ES2587863T3 - Uso de un inhibidor de C1 para el tratamiento de un edema secundario del sistema nervioso central - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de C1 para uso en un método para prevenir la formación y/o reducir el tamaño de un edema secundario del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto en donde el sujeto tiene o ha tenido al menos un trastorno seleccionado a partir del grupo que consiste en ictus, ictus isquémico, ictus hemorrágico, ictus perinatal, lesión cerebral traumática y lesión de la médula espinal.

Description

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DESCRIPCION

Uso de un inhibidor de C1 para el tratamiento de un edema secundario del sistema nervioso central

El objeto de la presente invencion es, en el aspecto mas general, la prevencion y/o el tratamiento de un edema secundario. En particular, la presente invencion se refiere a un inhibidor de C1 para uso en un metodo para prevenir la formacion y/o reducir el tamano de un edema secundario del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto, en donde el sujeto tiene o ha tenido al menos un trastorno seleccionado a partir del grupo que consiste en ictus, ictus isquemi- co, ictus hemorragico, ictus perinatal, lesion cerebral traumatica y lesion de la medula espinal. Preferiblemente, el edema secundario del SNC es un edema cerebral secundario. Otro objeto de la presente invencion es el tratamiento de trastornos asociados con un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica o la barrera hemato- medular. Y un tercer objeto es un inhibidor de C1 obtenido a partir del plasma para uso en un metodo de prevencion, reduccion o tratamiento de una lesion cerebral por isquemia-reperfusion.

En esta memoria descriptiva se citan una serie de documentos.

La patologfa de la isquemia cerebral y la posterior lesion debida a reperfusion (lesion cerebral por isquemia- reperfusion) es compleja e implica un gran numero de rutas moleculares y celulares diferentes. Entre ellas, una ca- ractenstica de la persistencia de isquemia es la desintegracion estructural de la barrera hematoencefalica que, en consecuencia, conduce a la formacion de edema cerebral. Un edema excesivo puede danar regiones del cerebro que por lo demas estan sanas, simplemente mediante una compresion mecanica y es una causa frecuente de em- peoramiento de los smtomas neurologicos en pacientes con ictus. Hasta la fecha, no hay estrategias convincentes con una base farmacologica, para combatir la formacion de edema en el ictus isquemico agudo.

El edema cerebral se define como un aumento del volumen del cerebro que es el resultado de una acumulacion anormal, localizada o difusa de lfquido dentro del parenquima cerebral. En general, el edema cerebral se clasifica en 4 grupos diferentes: edema vasogenico, citotoxico, hidrocefalico (o intersticial) y osmotico (o hipostatico). A pesar de esta clasificacion de formas distintas de edema, en la mayona de las situaciones clmicas existe una combinacion de diferentes tipos de edema, en funcion de la evolucion temporal de la enfermedad. En cuanto a la formacion de un edema posterior a un flujo sangumeo cerebral perturbado y sangrado cerebral, el edema cerebral citotoxico y/o el edema vasogenico parece tener funciones importantes. Ademas, de cara a los mediadores implicados en la forma- cion de un edema cerebral, se pueden mencionar muchos mediadores (por ejemplo, bradicinina), que tienen muchas propiedades ademas de sus efectos sobre la formacion de un edema cerebral (Nag et al. (2009) Acta Neuropathol.; 118:197-217).

Inicialmente, en el edema cerebral, los cambios en el volumen del cerebro estan compensados por una disminucion en el volumen de lfquido cefalorraqrndeo y sangre, por lo que el edema cerebral primario es principalmente un edema citotoxico. En las lesiones hemisfericas grandes, una inflamacion progresiva supera estos mecanismos de com- pensacion y un incremento de la presion intracraneal (es decir, formacion de edema cerebral secundario o maligno) produce herniaciones en el tejido cerebral que conducen a la muerte. Por lo tanto, el edema cerebral vasogenico, maligno continua siendo una causa principal de mortalidad, despues de diversos tipos de patologfas cerebrales, tales como infartos cerebrales graves, hemorragias, traumatismos, infecciones y tumores cerebrales. La falta de un tratamiento eficaz contra el edema cerebral sigue siendo un estfmulo para un interes e investigacion constantes.

En cuanto al ictus isquemico, el edema cerebral secundario es una causa frecuente de crecimiento del infarto secundario y posterior deterioro de los smtomas neurologicos en el curso de un ictus isquemico (Ayata y Ropper (2002) J Clin Neurosci.; 9:113-124; Bardutzky y Schwab (2007) Stroke; 38:3084-3094). En el ictus isquemico, un infarto maligno de la arteria cerebral media (ACM) es un termino usado para describir un infarto del territorio comple- to de la ACM con un efecto que ocupa un espacio significativo y herniacion del tejido cerebral. La incidencia del infarto maligno de la ACM se estima en menos del 1% de los ictus. La mortalidad con formas conservadoras de tratamiento medico es de aproximadamente el 80% y el coma termina en muerte cerebral 2-5 dfas despues del inicio. La muerte generalmente se produce por una inflamacion progresiva del tejido cerebral isquemico, cambios del tejido cerebral, incremento focal de la presion intracraneal y la extension de la isquemia a territorios vasculares ad- yacentes. Los supervivientes de este tipo de ictus estan invalidos, con mala calidad de vida. Hasta la fecha, ningun medicamento ha mostrado poder reducir el edema cerebral de forma persistente en la isquemia cerebral y, muchas veces la ultima metodologfa de tratamiento como procedimiento para salvar vidas es la hemicraniectoiTHa descom- presiva. Ademas, los mecanismos moleculares subyacentes a la formacion de edema y la posterior degeneracion neuronal en el ictus isquemico, son en gran parte desconocidos.

El sistema de calicrema-cinina (KKS) se inicia con el factor XII de la coagulacion de la sangre (FXII, factor de Hage- man) y tiene un papel importante en la regulacion de la permeabilidad vascular y la formacion de edema (Leeb- Lundberg et al. (2005) Pharmacol. Rev.; 571:27-77). La activacion del KKS se ha mostrado recientemente tambien en pacientes con ictus (Wagner et al. (2002) J. Neurol. Sci.; 202:75-76). Las cininas (por ejemplo, bradicinina, calidi- na) constituyen los productos finales del KKS. Las cininas son hormonas peptfdicas proinflamatorias muy activas que son liberadas por las calicremas desde sus precursores, cininogenos, durante diversos tipos de lesion tisular, incluyendo la isquemia cerebral. Los efectos celulares de las cininas estan mediados por dos receptores de bradicinina diferentes, B1R y B2R. La activacion de estos receptores desencadena procesos inflamatorios en el organo

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diana, tales como la liberacion de citocinas proinflamatorias o la atraccion de celulas inmunes, as^ como un aumento de la permeabilidad vascular.

Recientemente, el bloqueo de B1R, pero no B2R, reduda la lesion de la barrera hematoencefalica y la formacion de edema en modelos experimentales de isquemia cerebral focal (Austinat et al. (2009) Stroke; 40:285-293) y de lesion cerebral traumatica (Raslan et al. (2010) J. Cereb. Blood Flow Metab.; 30:1477-1486) en ratones, lo que sugiere una relevancia funcional del KKS sobre la formacion de edema cerebral en la fase aguda del ictus isquemico y la lesion cerebral traumatica.

En estudios de prevencion de la activacion del KKS a traves de la inhibicion de FXII, que se activa fisiologicamente despues de entrar en contacto con superficies cargadas negativamente (activacion por contacto), se investigo el resultado neuropatologico despues de un ictus experimental agudo (Hagedorn et al. (2010) Circulation; 121:15101517; Kleinschnitz et al. (2006) JEM; 203(3):513).

El inhibidor de la C1 esterasa (C1-INH) es una glicoprotema de 478 aminoacidos que pertenece a la superfamilia de inhibidores de la proteasa de serina, denominados serpinas. Su designacion tiene origen en la descripcion inicial como el unico inhibidor fisiologico conocido de la via clasica del complemento en la sangre y el tejido. Sin embargo, C1-INH es tambien un importante regulador del KKS mediante el bloqueo de FXII activado y la calicrema plasmatica. Ademas de muchas otras funciones (por ejemplo, inhibicion de FXIa), es el unico inhibidor fisiologico conocido de C1s y C1r, las proteasas de serina homologas activadas del primer componente del sistema del complemento.

Estudios previos han demostrado un papel beneficioso de las formulaciones de C1-INH en modelos animales de ictus isquemico en sf mismo (De Simoni et al. (2004) Am. J. Pathol.; 164:1857-1863; Gesuete et al. (2009) Ann. Neurol.; 66:332-342), asf como de la lesion cerebral traumatica (Longhi et al. (2009) Crit. Care Med.; 37:659-665) y de la lesion traumatica de la medula espinal (Tei et al. (2008) Neurol. Res.; 30:761-767), pero los mecanismos mole- culares subyacentes se desconocen en gran parte. Por otra parte, estos estudios se centran en los resultados neu- ropatologicos agudos mientras que los efectos sobre el edema cerebral (secundario), es decir, la prevencion de su formacion y/o la reduccion de su tamano, no se han descrito. Ademas, de Simoni et al. (2004; Am. J. Pathol.; 164:1857-1863) dan a conocer que el inhibidor de C1 obtenido a partir de plasma (15 U/raton) solo era eficaz en el modelo murino de lesion por isquemia/reperfusion cuando se administraba al inicio de la reperfusion, pero perdfa completamente la eficacia cuando se administraba 30 minutos despues del inicio de la reperfusion.

Por lo tanto, es evidente que todavfa existe una necesidad de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un edema cerebral secundario que se produce despues de una oclusion de un vaso sangumeo en el cerebro. Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es satisfacer tal necesidad.

Por lo tanto, el problema tecnico subyacente de la presente invencion era proporcionar medios y metodos alternati- vos y/o mejorados que se dirijan con exito al edema cerebral secundario, que formen la base o puedan permitir el desarrollo de medicamentos mas satisfactorios para el tratamiento y/o la prevencion del edema cerebral secundario.

