumen en la siguiente tabla. Específicamente, las Figuras 1 y 2 son gráficos de fuerza de vocalización de retirada de la pata (g) frente vocalización al tiempo (horas).
Tabla 8
- Duración de la analgesia para la nocicepción mecánica
- Ejemplo de compuesto de ensayo
- Cantidad de compuesto de ensayo (%) Cantidad de lidocaína (%) Cantidad total de inyección (µl) Tiempo promedio de la analgesia (h)
- 6
- 0,5 2 200 14
- 2
- 200 10
- 0
- 200 5
- 2
- 100 8
- 1
- 0,5 2 100 7
- 2
- 200 8
- 2
- 200 14
- 2
- 200 12
- 2
- 200 6
- 2
- 0,5 2 200 12
- 12
- 0,5 2 200 0,5
- 5
- 0,2 2 200 2
- 0,3
- 2 200 24
- 0,4
- 2 200 44
- 0,45
- 2 200 >64
- 0,5
- 2 200
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-
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