CN104010656A - 使用免疫球蛋白和c1-抑制剂的联合疗法 - Google Patents

Abstract

公开了使用C1-INH和免疫球蛋白（如人血浆衍生的免疫球蛋白（IVIG））的组合来治疗脑缺血的方法。

Description

使用免疫球蛋白和C1-抑制剂的联合疗法

本申请依据35U.S.C.§119要求2011年9月24日提交的美国临时专利申请号61/538,832的优先权，将该申请全文按引用并入本文中。

本发明依据合作协议#29466-09部分使用由国家卫生研究院（National Institutes of Health）的国家老龄化研究所（The NationalInstitute on Aging）授予的政府支持来进行的。政府在本发明中具有某些权利。

本发明总地涉及C1-抑制剂（C1酯酶抑制剂或C1-INH）和免疫球蛋白（如，血浆衍生的免疫球蛋白G（IVIG））在脑缺血治疗中的用途。

急性缺血性中风（AIS）是重要的公众健康问题，引起高比例的死亡和存活者永久性的神经性缺乏。目前以酶促血栓溶解形式的介入治疗只是使小部分的病人受益。美国所有AIS病人中低于6%符合目前的护理治疗标准，如通过重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂rtPA的酶促血栓溶解，这主要是由于短的治疗窗口（例如，通常在中风后约1小时）引起的。Adeoye O，Hornung R，Khatri P，Kleindorfer D.Stroke42(7):1952-1955（2011）。如rtPA这样的治疗也可能增加诱发病人出血的风险。因此，对于改进的AIS治疗存在需求，并且特别是对在中风后的稍后时间给予时能有效的治疗存在需求。

补体系统是约30种循环血浆蛋白质和相关的细胞膜蛋白质的蛋白水解级联。血浆蛋白质一般在肝脏中合成，并且通常作为无活性的前体循环。通过补体蛋白酶的前体分裂启动负责各种先天免疫应答（包括炎症）的细胞因子信号传递级联。补体激活涉及多种免疫-炎症应答，包括与脑缺血相关的炎症。

在脑缺血再灌注过程中，循环的恢复可能导致脑组织的炎症和氧化性损伤。在再灌注时进入组织中的白细胞释放炎症因子（包括白细胞介素和自由基）的宿主。随着返回的血液重新引入的氧也可能损伤细胞和质膜。补体系统涉及脑中导致再灌注损伤的缺血级联的启动。因此，用于抑制或调节补体系统的技术可以提供治疗或预防再灌注损伤的机会。

血浆衍生的免疫球蛋白，如静脉内免疫球蛋白G（IVIG），是通过静脉给予的含有从多名血液供体提取的汇集免疫球蛋白的血液制品。IVIG用于治疗各种免疫缺陷和炎性疾病。已经表明IVIG清除脑中的活性补体片段并且保护脑免受与脑缺血和再灌注相关的损伤。Arumugam等，PNAS104(35):14104-14109（2007）。

C1-抑制剂（C1-INH）是防止与补体系统相关的循环蛋白酶的自发激活的丝氨酸蛋白酶抑制剂，特别是C1r和C1s，以及MASP-1和MASP-2。鉴于C1-INH在调节补体传统途径中和涉及补体介导的再灌注损伤中的炎症的重要作用，已经研究了C1-INH给予对中风后神经性缺乏和梗死大小的影响。De Simoni等，J.Cereb.Blood Flow Metab.23(2):232-239(2003)；还可以参见Longhi等，Crit.Care Med.37(2):659-665(2009)。之前的研究已经表明C1-INH在脑缺血的小鼠模型中具有有效的神经保护特性。所提出的与C1-INH神经保护相关的机理包括1）补体抑制，2）对损伤的炎症应答的减弱，3）凋亡的减弱，和4）白细胞-内皮细胞粘附的降低。已经表明通过血浆衍生的C1-INH对补体激活的抑制在小鼠以及大鼠中是有益的。De Simoni等，Am JPathol164:1857-1863(2004)；Akita等，No To Shinkei53:641-644(2001)。然而，这些研究中观察到的治疗窗口在缺血后短于一小时。上文。这与最近的发现相反，最近的发现是：重组C1-INH能够在较后的时间点减小脑梗死大小（例如，在MCAO后18小时准备放弃时）。Gesuete等，Ann Neurol66:332-342(2009)。直至现在的一般概念是血浆衍生的C1-INH，由于其短的治疗窗口，作为用于治疗人中风的重组C1-INH是没有前景的。

尽管动物实验已经表明C1-INH和IVIG单独在调节脑中的再灌注损伤影响中都是有效的，但对研发更有效的、较低剂量的和成本有效的用于治疗与脑缺血相关的再灌注损伤的方法，仍然存在需求。因此，本文公开了使用C1-INH和免疫球蛋白（如，IVIG）来治疗、减轻或预防与脑缺血相关的再灌注损伤和炎性损伤的联合疗法，通过预防性给予或在缺血后的时间点给予。在一些实施方案中，C1-INH和免疫球蛋白（如，IVIG）的联合使用可以用于治疗或预防较后时间点的再灌注损伤和炎性损伤，其中任一种成分单独提供较低的治疗作用。在一些实施方案中，联合给予直至脑缺血后约6小时或以低于任一种成分的最大剂量来给予，同时提供有益作用。在一些实施方案中，可以在晚于脑缺血后6小时时来联合给予。使用C1-INH和免疫球蛋白（如，IVIG）的组合由此导致增强的治疗结果，同时允许降低的治疗剂量，由此降低成本以及降低治疗化合物的不良反应的风险。

附图简述

图1.C1-INH剂量响应曲线。在缺血期（I）结束后1小时，用300U/Kg（7.6U/动物）、150U/Kg（3.8U/动物）和75U/Kg（1.9U/动物）的递减剂量C1-INH治疗小鼠组（n=12-21）。相对于垂直轴上的梗死体积的减小（%），将C1-INH浓度（U/Kg）作图于水平轴上。

