ES2582313T3 - 5,6-dihidro-4H-pirrolo[1,2-a][1,4]-benzodiazepinas y 6H-pirrolo[1,2-a][1,4]benzodiazepinas antifúngicas sustituidas con fenil derivados - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I)**Fórmula** o forma estereoisomérica del mismo, en el que R1 es hidrógeno, halo, alquilo de C1-4 o alquil C1-4-oxi; R2 es hidrógeno o halo; R3 y R4 son hidrógeno; o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace;~ R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, alquil C1-4-sulfinilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo; R6 es hidrógeno o halo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un solvato del mismo.

Description

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R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace;

R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, alquil C1-4-sulfinilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo; R6 es hidrógeno o halo;

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables, y los solvatos de los mismos.

En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I) y a formas estereoisoméricas de los mismos,

en los que R1 es hidrógeno, halo, alquilo de C1-4 o alquil C1-4-oxi; R2 es hidrógeno o halo; R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace; R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo; R6 es hidrógeno o halo;

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables, y los solvatos de los mismos. En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I) y a formas estereoisoméricas de los mismos,

en los que R1 es hidrógeno, halo, alquilo de C1-4 o alquil C1-4-oxi; en particular, R1 es halo; R2 es hidrógeno o halo; R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace; R5 es alquil C1-4-carbonilo o alquil C1-4-sulfonilo; en particular, alquil C1-4-carbonilo; R6 es hidrógeno o halo;

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables, y los solvatos de los mismos. En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I) y a formas estereoisoméricas de los mismos,

en los que R1 es hidrógeno, halo, alquilo de C1-4 o alquil C1-4-oxi; en particular, R1 es halo; R2 es hidrógeno o halo; R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace; R5 es alquil C1-4-carbonilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo; R6 es hidrógeno o halo;

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables, y los solvatos de los mismos En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I) y a formas estereoisoméricas de los mismos,

en el que R1 es hidrógeno, halo, alquilo de C1-4 o alquil C1-4-oxi; en particular, R1 es halo; R2 es hidrógeno o halo; R3 y R4 son hidrógeno;

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R6 es hidrógeno o halo; y las sales de adición farmacéuticamente aceptables, y los solvatos de los mismos. En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I) y a formas estereoisoméricas de los mismos,

en los que

R1 es halo; en particular, cloro o fluoro; más particularmente, cloro;

R2 es hidrógeno o halo; en particular, hidrógeno, cloro o fluoro;

R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace;

R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo; en particular, metilcarbonilo, metilsulfonilo o 1-hidroxietilo;

R6 es hidrógeno o halo; en particular, hidrógeno o fluoro; más particularmente, hidrógeno;

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables de los mismos, y los solvatos de los mismos.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R1 es halo, alquilo de C1-4 o alquil C1-4-oxi; y en los que R2 es halo; en particular, en los que R1 y R2 son ambos halo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que al menos uno de R1 y R2 es diferente de hidrógeno.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R1 es halo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R2 es halo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R3 y R4 tomados juntos forman un enlace.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R5 es alquil C1-4-carbonilo; alquil C1-4-sulfonilo; o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R5 es alquil C1-4-carbonilo; en particular, metilcarbonilo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R5 es alquil C1-4-sulfonilo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R5 es metilcarbonilo, metilsulfonilo

o 1-hidroxietilo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R6 es halo.

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos tal como se menciona en cualquiera de las otras realizaciones, en los que R6 es hidrógeno.

Un grupo interesante de compuestos se refiere a compuestos de fórmula (I) novedosos, que tienen una o más de las fórmulas seleccionadas de (I-x) y (I-y) y a formas estereoisoméricas de los mismos

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en los que todos los sustituyentes tienen el mismo significado como se define en cualquiera de las realizaciones aquí anteriormente,

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables y los solvatos de los mismos. Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los mismos, que tienen la Fórmula (I-x).

Una realización de la presente invención se refiere a aquellos compuestos de fórmula (I) o cualquier subgrupo de los

mismos, que tienen la Fórmula (I-y). En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I-x) y (I-y) y a formas estereoisoméricas de los mismos, en los que

R1 es halo; en particular, cloro o fluoro; más particularmente, cloro; R2 es hidrógeno o halo; en particular, hidrógeno, cloro o fluoro; R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace; R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, alquil C1-4-sulfinilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto

de hidroxilo; en particular, R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo; más particularmente, metilcarbonilo, metilsulfonilo o 1-hidroxietilo; R6 es hidrógeno o halo; en particular, hidrógeno o fluoro; más particularmente, hidrógeno;

