CN103990147A - Toll作用蛋白（Tollip）在脑卒中疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种Toll作用蛋白(Toll-interactingprotein，Tollip)基因在脑卒中疾病中的功能和应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以Tollip基因敲除小鼠为实验对象，通过大脑中动脉缺血再灌注模型，结果表明与野生型对照小鼠对比，Tollip基因敲除小鼠脑袋梗死体积明显减少，神经功能明显好转，脑袋死亡的细胞数量也明显减少。从而发现Tollip基因能够促进恶化神经系统并加重促进脑卒中的发生发展，Tollip可作为药物靶标筛选治疗脑卒中的药物，Tollip的抑制剂可用于制备治疗脑卒中的药物。

Description

Toll作用蛋白(Tollip)在脑卒中疾病中的应用

 

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种Toll作用蛋白（Tollip）在脑卒中疾病中的应用。

背景技术

缺血性脑卒中目前是全球第四大致死因素及第二大致残因素，其发后数分钟至数小时内即出现不可逆转的脑损伤，对患者的生命和健康造成严重危害。神经元细胞是中枢神经系统重要的组成部分，但其高代谢率降低了对缺血缺氧环境的耐受能力，因此较其他神经血管元件组分更易受到损伤。目前组织纤溶酶原激活剂( tPA)纤溶的治疗仍是缺血性脑卒中的主要治疗手段，但其仅 4.5 小时长的时间窗限制大部分患者只能接受对症治疗。研究表明，神经元保护策略可以在脑缺血损伤后较长时间内改善大脑功能，减少神经元细胞损失。凋亡是大脑缺血/再灌注过程中细胞死亡的基本机制之一，但其调控机制仍未完全阐明。因此，研究大脑缺血/再灌注时神经元细胞凋亡生存的分子机制，将有助于为神经元保护提供新的治疗策略和方法。

多数研究认为，恢复脑组织供血是治疗脑缺血最有效的方法。尽管 1996 年起组织纤溶酶原激活剂（tPA）即批准用于缺血性脑卒中治疗，迄今为止其仍然是美国药监局（FDA）唯一审核通过的溶栓药物。因为随时间延长出血风险增加，tPA的治疗时间窗仅为4.5小时；考虑到缺血性和出血性脑卒中在早期影像学不易鉴别，进一步延误了患者接受tPA治疗的机会。目前只有小于5%的缺血性脑卒中患者使用tPA溶栓治疗。此外，研究发现脑组织如果长时间严重缺血缺氧，即使在后期恢复脑血流仍会对脑组织造成不可逆转的损伤，因此当前仍迫切需要研究针对缺血缺氧和（或）再灌注所致病理生理学事件的治疗策略。自20世纪90年代以来，研究保护神经和脑组织的治疗策略一直是脑卒中治疗的热点，这些策略不仅可以延长tPA的治疗时间窗，也可以减轻缺血再灌注诱导的脑组织损伤。多种神经保护药物已在动物实验中取得了令人振奋的结果，但是进入脑卒中3期临床实验后，绝大部分药物均未取得预期效果，其首要失败的原因之一是大部分已知神经保护机制作用于在卒中后4-6小时以内，而临床实践中很难在如此短暂的时间窗内实施治疗，因此进一步阐明卒中发生后较长一段时间内促进或保护脑组织损伤的分子机制对于研究有效的卒中治疗靶点或者策略具有重要意义。

