KR101956585B1 - 면역글로불린과 ｃ1-억제제를 사용하는 병용 치료요법 - Google Patents

면역글로불린과 ｃ1-억제제를 사용하는 병용 치료요법 Download PDF

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체에스엘 베링 게엠베하
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Abstract

본 발명은 사람 혈장-유래된 면역글로불린 G(IVIG)와 같은 면역글로불린과 C1-INH(C1-억제제)의 병용물을 사용하여 대뇌 허혈을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

면역글로불린과 Ｃ1-억제제를 사용하는 병용 치료요법{COMBINATION THERAPY USING IMMUNOGLOBULIN AND C1-INHIBITOR}
본 출원은, 본원에 그 전문이 인용에 의해 포함되는 2011년 9월 24일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/538,832호에 대하여 35 U.S.C. §119 하에 우선권을 주장한다.
본 발명은, 미국 국립 보건원의 국립 노화 연구소에 의해 수여된 공동 협정 #29466-09 하의 정부 지원으로 일부 이루어졌다. 정부는 본 발명에 있어서 소정 권한을 갖는다.
본 발명은 일반적으로, 대뇌 허혈의 치료에서의, C1-억제제(C1 에스테라제 억제제 또는 C1-INH) 및 면역글로불린, 예를 들면, 혈장-유도된 면역글로불린 G(IVIG)의 용도에 관한 것이다.
급성 허혈성 뇌졸중(AIS)은, 높은 사망률 및 생존자에서 영구적인 신경학적 결손을 야기하는 중요한 공중 보건 문제이다. 효소적 혈전 용해 형태의 현행 중재 치료는 낮은 비율(%)의 환자에게만 유익하다. 미국에서의 모든 AIS 환자의 6% 미만은, 주로 짧은 치료학적 윈도우(therapeutic window)(예를 들면, 통상적으로 뇌졸중 후 약 1시간)으로 인해 재조합 조직 플라스미노겐 활성인자(recombinant tissue plasminogen activator; rtPA)에 의한 효소적 혈전 용해와 같은 현행 표준의 관리 치료를 받을 자격이 있다. Adeoye O, Hornung R, Khatri P, Kleindorfer D. Stroke 42(7): 1952-1955 (2011). 또한, rtPA와 같은 치료는 환자에서 뇌출혈을 유도할 위험을 증가시킬 수 있다. 따라서, AIS에 대한 개선된 치료, 및 특히, 뇌졸중 후 보다 늦은 시간에 투여되는 경우에 유효한 치료에 대한 필요성이 존재한다.
보체계는 약 30개의 순환 혈장 단백질 및 관련 세포막 단백질의 단백질분해 캐스케이드(cascade)이다. 혈장 단백질은 일반적으로 간에서 합성되며, 통상적으로 불활성 전구체로서 순환한다. 보체 프로테아제에 의한 전구체 개열(cleavage)은, 염증을 포함하는 각종 선천 면역 반응을 담당하는 사이토카인 신호전달 캐스케이드를 개시한다. 보체 활성화는, 대뇌 허혈과 관련된 염증을 포함하는 각종 면역-염증 반응에 연루되어 있다.
대뇌 허혈 후 재관류 동안, 순환의 복원은 뇌 조직에 대한 염증성 및 산화성 손상을 유발할 수 있다. 재관류시 상기 조직에 진입하는 백혈구 세포는, 인터류킨 및 유리 라디칼을 포함하는 염증성 인자의 숙주를 방출한다. 또한, 회귀 혈액에 의한 산소의 재도입은 세포 및 원형질막도 손상시킬 수 있다. 보체계는, 재관류 손상을 초래하는 뇌에서의 허혈성 캐스케이드의 개시에 연류되어 있다. 따라서, 보체계를 억제하거나 조정하기 위한 기술은 재관류 손상을 치료하거나 예방할 기회를 제공할 수 있다.
정맥내 면역글로불린 G(IVIG)와 같은 혈장-유도된 면역글로불린은, 다중 혈액 공여자로부터 추출된 혼주된(pooled) 면역글로불린을 함유하는 정맥내-투여되는 혈액 생성물이다. IVIG는 각종 면역결핍증 및 염증성 질환에 사용하기 위해 권장된다. IVIG는 뇌에서의 활성 보체 단편을 소거(scavenge)하고 대뇌 허혈 및 재관류와 관련된 손상을 보호하는 것으로 나타났다. Arumugam et al., PNAS 104(35): 14104-14109 (2007).
C1-억제제(C1-INH)는, 보체계와 관련된 순환 프로테아제의 자발적 활성을 예방하는 세린 프로테아제 억제제, 특히, C1r, C1s, MASP-1 및 MASP-2이다. 보체 전형적 경로의 조절에서 C1-INH의 중심 역할과 재관류 손상에서 보체-매개된 염증의 관여를 고려해 볼 때, C1-INH 투여는, 뇌졸중 후 신경학적 결손 및 경색 크기에 대한 C1-INH의 영향에 대해 조사되었다. 문헌[De Simoni et al., J. Cereb . Blood Flow Metab . 23(2): 232-239 (2003)]; 및 또한 문헌[Longhi et al., Crit . Care Med . 37(2): 659-665 (2009)]도 참조한다. 이전 연구는, C1-INH가 대뇌 허혈의 마우스 모델에서 강력한 신경보호 특성을 가짐을 밝혔다. C1-INH 신경 보호와 관련되는 제안된 메커니즘으로는 1) 보체 억제, 2) 손상에 대한 염증 반응의 약화, 3) 아폽토시스의 약화, 및 4) 백혈구-내피 세포 부착의 감소가 포함된다. 혈장-유도된 C1-INH에 의한 보체 활성화의 억제는 마우스뿐만 아니라 래트에서도 이로운 것으로 나타났다. De Simoni et al., Am J Pathol 164: 1857-1863 (2004); Akita et al., No To Shinkei 53: 641-644 (2001). 그러나, 이들 연구에서 관찰된 치료학적 윈도우는 허혈 후 1시간 미만이었다. Id . 이는, 재조합 C1-INH가 보다 늦은 시점(예를 들면, MCAO 후 18시간 이하에 제공되는 경우)에서 뇌 경색 크기를 감소시킬 수 있는 최근 결과와는 대조적이다. Gesuete et al., Ann Neurol 66: 332-342 (2009). 지금까지의 일반적인 개념은, 혈장-유도된 C1-INH가 짧은 치료학적 윈도우로 인하여 사람에서 뇌졸중을 치료하기 위한 재조합 C1-INH 만큼 유망하지 않다는 것이었다.
동물 실험은 C1-INH 및 IVIG가 개별적으로 뇌의 재관류 손상의 영향을 조정하는데 효과적일 수 있음을 시사하지만, 대뇌 허혈과 관련된 재관류 손상을 치료하기 위한 보다 효과적이고 보다 낮은 용량의 비용-효율적인 방법을 개발할 필요성이 있다. 따라서, 예방학적 투여 또는 허혈 후 시점에서의 투여에 의해 대뇌 허혈과 관련된 재관류 손상 및 염증성 손상을 치료하거나, 감소시키거나 또는 예방하기 위해 C1-INH 및 면역글로불린, 예를 들면, IVIG를 사용하는 병용 치료요법이 본원에 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, C1-INH 또는 면역글로불린 중 어느 하나의 단독 구성요소가 치료 효과를 덜 제공하는 경우, C1-INH와 면역글로불린, 예를 들면, IVIG의 병용물의 사용은 보다 늦은 시점에서 재관류 손상 및 염증 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 병용물은 대뇌 허혈 후 약 6시간 이하에 투여되었거나, 이로운 효과를 제공하면서 각 구성요소의 최대 용량보다 더 적게 투여되었다. 일부 실시형태에서, 상기 병용물은 대뇌 허혈 후 6시간보다 더 늦게 투여될 수 있다. 따라서, C1-INH와 면역글로불린, 예를 들면, IVIG의 병용물을 사용하는 것은, 치료 용량을 감소시키면서 치료 결과를 향상시킬 수 있으며, 이로써 비용을 낮출 수 있을 뿐만 아니라 치료 화합물에 대한 유해 반응의 위험을 감소시킬 수 있다.
