JP6190368B2 - 免疫グロブリンおよびc1−阻害剤を用いる組合せ療法 - Google Patents
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Description
ここで、本開示による特定の例となる実施態様を詳細に参照することにし、この特定の例は添付の図面に図示されている。本願において、特に明記しない限り、単数の使用は複数を含む。また、本願において、特に明記しない限り、「または」の使用は「および/または」を意味する。さらにまた、「含んでいる」という用語、ならびに「含む」および「含まれた」などの他の形態の使用は、非限定的である。本明細書に記述された任意の範囲は、端点および端点の間のすべての値を含むと理解される。
本明細書に用いるように、「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は、脳内の活性補体断片に結合し、かつ/または脳内の活性補体断片を除去するなんらかの免疫グロブリン(抗体としても知られる)またはその断片のことをいう。また、この文脈における「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、補体断片に対するいくらかの結合性(binding)をなお保持している誘導体またはその断片も含む。このような断片には、とりわけ、Fab断片、F(ab’)2またはFc断片がある。抗体が活性補体断片と類似の結合親和性を血漿由来の抗体と共有していれば、この抗体は、ドナー血漿から誘導してもよいし、または別の方法(下に議論する)を用いて調製してもよい。
「C1インヒビター」、「C1エステラーゼインヒビター」および「C1−INH」という用語は、補体系に関連する循環プロテアーゼ、好ましくはプロテアーゼC1rおよびC1s、ならびにMASP−1およびMASP−2の自発活性化を妨げるセリンプロテアーゼインヒビターとして機能するタンパク質またはその断片のことをいう。さらに、C1−INHは、セレクチンが介在する白血球の内皮細胞への接着を低減する抗炎症性分子の役割を果たすことができる。ここで用いるC1−INHは、天然のセリンプロテアーゼインヒビターもしくはその活性断片であることができ、または類似の機能性、たとえば、プロテアーゼC1rおよびC1s、ならびに/もしくはMASP−1およびMASP−2の阻害を提供する組換えペプチド、合成ペプチド、ペプチドミメティックもしくはペプチド断片を含むことができる。C1−インヒビターの構造および機能に関するさらなる開示については、米国特許第4,915,945号;米国特許第5,939,389号;米国特許第6,248,365号;米国特許第7,053,176;およびWO2007/073186を参照し、それらはその全体として本明細書に組み込まれる。
さまざまな実施態様において、免疫グロブリンおよびC1−インヒビターは、当業者に知られている方法にしたがって製造することができる。たとえば、血漿由来の免疫グロブリンおよびC1−INHは、数人のドナーから血漿を採取することによって調製することができる。血漿のドナーは、当分野で定義されたとおり健常でなければならない。好ましくは、何人か(1000人またはそれ以上)の健常なドナーの血漿をプールし、場合によりさらに処理する。血漿由来の免疫グロブリン(この場合、IVIG)を調製する例示的方法は、米国特許第2010/0330071A1号に見いだすことができ、この開示は全体として本明細書に組み込まれる。市販IVIG製品の例は、PRIVIGEN(R)(CSLベーリング)およびSANDOGLOBULIN(R)/CARIMUNE(R)である。
特定の実施態様では、C1−INHを含む医薬組成物および血漿由来および/または非血漿由来の免疫グロブリン含む医薬組成物を脳虚血の治療に使用するために製造する。C1−INHを含む医薬組成物および免疫グロブリンを含む医薬組成物を製造する方法は、当分野で知られている。たとえば、C1−INHまたは免疫グロブリンの粉末または凍結乾燥形態(たとえば、凍結乾燥によって)を提供し、かつ水性医薬が所望である場合、この粉末を、医薬製剤の水性成分と混合することによって溶解し、ボルテックスまたは穏やかな撹拌のような適した技術を用いて撹拌することができる。別法として、水性医薬が所望であり、かつC1−INHまたは免疫グロブリンがすでに水性形態である場合、これらの成分を投与前に直接組み合わせることができる。特定の実施態様では、C1−INHを凍結乾燥形態で提供し、患者に投与する前に水性免疫グロブリン組成物と組み合わせる。別の実施態様では、免疫グロブリンを凍結乾燥形態で提供し、投与前に水性C1−INH組成物と組み合わせる。さらに別の実施態様では、両C1−INHを凍結乾燥形態で提供し、投与前に水性薬学的成分(たとえば、さらなる活性成分または賦形剤、安定剤、溶媒もしくは担体のような不活性成分)と組み合わせる。さらに別の実施態様では、C1−INHおよび免疫グロブリンを水溶液で提供し、別々に投与してもよいし、または患者に投与する前に合わせてもよい。