Toll样受体（TLR）介导的信号通路已被证实在天然免疫中发挥重要的作用，TLR被激活时，TLRs通过白介素1受体（IL-1R）招募胞浆蛋白MyD88，反过来又与IL-1R相关激酶（IRAK）作用，激活下游的相关信号通路。TLRs信号通路的激活是一把双刃剑：一方面可以通过刺激天然免疫应答和提高获得性免疫反应来保护机体，另一方面它所引起的持续性免疫反应也会对机体产生损伤。慢性炎症，感染性疾病以及肿瘤都与之相关。近期的研究表明，一些心血管疾病（如动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、心肌重构）的发生发展也与TLRs介导的信号转导密切相关（Xu XH et al. Toll-like receptor-4 is expressed by macrophages in murine and human lipid-rich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidized ldl. Circulation (2001);104:3103-8; Topkara VK et al. Therapeutic targeting of innate immunity in the failing heart. J Mol Cell Cardiol (2011);51:594-9.）。Toll作用蛋白( Toll－interacting protein，Tollip) 作为TLR 信号转导的负调节因子，通过下调TLR 信号转导而抑制细胞活化和炎症反应，从而在炎症反应的负调控中具有重要作用（Zhang G et al. Negative regulation of toll like receptor mediated signaling by Tollip. J Biol Chem (2002); 277: 7059－65）。我们已有研究证实Tollip同AKT作用抑制下游的信号通路，负性调节主动脉缩窄引起的心肌重构，从而保护心肌肥厚（Liu Y et al. Toll-Interacting Protein (Tollip) Negatively Regulates Pressure Overload-Induced Ventricular Hypertrophy in Mice. Cardiovascular Research (2014 ) ;101(1):87-96）。到目前为止国际上无文献报道有关Tollip在脑卒中疾病中应用的内容。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是确定Tollip基因的表达与脑卒中疾病之间的相互关系，提供一种Tollip作为药物靶标在筛选保护神经系统功能的药物中的应用，进而提供一种Tollip的抑制剂在制备保护神经功能的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以Tollip基因敲除小鼠为实验对象，通过小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤造成脑卒中模型，结果表明与野生型小鼠（对照组）相比，Tollip基因敲除小鼠梗死体积明显降低，神经功能明显好转。这提示Tollip基因具有恶化神经功能的作用，能加重促进脑卒中的发展，为研究防治脑卒中疾病的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。

因此，Tollip基因可作为药物靶点，构建Tollip基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/ 或治疗脑卒中的药物；Tollip基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/ 或治疗脑卒中的药物和/ 或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/ 或治疗脑卒中的目的。例如以Tollip为靶基因，设计可干扰Tollip表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA 干扰的方法使Tollip基因沉默来治疗脑卒中；还可以设计并构建Tollip的突变体，注射后进入细胞，竞争Tollip原形的作用底物，从而抑制Tollip的功能，起到治疗目的；此外，还可以以Tollip为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用Tollip基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制Tollip的分子，从而为脑卒中的治疗提供新的治疗性分子。

针对Tollip的上述功能，提供Tollip作为药物靶标在筛选治疗脑卒中的药物中的应用。

针对Tollip的上述功能，提供Tollip的抑制剂在制备治疗脑卒中的药物中的应用。

一种保护神经功能的药物，包含Tollip的抑制剂。

一种治疗脑卒中的药物，包含Tollip的抑制剂。

所述的Tollip的抑制剂优选为Tollip基因的siRNA、Tollip基因的RNA干扰载体，Tollip的抗体及其他能够抑制Tollip表达的抑制剂中的一种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明发现Tollip基因的新功能，即Tollip基因能够恶化脑卒中的作用。

2.基于Tollip基因在恶化脑卒中疾病中的功能，为研制脑卒中的药物提供靶标。

3. Tollip的抑制剂可用于制备保护神经功能和治疗脑卒中的药物。

附图说明

图1是WT和Tollip-KO小鼠脑缺血/再灌注损伤严重程度的评估结果图。

A为TTC染色结果图；

B为脑梗体积统计柱状图；

C为神经功能评分统计柱状图；

图2是Fluoro Jade B染色检测脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用11-12周龄、体重在25-30g，背景为雄性C57BL/6品系的野生型小鼠（WT，购自北京华阜康生物科技有限公司，质量合格证号：949431）、Tollip基因敲除小鼠（Tollip-KO，购买自 European Mouse Mutant Archive (EMMA)，货号EMMA01970）

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

 

【实施例1】 小鼠脑梗死模型（I/R）获得

1. 实验动物分组：雄性C57BL/6品系野生型小鼠及Tollip基因敲除小鼠，通过大脑中动脉缺血再灌注建立脑梗死模型（I/R）。随机分为2组，每组10只小鼠：C57BL/6品系野生型小鼠I/R术组（WT I/R）、Tollip基因敲除小鼠I/R术组（KO I/R）。

