ES2886859T3 - Terapia usando un inhibidor del factor xii en un trastorno neurotraumático - Google Patents

Abstract

Un inhibidor directo del Factor XII (FXII) para su uso en el tratamiento de lesiones traumáticas del cerebro (lesión cerebral traumática), en el que el inhibidor del FXII no es un inhibidor de la C1 esterasa, en el que el inhibidor del FXII comprende (i) la secuencia polipeptídica de Infestin-4 de tipo salvaje definida por SEQ ID NO:1, o una secuencia polipeptídica que comprende: (a) SEQ ID NO: 1 modificado para contener 1-5 mutaciones de aminoácidos fuera de las posiciones de aminoácidos N-terminal 2-13 de SEQ ID NO: 1; y/o (b) una homología de al menos el 95%, el 98% o el 99% con la SEQ ID NO: 1 y reteniendo seis restos de cisteína conservados de SEQ ID NO: 1; y/o (ii) un anticuerpo anti-FXII.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia usando un inhibidor del factor xii en un trastorno neurotraumático

La presente divulgación se refiere al uso de un inhibidor directo del Factor XII (FXII) en el tratamiento de un trastorno neurotraumático, que es una lesión cerebral traumática (TBI).

Existen dos vías convergentes para la coagulación que son desencadenadas por componentes "extrínsecos" (pared del vaso) o "intrínsecos" (transmitidos por la sangre) del sistema vascular. La vía de activación "intrínseca" o de contacto se inicia cuando el Factor XII (FXII, factor Hageman) entra en contacto con superficies cargadas negativamente en una reacción en la que intervienen el cininógeno de alto peso molecular y la calicreína plasmática. El factor XII es una serina proteasa y, una vez activado (FXIIa), activa aún más el FXII circulante en una reacción de retroalimentación positiva (directamente o a través de la activación de la precalicreína). El FXIIa también activa el Factor XI y la coagulación sanguínea procede en una cascada de reacción que implica la activación de otros factores por proteólisis limitada que culmina en la generación de trombina, que convierte el fibrinógeno plasmático en fibrina y activa las plaquetas.

El sistema calicreína-quinina (KKS) también es iniciado por el factor de coagulación sanguínea XII (FXII, factor Hageman) y desempeña un papel importante en la regulación de la permeabilidad vascular y la formación de edema (Leeb-Lundberg et al. (2005) Pharmacol. Rev.; 571:27-77). La activación del KKS se ha mostrado recientemente también en pacientes con ictus (Wagner et al. (2002) J. Neurol. Sci.; 202:75-76). Las cininas (por ejemplo, la bradiquinina, la calidina) constituyen los productos finales del KKS. Las cininas son hormonas peptídicas proinflamatorias muy activas que son liberadas por las calicreínas a partir de sus precursores, los cininógenos, durante varios tipos de lesiones tisulares, incluida la isquemia cerebral. Los efectos celulares de las cininas están mediados por dos receptores de bradiquinina diferentes, el B1R y el B2R. La activación de estos receptores desencadena procesos inflamatorios en el órgano diana, como la liberación de citoquinas proinflamatorias o la atracción de células inmunitarias, así como el aumento de la permeabilidad vascular.

La lesión cerebral traumática (TBI) es una afección neurológica devastadora y puede definirse como un daño cerebral resultante de un movimiento rápido del cerebro dentro del cráneo o una lesión directa en el cerebro y/o las raíces nerviosas debido a un evento traumático que causa una disrupción mecánica inmediata del tejido cerebral/raíces nerviosas y eventos patogénicos retardados. Es un trastorno heterogéneo que puede variar en el tipo de lesión cerebral, la distribución del daño cerebral y los mecanismos de daño. El evento traumático suele estar causado por accidentes de tráfico o deportivos, y es la principal causa de muerte y discapacidad en adolescentes y jóvenes varones (Tagliaferri et al., 2006, Acta Neurochir (Wien), 148(3):255-68). La LCT constituye aproximadamente el 20% de todos los traumatismos y tiene un gasto muy elevado asociado a la enfermedad (60.000 millones de dólares en Estados Unidos en 2000). Además, las opciones de tratamiento para la LCT son muy limitadas (Faul et al., 2007, Journal of Trauma-Injury Infection & Critical Care, 63(6), 1271-8; Steudel et al., 2005, Acta Neurochir (Wien), 147(3):231-42); en la actualidad, el único procedimiento eficaz para tratar las LCT graves es prevenir su aparición. Aunque varios ensayos clínicos de fase II han mostrado los efectos favorables de los compuestos terapéuticos (Narayan et al., 2002, J Neurotrauma, 19(5):503-57), desgraciadamente todos los compuestos no han mostrado claramente su eficacia en los ensayos de fase III (Doppenberg et al., 2004, Neurosurg Anesthesiol, 16(1):87-94). A pesar de los numerosos ensayos clínicos, los intentos de encontrar un agente neuroprotector seguro y eficaz han fracasado (Kabadi et al., 2014, International Journal of Molecular Sciences 15:1216-1236; Menon et al., 2015, Nature reviews Neurology 11:71-72).

El daño cerebral primario que se produce debido a una fuerza externa provoca una alteración mecánica irreversible del tejido cerebral. En la secuela, los procesos de lesiones secundarias contribuyen a la exacerbación del daño cerebral traumático. El daño tisular cerebral primario puede ser difuso o focal, por lo que las circunstancias de la lesión determinan el grado relativo de desarrollo del traumatismo difuso y focal. Mientras que el traumatismo focal se asocia a la contusión del tejido cerebral, la lesión vascular y la hemorragia, acompañadas de isquemia, la lesión cerebral difusa se caracteriza por una lesión axonal difusa. Los factores clave que contribuyen al daño cerebral son la inflamación, las alteraciones metabólicas y la disfunción cerebrovascular, que propagan aún más la isquemia tisular inducida por la lesión y el edema cerebral debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB) (Schlosberg et al. (2010) Nat Rev Neurol; 6:393-403; Donkin y Vink (2010) Curr. Opinion in Neurol; 23:293-299).

Más allá de los procesos de lesión bien caracterizados, como la excitotoxicidad, la inflamación y el daño de la barrera hematoencefálica, la formación de trombos en la microcirculación cerebral contribuye probablemente al daño cerebral secundario al causar isquemia pericontusional y reducir el flujo sanguíneo cerebral regional (Schwarzmaier et al., 2010, J Neurotrauma 27:121-130). En la LCT clínica, la oclusión de vasos intracerebrales con isquemia posterior empeora el resultado (Stein et al., 2002, J Neurosurg 97:1373-1377 Stein et al., 2004, Neurosurgery 54:687-691 Harhangi et al., 2008, Acta Neurochir (Wien) 150:165-175; Maegele, 2013, Transfusion 53 Suppl 1:28S-37S). Sin embargo, el uso potencial de los anticoagulantes convencionales en los pacientes con LCT se discute de forma controvertida. Algunos estudios apoyan un efecto beneficioso neto de la anticoagulación tras el TCE al reducir el riesgo de eventos tromboembólicos (Dudley et al., 2010, J Neurotrauma 27:2165-2172; Albrecht et al., 2014, JAMA Internal Medicine 174:1244-1251) y la mejora de los parámetros de resultado (Stutzmann et al., 2002, CNS Drug Rev 8:1-30; Kim et al., 2014, J Emerg Trauma Shock 7:141-148) mientras que otros estudios informan de un efecto perjudicial de la anticoagulación (Peck et al., 2014, The Journal of Trauma and Acute Care Surgery 76:431-436) debido a un mayor riesgo de hemorragias intracraneales que también se producen con frecuencia después de TBI.

El sistema calicreína-quinina (KKS) está implicado en múltiples estados patológicos (Leeb-Lundberg et al. (2005) Pharmacol. Rev.; 571:27-77), y representa una atractiva diana terapéutica en la LCT. Las quininas, liberadas por las calicreínas, son péptidos proinflamatorios que median sus efectos a través de la activación de dos receptores acoplados a proteínas G (GPCR), el receptor de quinina B1 (B1R) y el B2 (B2R) (Leeb-Lundberg et al., 2005, Pharmacol. Rev.; 571:27-77; (Albert-Weissenberger et al. (2013) Progr. Neurobiol; 101-102:65-82^. Las quininas desempeñan un papel importante en la regulación de la permeabilidad vascular, la formación de edemas, la migración celular transendotelial y la inflamación en diferentes órganos tras una lesión (Leeb-Lundberg et al., 2005, Pharmacol. Rev.; 571:27-77). Además, el KKS está vinculado a la cascada de coagulación plasmática a través del factor XII (FXII, factor Hageman). Todos los componentes del KKS han sido identificados en el cerebro de roedores y humanos (Albert-Weissenberger et al. (2013) Progr. Neurobiol; 101-102:65-82), y su expresión se regula al alza tras una lesión cerebral (Ongali et al. (2006) J. Neurotrauma 23, 696-707; Raslan et al., (2010) J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1477­ 1486; Trabold et al. (2010), J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 130-139.). Recientemente, en ratones, se mostró que el bloqueo de B1R, pero no de B2R, reduce el daño de la barrera hematoencefálica y la formación de edema en modelos experimentales de isquemia cerebral focal (Austinat et al. (2009) Stroke; 40:285-293,) y la lesión cerebral traumática (Albert-Weissenberger et al. (2012) J. Cereb. Blood Flow Metab.; 32:1747-56; Raslan et al. (2010) J. Cereb. Blood Flow Metab.; 30:1477-1486) sugiriendo la relevancia funcional del KKS en la formación de edema cerebral en la fase aguda del ictus isquémico y la lesión cerebral traumática (Albert-Weissenberger et al. (2013) Progr. Neurobiol; 101-102:65-82).

En los estudios que impiden la activación del KKS a través de la inhibición del FXII, que se activa fisiológicamente al entrar en contacto con superficies cargadas negativamente (activación por contacto), se investigó el resultado neuropatológico tras un accidente cerebrovascular experimental agudo (Hagedorn et al. (2010) Circulation; 121:1510-1517; Kleinschnitz et al. (2006) JEM; 203(3):513).

El documento WO 2006/066878 divulga por primera vez, en general, el uso de un inhibidor del FXII en el tratamiento o la prevención de la trombosis venosa o arterial sin que se asocie a una hemorragia anormal (hemostasia).

Hagedorn et al. ((2010) Circulation; 121:1510-1517) divulga el tratamiento y la prevención de la formación de trombos arteriales oclusivos mediante la albúmina humana recombinante Infestin-4, un inhibidor del FXII, dejando la hemostasia totalmente intacta. Además, la rHA-Infestin-4 fue protectora en un modelo murino de ictus isquémico.

El documento EP 2 623 110 A1 divulga inhibidores del FXII para el tratamiento de trastornos inflamatorios neurológicos. Aunque el término "enfermedad inflamatoria neurológica" se refiere a una afección con una inflamación de una o más áreas del cerebro o la médula espinal, este trastorno no está vinculado a una lesión cerebral traumática o a una lesión de la médula espinal.

El documento WO 2014/135694 (publicado el 12 de septiembre de 2014) divulga un sistema de activación por contacto seleccionado entre un inhibidor de la esterasa C1, un inhibidor de la calicreína y un inhibidor del FXII, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) a distancia. Aunque dicha IRI remota puede incluir la alteración de la barrera hematoencefálica, las enfermedades y los efectos mencionados (edema cerebral, accidente cerebrovascular, aumento de la presión intracraneal e inflamación del tejido neuronal), así como la propia IRI remota, no están relacionados de forma inequívoca con la lesión cerebral traumática o la lesión medular.

El documento WO 2011/069090 divulga el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a la activación del FXII mediante la administración de un agente de unión a la fosfatidilserina, es decir, un inhibidor de un activador del FXII. Se menciona que la inhibición de la activación del FXII puede, por ejemplo, ser útil en la prevención y el tratamiento del shock (neurogénico) causado, por ejemplo, por un traumatismo de la médula espinal. Aunque El documento WO 2011/069090 también menciona brevemente que un agente de unión a la fosfatidilserina puede combinarse con un anticuerpo anti-FXII, la eficacia de un inhibidor directo del FXII (solo o en combinación) en el traumatismo de la médula espinal o en la lesión cerebral traumática no está probada.

Albert-Weissenberger et al. se centra en el uso de determinados receptores de quinina, así como del C1 para tratar la LCT. Plantea la hipótesis de que los inhibidores del FXII también pueden ser un objetivo atractivo para el tratamiento de la LCT, pero no revela ningún dato real.

El documento EP 2497489 divulga los mismos inhibidores de FXII divulgados en la presente memoria pero en el En resumen, existe el estado de la técnica que divulga el uso de un inhibidor del FXII en indicaciones trombóticas particulares o en enfermedades inflamatorias o afecciones neurológicas. Pero ninguno de estos documentos está relacionado con una enfermedad con el patomecanismo que es relevante en los trastornos neurotraumáticos. Además, las intervenciones terapéuticas específicas para las lesiones cerebrales traumáticas están ausentes en el estado de la técnica y sigue habiendo una demanda apremiante para identificar conceptos innovadores basados en el patomecanismo para las terapias eficaces, en particular en vista de las controvertidas discusiones sobre el tratamiento anticoagulante en pacientes con TBI.

Por lo tanto, en la lesión cerebral traumática, es evidente que todavía existe la necesidad de una medicación mejorada para el tratamiento de una lesión cerebral traumática. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención satisfacer tal necesidad. Por lo tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención era proporcionar medios y procedimientos alternativos y/o mejorados para abordar con éxito la lesión cerebral traumática que constituyan la base o puedan permitir el desarrollo de una terapéutica más satisfactoria para el tratamiento de la lesión cerebral traumática. La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En consecuencia, se divulgan en la presente memoria terapias que comprenden el uso de al menos un inhibidor directo del Factor XII (inhibidor del FXII) en el tratamiento de un trastorno neurotraumático. El trastorno neurotraumático es consecuencia de una lesión traumática del sistema nervioso central y es una lesión cerebral traumática, y la terapia puede comprender la administración de una cantidad eficaz de al menos un inhibidor del FXII (por ejemplo, rHA-Infestin-4 o un anticuerpo anti-FXII).

En otras palabras, los inventores han descubierto que una lesión cerebral traumática que se produce después de una lesión traumática inicial del sistema nervioso central, en particular un edema traumático, podría tratarse y/o prevenirse mediante la administración de un inhibidor directo del FXII. En consecuencia, en general, la presente invención se refiere a un inhibidor directo del FXII para su uso en un procedimiento de tratamiento de una lesión traumática y/o para tratar o prevenir la formación y/o reducir el tamaño de un edema primario del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto en el que el sujeto, preferentemente un sujeto humano, tiene o ha tenido al menos una lesión cerebral traumática.