图2.IVIG剂量响应曲线。在缺血后1小时，用递减剂量的IVIG治疗动物组（12-22），所述剂量从1g/kg体重开始，并且以递减半剂量继续-0.5g/Kg和0.25g/Kg（鉴于成年小鼠的平均体重为25-30g，或为mg/g）。相对于垂直轴上的梗死体积的减小（%），将IVIG剂量（g/Kg）作图于水平轴上。

图3.C1-INH/IVIG联合治疗。在缺血后1小时，将0.50mg/g体重的单一IVIG剂量给予小鼠，接着30分钟后给予单次静脉注射的75U/kg C1-INH（n=19）。72小时再灌注阶段后，测定脑梗死体积，并且相对于来自单独的C1-INH或单独的IVIG的百分比抑制，比较梗死体积的百分比抑制。

图4a-b.在开始缺血后六小时，用1g/kg的IVIG（n=11）、300U/kg的C1-INH（n=9）或联合（n=10）治疗小鼠，并且在缺血后72小时（*P<0.001）测定梗死面积（图4a）和神经性缺乏评分（图4b）。

说明性实施方案的描述

现在将详细地参照根据本发明的某些示例性实施方案，在附图中说明了其的某些实例。

在本申请中，单数的使用包括复数，除非特意另外指出。此外，在本申请中，“或”的使用表示“和/或”，除非另外指出。此外，术语“包括（including）”以及其他形式，如“包括（includes）”和“包括（included）”是非限制性的。将理解本文所述的任何范围包括端点以及端点之间的所有值。

该部分标题仅仅是为了组织目的，并不认为是限制所述的主题。本申请中引用的所有文献，或这些文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，在此特意全部并入本文作为参考，用于任何目的。就并入作为参考的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的本发明相矛盾来说，说明书将取代任何相矛盾的材料。

公开了免疫球蛋白和补体蛋白酶C1的抑制剂。C1-抑制剂（如，C1-INH）和免疫球蛋白（如，汇集的静脉内免疫球蛋白G（IVIG））的组合可以用于治疗、预防或减轻与脑缺血相关的炎性损伤或再灌注损伤。在一些实施方案中，C1-INH和免疫球蛋白（如，IVIG）的联合使用可以用于治疗或预防稍后时间点的再灌注损伤和炎性损伤，其中任一种单独的成分提供较低的治疗或其他有益作用。在一些实施方案中，联合给药可以直至脑缺血后约6小时或更长时间，或以低于任一种成分的最大剂量来联合给药，同时提供有益作用。该组合可以单独使用，或者也可以给予其他治疗化合物，如旨在除去或抑制脑中血块形成的化合物。

免疫球蛋白

如本文中所用的，术语“免疫球蛋白”和“抗体”指的是与脑中的活性补体片段结合和/或清除脑中的活性补体片段的任何免疫球蛋白（也称为抗体）或其片段。关于这一点术语“抗体”和“免疫球蛋白”还包括仍然保持与补体片段的一定结合的衍生物或其片段。这样的片段特别包括Fab片段、F(ab’)₂或Fc片段。抗体可以源自供体血浆或可以使用替换方法来制备（下文将讨论），只要它们与血浆衍生的抗体共享对活性补体片段的相似结合亲和性。

术语“补体片段”指的是与涉及补体免疫性的信号传递级联的任何循环小分子、蛋白质或酶。这些级联包括发炎、细胞因子信号传递和本领域已知的其他补体级联。

术语“血浆衍生的免疫球蛋白”用来表示源自哺乳动物（优选人类）血浆的任何多克隆抗体级分。在这点上，术语“抗体”可以与术语“免疫球蛋白”互换使用。在某些实施方案中，汇集多名（通常为1000或更多）健康供体的血浆并且任选地进一步处理。在一些实施方案中，从汇集的血浆富集免疫球蛋白级分。优选地，从汇集的血浆纯化免疫球蛋白。更优选地，将免疫球蛋白纯化并浓缩。在各种实施方案中，使用纯化并浓缩的免疫球蛋白G（IgG）。在该内容中的血浆衍生的免疫球蛋白还包括仍然保留对补体片段的结合的衍生物或其片段。这样的片段特别包括Fab片段、F(ab’)₂或Fc片段。此外，包含血浆衍生的免疫球蛋白的组合物除了血浆衍生的免疫球蛋白以外还包括非血浆衍生的抗体。

术语“静脉内免疫球蛋白”指的是静脉内递送的包含免疫球蛋白的组合物。优选地，静脉内递送的免疫球蛋白是免疫球蛋白G（IgG），更优选血浆衍生的IgG，甚至更优选人衍生的静脉内免疫球蛋白G（IVIG）。IVIG是获自大量健康个体血浆的汇集多特异性免疫球蛋白G的治疗性制备物。术语“健康个体”意指符合目前（献血时）针对献血的标准合格条件的个体，记住这样的合格条件接受持续的改进和改变。

在某些实施方案中，IVIG可以含有痕量不同Ig类别的免疫球蛋白，如IgA或IgM（优选低于2%的IgM或IgA，更优选低于1%）。在各种实施方案中，免疫球蛋白将是>90%的IgG，更优选>95%的IgG，甚至更优选>98%的IgG。

在其他实施方案中，静脉内递送的免疫球蛋白是免疫球蛋白A（IgA）或免疫球蛋白M（IgM），更优选血浆衍生的IgA或IgM，甚至更优选人衍生的静脉内IgA（IVIA）或IgM（IVIM）。IVIA和IVIM是获自大量健康个体（优选至少1000名个体）血浆的汇集多特异性免疫球蛋白A或免疫球蛋白M的治疗性制备物。在某些实施方案中，IVIA或IVIM可以含有痕量的不同Ig类别的免疫球蛋白（优选低于2%的其他免疫球蛋白类别，更优选低于1%）。在各种实施方案中，免疫球蛋白将是>90%的IgA或IgM，更优选>95%的IgA或IgM，甚至更优选>98%的IgA或IgM。在其他实施方案中，静脉内递送的免疫球蛋白是血浆衍生的IgG、IgM和/或IgA的组合物。在某些实施方案中，组合静脉内免疫球蛋白为至少50%IgG，优选至少70%IgG，并且更优选至少90%IgG。