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables de los mismos, y los solvatos de los mismos. En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I-x) y a formas estereoisoméricas de los

mismos, en los que R1 es halo; en particular, cloro o fluoro; más particularmente, cloro; R2 es hidrógeno o halo; en particular, hidrógeno, cloro o fluoro; R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace; R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, alquil C1-4-sulfinilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto

de hidroxilo; en particular, R5 es alquil C1-4-carbonilo, alquil C1-4-sulfonilo, o alquilo de C1-4 sustituido con un resto de hidroxilo; más particularmente, metilcarbonilo, metilsulfonilo o 1-hidroxietilo; R6 es hidrógeno o halo; en particular, hidrógeno o fluoro; más particularmente, hidrógeno;

y las sales de adición farmacéuticamente aceptables de los mismos, y los solvatos de los mismos. En una realización, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I-y) y a formas estereoisoméricas de los

mismos, en los que R1 es halo; en particular, cloro o fluoro; más particularmente, cloro; R2 es hidrógeno o halo; en particular, hidrógeno, cloro o fluoro; R3 y R4 son hidrógeno;

o R3 y R4 tomados juntos forman un enlace;

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Los compuestos de fórmula (I) en los que R3 y R4 forman juntos un enlace adicional, representándose dichos compuestos mediante la fórmula (I-b), pueden prepararse a partir de los compuestos representados mediante la fórmula (I-a), siguiendo reacciones de oxidación de amina a imina conocidas en la técnica. Estas reacciones de oxidación pueden realizarse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (I-a) con un oxidante tal como, por

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Un producto intermedio de fórmula (VII) puede prepararse a partir de un producto intermedio de fórmula (VIII). Un producto intermedio de fórmula (VIII) puede hacerse reaccionar con una fuente de nitrógeno tal como NH3.H2O en presencia de HOBT y EDCI. Este tipo de reacción normalmente puede realizarse en un disolvente adecuado como DMF. La agitación de la mezcla de reacción puede potenciar la velocidad de reacción.

Un producto intermedio de fórmula (VIII) puede prepararse fácilmente tratando un producto intermedio de fórmula

(IX) con tetrahidro-2,5-dimetoxifurano en un disolvente inerte tal como dioxano en presencia de un ácido tal como hidrocloruro de piridina (1:1) a una temperatura elevada, preferiblemente a temperatura de reflujo. Alternativamente, también puede usarse un derivado de éster reactivo de (IX) en este tipo de reacción para preparar un producto intermedio de fórmula (VIII).

Los compuestos de la presente invención según la fórmula (I-c), en los que R5b se define como H-(CH2)1-3-CH(OH)-, y en los que los otros sustituyentes se definen como antes, se pueden preparar según el Esquema 2:

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Un compuesto de fórmula (I-ab) se puede preparar según los protocolos de reacción descritos en el Esquema 1. En la fórmula (I-ab), R5ab se define como alquil C1-3-carbonilo, y todos los otros sustituyentes son como se definen anteriormente.

El grupo carbonilo de R5ab en compuestos de fórmula (I-ab) se puede reducir para obtener compuestos según la fórmula (I-c). Típicamente, esta reacción se puede llevar a cabo en presencia de un agente reductor tal como, por ejemplo, hidruro de litio y aluminio (LiAlH4) o borohidruro de sodio (NaBH4). Esta reacción se puede llevar a cabo en presencia de un disolvente orgánico aprótico seco, habitualmente DCM, Et2O o THF, seguido de tratamiento acuoso.

Los compuestos de fórmula (I-f)

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R5f es alquilo de C1-4 sustituido con un grupo hidroxilo

en los que R5f representa alquilo de C1-4 sustituido con un resto hidroxilo, se pueden preparar usando protocolos de reacción análogos como se describen en el Esquema 1. En ese caso, se puede usar un intermedio de fórmula (XII-a) en lugar de un intermedio de fórmula (XII).

Un intermedio de fórmula (XII-a) se puede preparar según protocolos bien conocidos como se muestra en el Esquema 2b. En una primera etapa, el grupo hidroxilo de un intermedio de fórmula (XVIII) se puede bloquear mediante grupos protectores (PG). Se pueden desproteger tras una etapa de reacción. Los grupos protectores convencionales se pueden usar según práctica convencional. Típicamente, el grupo 2-tetrahidropiranilo se puede usar como un grupo protector para alcoholes. En ese caso, un intermedio de fórmula (XVIII) se puede hacer reaccionar con dihidropirano en presencia de un ácido tal como, por ejemplo, PPTS (ácido 4-metilbencenosulfónico). En una segunda etapa, un intermedio de fórmula (XIX) se conviente en un intermedio de fórmula (XII-a). Esto se hace típicamente con n-butil-litio en disolventes anhidros apróticos, por ejemplo THF en una primera etapa, seguido de adición de DMF en una segunda etapa. La reacción se puede llevar a cabo en una atmósfera inerte tal como, por ejemplo, N2.

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una sal de adición farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, a animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos.

Dichos métodos comprenden la administración, es decir la administración tópica o sistémica, preferiblemente administración oral, de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I), a animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos.