도 1. C1-INH 용량 반응 곡선. 마우스의 그룹(n = 12 내지 21)을 허혈 기간(I)의 종료 1시간 후에 300U/Kg(7.6U/동물), 150U/Kg(3.8U/동물) 및 75U/Kg(1.9U/동물)으로 C1-INH의 용량을 감소시키면서 치료하였다. 세로축 상의 경색 용적(%)의 감소에 대하여 C1-INH 농도(U/Kg)를 가로축 상에 플로팅(plotting)한다.
도 2. IVIG 용량 반응 곡선. 동물의 그룹(n = 12 내지 22)을 허혈 1시간 후에 1g/체중 kg으로 시작하여 절반 용량 - 0.5g/Kg 및 0.25g/Kg(또는 25 내지 30g인 성체 마우스의 평균 체중을 고려하여 mg/g) - 을 계속해서 감소시킴으로써 IVIG의 용량을 감소시키면서 치료하였다. 세로축 상의 경색 용적(%)의 감소에 대하여 IVIG 용량(g/Kg)을 가로축 상에 플로팅한다.
도 3. C1-INH/IVIG 병용 치료. 허혈 1시간 후에 마우스에게 단일 IVIG 용량 0.50mg/체중 g을 제공하고, 이어서, 30분 후에 75U/kg으로 C1-INH를 단일 정맥내(i.v.) 주사하였다(n = 19). 뇌 경색 용적을 72시간의 재관류 기간 후에 측정하였고, 경색 용적의 억제율(%)을 C1-INH 단독 또는 IVIG 단독으로부터의 억제율(%)과 비교하였다.
도 4a 내지 도 4b. 마우스를 허혈 시작 6시간 후에 IVIG 1g/kg(n = 11), C1-INH 300U/kg(n = 9) 또는 병용물(n = 10)로 치료하고, 허혈 72시간 후에 경색 영역(도 4a) 및 신경학적 결손 스코어(도 4b)를 측정하였다(*P<0.001).
지금부터 본 개시에 따른 예시적인 소정 실시형태를 상세히 참조할 것이고, 이들의 특정 예는 첨부되는 도면에 도시되어 있다.
본원에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 명시하지 않으면 복수를 포함한다. 또한, 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시하지 않으면 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본원에 기술된 임의의 범위는 종점들 및 종점들 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
섹션 제목은 유기적 구조의 목적만을 위한 것이고, 기술된 주제를 한정하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 논문을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 본 출원에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는, 임의의 목적을 위해 이들의 전문이 인용에 의해 명백히 포함된다. 인용에 의해 포함된 출판물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 발명과 모순되는 한에 있어서는 본 명세서가 임의의 모순되는 자료를 대체할 것이다.
면역글로불린 및 보체 프로테아제 C1의 억제제를 개시한다. C1-억제제, 예를 들면, C1-INH와 면역글로불린, 예를 들면, 혼주된 정맥내 면역글로불린 G(IVIG)의 병용물은 대뇌 허혈과 관련된 염증 손상 및 재관류 손상을 치료하거나, 예방하거나 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, C1-INH와 면역글로불린, 예를 들면, IVIG의 병용물의 사용은 둘 중 어느 하나의 성분 단독이 치료 효과 또는 다른 이로운 효과를 덜 제공하는 보다 늦은 시점에서 재관류 손상 및 염증 손상을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 병용물은 대뇌 허혈 후 약 6시간보다 늦게 투여될 수 있거나, 이로운 효과를 제공하면서 둘 중 어느 하나의 성분의 최대 용량 보다 적은 용량으로 투여될 수 있다. 상기 병용물을 단독으로 투여될 수 있거나, 뇌에서 혈병 형성을 제거하거나 억제하는 것으로 의도되는 화합물과 같은 추가의 치료 화합물도 또한 투여될 수 있다.
면역글로불린
본원에 사용된 용어 "면역글로불린" 및 "항체"란, 뇌에서 활성 보체 단편에 결합하고/하거나 뇌에서 활성 보체 단편을 소거하는 임의의 면역글로불린(항체로서도 또한 공지됨) 또는 이의 단편을 말한다. 이러한 문맥에서의 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은, 또한 보체 단편에 결합하는 일부를 여전히 보유하는 유도체 또는 이의 단편도 포함한다. 이러한 단편은 그 중에서도 Fab 단편, F(ab')2 또는 Fc 단편을 포함한다. 상기 항체는 공여자 혈장으로부터 유도될 수 있거나 대안의 방법(하기에 논의함)을 사용하여 제조될 수 있고, 단, 항체는 활성 보체 단편에 대한 유사한 결합 친화성을 혈장-유도된 항체와 공유한다.
용어 "보체 단편"이란, 보체 면역에 연관된 신호전달 캐스케이드와 관련된 임의의 순환성 소분자, 단백질 또는 효소를 말한다. 이러한 캐스케이드는 염증, 사이토카인 신호전달, 및 당업계에 공지되어 있는 다른 보체 캐스케이드를 포함한다.
용어 "혈장-유도된 면역글로불린"이란, 포유동물, 바람직하게는 사람, 혈장으로부터 유도된 임의의 폴리클로날 항체 분획을 의미하는 것으로 의도된다. 이와 관련하여, 용어 "항체"는 용어 "면역글로불린"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 다중(일반적으로 1000명 이상)의 건강한 공여자의 혈장을 모으고 임의로 추가로 프로세싱한다. 일부 실시형태에서, 상기 면역글로불린 분획은 혼주된 혈장으로부터 농축된다. 바람직하게, 상기 면역글로불린을 혼주된 혈장으로부터 정제된다. 보다 바람직하게, 상기 면역글로불린을 정제하고 농축한다. 각종 실시형태에서, 정제되고 농축된 면역글로불린 G(IgG)를 사용한다. 본 문맥에서의 상기 혈장-유도된 면역글로불린은 또한 보체 단편에 결합하는 일부를 여전히 보유하는 유도체 또는 이의 단편도 포함한다. 이러한 단편은 그 중에서도 Fab 단편, F(ab')2 또는 Fc 단편을 포함한다. 또한, 혈장-유도된 면역글로불린을 포함하는 조성물은 또한 혈장-유도된 면역글로불린에 대한 비-혈장-유도된 항체의 첨가도 포함할 수 있다.
용어 "정맥내 면역글로불린"이란, 면역글로불린을 포함하는 조성물의 정맥내 전달을 말한다. 정맥내 전달된 면역글로불린은 바람직하게는 면역글로불린 G (IgG), 보다 바람직하게는 혈장-유도된 IgG, 더욱 더 바람직하게는 사람-유도된 정맥내 면역글로불린 G(IVIG)이다. IVIG는 다수의 건강한 개체의 혈장으로부터 수득된 혼주된 다중특이적 면역글로불린 G의 치료학적 제제이다. 용어 "건강한 개체"란, 헌혈하기 위한 현행(헌혈시) 표준 자격 기준을 만족하는 개체를 의미하며, 이러한 자격 기준은 계속적으로 개선되고 변화됨을 유의한다.
특정 실시형태에서, IVIG는 IgA 또는 IgM과 같은 극미량의 상이한 Ig 부류의 면역글로불린(바람직하게는 2% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만의 IgA 또는 IgM)을 함유할 수 있다. 각종 실시형태에서, 상기 면역글로불린은 90% 초과의 IgG, 보다 바람직하게는 95% 초과의 IgG, 더욱 더 바람직하게는 98% 초과의 IgG일 것이다.