Los inventores han encontrado que la inhibición farmacológica del FXII con un inhibidor directo del FXII minimiza la formación de trombos microvasculares inducidos por el trauma después de una lesión cerebral traumática y mejora el resultado funcional, como una mejor función motora, una reducción del volumen de la lesión cerebral y una disminución de la neurodegeneración, sin aumentar el riesgo de hemorragias intracerebrales anormales.

En algunas realizaciones, el al menos un inhibidor del FXII puede comprender una secuencia polipeptídica de Infestin-4 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) o una secuencia de Infestin-4 con 1-5 mutaciones aminoacídicas fuera de las posiciones aminoacídicas N-terminales 2-13 de SEQ ID NO: 1 y/o una homología de al menos el 95%, 98% o 99% con la SEQ ID NO: 1 y conservando seis restos de cisteína conservados de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, el al menos un inhibidor del FXII puede comprender un anticuerpo anti-FXII. En algunas realizaciones, el al menos un inhibidor del FXII puede estar vinculado a un compañero de fusión (por ejemplo, un polipéptido potenciador de la vida media) directamente o a través de un enlazador. En algunas realizaciones, el inhibidor del FXII es específico para el FXII, el FXIIa y/o la activación del FXII.

En varias realizaciones, el inhibidor del FXII se administra inmediatamente después de la lesión neurotraumática de un paciente o después de que el paciente desarrolle el trastorno neurotraumático, o se administra profilácticamente. El inhibidor del FXII puede administrarse una vez, o varias veces (por ejemplo, como tratamiento profiláctico repetido, o como tratamiento repetido durante o después de la lesión traumática que provoca el trastorno neurotraumático).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una reducción del tamaño de la lesión en los ratones de tipo salvaje (WT) tratados con rHA-Infestin-4 o en los ratones FXII-/, en comparación con los controles tratados con NaCl o WT, respectivamente, 24 horas después de la inducción del traumatismo. Se analizaron las tinciones con TTC de cortes cerebrales obtenidos de ratones machos y hembras para determinar el volumen de las lesiones. La deficiencia o inhibición del FXII reduce el tamaño de las lesiones 24 horas después de la inducción del traumatismo.

La Figura 2 muestra la preservación de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) 24 horas después de la inducción del traumatismo en los ratones FXII_/" en comparación con los controles WT. La integridad de la BBB se analizó mediante la extensión de la extravasación de Evans Blue en el hemisferio lesionado, determinada por fotometría, y el contenido de agua cerebral como medida del edema cerebral en el hemisferio lesionado.

La figura 3 muestra la conservación de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) 24 horas después de la inducción del traumatismo en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los controles tratados con NaCl. La integridad de la BBB se analizó mediante la extensión de la extravasación de Evans Blue en el hemisferio lesionado, determinada por fotometría, y la expresión proteica relativa de la proteína estructural de la BBB, Occludin. El contenido de agua del cerebro es una medida del edema cerebral en el hemisferio lesionado.

La figura 4 muestra la disminución de la formación de trombos y la amortiguación de los procesos trombóticos 24 horas después de la inducción del traumatismo. La expresión proteica relativa de la fibrina/fibrinógeno se analizó mediante Western blot y está reducida en los ratones fX iI_/" en comparación con los controles WT. La relación de vasos ocluidos respecto a los abiertos en el hemisferio lesionado se analizó histológicamente mediante la tinción con H&E del tejido cerebral y se encontró una menor relación de vasos ocluidos respecto a los abiertos en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los controles tratados con NaCl.

La figura 5 muestra la protección de los procesos inflamatorios en los ratones FXII'/_ 24 horas después de la inducción del traumatismo. La cuantificación de la infiltración de macrófagos en el hemisferio lesionado se analizó con tinción inmunohistoquímica; se midió la expresión génica relativa de las citocinas proinflamatorias TNFa e Interleucina-1p en los ratones FXII-/ en comparación con los controles WT y los ratones operados de forma simulada.

La figura 6 muestra que los procesos inflamatorios se amortiguan en los animales tratados con rHA-Infestin-4 24 horas después de la inducción del traumatismo. Se midió la expresión génica relativa de las citocinas proinflamatorias TNFa e Interleucina-1p en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los tratados con NaCl y los operados de forma simulada.

La figura 7 muestra la reducción del tamaño de las lesiones en los ratones FXII-/- en comparación con los controles WT 3d después de la inducción del traumatismo. Se midieron los volúmenes de las lesiones en cortes cerebrales teñidos con TTC y muestran la protección del daño tisular en los ratones FXII_/_ machos y hembras.

La figura 8 muestra la reducción del daño de la barrera hematoencefálica (BBB) 3d tras la inducción del traumatismo en los ratones FXII_/_ en comparación con los controles WT. La integridad de la BBB se analizó mediante la extensión de la extravasación de Evans Blue en el hemisferio lesionado, determinada por fotometría.

La figura 9 muestra la acumulación de plaquetas intracerebrales y la trombosis como características patológicas de la lesión cerebral traumática (tras la lesión por caída de peso y la criolesión).

La figura 10 muestra la disminución de la acumulación de plaquetas intracerebrales en el día 7 después de la lesión por caída de peso en los ratones FXII-/-.

La figura 11 muestra la disminución de la acumulación de plaquetas intracerebrales en el día 1 y en el día 3 después de la criolesión de los ratones FXII-/-.

La figura 12 muestra la mejora de la deficiencia de FXII en el resultado tras la lesión por caída de peso, ya que los ratones FXII-/- desarrollan una puntuación de gravedad neurológica significativamente menor que los ratones de tipo salvaje y los ratones FXII_/_ reconstituidos con FXII humano en el día 3 y en el día 7 tras el traumatismo cerebral difuso.

La figura 13 muestra la mejora de la deficiencia de FXII en el resultado después de la criolesión de los ratones FXII'/' mostrando volúmenes de lesión significativamente reducidos en comparación con los ratones WT y mostrando un número significativamente disminuido de neuronas apoptóticas en los ratones FXII-/ cuando se comparan con los controles WT.

La figura 14 muestra la disminución de la acumulación de plaquetas intracerebrales y la mejora del resultado tras un traumatismo cerebral por caída de peso mediante la inhibición farmacológica del FXII con rHA-Infestin-4.

La figura 15 muestra la disminución de la acumulación intracerebral de plaquetas y la protección contra el traumatismo cerebral focal mediante la inhibición farmacológica del FXII con rHA-Infestin-4.

La figura 16 muestra que la deficiencia genética y la inhibición farmacológica del FXII no provocan hemorragias tras la criolesión.

La figura 17 muestra la reducción de la infiltración de células inmunitarias 24 horas y 3 días después de la inducción de la lesión.

Descripción detallada de unas realizaciones

Las realizaciones de la divulgación pertenecen a procedimientos que comprenden la administración de un inhibidor directo del Factor XII (FXII) a un paciente para tratar un trastorno neurotraumático que es una lesión cerebral traumática. En algunas realizaciones, esta terapia puede interactuar con múltiples vías subyacentes a la fisiopatología de las enfermedades tratadas, por ejemplo, la tromboinflamación, el edema cerebral citotóxico y vascular, el déficit de perfusión microvascular debido a los vasoespasmos y la formación de microtrombos, el daño al endotelio microvascular y los componentes de la barrera hematoencefálica, proporcionando potencialmente un tratamiento más eficaz a una gama más amplia de poblaciones de pacientes en comparación con las terapias de tratamiento en el técnica previo.

Definiciones

En la presente divulgación, el uso del singular (como "un" o "el") incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. También en la presente divulgación el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no son limitantes. Se entenderá que cualquier intervalo descrito en la presente memoria incluye los puntos finales y todos los valores entre los puntos finales.

Los títulos de las secciones son sólo a efectos de organización y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.

Como se utiliza en el presente documento, un "inhibidor del FXII" se refiere a un inhibidor del Factor XII (antes de la activación, es decir, su zimógeno) y del Factor XII activado (FXIIa), así como a la activación del FXII. Los inhibidores del FXII abarcan variantes funcionales y fragmentos del inhibidor de tipo salvaje. Una variante o fragmento funcional es una molécula que conserva al menos el 50% (por ejemplo, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o 100%, o cualquier porcentaje intermedio) de la capacidad de la molécula de tipo salvaje para inhibir el FXII, el FXIIa o la activación del FXII.

El término "inhibidor directo del FXII", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un inhibidor que actúa por contacto (por ejemplo, unión) con el FXII (o FXIIa), es decir, el inhibidor del FXII se une al FXII y/o al FXIIa e inhibe su actividad y/o activación. Por el contrario, un inhibidor indirecto puede actuar sin entrar en contacto con la proteína FXII (o FXIIa). Por ejemplo, puede utilizarse un ARN antisentido para disminuir la expresión del gen del FXII, o una pequeña molécula puede inhibir los efectos del FXIIa a través de interacciones con los socios de reacción del FXIIa, como el Factor XI; éstos no interactúan directamente con la proteína FXII. Por lo tanto, un inhibidor indirecto, en contraste con un inhibidor directo, actúa antes o después de la proteína FXII. A continuación, se presentan algunos ejemplos de inhibidores directos. En algunas realizaciones, los inhibidores del FXII son inhibidores no endógenos; es decir, no son inhibidores que se producen naturalmente en el cuerpo humano o animal. En algunas realizaciones, los inhibidores del FXII son específicos para el FXII o el FXIIa, en particular específicos para el FXII o el FXIIa humano, como se explica a continuación.

Un "trastorno neurotraumático", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una lesión traumática del sistema nervioso central (SNC), seleccionada entre una lesión de la médula espinal y una lesión cerebral traumática. Según la invención, el trastorno neurotraumático es un edema cerebral traumático primario, que es un edema que se produce durante la lesión inicial o poco o inmediatamente (es decir, en cuestión de minutos) después de la lesión. En consecuencia, un trastorno neurotraumático o un edema del SNC se refiere a cualquier hinchazón cerebral directa, es decir, la hinchazón se produce inmediatamente después de la lesión inicial. Se trata inicialmente de un edema vasogénico resultante de un aumento de la difusión de agua a través de la barrera hematoencefálica dañada, pero más tarde también de un edema citotóxico resultante de una captación anormal de agua por parte de las células cerebrales lesionadas. Un trastorno neurotraumático implica además una lesión neural directa (apoptosis, daño axonal), un déficit energético del tejido cerebral local causado por el daño microvascular y procesos tromboinflamatorios que se producen inmediatamente y duran de días a meses después de la lesión.

Preferentemente, el trastorno neurológico según la invención se produce inicialmente unas horas después de la lesión inicial (es decir, cuando la fuerza externa lesiona el SNC) y puede persistir durante semanas. En algunas realizaciones, el trastorno neurológico del SNC aparece dentro de los 30 minutos o dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 12 o 24 h después de la lesión inicial o en cualquier momento intermedio.

Preferentemente, el trastorno neurotraumático según la invención se produce inicialmente unas horas después de la lesión inicial (es decir, cuando la fuerza externa lesiona el SNC) y puede persistir durante semanas. En algunas realizaciones, el trastorno neurotraumático del SNC aparece en 30 minutos o en 1,2, 3, 4, 5, 6 , 12 o 24 h después de la lesión inicial o en cualquier momento intermedio.

El término "lesión cerebral traumática" ("TBI") se refiere a un daño cerebral resultante de un rápido movimiento del cerebro dentro del cráneo debido a un evento traumático que causa una disrupción mecánica inmediata del tejido cerebral y eventos patógenos retardados. Es un trastorno heterogéneo que puede variar en el tipo de lesión cerebral, la distribución del daño cerebral y los mecanismos de daño. Un síntoma de la LCT, que aparece con mucha frecuencia, es un edema cerebral traumático. El suceso traumático suele estar causado por accidentes de tráfico o deportivos.

El término "lesión de la médula espinal" (LME), como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier lesión de la médula espinal causada por un traumatismo y no por una enfermedad. Dependiendo de dónde se dañen la médula espinal y las raíces nerviosas, los síntomas pueden variar mucho, desde el dolor hasta la parálisis o la incontinencia. Las lesiones de la médula espinal se describen en varios niveles de "incompleta", que pueden variar desde no tener ningún efecto en el paciente hasta una lesión "completa" que significa una pérdida total de la función neurológica/orgánica. A menudo, la lesión medular está asociada a un edema medular. Las lesiones de la médula espinal tienen muchas causas, pero suelen estar asociadas a traumatismos importantes, por ejemplo, accidentes de tráfico, caídas, lesiones deportivas y violencia.

El término "edema cerebral traumático" o "edema cerebral" se refiere a cualquier hinchazón del cerebro después de la lesión, es decir, la hinchazón se produce en un corto período de tiempo después de la lesión inicial del SNC. El término "edema medular traumático" o "edema medular" se refiere a cualquier hinchazón de la médula espinal posterior a la lesión, es decir, la hinchazón se produce en un corto periodo de tiempo tras la lesión inicial.

Como se utilizan en la presente memoria, los términos "tratar" y "tratamiento" abarcan la prevención, inhibición, eliminación, retraso de la aparición, ralentización, disminución, reducción de la gravedad o mejora de al menos un signo, síntoma o aspecto de un trastorno o enfermedad. Tratar no requiere una eliminación completa de los síntomas, en el sentido de que engloba, pero no equivale a, "curar" o "sanar". En algunas realizaciones, un paciente puede ser tratado para prevenir un trastorno, lo que significa administrar una terapia a un sujeto que se sabe que está en riesgo de desarrollar un trastorno neurotraumático que es una lesión cerebral traumática. En algunas realizaciones, "tratar" o "tratamiento" también puede incluir la mejora de los efectos de un trastorno o enfermedad. Los términos "mejorar" y "mejorar los efectos" significan que se mejora algún aspecto del trastorno o la enfermedad que produce un deterioro de una o más funciones del paciente. Por ejemplo, el tratamiento de una lesión cerebral traumática puede incluir la prevención de una lesión cerebral traumática, la mejora de los efectos de la lesión cerebral traumática o la reducción de la gravedad de la lesión cerebral traumática (medida, por ejemplo, por la función neurológica o las imágenes del cerebro).