2. 线栓法脑梗死I/R手术采用MCAO（middle cerebral artery occlusion，大脑中动脉闭塞）模型操作流程： 

（1） 抓取小鼠，使用3%异氟烷麻醉小鼠，8%硫化钠脱去颈部的鼠毛，颅顶鼠毛用手术剪迅速剪掉，3%活力碘消毒颈部及颅顶皮2次，75%酒精脱碘1次；

（2） 在小鼠的颅顶部位横向切口，暴露颅骨，用镊子轻轻剥离颅骨表面的结缔组织。将激光多普勒血流仪的光纤探头用生物胶固定在前囟后方2mm，左侧5mm的部位；

（3） 将小鼠仰卧固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。在ECA    远心端用8-0线结扎，ECA近心端处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA、CCA；然后在ECA远心端结扎和近心端挂线中间剪一小口，将线栓由剪口送入到 CCA，并将 ECA近心端的挂线在剪口处打一活结，松紧度以线栓可自由进出但略带摩擦感为宜，再松ICA动脉夹，将线栓送入ICA，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在 9-11mm左右至血流下降遇阻力停。这时将绕在ECA近心端处活结轻轻系牢拴线，整个过程必须维持小鼠的肛温在37±0.5℃；

（4） 从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力停时开始计时，45min后先松开ECA近心端处活结，将线栓拔出，并将 ECA 近心端处活结扎紧，迅速松开CCA处动脉夹，并将ECA 近心端结扎（Sham组在从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力时抽出线栓）。注意观察血流恢复情况，选择血流下降75%以上，血流恢复达70%以上的小鼠纳入实验；

（5） 缝合小鼠颈部及头部皮肤，并用活力碘消毒伤口。手术结束后，将小鼠放在温箱中，箱温维持在 28℃，给水和饲料至取材。

【实施例2】 脑梗死模型（I/R）小鼠脑梗死体积测定

脑缺血/再灌注损伤严重程度的评估指标主要包括大脑梗死体积和神经功能评分，这些指标均与缺血/再灌注损伤严重程度正相关。

（1）分别在手术后24h，72h取材前进行神经功能及行为学评分； 

基于 Berderson神经功能评分改进方法（9 分制）：

0分：无神经受损的症状；

1分：提尾时对侧前肢蜷曲，或者不能完全到达患侧前肢；

2分：提尾时对侧肩膀内收；

3分：平推：向对侧推动时阻力下降；

4分：可自发的向各个方向运动，但在脱尾巴时只向对侧转弯；

5分：自发运动时转圈或只向对转；

6分：无自主运动，只在刺激时运动；

7分：无自主运动，刺激时也无运动；

8分：与脑缺血有关的死亡。

（2） 抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，剪开小鼠胸腔，剪破心脏放血；

（3） 体积分数75%酒精消毒后颈部皮肤，剪开后颈部皮肤，暴露头及颈部，从颈椎处剪断颈髓，分离除去后颈部肌肉，眼科剪纵向剪开脑干小脑外颅骨，用纹齿钳剥开颅骨，分离大脑表面的硬脑膜，避免硬脑膜划伤脑组织。取脑时从延髓开始，小心分离颅底组织，避免损伤大脑；

（4） 将取下的脑组织放入装有PBS的培养皿中润洗，用纱布吸干PBS，将脑组织放入1mm小鼠脑模，置于-20℃冰箱冻存（不超过4h）；

（5） 脑组织 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloricej, TTC)染色：从-20℃冰箱取出脑组织，立即切成1mm厚的切片，包括前囟前方切4片，后方切3片，共切7片。将切片立即置于10mL2% TTC溶液的血清瓶中，37℃恒温孵育10min。不时翻动切片，使组织均匀染色。正常脑组织染色后呈鲜红色，而梗死区呈苍白色；