다른 실시형태에서, 정맥내 전달된 면역글로불린은 면역글로불린 A(IgA) 또는 면역글로불린 M(IgM), 보다 바람직하게는 혈장-유도된 IgA 또는 IgM, 더욱 더 바람직하게는 사람-유도된 정맥내 IgA (IVIA) 또는 IgM (IVIM)이다. IVIA 및 IVIM은 다수의 건강한 개체, 바람직하게는 1000명 이상의 개체의 혈장으로부터 수득된 혼주된 다중특이적인 면역글로불린 A 또는 면역글로불린 M의 치료학적 제제이다. 특정 실시형태에서, IVIA 또는 IVIM은 극미량의 상이한 Ig 부류의 면역글로불린(바람직하게는 2% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만의 다른 면역글로불린 부류)을 함유할 수 있다. 각종 실시형태에서, 상기 면역글로불린은 90% 초과의 IgA 또는 IgM, 보다 바람직하게는 95% 초과의 IgA 또는 IgM, 더욱 더 바람직하게는 98% 초과의 IgA 또는 IgM일 것이다. 다른 실시형태에서, 정맥내 전달된 면역글로불린은 혈장-유도된 IgG, IgM 및/또는 IgA의 배합물이다. 특정 실시형태에서, 상기 정맥내 면역글로불린의 배합물은 50% 이상의 IgG, 바람직하게는 70% 이상의 IgG, 보다 바람직하게는 90% 이상의 IgG이다.
IVIG는 바람직한 투여(정맥내 투여) 경로 뿐만 아니라 생성물을 의미한다. 바람직한 실시형태에서, IVIG는 정맥내 투여에 적합한 전체 용액 중에 5% (w/v) 이상의 면역글로불린을 함유하는 용액으로서 제공된다. 다른 실시형태에서, IVIG는 약 6% 이상의 면역글로불린, 보다 바람직하게는 약 8% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상 또는 25% 이상(또는 이들 사이의 모든 백분율)의 면역글로불린을 함유하는 용액으로서 제공된다. 상기 용액은 안정화제와 같은 추가의 성분, 예를 들면, 프롤린 또는 글리신과 같은 아미노산, 또는 슈크로스, 말토스, 소르비톨, 알부민, 니코틴아미드, 또는 PEG 등을 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, IVIG는 PRIVIGEN®(제조원: CSL Behring) 또는 SANDOGLOBULIN®/CARIMUNE®(제조원: CSL Behring)이다. PRIVIGEN®은 체액성 면역 결손과 관련된 원발성 면역결핍증을 앓고 있는 환자에 대한 대체 치료요법으로서 권고된다.
다른 실시형태에서, 상기 면역글로불린은 피하 면역글로불린 G (SCIG)이다. SCIG로서 약칭되는 용어 "피하 면역글로불린 G"란, IVIG와 유사하지만 피하 투여용으로 제형화된 혼주된 면역글로불린 G의 치료학적 제제를 의미한다. SCIG는 또한 바람직한 투여(피하 투여) 경로 뿐만 아니라 생성물을 의미한다. 특정 실시형태에서, SCIG는 약 10% (w/v) 이상의 면역글로불린, 보다 바람직하게는 15% 이상의 면역글로불린, 가장 바람직하게는 약 20% 이상의 면역글로불린을 함유하는 용액으로서 제공된다. 상기 용액은 안정화제와 같은 추가의 성분, 예를 들면, 프롤린 또는 글리신과 같은 아미노산, 또는 슈크로스, 말토스, 소르비톨, 알부민, 니코틴아미드, PEG, 또는 폴리소르베이트 80 등을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, SCIG는 VIVAGLOBIN® 또는 HIZENTRA®(둘 다 제조원: CSL Behring)이다.
대안의 실시형태에서, 본 개시는 활성 보체 단편에 대한 유사한 결합을 혈장-유도된 항체와 공유하는 비-혈장-유도된 항체(예를 들면, 활성 보체 단편의 소거제로서 작용하는 항체)의 사용을 고려한다. 상기 항체는 상기 논의된 혈장-유도된 면역글로불린과 독립적으로 또는 이에 대한 첨가제로서 사용될 수 있다. 이들 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 본원에 사용될 수 있는 항체로는 Ig 부류인 IgM, IgG 및 IgA(바람직하게는 IgG)의 항체가 포함된다. 용어 "항체"는, 결합을 여전히 보유하는 유도체 또는 이의 단편도 포함한다. 이러한 단편은 그 중에서도 Fab 단편, F(ab')2, Fv 단편, scFv 유도체, 또는 Fc 단편을 포함한다. 추가된 항체는 또한 재조합, 키메라, 사람화, 탄수화물-구조 최적화 및 완전 사람 항체 및 단편과 같은 실시형태를 포함한다. 또한, 재조합 항체는, 예를 들면, 이소형, 친화성 성숙 기술, 이펙터 기능 변경을 위한 변형, 글리코실화 변경을 위한 변형 등을 전환(switching)함으로써 추가로 변형될 수 있다.
C1 억제제
용어 "C1 억제제", "C1 에스테라제 억제제", 및 "C1-INH"란, 보체계와 관련된 순환 프로테아제, 바람직하게는 프로테아제 C1r 및 C1s 뿐만 아니라 MASP-1 및 MASP-2의 자발 활성화를 예방하기 위한 세린 프로테아제 억제제로서 기능하는 단백질 또는 이의 단편을 말한다. 또한, C1-INH는 내피 세포에 대한 셀렉틴-매개된 백혈구 부착을 감소시키는 항염증성 분자로서 작용할 수 있다. 본원에 사용된 C1-INH는 천연 세린 프로테아제 억제제 또는 이의 활성 단편일 수 있거나, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 펩타이드 모방체(mimetic), 또는 유사한 기능 특성 - 예를 들면, 프로테아제 C1r 및 C1s 및/또는 MASP-1 및 MASP-2의 억제 - 을 제공하는 펩타이드 단편을 포함할 수 있다. C1-억제제의 구조 및 기능과 관련한 추가의 개시에 대해서는 미국 특허 제4,915,945호, 미국 특허 제5,939,389호, 미국 특허 제6,248,365호; 미국 특허 제7,053,176호; 및 국제공개번호 제WO 2007/073186호를 참조하며, 이의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다.
C1-억제제를 포함하는 시판 제품은, 예를 들면, 혈장-유도된 CINRYZE®(제조원: Viropharma), 재조합 RUCONEST® 또는 RHUCIN®(둘 다 제조원: Pharming), 및 혈장-유도된 BERINERT®(제조원: CSL Behring)이다. BERINERT®는 유전성 혈관부종 및 선천성 결핍증의 치료에 권고된다.
면역글로불린 및 C1 -억제제의 생산
각종 실시형태에서, 면역글로불린 및 C1-억제제는, 당업자에게 공지되어 있는 방법에 따라 생산할 수 있다. 예를 들면, 혈장-유도된 면역글로불린 및 C1-INH는 몇몇의 공여자로부터 혈장을 수거함으로써 제조할 수 있다. 혈장의 공여자는 당업계에서 정의되는 바와 같이 건강해야만 한다. 바람직하게, 몇몇(1000명 이상)의 건강한 공여자의 혈장을 모으고 임의로 추가로 가공한다. 혈장-유도된 면역글로불린(이 경우, IVIG)의 제조 방법의 예는 미국 공개특허 제2010/0330071 A1호에서 발견될 수 있으며, 이의 개시는 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 시판 IVIG 제품의 예는 PRIVIGEN®(제조원: CSL Behring) 및 SANDOGLOBULIN®/CARIMUNE®이다.
활성 보체 단편에 결합하는 비-혈장-유도된 항체 및 단편의 생산을 위한 기술은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 및 Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998]에 기술되어 있다. 또한, 유전자전이 동물을 사용하여 완전한 사람 항체 또는 이의 단편을 발현할 수 있다. 모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속 세포주 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술에 대한 예는 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)]에 최초로 기술되었고 사람 항체를 생산하기 위해 당업자에 의해 추가로 개발된 하이브리도마 기술을 포함한다. 또한, 트리오마(trioma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor, Immunology Today 4: 72 (1983)] 및 사람 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)]도 포함된다. 비-혈장-유도된 항체를 세포에서 발현시킬 수 있으며, 예를 들면, 그 중에서도 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 통해 항체 핵산 작제물을 형질감염시키고/시키거나 형질도입시킬 수 있다. 또한, 소규모 또는 대규모로 생산하기 위한 다른 재조합 기술도 사용할 수 있다.