La solucion de este problema tecnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindica- ciones.

Sorprendentemente, el solicitante ha descubierto que un edema cerebral secundario que se produce con posteriori- dad a una lesion inicial, se podna prevenir o reducir mediante la administracion de inhibidor de C1. Una lesion inicial

0 un trastorno primario de este tipo podna ser una oclusion de un vaso sangumeo en el cerebro, por ejemplo, un ictus isquemico o una hemorragia en el cerebro, por ejemplo, un ictus hemorragico.

Por consiguiente, en general, la presente invencion se refiere a un inhibidor de C1 para uso en un metodo para prevenir la formacion y/o reducir el tamano de un edema secundario del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto, en donde el sujeto tiene o ha tenido al menos un trastorno seleccionado a partir del grupo que consiste en ictus, ictus isquemico, ictus hemorragico, ictus perinatal, lesion cerebral traumatica y lesion de la medula espinal. En particular, el ictus hemorragico es una hemorragia cerebral o una hemorragia subaracnoidea.

En una realizacion preferida de la invencion, el edema secundario del sistema nervioso central (SNC) es un edema cerebral secundario o un edema secundario de la medula espinal.

De acuerdo con la presente invencion, las expresiones "inhibidor de C1", "inhibidor de la C1 esterasa" y "C1-INH" se refieren a las protemas o fragmentos de las mismas que actuan como inhibidores de la proteasa de serina para inhibir proteasas asociadas con el sistema del complemento, preferiblemente las proteasas C1r y C1s, asf como MASP-1 y MASP-2, con el sistema de calicrema-cinina, preferiblemente calicrema plasmatica y factor XIIa, y con el sistema de coagulacion, preferiblemente el factor XIa. Ademas, C1-INH puede servir como una molecula antiinflama- toria que reduce la adhesion de leucocitos mediada por selectinas, a las celulas endoteliales. C1-INH tal como se utiliza en esta memoria puede ser un inhibidor de la proteasa de serina natural o un fragmento activo del mismo, o puede comprender un peptido recombinante, un peptido sintetico, un mimetico de peptido o un fragmento peptfdico que proporciona propiedades funcionales similares - por ejemplo, la inhibicion de las proteasas C1 y C1s, y/o MASP-

1 y MaSP-2 y/o el factor XIIa y/o el factor XIa. Para una descripcion adicional en relacion con la estructura y la fun- cion del inhibidor de C1, veanse los documentos de patente de EE.UU. 4.915.945; patente de EE.UU. 5.939.389;

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patente de EE.UU. 6.248.365; patente de EE.UU. 7.053.176; y WO 2007/073186.

Por lo tanto, en una realizacion preferida de la presente invencion, el inhibidor es un inhibidor de C1 obtenido a partir del plasma o recombinante. En una realizacion preferida adicional, dicho inhibidor es identico a la protema humana de origen natural o a una variante de la misma. El C1-INH incluira todos los alelos de origen natural que tienen la misma funcion que el inhibidor de C1. En la realizacion mas preferida, dicho inhibidor es el inhibidor de la C1 estera- sa humana.

En otra realizacion preferida, el inhibidor de C1 de acuerdo con la presente invencion, se modifica para mejorar la biodisponibilidad y/o la semivida, para mejorar la eficacia y/o para reducir los efectos secundarios potenciales. La modificacion se puede realizar mediante etapas recombinantes o de otro tipo. Ejemplos de tal modificacion podna ser una glicosilacion o una fusion de albumina del inhibidor de C1 descrito. Para una descripcion adicional con res- pecto a la glicosilacion y la fusion de albumina de protemas, vease el documento WO 01/79271, que se incorpora en esta memoria en su totalidad.

En diversas realizaciones, el inhibidor de C1 se puede producir de acuerdo con metodos conocidos por un experto en la tecnica. Por ejemplo, el C1-INH obtenido a partir de plasma se puede preparar recogiendo plasma sangumeo de varios donantes. Los donantes de plasma deben estar sanos tal y como se define en la tecnica. Preferiblemente, el plasma de varios (1000 o mas) donantes sanos se agrupa y opcionalmente se procesa adicionalmente. Un proce- dimiento ejemplar para la preparacion del inhibidor de C1 con fines terapeuticos, se describe en el documento de patente de EE.UU. 4.915.945, cuya descripcion se incorpora en esta memoria en su totalidad. Alternativamente, en algunas realizaciones, C1-INH se puede recoger y concentrar a partir de fuentes de tejidos naturales, utilizando metodos conocidos en la tecnica. Los productos disponibles comercialmente que comprenden inhibidor de C1 se obtienen, por ejemplo, a partir del plasma, Cinryze® (ViroPharma), recombinantes, Ruconest® o Rhucin® (ambos Pharming), y a partir del plasma, Berinert® (CSL Behring). Berinert® esta indicado para el tratamiento de angioedema hereditario y deficiencias congenitas. C1-INH recombinante se puede preparar por metodos conocidos.

La expresion "edema del sistema nervioso central" o "edema del SNC" se refiere a una acumulacion excesiva de lfquido) en los espacios intracelulares y/o extracelulares del sistema nervioso central (SNC). El termino "edema del cerebro" o "edema cerebral" se refiere a una acumulacion excesiva de lfquido en los espacios intracelulares y/o extracelulares del cerebro. La fisiopatologfa, incluso de un edema agudo o primario del SNC, preferiblemente la formacion de un edema cerebral primario, y en particular la aparicion de un edema maligno o secundario, retardado temporalmente (es decir, horas o dfas despues del inicio del ictus) del SNC, preferiblemente un edema cerebral secundario, y sus mecanismos patologicos (moleculares) implicados se desconocen en gran parte y parecen ser bastante complejos. En cuanto a la formacion de un edema posterior a un flujo sangumeo cerebral perturbado y un sangrado cerebral, el edema cerebral vasogenico y/o citotoxico parece tener un papel importante.

El edema primario del SNC, preferiblemente el edema cerebral primario, es un edema que se produce durante la lesion inicial, o poco o inmediatamente despues (es decir, en cuestion de minutos) de la lesion. Es principalmente un edema citotoxico que se produce por una absorcion anormal de lfquido en las celulas cerebrales lesionadas.

En contraste, el edema secundario del SNC, preferiblemente, el edema cerebral secundario, se produce mas tarde, es decir, horas o incluso dfas despues de la lesion, y es principalmente un edema vasogenico. Por ejemplo, en una lesion cerebral traumatica (LCT), el edema cerebral maligno es una complicacion rara (<10%), pero frecuentemente fatal (~100%). Se diagnostica mediante un rapido aumento de la presion intracraneal (PIC) horas despues de la lesion que es refractaria al tratamiento medico.

Por lo tanto, tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "edema secundario del cerebro" o "edema cerebral secundario" o "edema maligno del cerebro" o "edema cerebral maligno" se refieren a cualquier inflamacion retardada del cerebro despues de la lesion, es decir, la inflamacion tardfa se produce en cuestion de horas o dfas despues de la lesion inicial. En particular, el edema cerebral secundario de acuerdo con la invencion es sustancial- mente un edema vasogenico. En este tipo de edema, debido a la ruptura de la barrera hematoencefalica, las protef- nas intravasculares que normalmente estan excluidas y el fluido penetran en el espacio extracelular del parenquima cerebral. Una vez que los componentes del plasma atraviesan la barrera hematoencefalica, el edema se expande y esto puede ser muy rapido y generalizado.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresion "edema secundario de la medula espinal" se refiere a cualquier inflamacion retardada posterior a una lesion de la medula espinal, es decir, la inflamacion tardfa se produce en cuestion de horas o dfas despues de la lesion inicial. En particular, el edema secundario de la medula espinal de acuerdo con la invencion es sustancialmente un edema vasogenico. En este tipo de edema, las protemas intravasculares que normalmente estan excluidas y el fluido penetran en el espacio extracelular del parenquima cerebral. Una vez que los componentes del plasma cruzan la barrera hematomedular, el edema se expande y esto puede ser muy rapido y generalizado.

Preferiblemente, el edema secundario se produce de 1 a 10 dfas, mas preferiblemente de 2 a 5 dfas despues de la lesion inicial, lo que conduce a al menos un trastorno que esta relacionado con el edema cerebral secundario. En algunas realizaciones, el edema secundario aparece 2, 3, 4 o 5 dfas despues de la lesion inicial o en cualquier mo-

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mento entre tanto.

La expresion "prevencion de la formacion de un edema secundario" se refiere a metodos de uso del inhibidor de C1 en donde se previene la formacion de un edema secundario de forma total o parcial. La prevencion de la formacion de un edema secundario significa en su conjunto que un edema secundario no se produce en absoluto si se admi- nistra el inhibidor de C1 antes de la formacion. La prevencion de la formacion de un edema secundario significa en parte reducir el tamano de un edema secundario en un escenario en el que se administra el inhibidor de C1 en un momento anterior a cuando el edema secundario haya comenzado a producirse y el tamano del edema que se produce mas tarde sera menor que el tamano de un edema en un paciente no tratado. En una realizacion preferida de la invencion, el tamano del edema secundario, es decir, el volumen del edema secundario, se evita por lo menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% (o en cualquier porcentaje intermedio), en comparacion con el tamano de un edema secundario sin tratar.

Tal como se utiliza en este documento, el termino "reducir" comprende disminuir la probabilidad de un edema secundario en un individuo o en un animal, disminuyendo la gravedad de cualquier smtoma, y/o disminuyendo la pro- porcion de pacientes en una poblacion con riesgo de edema secundario, despues de una lesion inicial. Por lo tanto, "reducir" se refiere a la disminucion, reduccion, declinacion, limitacion, correccion o mejora de una afeccion de edema secundario. La reduccion del tamano de un edema secundario puede incluir, por ejemplo, la proteccion frente a la aparicion de un edema secundario; la reduccion del riesgo de un edema secundario, la reduccion de la gravedad de un edema secundario a medida que se desarrolla, o una vez que se ha desarrollado; limitar la lesion de un edema secundario; reducir la extension de un edema secundario, por ejemplo, limitar el volumen del edema desarrollado despues de una lesion inicial; o mejorar las afecciones en el cerebro o la medula espinal asociadas con un edema secundario.