Los expertos en el tratamiento de tales enfermedades podrían determinar la cantidad diaria terapéutica eficaz a partir de los resultados de los ensayo presentados a continuación en el presente documento. Una cantidad diaria terapéutica eficaz sería de de aproximadamente 0,005 mg/kg a 50 mg/kg, en particular de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, más en particular de 0,01 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, lo más preferiblemente de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. La cantidad de un compuesto según la presente invención, también denominado en el presente documento como principio activo, que se requiere para lograr un efecto terapéutico variará, por supuesto, en una base de caso a caso, por ejemplo con el compuesto particular, la vía de administración, la edad y el estado del receptor, y el trastorno o enfermedad particular que está tratándose.

Un método de tratamiento también puede incluir la administración del principio activo en un régimen de entre una y cuatro tomas al día. En estos métodos de tratamiento, los compuestos según la invención se formulan preferiblemente antes de la administración. Tal como se describe a continuación en el presente documento, las formulaciones farmacéuticas adecuadas se preparan mediante procedimientos conocidos usando componentes bien conocidos y fácilmente disponibles.

Aunque es posible que el principio activo se administre solo, es preferible presentarlo como una composición farmacéutica.

La presente invención también proporciona composiciones para tratar o prevenir infecciones fúngicas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El portador o diluyente debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la composición y no perjudicial para los receptores de la misma.

Los compuestos de la presente invención, que son adecuados para tratar o prevenir infecciones fúngicas, pueden administrarse solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La terapia de combinación incluye la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica que contiene un compuesto de fórmula (I) y uno o más agentes terapéuticos adicionales, así como la administración del compuesto de fórmula (I) y cada agente terapéutico adicional en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, un compuesto de fórmula (I) y un agente terapéutico pueden administrarse juntos al paciente en una única composición de dosificación oral, tal como un comprimido o una cápsula, o cada agente puede administrarse en formulaciones de dosificación oral separadas.

En vista de sus propiedades farmacológicas útiles, los compuestos objeto pueden formularse en diversas formas farmacéuticas para fines de administración. Los compuestos según la invención, en particular los compuestos según la fórmula (I), una sal de adición de ácido o base farmacéuticamente aceptable de los mismos, una forma estereoquímicamente isomérica de los mismos, o cualquier subgrupo o combinación de los mismos pueden formularse en diversas formas farmacéuticas para fines de administración. Como composiciones apropiadas, pueden mencionarse todas las composiciones empleadas habitualmente para fármacos de administración sistémica.

Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, se combina una cantidad eficaz del compuesto particular, opcionalmente en forma de sal de adición, como principio activo, en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, portador que puede adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas están deseablemente en forma de dosificación unitaria adecuada, en particular, para administración por vía oral, por vía rectal, por vía percutánea, mediante inyección parenteral o mediante inhalación. Por ejemplo, en la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y disoluciones; o portadores sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos. Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan las formas unitarias de dosificación oral más ventajosas, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. Para composiciones parenterales, el portador comprenderá habitualmente agua estéril, al menos en gran parte, aunque pueden incluirse otros componentes, por ejemplo, para ayudar en la solubilidad. Pueden prepararse disoluciones inyectables, por ejemplo, en las que el portador comprende disolución salina, disolución de glucosa o una mezcla de disolución salina y disolución de glucosa. Pueden prepararse disoluciones inyectables, por ejemplo, en las que el portador comprende disolución salina, disolución de glucosa o una mezcla de disolución salina y disolución de glucosa. Pueden formularse disoluciones inyectables que contienen compuestos de fórmula (I) en un aceite para

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consiste en una fase tal como se define en termodinámica, una dispersión sólida de este tipo se denominará “una disolución sólida”. Las disoluciones sólidas son sistemas físicos preferidos porque los componentes en las mismas habitualmente están fácilmente biodisponibles para los organismos a los que se administran. Esta ventaja puede explicarse probablemente por la facilidad con la que dichas disoluciones sólidas pueden formar disoluciones líquidas cuando se ponen en contacto con un medio líquido tal como los jugos gastrointestinales. La facilidad de disolución puede atribuirse al menos en parte al hecho de que la energía requerida para la disolución de los componentes a partir de una disolución sólida es inferior a la requerida para la disolución de los componentes a partir de una fase sólida cristalina o microcristalina.

La expresión “una dispersión sólida” también comprende dispersiones que son menos homogéneas por todas partes que disoluciones sólidas. Tales dispersiones no son química ni físicamente uniformes por todas partes o comprenden más de una fase. Por ejemplo, la expresión “una dispersión sólida” también se refiere a un sistema que tiene dominios o regiones pequeñas en las que se dispersa compuesto de fórmula (I) amorfo, microcristalino o cristalino, o polímero soluble en agua amorfo, microcristalino o cristalino, o ambos, más o menos uniformemente en otra fase que comprende polímero soluble en agua, o compuesto de fórmula (I), o una disolución sólida que comprende compuesto de fórmula (I) y polímero soluble en agua. Dichos dominios son regiones dentro de la dispersión sólida marcadas de manera distintiva por alguna característica física, de tamaño pequeño, y distribuidas uniforme y aleatoriamente por toda la dispersión sólida.