C1-INH의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 치료 목적을 위한 C1-억제제의 생산 방법은 미국 특허 제4,915,945호에 개시되어 있으며, 이의 개시는 이의 전문이 포함된다. 대안으로, 일부 실시형태에서, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 천연 조직 공급원으로부터 C1-INH를 수거하고 농축시킬 수 있다. C1-억제제를 포함하는 시판 제품은, 예를 들면, 플라즈마-유도된 Cinryze®(제조원: Viropharma), 재조합 Ruconest® 또는 Rhucin®(둘 다 제조원: Pharming), 및 혈장-유도된 BERINERT®(제조원: CSL Behring)이다. 재조합 C1-INH는 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
약제학적 조성물
특정 실시형태에서, C1-INH를 포함하는 약제학적 조성물 및 혈장-유도되고/되거나 비-혈장-유도된 면역글로불린을 포함하는 약제학적 조성물은, 대뇌 허혈의 치료에 사용하기 위해 제조한다. C1-INH를 포함하는 약제학적 조성물 및 면역글로불린을 포함하는 약제학적 조성물의 제형화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 분말 또는 동결건조 형태의 C1-INH 또는 면역글로불린(예를 들면, 동결건조에 의함)이 제공되고 수성 약제가 바람직한 경우, 상기 분말은, 약제학적 제형의 수성 성분과 혼합함으로써 용해시키고, 와류 교반 또는 온화한 교반과 같은 적합한 기술을 사용하여 교반시킬 수 있다. 대안으로, 수성 약제가 바람직하고 C1-INH 또는 면역글로불린이 이미 수성 형태로 존재하는 경우, 투여하기 전에 성분들을 직접 배합할 수 있다. 특정 실시형태에서, C1-INH를 동결건조 형태로 제공하고, 환자에게 투여하기 전에 수성 면역글로불린 조성물과 배합한다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린을 동결건조 형태로 제공하고, 투여하기 전에 수성 C1-INH 조성물과 배합한다. 또 다른 실시형태에서, C1-INH 둘 다를 동결건조 형태로 제공하고, 투여하기 전에 수성 약제학적 성분(예를 들면, 추가의 활성 성분 또는 불활성 성분, 예를 들면, 충전제, 안정화제, 용매, 또는 담체)과 배합한다. 또 다른 실시형태에서, C1-INH와 면역글로불린 둘 다를 수용액으로 제공하고, 환자에게 개별적으로 투여하거나 투여하기 전에 배합할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 충전제, 증량제, 완충제, 안정화제, 또는 부형제와 같은 1종 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 표준 약제학적 제형 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다[참조예: 2005 Physicians' Desk Referenceⓒ, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennado et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000]. 적합한 약제학적 첨가제로는, 예를 들면, 만니톨, 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화 나트륨, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 또한 PH 완충 시약과 습윤제 또는 유화제도 함유할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 상기 조성물은 보존제 또는 안정화제를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물의 제형화는 의도되는 투여 경로 및 다른 파라미터에 따라 달라질 수 있다[참조예: Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th ed., APhA Publications, 2003]. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동결건조된 덩어리 또는 분말일 수 있다. 동결건조된 조성물을 정맥내 주사로 투여하기 위해, 예를 들면, 주사용 멸균수(Sterile Water for Injection, USP)로 재구성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 멸균의 비-발열성 용액일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 상기 조성물은 분말 형태, 환제 또는 정제로 전달된다.
기술된 약제학적 조성물은 단독 활성 화합물로서 C1-INH 및/또는 면역글로불린을 포함할 수 있거나, 1종 이상의 다른 화합물, 조성물 또는 생물학적 재료와 배합하여 전달될 수 있다. 이러한 화합물의 예로는 비타민, 항생제, 또는 뇌에서 혈병 형성을 제거하거나 억제하기 위한 화합물(예를 들면, 아스피린, 클로피도그렐 또는 디피리다몰)이 포함된다.
또한, 대뇌 허혈의 치료를 위한 키트도 개시된다. 특정 실시형태에서, 상기 키트는, (a) IVIG와 같은 면역글로불린, (b) C1-INH, (c) 대뇌 허혈의 치료에 사용하기 위한 지침서, 및 임의로 (d) 1종 이상의 추가의 치료 활성 화합물 또는 약물을 포함한다.
상기 키트의 성분은 1개 이상의 바이알과 같은 1개의 또는 상이한 용기에 함유될 수 있다. 항체는 유통기한을 향상시키기 위해 액체 또는 고체 형태(예를 들면, 동결건조 후)로 존재할 수 있다. 액체 형태로 존재하는 경우, 면역글로불린은 안정화제 및/또는 보존제, 예를 들면, 프롤린, 글리신 또는 슈크로스와 같은 첨가제를 포함하거나, 유통기한을 향상시키는 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 마찬가지로, C1-INH는 액체 또는 고체 형태(예를 들면, 동결건조 후)로 존재할 수 있다. 액체 형태로 존재하는 경우, C1-INH는 안정화제 및/또는 보존제, 예를 들면, 프롤린, 글리신 또는 슈크로스와 같은 첨가제를 포함하거나, 유통기한을 향상시키는 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 키트는, 면역글로불린과 C1-INH의 투여 전에, 이의 투여와 동시에 또는 이의 투여 후에 투여되는 치료 활성 화합물 또는 약물과 같은 추가의 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 화합물의 예는 비타민, 항생제, 항바이러스제 등을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 키트에는 뇌에서 혈병 형성을 제거하거나 억제하는 것으로 의도되는 화합물(예를 들면, 아스피린, 클로피도그렐, 또는 디피리다몰)이 포함될 수 있다.
각종 실시형태에서, 키트의 사용 지침서는 대뇌 허혈의 치료에서 키트 성분을 사용하기 위한 지침을 포함할 것이다. 상기 지침서는, 면역글로불린 및 C1-억제제의 제조 방법(동결건조된 단백질의 경우, 희석 방법 또는 재구성 방법)에 관한 정보를 추가로 포함할 수 있다. 상기 지침서는 투여 용량 및 투여 빈도에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
치료 방법
특정 실시형태에서, 대뇌 허혈의 영향을 치료하거나, 예방하거나 또는 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "대뇌 허혈"이란, 하나 이상의 뇌 동맥의 폐색으로 인해 뇌의 적어도 일부에 혈류가 불충분한 임의의 병태를 말한다. 상기 정의는 국소 허혈과 전뇌 허혈 둘 다를 포함한다. 상기 용어는 불충분한 혈류의 모든 의학적 원인, 예를 들면, 대뇌 저산소증, 외상성 뇌 손상 및 뇌졸중(혈전증, 뇌혈관 색전증, 허혈성 뇌졸중, 주산기(perinatal) 뇌졸중 및 뇌 경색 포함)을 포함한다.
예를 들면, 대뇌 허혈의 치료는, 뇌에서 활성 보체 단편을 소거하는 C1-INH 및 면역글로불린을 환자에게 투여함을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 면역글로불린은 IVIG이다. 일부 실시형태에서, 대뇌 허혈 후 염증 손상 또는 재관류 손상의 영향을 예방하거나, 치료하거나 또는 감소시키기 위해 상기 배합물을 투여한다. 면역글로불린 및 C1-억제제를 함께 또는 개별적으로 투여할 수 있다. 상기 화합물을 임의의 적합한 전달 경로로 투여할 수 있으며, 비경구, 경막하, 근육내, 낭내 또는 복강내 주사를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린이 IVIG인 경우, 상기 화합물을 정맥내로 전달한다. 면역글로불린이 SCIG인 다른 실시형태에서, 상기 화합물은 피하로 전달된다.
면역글로불린 및 C1-INH를 함께 투여하거나 개별적으로 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, C1-INH 및 면역글로불린을 1회 정맥 투여로 함께 투여한다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린을 먼저 투여하고, 이어서, C1-INH를 투여한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린을 투여한 후 약 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 또는 120분 후에(또는 이들 사이의 임의의 시점에서) C1-INH를 투여한다. 다른 실시형태에서, C1-INH를 먼저 투여하고, 이어서, 면역글로불린을 투여한다. 특정 실시형태에서, C1-INH를 투여한 후 약 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 또는 120분 후에(또는 이들 사이의 임의의 시점에서) 면역글로불린을 투여한다.