La expresion "reducir el tamano de un edema secundario" se refiere a metodos de uso del inhibidor de C1 en donde el tamano de un edema secundario se reduce de forma independiente de si la formacion del edema secundario se ha iniciado en el momento de la administracion o no. Por lo tanto, reducir el tamano de un edema secundario significa reducir el volumen de un edema secundario en un escenario en el que el inhibidor de C1 se administra para reducir el tamano de un edema secundario ya existente, lo que se producira despues de la administracion, asf como en un escenario en el que el C1-INH se administra para reducir el tamano de un edema secundario que ya se ha produ- cido, pero que sigue creciendo. En una realizacion preferida de la invencion, reducir el tamano de un edema secundario significa que el tamano del edema secundario se reduce en al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% (o en cualquier porcentaje intermedio), en comparacion con el tamano o el volumen del edema secundario sin tratar, es decir, en ausencia de terapia.

Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el tamano del edema secundario se reduce en al menos un 10%, preferiblemente en al menos un 20%, mas preferiblemente en al menos un 30%, mas preferiblemente en al menos un 40%, mas preferiblemente en al menos un 50%, mas preferiblemente en al menos un 60%, mas preferiblemente en al menos un 70%, mas preferiblemente en al menos un 80%, mas preferiblemente en al menos un 90%, en comparacion con el volumen del edema secundario sin tratar.

En ciertas realizaciones de la invencion, dicho tratamiento de un edema secundario en un sujeto es profilactico y/o terapeutico. El uso del inhibidor de C1 de acuerdo con la invencion se puede emplear de forma profilactica y/o tera- peutica para prevenir la formacion de un edema secundario y/o para reducir el tamano de un edema secundario.

El trastorno que se relaciona con el edema secundario es inducido por un dano inicial, que en el presente documento se utiliza como alternativa a la expresion "lesion inicial", es decir, la lesion inicial conduce a al menos un trastorno que se relaciona con el edema secundario. Un ejemplo de una lesion inicial de acuerdo con la presente invencion, es una isquemia cerebral. Preferiblemente, esta lesion inicial podna ser una oclusion de un vaso sangumeo, por ejemplo, un ictus isquemico, o una hemorragia, por ejemplo, un ictus hemorragico. Mas preferiblemente, la lesion inicial es una oclusion de un vaso sangumeo en el cerebro o una hemorragia en el cerebro.

El al menos un trastorno, que esta relacionado con el edema secundario, se selecciona a partir del grupo que con- siste en ictus, ictus isquemico, ictus hemorragico, ictus perinatal, lesion cerebral traumatica y lesion de la medula espinal.

El termino "ictus", tal y como se usa en la presente invencion es bien conocido en la tecnica y en ocasiones tambien se hace referencia al mismo como accidente cerebrovascular (ACV) o infarto cerebral. Un ictus es una afeccion medica que se define medicamente por una reduccion del suministro de sangre al cerebro, dando como resultado una perdida de la funcion cerebral, entre otras cosas debido a isquemia. Dicha reduccion en el suministro sangumeo puede ser debida, por ejemplo, a una trombosis o embolia. Ademas el ictus puede estar causado por procesos he- morragicos. Por lo tanto, los ictus se clasifican generalmente en dos categonas principales, a saber, i) ictus isquemi- co e ii) ictus hemorragico. La isquemia es debida a una interrupcion de la circulacion sangumea y la hemorragia se debe a una ruptura de un vaso sangumeo o una estructura vascular anormal, conduciendo ambos escenarios en ultima instancia a una lesion del tejido cerebral. Alrededor del 87% de los ictus estan causados por isquemia, y el resto por hemorragia. Algunos desarrollan hemorragias dentro de la zona de la isquemia ("transformacion hemorra- gica"). Se desconoce el numero de hemorragias que en realidad comienzan como un ictus isquemico.

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De acuerdo con la presente invencion, dicho ictus, es por lo tanto preferiblemente un ictus isquemico o un ictus he- morragico.

En un ictus isquemico, el suministro de sangre a una parte del cerebro disminuye, lo que lleva a una disfuncion y necrosis del tejido cerebral en esa zona. Existen principalmente tres razones causales: trombosis (obstruccion de un vaso sangumeo por un coagulo sangumeo que se forma localmente), embolia ^dem, debido a un coagulo de san- gre/embolo procedente de otra parte del cuerpo) e hipoperfusion sistemica (disminucion general del suministro de sangre, por ejemplo, en choque). De acuerdo con la invencion, la trombosis se puede producir preferiblemente en arterias, venas, arteriolas, venulas y capilares mientras que la embolia puede ocurrir preferentemente en las arterias, arteriolas y capilares.

Un ictus hemorragico, es decir, una hemorragia intracraneal, es una acumulacion de sangre en cualquier lugar den- tro de la boveda craneal. Se hace una distincion entre hemorragia intra-axial (sangre dentro del cerebro) y hemorragia extra-axial (sangre dentro del craneo pero fuera del cerebro).

En una realizacion particularmente preferida de la invencion, dicho ictus hemorragico es una hemorragia cerebral o una hemorragia subaracnoidea.

Una hemorragia cerebral o una hemorragia intracerebral es un subtipo de hemorragia intracraneal que se produce dentro del propio tejido cerebral. La hemorragia cerebral puede ser debida a hipertension cronica o a traumatismo cerebral, o puede estar inducida por farmacos, por ejemplo, por un tratamiento antiplaquetario (por ejemplo, acido acetilsalidlico) o por un tratamiento anticoagulatorio (por ejemplo, antagonistas de la vitamina K como fenprocumon), o puede ocurrir de forma espontanea en un ictus hemorragico. Una hemorragia intracerebral no traumatica es una hemorragia espontanea en el tejido cerebral. Una hemorragia cerebral es una hemorragia intra-axial; es decir, que se produce en el tejido cerebral mas que en un lugar fuera del mismo. Hay dos tipos principales de hemorragias intra-axiales: la hemorragia intraparenquimatosa y la hemorragia intraventricular (sangre en el sistema ventricular). La otra categona de hemorragia intracraneal es la hemorragia extra-axial, tal como hematoma epidural, subdural, subaracnoidea, todas las cuales se producen dentro del craneo pero fuera del tejido cerebral.

Una hemorragia subaracnoidea es un sangrado en el espacio subaracnoideo - el area entre la membrana aracnoi- dea y la piamadre que rodea el cerebro. Esto puede ocurrir espontaneamente, por lo general a causa de un aneu- risma cerebral roto, o puede ser el resultado de una lesion en la cabeza.

Un ictus perinatal, tal y como se emplea en la presente invencion, es una enfermedad focal de los vasos sangumeos cerebrales que conduce a una lesion en el cerebro durante el periodo fetal o de recien nacido. Perinatal se refiere al penodo de tiempo que se extiende desde la mitad del embarazo (vida fetal) hasta el nacimiento y el primer mes de vida. Por lo tanto, un ictus perinatal significa un ictus que se produce en un bebe en cualquier momento despues de 28 semanas de embarazo hasta 28 dfas despues del nacimiento. En algunos casos, esto puede conducir a una epilepsia infantil.

Una lesion cerebral traumatica (LCT), tambien conocida como lesion intracraneal, de acuerdo con la presente invencion, se produce cuando una fuerza externa lesiona traumaticamente el cerebro. La LCT se puede clasificar en fun- cion de la gravedad, el mecanismo (lesion en la cabeza cerrada o penetrante) u otras caractensticas (por ejemplo, tiene lugar en un lugar espedfico o sobre un area extendida) y puede causar una serie de efectos ffsicos, cognitivos, sociales, emocionales y de comportamiento, y el resultado puede variar desde una recuperacion completa hasta una incapacidad permanente o la muerte. La lesion cerebral traumatica se define como una lesion en el cerebro como resultado de una fuerza mecanica externa, tal como una aceleracion o desaceleracion rapidas, un impacto, ondas de choque o la penetracion de un proyectil. La funcion del cerebro se ve afectada de forma temporal o permanente y el dano estructural puede ser detectable o no con la tecnologfa actual.

La expresion "lesion de la medula espinal" (LME) tal y como se emplea en este documento, se refiere a cualquier lesion de la medula espinal que es debida a un traumatismo en lugar de una enfermedad. Dependiendo de donde se lesione la medula espinal y las rames nerviosas, los smtomas pueden variar ampliamente, desde dolor a paralisis, hasta incontinencia. Las lesiones de la medula espinal se describen a distintos niveles como "incompletas", que pueden variar desde no tener ningun efecto sobre el paciente hasta una lesion "completa", que significa una perdida total de la funcion: las lesiones de la medula espinal tienen muchas causas, pero por lo general se asocian a trauma- tismos graves debidos, p. ej., a accidentes de veldculos de motor, cafdas, lesiones deportivas y violencia.

En ciertas realizaciones de la invencion, el sujeto que tiene la lesion inicial es un sujeto que no carece congenita- mente del inhibidor de C1, es decir, el inhibidor de C1 no se administra a un sujeto que tiene una carencia congenita de inhibidor de la esterasa de C1.

En una realizacion preferida de la invencion, el inhibidor de C1 se usa para prevenir la formacion y/o para reducir el tamano de un edema secundario en un ser humano, es decir, un objeto preferido de la invencion es un ser humano. Pero de acuerdo con la invencion, el inhibidor de C1 tambien se puede administrar a un sujeto que es un animal, preferiblemente un animal domestico, mas preferiblemente un perro, un gato o un caballo.