Como se utiliza en el presente documento, un "paciente" es cualquier ser humano o animal que tenga, haya tenido o pueda desarrollar un trastorno neurotraumático que sea una lesión cerebral traumática y que pueda beneficiarse de la administración de un inhibidor del FXII. La administración de un inhibidor del FXII puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido de administración de un agente farmacéutico o terapéutico a un paciente, incluyendo, sin limitación, la administración parenteral (por ejemplo, subdural, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal, intranasal, intratraqueal, inhalación y/o inyección intraperitoneal), oral y/o rectal, así como la administración por instilación, aplicación de aerosoles y/o técnicas de infusión. En ciertas realizaciones, la administración puede hacerse por vía intravenosa, subcutánea o intratecal.

Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo" incluye cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión al antígeno funcional, incluidas las inmunoglobulinas y las partes o fragmentos de unión al antígeno. Una parte o fragmento de unión al antígeno funcional es una molécula que conserva al menos el 50% (por ejemplo, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o 100%, o cualquier porcentaje intermedio) de la capacidad del anticuerpo de longitud completa para unirse al antígeno e inhibirlo. El término anticuerpo incluye, pero no se limita, a los anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, inespecíficos, humanizados, totalmente humanos, camelizados, de cadena única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, retro-mutados y con injerto CDR. El término también incluye fragmentos de anticuerpos como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH (también denominados nanocuerpos) y otros fragmentos o variantes de anticuerpos que conservan la función de unión al antígeno, incluidos los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos. Un anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Como se utiliza en la presente memoria, un "antígeno" es una molécula diana capaz de unirse a un anticuerpo. Como se utiliza en el presente documento, el término "sitio de unión al antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo capaz de unirse o complementarse con una parte o la totalidad de un antígeno.

I. Trastornos neurotraumáticos

En algunas realizaciones, se divulga un inhibidor del FXII que puede utilizarse en procedimientos de tratamiento de un trastorno neurotraumático resultante de una lesión traumática del sistema nervioso central que es una lesión cerebral traumática. Los procedimientos pueden comprender la administración a un sujeto que lo necesite de al menos un inhibidor del FXII. En consecuencia, la invención también proporciona una o más composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un inhibidor del FXII en excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables para su uso en el tratamiento de trastornos neurotraumáticos resultantes de una lesión traumática del sistema nervioso central y que es una lesión cerebral traumática. Del mismo modo, la divulgación también proporciona el uso de una o más composiciones que comprenden al menos un inhibidor de FXII en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno neurotraumático que es una lesión cerebral traumática. El al menos un inhibidor del FXII puede utilizarse solo o también pueden administrarse compuestos terapéuticos adicionales.

Una lesión cerebral traumática (TBI), también conocida como lesión intracraneal, según la presente invención, ocurre cuando una fuerza externa lesiona traumáticamente el cerebro. Las LCT pueden clasificarse en función de la gravedad, el mecanismo (lesión craneal cerrada o penetrante) u otras características (por ejemplo, que se produzcan en un lugar específico o en una zona extensa) y pueden causar una serie de efectos físicos, cognitivos, sociales, emocionales y conductuales, y el resultado puede variar desde la recuperación completa hasta la discapacidad permanente o la muerte. La lesión cerebral traumática se define como el daño al cerebro resultante de una fuerza mecánica externa, como la aceleración o desaceleración rápida, el impacto, las ondas expansivas o la penetración de un proyectil. La función cerebral se ve afectada temporal o permanentemente y el daño estructural puede o no ser detectable con la tecnología actual.

Las causas más comunes de TBI incluyen la violencia, los accidentes de transporte, la construcción y los accidentes deportivos. Los accidentes de moto son una de las principales causas, cada vez más importantes. En los niños de dos a cuatro años, las caídas son la causa más común de TBI, mientras que en los niños mayores los accidentes de tráfico compiten con las caídas por esta posición. La LCT es la tercera lesión más común resultante del maltrato infantil. Los malos tratos causan el 19% de los casos de traumatismos cerebrales pediátricos, y la tasa de mortalidad es mayor entre estos casos.

El tipo, la dirección, la intensidad y la duración de las fuerzas contribuyen todas ellas a las características y la gravedad de la LCT. Las fuerzas que pueden contribuir a la LCT incluyen fuerzas angulares, rotativas, de cizallamiento y de traslación. Incluso en ausencia de un impacto, una aceleración o desaceleración significativa de la cabeza puede causar una LCT; sin embargo, en la mayoría de los casos la culpa es probablemente de una combinación de impacto y aceleración. Las fuerzas que implican que la cabeza golpee o sea golpeada por algo, denominadas carga de contacto o impacto, son la causa de la mayoría de las lesiones focales, y el movimiento del cerebro dentro del cráneo, denominado carga sin contacto o inercial, suele causar lesiones difusas. Los daños pueden producirse directamente bajo el lugar del impacto, o pueden producirse en el lado opuesto al impacto. Una LCT según la invención puede ser causada por una lesión difusa y/o por una lesión focal.

El tratamiento con al menos un inhibidor del FXII puede realizarse de forma profiláctica para prevenir un trastorno neurotraumático que es una lesión cerebral traumática. En la mayoría de los casos, el tratamiento se realiza después de la lesión traumática, es decir, el tratamiento se administra inmediatamente o en algún momento después de producirse la lesión traumática del sistema nervioso central que dio lugar a un trastorno neurotraumático que es una lesión cerebral traumática. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse por primera vez directamente después de que la fuerza externa lesione el sistema nervioso central, o hasta aproximadamente 1 hora, o hasta aproximadamente 2, o incluso hasta 24 horas, o incluso hasta 3 días.

En las realizaciones preferentes, el tratamiento se inicia inmediatamente después, o menos de unas 12 horas después de la aparición inicial del trastorno neurotraumático. En algunas realizaciones, el tratamiento se inicia hasta aproximadamente 30 minutos, o hasta aproximadamente 1 hora, hasta aproximadamente 2, o incluso hasta aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones, el tratamiento se administra inmediatamente después, o aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40 o 50 minutos, o 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas después de la aparición de la fuerza externa que lesiona traumáticamente el cerebro (o en cualquier momento intermedio). En algunas realizaciones, el tratamiento se administra tan pronto como sea posible después de la aparición de la lesión inicial, y preferentemente menos de 1 hora, menos de 6 horas o menos de 24 horas después de la lesión. En algunas realizaciones, el tratamiento se lleva a cabo no más tarde de aproximadamente 24 horas después de la lesión inicial, o no más tarde de aproximadamente 6 horas después de la lesión, o no más tarde de aproximadamente 1 hora después de la lesión.

En algunas realizaciones, la administración de al menos un inhibidor del FXII puede hacerse de forma profiláctica para prevenir una lesión inicial en un paciente con riesgo de sufrir un trastorno neurotraumático. El tratamiento profiláctico puede realizarse en una dosis única o en dosis repetidas. Las dosis periódicas pueden administrarse durante un tiempo determinado, por ejemplo, a lo largo de un tratamiento.

En algunas realizaciones, la administración de al menos un inhibidor del FXII puede hacerse repetidamente, por ejemplo, para tratar a un paciente con riesgo de padecer un trastorno neurotraumático o para tratar a un paciente de manera más eficaz. Dicho tratamiento puede realizarse en dosis múltiples, por ejemplo, en dos, tres, cuatro, cinco o más dosis de forma repetida, como una dosis cada 1 hora, cada 2 horas, cada 4 horas, cada 6 horas, cada 12 horas, o cualquier periodo de tiempo intermedio.

La administración de al menos un inhibidor del FXII (por ejemplo, a un paciente que necesita tratamiento) puede ocurrir en una dosis única o en administraciones repetidas, y en cualquiera de una variedad de formas de sal fisiológicamente aceptables, y/o con un portador farmacéutico aceptable y/o aditivo como parte de una composición farmacéutica. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el al menos un inhibidor del FXII se administra (i) una vez, cada una como una inyección o infusión separada, o en una única inyección o infusión combinada, (ii) en dosis múltiples, por ejemplo, en dos, tres, cuatro, cinco o más dosis, cada una como una inyección o infusión, o (iii) como una infusión o aplicación. La infusión/aplicación puede administrarse durante un periodo de tiempo, preferentemente durante un periodo de 1 minuto a 24 horas, o de 10 minutos a 12 horas, o de 10 minutos a 6 horas, o de 10 minutos a 5 horas, o de 10 minutos a 4 horas, o de 10 minutos a 3 horas, o de 10 minutos a 2 horas, o de 10 minutos a 1 hora (o cualquier periodo de tiempo intermedio). La administración puede realizarse de forma repetida después de la lesión hasta que desaparezcan los síntomas de la lesión neurotraumática, es decir, la administración de al menos un inhibidor del FXII puede realizarse en administraciones repetidas durante días o meses, por ejemplo, durante un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, cuatro semanas, dos meses.

La composición que comprende al menos un inhibidor del FXII puede administrarse a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad, el estado general y el sexo del sujeto, así como con la gravedad de la afección médica en el sujeto. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento.

Una dosis terapéuticamente eficaz del al menos un inhibidor del FXII puede depender de muchos factores como, por ejemplo, la indicación exacta, la formulación o el modo de administración, y puede determinarse en ensayos preclínicos y clínicos para cada indicación respectiva. Por ejemplo, en una realización, la dosis del inhibidor del FXII es de aproximadamente 0,01, 0,1, 1, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg/kg de peso corporal, o cualquier dosis intermedia, o que oscile entre aproximadamente 0 ,01-1000 mg/kg, aproximadamente 0 ,1-1000 mg/kg, aproximadamente 1-1000 mg/kg, aproximadamente 1-500 mg/kg, aproximadamente 10-200 mg/kg, aproximadamente 10-100 mg/kg, aproximadamente 50-500 mg/kg, aproximadamente 50-200 mg/kg o aproximadamente 100-200 mg/kg, o cualquier intervalo de dosis intermedio. En ciertas realizaciones, el inhibidor del FXII es el rHA-Infestin-4. En algunas realizaciones, cuando se utiliza rHA-Infestin-4, la dosis puede varíar entre aproximadamente 0,01 y 1000 mg/kg de peso corporal, o entre aproximadamente 1 y 1000 mg/kg, o entre aproximadamente 1 y 500 mg/kg, o entre aproximadamente 50 y 500 mg/kg (o cualquier intervalo de dosis intermedio).

En algunas realizaciones, el inhibidor del FXII puede ser un anticuerpo anti-FXII. En aquellas realizaciones que implican una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-FXII, una dosis terapéuticamente eficaz es una dosis que produce un efecto terapéutico positivo en el paciente o sujeto que requiere el tratamiento. Una dosis terapéutica eficaz puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a 50 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a 2 mg/kg o de aproximadamente 0,1 a 1 mg/kg, o cualquier intervalo de dosis intermedio. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz puede ser una dosis que inhiba la actividad del FXIIa en el sujeto en al menos un 50%, o al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% (o cualquier porcentaje intermedio).

La dosis exacta terapéuticamente eficaz del inhibidor del FXII puede ser determinada por el experto en la materia mediante experimentos de rutina y no implica ninguna intervención sorprendente.

En ciertas realizaciones, el al menos un inhibidor del FXII se administra a una concentración que produce una reducción de al menos un síntoma del trastorno neurotraumático.

Las composiciones farmacéuticas administradas pueden comprender al menos un inhibidor del FXII como único compuesto activo, o pueden administrarse en combinación con uno o más compuestos, composiciones o materiales biológicos adicionales. Algunos ejemplos de compuestos adicionales incluyen los esteroides, en particular la cortisona.

En algunas realizaciones, los efectos del tratamiento con al menos un inhibidor del FXII en un trastorno neurotraumático pueden ser supervisados midiendo la extensión del daño tisular y/o el edema. Los procedimientos para medir la extensión del daño tisular pueden incluir, por ejemplo, histología, ensayos bioquímicos, colorimétricos e inmunológicos (Evans Blue-extravasado, tinción TTC, Western Blot, RT-PCR de mediadores inflamatorios), medición de la función neurológica o imágenes cerebrales (MRT, CT, PET). En algunas realizaciones, el daño tisular provoca una pérdida de la función neurológica que puede medirse mediante la evaluación de la función neurológica (Neuroscore).

En ciertas realizaciones de los procedimientos divulgados, los pacientes deben ser tratados de acuerdo con los estándares de atención establecidos para su presentación clínica.

II. Inhibidores del factor XII

Como se ha comentado anteriormente, los términos "Factor XII" y "FXII" se refieren cada uno a uno o a ambos del Factor XII (por ejemplo, el zimógeno o la forma precursora del péptido) y del Factor XII activado (FXIIa). Por lo tanto, los "inhibidores del FXII" pueden incluir inhibidores de uno o ambos FXII y FXIIa (también denominados aFXIIa), así como la activación del FXII, incluidos los productos de escisión del FXIIa alfa y FXIIa beta (también denominados FXIIf). Además, los anticuerpos anti-FXII incluyen anticuerpos que se unen e inhiben uno o ambos FXII y FXIIa. El término "inhibidor del FXII" también incluye un inhibidor del FXII que está vinculado a un polipéptido que prolonga la vida media, que en algunas realizaciones incluye un enlazador. Entre los ejemplos de inhibidores del FXII que pueden utilizarse se encuentran el rHA-Infestin-4, el SPINK-1, los anticuerpos anti-FXII, incluidas las versiones/fragmentos modificados de estas proteínas que conservan la capacidad de inhibir la activación del FXII. En una realización, el inhibidor del FXII es SPINK-1 o un SPINK-1 modificado. En una realización, el inhibidor del FXII es Infestin-4 o un Infestin-4 modificado o un anticuerpo anti-FXII.

El inhibidor del FXII es un inhibidor directo del FXII. El término inhibidor "directo" se refiere a un inhibidor que actúa por contacto (por ejemplo, unión) con el FXII (o FXIIa), es decir, el inhibidor del FXII se une al FXII y/o al FXIIa e inhibe su actividad y/o activación. Por el contrario, un inhibidor indirecto puede actuar sin entrar en contacto con la proteína FXII (o FXIIa). Por ejemplo, se puede utilizar un ARN antisentido para disminuir la expresión del gen del FXII, o una pequeña molécula puede inhibir los efectos del FXIIa a través de interacciones corriente abajo con los socios de reacción del FXIIa, como el Factor XI; éstos no interactúan directamente con la proteína FXII. Por lo tanto, un inhibidor indirecto, en contraste con un inhibidor directo, actúa corriente arriba u abajo de la proteína FXII. A continuación se presentan algunos ejemplos de inhibidores directos. En algunas realizaciones, los inhibidores del FXII son inhibidores no endógenos; es decir, no son inhibidores que se produzcan de forma natural (de forma endógena) en el respectivo cuerpo humano o animal. En algunas realizaciones el inhibidor del FXII no es un inhibidor del FXII como, por ejemplo, un inhibidor del C1.