IVIG表示一种产品以及优选的给药途径（静脉内给药）。在优选的实施方案中，作为适用于静脉内给药的总溶液中的含有至少5%（w/v）免疫球蛋白的溶液来提供IVIG。在其他实施方案中，作为含有至少约6%免疫球蛋白，更优选至少约8%、10%、15%、20%或25%免疫球蛋白（或其中的任意百分比）的溶液来提供IVIG。所述溶液可以含有其他成分，如稳定剂，例如氨基酸，如脯氨酸或甘氨酸，或蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、白蛋白、烟酰胺、PEG等。

在某些实施方案中，IVIG是（CSL Behring）或（CSL Behring）。表示为用于患有与体液免疫缺陷相关的原发性免疫缺陷的病人的替代治疗。

在其他实施方案中，免疫球蛋白是皮下免疫球蛋白G（SCIG）。术语“免疫球蛋白G”，缩写为SCIG，意指与IVIG相似的汇集的免疫球蛋白G的治疗性制备物，但配制成用于皮下给药。SCIG也表示一种产品以及优选的给药途径（皮下给药）。在某些实施方案中，作为含有至少10%（w/v）免疫球蛋白，更优选至少15%免疫球蛋白，最优选至少20%免疫球蛋白的溶液来提供SCIG。所述溶液可以含有其他成分，如稳定剂，例如氨基酸，如脯氨酸或甘氨酸，或蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、白蛋白、烟酰胺、PEG、聚山梨酸酯80等。在某些实施方案中，SCIG是或（两者都来自CSLBehring）。

在可替换的实施方案中，本发明考虑了使用与血浆衍生的抗体共享相似的结合活性补体片段的非血浆衍生的抗体（例如，作为活性补体片段清道夫的抗体）。所述抗体可以单独使用或作为以上讨论的血浆衍生的免疫球蛋白的附加成分使用。这些抗体可以是多克隆或单克隆的。本文中可以使用的抗体包括Ig类别IgM、IgG和IgA（优选IgG）的那些抗体。术语“抗体”还包括仍然保留结合的衍生物或其片段。这样的片段特别包括Fab片段、F(ab’)₂、Fv片段、scFv衍生物或Fc片段。添加的抗体还包括如重组、嵌合、人源化、碳水化合物结构优化的和完全人抗体和片段的实施方案。重组抗体还可以进一步进行修饰，例如，通过转换同种型、亲和性成熟技术、改变效应物功能的修饰、改变糖基化的修饰等。

C1抑制剂

术语“C1抑制剂”、“C1酯酶抑制剂”和“C1-INH”指的是作为丝氨酸蛋白酶抑制剂来防止与补体系统相关的循环蛋白酶（优选蛋白酶C1r和C1s，以及MASP-1和MASP-2）的自发激活的蛋白质或其片段。此外，C1-INH可以作为降低选择素介导的白细胞与内皮细胞的粘附的抗炎分子。本文中使用的C1-INH可以是天然丝氨酸蛋白酶抑制剂或其活性片段，或可以包括提供相似功能特性（例如，蛋白酶C1r和C1s，和/或MASP-1和MASP-2的抑制）的重组肽、合成肽、肽模拟物或肽片段。关于C1-抑制剂的结构和功能的更多公开内容，参见，美国专利4,915,945；美国专利5,939,389；美国专利6,248,365；美国专利7,053,176；和WO2007/073186，将这些专利的全文并入本文中作为参考。

商业购得的包含C1-抑制剂的产品是例如血浆衍生的（Viropharma）、重组或（两者都来自Pharming）和血浆衍生的（CSL Behring）。表示用于治疗遗传性血管水肿和先天性缺陷。

免疫球蛋白和C1-抑制剂的生产

在各种实施方案中，可以根据本领域技术人员已知的方法来生产免疫球蛋白和C1-抑制剂。例如，可以通过从数名供体收集血浆来制备血浆衍生的免疫球蛋白以及C1-INH。血浆的供体应该是健康的，如本领域限定的。优选地，汇集数名（1000名或更多）健康供体的血浆并任选地进一步处理。用于制备血浆衍生的免疫球蛋白（在这种情况中，IVIG）的示例性方法可以在US申请2010/0330071A1中找到，将其公开内容全部并入本文中作为参考。商业IVIG产品的实例是（CSL Behring）和。

用于生产结合活性补体片段的非血浆衍生的抗体和片段的技术是本领域公知的，并且描述于，例如，Harlow和Lane"Antibodies,ALaboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988以及Harlow和Lane“Using Antibodies:A Laboratory Manual”ColdSpring Harbor Laboratory Press,1998。此外，转基因动物可以用于表达完全人抗体或其片段。对于单克隆抗体的制备，可以使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。这样的技术的实例包括最初由和Milstein,Nature256:495-497(1975)描述的杂交瘤技术，该技术由本领域进一步发展来产生人抗体。还包括三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术（Kozbor,Immunology Today4:72(1983)），和EBV-杂交瘤技术来产生人单克隆抗体（Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96）。非血浆衍生的抗体可以在细胞中表达，例如，可以经由特别是病毒或质粒载体转染和/或转导抗体核酸构建体。也可以使用用于小规模或大规模生产的其他重组技术。

用于制备C1-INH的方法是本领域已知的。例如，为了治疗目的生产C1-抑制剂的方法公开于美国专利4,915,945中，将其公开内容全部并入本文中作为参考。或者，在一些实施方案中，可以使用本领域已知的技术，从天然组织来源收集和浓缩C1-INH。商业购得的包含C1-抑制剂的产品是，例如，血浆衍生的（Viropharma）、重组或（两者都来自Pharming）和血浆衍生的（CSL Behring）。可以通过已知方法来制备重组C1-INH。