特定の実施態様では、脳虚血の影響を治療、予防または低減する方法を提供する。本明細書に用いる「脳虚血」という用語は、1つまたはそれ以上の脳動脈の閉塞のため、脳の少なくとも一部に不十分な血流があるなんらかの状態のことをいう。この定義は、局所性および広範囲の虚血を包含する。この用語は、不十分な血流のすべての医学的原因、たとえば、脳低酸素、外傷性脳損傷および脳卒中(血栓症、脳血管性塞栓症、虚血性脳卒中、周産期脳卒中および脳梗塞を含む)を包含する。
以下の実施例は、本開示を説明するのに役立つが、それによって本開示が限定されるわけではない。
マウスの中大脳動脈(MCAO)を1時間閉塞させた後、72時間再灌流させることによって脳虚血/再灌流(I/R)損傷を誘発させた。Arumugam et al., PNAS 104: 14104-14109 (2007); Wang et al., Eur. J. Neurosci. 28(1): 51-61 (2008)。無処置(I/Rのみ)マウスでは、この手順により罹患した脳半球の脳梗塞平均値は36%になった。
動物の群(n=12〜22)を、虚血の1時間後にIVIG(PRIVIGEN(R)、CSLベーリング)の用量を減らして処置し、1g/kg体重で出発し、半分の用量0.5g/kgおよび0.25g/kg(または成体マウスの平均体重を25〜30gであるとみなしてmg/gで測定する)を着実に減らして継続した。IVIG用量の減らすことと脳梗塞サイズの低減との間には直線的相関性があった。IC50値は、約0.5g/kg(mg/g)であった。図2を参照のこと。
実験的な脳卒中にかけたマウスを、虚血終了の3時間後に150U/kg(動物当たり3.8U)でBERINERT(R)処置した。脳梗塞サイズを測定し、梗塞サイズの低減を決定した。虚血終了の3時間後の処置から生じた梗塞サイズにおける低減は、虚血1時間後に投与したときの同用量の効果と統計学的に異ならなかった(脳梗塞の約50%低減)。この所見は、血漿由来のC1−INH(Baxter-Immuno、ピサ、イタリア)が、脳虚血後1時間しか治療域がないことを示すDe Simoni et al., The Powerful Neuroprotective Action of C1-Inhibitor on Brain Ischemia-Reperfusion Injury Does Not Require C1q, Am. J. Pathol. 164: 1857-63 (2004)によって以前に公開された結果と対照的である。
併用処置としてのIVIGおよびC1−INHの神経保護の可能性を決定するため、虚血後1時間で単一用量の0.50mg/gIVIGをマウスに与え、続いて30分後、75U/kgのC1−INHのi.v.注射1回(n=19)を行った。脳梗塞体積は、72時間再灌流期間後に決定した。この併用処置により、75U/kg用量のC1−INHの効果がほぼ3倍増強され(26%から76%まで)脳梗塞体積の低減における0.5mg/gのIVIGの効果がざっと2倍になった(40%から76%まで)。この併用処置は、最適C1−INH用量(300U/kg)と比較したときに、より神経保護性であった。併用処置により、死亡率および梗塞サイズが、300U/kgのC1−INHを注入した動物と比較して約50%低減した。併用処置は、IVIG(1g/kg)の最適用量と同じくらい有効であり、死亡率および梗塞サイズは、2群の動物間で有意に差がなかった。図3を参照のこと。I/Rのみの群との比較においてIVIGおよびC1−INHの両方を投与したマウスでは、神経障害がすべての時点(虚血後24、48および72時間)で有意に低減され、IVIG(0.50mg/g)またはC1−INH(75U/kg)の最適以下の用量で単独で処置したマウスよりも17%〜24%低かった。
ヒト脳卒中は、両性別に等しく影響を及ぼし、その発生率は年齢とともに上昇する。そのため、本発明者らは、雌マウスにおけるIVIG、C1−INHおよび併用処置の有効性を試験した。また、本発明者らは、虚血後6時間の13〜14ヵ月の雄マウス(以前に試験したよりも老齢)における効果を試験した。老齢の雄マウスおよび雌マウスは、IVIG単独1g/kg、C1−INH単独300U/kgで注入したときだけでなく連続して投与した両者の最大半量阻害(IC50)濃度で注入したときも同様に、無処置動物と比較して虚血後72時間で有意に低減された梗塞サイズおよび神経障害度を示した。老齢マウスでは、組合せ療法は、梗塞サイズおよび神経障害スコアの低減という観点から、約50%および70%有効であった。