Además, puede ser conveniente formular los presentes compuestos antifúngicos en forma de nanopartículas que tienen un modificador de superficie adsorbido sobre la superficie de las mismas en una cantidad suficiente para mantener un tamaño de partículas medio eficaz de menos de 1000 nm. se cree que los modificadores de superficie útiles incluyen los que se adhieren físicamente a la superficie del agente antifúngico pero no se unen químicamente al agente antifúngico.

Los modificadores de superficie adecuados pueden seleccionarse preferiblemente de excipientes farmacéuticos orgánicos e inorgánicos conocidos. Tales excipientes incluyen diversos polímeros, oligómeros de bajo peso molecular, productos naturales y tensioactivos. Los modificadores de superficie preferidos incluyen tensioactivos no iónicos y aniónicos.

Aún otro modo interesante de formular los presentes compuestos implica una composición farmacéutica mediante la cual los presentes antifúngicos se incorporan en polímeros hidrófilos y la aplicación de esta mezcla como película de recubrimiento sobre muchas perlas pequeñas, produciendo así una composición que puede fabricarse convenientemente y que es adecuada para preparar formas de dosificación farmacéuticas para administración oral.

Dichas perlas comprenden un núcleo central, redondeado o esférico, una película de recubrimiento de un polímero hidrófilo y un agente antifúngico y una capa de recubrimiento sellante.

Materiales adecuados para uso como núcleos en las perlas son múltiples, siempre que dichos materiales sean farmacéuticamente aceptables y tengan firmeza y dimensiones apropiadas. Los ejemplos de tales materiales son polímeros, sustancias inorgánicas, sustancias orgánicas, y sacáridos y derivados de los mismos.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación.

Forma de dosificación unitaria, tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Los ejemplos de tales formas de dosificación unitarias son comprimidos (incluyendo comprimidos ranurados o recubiertos), cápsulas, pastillas, supositorios, paquetes de polvo, obleas, disoluciones o suspensiones inyectables, cucharillas, cucharadas y similares, y múltiplos segregados de los mismos.

Puesto que los compuestos según la invención son compuestos administrables por vía oral potentes, son especialmente ventajosas composiciones farmacéuticas que comprendan dichos compuestos para administración por vía oral.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención.

Parte experimental

A continuación en el presente documento, el término “DCM” significa diclorometano; “LCMS” significa cromatografía de líquidos/espectrometría de masas; “TLC” significa cromatografía de capa fina; “DIPE” significa éter diisopropílico; “PE” significa éter de petróleo; “TFA” significa ácido trifluoroacético; “HPLC” significa cromatografía de líquidos de alta resolución; “r.t.” significa temperatura ambiente; “p.f.” significa punto de fusión; “min” significa minuto(s); “h” significa hora(s); “EtOAc” significa acetato de etilo; “EtOH” significa etanol; “r.m.” significa mezcla(s) de reacción; “c.s.” cantidad suficiente; “THF” significa tetrahidrofurano; “HOAc” significa ácido acético; “HOBT” significa 1-hidroxi1H-benzotriazol; “Me2S” significa sulfuro de dimetilo; “PPTS” significa ácido 4-metil-bencenosulfónico, compuesto

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El intermedio 4 (29 g, 143 mmoles) se disolvió en THF (200 ml). Se añadió una disolución 10 M de BH3.Me2S (15,45 ml, 154,5 mmoles) lentamente a la disolución bajo una atmósfera de N2. La r.m. se agitó y se puso a reflujo toda la noche. Después, la mezcla se enfrió y se acidificó con HCl 6 N hasta pH 1. Subsiguientemente, la mezcla se agitó y se puso a reflujo durante 30 min. La mezcla se enfrió de nuevo y se vertió en agua con hielo. Esta mezcla se ajustó hasta pH 8-9 con NaOH, y después se extrajo con EtOAc. La capa orgánica separada se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró. El residuo se disolvió en HCl/dioxano. El disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se lavó con DCM (50 ml). El sólido se separó por filtración y se secó a vacío. Rendimiento: 22 g de intermedio 5 (64,7% de rendimiento; .HCl).