药物组合物

在某些实施方案中，制备了包含C1-INH的药物组合物和包含血浆衍生的和/或非血浆衍生的免疫球蛋白的药物组合物，用于脑缺血的治疗中。配制包含C1-INH的药物组合物和包含免疫球蛋白的药物组合物的方法是本领域已知的，例如，如果提供粉末或冻干的形式的C1-INH或免疫球蛋白（例如，通过冷冻干燥）并且期望是含水药物，则通过混合药物制剂的含水成分来溶解粉末，并且使用合适的技术（如，涡旋或温和搅拌）来搅拌。或者，如果期望是含水药物并且C1-INH或免疫球蛋白已经是含水形式，则可以在给药前将成分直接混合。在某些实施方案中，以冻干的形式提供C1-INH，并且在给予于病人之前与含水免疫球蛋白组合物混合。在其他实施方案中，以冻干的形式提供免疫球蛋白，并且在给药之前与含水C1-INH组合物混合。在再其他实施方案中，以冻干的形式提供C1-INH，并且在给药之前与含水药物成分（例如，其他活性成分或无活性成分，如填充剂、稳定剂、溶剂或载体）混合。在再其他实施方案中，C1-INH和免疫球蛋白都以含水溶液来提供，并且可以分开给药或在给药于病人之前混合。

在某些实施方案中，药物组合物可以包含至少一种添加剂，如填充剂、膨胀剂、缓冲剂、稳定剂或赋形剂。标准药物配制技术是本领域技术人员公知的（参见，例如，2005Physicians’Desk,Thomson Healthcare:Montvale,NJ,2004;Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第20版，Gennado等编辑，Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000）。合适的药物添加剂包括，例如，甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇等。在某些实施方案中，药物组合物还可以含有pH缓冲剂和润湿或润滑剂。在进一步的实施方案中，组合物可以含有防腐剂或稳定剂。

药物组合物的配制可以根据计划的给药途径和其他参数而改变（参见，例如，Rowe等，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，APhA Publications,2003.）。在一些实施方案中，药物组合物可以冻干冰火粉末。冻干组合物可以重构，例如使用灭菌注射用水，USP，以用于通过静脉内注射的给药。在其他实施方案中，组合物可以是无菌的、非致热溶液。在进一步的实施方案中，组合物以丸剂或片剂中的粉末形式来递送。

所述的药物组合物可以包含C1-INH和/或免疫球蛋白作为唯一的活性化合物或可以结合至少一种其他化合物、组合物或生物材料来一起递送。这样的化合物实例包括维生素、抗生素或旨在去除或抑制脑中血块形成的化合物（例如，阿司匹林、氯吡格雷（clopidogrel）或潘生丁（dipyridamole））。

还公开了用于治疗脑缺血的药盒。在某些实施方案中，药盒包括（a）免疫球蛋白，如IVIG；（b）C1-INH，（c）用于治疗脑缺血的说明书和任选地（d）至少一种更多的治疗活性化合物和药物。

药盒的成分可以包含在一个或不同的容器中，如一个或多个小瓶。抗体可以是液体或固体形式（例如，冻干后），以延长货架期。如果是液体形式，免疫球蛋白可以包含添加剂，如稳定剂和/或防腐剂，如脯氨酸、甘氨酸或蔗糖或延长货架期的其他添加剂。同样，C1-INH可以是液体或固体形式（例如，冻干后）。如果是液体形式，C1-INH可以包含添加剂，如稳定剂和/或防腐剂，如脯氨酸、甘氨酸或蔗糖，或延长货架期的其他添加剂。

在某些实施方案中，药盒可以含有其他化合物，如在免疫球蛋白和C1-INH给药之前、同时或之后给药的治疗活性化合物或药物。这样的化合物实例包括维生素、抗生素、抗病毒剂等。在其他实施方案中，药盒中可以包括旨在去除或抑制脑中血块形成的化合物（例如，阿司匹林、氯吡格雷（clopidogrel）或潘生丁（dipyridamole））。

在各种实施方案中，药盒的使用说明书将包括在脑缺血治疗中使用药盒成分的指导。说明书可以进一步含有关于怎样制备（例如，稀释或重构，在冷冻干燥蛋白质的情况中）免疫球蛋白和C1-抑制剂的信息。说明书可以进一步包括关于给予剂量和次数的指导。

治疗方法

在某些实施方案中，提供了治疗、预防或减轻脑缺血影响的方法。本文中使用的术语“脑缺血”是指其中由于一个或多个脑动脉阻塞导致脑的至少一部分血流不足的任何病症。所述定义包括局灶性脑缺血和全脑缺血。术语包括所有不足血流的医学诱因，例如，大脑缺氧、外伤性脑损伤和中风（包括血栓、脑血管栓塞、缺血性中风、围产期中风和脑梗死）。

例如，脑缺血的治疗可以包括将清除脑中的活性补体片段的C1-INH和免疫球蛋白给予于病人。优选地，免疫球蛋白是IVIG。在一些实施方案中，给予组合物来预防、治疗或减轻脑缺血后炎性损伤或再灌注损伤的影响。免疫球蛋白和C1-抑制剂可以一起给予或分开给予。可以通过任何合适的传统途径来给予化合物，并且可以包括但不限于非肠道、硬膜下、肌内、鞘内或腹膜内注射。在其中免疫球蛋白是IVIG的某些实施方案中，通过静脉内递送化合物。在其中免疫球蛋白化合物是SCIG的其他实施方案中，通过皮下递送化合物。

免疫球蛋白和C1-INH可以一起给予或分开给予。在某些实施方案中，C1-INH和免疫球蛋白在单次静脉内给予中一起给予。在其他实施方案中，首先给予免疫球蛋白，接着给予C1-INH。在某些实施方案中，在给予免疫球蛋白后大约5、10、20、30、40、50、60、90或120分钟（或其中的任何时间）给予C1-INH。在其他实施方案中，首先给予C1-INH，接着给予免疫球蛋白。在某些实施方案中，在给予C1-INH后大约5、10、20、30、40、50、60、90或120分钟（或其中的任何时间）给予免疫球蛋白。