En una realización, el inhibidor del FXII es un inhibidor específico del FXII, preferentemente un inhibidor específico del FXIIa.

Un inhibidor específico del FXII se refiere a un inhibidor que inhibe las serinproteasas plasmáticas u otras proteínas endógenas distintas del FXII y/o el FXIIa en una relación menor o igual al 25% si se utiliza en una relación molar de 1:1. En otras palabras: un inhibidor específico de FXII/FXIIa inhibe las serinproteasas plasmáticas distintas de FXII y/o FXIIa en menos o igual al 25% cuando dicho inhibidor se utiliza en una relación molar de 1:1 de la respectiva serinproteasa plasmática a dicho inhibidor. Preferentemente, el inhibidor del FXII inhibe las serinproteasas plasmáticas distintas del FXII y/o del FXIIa en una relación menor o igual al 20%, preferentemente en una relación menor o igual al 15%, preferentemente en una relación menor o igual al 10%, preferentemente en una relación menor o igual al 5%, preferentemente en una relación menor o igual al 1% si se utiliza en una relación molar de 1:1. Por ejemplo, un mAb específico de FXII inhibe la serinproteasa plasmática FXIa sólo en un 5%, en el que la relación molar de FXIa con dicho mAb es de 1:1, mientras que el mismo mAb de FXII inhibe el FXIIa al menos en un 80%, preferentemente al menos en un 90%.

En una realización de la invención, una de las otras serinproteasas plasmáticas se inhibe en más del 50% si se utiliza en una relación molar de 1:1 de la respectiva serinproteasa plasmática a dicho inhibidor.

En otra realización de la invención, otras dos serinproteasas plasmáticas se inhiben en más del 50% si se utilizan en una relación molar de 1:1 de la respectiva serinproteasa plasmática a dicho inhibidor.

En otra realización, el inhibidor del FXII es un inhibidor del FXII humano, incluyendo un anticuerpo monoclonal humanizado, preferentemente un anticuerpo monoclonal totalmente humano.

La "homología", como se utiliza en la presente memoria, se refiere al número porcentual de aminoácidos que son idénticos o que constituyen sustituciones conservadoras. La homología puede determinarse utilizando programas de comparación de secuencias como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395), que se incorpora en la presente memoria por referencia. De este modo, las secuencias de longitud similar o sustancialmente diferente a las citadas en la presente memoria podrían compararse mediante la inserción de huecos en el alineamiento, siendo dichos huecos determinados, por ejemplo, por el algoritmo de comparación utilizado por GAP.

En una realización, la formulación farmacéutica administrada comprende el inhibidor del FXII como única sustancia activa, es decir, el inhibidor del FXII no se utiliza en combinación con otro agente activo. Preferentemente, el inhibidor del FXII no se utiliza en combinación con un agente de unión a la fofatidilserina, por ejemplo, una composición de anexina V modificada.

A. Infestin-4

En una realización, la divulgación proporciona un inhibidor de FXII que comprende el dominio 4 de infestina (referido como "Infestina-4"). Las infestinas son una clase de inhibidores de la serina proteasa derivados del intestino medio del insecto hematófago Triatoma infestans, un importante vector del parásito Trypanosoma cruzi, conocido por causar la enfermedad de Chagas (Campos ITN et al. 32 Insect Biochem. Mol. Bio. 991-997, 2002; Campos ITN et al. 577 FEBS Lett. 512-516, 2004; documento WO 2008/098720). Este insecto utiliza estos inhibidores para evitar la coagulación de la sangre ingerida. El gen de la infestina codifica 4 dominios que dan lugar a proteínas que pueden inhibir diferentes factores de la vía de coagulación. En particular, el dominio 4 codifica una proteína (Infestin-4) que es un fuerte inhibidor del FXIIa. Se ha administrado Infestin-4 en ratones sin que se produzcan complicaciones hemorrágicas (documento WO 2008/098720 Hagedorn et al., Circulation 2010; 121:1510-17).

En varias realizaciones, un inhibidor del FXII comprende Infestin-4. El término "Infestin-4", como se utiliza en la presente memoria, abarca variantes o fragmentos del péptido de tipo salvaje que conservan la capacidad de inhibir el FXII. En algunas realizaciones, el Infestin-4 se elige por su capacidad de inhibir el FXIIa. En ciertas realizaciones, la Infestina-4 comprende una variante de la Infestina-4, en la que la variante comprende el dominio 4 de la Infestina y, opcionalmente, los dominios 1, 2 y/o 3 de la Infestina. En una realización, la Infestina-4 es una construcción de Infestina-4 marcada con (His)6. En otra realización, la infestina-4 es una proteína de fusión que comprende un socio de fusión, como un polipéptido potenciador de la vida media (por ejemplo, albúmina, un dominio Fc de una IgG o PEG), unido a la infestina-4. En algunas realizaciones, un enlazador conecta la pareja de fusión con Infestin-4. En varias realizaciones, la Infestina-4 es la proteína rHA-Infestina-4 descrita por Hagedorn et al. (Circulation 2010; 117:1153-60). En una realización, una composición comprende albúmina unida a la proteína rHA-Infestin-4 descrita por Hagedorn et al. (Circulation 2010; 117:1153-60) mediante un enlazador flexible. En ciertas realizaciones, se utilizan otros inhibidores del FXII de Infestin-4, cuyos ejemplos se describen en el documento WO 2008/098720 y en Hagedorn et al. (Circulation 2010; 117:1153-60).

Un ejemplo de secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje se presenta en SEQ ID NO: 1:

EVRNPCACFRNYVPVCGSDGKTYGNPCMLNCAAQTKVPGLKLVHEGRC.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "variante" de Infestin-4 se refiere a un polipéptido con una o más mutaciones de aminoácidos, donde la "mutación" se define como una sustitución, una supresión o una adición a la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1). El término "Infestin-4" engloba estas variantes de Infestin-4. El término "variante" de Infestin-4 también incluye fragmentos del tipo salvaje o una secuencia mutada de Infestin-4. En varias realizaciones, la una o más mutaciones en la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje no alteran sustancialmente la capacidad funcional del polipéptido para inhibir el FXII. En algunas realizaciones, la una o más mutaciones no eliminan completa o sustancialmente la capacidad del polipéptido de inhibir el FXII (por ejemplo, la variante conserva al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o más de la capacidad inhibitoria de la Infestina-4 de tipo salvaje). A continuación, se ofrecen otros ejemplos de estas variantes.

En una realización, una variante de Infestin-4 comprende la secuencia de aminoácidos VRNPCACFRNYV (SEQ ID NO: 20, que son los restos 2-13 de SEQ ID NO: 1) del amino terminal de la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje. En ciertas realizaciones, la variante puede comprender los restos 2-13 de SEQ ID NO: 1 y también comprende al menos una, y opcionalmente hasta cinco, mutaciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje, fuera de los restos 2-13 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la variante conserva seis restos de cisteína conservados de la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje, y/o una homología de al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje. En algunas realizaciones, una variante de Infestin-4 comprende los aminoácidos conservados de la región N-terminal 2-13 de la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje, y al menos una, y opcionalmente hasta cinco, mutaciones de aminoácidos fuera de estos aminoácidos N-terminales conservados, lo que resulta en diferencias de la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje. Como se utiliza en la presente memoria, el término "fuera de los aminoácidos N-terminales" de una variante de Infestin se refiere a cualquier aminoácido a lo largo de la cadena polipeptídica de la variante que no sea el tramo contiguo de aminoácidos que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20: v Rn PCACFRNYV, que son los aminoácidos 2-13 de SEQ ID NO: 1.

En otra realización, una variante de Infestin-4 comprende seis restos de cisteína conservados y/o tiene una homología de al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje. En una realización, los seis restos de cisteína conservados son aminoácidos en las posiciones 6 , 8 , 16, 27, 31 y 48 de la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje, SEQ ID NO: 1. En una realización, la variante comprende la cisteína final conservada en la posición 48. En otras realizaciones, las posiciones exactas de los restos de cisteína, y las posiciones relativas entre sí, pueden cambiar con respecto a las posiciones 6 , 8 , 16, 27, 31 y 48 de la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje debido a inserciones o deleciones en la variante de Infestin-4. No obstante, en estas realizaciones, una variante de Infestin-4 comprende las seis cisteínas y/o puede compartir el 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o cualquier porcentaje intermedio de homología con la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante de Infestin-4 conserva los aminoácidos 2-13 de SEQ ID NO: 1 así como los seis restos de cisteína, y puede compartir el 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o cualquier porcentaje intermedio de homología con la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje.

En algunas realizaciones, la variante de Infestin-4 comprende SEQ ID NO: 21: DSLGREVRNPCA. En algunas realizaciones, esta secuencia se añade en o cerca del N-terminal de un fragmento o secuencia de Infestin-4 de longitud completa y deriva de la proteína humana SPINK-1.

En algunas realizaciones, una variante de Infestin-4 comprende una construcción de fusión entre la Infestin-4 de tipo salvaje o una variante de Infestin-4 y la albúmina humana (denominada "HA"). En algunas realizaciones, la HA es una proteína recombinante (denominada "rHA"). En ciertas realizaciones, las proteínas Infestin-4 y HA se unen directamente, o a través de un polipéptido enlazador.

En una realización, el inhibidor de FXII comprende una variante de la secuencia polipeptídica de Infestin-4 de tipo salvaje, en la que la variante comprende los aminoácidos N-terminales 2-13 de SEQ Id NO: 1; al menos una, y opcionalmente hasta cinco, mutaciones de aminoácidos fuera de los aminoácidos N-terminales; seis restos de cisteína conservados; y/o homología de al menos el 95%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con la secuencia de Infestin-4 de tipo salvaje.

En varias realizaciones, se proporciona una variante de Infestin-4 que conserva la capacidad de inhibir el FXII. La actividad inhibidora funcional puede evaluarse, por ejemplo, mediante la caracterización in vitro y/o in vivo , incluidos los ensayos directos para probar la inhibición de la actividad de la enzima FXII, el tiempo de coagulación prolongado (por ejemplo, el tiempo de tromboplastina parcial activado, aPTT), las pruebas clínicas de coagulación que abordan la vía intrínseca de la coagulación, o los procedimientos in vivo que evalúan la coagulación.

Otros ejemplos de variantes de Infestin-4 son los mutantes de SPINK-1, que se describen a continuación.

B. Anticuerpos FXII

En varias realizaciones, el inhibidor del FXII es un anticuerpo anti-FXII que se une al FXII y/o al FXIIa e inhibe o reduce la activación y/o actividad del FXII. El término "anticuerpo antifactor XII" abarca los anticuerpos de longitud completa y sus fragmentos funcionales (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno como Fab, F(ab)2, Fv y scFv). El término también abarca los anticuerpos policlonales y monoclonales y los anticuerpos de cualquiera de los isotipos como IgM, IgD, IgA, IgG e IgE, y cualquier subclase de los mismos, como IgG-i, El anticuerpo puede ser de una especie de mamífero como el humano, el ratón, la rata, el conejo, la cabra, el hámster o el mono. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser humanizado o injertado con c Dr . En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser mutado o modificado para alterar la inmunogenicidad, la vida media, y/o para impartir otras propiedades ventajosas asociadas a un anticuerpo terapéutico. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-FXII que se une a un epítopo de la cadena pesada o de la cadena ligera del FXII, como un epítopo neutralizante. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede estar conjugado con un polipéptido, un ácido nucleico o una pequeña molécula. Un "anticuerpo anti-FXII" también incluye anticuerpos que se unen a y/o inhiben uno o ambos del zimógeno del FXII y la proteína activada (FXIIa), incluyendo los fragmentos de escisión del FXIIa alfa y del FXIIa beta. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente al FXIIa o a los fragmentos de la cadena alfa o beta del FXIIa.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FXII puede unirse e inhibir la activación y/o actividad del FXIIa. Los anticuerpos anti-FXII se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 2006/066878y en Ravon et al., Blood 86: 4134-43 (1995). Otros anticuerpos monoclonales (mAbs) contra el Factor XII humano incluyen el mAb B7C9 descrito por Pixley et al. (J Biol Chem 1987; 262, 10140-45); un mAb descrito por Small et al. (Blood 1985; 65:202-10); los anticuerpos monoclonales F1 y F3 descritos por Nuijens et al. (J. Biol. Chem. 1989; 264:12941-49); los anticuerpos monoclonales B6F5, C6B7 y D2E10 contra la cadena ligera del FXII descritos en el documento WO89/11865 un anticuerpo monoclonal que se une selectivamente al FXIIa-p sobre el FXII descrito en el documento WO90/08835 y el anticuerpo anti-FXII OT-2 descrito en el documento WO91/17258.

Otros anticuerpos monoclonales antifactor XII se describen en el documento WO 2013/014092 que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden tener una afinidad de unión más de 2 veces superior al Factor XIIa-beta humano que al FXII humano inactivado y pueden ser capaces de inhibir la actividad amidolítica del Factor XIIa humano.