（6） 脑组织固定：将烧杯里的脑组织及溶液一同转入做好标记的杯中，弃去TTC溶液，用10%中性福尔马林溶液固定脑组织切片，24h后拍照并用IPP软件分析；

（7） 脑梗体积计算：梗死体积% =（对侧大脑半球体积-梗死侧未梗死体积）/（对侧大脑半球体积×2）× 100%；

总梗死体积为各自7张脑片结果数据之和。

TTC是脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白色。

TTC染色结果如图1所示，经过I/R缺血45min再灌注24小时后Tollip-KO小鼠梗死体积较野生型小鼠降低；且这种保护作用在I/R术后72小时仍然持续，脑组织梗死比野生型小鼠均低，而神经功能评分在I/R术后24小时、72小时均改善。

    【实施例3】 脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定

1．脑组织冰冻切片制备

1） 实验小鼠按50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉；

2） 开胸暴露心脏，用注射针头穿刺如左心室，同时剪开右心房；

3） 用 0.1mol/L PBS（pH7.4）100mmHg压力灌流至肝脏变苍白后，用4%多聚甲醛灌流15min；

4） 开颅迅速取出小鼠大脑，室温4%多聚甲醛后固定6-8h；

5） 切除脑组织的嗅球和小脑，再延正中线将大脑分为先后两个部分，用先前的固定液再固定15min；

6） 随后浸没于含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液中，4℃冰箱沉底过夜；

7） 30%蔗糖与OCT 按1:1混合后，倒适量到包埋框中，将前一步的组织取出，在纱布上吸去液体后在该包埋框中浸泡一会儿，再将其转入到先已加入2滴OCT 的另一个包埋框中，调整组织的位置，使其正好位于包埋框的正中；

8）将盛组织的包埋框，移入干冰中，尽量使其处于水平位，稍待一会儿后，继续加入 OCT，浸没组织一定的高度，待 OCT 凝固后，将其储存于-80℃的冰箱中；

9）用冰冻切片机的标准程序切5um的冰冻切片备用。

2. FJB（Fluoro Jade B）染色

1）将冰切组织切片在烘箱中烘干1小时；

2）1% NaOH+80%无水乙醇 5min； 

3）70%无水乙醇 2min；

4）dd H2O 2min；

5）Flouro Jade B稀释液 (AG310, Millipore, Billerica, MA)，室温，避光20min；

6）dd H2O 1min X3；

7）在烘箱中烘片5-10min；

8）二甲苯 > 1min；

9）封片，拍照。

脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况测定结果见图2所示，我们检测了Tollip-KO小鼠和野生型小鼠I/R术后24小时脑组织梗死周边区神经元细胞凋亡情况。Fluoro Jade B细胞凋亡检测显示，Tollip-KO组小鼠的凋亡细胞数量明显比WT组小鼠少，这提示Tollip与神经元细胞缺血/再灌注时死亡相关。这些结果表明，抑制Tollip表达可以改善脑组织缺血再灌注损伤程度和神经元细胞凋亡。

我们的研究成果表明，Tollip KO小鼠在大脑中动脉缺血再灌注引起的损伤中，我们发现Tollip敲除后，小鼠梗死体积显著减少，神经功能明显改善，神经细胞凋亡也明显减少。说明Tollip基因在脑卒中疾病模型中有着重要的恶化作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.Tollip作为药物靶标在筛选保护神经系统疾病的药物中的应用。

2.Tollip作为药物靶标在筛选治疗神经系统疾病的药物中的应用。

3.Tollip的抑制剂在制备保护脑卒中疾病的药物中的应用。

4.一种保护脑卒中疾病的药物，其特征在于：包含Tollip的抑制剂。

5.Tollip的抑制剂在制备治疗脑卒中疾病的药物中的应用。

6.一种治疗脑卒中疾病的药物，其特征在于：包含Tollip的抑制剂。

7.根据权利要求3或5所述的应用，其特征在于：所述的Tollip的抑制剂优选为Tollip基因的siRNA、Tollip基因的RNA干扰载体或Tollip的抗体及其他能够抑制Tollip表达的抑制剂中的一种。

8.根据权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述的Tollip的抑制剂优选为Tollip基因的siRNA、Tollip基因的RNA干扰载体或Tollip的抗体及其他能够抑制Tollip表达的抑制剂中的一种。