使用C1-INH和免疫球蛋白（如IVIG）的治疗可以在脑缺血后立即进行或直至脑缺血后约六小时进行。在某些实施方案中，在脑缺血后约10、20、30、40或50分钟，或1、2、3、4、5或6小时（或其中的任何时间）进行治疗。甚至在中风后6小时后进行治疗也可以具有益处（例如，脑缺血后约7、8、9、10、15、18或24小时，或其中的任何时间）。在一些实施方案中，C1-INH和免疫球蛋白（如，IVIG）的联合使用可以用于治疗或预防较后时间点的再灌注损伤和炎性损伤，其中任一种单独的成分提供较少的治疗或其他有益作用。在一些实施方案中，可以以低于任一种成分的最大剂量来给予组合物，同时提供有益作用。在一些实施方案中，在脑缺血后约3小时后（例如，直至约6小时）给予联合治疗可以产生超过在这些较后时间点给予单独的免疫球蛋白或C1-INH时观察到的那些的有益作用。

可以以单次剂量或重复给药，并且以多种生理学上可接受形式中的任意一种，和/或使用可接受的药物学载体和/或添加剂作为药物组合物的一部分来进行病人的给药。

可以将包含C1-INH的组合物和包含免疫球蛋白（IVIG）的组合物以治疗有效量给予于病人。通常，治疗有效量可以根据患者年龄、一般状况和性别，以及患者医学病症的严重程度而改变。剂量可以由医师来决定，并且按照需要调整，以适合观察到的治疗作用。在某些实施方案中，C1-INH的剂量大约为0.01U/kg至2000U/kg体重。在各种实施方案中，C1-INH的剂量为0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、1000、1500或2000U/kg体重（或其中的任何值）。用于C1-INH给药的示例性治疗范围还公开于美国专利5,939,389中，将其公开内容全部并入。在一些实施方案中，免疫球蛋白是IVIG，并且剂量为0.01、0.05、0.10、0.20、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75或3.0g/kg体重（或其中的任何值）。用于IVIG给药的示例性治疗范围还公开于Arumugam等，PNAS104(35):14104-14109（2007），将其公开内容全部并入本文中。

给药的药物组合物可以包括C1-INH和/或免疫球蛋白作为唯一的活性化合物或可以与至少一种其他化合物、组合物或生物材料结合来递送。这样的化合物实例包括维生素、抗生素，或旨在去除或抑制脑中血块形成的化合物（例如，阿司匹林、氯吡格雷（clopidogrel）或潘生丁（dipyridamole））。

在某些实施方案中，使用C1-INH和免疫球蛋白组合治疗脑缺血可以增强分开的C1-INH或免疫球蛋白治疗的治疗作用。在一些实施方案中，联合疗法导致对脑缺血后梗死体积或神经性缺乏减小的叠加作用。在进一步的实施方案中，组合物协同作用来增强分开使用C1-INH或免疫球蛋白治疗看到的效果。在某些实施方案中，联合疗法将用单独的C1-INH治疗观察到的脑梗死体积的减小提高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%（或其中的任何百分比）。在一些实施方案中，联合疗法将用单独的免疫球蛋白治疗观察到的脑梗死体积的减小提高5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%（或其中的任何百分比），或产生至少约等于脑缺血后独立给予最佳浓度的免疫球蛋白时观察到的减小的梗死体积减小。

在某些实施方案中，C1-INH和IVIG的联合给予将梗死体积减小至脑缺血后独立给予C1-INH时观察到的约一半或三分之一。在一些实施方案中，C1-INH和IVIG的联合给予将梗死体积减小至脑缺血后独立给予IVIG时观察到的约一半，或将梗死体积减小至至少约等于脑缺血后独立给予最佳浓度的IVIG时观察到的体积。

在联合疗法的某些实施方案中，与单独给药时的最佳浓度相比，C1-INH和IVIG以降低的剂量给药。在这些实施方案中，联合疗法能够使用降低的浓度，同时维持治疗效果或其他有益效果，由此降低成本和治疗剂不良反应的风险。此外，在某些实施方案中，降低剂量的联合疗法的给予可以帮助降低或避免与高剂量C1-INH或IVIG相关的出血风险。Bundesarztekammer,Dtsch Arztebl97:B-864(2000),Stieh等，Biomed Prog.9:13–16(1996)，Horstick等，Circulation104:3125-3131(2001)。在某些实施方案中，降低剂量的使用还可以导致提高的病人耐受性。在一些实施方案中，用于急性缺血性中风的有效治疗方案可以由最初的IVIG治疗，接着给予一种或多种早作用治疗剂（例如，钠或钙通道的抑制剂），并且最后给予IVIG/C1-INH组合组成。

在治疗人中风受害者中，应当根据确定的护理标准来治疗病人。特别地，在可能的情况中，病人应当接受MRI或其他方法的检查，以确定脑损伤是缺血性的还是出血性的，因为在脑损伤是出血性的情况下，IVIG或C1-INH的给药可能是禁忌的。

实施例

以下实施例用于说明并非限制本发明。

实施例1：C1-INH剂量响应

通过小鼠1小时的中脑动脉梗死（MCAO）接着72-小时再灌注来诱发脑缺血/再灌注损伤（I/R）。Arumugam等，PNAS104:14104-14109(2007)；Wang等，Eur.J.Neurosci.28(1):51-61(2008)。在未治疗的（仅有I/R）小鼠中，该程序导致病变的半球36%的平均脑梗死。

为了评价C1-INH浓度的影响，在缺血期结束后1小时，用300U/Kg（7.6U/动物）、150U/Kg（3.8U/动物）和75U/Kg（1.9U/动物）递减剂量的C1-INH（CSL Behring）治疗动物组（n=12-21）。在150U/Kg下，对脑梗死大小（50%）减小的最大作用达到峰值，使用75U/Kg或1.9U/动物获得了IC₅₀作用（25%降低）。参见图1。