En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica que comprende C1-INH se prepara para uso en el tratamien-

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to de edema secundario del SNC. Los metodos para la formulacion de composiciones farmaceuticas que compren- den C1-INH son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, si se proporciona una forma en polvo o liofilizada de C1-INH (por ejemplo, mediante liofilizacion) y se desea un producto farmaceutico acuoso, el polvo se puede disolver mez- clando con componentes acuosos de la formulacion farmaceutica y agitando, usando tecnicas adecuadas, tales como agitacion con formacion de vortice o agitacion suave. En otras realizaciones, C1-INH se proporciona en forma liofilizada y se combina con componentes farmaceuticos acuosos (por ejemplo, componentes activos adicionales o componentes inactivos tales como cargas, estabilizadores, disolventes o vehmulos) antes de la administracion.

En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica puede comprender al menos un aditivo tal como una carga, agente de carga, tampon, estabilizador o excipiente. Las tecnicas de formulacion farmaceutica convencionales son bien conocidas por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Gennado et al., compi- ladores, Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000). Los aditivos farmaceuticos adecuados incluyen, por ejemplo, manitol, almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sflice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas tambien pueden contener reactivos tamponadores del pH y agentes humectantes o emulsionantes. En realizaciones adicionales, las composiciones pueden contener conservantes o estabilizantes.

La formulacion de composiciones farmaceuticas puede variar dependiendo de la via de administracion deseada y otros parametros (vease, por ejemplo, Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a ed., APhA Publications, 2003). En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica puede ser una torta liofilizada o polvo. La composicion liofilizada se puede reconstituir para una administracion mediante inyeccion intravenosa, por ejemplo, con agua esteril para inyeccion, USP. En otras realizaciones, la composicion puede ser una solucion esteril, no pirogena. En todavfa otras realizaciones, la composicion se suministra en forma de polvo en una pfldora o comprimido.

Las composiciones farmaceuticas descritas pueden comprender C1-INH como unicos compuestos activos o se pueden administrar en combinacion con al menos otro compuesto, composicion o material biologico. Ejemplos de tales compuestos incluyen vitaminas, antibioticos o compuestos destinados a eliminar o inhibir la formacion de coagulos de sangre en el cerebro (por ejemplo, activador tisular del plasminogeno, acido acetilsalidlico, clopidogrel o dipiri- damol).

Tambien se describen kits para el tratamiento del edema secundario en el SNC. En ciertas realizaciones, los kits comprenden (a) C1-INH, (b) instrucciones para uso en el tratamiento de un edema secundario del SNC o una lesion cerebral por isquemia-reperfusion o para uso en el tratamiento de un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica o la barrera hematomedular y, opcionalmente, (c) al menos un compuesto adicional terapeutica- mente activo o un farmaco. El componente C1-INH puede estar en forma lfquida o solida (por ejemplo, despues de la liofilizacion). Si esta en forma lfquida, el C1-INH puede comprender aditivos tales como estabilizadores y/o conservantes tales como prolina, glicina o sacarosa, u otros aditivos que mejoran la vida util.

En ciertas realizaciones, el kit puede contener compuestos adicionales, tales como compuestos terapeuticamente activos o farmacos que han de administrarse antes, al mismo tiempo o despues de la administracion del C1-INH. Ejemplos de tales compuestos incluyen vitaminas, antibioticos, agentes antivirales, etc. En otras realizaciones, los compuestos destinados a eliminar o inhibir la formacion de coagulos de sangre en el cerebro (por ejemplo, activador tisular del plasminogeno, acido acetilsalidlico, clopidogrel o dipiridamol) pueden estar incluidos en el kit.

En diversas realizaciones, las instrucciones para el uso de los kits incluiran indicaciones para usar los componentes del kit en el tratamiento de un edema secundario del SNC. Las instrucciones pueden contener, ademas, informacion sobre como preparar (por ejemplo, diluir o reconstituir, en el caso de una protema liofilizada) el inhibidor de C1. Las instrucciones pueden incluir, ademas, una orientacion con respecto a la dosificacion y la frecuencia de la administra- cion.

Una formulacion del inhibidor de C1 se puede administrar al individuo por cualquier medio de administracion farma- ceuticamente adecuado. Se conocen varios sistemas de entrega y se pueden emplear para administrar la composicion por cualquier via conveniente. En una realizacion preferida, la formulacion del inhibidor de C1 se administra sistemicamente. Para el uso sistemico, la protema terapeutica se formula para administracion parenteral o enteral (por ejemplo, oral, vaginal o rectal) de acuerdo con metodos convencionales. Una administracion parenteral puede incluir, sin limitacion, una inyeccion intravenosa, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, subdural, intratecal o una inyeccion directamente en el cerebro, administracion intrapulmonar, transdermica o intranasal. La via de administracion mas preferida es la administracion intravenosa. Las formulaciones se pueden administrar conti- nuamente mediante infusion o mediante inyeccion de bolo. Algunas formulaciones incluyen sistemas de liberacion lenta.

En ciertas realizaciones en relacion con el tratamiento de un edema secundario, el C1-INH se administra 5, 10, 20, 30, 40 o 50 minutos, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48, 72, 96, 120 o 240 horas (o en cualquier momento intermedio) despues de que haya comenzado la lesion inicial. En una realizacion preferida, la administracion se lleva a cabo en un plazo maximo de 10 dfas despues de la lesion inicial,

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preferentemente en un plazo maximo de 5 d^as, mas preferiblemente en un plazo maximo de 3 d^as, mas preferen- temente, en un plazo maximo de 1 dfa, mas preferiblemente en un plazo maximo de 12 horas, mas preferentemente en un plazo maximo de 6 horas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 3 horas, mas preferentemente, en un plazo maximo de 1 hora, mas preferiblemente en un plazo maximo de 30 minutos e incluso mas preferiblemente directamente despues de la lesion inicial (o en cualquier momento intermedio).

Con respecto a la semivida larga del inhibidor de la esterasa de C1 humano y/o el tratamiento profilactico, la administracion preferida debena realizarse lo antes posible despues de la aparicion de la lesion inicial.

En otras realizaciones preferidas, el tratamiento con C1-INH se puede iniciar inmediatamente o hasta diez dfas despues del inicio de la reperfusion despues de la oclusion, que fue causada por la lesion inicial. Preferiblemente, tal tratamiento se produce lo antes posible, despues del inicio de la reperfusion. En ciertas realizaciones, el tratamiento se produce 5, 10, 20, 30, 40 o 50 minutos o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 36, 48, 72, 96, 120 o 240 horas (o en cualquier momento intermedio) tras el inicio de la reperfusion, despues de la lesion inicial (o en cualquier momento intermedio). En una realizacion preferida, la administracion tiene lugar en un plazo maximo de 10 dfas tras el inicio de la reperfusion despues de la lesion inicial, preferiblemente en un plazo maximo de 5 dfas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 3 dfas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 1 dfa, mas preferiblemente en un plazo maximo de 12 horas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 6 horas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 3 horas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 1 hora, mas preferiblemente en un plazo maximo de 30 minutos y aun mas preferiblemente directamente tras el inicio de la reperfusion despues de la lesion inicial.

En ciertas realizaciones en relacion con el tratamiento de la lesion cerebral por isquemia-reperfusion con el inhibidor de C1 obtenido a partir de plasma, el tratamiento se puede iniciar desde 30 minutos hasta diez dfas despues del inicio de la reperfusion. En realizaciones preferidas, el tratamiento se produce 30, 40 o 50 minutos o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48, 72, 96, 120 o 240 horas despues del inicio de la reperfusion (o en cualquier momento intermedio). En otras realizaciones, la administracion tiene lugar en un plazo maximo de 10 dfas despues del inicio de la reperfusion, preferiblemente en un plazo maximo de 5 dfas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 3 dfas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 1 dfa, mas preferiblemente en un plazo maximo de 12 horas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 6 horas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 3 horas, mas preferiblemente en un plazo maximo de 1 hora, mas preferiblemente en un plazo maximo de 45 minutos y aun mas preferiblemente en un plazo maximo de 30 minutos despues del inicio de la reperfusion (o en cualquier momento intermedio). Preferiblemente, tal tratamiento se produce entre 30 minutos y 10 dfas despues del inicio de la reperfusion, mas preferiblemente entre 30 minutos y 5 dfas, mas preferiblemente entre 30 minutos y 3 dfas y mas preferiblemente entre 30 minutos y 1 dfa despues del inicio de la reperfusion (o en cualquier momento intermedio).

La administracion a un paciente puede tener lugar en forma de una dosis unica o en administraciones repetidas, y con cualquiera entre una variedad de formas de sales fisiologicamente aceptables, y/o con un vefuculo y/o aditivo farmaceuticamente aceptable como parte de una composicion farmaceutica. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el inhibidor de C1 se administra (i) en una dosis unica como inyeccion o infusion, o (ii) en dosis multiples, preferiblemente en dos dosis, cada una como inyeccion o infusion, o (iii) como una infusion o aplicacion a largo plazo. La infusion o aplicacion a largo plazo se administra durante un penodo de tiempo, preferiblemente durante un penodo de 30 minutos a 2 semanas, mas preferiblemente de 30 minutos a 1 semana, mas preferiblemente de 30 minutos a 6 dfas, mas preferiblemente de 30 minutos a 5 dfas, mas preferiblemente de 30 minutos a 4 dfas, mas preferiblemente de 30 minutos a 3 dfas, mas preferiblemente de 30 minutos a 2 dfas, mas preferiblemente de 30 minutos a 1 dfa, mas preferiblemente de 30 minutos a 12 horas, mas preferiblemente de 30 minutos a 6 horas (o en cualquier mo- mento intermedio).

En una realizacion preferida, la administracion a un paciente se produce en una dosis doble, una vez despues de la lesion inicial y antes del inicio de la reperfusion y una vez tras el inicio de la reperfusion despues de la lesion inicial.