I/R損傷を受けたマウスからの脳試料において、第3補体成分の活性断片、C3bのレベルにおけるIVIG/C1−INH併用処置の効果を評価した。正常動物および偽手術された動物の脳で観察されたC3bの基礎レベルは、I/Rマウスの反対側の(非損傷)脳半球におけるC3bレベルと類似していた。I/R損傷後、損傷部位(同側脳半球中)のC3bは、皮質で5倍、線条体で15倍上昇した。再灌流の開始1時間後に投与したIVIG(1.0g/kgで)およびC1−INH(300U/kgで)は、罹患した脳半球の皮質および線条体の両方においてC3b発現を約3倍低下させた。このデータは、脳虚血に反応して補体系が活性化され、原位置での活性断片の沈着を導くことを示唆している。補体除去および阻害は、C3b沈着によって誘発される神経損傷の低減に有効であると考えられる。梗塞の線条体部分におけるC3bのより顕著な沈着は、その領域におけるより広範な解剖学的損傷の以前の所見と関連しており、I/R脳損傷と補体活性化との間の因果関係のさらなる証拠を提供している。
補体系およびToll様受容体(TLR)は、宿主の先天性免疫防御系の最前線となり、侵入してくる病原体および変化した自己抗原に対してパターン認識を介して反応する。したがって、虚血性脳卒中の補体およびTLR経路の同時活性化の可能性を評価した。IVIGおよびC1−INHによる両経路の減弱は、C3bおよびTLR2に対する抗体を用いて二重標識免疫組織化学を実施することによって評価した。I/R損傷の24時間後に脳のペナンブラ領域から採取した組織切片では、抗体シグナルのピクセル強度を定量化することによって決定したところ、90%を超える脳細胞が、偽手術した動物から採取した同じ切片中より11倍(C3)および28倍(TLR2)高い内因性C3およびTLR2発現レベルを示した。虚血後1時間にIVIG(1g/kg)およびC1−INH(300U/kg)で処置したマウスでは、C3およびTLR2シグナルが有意に抑制された。C3およびTLR2についての二重標識免疫蛍光染色は、ほとんどすべての脳細胞中に、これらの2つの分子が共存することを示した。IVIGおよびC1−INHの両方で処置したマウスの切片では、共存シグナルが個々のシグナルと同じくらい効果的に抑制された。
IVIG(PRIVIGEN(R)、CSLベーリング)およびC1−INH(BERINERT(R)、CSLベーリング)は、いずれも、虚血の30分前または1時間後に与えたときに、脳梗塞サイズ、神経障害スコア、および損傷部位でのC3b断片の沈着を用量反応的に有意に低減する。最適用量のIVIGは、最適用量のC1−INHよりも神経保護をもたらす(それぞれ、脳梗塞体積の低減85%対48%および神経障害の阻害35%対22%)。IVIGおよびC1−INHの代わりにヒト血清アルブミンおよびビヒクル(溶液を安定化する)を用いた処置は、無処置対照で観察される脳損傷の規模を改善しなかった。このデータは、補体減弱が脳卒中の新規な介入療法と考えられることを示唆している。
局所性の脳虚血/再灌流モデル。すべての実験的なプロトコールおよび手順は、アメリカ国立老化研究所の実験動物員会(Animal Care and Use Committee of the National Aging Institute)によって承認されており、NIHの実験動物の管理と使用に関する指針(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)を遵守して実施した。3ヵ月齢の雄C57BL/6マウス(25〜30g)をイソフルラン(誘導5.0%、維持1.5〜2.0%)で麻酔した。次いで、腔内フィラメント法(intraluminal filament method)を用いて動物を一過性中大脳動脈閉塞(TMCAO)にかけた。簡潔には、左総頸動脈、外頸動脈(ECA)および内頸動脈(ICA)を、頸部正中切開(midline neck incision)により露出させた。次いで、ケイ素コーティングされたモノフィラメント(コーティングを含めた直径0.23+/−0.02mm)を切開によりECA内腔に導入し、耐光性(light resistance)が感知されるまでECAからICA内腔まで進めた。1時間後、モノフィラメントを除去して最長72時間まで再灌流を開始した。偽手術したマウスに、閉塞を生じるフィラメントの挿入を除く同様の処置をした。
これらの実施例で用いるIVIG製剤(PRIVIGEN(R)、CSLベーリングAG、ベルン、スイス)は、>98%のIgGおよび>0.025mg/mlのIgAを含有する10%タンパク質溶液であった。PRIVIGEN(R)中のIgG分子は、250mmol/L L−プロリン(ビヒクル)で安定化されている。凍結乾燥された血漿由来のヒトC1sエステラーゼインヒビター、C1−INH(BERINERT(R)、CSLベーリング社、マールブルク、ドイツ)を、滅菌水10mlで再構成して10mg/mlのグリシン、8.5mg/mlのNaClおよび3mg/mlのクエン酸ナトリウムを含有するビヒクル溶液中で500Uの最終C1−INH用量を達成した。再構成したC1−INHを+4℃に保ち、14日以内に用いた。IVIGおよびC1−INHは、30分前(前処置)またはMCAO後指定された時点(処置後1時間および3時間)のいずれかでゆっくり注入することによって大腿静脈中に投与した。両療法のビヒクル溶液(上の実施例に記述したとおり)は、IVIGおよびC1−INHの最適用量が送達されるのと等しい体積で対照動物に注入した。