Tabla 1.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-FXII comprende las secuencias de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la región variable de la cadena ligera (VL) presentadas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FXII comprende los HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y/o comprende los VCDR1, VCDR2 y VCDR3 que se muestran en la Tabla 1. El anticuerpo 3F7 como se describe en el documento WO 2013/014092 A1 es un ejemplo de dicho anticuerpo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una o más de las siguientes características: (a) se une al FXII humano; (b) comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que es idéntica en más de un 85% a la secuencia de SE^q ID NO: 6 , como más del 90%, 95%, 98% o 99% idéntica; (c) comprende una región variable de la cadena ligera (VL) que es más del 85% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 7, como por ejemplo más del 90%, 95%, 98% o 99% idéntica; (d) comprende una CDR1 de cadena pesada al menos 80% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 8 , como por ejemplo más del 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos, y/o CDR2 de la cadena pesada al menos 60% idénticos con SeQ ID NO: 9, como más del 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica, y/o la cadena pesada CDR3 al menos 80% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 11, como por ejemplo más del 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos; (e) comprende una cadena ligera CDR1 al menos 50% idéntica a SEQ ID NO: 13, tales como más del 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos, y/o al menos 50% idénticos a la cadena ligera CDR2 de SEQ ID NO: 14, como más del 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos, y/o al menos 50% idénticos a la cadena ligera CDR3, con la secuencia A-X1-W-X2-X3-X4-X5-R-X6-X7 (SEQ ID NO: 16), como más del 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos; en los que X1 puede ser A o S, X5 puede ser L o V, y los otros Xn pueden ser cualquier aminoácido; (f) se une al Factor XIIa-beta humano con una K^d mejor que 10-8M; (g) compite con Infestin-4 para unirse al Factor XIIa-beta humano; o (h) es una IgG humana o una variante funcional de la misma, preferentemente IgG4 humana o una variante funcional de la misma.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-FXII es un anticuerpo IgG que se une al FXII/FXIIa humano y comprende (a) una región VH que comprende la CDR1 de la cadena pesada como se establece en SEQ ID NO: 8 , CDR2 de la cadena pesada, como se indica en el SEQ ID NO: 10, y la cadena pesada CDR3 como se establece en el SEQ ID NO:

12; y/o (b) una región VL que comprende la CDR1 de la cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 13, CDR2 de la cadena ligera, como se establece en SEQ ID NO: 14, y el CDR3 de la cadena ligera como se establece en el SEQ ID NO: 16. Una CDR2 de la cadena pesada puede comprender la secuencia GIX1X2X3X4X5X6TVYADSVKG (SEQ ID NO: 10), en la que X1 es R, N o D, X2 es P, V, I o M; X3 es S, P o A; X4 es G, L, V o T; X5 puede ser cualquier aminoácido, preferentemente X5 es G, Y, Q, K, R, N o M; y X6 es T, G o S. Una CDR3 de cadena pesada puede comprender la secuencia ALPRSGYLX1X2X3X4YYYALDV (SEQ ID NO: 12), en la que X1 es I, M o V; X2 es S o K; X3 es P, K, T o H; y X4 es H, N, G o Q. Una cadena ligera CDR3 puede comprender la secuencia AX1WX2X3X4X5RX6X7 (SEQ ID NO: 16), en la que X1 es A o S; X2 es D, Y, E, T, W, E o S; X3 es A, N, I, L, V, P, Q o E; X4 es S, D, P, E, Q o R; X5 es L o V; X6 es G, L o K; y X7 es V, A, D, T, M o G.

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-FXII es un fragmento de un anticuerpo IgG que se une al FXII/FXIIa humano y comprende (a) una región VH que comprende la CDR1 de la cadena pesada como se establece en SEQ ID NO: 8 , CDR2 de la cadena pesada, como se establece en el SEQ ID NO: 9, y la cadena pesada CDR3 como se establece en el SEQ ID NO: 11; y/o (b) una región VL que comprende la CDR1 de la cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 13, CDR2 de la cadena ligera, como se establece en SEQ ID NO: 14, y el CDR3 de la cadena ligera como se establece en el SEQ ID NO: 15.

En varias realizaciones, el anticuerpo anti-FXII es un anticuerpo madurado por afinidad, quimérico, injertado con CDR o humanizado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-FXII se elige entre los anticuerpos VR115, VR112, VR24, VR110 y VR119 madurados por afinidad (en relación con el 3F7) (los SEQ ID NOs para HCDR 1-3 y LCDR1-3 de estos anticuerpos se muestran a continuación en la Tabla 2).

Tabla 2.

Como se ha señalado anteriormente, SEQ ID NO: 10 es una secuencia degenerada. VR119 comprende SEQ ID NO:

10 en la que X1 es N, X2 es V, X3 es P; X4 es L, X5 Y; y X6 es G. VR112 comprende SEQ ID NO: 10 en la que X1 es N, X2 es V, X3 es P, X4 es V, X5 es Q, y X6 es G. VR115 comprende SEQ ID NO: 10 en la que X1 es D, X2 es I, X3 es P, X4 es T, X5 es K, y X6 es G. VR110 comprende SEQ ID ⁿ O: 10 en la que X1 es D, X2 es M, X3 es P, X4 es T, X5 es K, y X6 es G. VR24 comprende un único LCDR1: SGSSEMTVHHYVY (SEQ ID NO: 17).

En las realizaciones que implican CDR de anticuerpos, las CDR se definen según el sistema de numeración KABAT (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD. (1991)).

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-FXII o un fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe el FXIIa-alfa humano, por ejemplo, en un ensayo de actividad amidolítica del FXIIa in vitro (documento WO 2013/014092), en más de un 40%, más de un 50% o más de un 60%, cuando se utiliza en una relación molar de 1:0,2 de FXIIa-alfa a anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe el Factor XIIa-alfa humano en más del 80%, más del 85% o más del 90%, cuando se utiliza en una relación molar de 1:0,5 de FXIIa-alfa a anticuerpo. En una realización, el anticuerpo logra una inhibición completa o casi completa (por ejemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) del FXIIa-alfa humano cuando se utiliza en una relación molar de 1:0,5. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una afinidad por el FXIIa humano que es al menos aproximadamente comparable a la del anticuerpo 3F7.

C. Inhibidores del FXII vinculados a los HLEP

Otro aspecto de la divulgación proporciona inhibidores del FXII unidos a socios de fusión, como polipéptidos potenciadores de la vida media (HLEP) o moléculas como el PEG. En una realización, los inhibidores del FXII son proteínas pequeñas. Por lo tanto, cabe esperar una rápida eliminación renal (como se observa en otras proteínas pequeñas) (Werle M y Bernkop-Schnurch A, Amino Acids 2006; 30:351-367,). Una forma de abordar la corta vida media plasmática de un compuesto polipeptídico es inyectarlo repetidamente o mediante infusión continua. Otro enfoque consiste en aumentar la vida media plasmática intrínseca del propio polipéptido. Por ejemplo, en una realización, los inhibidores del FXII están vinculados a proteínas que prolongan la vida media.

Un "polipéptido potenciador de la vida media" es un compañero de fusión polipeptídica que puede aumentar la vida media del inhibidor del FXII in vivo en un paciente o en un animal. Algunos ejemplos son la albúmina y las inmunoglobulinas y sus fragmentos, como los dominios Fc, o derivados, que pueden fusionarse con un inhibidor del FXII directamente o a través de un enlazador escindible o no escindible. Ballance et al. (documento WO 2001/79271) describió polipéptidos de fusión que comprendían una multitud de diferentes polipéptidos terapéuticos fusionados con albúmina de suero humano.

Los términos "albúmina" y "albúmina sérica" abarcan la albúmina humana (HA) y sus variantes, cuya forma madura completa se divulga en el presente documento (SEQ ID NO: 19), así como la albúmina de otras especies y sus variantes. Como se utiliza en el presente documento, "albúmina" se refiere a un polipéptido de albúmina o a una secuencia de aminoácidos, o a una variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En ciertas realizaciones, la albúmina se utiliza para estabilizar o prolongar la actividad terapéutica de un inhibidor del FXII. La albúmina puede proceder de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, el ser humano, el mono, la vaca, la oveja o el cerdo. La albúmina no mamífera también puede utilizarse e incluye, entre otras, la albúmina de pollo y de salmón. La porción de albúmina del polipéptido ligado a la albúmina puede proceder de un animal diferente al de la porción del polipéptido terapéutico. Véase el documento WO 2008/098720 para ejemplos de proteínas de fusión de albúmina.

En una realización, una variante de albúmina tiene una longitud de al menos 10, 20, 40, 50, 60 o al menos 70 aminoácidos (o cualquier longitud intermedia) o puede incluir 15, 20, 25, 30, 50 o más aminoácidos contiguos (o cualquier número intermedio) de una secuencia de albúmina humana (HA) (por ejemplo, SEQ ID NO: 19), o puede incluir parte o la totalidad de dominios específicos de la HA. Una variante de la albúmina puede incluir una sustitución, supresión o adición de aminoácidos, ya sea una sustitución conservadora o no conservadora, en la que dichos cambios no alteren sustancialmente el sitio activo, o el dominio activo, que confiere las actividades terapéuticas de los polipéptidos potenciadores de la vida media. Estas variantes pueden compartir una homología del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% (o cualquier porcentaje intermedio).

En algunas realizaciones, la variante de albúmina es un fragmento y puede comprender al menos un dominio completo de albúmina y/o fragmentos de esos dominios, por ejemplo los dominios 1 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO: 19), 2 (aminoácidos 195-387 de SEQ ID NO: 19), 3 (aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO 19), 1 2 (1-387 de SEQ ID NO: 19), 2 3 (195-585 de SEQ ID NO: 19) o 1 3 (aminoácidos 1-194 aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO: 19). Cada dominio se compone a su vez de dos subdominios homólogos, a saber, los restos 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, de SEQ ID NO: 19, con regiones enlazadoras flexibles entre subdominios que comprenden los restos Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315 y Glu492 a Ala511. Así, en algunas realizaciones, la variante de albúmina comprende al menos un subdominio completo de albúmina.

En ciertas realizaciones, otras proteínas estructural o evolutivamente relacionadas con la albúmina ("proteínas de la familia de la albúmina") pueden utilizarse como HLEP, incluyendo, pero sin limitarse a la alfa-fetoproteína (documento WO 2005/024044 Beattie y Dugaiczyk, 20 Gene 415-422, 1982), la afamina (Lichenstein et al. 269 (27) J. Biol. Chem.

18149-18154, 1994), y la proteína de unión a la vitamina D (Cooke y David, 76 J. Clin. Invertir. 2420-2424, 1985). Los genes que codifican estas proteínas representan un clúster multigénico con similitudes estructurales y funcionales que se sitúan en la misma región cromosómica en humanos, ratones y ratas. La similitud estructural de los miembros de la familia de la albúmina sugiere que pueden utilizarse como HLEP. Por ejemplo, se ha afirmado que la alfafetoproteína prolonga la vida media de un polipéptido terapéutico unido in vivo (documento WO 2005/024044). Por lo tanto, en algunas realizaciones, estas proteínas, o variantes de las mismas, que pueden ser capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica, pueden utilizarse como HLEPs unidas al FXII o al FXIIa y pueden derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, el ser humano, el mono, la vaca, la oveja o el cerdo, o no mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la gallina o el salmón. En algunas realizaciones, las variantes pueden comprender 10 o más aminoácidos de longitud, o pueden comprender unos 15, 20, 25, 30, 50 o más aminoácidos contiguos de la respectiva secuencia proteica de la que se derivan, o pueden incluir parte o la totalidad de dominios específicos de las respectivas proteínas. Las proteínas de fusión de los miembros de la familia de la albúmina pueden incluir variantes polimórficas de origen natural.

En ciertas realizaciones, se pueden utilizar moléculas de polietilenglicol (PEG) mono o poli (por ejemplo, 2-4) como socios de fusión y pueden extender la vida media in vivo . La pegilación puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación disponibles. Los procedimientos ejemplares para preparar productos proteicos pegilados pueden incluir generalmente (a) la reacción de un polipéptido con polietilenglicol (como un éster reactivo o un derivado aldehídico de PEG) en condiciones en las que la proteína se une a uno o más grupos PEG; y (b) la obtención del producto o productos de reacción. Existen varios procedimientos de fijación del PEG. Véase, por ejemplo, el documento EP 0401 384, de Malik et all., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992); Francis, Focus on Growth Factors, 3(2):4-10 (1992); documentos EP 0 154 316; EP 0401 384; WO 92/16221; WO 95/34326 ; Pat. de EE.UU. N° 5.252.714.

En algunas realizaciones, se puede utilizar una inmunoglobulina (Ig) como HLEP. El término "inmunoglobulina" abarca los fragmentos funcionales y sus variantes, como una región Fc o uno o más dominios constantes de Ig. En algunas realizaciones, la Ig comprende una región Fc o porciones del (de los) dominio(s) constante(s) de la inmunoglobulina. La región constante puede ser la de una inmunoglobulina IgM, IgG, IgD, IgA o IgE. En algunas realizaciones, la porción de polipéptido terapéutico está conectada a la Ig a través de la región bisagra del anticuerpo o de un enlazador peptídico, que puede ser escindible. Varias patentes y solicitudes de patente describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulina para prolongar la vida media de la proteína terapéutica in vivo (documentos US 2004/0087778, WO 2005/001025, WO 2005/063808, WO 2003/076567, WO 2005/000892, WO 2004/101740, US 6.403.077). Por lo tanto, en algunas realizaciones, las regiones de inmunoglobulina (por ejemplo, los dominios Fc, los fragmentos Fc de las inmunoglobulinas y sus variantes) se utilizan como HLEP. En algunas realizaciones, los inhibidores del FXII pueden fusionarse a dominios Fc o a porciones de regiones constantes de inmunoglobulinas como HLEPs. En algunas realizaciones, estas proteínas de fusión se preparan como moléculas recombinantes expresadas en células huésped procariotas o eucariotas, como bacterias, levaduras, plantas, animales (incluyendo insectos) o líneas celulares humanas o en animales transgénicos (documento WO 2008/098720).

Un ejemplo de proteína de fusión SPINK mutante-Fc, la proteína de fusión SPINK-K2-Fc, se describe en el documento WO 2008/098720.

D. Enlazadores

En varias realizaciones, se puede introducir un enlazador peptídico intermedio entre un polipéptido terapéutico y un HLEP. En una realización, se introduce un enlazador escindible, particularmente si e1HLEp tiene el potencial de interferir con la actividad específica del polipéptido terapéutico, por ejemplo, por impedimento estérico. En ciertas realizaciones, el enlazador es escindible por las enzimas implicadas en la coagulación, como las proteasas de coagulación de la vía intrínseca, extrínseca o común de coagulación. Las proteasas de coagulación de la vía intrínseca incluyen las proteasas de la vía de activación de contacto, por ejemplo, FXIIa, FXIa o FIXa. En una realización, el enlazador es escindido por el FXIIa. Las proteasas de la vía extrínseca incluyen las proteasas de la vía del factor tisular, por ejemplo, el FVIIa. Las proteasas de la vía común incluyen las proteasas implicadas en la conversión del fibrinógeno en fibrina, por ejemplo, FXa, FIIa y FXIIIa.

111. Composiciones farmacéuticas

En cualquiera de los diversos aspectos de la invención, el inhibidor del FXII puede tener una pureza superior al 80%, o superior al 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. En una realización, el inhibidor del FXII puede tener un estado de pureza farmacéutica superior al 99,9% con respecto a macromoléculas contaminantes, como otras proteínas y ácidos nucleicos, y puede estar libre de agentes infecciosos y pirogénicos.