La composicion que comprende C1-INH se puede administrar a un paciente en cantidades terapeuticamente efica- ces. Generalmente, una cantidad terapeuticamente eficaz puede variar con la edad del sujeto, el estado general y el genero, asf como la gravedad de la afeccion medica en el sujeto. La dosificacion la puede determinar un medico y ajustarla, segun sea necesario, para que se adapte a los efectos observados del tratamiento. En ciertas realizaciones, la dosis de C1-INH puede variar desde aproximadamente 1 U/kg hasta 5000 U/kg de peso corporal. En diversas realizaciones, la dosis de C1-INH es 1, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 o 4500 U/kg de peso corporal (o cualquier valor intermedio). Tambien se describen intervalos terapeuticos ejemplares para la administracion de C1-INH en el documento de patente de EE.UU. 5.939.389, cuya descripcion se incorpora en su totalidad. Preferiblemente, el inhibidor de C1 se administra en una dosis de 1 a 1000 unidades por kg de peso corporal, mas preferiblemente de 5 a 500 unidades por kg de peso corporal, mas preferiblemente de 10 a 200 unidades por kg de peso corporal y lo mas preferiblemente en una dosis de 20 a 100 unidades por kg de peso corporal.

Las composiciones farmaceuticas administradas pueden comprender C1-INH como unico compuesto activo o se pueden administrar en combinacion con al menos otro compuesto, composicion o material biologico. Ejemplos de

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tales compuestos incluyen vitaminas, antibioticos o compuestos destinados a eliminar o inhibir la formacion de coa- gulos de sangre en el cerebro (por ejemplo, activador tisular del plasminogeno, acido acetilsalidlico, clopidogrel o dipiridamol).

Las Figuras muestran:

Figura 1: C1-INH reduce la mortalidad y mejora el resultado funcional despues de un ictus isquemico agudo en ratones. (a) Mortalidad en los ratones tratados con C1-INH (7,5 U o 15,0 U, respectivamente) y los controles hasta el dfa 7 despues de tMCAO (n = 10/grupo); **p = 0,0087, *p = 0,0215, prueba de rango logantmico en comparacion con ratones de control. (b) Resultado funcional a largo plazo (puntuacion de Bederson) el dfa 5 despues de tMCAO (n = 3-9/grupo); **p <0,01, prueba de Kruskal-Wallis seguida por prueba de comparacion multiple de Dunn.

Figura 2: C1-INH muestra una profunda estabilizacion de la barrera hematoencefalica y efectos anti- edematosos en el ictus isquemico. (a) Panel superior: Secciones cerebrales coronales correspondientes repre- sentativas de ratones de control (Ctrl) y de ratones tratados 1 h despues de la lesion inicial con 7,5 U de C1- INH o 15,0 U de C1-INH el dfa 1 despues de tMCAO (24 h despues de la lesion inicial) despues de la inyeccion del trazador vascular azul de Evans. La fuga vascular se redujo significativamente despues del tratamiento con C1-INH. Se debe tener en cuenta que la extravasacion de azul de Evans era casi nula en las zonas en donde estaba presente el infarto tambien en los ratones que recibieron C1-INH (ganglios basales, flecha roja). Panel inferior: Volumen de la extravasacion de azul de Evans determinado mediante planimetna en el hemisferio isquemico de ratones tratados y sin tratar, 24 horas despues de tMCAO (n= 7-10/grupo); *p <0,05, ANOVA de 1 via, prueba post-hoc de Bonferroni en comparacion con ratones de control sin tratar. (b) Formacion de edema, medida por el contenido de lfquido cerebral en el hemisferio isquemico de los ratones de control (Ctrl) y los ratones tratados 1 h despues de la lesion con 7,5 U de C1-INH o 15,0 U de C1-INH el dfa 1 despues de tMCAO (24 h despues de la lesion inicial) (n = 5/grupo); ***p <0,0001, ANOVA de 1 via, prueba post-hoc de Bonferroni en comparacion con ratones de control sin tratar. (c) Expresion genica relativa de endotelina-1 en la corteza y los ganglios basales de ratones con operacion simulada, controles (Ctrl) y ratones tratados 1 h despues de la lesion inicial con 7,5 U de C1-INH o 15,0 U de C1-INH (n = 6-14/grupo) 24 horas despues de tMCAO. Tengase en cuenta que 15,0 U de C1-INH impedfa la induccion de la endotelina-1 en ambas regiones del cerebro; ***p <0,0001, ###p <0,0001, ANOVA de 2 vfas, prueba post hoc de Bonferroni en comparacion con los ratones con operacion simulada (corteza (*) o ganglios basales (#), respectivamente). (d) Analisis de transferencia Western de la expresion de ocludina en los ganglios basales isquemicos el dfa 1 despues de tMCAO (24 h despues de la lesion inicial) en ratones de control o ratones que recibieron 7,5 U de C1-INH o 15,0 U de C1-INH, respectivamente (tratamiento 1 h despues de la lesion inicial) (n = 4/grupo), *p <0,05, ANOVA de 1 via, prueba post- hoc de Bonferroni en comparacion con los ratones sin tratar.

Figura 3: El tratamiento con C1-INH reduce la formacion de edema cerebral despues del ictus en las ratas. Las ratas se sometieron a 90 min de tMCAO y se trataron con 20 U/kg de C1-INH inmediatamente despues de la reperfusion. El grado de edema cerebral se calculo por planimetna de secciones cerebrales tenidas con TTC el dfa 1 (24 h despues de la lesion inicial) (n = 15/grupo); ***p <0,0001, prueba t de Student de dos colas en comparacion con los controles tratados con vehfculo.

Figura 4: El tratamiento con C1-INH reduce la formacion de trombos intracerebrales despues del ictus. (a) Panel superior: Acumulacion de fibrina (fibrinogeno) en la corteza infartada (i) y contralateral (c) y los ganglios basales de ratones de control (Ctrl) y ratones tratados con 7,5 U de C1-INH o 15,0 U de C1-INH, como se deter- mino por inmunotransferencia 24 horas despues de tMCAO. Se muestran dos inmunotransferencias represen- tativas de cada grupo. Panel inferior: cuantificacion densitometrica de la formacion de trombos en los grupos de ratones y las regiones cerebrales indicadas anteriormente (n = 3-5/grupo); ***p <0,0001, ##p <0,01, ANOVA de 2 vfas, prueba post hoc de Bonferroni en comparacion con los controles (corteza (*) o ganglios basales (#), respectivamente). (b) Panel superior: Tincion H&E representativa de los ganglios basales infartados de ratones de control (Ctrl) y ratones tratados con 15,0 U de C1-INH el dfa 1 despues de tMCAO. Los vasos tromboticos eran abundantes en los ratones de control (puntas de flecha), mientras que la permeabilidad microvascular era significativamente mayor en los ratones que recibieron 15,0 U de C1-INH (flecha) y esto se confirmo mediante el calculo del mdice de trombosis (n = 5/grupo) (panel inferior); *p <0,05, ANOVA de 1 via, prueba post hoc de Bonferroni, en comparacion con los controles. Barra a escala: 100 pm.

Figura 5: Un tratamiento retrasado con C1-INH reduce la formacion de trombos intracerebrales. Panel superior: Acumulacion de fibrina (fibrinogeno) en las cortezas y los ganglios basales infartados de los ratones de control (Ctrl) y los ratones tratados con 7,5 U de C1-INH o 15,0 U de C1-INH, 6 h despues del ictus, tal y como se de- termino por inmunotransferencia 24 horas despues de tMCAO. Panel inferior: Cuantificacion densitometrica de la formacion de trombos en los grupos de ratones y las regiones del cerebro indicadas anteriormente (n = 4/grupo); *p <0,05, **p <0,01, ###p <0,0001, ANOVA de 2 vfas, prueba post hoc de Bonferroni, en comparacion con los controles (corteza (*) o ganglios basales (#), respectivamente).

Figura 6: C1-INH sigue siendo eficaz cuando se aplica en un entorno retardado despues de tMCAO. (a) Puntuacion neurologica de Bederson (panel superior) y puntuacion de la prueba de agarre (panel inferior) el dfa 1

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despues de tMCAO (24 h despues de la lesion inicial) en los grupos de ratones indicados anteriormente (n = 8- 16/grupo). Los ratones que recibieron 6 h despues de la lesion inicial 15,0 U de C1-INH se desarrollaban signi- ficativamente mejor en comparacion con los controles o con los ratones que recibieron la dosis mas baja (7,5 U) de C1-INH; *p <0,05, prueba de Kruskal-Wallis seguida por la prueba de comparacion multiple de Dunn.

Los ejemplos ilustran la presente invencion, y no la limitan de ningun modo.

Modelo de isquemia. Ratones C57Bl/6 y ratas CD se incluyeron en el estudio que se llevo a cabo de conformidad con las directrices institucionales para el uso de animales de experimentacion, y los protocolos fueron aprobados por las autoridades gubernamentales (Regierung von Unterfranken, Wurzburg, Alemania; Regierungsprasidium Giessen, Alemania). Se indujo una isquemia cerebral focal durante 60 min (ratones C57Bl/6 de 6-8 semanas o 20 semanas de edad) o 90 min (ratas CD de 7-9 semanas de edad) mediante oclusion transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO), utilizando la tecnica de filamento intraluminal (Longa, E.Z., Weinstein, P.R., Carlson, S., & Cummins, R., Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 1989; 20 (1):84-91; Kleinschnitz et al Stroke 2011). En los animales se controlaron los parametros fisiologicos decisivos que pueden afectar al resultado del ictus (por ejemplo, flujo sangumeo cerebral). Todos los experimentos de ictus se realizaron de acuerdo con las directrices ARRIVE, publicadas recientemente (
http://www.nc3rs.org/ARRIVE). Los animales fueron asignados al azar a los operarios a traves de una persona independiente que no participaba en la adquisicion y el analisis de los datos. Se realizo la cirugfa y la evaluacion de todos los parametros de lectura a la vez que se desconodan los grupos experimentales. El diseno detallado del estudio, incluyendo los criterios de exclusion, se proporciona a continua- cion.