Ejemplo A3

a) Preparación del intermedio 6

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Se añadió tetrahidro-2,5-dimetoxifurano (49,9 g, 0,378 moles) a una disolución de 2-amino-4-clorobenzonitrilo (50,0 g, 0,328 moles) en HOAc (300 ml). La r.m. se agitó y se puso a reflujo durante 2 h, y después se enfrió. Subsiguientemente, el disolvente se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (eluyente: DCM). Las fracciones del producto se recogieron, y el disolvente se evaporó. Rendimiento: 13 g de intermedio 6 (98,4% de rendimiento).

b) Preparación del intermedio 7

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El intermedio 6 (33 g, 0,163 moles) se disolvió en THF (250 ml). Se añadió lentamente una disolución 10 M de BH3 en Me2S (17,6 ml, 0,176 moles) a la disolución una atmósfera de bajo N2. La r.m. se agitó y se puso a reflujo toda la noche. Subsiguientemente, la mezcla se enfrió y se acidificó con una disolución 6 N de HCl hasta pH 1. La mezcla se agitó y se puso a reflujo de nuevo durante 30 min. La mezcla se enfrió y se vertió en agua con hielo. Esta mezcla se ajustó hasta pH 8-9 con NaOH, y después se extrajo con EtOAc. La capa orgánica separada se secó (Na2SO4), se filtró, y el disolvente se evaporó. El residuo se disolvió en HCl/dioxano. El disolvente de esta disolución se evaporó, y el residuo se lavó con DCM (50 ml). El sólido se separó por filtración y se secó a vacío. Rendimiento: 23,5 g de intermedio 7 (59,4% de rendimiento; .HCl).

Ejemplo A4

a) Preparación del intermedio 8

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Una mezcla de 3,5-difluorobencenamina (129 g, 1,00 moles) y HCl concentrado (350 ml) en H2O (2 l) se añadió a una mezcla de 2,2,2-tricloro-acetaldehído (179 g, 1,22 moles) y Na2SO4 (1500 g) en H2O (2 l). Subsiguientemente, se añadió NH2OH.HCl (207 g, 3,00 moles) en H2O (500 ml), y la r.m. se calentó hasta reflujo durante 1 h. Después, la r.m. se enfrió hasta 0ºC. El sólido se recogió y se disolvió en EtOAc. Esta disolución se secó (Na2SO4), se filtró, y el disolvente se evaporó para producir un sólido gris. Rendimiento: 160 g de intermedio 8 (80% de rendimiento).

b) Preparación del intermedio 9

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El intermedio 8 (160 g, 0,8 moles) se añadió en porciones a H2SO4 conc. (1 l) a 50ºC. La disolución se calentó hasta 100ºC durante 2 h, y después se vertió en agua con hielo (3 l). El precipitado (aproximadamente 0,8 moles) se recogió y se disolvió en NaOH 1 N (2 l). Se añadió H2O2 (300 ml) a esta disolución a 0ºC, y, tras dejar a la r.m. alcanzar r.t., se agitó toda la noche. Subsiguientemente, la mezcla se filtró y se añadió HCl 2N al filtrado hasta pH 1. El precipitado se separó por filtración y se disolvió en EtOAc (2 l). La disolución se secó (Na2SO4), se filtró, y el disolvente se evaporó para producir 120 g de intermedio 9 (83% de rendimiento) como un sólido amarillo.

c) Preparación del intermedio 10

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10 Una mezcla de intermedio 9 (60,0 g, 0,346 moles), tetrahidro-2,5-dimetoxifurano (45,7 g, 0,346 moles) e hidrocloruro de piridina (1:1) (40 g, 0,346 moles) en dioxano (500 ml) se calentó hasta reflujo toda la noche. El disolvente se eliminó, y el residuo se disolvió en EtOAc (100 ml). Esta disolución se lavó con salmuera y con H2O. La capa orgánica separada se secó (MgSO4), se filtró, y el disolvente se evaporó para producir 70 g de intermedio 10, que se usó directamente como tal en la etapa de reacción siguiente.

15 d) Preparación del intermedio 11

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Se añadió NH3.H2O (100 ml) a una disolución de intermedio 10 (70 g (bruto), aproximadamente 0,311 moles), HOBT (47 g, 0,346 moles) y EDCI (70 g, 0,346 moles) en DMF (300 ml). La r.m. se agitó toda la noche. El disolvente se eliminó, y el residuo se disolvió en EtOAc. Esta disolución se lavó con salmuera y con H2O. La capa orgánica

20 separada se secó (MgSO4), se filtró, y el disolvente se evaporó. Rendimiento: 55 g de intermedio 11, que se usó directamente como tal en la etapa de reacción siguiente.

e) Preparación del intermedio 12

imagen29

Una disolución 10 M de BH3 en Me2S (40,5 ml, 0,405 moles) se añadió a una mezcla de intermedio 11 (45 g, 0,2025

25 moles) en THF (500 ml). La r.m. se puso a reflujo toda la noche bajo una atmósfera de N2. Subsiguientemente, se añadió HCl 6 N (10 ml), mientras la mezcla se enfrió en un baño de agua con hielo. La mezcla se puso a reflujo de nuevo durante 30 min., y después se añadió NaOH sólido hasta pH >9, mientras la mezcla se enfrió en un baño de agua con hielo. La mezcla se extrajo con DCM (2 veces 300 ml). La capa orgánica separada se secó (MgSO4), se filtró, y el disolvente se evaporó. El residuo marrón se convirtió en la sal de HCl (.HCl) con HCl/2-propanol).