En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica puede comprender al menos un aditivo como una carga, un agente de volumen, un tampón, un estabilizador o un excipiente. Algunas técnicas ejemplares de formulación farmacéutica se describen, por ejemplo, en la 2005 Physicians' Desk Reference, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Gennaro et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2000 Kibbe et al. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., Pharmaceutical Press, 2000. Los aditivos farmacéuticos incluyen, por ejemplo, manitol, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden contener también reactivos amortiguadores del pH y agentes humectantes o emulsionantes. En otras realizaciones, las composiciones pueden contener conservantes y/o estabilizadores. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma liofilizada o soluble estable. Los polipéptidos pueden ser liofilizados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones, se prepara una composición farmacéutica que comprende al menos un inhibidor del FXII para su uso en el tratamiento de un trastorno neurotraumático que es una lesión cerebral traumática. Por ejemplo, si se proporciona un polvo o una forma liofilizada del inhibidor del FXII (por ejemplo, por liofilización) y se desea un producto farmacéutico acuoso, el polvo puede disolverse mezclándolo con los componentes acuosos de la formulación farmacéutica y agitándolo mediante técnicas adecuadas como el vórtex o la agitación suave. Alternativamente, si se desea un producto farmacéutico acuoso y el inhibidor del FXII ya está en forma acuosa, los componentes pueden combinarse directamente antes de la administración. En ciertas realizaciones, el inhibidor del FXII se proporciona en forma liofilizada y se combina con componentes farmacéuticos acuosos (por ejemplo, componentes activos adicionales o componentes inactivos como cargas, estabilizadores, disolventes o portadores) antes de su administración.

La formulación de las composiciones farmacéuticas puede variar en función de la vía de administración prevista y de otros parámetros (véase, por ejemplo, Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a ed., APhA Publications, 2003). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede ser una torta o polvo liofilizado. La composición liofilizada puede ser reconstituida para su administración por inyección intravenosa, por ejemplo, con Agua Estéril para Inyecciones, USP. En otras realizaciones, la composición puede ser una solución estéril, no pirogénica. En otras realizaciones, la composición se suministra en forma de polvo, en una píldora o comprimido.

Las formulaciones del inhibidor del FXII pueden administrarse al paciente por cualquier medio de administración farmacéuticamente adecuado. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse por vía sistémica, como por vía parenteral, o por vía intratecal. Las formulaciones parenterales pueden administrarse por vía intravenosa o subcutánea, ya sea en forma de bolo o de infusión, según los procedimientos conocidos. Los portadores líquidos preferidos, que son bien conocidos para uso parenteral, incluyen agua estéril, solución salina, dextrosa acuosa, soluciones de azúcar, etanol, glicoles y aceites. Para el uso sistémico, la(s) proteína(s) terapéutica(s) puede(n) estar formulada(s) para una vía intravenosa o una vía arterial. Las formulaciones pueden administrarse de forma continua por infusión o por inyección en bolo.

Los comprimidos y cápsulas para la administración oral o rectal pueden contener excipientes convencionales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes o humectantes, etc. Las preparaciones líquidas orales o rectales pueden presentarse en forma de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes, elixires o similares, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Estos preparados líquidos pueden contener aditivos convencionales, como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Algunas formulaciones abarcan sistemas de liberación lenta, como un parche.

Las figuras muestran:

La Figura 1 muestra la reducción del tamaño de las lesiones en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 o FXII-/- en comparación con los controles tratados con NaCl o de tipo salvaje (BI/6 ), respectivamente, 24 horas después de la inducción del traumatismo. Se analizaron las tinciones con TTC de cortes cerebrales obtenidos de ratones machos y hembras para determinar el volumen de las lesiones. La deficiencia o inhibición del FXII reduce el tamaño de las lesiones 24 horas después de la inducción del traumatismo. (A) Volúmenes de las lesiones en ratones machos de tipo salvaje y fX iI_/" (n=19), (B) en ratones hembra (n=4 para BI/6 y n=5 para FXII_/") y (C) en animales tratados con rHA-Infestin-4 y controles (n=14 para rHA-Infestin-4 y n=13 para controles). *P<0,001, P<0,01, prueba t de Student no emparejada de dos colas, media+SEM.

La figura 2 muestra la preservación de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) 24 horas después de la inducción del traumatismo en los ratones FXII_/", en comparación con los controles de tipo salvaje (Bl/6 ). (A) Extensión de la extravasación de Evans Blue en el hemisferio lesionado determinada por fotometría (n=6 para FXII_/" y n=8 para Bl/6 ). (B) Contenido de agua cerebral como medida de edema cerebral en el hemisferio lesionado (n=8 para FXII_/" y n=9 para Bl/6 ). *P<0,05, prueba t de Student no emparejada de dos colas, media+SEM.

La figura 3 muestra la conservación de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) 24 horas después de la inducción del traumatismo en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los controles tratados con NaCl. La integridad de la BBB se analizó mediante (A) la extensión de la extravasación de Evans Blue (EB) en el hemisferio lesionado determinada por fotometría (n=5) y (B) el contenido de agua cerebral como medida del edema cerebral en el hemisferio lesionado (n=8 para rHA-Infestin-4 y n=9 para los controles). (C) Expresión proteica relativa de la proteína de unión estrecha Occludin (n=5) **P<0,01, *P<0,05, prueba t de Student no apareada, de dos colas, media+SEM.

La figura 4 muestra la disminución de la formación de trombos y la amortiguación de los procesos trombóticos 24 horas después de la inducción del traumatismo. (A) La expresión proteica relativa de la fibrina/fibrinógeno se analizó mediante Western blot y está reducida en los ratones FXII'/_ en comparación con los controles de tipo salvaje (Bl/6 ; n=3). (B) Se determinó la relación entre los vasos ocluidos y los vasos abiertos en el hemisferio lesionado en cortes cerebrales teñidos con H&E (n=5, 5 cortes por animal). Tinciones representativas (panel inferior) con vasos ocluidos (flecha) y vasos abiertos (asterisco). Se encontró una mejor relación en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los controles tratados con NaCl. *P<0,01, P<0,05, prueba t de Student no emparejada de dos colas, media+SEM.

La figura 5 muestra la protección de los procesos inflamatorios en los ratones FXII'/_ 24 horas después de la inducción del traumatismo. (A) La cuantificación de la infiltración de macrófagos en el hemisferio lesionado se analizó con tinción inmunohistoquímica contra macrófagos/microglía CD11b+ en el día 1 y se comparó con los controles de tipo salvaje (BI/6 ; n=4). Se midió la expresión génica relativa de las citocinas proinflamatorias TNFa (B) e lnterleucina-1p (C) en los ratones fX|I-/" en comparación con los controles de tipo salvaje (BI/6 ) y los ratones operados de forma simulada en las cortezas ipsilaterales (ipsi) tras la inducción del traumatismo (n=5). ***P<0,001, **P<0,01, *P<0,05, en comparación con BI/6 , ##P<0,01, #P<0,05 en comparación con animales operados de forma simulada, prueba t de Student no emparejada, de dos colas (A), ANOVA de 1 vía seguida de prueba post-hoc de Bonferroni, media+SEM.

La figura 6 muestra las citoquinas proinflamatorias en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los tratados con NaCl y los operados de forma simulada. Los procesos inflamatorios se amortiguan en los animales tratados con rHA-Infestin-4 24 horas después de la inducción del traumatismo. Se muestra la expresión génica relativa de las citocinas proinflamatorias TNFa (A) e lnterleucina-1p (B) en las cortezas ipsilaterales (ipsi; n=3). P<0,05 en comparación con los animales operados de forma simulada, ANOVA de 1 vía seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni, media+SEM.

La figura 7 muestra la reducción del tamaño de las lesiones en los ratones FXII-/" en comparación con los controles de tipo salvaje (BI/6 ) 3d después de la inducción del traumatismo. Los ratones deficientes en FXII están protegidos del daño tisular en el día 3. Se midieron los volúmenes de las lesiones en cortes de cerebro teñidos con TTC en ratones machos (n=9 para FXII-/" y n=14 para BI/6 ) y hembras (n=3). *P<0,01, prueba t de Student no apareada y de dos colas, media+SEM.

La figura 8 muestra la reducción del daño de la barrera hematoencefálica (BBB) 3d tras la inducción del traumatismo en los ratones FXII-/, en comparación con los controles de tipo salvaje (BI/6 ). La integridad de la BBB se conserva en los ratones FXII'/_ en el día 3 después de la inducción del trauma. La extensión de la extravasación de Evans Blue en el hemisferio lesionado se determinó mediante fotometría (n=4 para BI/6 y n=5 para FXII_/"). *P<0,001, prueba t de Student no apareada y de dos colas, media+SEM.

La figura 9 muestra que la acumulación de plaquetas intracerebrales y la trombosis son características patológicas de la lesión cerebral traumática. (A) La tinción inmunohistológica representativa del marcador plaquetario glicoproteína Ib (GPIb) del tejido cerebral humano traumatizado muestra una marcada deposición plaquetaria intravascular (flecha; el vaso no ocluido se indica con un asterisco; la barra de escala representa 100 |jm). (B) La tinción representativa con hematoxilina y eosina de una sección cerebral de ratón del hemisferio lesionado el día 7 después de la lesión por caída de peso muestra los vasos ocluidos (flechas; la barra de escala representa 100 jm ). (C) El flujo sanguíneo cerebral sobre la corteza parietal derecha (área de impacto) disminuye significativamente en 7 días. (E) La tinción representativa de hematoxilina y eosina de una sección del cerebro de un ratón del hemisferio lesionado el día 1 después de la criolesión muestra los vasos ocluidos (flecha; la barra de escala representa 100 jm ).

La figura 10 muestra que la acumulación de plaquetas intracerebrales en el día 7 después de la lesión por caída de peso está disminuida en los ratones con deficiencia de factor XII (FXII"/_). (A) El cálculo del índice de trombosis a partir de secciones cerebrales teñidas con hematoxilina y eosina muestra que los vasos ocluidos disminuyeron en los ratones FXII_/" en comparación con los ratones de tipo salvaje (WT) y los ratones FXlK reconstituidos con FXII humano (FXlK/hFXIl) (n=5 por grupo, ***P<0,001, **P<0,01). (B) El análisis de las tinciones de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la glicoproteína Ib (GPlb) y CD31 revela una marcada reducción de los depósitos plaquetarios intravasculares en el día 7 después de la inducción de la lesión en los ratones FXII'/_ en comparación con los ratones WT y los ratones FXlK/hFXII (n=4 por grupo, ***P<0,001). (C) El análisis de Western Blot utilizando un anticuerpo GPlb confirma que las plaquetas se acumulan en menor medida en los ratones FXII'/_ en comparación con los controles WT o los ratones operados de forma simulada. Las bandas se cuantificaron por densitometría en relación con el control de pactina. El panel inferior muestra dos blots representativos de cada grupo (n=5 por grupo, ***P<0,001, **P<0,01; UA= unidades arbitrarias).

La figura 11 muestra que la acumulación intracerebral de plaquetas en el día 1 (d1) y en el día 3 (d3) después de la criolesión está disminuida en los ratones con deficiencia de factor XII (FXII'/_). (A) El cálculo del índice de trombosis a partir de secciones cerebrales teñidas con hematoxilina y eosina muestra que los vasos ocluidos están disminuidos en los ratones FXII-/" cuando se comparan con los ratones de tipo salvaje (WT) y los ratones FXII-/" reconstituidos con FXII humano (FXlK/hFXII) (n=5 por grupo, ***P<0,001, **P<0,01). (B ) El análisis de Western Blot utilizando un anticuerpo contra la glicoproteína Ib (GPlb) confirma que las plaquetas se acumulan en menor medida en los ratones FXM-/“ cuando se comparan con los controles WT o los ratones operados de forma simulada (Sham). Las bandas se cuantificaron por densitometría en relación con el control de p-actina (n=5 por grupo, *P<0,05). (C) El análisis de las tinciones de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos GPIb y CD31 revela una marcada reducción de los depósitos plaquetarios intravasculares en los ratones FXII-/- en comparación con los ratones WT y FXN-/-/hFXN.

La figura 12 muestra que la deficiencia del factor XII (FXII) mejora el resultado después de una lesión por caída de peso. Los ratones con deficiencia de FXII (FXII-/-) desarrollan una puntuación de gravedad neurológica (NSS) significativamente menor que los ratones de tipo salvaje (WT) y los ratones FXII-/-reconstituidos con FXII humano (FXII-/-/hFXII) en el día 3 y en el día 7 después de un traumatismo cerebral difuso. Una hora (día 0) y 1 día después del traumatismo, los animales mostraron déficits neurológicos similares (n=10-13 por grupo, *P<0,05).

La figura 13 muestra que la deficiencia del factor XII (FXII) mejora el resultado después de la criolesión. (A) Volumetría de lesiones tras la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de secciones cerebrales de ratones machos de tipo salvaje (WT), ratones deficientes de FXII (FXII-/-), Ratones FXII-/-reconstituidos con FXII humano (FXII-/- hFXII), ratones hembra de tipo salvaje (WT fem) y ratones hembra FXII-/-(FXII-/- fem) se realizó el día 1 (d1) y el día 3 (d3) después del traumatismo cerebral focal. Los ratones FXII-/- macho y hembra muestran volúmenes de lesión significativamente reducidos en comparación con los ratones WT. El efecto beneficioso de la deficiencia de FXII puede revertirse mediante la aplicación de FXII humano (hFXII) (n=7 por grupo, **P<0,01, *P<0,05). (B ) Las imágenes seriales de RM de eco de gradiente ponderadas en T2 muestran lesiones hiperintensas en el d1 y en el día 7 (d7) después de la inducción del traumatismo en ratones WT y en ratones FXII-/-. Las áreas hipointensas que indican hemorragia intracerebral están ausentes en ambos grupos. El panel inferior muestra dos cortes cerebrales representativos por grupo y punto de tiempo. La volumetría de la lesión basada en la RM (panel superior) confirma el desarrollo de lesiones más pequeñas en los ratones FXII-/-(n=8-9 por grupo, *P<0,05). (C) La apoptosis neuronal está disminuida en los ratones FXII-/-. El panel muestra el número de neuronas positivas a TUNEL por corte de cerebro en el hemisferio lesionado en d1 y en d3. El número de neuronas apoptóticas está significativamente disminuido en los ratones FXII-/- en comparación con los controles WT (n=4 por grupo, ***P<0,001, *P<0,05, la barra de escala representa 50 pm).