Induccion de isquemia cerebral en ratones. La isquemia cerebral focal se indujo en ratones de 6-8 semanas o 20 semanas de edad mediante oclusion transitoria durante 60 min de la arteria cerebral media (tMCAO) como se ha descrito (Kleinschnitz et al., J Exp Med 2006; PloS Biol 2010). Los ratones fueron anestesiados con 2,5% de isoflu- rano (Abbott, Wiesbaden, Alemania) en una mezcla de N2O al 70% / O2 al 30%. La temperatura corporal interna se mantuvo a 37°C durante toda la operacion mediante el uso de un dispositivo de calentamiento con retroalimentacion controlada. Despues de una incision en la piel en la lmea media del cuello, la arteria carotida comun proximal y la arteria carotida externa se ligaron y se inserto un monofilamento de nailon 6.0 homologado, recubierto con silicona (6021; Doccol Corp., Redlands, cA, EE.UU.) y se hizo avanzar a traves de la arteria carotida interna derecha para ocluir el origen de la ACM derecha. La sutura intraluminal se dejo in situ durante 60 minutos. A continuacion, los animales se volvieron a anestesiar y el monofilamento de la oclusion se retiro para permitir la reperfusion.

Evaluacion de los resultados funcionales en ratones. El dfa 1 (24 h despues de la lesion inicial) y el dfa 5 despues de tMCAO, se puntuaron los deficits neurologicos y se cuantificaron segun Bederson (Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, Nishimura Me, Davis RL, Bartkowski H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 1986;173:472-476): 0, sin deficit; 1, flexion de la extremidad anterior; 2, como en 1, ademas de una disminucion de la resistencia al empuje lateral; 3, caminar en drculos unidireccio- nales; 4, girar de forma longitudinal; 5, sin movimiento. Para la prueba de agarre (Moran PM, Higgins LS, Cordell B, Moser PC. Age-related learning deficits in transgenic mice expressing the 751-amino acid isoform of human beta- amyloid precursor protein. Proc Natal Acad Sci U S A. 1995; 9212:5341-5345), el raton se coloco a mitad de camino en una cuerda entre dos soportes y se puntuo de la siguiente manera: 0, se cae; 1, se aferra a la cuerda con una o dos de las patas delanteras; 2, como en 1 mas intentos de subir a la cuerda; 3, se aferra a la cuerda con una o am- bas patas delanteras mas una o ambas patas traseras; 4, se aferra a la cuerda con las patas delanteras y traseras, ademas de la cola enrollada en la cuerda; 5, escape (a los soportes).

Induccion de isquemia cerebral en ratas. Ratas de 7-9 semanas de edad fueron sometidas a 90 minutos de tMCAO utilizando una tecnica de filamento intraluminal (Longa, E.Z., Weinstein, P.R., Carlson, S., & Cummins, R., Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 1989; 20 (1):84-91). En detalle, se indujo la anestesia en los animales con respiracion espontanea en una camara de isoflurano con isoflurano al 5% (CP Pharma, Burgdorf, Alemania) y se mantuvo a continuacion con isoflurano al 2,5% a traves de una mascara facial. Durante la cirugfa, los animales se colocaron sobre un dispositivo de calentamiento para garantizar la normo- termia (37°C). Despues de una incision en la piel en la lmea media del cuello, la arteria carotida comun izquierda y la arteria carotida externa se aislaron y se ligaron. Despues de la arteriotoiTHa, un monofilamento de nailon 4.0 homologado, recubierto con silicona (Ethilon®; Johnson & Johnson, St-Stevens-Woluwe, Belgica) con su punta roma mediante calentamiento, se inserto en la arteria carotida interna y se hizo avanzar cranealmente hacia el origen de la arteria cerebral media hasta que se noto una resistencia suave. El filamento de la oclusion se dejo in situ durante 90 minutos. A continuacion, los animales se volvieron a anestesiar y el monofilamento de la oclusion fue retirado para permitir la reperfusion.

Tratamiento con C1-INH. De 1 ho 6 h despues de la induccion de tMCAO (lesion inicial), los ratones recibieron una unica inyeccion intravenosa de C1-INH plasmatico humano (Berninert® P, CSL Behring GmbH, Marburg, Alemania) con una dosis de 7,5 unidades (U) o 15,0 U diluidas en 150 pl de solucion de vehmulo (solucion salina isotonica). Las dosis respectivas se eligieron basandose en trabajos publicados anteriormente en modelos de roedores con isquemia cerebral y 15,0 U se corresponde a la cantidad de C1-INH requerida para obtener una inhibicion del 90% al 95% de la actividad hemolttica del complemento en ratones (Longhi L et al., Crit Care Med 2009; Storini C et al., Neurobiol Dis, 2005). C1-INH se inyecto en las ratas por via intravenosa, 90 min despues de la induccion de tMCAO

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(inmediatamente despues de la induccion de la reperfusion) con una dosis de 20 U/kg de peso corporal. Los ratones y las ratas de control recibieron volumenes iguales de solucion salina isotonica (vehteulo).

Diseno del estudio de ictus. Ratones o ratas tratados con velmculo o ratones o ratas que recibieron C1-INH fueron asignados al azar a los operarios a traves de una persona independiente que no participaba en la adquisicion y ana- lisis de los datos. Se realizo la cirugfa y la evaluacion de todos los parametros de lectura, a la vez que se descono- dan los grupos experimentales. Las siguientes condiciones exclman los animales de analisis de criterios de valora- cion (criterios de exclusion):

1. Muerte 24 horas despues de MCAO

2. Hemorragia subaracnoidea (HSA) (como se determino macroscopicamente durante el muestreo del cere-

bro o por IRM)

3. Puntuacion de Bederson = 0 (24 horas despues de tMCAO, solamente ratones)

Las tasas de abandono se distribuyeron de manera uniforme entre los grupos.

Determinacion de fugas en la barrera hematoencefalica y edema cerebral. Para determinar fugas en la barrera hematoencefalica, 100 pl de trazador azul de Evans al 2% (Sigma Aldrich, Alemania) diluidos en NaCl al 0,9% se inyectaron por via i.v. 1 h despues de la induccion de tMCAO (Austinat et al., Stroke 2011). Despues de 24 h, los ratones tratados con C1-INH y los controles se perfundieron transcardialmente con paraformaldelmdo (PFA) al 4%y los cerebros se extirparon rapidamente y se cortaron en secciones coronales de 2 mm de espesor, utilizando una matriz para cortes de cerebro de raton (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EE.UU.). Se realizaron mediciones plani- metricas (programa informatico ImageJ, National Institutes of Health, EE.UU.) del parenquima cerebral tenido con azul de Evans para estimar la lesion en la barrera hematoencefalica.

Para evaluar la extension del edema cerebral secundario, los ratones tratados con C1-INH y los controles fueron sacrificados 24 horas despues de tMCAO. Se extrajeron los cerebros, se separaron los hemisferios y se pesaron para determinar el peso humedo (PH). Despues de ello, se secaron los hemisferios durante 72 h a 60°C y se deter- mino el peso seco (PS). El contenido en agua hemisferica (%) se calculo utilizando la siguiente formula: ((PH- PS)/PH) x 100 (Austinat et al., Stroke 2009).

En las ratas, la extension del edema cerebral secundario se calculo mediante planimetna de secciones cerebrales tenidas con TTC, de acuerdo con la siguiente ecuacion:

Area del edema cerebral (%) = [AL+AI+AC) x 100/(AC x 2)] -100,

mientras que AL representa el area total del tejido cerebral negativo para TTC (isquemico), Al representa el area total de tejido viable del hemisferio ipsilateral (con ictus), y AC representa el area total del hemisferio contralateral (sano).

La tincion con TTC (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio), necesaria para el calculo del edema cerebral en ratas, se realizo usando el siguiente protocolo: Las ratas se sacrificaron 24 horas despues de tMCAO. Los cerebros se extirparon rapidamente y se cortaron en seis secciones coronales de 2 mm de espesor utilizando una hoja de afeitar (VWR International GmbH, Darmstadt, Alemania). Los cortes se tineron durante 15 minutos a 37°C con TTC al 2% (Merck Eurolab GmbH, Darmstadt, Alemania) en PBS para visualizar los infartos (Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke. 1986; 176:1304-1308).

Histologia e inmunohistoqmmica. Cerebros crioincluidos se cortaron en secciones de 10 pm de espesor y se fijaron en acetona para la tincion de granulocitos neutrofilos o en PFA al 4% en PBS para la tincion de micro- glfa/macrofagos y ocludina. El bloqueo de los epftopos se logro mediante un tratamiento previo con albumina de suero bovino (BSA) en PBS durante 45 min, para evitar la union no espedfica. Para la tincion de celulas inmunes invasoras (Austinat et al., 2009), aloantfgeno Ly-6B.2 de rata anti-raton (granulocitos neutrofilos; MCA771GA, AbD Serotec, Alemania) con una dilucion de 1:1000 y CD11b de rata anti-raton (microglfa/macrofagos; MCA711, Serotec AbD, Alemania) con una dilucion de 1:100 en PBS que contema BSA al 1%, se anadieron durante la noche a 4°C. Despues, los portaobjetos se incubaron con una IgG anti-rata biotinilada (BA-4001, Vector Laboratories, EE.UU.) diluida 1:100 en PBS que contema BSA al 1% durante 45 min a temperatura ambiente. Despues del tratamiento con una solucion de bloqueo de avidina/biotina (kit de bloqueo con avidina/biotina, Sp-2001, Vector Laboratories, Inc., California, EE.UU.) para inhibir la actividad peroxidasa endogena, el anticuerpo secundario se uma a traves de es- treptavidina a una peroxidasa biotinilada (POD), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Vectorstain ABC Kit, peroxidasa estandar PK-4000, Vector Laboratories, Inc., California, EE.UU.). Los antfgenos se visualizaron a traves de POD utilizando el cromogeno 3,3'-diaminobencidina (DAB) (Kem-En-Tec Diagnostics, Dinamarca). Para la cuantificacion de celulas inmunes, secciones de cerebro identicas (10 pm de espesor) a nivel de los ganglios basa- les (0,5 mm anterior del bregma) procedentes de ratones tratados con C1-INH y controles, se seleccionaron y el recuento de celulas se realizo a partir de 5 cortes consecutivos (distancia de 10 pm) de 4 animales diferentes, bajo un microscopio Nikon Eclipse 50i (Nikon, Alemania) (Austinat et al., 2009).