C1-INH 및 면역글로불린, 예를 들면, IVIG을 이용한 치료는, 대뇌 허혈 후 즉시 또는 약 6시간 이하까지 수행할 수 있다. 특정 실시형태에서, 치료는 대뇌 허혈 후 약 10분, 20분, 30분, 40분, 또는 50분, 또는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 또는 6시간 후에(또는 이들 사이의 임의의 시점에서) 수행한다. 뇌졸중 후 심지어 6시간 후(예를 들면, 대뇌 허혈 후 약 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 15시간, 18시간, 또는 24시간 후에 또는 이들 사이의 임의의 시점에서)의 치료도 이점을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 성분 단독이 치료 효과 또는 다른 유익한 효과를 덜 제공하는 경우, C1-INH와 면역글로불린, 예를 들면, IVIG의 병용물을 사용하여 보다 늦은 시점에서 재관류 손상 및 염증 손상을 치료하거나 예방할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 병용물은 유익한 효과를 제공하면서 둘 중 어느 하나의 성분의 최대 용량보다 적은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대뇌 허혈 후 약 3시간 후에(예를 들면, 약 6시간 이하까지) 상기 병용 치료요법을 투여하는 것은, 면역글로불린 또는 C1-INH를 이러한 보다 늦은 시점에서 단독으로 투여할 때 관찰된 효과를 초과하는 유익한 효과를 수득할 수 있다.
환자에 대한 투여는 임의의 생리학적으로 허용되는 다양한 형태로 및/또는 약제학적 조성물의 일부로서의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 첨가제와 함께 단일 용량 또는 반복 투여로 수행할 수 있다.
C1-INH를 포함하는 조성물과 IVIG와 같은 면역글로불린을 포함하는 조성물을 치료학적 유효량으로 환자에게 투여할 수 있다. 일반적으로, 치료학적 유효량은 환자의 연령, 일반적 조건, 및 성별뿐만 아니라 환자의 의학적 병태의 중증도에 따라서도 달라질 수 있다. 용량은 의사에 의해 결정될 수 있으며, 필요에 따라 관찰되는 치료 효과에 맞추기 위해 조정될 수 있다. 특정 실시형태에서, C1-INH의 용량은 약 0.01U/Kg 체중 내지 2000U/Kg 체중의 범위일 수 있다. 각종 실시형태에서, C1-INH의 용량은 0.01, 0.05, 0.10, 0.50, 1.0, 5.0, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 1000, 1500, 또는 2000U/Kg 체중(또는 이들 사이의 임의의 수치)이다. C1-INH 투여에 대한 예시적인 치료학적 범위는 또한 미국 특허 제5,939,389호에 개시되어 있고, 이의 개시는 이의 전문으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린은 IVIG이고, 용량은 0.01, 0.05, 0.10, 0.20, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 또는 3.0g/kg 체중(또는 이들 사이의 임의의 수치)이다. IVIG 투여에 대한 예시적인 치료 범위는 또한 문헌[참조: Arumugam et al., PNAS 104(35): 14104-14109 (2007)]에 개시되어 있으며, 이의 개시는 이의 전문이 본원에 포함된다.
투여되는 약제학적 조성물은 활성 화합물 단독으로서 C1-INH 및/또는 면역글로불린을 포함할 수 있거나, 1종 이상의 다른 화합물, 조성물 또는 생물학적 재료와 병용하여 전달될 수 있다. 이러한 화합물의 예로는 비타민, 항생제, 또는 뇌에서 혈병 형성을 제거하거나 억제하는 것으로 의도되는 화합물(예를 들면, 아스피린, 클로피도그렐 또는 디피리다몰)이 포함된다.
특정 실시형태에서, C1-INH와 면역글로불린의 병용물을 사용한 대뇌 허혈의 치료는, C1-INH 또는 면역글로불린 중 어느 하나의 단독 치료요법의 치료 효과를 강화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 병용 치료요법은 대뇌 허혈 후 경색 용적 또는 신경학적 결손의 감소에 대하여 부가 효과를 초래한다. 추가의 실시형태에서, 상기 병용물은 상승 효과적으로 작용하여 C1-INH 또는 면역글로불린 중 어느 하나의 단독 치료요법으로 나타난 효과를 향상시킨다. 특정 실시형태에서, 병용 치료요법은 C1-INH 단독 치료요법으로 관찰된 뇌 경색 용적의 감소를 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%(또는 이들 사이의 임의의 비율(%))까지 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 병용 치료요법은 면역글로불린 단독 치료요법으로 관찰된 뇌 경색 용적의 감소를 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%(또는 이들 사이의 임의의 비율(%))까지 증가시키거나, 최적 농도의 면역글로불린이 대뇌 허혈 후 단독 투여될 때 관찰된 경색 용적의 감소와 대략 적어도 동등하게 경색 용적을 감소시킨다.
특정 실시형태에서, C1-INH와 IVIG의 병용 투여는, C1-INH가 대뇌 허혈 후 단독 투여될 때 관찰된 경색 용적의 약 1/2 또는 1/3까지 경색 용적을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, C1-INH와 IVIG의 병용물의 투여는, IVIG가 대뇌 허혈 후 단독 투여될 때 관찰된 경색 용적의 약 1/2까지 경색 용적을 감소시키거나, 최적 농도의 IVIG가 대뇌 허혈 후 단독 투여될 때 관찰된 감소와 대략 적어도 동등하게 경색 용적을 감소시킨다.
상기 병용 치료요법의 특정 실시형태에서, C1-INH와 IVIG는 개별적으로 투여될 때의 최적 농도와 비교하여 감소된 용량으로 투여된다. 이들 실시형태에서, 상기 병용 치료요법은 치료 효과 또는 다른 유익한 효과를 유지하면서 감소된 농도의 사용을 가능하게 함으로써 비용 및 치료제에 대한 유해 반응의 위험을 감소시킨다. 또한, 특정 실시형태에서, 감소된 용량의 병용 치료요법의 투여는 고용량의 C1-INH 또는 IVIG와 관련된 출혈의 위험을 감소시키거나 회피하는데 도움을 줄 수 있다. Bundesarztekammer, Dtsch Arztebl 97: B-864 (2000); Stieh et al., Biomed Prog . 9: 13-16 (1996); 및 Horstick et al., Circulation 104: 3125-3131 (2001). 특정 실시형태에서, 감소된 용량의 사용은 또한 환자 내성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 급성 허혈성 뇌졸중에 효과적인 치료 용법은 초기에 IVIG 치료, 이어서, 1종 이상의 조기-작용성 치료제(예를 들면, 나트륨 또는 칼슘 채널의 억제제)의 투여, 및 최종적으로 IVIG/C1-INH의 병용물의 투여로 이루어질 수 있다.
사람 뇌졸중 환자의 치료에 있어서, 환자를 확립된 관리 표준에 따라 치료해야 한다. 특히, 뇌 손상이 출혈성인 경우에는 IVIG 또는 C1-INH의 투여가 금지될 수 있기 때문에, 가능하면 MRI 또는 뇌 손상이 허혈성 또는 출혈성인지 여부를 측정하는 다른 방법으로 환자를 검사해야 한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 개시를 설명하기 위한 것이며, 이를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: C1 - INH 용량-반응
마우스의 중간 대뇌 동맥(MCAO)의 1시간 폐색 후 72시간의 재관류에 의해 뇌 허혈/재관류(I/R) 손상을 유도하였다. Arumugam et al., PNAS 104: 14104-14109 (2007); 및 Wang et al., Eur . J. Neurosci . 28(1): 51-61 (2008). 비-치료(I/R만) 마우스에서, 이러한 절차는 이환 반구체의 36%의 평균 뇌 경색을 초래하였다.