30 Rendimiento: 35 g de intermedio 12 (71% de rendimiento).

Ejemplo A5

a) Preparación del intermedio 13

imagen30

Una mezcla de intermedio 3 (2,8 g, 10,0 mmoles) y 4-(metiltio)benzaldehído (1,8 g, 12,0 mmoles) en EtOH (15 ml) se puso a reflujo durante 4 h. La mezcla se enfrió y se cristalizó toda la noche. El precipitado se separó por filtración, se lavó con éter isopropílico y se secó a vacío. Rendimiento: 2,85 g de intermedio 13 bruto (.HCl), que se usó como tal en la etapa de reacción siguiente. Si se desea, el producto se puede purificar adicionalmente mediante HPLC.

b) Preparación del intermedio 14

imagen31

El intermedio 13 bruto (2,8 g; aproximadamente 6,9 mmoles) se neutralizó con NH3.H2O (10 ml), y la mezcla se extrajo con DCM. La capa orgánica separada se secó (Na2SO4), se filtró, y el disolvente se evaporó a vacío. El

10 residuo se agitó en DCM (40 ml), y se añadió MnO2 (7,2 g, 83,1 mmoles) a esta disolución. La r.m. se agitó durante 48 h a r.t., y después se filtró sobre tierra de diatomeas (eluyente: PE/EtOAc desde 5/1 hasta 2/1). Las fracciones deseadas se recogieron, y el disolvente se evaporó a vacío. Rendimiento: 1,60 g de intermedio 14 (62,2% de rendimiento).

Ejemplo A6

15 a) Preparación del intermedio 15

imagen32

Se añadieron DHP (7 ml) y PPTS (0,58 g) a una disolución de 4-bromo-bencenoetanol (9,4 g; 0,0467 moles) en DCM (c.s.) a 25ºC. La disolución se agitó a 25ºC durante 10 horas. La mezcla se lavó con agua (3 x 50 ml), se secó (MgSO4), se filtró, y el disolvente se evaporó. Rendimiento: 12,63 g de intermedio 15 (95% de rendimiento).

20 b) Preparación del intermedio 16

imagen33

Reacción en condiciones anhidras

Una disolución 2 M de n-butil-litio en n-hexano (15 ml) se añadió gota a gota a una disolución de intermedio 15 (8,62 g) en THF (150 ml) a -78ºC. Esta mezcla se agitó durante 1 hora a -78ºC. Después se añadió DMF (7 ml) gota a

25 gota, y la mezcla de reacción se agitó durante otras 2 horas a -78ºC. La mezcla de reacción se combinó con una disolución de NH4Cl y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron 3 veces con una disolución saturada de NaCl, se secaron (Na2SO4), se filtraron, y el disolvente se evaporó. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/EtOAc 8/1). Las fracciones deseadas se recogieron, y el disolvente se evaporó. Rendimiento: 6,57 g de intermedio 16 (94% de rendimiento).

30 Ejemplo A7

a) Preparación del intermedio 17

imagen34

5

10

15

20

25

30

35

Se añadió 2,5-dimetoxitetrahidrofurano (180 mmoles) a una mezcla de 2-amino-4-clorobenzonitrilo (164 mmoles) en HOAc (250 ml). La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 30 minutos. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Se añadió una disolución acuosa saturada de NaHCO3 al concentrado. La mezcla se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una disolución acuosa saturada de NaHCO3 y con agua, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se evaporaron. Se obtuvieron cristales de color oscuro. El bruto obtenido se disolvió en DCM y se filtró sobre un tapón de sílice. Rendimiento: el intermedio 17 (99% de rendimiento; sólido cristalino amarillo).

b) Preparación del intermedio 18

imagen35

Se añadió hidruro de litio y aluminio (III) (250 mmoles) en THF anhidro (20 ml) durante 2 minutos a una disolución enfriada con hielo de intermedio 17 (114 mmoles) en THF anhidro (200 ml). Tras la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora. La mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa al 15% de 2,3-dihidroxisuccinato de sodio y potasio tetrahidratado enfriada con hielo (sal de Rochelle) con agitación vigorosa, seguido de EtOAc (300 ml). La mezcla se agitó durante 30 min. Las capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (300 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (50 ml), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para producir un aceite translúcido amarillo.

El aceite obtenido se disolvió en éter dietílico (800 ml), y se añadió HCl en dioxano 4 M (28,5 ml) a esta disolución. La suspensión resultante se filtró y se lavó con éter dietílico. El residuo del filtro se secó a 50ºC para producir el intermedio 18 (65% de rendimiento; sólido amarillo).