局所性の脳I/R損傷の機能性結果は、脳卒中後の指定された時点で、6点神経障害スコア(0、欠陥なし;1、右足の伸展不良;2、右に旋回3、右に転倒;4、自発歩行不能および5、死亡)を用いて評価した。各マウスを、少なくとも2人の研究者によって盲検化方式で評価した。
マウスに麻酔をかけ、断頭し、その脳を摘出した。齧歯動物脳マトリックス(Kent Scientific、トリントン、CT)を用いて2ミリメートルの冠状切片を調製し、リン酸緩衝液中の2%2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロリド一水和物(TTC、シグマ、セントルイス、MO)を用いて37℃で20分間染色した。切片をスキャンし、NIH画像分析ソフトウェア(ImageJ;アメリカ国立衛生研究所(National Institutes of Health)、ベセスダ、MD)を用いて梗塞サイズを評価した。
IVIG処置マウスおよびC1−INH処置マウス、ならびに適当なビヒクル対照マウスからの脳皮質および線条体試料を、300mM NaCl、1.5mM MgCl2、25mM HEPES、20mM β−グリセロリン酸、0.2mM EDTA、0.5mMジチオトレイトール(DTT)および0.1%トリトン−Xを含有する溶解緩衝液中にプロテアーゼインヒビターとともに入れた。超音波処理装置(VC130 PB、ソニックアンドマテリアルズ社(Sonic & Materials Inc.)、ニュータウン、CT)を用いて4℃で30秒の超音波処理によって組織を溶解し、細胞抽出物を18,000×gで5分間遠心分離した。次いで、BioRad(ハーキュリーズ(Hercules)、CA)からのビシンコニン酸(BCA)アッセイキットによってタンパク質含量を決定した。上清試料を10%SDSゲル上で分離し、分離したタンパク質を0.45μmポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(ミリポア社、ベッドフォード、MA)に電気泳動的に移動させた。ブロットを、一次抗C3b抗体(セルサイエンシズ(Cell Sciences)、カントン、MA)および抗βアクチンモノクローナル抗体(シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)、セントルイス、MO)と共に4℃で一夜インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次IgGを用いて1時間インキュベーションした後、増強化学発光アッセイ(アマシャム社、ピスカタウェイ、NJ)を用いて反応生成物を視覚化した。タンパク質発現における相対的変化は、Scion Imageプログラム(オレム、UT)を用いて各タンパク質バンドの平均画素密度から算定した。
免疫組織化学的研究用に指定されたマウスに、再灌流24時間後、深麻酔にかけ、流出物が透明になるまでPBSで経心的に灌流させた。固定は、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを用いて行った。脳を解剖し、同じ固定液中、4℃で一夜置いた。前頭部の脳を、パラフィン切片用に処理した。連続的な冠状切片を切断し(厚さ5μm)、ガラススライドガラス上に取り付けた。切片を脱パラフィンし、再水和させ、高pHのTRIS−EDTA緩衝液を用いて抗原賦活化にかけた。すべての細胞計数を、すべての切片にわたって維持された所定の領域において実施した。非特異的抗体結合を遮断した後、切片を、一次ウサギポリクローナル抗C3抗体(サンタクルスバイオテクノロジー(Santa Cruz Biotechnology)、サンタクルス、CA)およびラットモノクローナル抗TLR2、(バイオレジェンド(Biolegend)、CA)と共に4℃で一夜インキュベートした。適当なAlexa Fluor 568(赤色蛍光)およびAlexa Fluor 488(緑色蛍光)に結合した二次抗体(インビトロゲン(Invitrogen)、カールズバッド、CA)と共に45分間インキュベートし、ヘキスト33258で対比染色した後、オリンパス蛍光顕微鏡で画像を得た。画像は、入力レベルを、得られたシグナル強度の範囲にわたって調整してフォトショップ7.0(アドビシステムズ、サンノゼ、CA)で処理した。画素強度は、IPラボソフトウェア(IP Labs Software)(BDバイオサイエンシズ(BD Biosciences)、サンディエゴ、CA)を用いて定量化した。