C1-INH 농도의 영향을 평가하기 위해, 300U/Kg (7.6U/동물), 150U/Kg (3.8U/동물) 및 75U/Kg (1.9U/동물)으로 C1-INH (BERINERT®, 제조원: CSL Behring)의 용량을 감소시키면서 마우스의 그룹(n = 12 내지 21)을 허혈 기간의 종료 후 1시간 후에 치료하였다. 뇌 경색 크기의 감소(50%)에 대한 최대 효과는 150U/Kg에서 피크값을 가지며, IC50 효과(25% 감소)는 75U/Kg 또는 1.9U/동물로 달성되었다. 도 1을 참조한다.
허혈 전에 및 허혈 후 1시간, 3시간 및 6시간에서의 재관류 동안, 1회 용량의 C1-억제제를 300U/Kg으로 30분 투여하였고, 이는 비히클-치료된 마우스와 비교하여 뇌 경색 크기를 각각 69%, 48%, 50% 및 67% 감소시켰다. 또한, C1-INH 치료는 비히클만을 투여한 마우스와 비교하여 감소된 신경학적 결손 스코어(MCAO 후 48시간 및 72시간 후에)로 도시된 바와 같이 기능 손상을 유의하게 감소시켰다. 150U/Kg 및 75U/Kg으로의 C1-INH 용량의 감소는, IVIG 용량-반응 실험에서 나타낸 바와 같이 실험 뇌졸중 종점의 상응하는 증가성 악화를 초래하지 않았다. 그 대신에, 3개 용량의 C1-INH 중에서 뇌 경색, 허혈-후 72시간에서의 신경학적 결손 및 사망률의 억제 정도에서 유의한 차이는 없었다.
실시예 2: IVIG 용량 반응
1g/체중 kg으로 시작하여 절반 용량 - 0.5g/Kg 및 0.25g/Kg (또는 25 내지 30g인 성체 마우스의 평균 체중을 고려하여 mg/g으로 측정함) - 을 계속해서 감소시킴으로써 IVIG(PRIVIGEN®, 제조원: CSL Behring)의 용량을 감소시키면서 동물의 그룹(n = 12 내지 22)을 허혈 후 1시간 후에 치료하였다. IVIG 용량의 감소와 뇌 경색 크기의 감소 사이의 선형 상관관계가 있었다. IC50 값은 약 0.5g/kg(mg/g)이었다. 도 2를 참조한다.
MCAO 전 30분에 및 MCAO 후 1시간 후에의 IVIG 치료(1g/kg)뿐만 아니라, 허혈 후 3시간 및 6시간 후에의 IVIG 치료(2g/kg)는 경색 크기를 각각 56%, 80%, 58% 및 59% 감소시켰다. 대조군 시약, 비히클 용액 중의 250mM L-프롤린(PRIVIGEN® 중 면역글로불린 분자에 대해 비히클 또는 안정화제로서 작용함) 또는 사람 알부민(IV 용도) 1g/kg은 비치료된 마우스와 비교할 때의 경색 크기에 대하여 유의한 영향을 갖지 않았다.
IVIG-clfy된 마우스에서 관찰된 허혈성 뇌 손상의 현저한 감소가 기능 손상을 감소시켰는지를 결정하기 위해, 뇌 경색 측정값을 수득하기 위해 결국 희생된 마우스에서 MCAO 후 24시간, 48시간 및 72시간에서 신경학적 결손을 매일 평가하였다. Murakami et al., J. Neurosci . 18: 205-213 (1998). IVIG 처리는 허혈 후 48시간 및 72시간에서 신경학적 결손을 감소시켰다. IVIG는 또한 허혈성 뇌 손상의 결과에 대하여 용량-의존적 영향을 발휘하였다. PRIVIGEN® (1.0g/kg, 0.5g/kg 및 0.25g/kg)의 절반-감소 용량에 의해, 뇌 경색 크기의 단계적 증가, 72시간에서의 신경학적 결손, 및 사망률이 관찰되었다.
실시예 3: BERINERT ® 의 치료학적 윈도우
실험 뇌졸중 마우스를 허혈 종료 후 3시간에서 BERINERT® 150U/Kg (3.8U/동물)로 치료하였다. 뇌 경색 크기를 측정하였고 경색 크기 감소를 측정하였다. 허혈 종료 후 3시간 후에의 치료로부터 수득된 경색 크기의 감소는 허혈 후 1시간에서 투여될 때의 동일 용량의 효과(뇌 경색의 약 50% 감소)와 통계적으로 상이하지 않았다. 이러한 결과는, 혈장-유도된 C1-INH(Baxter-Immuno, Pisa, Italy)가 뇌 허혈 후 단지 1시간의 치료학적 윈도우만을 가짐을 나타내는 초기에 공개된 결과[참조: De Simoni et al., The Powerful Neuroprotective Action of C1-Inhibitor on Brain Ischemia-Reperfusion Injury Does Not Require C1q, Am . J. Pathol . 164: 1857-63 (2004)]와 대조적이다.
실시예 4: C1 - INH 와 IVIG 처리의 병용
병용 처리로서 IVIG 및 C1-INH의 신경보호 가능성을 측정하기 위해, 1회 용량의 IVIG 0.50 mg/g을 허혈 후 1시간 후에 투여하고, 이어서, 30분 후에 C1-INH 75U/Kg의 1회 정맥 주사를 투여하였다(n = 19). 72시간의 재관류 기간 후 뇌 경색 용적을 측정하였다. 병용 처리는 75U/Kg 용량의 C1-INH의 효과를 거의 3배(26% 내지 76%) 강화하였고, 뇌 경색 용적의 감소에 대한 IVIG 0.5mg/g의 효과를 대략 2배(40% 내지 76%)로 만들었다. 병용 처리는 최적의 C1-INH 용량(300U/Kg)과 비교하는 경우에 더 신경보호성이었다. 병용 처리는 C1-INH 300U/Kg을 주입한 동물과 비교하여 사망률과 경색 크기 둘 다를 약 50% 감소시켰다. 병용 처리는 최적 용량의 IVIG (1g/kg) 만큼 효과적이었다 - 사망률 및 경색 크기는 2개 그룹의 동물들 사이에서 유의하게 다르지 않았다. 도 3을 참조한다. IVIG와 C1-INH 둘 다를 투여받은 마우스에서의 신경학적 결손은 I/R만의 그룹과 비교하여 모든 시점(허혈 후 24시간, 48시간 및 72시간)에서 현저하게 감소하였고, 차선의 용량의 IVIG (0.50 mg/g) 또는 C1-INH (75U/Kg) 단독으로 처리된 마우스에서보다 17% 내지 24% 낮았다.
병용 투여는 심지어 허혈 후 6시간에서 투여될 때에도 뇌 경색 크기를 감소시키는 점(비치료된 동물과 비교하여 67%)에서 IVIG 또는 C1-INH 단독과 같이 동등하게 효과적이었다. 도 4a를 참조한다. 허혈 후 6시간 후에 병용 치료를 행한 후, 신경학적 장애 스코어는 71% 향상되었다. 이러한 효과는 최적 개별 용량의 IVIG 또는 C1-INH로 처리된 마우스와 비교하여 보다 유의하게 확연하였다. 도 4b를 참조한다.
실시예 5: IVIG 및 C1 - INH 는 고령의 마우스 및 암컷 마우스를 손상으로부터 보호한다
사람 뇌졸중은 암수 양성에 동등하게 영향을 미치며, 발병률은 연령에 따라 증가한다. 이러한 이유로 인해, 암컷 마우스에서 IVIG, C1-INH 및 병용 처리의 유효성을 시험하였다. 또한, 본 발명자들은 허혈 후 6시간에서 13월령 내지 14월령의 수컷 마우스(이전에 시험한 마우스보다 고령임)도 시험하였다. IVIG 1g/kg 단독, C1-INH 300U/Kg 단독 및 연속 투여되는 둘 다의 최대 억제 농도(IC50)의 절반으로 주입될 때, 고령의 수컷 마우스와 암컷 마우스 둘 다는 비치료된 동물과 비교하여 허혈 후 72시간에서 경색 크기 및 신경학적 장애의 정도를 감소시켰다. 고령의 마우스에서, 병용 치료요법은 경색 크기 및 신경학적 결손 스코어를 감소시키는 점에서 약 50% 및 70% 더 효과적이었다.