La figura 14 muestra que la inhibición farmacológica del factor XII (FXII) con rHA-Infestin-4 disminuye la acumulación intracerebral de plaquetas y mejora el resultado tras un traumatismo cerebral por caída de peso. (A ) Los vasos ocluidos son más abundantes en los ratones tratados con vehículo y en comparación con los ratones tratados con rHA-Infestin-4. Este hallazgo se confirma al calcular el índice de trombosis a partir de secciones cerebrales teñidas con hematoxilina y eosina el día 7, mostrando una disminución altamente significativa de los vasos ocluidos en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 (n=5 por grupo, ***P<0,001). (B) El análisis de las tinciones de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la glicoproteína Ib (GPIb) y CD31 revela una marcada reducción de los depósitos plaquetarios intravasculares el día 7 después de la inducción de la lesión cuando los ratones fueron tratados con rHA-Infestin-4 (n=4 por grupo, ***P<0,001). (C) Los ratones tratados con rHA-Infestin-4 desarrollan una puntuación de gravedad neurológica (NSS) significativamente menor que los ratones tratados con vehículo (Vehicle) en el día 3 y en el día 7 después del traumatismo cerebral. Una hora (día 0) y 1 día después del traumatismo cerebral, los animales mostraron déficits neurológicos similares (n=13 por grupo, *P<0,05).

La figura 15 muestra que la inhibición farmacológica del factor XII con rHA-Infestin-4 disminuye la acumulación de plaquetas intracerebrales y proporciona protección frente al traumatismo cerebral focal. (A ) Los vasos ocluidos son más abundantes en los animales tratados con vehículo en comparación con los ratones tratados con rHA-Infestin-4, como se determina mediante el cálculo del índice de trombosis en el día 1 (d1) y en el día 3 (d3) después de la inducción de la lesión, mostrando un aumento altamente significativo de los vasos ocluidos en los animales tratados con vehículo (n=4 por grupo, ***P<0,001, **P<0,01, la barra de escala representa 100 pm). (B) El análisis de las tinciones de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la glicoproteína Ib (GPIb) y CD31 revela una marcada reducción de la agregación plaquetaria intravascular en los días 1 y 3 tras la inducción de la lesión cuando los ratones fueron tratados con rHA-Infestin-4 (n=4 por grupo, ***P<0,001). (C) La volumetría de las lesiones tras la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de secciones cerebrales de ratones tratados con vehículo y ratones tratados con rHA-Infestin-4 se realizó en el d1 y d3 después del traumatismo cerebral focal. Los ratones tratados con rHA-Infestin-4 están sustancialmente protegidos del traumatismo cerebral (n=7 por grupo, **P<0,01, *P<0,05). (D) Se evaluó el número de neuronas TUNEL-positivas por corte de cerebro después de la inmunomarcación para el marcador neuronal NeuN y la sujeción al ensayo TUNEL para detectar la apoptosis. El número de neuronas apoptóticas disminuye significativamente en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los controles tratados con vehículo en los días 1 y 3 (n=4 por grupo, **P<0,01, *P<0,05).

La figura 16 muestra que la deficiencia genética y la inhibición farmacológica del factor XII no provocan hemorragias tras la criolesión. El panel superior muestra cortes cerebrales representativos teñidos con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de ratones operados de forma simulada, ratones deficientes en FXII, ratones tratados con rHA-Infestin-4 y ratones deficientes en FXI. El panel inferior muestra la cantidad de hemoglobina en los hemisferios lesionados de ratones operados de forma simulada (Sham), ratones de tipo salvaje (WT), ratones deficientes de FXII (FXII-/), ratones tratados con vehículo (Vehicle), ratones tratados con rHA-Infestin4 y ratones deficientes de FXI (FXI-/) un día después de la inducción del traumatismo. Las concentraciones de hemoglobina en los grupos con inhibición del FXII se mantienen al nivel de los animales operados de forma simulada, los ratones FXI-/ muestran cantidades de hemoglobina altamente significativas (n=4-5 por grupo, ns=no significativo, ***P<0,001).

La figura 17 muestra la reducción de la infiltración de células inmunitarias 24 horas y 3 días después de la inducción de la lesión. La cantidad de neutrófilos Ly.6B.2 positivos se determinó inmunohistoquímicamente en los ratones FXII'/_- y en los tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los controles WT o tratados con NaCl, respectivamente.

Los ejemplos ilustran la invención. El ejemplo pretende ilustrar y en modo alguno limitar la presente divulgación. Otras realizaciones de las composiciones y procedimientos divulgados serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la consideración de la memoria y la práctica de las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento.

Ejemplo 1:

Procedimientos:

Ratones C57BI/6 de 6 semanas de edad de tipo salvaje (BI/6 ) y ratones deficientes en FXII (FXII-/-) fueron sometidos a TBI focal experimental utilizando un modelo de lesión criogénica cortical. Para la inhibición farmacológica del FXII activado, los ratones de tipo salvaje fueron tratados con rHA-Infestin-4 (200 mg/kg i.v.) 1h después de la inducción del trauma. El tamaño de la lesión se determinó por volumetría a partir de cortes de cerebro teñidos con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). Para evaluar el daño de la barrera hematoencefálica (BBB), se midió la extravasación intracerebral de azul de Evans (EB) mediante fotometría y se calculó la relación peso húmedo/peso seco para medir el contenido de agua cerebral (=edema). Se realizaron análisis de Western Blot (WB) y tinciones inmunohistoquímicas (IHC) para evaluar la expresión proteica de las proteínas de la unión estrecha y de la fibrina/fibrinógeno. La respuesta inflamatoria local tras el TBI se analizó mediante PCR e histología.

Resultados:

24 horas después de la inducción del traumatismo, se pudo observar una reducción significativa del tamaño de la lesión en los ratones FXII'/_, así como en los ratones de tipo salvaje tratados con rHA-Infestin-4, en comparación con los controles. La menor formación de trombos dentro de la vasculatura cerebral, así como la preservación de la integridad de la BBB, podrían identificarse como mecanismos subyacentes. Además, la inhibición del FXII amortiguó la respuesta inflamatoria local tras la LCT. Además, se observó una reducción del tamaño de la lesión y la preservación de la integridad de la BBB en los ratones FXII'/_ 3 días después de la inducción del traumatismo en comparación con los controles.

Conclusión:

El bloqueo del FXII protege de la LCT al reducir la "tromboinflamación". Por lo tanto, la inhibición del FXII es una estrategia prometedora para combatir el TBI y otros trastornos neurológicos, preferentemente neurotraumáticos.

Ejemplo 2:

Materiales y procedimientos:

Animales

Un total de 124 (110 machos y 14 hembras) ratones C57BI/6N (tipo salvaje), 55 (41 machos y 14 hembras) ratones con deficiencia de FXII (FXII"/_) (Pauer et al., 2004, Thromb Haemost 92:503-508), y 5 ratones machos con deficiencia de FXI (FXI'/_) (Gailani et al., 1997, Blood Coagul Fibrinolysis 8:134-144) se utilizaron en este estudio. Los ratones se alojaron en grupos de cinco a nueve con libre acceso a la comida y al agua y con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. En este estudio, todos los experimentos fueron aprobados por las autoridades institucionales y reguladoras y se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva de la u E 2010/63/UE y los criterios ARRIVE (Kilkenny et al., 2012, Osteoarthritis Cartilage 20:256-260).

Modelo de criolesión cortical

La criolesión cortical se indujo como se ha descrito anteriormente (Albert-Weissenberger et al., 2014, Frontiers in cellular neuroscience 8:269). Brevemente, ratones de 6 semanas de edad fueron anestesiados con inyecciones intraperitoneales de cetamina (0,1 mg/g) y xilacina (0,005 mg/g). Después de sujetar la cabeza del ratón en un marco estereotáctico (sistemas TSE) se realizó la cirugía en la corteza parietal derecha tras exponer el cráneo mediante una incisión en el cuero cabelludo. Se llenó un cilindro de cobre con un diámetro de punta de 2,5 mm con nitrógeno líquido (-196 °C) y se colocó en la corteza parietal derecha (coordenadas desde el bregma: 1.5 mm caudal, 1,5 mm lateral) durante 90 s. Los animales operados de forma simulada se sometieron al mismo procedimiento quirúrgico sin enfriar el cilindro de cobre.

Modelo de caída de peso

La lesión craneal cerrada experimental se realizó como se ha descrito previamente (Albert-Weissenberger et al., 2012, J Cereb Blood Flow Metab 32:1747-1756; Albert-Weissenberger et al., 2012, Exp Transl Stroke Med 4:1). Brevemente, tras la inducción de la anestesia con isoflurano, se colocaron ratones de 10 a 16 semanas de edad con respiración espontánea en un marco estereotáctico y se expuso el cráneo mediante una incisión longitudinal en la línea media del cuero cabelludo. Tras la identificación de la zona de impacto, se dejó caer una pesa con una punta roma recubierta de silicona con un impacto final de 0,01 J. La operación simulada incluía la anestesia y la exposición del cráneo, pero sin lesión por caída de pesa. El estado neuroconductual de los ratones se evaluó mediante la puntuación de gravedad neurológica (NSS), una puntuación compuesta que incluye tareas sobre la función motora, el estado de alerta y el comportamiento fisiológico; las puntuaciones más bajas indican menos déficits. Los ratones fueron evaluados 1 hora, 1 día, 3 días y 7 días después de la lesión por caída de peso. El personal que realizó los ensayos funcionales no conocía los grupos experimentales.

Tratamiento farmacológico

Una hora después de la inducción de la criolesión focal o de la lesión difusa por caída de peso, los ratones de tipo salvaje recibieron una única inyección intravenosa del inhibidor específico del FXII rHA-Infestin-4 (CSL Behring, Marburg, Alemania) a una dosis de 200 mg/kg de peso corporal. Los animales de control recibieron volúmenes iguales de cloruro de sodio al 0,9% (vehículo). La inyección intravenosa de 2 pg/g de peso corporal de FXII humano (hFXII) (Sekisui Diagnostics, ADG412H) 1 h después de la inducción de la lesión y de forma continua cada 72 h dio lugar a la reconstitución de los ratones FXII'/_.

Determinación del tamaño de la lesión tras la criolesión cortical

Veinticuatro horas o tres días después de la criolesión, los ratones fueron sacrificados; los cerebros se extrajeron rápidamente y se cortaron en cinco secciones coronales de 1 mm de grosor utilizando una matriz de cortes de cerebro de ratón (Harvard Apparatus). Los cortes se tiñeron durante 20 minutos a 37 °C con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC; Sigma-Aldrich) al 2% en PBS para visualizar la lesión. Los volúmenes de las lesiones se calcularon mediante volumetría (software ImageJ, National Institutes of Health, US) de forma ciega.

Formación de imágenes por resonancia magnética

La RMN se realizó repetidamente 1 día y 7 días después de la criolesión en una unidad de 3 Tesla (Vision; Siemens) bajo anestesia con ketamina (0,1 mg/g) y xilacina (0,005 mg/g). El protocolo incluía una secuencia coronal ponderada en T2 (grosor de corte de 2 mm), y una secuencia coronal de eco de gradiente ponderada en T2 sensible a la sangre CISS (Constructed Interference in Steady State; grosor de corte de 1 mm). Los volúmenes de las lesiones se calcularon mediante planimetría del área hiperintensa en imágenes CISS de alta resolución. Se examinaron además las imágenes del CISS para detectar posibles hemorragias intracerebrales.

Flujometría láser Doppler

Se utilizó la flujometría láser Doppler (Moor Instruments) para supervisar el flujo sanguíneo cerebral regional sobre la corteza parietal derecha (área de impacto). El flujo sanguíneo cerebral se midió en serie en la línea de base (antes de la inducción de la lesión), 1 hora, 3 y 7 días después de la inducción de la lesión.

Histología e inmunohistoquímica

Los cerebros de ratón crioembebidos se cortaron en cortes de 10 pm de espesor o de 15 pm de espesor (modelo de criolesión cortical y modelo de caída de peso, respectivamente) utilizando un criostato (Leica). Para evaluar el índice de trombosis se realizó una tinción con hematoxilina y eosina según los procedimientos estándar. Las tinciones se examinaron a ciegas y se contó el número de vasos sanguíneos ocluidos (Nocc) y no ocluidos (Nopen) dentro de los hemisferios lesionados en uno de cada diez cortes cerebrales con un aumento de 20 veces. El índice de trombosis se calculó mediante la siguiente ecuación: (Nocc/(Nopen+Nocc)) x100. Para evaluar los agregados de plaquetas dentro de los vasos del cerebro humano, se tiñeron secciones embebidas en parafina contra la glicoproteína Ib (GPIb; abcam, ab102647) según el protocolo del fabricante y luego se contratiñeron con hematoxilina para visualizar todos los núcleos. Para las tinciones de inmunofluorescencia, se aplicaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-GPIb (1:100, donación del Prof. Nieswandt, Rudolf-Virchow-Zentrum, Würzburg), anti-CD31 (Bio-Rad Laboratories, MCA2388GA, 1:100), anti-NeuN (Millipore, MAB377, 1:1000). Como anticuerpos secundarios se utilizaron Cy2 anti­ rata (Dianova, 122-225-167, 1:100), Cy3 anti-rata (Dianova, 712-165-150, 1:100) y DyLight 488 anti-ratón (abcam, ab96871, 1:100). La apoptosis neuronal se evaluó utilizando un kit de detección de la muerte celular in situ TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick-end Labeling) (Roche, Basilea, Suiza) según las instrucciones del fabricante. El número de neuronas apoptóticas se determinó a partir de tres campos con un aumento de 40 veces del hemisferio lesionado de dos cortes de cerebro bajo un microscopio Nikon Eclipse 50i equipado con la unidad de control de cámara DS-U3 DS y el software NIS-Elements (Nikon, Düsseldorf, Alemania). Para evaluar los agregados plaquetarios se cuantificaron dos cortes de cerebro por animal. Para el análisis cuantitativo utilizamos secciones de regiones cerebrales casi idénticas para una mejor comparación entre los grupos.

Análisis Western Blot

La inmunorreactividad de la GPIb (anti-GPIb, 1:500, obsequio del Prof. Nieswandt, Rudolf-Virchow-Zentrum, Würzburg) en las cortezas lesionadas se detectó mediante un análisis de Western Blot como se describió anteriormente (Langhauser et al., 2012, Blood, 120(19):4082-92| El análisis densitométrico de la GPIb se realizó de forma ciega utilizando el software ImageJ (National Institutes of health, USA) con p-Actina (Dianova, A5441, 1:500000) como control de carga para normalizar los niveles de GPIb detectados.