統計的比較は、スチューデントt検定、フィッシャーの正確検定、ANOVA、および対比較のためのニューマンクールス事後試験(Newman-Keuls post hoc tests)を用いて行った。上記の実施例は、説明のためのものであって、本開示を限定するわけではない。開示されたデバイスおよび方法の他の実施態様は、本明細書の検討ならびに本明細書に開示されたデバイスおよび方法の実施から当業者に明らかとなる。
Claims (25)
- 脳虚血後の炎症損傷または再灌流障害の影響を予防、治療または低減するための、ヒト血漿由来の静脈内免疫グロブリンG(IVIG)を含む組成物およびC1−インヒビター(C1−INH)を含む組成物の組合せ物。
- 脳虚血後にC1−INHを単独で投与したときと比較して、IVIGとC1−INHとの組合せ物が梗塞体積において少なくとも約50%の低減を生じるような十分な濃度でIVIGおよびC1−INHを投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- IVIGとC1−INHとの組合せ物が、脳虚血後に最適濃度のIVIGを単独で投与したときに観察される低減と少なくともほぼ同等の梗塞堆積の低減を生じるような十分な濃度でIVIGおよびC1−INHを投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- C1−INHを約0.01U/kg体重から2000U/kg体重までの範囲の濃度で投与する、請求項2に記載の組合せ物。
- IVIGを約0.01g/kg体重から3.0g/kg体重の範囲の濃度で投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- 治療がない場合の梗塞体積と比較して、組合せ物が梗塞体積における少なくとも40%の低減を生じるような十分な濃度でIVIGおよびC1−INHを投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- IVIGおよびC1−INHを同時に投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- IVIGを最初に投与するか、またはC1−INHを最初に投与し、IVIGおよびC1−INHを順に投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- C1−INHをIVIGの少なくとも10分後に投与する、請求項8に記載の組合せ物。
- IVIGをC1−INHの少なくとも10分後に投与する、請求項8に記載の組合せ物。
- IVIGおよびC1−INHの組合せ物を脳虚血の約6時間後までに投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- IVIGおよびC1−INHを静脈内に投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- IVIGおよびC1−INHを、水性または凍結乾燥形態で提供する、請求項1に記載の組合せ物。
- 凍結乾燥された治療成分を、薬学的に許容される担体中に溶解することによって、投与前にそれらを再構成する、請求項13に記載の組合せ物。
- 薬学的に許容される担体が滅菌注射用水である、請求項14に記載の組合せ物。
- 脳虚血の治療のためのキットであって、
(a)IVIG;
(b)C1−INH;および
(c)場合により、少なくとも1つのさらなる治療活性化合物または薬物
を含む、キット。 - 少なくとも1つのさらなる治療活性化合物または薬物が、ビタミン、抗生物質、抗ウイルス薬剤、または脳内の血餅形成を除去または阻害することを目的とする化合物である、請求項16に記載のキット。
- 血餅形成を除去または阻害することを目的とする化合物がアスピリン、クロピドグレルまたはジピリダモールである、請求項17に記載のキット。
- IVIGおよびC1−INHを、水性または凍結乾燥形態で提供する、請求項16のキット。
- 凍結乾燥された成分を、薬学的に許容される担体中に溶解することによって投与前にそれらを再構成する、請求項19に記載のキット。
- 薬学的に許容される担体が滅菌注射用水である、請求項20に記載のキット。
- IVIGおよびC1−INHを、単独での投与の最適濃度より低い濃度で投与する、請求項1に記載の組合せ物。
- IVIGとC1−INHとの組合せ物の投与が、IVIGまたはC1−INHのいずれかを単独で最適濃度で投与したときに観察される低減と少なくともほぼ同等の梗塞体積の低減または神経障害の低減を生じる、請求項22に記載の組合せ物。
- IVIGおよびC1−INHを、脳出血のリスクを低減する濃度で投与する、請求項22に記載の組合せ物。
- IVIGおよびC1−INHを、脳虚血の約18時間後までに投与する、請求項1に記載の組合せ物。
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