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Para la tincion inmunofluorescente frente a ocludina, se aplico un anticuerpo de conejo anti-raton (ab 31721, Abcam, GB) durante la noche (4°C) con una dilucion de 1:100 en PBS que contema BSA al 1%. Las protemas se detectaron con anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo marcados con Cy3, con una dilucion de 1:300 en BSA al 1% en PBS. Para la tincion del ADN, un colorante fluorescente de Hoechst (Hoechst 33342, Sigma-Aldrich, Alemania) se anadio durante 30 minutos a una concentracion de 0,4 mg/ml. Las secciones se analizaron bajo un microscopio Axiophot 2 (Zeiss, Alemania).

Para el calculo del mdice de trombosis, todo el cerebro se corto en secciones, 24 h despues de tMCAO. Se realizo una tincion con H&E de acuerdo con procedimientos convencionales. Para la cuantificacion, se examinaron las tin- ciones de forma ciega con un microscopio (Axiophot2, Carl Zeiss AG) equipado con una camara CCD (Visitron Systems). El numero de vasos sangumeos ocluidos dentro de los ganglios basales isquemicos se conto cada diez cortes en los ratones de control o los ratones tratados con 7,5 U de C1-INH o 15,0 U de C1-INH, respectivamente, utili- zando 40 aumentos.

Los controles negativos para todos los experimentos histologicos inclrnan una omision del anticuerpo primario o secundario y no produdan una senal detectable (no mostrado).

Estudios de PCR. La homogeneizacion del tejido, el aislamiento de ARN y la RT-PCR en tiempo real se llevaron a cabo como se ha descrito (Austinat et al., Stroke 2009). El ARN total se preparo con un homogeneizador de potencia Miccra D-8 (ART, Alemania) utilizando el reactivo TRIzol® (Invitrogen, Alemania) y se cuantifico espectrofotometri- camente. A continuacion, 1 |jg de ARN total se transcribio de forma inversa con los reactivos de transcripcion inversa TaqMan® (Applied Biosystems, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante, usando hexameros aleatorios. Los niveles de expresion genica relativa de endotelina-1 (ID del ensayo: Mm 00438656_m1, Applied Biosystems, Alemania) se cuantificaron con la tecnologfa fluorescente TaqMan®. GAPDH (Reactivos del ensayo TaqMan® Predeveloped para expresion genica, referencia: 4352339E, Applied Biosystems, Alemania) se utilizo como control endogeno para normalizar la cantidad de ARN en la muestra. La PCR se realizo con cantidades iguales de ADNc en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus® (Applied Biosystems, Alemania) utilizando la mezcla de TaqMan® Universal 2x PCR Master Mix (Applied Biosystems, Alemania). Las reacciones (volumen total de 12,5 jl) se incuba- ron a 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 15 s a 95°C y 1 min a 60°C. Se incluyeron controles de agua para asegurar la especificidad. Cada muestra se midio por triplicado y los puntos de datos se examinaron en busca de integridad mediante un analisis de la grafica de amplificacion. El metodo comparativo Ct se utilizo para la cuantificacion relativa de la expresion genica como se ha descrito (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001; 25:402-408).

Transferencia Western. Cortezas cerebrales o ganglios basales se disecaron a partir de cerebros naturales y se homogeneizaron en tampon RIPA (Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de NP-40) que contema 0,1% de sDs y 4% de inhibidor de proteinasa (mezcla de inhibidor de proteasa completa, Roche). Las muestras se trataron con ultrasonidos durante 10 s. Despues, los lisados de tejidos se centrifugaron a 15.000 x g durante 30 min a 4°C y el material sobrenadante se utilizo para el ensayo de protemas BCA y el analisis de transferencia Western posterior. Los lisados totales se trataron con tampon de carga 4x SDS-PAGE (conc. final Tris 62,5 mM pH 6,8, 3% de beta- mercaptoetanol, 8% de SDS, 15% de glicerol) a 95°C durante 5 min. Se sometieron a electroforesis 20 jg de protef- na total y se transfirieron a una membrana de PVDF. Despues de bloquear durante 30 min con tampon de bloqueo (leche en polvo desnatada al 5%, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 0,05% de Tween-20), las membranas se incubaron con el anticuerpo primario a 4°C durante una noche con las siguientes diluciones: pAb anti-fibrinogeno 1:500 (Acris Antibodies), pAb anti-ocludina 1:1000 (Abcam, GB) y AcMo anti-actina 1:75.000 (Dianova). Despues de una etapa de lava- do con TBS-T (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 0,05% de Tween-20), las membranas se incubaron durante 1 h con IgG de burro anti-conejo conjugada con HRP (para fibrinogeno y ocludina) (Dianova, Alemania) o IgG de burro anti-raton (para actina) (Dianova, Alemania) con una dilucion de 1:5000 y se desarrollaron finalmente utilizando ECLplus (GE Healthcare) (Kraft et al., Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) deficient mice are susceptible to intracerebral thrombosis and ischemic stroke. PLoS One 2010).

Estadisticas

Todos los resultados se expresaron como media ± desviacion estandar (d.e.) a excepcion para escalas de resulta- dos funcionales ordinales que se representaron como graficos de dispersion incluyendo la mediana con el percentil 25% y el percentil 75% entre parentesis en el texto. El numero de experimentos para detectar un tamano del efecto estandarizado en volumenes de infarto >0,15, se calculo mediante un analisis de potencia a priori con los siguientes supuestos: a = 0,05, p = 0,2, media, desviacion estandar 10% de la media. Para el analisis estadfstico se utilizo el paquete de programas informaticos GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, CA, EE.UU.). Los datos se analizaron para estu- diar la distribucion gaussiana con la prueba de normalidad omnibus de D'Agostino y Pearson y luego se analizaron mediante ANOVA de 1 via o, en el caso de medir los efectos de dos factores de forma simultanea, la ANOVA de 2 vfas con ajuste post hoc de Bonferroni para los valores de p. Las puntuaciones de resultados funcionales no para- metricos se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparacion multiple post hoc de Dunn. Para la comparacion de las curvas de supervivencia, se utilizo la prueba Logrank. Los datos de las ratas se compararon mediante la prueba de la t de Student no pareada, de dos colas (tamano del ictus, edema cerebral) o la prueba no parametrica de Mann-Whitney (puntuaciones funcionales). Los valores de P <0,05 fueron considerados

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estadfsticamente significativos.

Resultados

Se determino el resultado funcional y la mortalidad de los ratones tratados con C1-INH y los controles durante un penodo de tiempo mas largo, despues del ictus isquemico (Fig. 1a, b). Siete dfas despues de los 60 minutos de tMCAO, 9 de cada 10 ratones de control (90%) hadan muerto, lo que estaba en consonancia con los informes ante- riores (Kleinschnitz et al., PLoS Biol 2010). En contraste, 7 de cada 10 ratones (70%) tratados con 7,5 U de C1-INH y 9 de cada 10 ratones (90%) tratados con la dosis mas alta de 15,0 U de C1-INH, sobrevivieron hasta el dfa 7 (p <0,05 o p <0,01, respectivamente) (Fig. 1a). De acuerdo con estos hallazgos, los ratones que recibieron 15,0 U de C1-INH mostraban puntuaciones de Bederson significativamente mejores que los controles, tambien en etapas mas avanzadas de desarrollo del infarto, es decir, el dfa 5 despues de tMCAO (puntuacion de Bederson: mediana 2,0 [2,0, 3,0] [control] frente a 0,0 [0,0, 1,0] [15,0 U], respectivamente; p <0,01) (Fig. 1 b).

C1-INH tiene un papel importante en la regulacion de la permeabilidad vascular y la supresion de la inflamacion mediante la inactivacion de proteasas claves del sistema de contacto-cinina, como el factor XIIa o la calicrema plas- matica (Alvin E. Davis III, Pedro Mejfa, Fengxin Lu, Molecular Immunology 2008). En consecuencia, se abordo la magnitud de la lesion de la barrera hematoencefalica y la formacion de edema en los hemisferios isquemicos. El dfa 1 despues de tMCAO, la integridad de la barrera hematoencefalica tal y como se hada determinado por el volumen de fuga del trazador vascular azul de Evans en el parenquima cerebral, se conservaba en ratones tratados con 15,0 U de C1-INH, 1 h despues del ictus y era menos pronunciada tambien despues de una inyeccion de 7,5 U de C1- INH, en comparacion con controles sin tratamiento previo (media 51,6 ± 30,6 mm3 [control] frente a 33,1 ± 25,0 mm3 [7,5 U] o 13,9 ± 11,4 mm3 [15,0 U], respectivamente; p <0,05 [control frente a 15,0 U]) (Fig. 2a). Este hallazgo se correlaciona con la formacion menos drastica de edema cerebral secundario (metodo de peso humedo/seco) despues de la aplicacion terapeutica de C1-INH (media 4,3 ± 1,1% [control] frente a 2,9 ± 1,0% [7,5 U] o 0,2 ± 0,9% [15,0 U], respectivamente; p <0,0001 [control frente a 15,0 U]) (Fig. 2b), un resultado que tambien se pudo confirmar en ratas (Fig. 3). Es importante destacar que casi no se encontro ninguna interrupcion de la barrera hematoencefalica en las regiones cerebrales (ganglios basales), en donde los infartos estaban presentes de forma regular tambien en los ratones tratados con C1-INH (Fig. 2a, flecha). Esto indica que el edema menor observado en el grupo C1-INH era un fenomeno espedfico y relevante de forma mecanica, pero no se deda simplemente a volumenes menores de infarto en estos animales.