Cuantificación de la hemorragia intracerebral

La concentración de hemoglobina en el parénquima cerebral que se correlaciona con la extensión de la hemorragia se determinó espectrofotométricamente (Choudhri et al., 1997, Stroke 28:2296-2302). Veinticuatro horas después del traumatismo, los animales fueron sacrificados y se les extrajo el cerebro. Los hemisferios lesionados se sonificaron durante 60 s en 1,5 ml de agua enfriada con hielo y posteriormente se centrifugaron a 4 °C durante 30 min. Se añadió un ml de solución de Drabkin a 250 pl del sobrenadante y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. La absorbancia se midió a 540 nm (MultiskanEX, Thermo Scientific, Waltham, MA).

Diseño experimental

El número de animales necesarios para detectar un tamaño del efecto estandarizado en los volúmenes de las lesiones > 0,2 en el día 1 después de la criolesión cortical o NSS > 0,2 en el día 1 después de la lesión por caída de peso, respectivamente, se determinaron mediante el cálculo del tamaño de la muestra a priori con las siguientes hipótesis: a = 0,05, p = 0,2, media y desviación estándar (G*Power 3.0.10). Los ratones han sido asignados aleatoriamente a los grupos de tratamiento (aleatorización en bloque después de la criolesión y para lograr grupos equilibrados aleatorización estratificada después de la lesión por caída de peso). Para evitar prejuicios, los experimentos se han realizado y analizado de forma ciega.

Estadísticas

Todos los resultados se expresaron en forma de media ± SEM, excepto en el caso de las escalas de NSS, que se representan en forma de gráficos de dispersión que incluyen la mediana con el percentil del 25 % y el percentil del 75 % indicados entre paréntesis en el texto. Para el análisis estadístico se utilizó el paquete de software PrismGraph 5.0 (GraphPad Software). Se comprobó la distribución gaussiana de los datos con la prueba de Kolmogorov Smirnov y, en caso de medir los efectos de dos factores simultáneamente, se analizaron mediante ANOVA de dos vías con corrección post hoc de Bonferroni para los análisis multivariantes o, en caso de datos no paramétricos (NSS), la prueba de Kruskal Wallis con corrección post hoc de Dunns. En caso de medir el efecto de un factor, se aplicó el ANOVA de una vía con corrección post hoc de Bonferroni. Si sólo se comparaban dos grupos, se realizaba la prueba t de Student no apareada y de dos colas. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados:

La trombosis microvascular es una característica patológica común en la lesión cerebral traumática

En primer lugar, analizamos una muestra de cerebro humano obtenida tras un caso mortal de TBI, mostrando que las plaquetas se acumulan en los microvasos del cerebro traumatizado (Figura 9 A). En consecuencia, imitamos de cerca la LCT humana en ratones utilizando un modelo de caída de peso que da lugar a un traumatismo cerebral predominantemente difuso. Las tinciones con hematoxilina y eosina del tejido cerebral lesionado de los ratones de tipo salvaje mostraron numerosas oclusiones de las luces de los vasos (Figura 9 B). En consecuencia, encontramos acumulación intravascular de plaquetas. Curiosamente, el flujo sanguíneo cerebral en la zona de impacto disminuyó ligeramente con el tiempo, con una reducción significativa del flujo sanguíneo cerebral el día 7 después de la lesión por caída de peso (Figura 9 C). Cuando se indujo un traumatismo cerebral focal mediante criolesión cortical, se encontraron numerosos vasos ocluidos y acumulaciones intravasculares de plaquetas GPIb-positivas en el tejido cerebral cortical el día 1 y 3 después de la inducción de la lesión (Figuras 1 D). Estos resultados apoyan firmemente la hipótesis de que la trombosis microvascular es una característica patológica común en la LCT.

El factor XII contribuye a la trombosis microvascular en la lesión cerebral traumática

Para evaluar el impacto de FXII en la formación de trombos intracerebrales después de TBI, primero analizamos el tejido cerebral contusionado de ratones deficientes en FXII en comparación con ratones de tipo salvaje o ratones deficientes en FXII que fueron reconstituidos con inyecciones intravenosas de HFXII (FXII'/_ /hFXII). El día 7 después de la lesión por caída de peso, el análisis histológico de secciones cerebrales teñidas con hematoxilina y eosina demostró que había menos microvasos cerebrales ocluidos en los ratones FXII'/_ en comparación con los ratones de tipo salvaje o FXII-//hFXII (Figura 10 A). Detectamos sistemáticamente menos acumulaciones intravasculares de plaquetas positivas a la GPIb en los cerebros de los ratones deficientes en FXII (Figura 10 B). Además, los análisis de Western Blot confirmaron que la cantidad de plaquetas estaba significativamente disminuida en el tejido cerebral de los ratones deficientes en FXII (Figura 10 C). De forma similar a la lesión por caída de peso, se detectó un menor número de vasos cerebrales ocluidos por trombos (Figura 11 A), menos acumulaciones de plaquetas en la vasculatura cerebral (Figura 11 C) y una menor cantidad de plaquetas en el tejido cerebral (Figura 11 B) uno y tres días después de la criolesión focal en los ratones FXII-/- en comparación con los ratones de tipo salvaje.

En resumen, observamos que la trombosis microvascular inducida por la lesión y el daño cerebral podían reproducirse en ratones con deficiencia de FXII que fueron reconstituidos mediante la administración de hFXII. Esto demuestra por primera vez que la activación de la vía de coagulación intrínseca por el FXII desempeña un papel en la formación de trombos cerebrales postraumáticos. En consecuencia, concluimos que el FXII contribuye a la trombosis microvascular independientemente de la naturaleza de la LCT.

La deficiencia de factor XII da lugar a un mejor resultado tras una lesión cerebral traumática

Para evaluar la importancia patológica de la reducción de la trombosis intracerebral en los ratones deficientes de FXII, determinamos a continuación el impacto de la deficiencia de FXII en el resultado funcional tras la lesión por caída de peso. La gravedad del traumatismo en las primeras fases (1 h y 1 día después de la inducción de la lesión) era comparable en todos los grupos, 3 días después de la lesión de la caída de peso los ratones FXII-/- se habían recuperado significativamente mejor que los ratones de tipo salvaje o FXII-/-/hFXII (mediana de NSS [percentil 25, percentil 75]: 4.0 [3,0, 4,0] en los ratones de tipo salvaje y 3,5 [3,0, 4,0] en los ratones FXII-/-/hFXII frente a 2,0 [1,0, 3.0] en los ratones FXII-/-, P<0,05, respectivamente; Figura 12). Es importante destacar que el mejor resultado neurológico en los ratones FXII-/- fue persistente hasta el día 7 (mediana de NSS [percentil 25, percentil 75]: 3.0 [2,0, 3.0] en los ratones de tipo salvaje y 2,5 [2,0, 3,0] en los ratones FXII-/-/hFXII frente a 1,0 [1,0, 2,5,0] en los ratones Fx II-/-, P<0,05, respectivamente; Figura 12).

A continuación, evaluamos el impacto de la deficiencia de FXII en el volumen de la lesión cortical y la neurodegeneración en el día 1 y 3 después de la criolesión. En los ratones machos, la deficiencia de FXII dio lugar a una reducción significativa de los volúmenes de las lesiones en los días 1 y 3, evaluados con tinción TTC de las secciones del cerebro (Figura 13 A). Dado que el género tiene un impacto significativo en el resultado clínico tras la LCT (Wright et al., 2014), sometimos a ratones hembra a criolesión. La deficiencia de FXII en ratones hembra también dio lugar a lesiones cerebrales significativamente más pequeñas en los días 1 y 3 en comparación con los ratones de tipo salvaje (Figura 13 A). Estas observaciones fueron corroboradas por estudios en los que se utilizó la resonancia magnética cerebral y se demostró que la deficiencia de FXII dio lugar a una reducción sostenida del tamaño de la lesión tras una lesión cerebral focal (Figura 13 B). La reducción del volumen de la lesión se acompañó de una disminución significativa de la apoptosis neuronal en los ratones con deficiencia de FXII el día 1 después de la criolesión en comparación con los ratones de control (Figura 13 C). Se observó una diferencia aún más pronunciada en la cantidad de células apoptóticas el día 3 después de la criolesión (Figura 13 C).

La inhibición farmacológica del Factor XII da lugar a una reducción de la trombosis microvascular y a un mejor resultado tras una lesión cerebral traumática

Para probar la eficacia de la inhibición farmacológica del FXII para el tratamiento de la trombosis patológica en la LCT, administramos el inhibidor selectivo del FXII activado, rHA-Infestin-4, 200 mg/kg de peso corporal por vía intravenosa y supervisamos la trombosis microvascular, el resultado funcional y los volúmenes de las lesiones en ratones sometidos a una lesión por caída de peso o criolesión. El análisis detallado de las secciones cerebrales teñidas con hematoxilina y eosina y la inmunohistoquímica que visualiza las plaquetas y el endotelio mostraron que menos trombos ocluyeron los microvasos cerebrales en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los ratones tratados con vehículo en ambos modelos de LCT (Figuras 14 A, 14 B, 15 A y 15 B).

La disminución de la formación de trombos en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 se asoció con un mejor resultado neurológico. Mientras que tras la lesión por caída de peso la gravedad inicial de los déficits neurológicos (1 h y día 1) era comparable entre los grupos de tratamiento (P>0,05), 3 y 7 días después del traumatismo los ratones tratados con rHA-Infestin-4 se habían recuperado significativamente mejor que los tratados con vehículo (día 3: mediana de la NSS [percentil 25, percentil 75]: 2.0 [2,0, 3,0] en ratones tratados con rHA-Infestin-4 frente a 3,0 [3,0, 3,0] en ratones tratados con vehículo, P<0,05; día 7: mediana de NSS [percentil 25, percentil 75]: 2.0 [1,5, 2,5] en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 frente a 3,0 [2,0, 5,0] en los ratones tratados con vehículo, P<0,05; Figura 14 C). Tras la criolesión, el volumen de la lesión y la neurodegeneración en los días 1 y 3 se redujeron en los ratones tratados con rHA-Infestin-4 en comparación con los tratados con vehículo. Para ambas lecturas, el efecto protector de rHA-Infestin-4 fue incluso más pronunciado el día 3 que el día 1 después de la criolesión (Figuras 7 C y 7 D).

De manera similar a la deficiencia de FXII, el tratamiento agudo de ratones con rHA-Infestin-4 previene la formación de trombos patológicos en la microcirculación cerebral en ambos modelos de TBI. La disminución de la formación de trombos se asocia a un mejor resultado neurológico conservado en fases posteriores al traumatismo cerebral (día 3, día 7), a un menor daño cerebral y a una menor neurodegeneración tras la lesión por caída de peso y por criolesión, respectivamente. Una única administración de rHA-Infestin-4 tras un traumatismo cerebral parece suficiente para proteger contra el deterioro de la lesión. En resumen, la inhibición farmacológica del FXII da lugar a una reducción de la trombosis microvascular y a un mejor resultado tras una LCT experimental.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor directo del Factor XII (FXII) para su uso en el tratamiento de lesiones traumáticas del cerebro (lesión cerebral traumática), en el que el inhibidor del FXII no es un inhibidor de la C1 esterasa, en el que el inhibidor del FXII comprende

(i) la secuencia polipeptídica de Infestin-4 de tipo salvaje definida por SEQ ID NO:1, o una secuencia polipeptídica que comprende:

(a) SEQ ID NO: 1 modificado para contener 1-5 mutaciones de aminoácidos fuera de las posiciones de aminoácidos N-terminal 2-13 de SEQ ID NO: 1; y/o

(b) una homología de al menos el 95%, el 98% o el 99% con la SEQ ID NO: 1 y reteniendo seis restos de cisteína conservados de SEQ ID NO: 1;

y/o

(ii) un anticuerpo anti-FXII.

2. Un inhibidor del FXII para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-FXII comprende

(i)

(a) una región VH que comprende la CDR1 de la cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 8, CDR2 de la cadena pesada, como se establece en el SEQ ID NO: 10, y la cadena pesada CDR3 como se establece en el SEQ ID NO: 12; y/o

(b) una región VL que comprende la CDR1 de la cadena ligera, como se establece en la SEQ ID NO: 13, CDR2 de la cadena ligera, como se establece en SEQ ID NO: 14, y el CDR3 de la cadena ligera como se establece en el SEQ ID NO: 16.;

o

(ii)

(a) una región VH que comprende la CDR1 de la cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 8, CDR2 de la cadena pesada, como se establece en el SEQ ID NO: 9, y la cadena pesada CDR3 como se establece en el SEQ ID NO: 11; y/o

(b) una región VL que comprende la CDR1 de la cadena ligera, como se establece en la SEQ ID NO: 13, CDR2 de la cadena ligera, como se establece en SEQ ID NO: 14, y el CDR3 de la cadena ligera como se establece en el SEQ ID NO: 15;

o

(iii) una región VH que comprende el SEQ ID NO: 6 y una región VL que comprende el SEQ ID NO: 7.

3. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo anti-FXII es un anticuerpo IgG.

4. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el al menos un inhibidor del FXII está unido a un socio de fusión que comprende PEG o un polipéptido potenciador de la vida media seleccionado entre albúmina, afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, albúmina humana, una inmunoglobulina y un Fc de una IgG.

5. Un inhibidor del FXII para su uso según la reivindicación 4, en el que el polipéptido potenciador de la vida media está unido al inhibidor del FXII mediante un enlazador.

6. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que el inhibidor del FXII es una proteína de fusión que comprende albúmina humana unida a un inhibidor del FXII mediante un péptido enlazador.

7. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el inhibidor del FXII se administra por vía intravenosa o subcutánea o intratecal.

8. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el inhibidor del FXII se administra (i) en una dosis única como inyección o infusión, (ii) en dosis múltiples, cada una como inyección o infusión, o (iii) como infusión o aplicación continua.

9. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el inhibidor del FXII se administra a una concentración que varía entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, o preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 mg/kg.

10. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el inhibidor del FXII se administra después de la lesión traumática.

11. Un inhibidor del FXII para su uso según la reivindicación 10, en el que la primera administración del inhibidor del FXII tiene lugar inmediatamente después de la lesión traumática, o hasta 24 horas, preferentemente hasta 12 horas, más preferentemente hasta 6 horas después de la lesión traumática.

12. Un inhibidor del FXII para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el inhibidor del FXII se administra al menos una vez, al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces o al menos cinco veces.