在缺血前30分钟以及在缺血后1小时、3小时和6小时的再灌注过程中，给予300U/Kg的单剂量C1-抑制剂，相对于载体处理的小鼠，将脑梗死大小分别降低69%、48%、50%和67%。C1-INH治疗还显著降低了功能损伤，如通过与只接受载体的小鼠相比，减小的神经性缺乏评分所示（MCAO后48小时和72小时）。C1-INH的剂量降至150U/Kg和75U/Kg没有导致实验中风终点相应的增量恶化，如在IVIG剂量响应实验中看到的。实际上，在三个剂量的C1-INH中，在缺血后72小时时的脑梗死、神经性缺乏的抑制程度以及死亡率没有显著差异。

实施例2：IVIG剂量响应

在缺血后1小时，用递减剂量的IVIG（，CSLBehring）处理动物组（n=12-22），从1g/kg体重开始，并且继续稳定降低一半剂量—0.5g/Kg和0.25g/Kg（或如鉴于成年小鼠的平均体重为25-30g，以mg/g测量的）。在递减的IVIG剂量和脑梗死大小减小之间存在线性关联。IC₅₀值大约为0.5g/Kg（mg/g）。参见图2。

在MCAO前30分钟（1g/kg）和MCAO后1小时，以及缺血后3小时和6小时（2g/kg）的IVIG治疗分别将梗死大小减小了56%、80%、58%和59%。与未治疗小鼠相比时，用对照试剂250mM L-脯氨酸（其作为中的免疫球蛋白分子的载体或稳定剂）或载体溶液中1g/kg的人白蛋白（用于IV使用）的治疗对梗死大小没有明显作用。

为了确定在IVIG-治疗的小鼠中观察到的缺血性脑损伤的显著减轻是否导致降低的功能损伤，在最终处死以获得脑梗死测量的小鼠中，在MCAO后24、48和72小时，每日评价神经性缺乏。Murakami等，J.Neurosci.18:205-213(1998)。在缺血后48和72小时，IVIG治疗显著减小了神经性缺乏。IVIG还对缺血性脑损伤的结果发挥了剂量依赖性作用。随着的剂量半递减（1.0g/kg、0.5g/kg和0.25g/kg），观察到72小时的脑梗死大小、神经性缺乏和死亡率逐步增加。

实施例3：的治疗窗口

在缺血完成后3小时，用150U/Kg（3.8U/动物）的治疗接受实验中风的小鼠。测量脑梗死大小，并且测定梗死大小减小。由缺血完成后3小时的治疗导致的梗死大小减小没有明显不同于缺血后一小时给予时的相同剂量的作用（大约50%的脑梗死大小减小）。这种发现与之前De Simoni等The Powerful Neuroprotective Action ofC1-Inhibitor on Brain Ischemia-Reperfusion Injury Does Not RequireC1q,Am.J.Pathol.164:1857-63(2004)公开的结果相反，表明血浆衍生的C1-INH（Baxter-Immuno，Pisa，意大利）在脑缺血后仅具有一小时的治疗窗口。

实施例4：联合C1-INH和IVIG治疗

为了确定IVIG和C1-INH作为联合治疗的神经保护潜能，在缺血后1小时给予单剂量的0.50mg/g IVIG，接着30分钟后单次静脉注射75U/kg的C1-INH（n=19）。在再灌注阶段72小时后测定脑梗死体积。联合治疗将75U/kg剂量的C1-INH对脑梗死体积减小的作用增强了接近3倍（从26%至76%），将0.5mg/g IVIG的作用增强了大约两倍（从40%至76%）。与最佳C1-INH剂量（300U/kg）相比，联合治疗的神经保护作用更大。联合治疗降低了死亡率，并且相对于灌注了300U/kg C1-INH的动物，将梗死大小减小了约50%。联合治疗与最佳剂量的IVIG（1g/kg）一样有效—两组动物之间的死亡率和梗死大小没有显著变化。参见图3。与仅有I/R组相比，在同时接受了IVIG和C1-INH的小鼠中，所有时间点（缺血后24、48和72小时）的神经性缺乏显著减小，并且比用次佳剂量的单独IVIG（0.50mg/g）或C1-INH（75U/kg）治疗的小鼠低17-24%。

就减小脑梗死大小而言，联合给予与单独的IVIG或C1-INH同等有效（与未治疗动物相比，减小67%），即使在缺血后6小时施用时。图4a。在缺血后6h联合治疗后，神经性缺乏评分提高71%。与用最佳单独剂量的IVIG或C1-INH治疗的小鼠相比，这种作用明显更显著。图4b。

实施例5：IVIG和C1-INH保护老年小鼠和雌性小鼠免受损伤

人中风的影响在两个性别上相等，但发病率随着年龄提高。为此，我们测试的IVIG、C1-INH和联合治疗在雌性小鼠中的有效性。我们还在缺血后6小时在13-14个月大的小鼠（大于之前测试的）中测试了影响。与未治疗动物相比，在缺血后72小时，灌注单独的1g/kgIVIG，单独的300U/kg C1-INH以及用半最大抑制（IC50）浓度连续给予两种药剂时，老年小鼠和雌性小鼠都显著呈现出减小的梗死大小和神经性缺乏程度。在老年小鼠中，就减小梗死大小和神经性缺乏评分而言，联合治疗大约50%和70%更有效。

实施例6：IVIG和C1-INH降低C3b的原位积聚

评价了联合的IVIG/C1-INH治疗对来自接受I/R损伤的小鼠的脑样品中的C3b（第三种补体成分的活性片段）水平的影响。在正常的和假手术动物的脑中观察到的C3b的基础水平与I/R小鼠的对侧（非损伤）半球中的C3b水平相似。I/R损伤后，损伤部位（在同侧半球中）的C3b在皮层中提高5-倍，在纹状体中提高15倍。在再灌注发生后1小时给予了IVIG（1.0g/kg）和C1-INH（300U/kg），将受影响半球的皮层和纹状体中的C3b表达大约降低了3倍。该数据表明在响应脑缺血时激活了补体系统，导致活性片段的原位积聚。补体清除和抑制显示出在降低由C3b沉积引发的神经损伤中是有效的。梗死的纹状体部分中更明显的C3b沉积与之前该区域中更大范围的解剖学损伤的发现相关，提供了更多的I/R脑损伤和补体激活之间的因果关系的证据。