B. Preparación de los compuestos

Ejemplo B1

a) Preparación del compuesto 12

imagen36

Una mezcla de intermedio 3 (0,552 g, 0,002 moles) y 4-acetil-benzaldehído (0,385 g, 0,0026 moles) en EtOH (4 ml) se agitó y se puso a reflujo durante 3 h. Después, la mezcla se enfrió y se cristalizó en la mezcla mediante reposo toda la noche. El producto se separó por filtración y se lavó (EtOH) y se secó. Rendimiento: 0,684 g del compuesto 12 (84,2% de rendimiento).

b) Preparación del compuesto 22

imagen37

El compuesto 12 (0,390 g, 0,00096 moles) se agitó en NH3.H2O (4 ml). Esta mezcla se extrajo con DCM (20 ml). La capa orgánica separada se secó (Na2SO4) y se filtró. La disolución se agitó con MnO2 (2,5 g, 0,028 moles) durante 4 días tras la filtración, y después el disolvente se eliminó. El producto se secó a vacío. Rendimiento: 0,010 g del compuesto 2 (2,8% de rendimiento).

Ejemplo B2

a) Preparación del compuesto 32

imagen38

Una mezcla de intermedio 5 (1,5 g, 6,17 mmoles) y 4-acetil-benzaldehído (1,0 g, 6,78 mmoles) en EtOH (10 ml) se puso a reflujo durante 4 h. Subsiguientemente, la mezcla se dejó reposar toda la noche a r.t. El disolvente se evaporó a vacío. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (SEPAX™: 21,2 x 250 mm; eluyente: 10%-40% de CH3CN (0,1% de TFA)/H2O (0,1% de TFA); caudal 25 ml/min.; 20 min.). Las fracciones deseadas se recogieron y se neutralizaron con una disolución saturada de NaHCO3. La mezcla se extrajo con DCM. La capa orgánica separada se secó (Na2SO4), se filtró, y el disolvente se evaporó para producir 0,68 g del compuesto 31 como un aceite (33% de rendimiento).

b) Preparación del compuesto 15

imagen39

Una mezcla de compuesto 32 (0,68 g, 2,02 mmoles) y MnO2 (2,63 g, 30,28 mmoles) en DCM (20 ml) se agitó durante 48 h a r.t. Subsiguientemente, la mezcla se filtró sobre tierra de diatomeas, y el filtrado se evaporó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (eluyente: PE/EtOAc 10/1). Las fracciones deseadas se recogieron, y el disolvente se evaporó para producir 0,6 g del compuesto 15 (89% de rendimiento).

15 Ejemplo B3

a) Preparación del compuesto 8

imagen40

Se añadió 4-acetil-benzaldehído (1,46 g, 9,78 mmoles) a una disolución de intermedio 7 (2,00 g, 8,23 mmoles) en EtOH (15 ml). La r.m. se agitó y se puso a reflujo durante 4 h, y después se enfrió. Tras reposar toda la noche, el 20 precipitado se separó por filtración y se secó a vacío para producir el producto bruto. El producto bruto se purificó mediante HPLC (SEPAX™: 21,2 x 250 mm; eluyente: 35%-55% de CH3CN (0,1% de TFA)/H2O (0,1% de TFA); caudal 15 ml/min.; 25 min.). Las fracciones del producto se recogieron, y el disolvente orgánico se evaporó. El residuo se ajustó hasta pH 7 con una disolución saturada de NaHCO3. Se añadió DCM (c.s.), y la capa orgánica se separó. La capa orgánica separada se secó (Na2SO4), se filtró, y el disolvente se evaporó. Rendimiento: 2,1 g del

25 compuesto 8 (68,4% de rendimiento).

b) Preparación del compuesto 18

imagen41

Una disolución del compuesto 8 (2,0 g, 5,9 mmoles) y MnO2 (6,1 g, 71,2 mmoles) en DCM (50 ml) se agitó a r.t. durante 2 días. La mezcla se filtró, y el filtrado se concentró para producir 0,650 g del compuesto 18 (36,3% de 30 rendimiento).

Ejemplo B4

a) Preparación del compuesto 33

imagen42

Una mezcla de intermedio 12 (1,5 g, 6,13 mmoles) y 4-acetilbenzaldehído (1 g, 6,74 mmoles) en EtOH (10 ml) se puso a reflujo durante 4 h, y después se dejó reposar toda la noche a r.t. El precipitado se separó por filtración, se lavó con EtOH (c.s.) y se secó a vacío para producir el producto bruto como un sólido blancuzco. El producto bruto

5 se purificó mediante HPLC (Synergi™: 50 x 250 mm; eluyente: 10%-40% de CH3CN (0,1% de TFA)/H2O (0,1% de TFA); caudal 80 ml/min.; 25 min.). Las fracciones deseadas se recogieron, y el disolvente se evaporó para producir la sal del ácido trifluoroacético. El producto se neutralizó con una disolución saturada NaHCO3 y se extrajo con DCM. La capa orgánica separada se secó, se evaporó, y el residuo se convirtió en la sal de HCl (1:1) con HCl/dioxano. Rendimiento: 0,7 g del compuesto 33 (30,5% de rendimiento; .HCl).