실시예 6: IVIG 및 C1 - INH 는 C3b 의 동일 부위( in - situ ) 축적을 감소시킨다
I/R 손상된 마우스로부터의 뇌 샘플에서 제3 보체 성분의 활성 단편인 C3b의 수준에 대한 IVIG/C1-INH 병용 처리의 효과를 평가하였다. 정상 및 모의 수술된(sham-operated) 동물의 뇌에서 관찰된 C3b의 기저 수준은 I/R 마우스의 대측성 (무손상된) 반구체에서의 C3b 수준과 유사하였다. I/R 손상 후, (동측성 반구체의) 손상 부위에서의 C3b는 피질에서 5배 증가하였고, 선조체에서 15배 증가하였다. 재관류의 발병 후 1시간 후에 투여된 IVIG(1.0g/kg)와 C1-INH(300U/Kg) 둘 다는 이환 반구체의 피질과 선조체 둘 다에서 C3b 발현을 약 3배 감소시켰다. 이러한 데이터는, 보체계가 뇌 허혈에 반응하여 활성화되어 활성 단편의 동일 부위 침착을 유발함을 시사한다. 보체 소거와 억제 둘 다는 C3b 침착에 의해 촉발된 신경 손상을 감소시키는데 효과적인 것으로 보인다. 경색의 선조체 부분에서 C3b의 보다 확연한 침착은 그 구역에서 보다 광범위한 해부학적 손상의 이전 결과와 상관관계가 있으며, I/R 뇌 손상과 보체 활성화 사이의 인과 관계의 추가의 증거를 제공한다.
실시예 6: 보체 활성화는 허혈성 뇌졸중에서 TLR2 를 상향조절한다
보체계 및 톨-유사 수용체(Toll-like receptor: TLR)는 숙주의 선천성 면역 방어 체계의 최전선을 대표하며, 패턴 인식을 통해 침입 병원체 및 변경된 자기-항원과 반응한다. 따라서, 허혈성 뇌졸중 동안 보체 및 TLR 경로의 가능한 공동-활성화를 평가하였다. C3b 및 TLR2에 대한 항체를 사용하여 이중-표지 면역조직화학법을 수행함으로써 IVIG 및 C1-INH에 의한 경로 둘 다의 약화를 평가하였다. I/R 손상 후 24시간에서 뇌의 반음영 영역으로부터 채취된 조직 절편에서, 뇌 세포의 90% 이상은, 항체 신호의 화소 강도의 정량화에 의해 측정시, 모의 수술 동물로부터 채취된 동일한 절편에서보다 11배(C3) 및 28배(TLR2) 높은 내인성 C3 및 TLR2 발현의 수준을 나타냈다. 허혈 후 1시간 후에 IVIG (1g/kg) 및 C1-INH (300U/Kg)로 처리된 마우스에서, C3과 TLR2 신호 둘 다는 유의하게 억제되었다. C3 및 TLR2에 대한 이중-표지 면역형광 염색은, 이들 2개의 분자는 거의 모든 뇌 세포에서 동시-국소화(co-localize)함을 밝혔다. IVIG와 C1-INH 둘 다로 처리된 마우스로부터의 절편에서, 동시 국소화된 신호는 각각의 신호만큼 효과적으로 저해되었다.
실시예 7: IVIG 치료요법, C1 - INH 치료요법, 및 병용 치료요법의 비교
IVIG(PRIVIGEN®, 제조원: CSL Behring)와 C1-INH(BERINERT®, 제조원: CSL Behring) 둘 다는 허혈 전 30분에서 또는 허혈 후 1시간에서 제공될 때 용량 반응 방식으로 뇌 경색 크기, 신경학적 결손 스코어, 및 손상 부위에서의 C3b 단편의 침착을 유의하게 감소시켰다. 최적 용량의 IVIG는 최적 용량의 C1-INH 보다 더 신경보호를 발휘하였다(각각 뇌 경색 용적의 감소 85% 대 48% 및 신경학적 결손의 억제 35% 대 22%). IVIG 및 C1-INH에 대한 사람 혈청 알부민 및 비히클 치료(용액을 안정화함)는 비치료된 대조군에서 관찰된 뇌 손상의 규모를 향상시키지 않았다. 이러한 데이터는, 보체 약화가 뇌졸중에 대한 신규한 중재 치료요법으로서 간주될 수 있음을 시사한다.
C1-INH는 보체 활성화를 억제하지만 이미 생성된 보체 활성화 단편을 중화시키지 않고, 한편, IVIG는 신규한 보체 활성화를 억제하지 않지만 활성화된 보체 단편을 소거한다. 뇌졸중과 같은 보체-매개된 질환에서, 새로운 차례의 보체 활성화는 산발적으로 발생하고, 신규한 병원성 보체 생성물을 생성한다. 억제제와 소거제의 병용물은 기존 활성 단편을 제거하고 추가의 보체 활성화를 예방하기 위한 개선된 치료 전략을 제공한다. 차선 용량의 IVIG와 C1-INH 둘 다의 병용은 개별 농도의 효과를 초과하였을 뿐만 아니라 최적의 C1-INH 농도의 효과도 초과하였고, IVIG 1g/kg의 치료 가능성과 동등하였으며, 예외적으로 고령 마우스에서 병용 치료는 IVIG 단독과 비교하여 우수한 뇌 보호를 나타냈다.
병용 치료요법은, IVIG와 C1-INH 둘 다가 다른 사람 장애의 치료에서 이미 사용되고 있어 안전한 것으로 나타났기 때문에 사람의 뇌졸중 치료에 혜택을 제공할 수 있다.
실시예 8: 재료 및 방법
국소 대뇌 허혈/ 재관류 모델. 모든 실험 프로토콜 및 절차는 국립 노화 연구소의 동물 관리와 사용 위원회에 의해 승인되었고, 실험 동물의 관리와 사용에 대한 NIH 지침에 따라 수행되었다. 3개월령의 수컷 C57BL/6 마우스(25 내지 30g)를 이소플루레인으로 마취하였다(유도 5.0%, 유지 1.5 내지 2.0%). 이어서, 내강내 필라멘트 방법을 사용하여 상기 동물에 일과성 중대뇌 동맥 폐색(TMCAO)을 수행하였다. 간단히, 좌측 총경동맥, 외경동맥(ECA) 및 내경동맥(ICA)을 중간선 목 절개를 통해 노출시켰다. 이어서, 실리콘-피복된 모노필라멘트(피막 직경 0.23 +/- 0.02 mm)를 절개를 통해 ECA 내강에 도입하였고, 내광성이 느껴질 때까지 ECA 강에서 ICA 강으로 전진시켰다. 1시간 후 모노필라멘트를 제거하여 72시간 이하까지 재관류를 개시하였다. 모의 수술 마우스는 폐색을 생산하는 필라멘트의 삽입을 제외하고는 동일하게 처리되었다.
치료 용법. 이들 실시예에 사용된 IVIG 제제(PRIVIGEN®, 제조원: 스위스 베른 소재의 CSL Behring AG)는 98% 초과의 IgG 및 0.025mg/ml 미만의 IgA를 함유하는 10% 단백질 용액이었다. PRIVIGEN® 중 IgG 분자는 250mmol/L L-프롤린(비히클)으로 안정화되어 있다. 동결건조된 혈장-유도된 사람 C1s 에스테라제 억제제인 C1-INH(BERINERT®, 제조원: 독일 마르부르크 소재의 CSL Behring GmbH)를 멸균수 10 ml로 재구성하여 글리신 10mg/ml, NaCl 8.5mg/ml 및 시트르산 나트륨 3mg/ml를 함유하는 비히클 용액 중의 500U의 최종 C1-INH 용량을 달성하였다. 재구성된 C1-INH를 +4℃에서 유지하였고 14일 이내에 사용하였다. IVIG와 C1-INH 둘 다를 MCAO 전 30분(사전치료)에서 또는 MCAO 후 지정된 시점(처리 후 1시간 및 3시간)에서 대퇴 정맥에 느린 주입으로 투여하였다. 최적 용량의 IVIG 및 C1-INH이 전달된 용적과 동등한 용적으로 두 치료제(상기 실시예에서 개시한 바와 같음)에 대한 비히클 용액을 대조군 동물에 주입하였다.