实施例6：补体激活上调缺血性中风中的TLR2

补体系统和Toll-样受体（TLR）代表宿主先天性免疫防御系统的第一线，并且经由模式识别反抗侵袭的病原体和改变的自身抗原。因此评价了在缺血性中风过程中可能的补体和TLR途径的共同激活。通过使用对抗C3b和TLR2的抗体进行双重标记免疫组织化学来评价IVIG和C1-INH对两条途径的减弱作用。在取自I/R损伤后24小时时脑半影区的组织切片中，超过90%的脑细胞显示出内在的C3和TLR2表达，其比取自假手术动物的相同切片中的高11（C3）和28（TLR2）倍，如通过定量抗体信号的像素强度来测定。在缺血后1小时用IVIG（1g/kg）和C1-INH（300U/kg）治疗的小鼠中，C3和TLR2信号都得到显著抑制。对C3和TLR2的双重标记免疫荧光染色揭示了，在几乎全部的脑细胞中，这两种分子共同定位。在来自用IVIG和C1-INH治疗的小鼠的切片中，与单独的细胞一样有效地抑制了共同定位的信号。

实施例7：IVIG疗法、C1-INH疗法和联合疗法的比较

在缺血前30分钟或缺血后1小时给予时，IVIG（CSL Behring）和C1-INH（CSL Behring）以剂量响应方式显著减小了损伤部位的脑梗死大小、神经性缺乏评分和C3b片段沉积。最佳剂量的IVIG发挥出比最佳剂量的C1-INH更高的神经保护（分别为，脑梗死体积减小85%vs.48%，神经性缺乏抑制35%vs.22%）。用人血清白蛋白以及用于IVIG和C1-INH的载体（稳定溶液）的治疗没有改善未治疗对照中观察到的脑损伤的规模。该数据表明可以将补体减弱认为是用于中风的新介入疗法。

C1-INH抑制补体激活，但没有中和已经产生的补体激活片段，同时IVIG没有抑制新的补体激活，但清除了激活的补体片段。在补体介导的疾病中，如中风，新一轮的补体激活零散地发生，产生新的致病补体产物。抑制剂和清除剂的组合提供了改进的治疗策略，用于除去现有的活性片段和预防进一步的补体激活。次佳剂量的IVIG和C1-INH的组合不仅超过了单独浓度的作用，而且还超过了最佳C1-INH浓度并且等于1g/kg IVIG的治疗潜能，除了在老年小鼠中，其中与单独的IVIG相比，联合治疗呈现出卓越的脑保护。

联合疗法可以提供用于人中风治疗的益处，因为IVIG和C1-INH都已经用于其他人疾病的治疗中，并且已经表明是安全的。

实施例8：材料和方法

局灶性脑缺血/再灌注模型。所有实验方案和程序由Animal Careand Use Committee of the National Aging Institute批准，并且依照NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals进行。用异氟烷（诱导5.0%，维持1.5-2.0%）将三个月大的雄性C57BL/6小鼠（25-30g）麻醉。然后使用管腔内细丝法，将动物接受瞬时中脑动脉梗死（TMCAO）。简而言之，通过中线颈部切口，将左颈总动脉、

颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）暴露。然后，将硅覆盖的单丝（具有涂层的直径为0.23+/-0.02mm）通过切口引入ECA腔中，并且从ECA前进至ICA腔，直至感觉到光电阻。在1小时时间段后取出单丝，以启动再灌注，直至72小时。对假手术的小鼠进行相同处理，不同的是插入细丝来产生梗死。

治疗方案。用于这些实施例中的IVIG制剂（CSLBehring AG，Bern，瑞士）是含有>98%IgG和<0.025mg/ml IgA的10%蛋白质溶液。用250mmol/L L-脯氨酸（载体）来稳定中的IgG分子。用10ml无菌水重构冻干的血浆衍生的人C1s酯酶抑制剂C1-INH（CSL Bering GmbH，Marburg，德国），以获得载体溶液中最终500U C1-INH的剂量，所述载体溶液含有10mg/ml甘氨酸、8.5mg/ml NaCl和3mg/ml柠檬酸钠。将重构的C1-INH保持在+4℃并且在14天内使用。通过在MCAO前30分钟（处理前）和指定的时间点（处理后1小时和3小时）通过缓慢注入股静脉中来给予IVIG和C1-INH。将用于两种治疗剂的载体溶液（如以上实施例中所述的）以等于其中递送最佳剂量的IVIG和C1-INH的体积注入对照动物中。

神经性缺乏评价。在指定的中风后时间点，使用六-点神经性缺乏评分来评价病灶性脑I/R损伤的功能结果（0，无缺陷；1，不能伸右爪；2，向右侧蜷缩；3，右侧失能；4，不能自主行走和5，死亡）。通过至少两名研究院盲式评价每只小鼠。

脑梗死的定量。将小鼠麻醉，斩首，并且取出脑。使用啮齿动物脑基质（Kent Scientific，Torrington，CT）制备两-毫米冠状切片，并且在37℃下用磷酸盐缓冲液中的2%2,3,5-氯化三苯基四氮唑单水合物（TTC，Sigma，St Louis，MO）染色20分钟。扫描切片，并且使用NIH图像分析软件（Image J；National Institutes of Health，Bethesda，MD）评价梗死大小。

凝胶电泳和Western印迹。将来自IVIG-和C1-INH治疗过的小鼠和合适的载体对照小鼠的皮层和纹状体样品放入含有300mMNaCl、1.5mM MgCl₂、25mM HEPES、20mMβ-甘油磷酸酯、0.2mMEDTA、0.5mM二硫苏糖醇（DTT）和0.1%曲通-X以及蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。使用超声波处理器（VC130PB，Sonic&Materials Inc.，Newtown，CT），通过在4℃下的30-秒超声波处理，来裂解组织，并且将细胞提取物在18,000×g下离心5分钟。然后通过来自Bio-Rad（Hercules，CA）的二辛可宁酸（BCA）试验试剂盒测定蛋白质含量。将上清液样品在10%SDS凝胶上分离，并且将分解的蛋白质通过电泳转移至0.45μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（MilliporeCorporation，Bedford，MA）。用初级抗-C3b抗体（Cell Sciences，Canton，MA）和抗-β肌动蛋白单克隆抗体（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）将印迹在4℃下孵育过夜。用辣根过氧化物酶-偶联的二抗IgG孵育1小时后，使用增强化学发光试验（AmershamCorporation，Piscataway，NJ）观察反应产物。使用Scion Image程序（Orem，UT），从每个蛋白质条带的平均像素密度估算蛋白质表达的相对变化。