La expresion de endotelina-1 en los cerebros isquemicos de ratones tratados con C1-INH y los controles tambien se analizo. La endotelina-1 ha mostrado estar involucrada de forma decisiva en la regulacion de la integridad vascular y la formacion de edema en diversas afecciones fisiopatologicas, incluyendo el ictus isquemico (Matsuo Y, Mihara Si, Ninomiya M, Fujimoto M. Protective effect of endothelin type A receptor antagonist on brain edema and injury after transient middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 2001; 32:2143-2148; Barone FC, Globus MY, Price WJ, White RF, Storer BL, Feuerstein GZ, Busto R, Ohlstein EH. Endothelin levels increase in rat focal and global ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 1994; 14:337-342). Veinticuatro horas despues de tMCAO, los niveles de ARNm de endotelina-1 eran significativamente elevados en las cortezas y los ganglios basales de ratones tratados con vedcu- lo y de ratones que hadan recibido 7,5 U de C1-INH, en comparacion con los ratones con una operacion simulada (expresion genica relativa en la corteza: 1,0 ± 0,2 [simulada] frente a 16,0 ± 6,3 [control] o 15,6 ± 6,8 [7,5 U], respectivamente, p <0,0001; expresion genica relativa en los ganglios basales: 1,0 ± 0,2 [simulada] frente a 4,3 ± 1,2 [control] o 4,2 ± 1,5 [7,5 U], respectivamente, p <0,0001) (Fig. 2c). En contraste, no se observo una induccion significati- va de los transcritos de endotelina-1 en ninguna region del cerebro despues del tratamiento con 15,0 U de C1-INH (p >0,05). Una vez mas, la expresion de endotelina-1 se mantuvo baja tambien en los ganglios basales despues del tratamiento con dosis elevadas de C1-INH (15,0 U) (Fig. 2c), aunque los ganglios basales se incluyeron de manera uniforme en las areas infartadas en todos los animales

De acuerdo con un efecto estabilizador de la barrera hematoencefalica de C1-INH en la inmunorreactividad del ictus contra la zona de oclusion, la protema ocludina se conservaba en los vasos de los ganglios basales isquemicos procedentes de ratones tratados con 15,0 U de C1-INH, pero tema una regulacion a la baja en los ratones de control o los ratones que recibieron 7,5 U de C1-INH, tal y como se muestra por inmunohistoqdmica. Para cuantificar mas detalladamente la expresion de la protema ocludina, tambien se ha realizado un analisis de transferencia Western (Fig. 2d). Una vez mas, la cantidad de ocludina el dfa 1 despues de tMCAO en los ganglios basales isquemicos de ratones sin tratar, era baja (densidad optica: 0,08 ± 0,10). En contraste, se podfa detectar significativamente mas protema ocludina despues del tratamiento con 7,5 U (densidad optica: 0,6 ± 0,3, p <0,05) o 15,0 U (densidad optica: 0,5 ± 0,2, p <0,05) de C1-INH, respectivamente.

Se ha mostrado que C1-INH inhibe la migracion celular desde el sistema vascular a los sitios de inflamacion mediante la union de moleculas de adhesion celular (Cai S, Davis III, AE, 2004, J Immunol). Por lo tanto, se ha cuantificado el numero de celulas inmunes que invaden el cerebro isquemico mediante inmunocitoqdmica. Veinticuatro horas despues de la induccion de tMCAO, una cantidad significativamente mayor de granulocitos neutrofilos (media 299,1 ± 138,1 [control] frente a 107,2 ± 109,5 [15,0 U], p <0,05), asf como macrofagos/celulas de microglia (media 676,3 ± 150,4 [control] frente a 117,1 ± 64,9 [15,0 U], p <0,0001) hada entrado en los ganglios basales isquemicos de los ratones de control sin tratar, que en los ratones que hadan sido tratados con 15,0 U de C1-INH 1 h despues del ictus. En contraste, la dosis mas baja de 7,5 U de C1-INH era incapaz de reducir el trafico celular despues de la

isquemia cerebral focal (p >0,05).

C1-INH tambien actua sobre FXlla, el activador principal de la v^a intrmseca de la coagulacion de la sangre (Alvin E. Davis III, Pedro Mejfa, Fengxin Lu, Molecular Immunology 2008). Por lo tanto, analizamos el impacto de C1-INH sobre la actividad trombotica despues de una lesion cerebral por isquemia/reperfusion. De hecho, la cantidad de 5 fibrina (fibrinogeno) detectada mediante transferencia Western en la corteza isquemica (densidad optica media 2,8 ± 1,1 [control] frente a 1,7 ± 0,8 [7,5 U] o 0,03 ± 0,02 [15,0 U], respectivamente; p <0,0001 [control frente a 15,0 U]) y en los ganglios basales (densidad optica media de 2,8 ± 1,0 [control] frente a 1,2 ± 0,7 [7,5 U] o 0,3 ± 0,2 [15,0 U], respectivamente; p <0,001 [control frente a 15,0 U]), se redujo significativamente el dfa 1 tras el ictus despues de la aplicacion de dosis elevadas (15,0 U) de C1-INH, 1 h despues de la induccion de tMCAO (Fig. 4a). De acuerdo con 10 ello, la permeabilidad microvascular se incrementaba en los ratones tratados con C1-INH, en comparacion con los controles sin tratamiento previo (mdice de trombosis: 15,8 ± 3,0 [control] frente a 12,2 ± 2,8 [7,5 U] o 9,8 ± 2,4 [15,0 U], respectivamente; p <0,05 [control frente a 15,0 U]) (Fig. 4b). Es importante destacar que la actividad trombotica todavfa se reducfa significativamente en las cortezas y los ganglios basales cuando C1-INH se aplicaba en un marco retardado, es decir, 6 h despues de tMCAO (Fig. 5).

15 En un intento de ampliar la ventana de tiempo terapeutico de C1-INH aplicado de forma exogena, ratones C57BL/6 recibieron tambien 7,5 U o 15,0 U de C1-INH en un marco retardado, es decir, 5 h despues del inicio de la reperfusion (es decir, 6 h despues de la induccion de tMCAO). En particular, la disfuncion neurologica todavfa era significativamente menor en el grupo de 15,0 U de C1-INH en comparacion con el grupo de 7,5 U de C1-INH o los animales de control el dfa 1 (puntuacion de Bederson: mediana 3,0 [3,0, 4,0] [control] frente a 3,0 [2,0, 3,0] [7,5 U] o 3,0 [1,0, 20 3,0] [15,0 U], respectivamente, p <0,05; puntuacion de la prueba de agarre, mediana 3,0 [1,0, 4,0] [control] frente a

4,0 [3,0, 4,0] [7,5 U] o 4,0 [3,0, 5,0] [15,0 U], respectivamente, p <0,05) (Fig. 6)

Claims (16)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un inhibidor de C1 para uso en un metodo para prevenir la formacion y/o reducir el tamano de un edema secun- dario del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto en donde el sujeto tiene o ha tenido al menos un trastorno seleccionado a partir del grupo que consiste en ictus, ictus isquemico, ictus hemorragico, ictus perinatal, lesion cerebral traumatica y lesion de la medula espinal.
2. 2. El inhibidor para uso segun la reivindicacion 1, en donde dicho edema secundario del SNC es un edema cerebral secundario o un edema secundario de la medula espinal.
3. 3. El inhibidor para uso segun la reivindicacion 1 o 2, en donde dicho edema secundario es sustancialmente un edema vasogenico.
4. 4. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho edema secundario se produce 1 a 10 dfas, preferiblemente 2 a 5 dfas despues de una lesion inicial que conduce a al menos un trastorno segun la reivindicacion 1.
5. 5. El inhibidor para uso segun la reivindicacion 4, en donde la lesion inicial es una oclusion de un vaso sangumeo o una hemorragia en el cerebro.
6. 6. El inhibidor para uso segun la reivindicacion 5, en donde dicho sujeto es un ser humano.
7. 7. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho inhibidor es un inhibidor de C1 obtenido a partir del plasma o recombinante.
8. 8. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho inhibidor es identico a la protema humana de origen natural o una variante de la misma.
9. 9. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho inhibidor es el inhibidor de la C1 esterasa humana.
10. 10. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el tamano del edema secundario se reduce al menos un 10%, preferiblemente al menos un 20%, mas preferiblemente al menos un 30% en comparacion con el tamano del edema cerebral secundario sin tratar.
11. 11. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho inhibidor se administra por via intravenosa o subcutanea.
12. 12. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho inhibidor se administra en una dosis de 1 a 1000 unidades por kg de peso corporal, preferiblemente de 5 a 500 unidades por kg de peso corporal.
13. 13. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho inhibidor se administra (i) en una dosis unica como una inyeccion o como una infusion, o (ii) en dosis multiples, preferiblemente en dos dosis, cada una como una inyeccion o como una infusion, o (iii) como una infusion o aplicacion a largo plazo.
14. 14. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho inhibidor se administra como maximo 10 dfas despues de la lesion inicial, preferiblemente como maximo 5 dfas, mas preferentemente como maximo 3 dfas despues de la lesion inicial.
15. 15. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho inhibidor se administra como maximo 10 dfas tras el inicio de la reperfusion despues de la lesion inicial, preferiblemente como maximo 5 dfas, mas preferiblemente como maximo 3 dfas tras el inicio de la reperfusion despues de la lesion inicial.
16. 16. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho inhibidor se administra dos veces, una vez despues de la lesion inicial y antes del inicio de la reperfusion y la segunda vez tras el inicio de la reperfusion despues de la lesion inicial.