신경학적 결손 평가. 지정된 뇌졸중-후 시점에서, 6점 신경학적 결손 스코어(0: 무결손; 1: 우측 앞발 내밀기 실패; 2: 우측 회전; 3: 우측 낙하; 4: 자발 보행 불가; 5: 사망)를 사용하여 국소 대뇌 I/R 손상의 기능 결과를 평가하였다. 2명 이상의 조사자에 의해 맹검 방식으로 각각의 마우스를 평가하였다.
대뇌 경색의 정량화. 마우스를 마취하고, 참수하고, 마우스의 뇌를 제거하였다. 설치류 뇌 매트릭스(제조원: 미국 코네티컷주 토링턴 소재의 Kent Scientific)를 사용하여 2mm의 관상 슬라이스를 제조하였고, 포스페이트 완충액 중의 2%의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 일수화물(제조원: 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 TTC, Sigma)로 37℃에서 20분 동안 염색하였다. NIH 이미지 분석 소프트웨어(제조원: 미국 메릴랜드주 베데스다 미국 국립 보건원 소재의 ImageJ)를 사용하여 절편을 스캐닝하고, 경색 크기를 평가하였다.
겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅 . 300mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 25mM HEPES, 20mM β-글리세로포스페이트, 0.2mM EDTA, 0.5mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.1% 트리톤-X를 함유하는 용출 완충액에 프로테아제 억제제와 함께, IVIG- 및 C1-INH-치료된 마우스 및 적절한 비히클 대조군 마우스로부터의 뇌 피질 및 선조체 샘플을 넣었다. 초음파 처리기(제조원: 미국 코네티컷주 뉴턴 소재의 VC 130 PB, Sonic & Materials Inc.)를 사용하여 4℃에서 30초 동안 초음파 처리함으로써 조직을 용출시켰고, 세포 추출물을 18,000×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 바이신코닌산(BCA) 검정 키트(제조원: 미국 캘리포니아주 허큘러스 소재의 Bio-Rad)로 단백질 함량을 측정하였다. 상청액 샘플을 10% SDS 겔 상에서 분리하였고, 분해된 단백질을 0.45μm의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(제조원: 미국 메릴랜드주 베드포드 소재의 Millipore Corporation)으로 전기영동에 의해 이동시켰다. 블롯을 일차 항-C3b 항체(제조원: 미국 메릴랜드주 캔턴 소재의 Cell Sciences) 및 항-β 액틴 모노클로날 항체(제조원: 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical Co.)와 함께 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 이차 IgG로 1시간 동안 항온배양한 후, 증강 화학발광 검정법(제조원: 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 Amersham Corporation)을 사용하여 반응 생성물을 가시화하였다. Scion 이미지 프로그램(제조원: 미국 유타주 오렘 소재)을 사용하여 각각의 단백질 밴드의 평균 화소 밀도로부터 단백질 발현의 상대적 변화를 추정하였다.
면역조직화학적 평가. 면역조직화학적 연구를 위해 지정된 마우스를 24시간의 재관류 후 깊게 마취하였고, 유출물이 맑아질 때까지 PBS로 경심 관류하였다. PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 고정화를 달성하였다. 뇌를 절개하였고, 4℃에서 밤새 동일한 고정액에 넣었다. 정면 뇌를 파라핀 절편화를 위해 프로세싱하였다. 일련의 관상 절편을 절단하였고(5μm 두께), 유리 슬라이드 상에 놓았다. 절편을 탈파라핀화하였고, 재수화하였고, 고-pH TRIS-EDTA 완충액을 사용하여 항원 회수를 수행하였다. 모든 절편에 걸쳐 유지되는 정의된 구역에서 모든 세포 계수를 수행하였다. 비특이적 항체 결합의 차단 후, 절편을 일차 토끼 폴리클로날 항-C3 항체(제조원: 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 Santa Cruz Biotechnology) 및 래트 모노클로날 항-TLR2(제조원: 미국 캘리포니아주 소재의 Biolegend)와 함께 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 적절한 Alexa Fluor 568(적색 형광) 및 Alexa Fluor 488(녹색 형광)과 함께 접합된 이차 항체(제조원: 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen)를 45분 동안 항온배양하고 Hoechst 33258 대조염색한 후, Olympus 형광 현미경으로 이미지를 획득하였다. 획득된 신호 강도의 범위에 걸치도록 조정된 입력 수준을 사용하여 이미지를 Photoshop 7.0(제조원: 미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 Adobe Systems)으로 프로세싱하였다. IP Labs Software(제조원: 미국 캘리포니아주 샌 디에이고 소재의 BD Biosciences)를 사용하여 화소 강도를 정량화하였다.
통계 분석. 스튜던츠 t 검정, Fisher의 정확 검정, ANOVA 및 쌍별 비교를 위한 Newman-Keuls 사후 검정을 사용하여 통계학적 비교를 실시하였다.
선행 실시예는 본 개시를 설명하는 것으로 의도되고, 이를 제한하지 않는다. 본원에 개시된 장치 및 방법의 다른 실시형태는 본 명세서 및 본원에 개시된 장치 및 방법의 실시를 고려하여 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (29)

  1. 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G와 C1-억제제(C1-INH)의 병용물(combination)을 포함하는, 대뇌 허혈(cerebral ischemia) 후 염증 손상 또는 재관류 손상의 영향을 예방하거나, 치료하거나 또는 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 C1-INH가 75 내지 300 U/체중 kg 범위의 농도로 투여되고 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G가 0.5 내지 1 g/ 체중 kg 범위의 농도로 투여되는, 약제학적 조성물.
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  5. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH는, 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G와 C1-INH의 병용물이 C1-INH를 대뇌 허혈 후 단독 투여할 때와 비교하여 경색 용적을 50% 이상 감소시키도록 하기에 충분한 농도로 투여되는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH는, 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G와 C1-INH의 병용물이 최적 농도의 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G를 대뇌 허혈 후 단독 투여할 때에 관찰된 경색 용적의 감소와 적어도 동등하게 경색 용적을 감소시키도록 하기에 충분한 농도로 투여되는, 약제학적 조성물.
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  9. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH는, 이들의 병용물이 치료 부재시의 경색 용적과 비교하여 경색 용적을 40% 이상 감소시키도록 하기에 충분한 농도로 투여되는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH가 동시에 투여되는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH가, 면역글로불린을 먼저 투여하거나 또는 C1-INH를 먼저 투여하거나 하여, 순차적으로 투여되는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 C1-INH가 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G를 투여한지 적어도 10분 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G가 C1-INH를 투여한지 적어도 10분 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G와 C1-INH의 병용물이 대뇌 허혈 후 6시간 이내에 투여되는, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH가 정맥내 투여되는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH가 수성 또는 동결건조된 형태로 제공되는, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 동결건조된 치료 성분들이, 이들을 약제학적으로 허용되는 담체에 용해시킴으로써, 투여하기 전에 재구성되는, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 주사용 멸균수인, 약제학적 조성물.
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  26. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH가 독립적인 투여를 위한 최적 농도보다 더 낮은 농도로 투여되는, 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH의 병용 투여가, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 또는 C1-INH를 최적 농도로 단독 투여할 때 관찰된 경색 용적 또는 신경학적 결손의 감소와 적어도 동등하게 경색 용적 또는 신경학적 결손을 감소시키는, 약제학적 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH가 뇌 출혈의 위험을 감소시키는 농도로 투여되는, 약제학적 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 사람 혈장-유도된 정맥내 면역글로불린 G 및 C1-INH가 대뇌 허혈 후 18시간 이내에 투여되는, 약제학적 조성물.
KR1020147010605A 2011-09-24 2012-09-21 면역글로불린과 ｃ1-억제제를 사용하는 병용 치료요법 KR101956585B1 (ko)

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