免疫组织化学评价。将指定用于免疫组织化学研究的小鼠在24小时再灌注后深度麻醉，并且经过心脏灌注PBS，直至流出物变得清澈。用PBS中的4%多聚甲醛完成固定。解剖出脑，并且置于相同固定剂中，在4℃下过夜。将前脑进行处理，用于石蜡切片。切除连续冠状切片（5μm厚），并且装载于载玻片上。将切片脱去石蜡、复水和接受使用高-pH TRIS-EDTA缓冲液的抗原修复。所有细胞计数在保持穿过所有切片的限定区域中进行。阻断非特异性抗体结合后，用初级兔子多克隆抗-C3抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）和大鼠单克隆抗-TLR2（Biolegend，CA）在4℃下将切片孵育过夜。用合适的偶联二抗（Invitrogen，Carlsbad，CA）的Alexa Fluor568（红色荧光）和Alexa Fluor488（绿色荧光）孵育45分钟后，用Hoechst33258复染，用Olympus荧光显微镜获取图像。用Photoshop7.0（Adobe Systems，San Jose，CA）处理图像，调节输入水平，以跨过获取的信号强度的范围。使用IP Labs软件（BD Biosciences，SanDiego，CA）定量像素强度。

统计学分析。使用Student’s t检验、Fisher’s精确检验、ANOVA和由此的Newman-Keuls检验进行统计学比较，用于成对比较。

之前的实施例旨在用于说明而不是限制本发明的公开内容。从考虑本文中公开的设备和方法的说明和实施，本领域技术人员将清楚所公开的设备和方法的其他实施方案。

Claims (29)

1.预防、治疗或降低脑缺血后的炎性损伤或再灌注损伤的影响的方法，包括给予包含免疫球蛋白的组合物和包含C1-抑制剂（C1-INH）的组合物。

2.权利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白是血浆衍生的免疫球蛋白。

3.权利要求2的方法，其中所述免疫球蛋白是人血浆衍生的免疫球蛋白。

4.权利要求3的方法，其中所述人衍生的免疫球蛋白是人血浆衍生的静脉内免疫球蛋白G（IVIG）。

5.权利要求4的方法，其中以足够的浓度给予IVIG和C1-INH，使得与脑缺血后独立给予C1-INH时相比，IVIG和C1-INH的组合导致至少约50%梗死体积的减小。

6.权利要求4的方法，其中以足够的浓度给予IVIG和C1-INH，使得IVIG和C1-INH的组合导致梗死体积的减少至少约等于脑缺血后独立给予最佳浓度的IVIG时观察到的减小。

7.权利要求4的方法，其中以大约0.01U/kg至2000U/kg体重范围的浓度来给予C1-INH。

8.权利要求1的方法，其中以大约0.01至3.0g/kg体重范围的浓度来给予IVIG。

9.权利要求1的方法，其中以足够的浓度给予免疫球蛋白和C1-INH，使得与未治疗情况下的梗死体积相比，所述组合导致至少40%梗死体积的减小。

10.权利要求1的方法，其中同时给予免疫球蛋白和C1-INH。

11.权利要求1的方法，其中按序给予免疫球蛋白和C1-INH，其中首先给予免疫球蛋白或首先给予C1-INH。

12.权利要求11的方法，其中在免疫球蛋白后至少10分钟给予C1-INH。

13.权利要求11的方法，其中在C1-INH后至少10分钟给予免疫球蛋白。

14.权利要求1的方法，其中给予所述免疫球蛋白和C1-INH的组合直至脑缺血后约六个小时。

15.权利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白和C1-INH通过静脉内给予。

16.权利要求1的方法，其中以含水或冻干的形式提供所述免疫球蛋白和C1-INH。

17.权利要求16的方法，其中所述冻干的治疗成分在给予前通过将其溶解于药物学上可接受的载体中重构。

18.权利要求17的方法，其中所述药物学上可接受的载体是灭菌注射用水。

19.用于治疗脑缺血的药盒，其包括：

（a）免疫球蛋白；

（b）C1-INH；和

（c）任选地，至少一种另外的治疗活性化合物或药物。

20.权利要求19的药盒，其中所述至少一种另外的治疗活性化合物或药物是维生素、抗生素、抗病毒剂，或旨在去除或抑制脑中血块形成的化合物。

21.权利要求20的药盒，其中所述旨在去除或抑制血块形成的化合物是阿司匹林、氯吡格雷（clopidogrel）或双嘧达莫（dipyridamole）。

22.权利要求19的药盒，其中所述免疫球蛋白是IVIG。

23.权利要求19的药盒，其中以含水或冻干的形式提供所述免疫球蛋白和C1-INH。

24.权利要求23的药盒，其中所述冻干的成分在给予前通过将其溶解于药物学上可接受的载体中重构。

25.权利要求24的药盒，其中所述药物学上可接受的载体是灭菌注射用水。

26.权利要求1的方法，其中以低于独立给予的最佳浓度的浓度来给予所述免疫球蛋白和C1-INH。

27.权利要求26的方法，其中所述免疫球蛋白和C1-INH的联合给予导致梗死体积的减小或神经性缺乏的减小，所述减小至少约等于以最佳浓度独立给予所述免疫球蛋白或C1-INH时观察到的减小。

28.权利要求26的方法，其中以降低脑出血风险的浓度来给予所述免疫球蛋白和C1-INH。

29.权利要求1的方法，其中给予所述免疫球蛋白和C1-INH直至脑缺血后约18小时。