10 b) Preparación del compuesto 24

imagen43

El compuesto 33 (0,6 g, 1,6 mmoles) se neutralizó con NH3.H2O (10 ml) y se extrajo con DCM. La capa orgánica separada se secó (Na2SO4), se filtró, y el disolvente se evaporó a vacío. El residuo se disolvió en DCM (20 ml), y se añadió MnO2 (1,67 g, 19,2 mmoles) a la disolución. La mezcla se agitó a r.t. durante 48 h. Subsiguientemente, la

15 mezcla se filtró sobre tierra de diatomeas. El filtrado se concentró a vacío, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (eluyente: PE/EtOAc 15/1). Las fracciones deseadas se recogieron, y el disolvente se evaporó. Rendimiento: 0,37 g del compuesto 24 (69% de rendimiento; sólido blanco).

Ejemplo B5

a) Preparación del compuesto 5

imagen44

[0235] Una mezcla de hidrocloruro de 2-cloro-6-(1H-pirrol-1-il)bencenometanamina (1:1) (1,00 g, 0,004 moles; preparada mediante un protocolo análogo al protocolo descrito para el intermedio 3 en A1.c) y 4-acetilbenzaldehído (0,59 g, 0,004 moles) en EtOH (10 ml) se agitó y se puso a reflujo durante 2 h. La mezcla se cristalizó toda la noche. El precipitado se separó por filtración, se lavó 3 veces con EtOH (5 ml) y se secó a vacío a 80ºC. Rendimiento: 0,94

25 g del compuesto 5 (63% de rendimiento).

b) Preparación del compuesto 17

imagen45

Una mezcla de H2O (25 ml) y NH4OH (5 ml) se añadió a una suspensión de DCM (50 ml) y compuesto 5 (0,380 g, 0,97 mmoles) a 25ºC. La mezcla se agitó durante 15 min. a 25ºC. Subsiguientemente, las capas se separaron. La 30 capa orgánica separada se secó (MgSO4), se filtró, y el disolvente se evaporó. El residuo se agitó en DCM (50 ml) y se añadió MnO2 (0,90 g, 0,01 moles) a la disolución. La mezcla se agitó durante 120 h a 25ºC. La mezcla se filtró

5

10

15

20

25

30

sobre tierra de diatomeas, y el filtrado se evaporó. El residuo se cristalizó en EtOH. El producto se separó por filtración y se secó. Rendimiento: 0,25 g del compuesto 17 (75% de rendimiento).

Ejemplo B6

a) Preparación del compuesto 14

imagen46

[0239] Una mezcla de hidrocloruro de 3,5-dicloro-2-(1H-pirrol-1-il)bencenometanamina (1:1) (1,86 g, 0,0067 moles; preparada mediante un protocolo análogo al protocolo descrito para el intermedio 3 en A1.c) y 4-acetilbenzaldehído (0,992 g, 0,0067 moles) en EtOH (20 ml) se agitó y se puso a reflujo durante 2 h. La mezcla se cristalizó toda la noche. El producto se separó por filtración, se lavó 2 veces con EtOH (10 ml) y se secó a vacío a 80ºC. Rendimiento: 2,49 g del compuesto 14 (91% de rendimiento; .HCl).

b) Preparación del compuesto 26

imagen47

Una mezcla del compuesto 14 (0,812 g, 0,002 moles) en DCM (20 ml) se lavó con H2O (30 ml), NH4OH (10 ml), y H2O (20 ml). La capa orgánica se secó (MgSO4) y se filtró. Se añadió MnO2 (1,8 g, 0,02 moles) al filtrado. La mezcla se agitó durante 96 h a 25ºC, y después se filtró sobre tierra de diatomeas. El filtrado se evaporó para producir 0,24 g del compuesto 26 (33% de rendimiento).

Ejemplo B7

Preparación del compuesto 30

imagen48

Una disolución de oxona (3,3 g, 5,4 mmoles) en H2O (10 ml) se añadió lentamente a una mezcla de intermedio 14 (1,0 g, 2,7 mmoles) en THF (15 ml) a r.t. La r.m. se agitó durante 2 h. Subsiguientemente, la mezcla se repartió entre DCM y NaHCO3. La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró, y el disolvente se evaporó para producir un residuo amarillo claro. Este residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente: PE/EtOAc desde 8/1 hasta 3/1). Las fracciones deseadas se recogieron, y el disolvente se evaporó a vacío. Rendimiento: 550 mg del compuesto 30 (50% de rendimiento).

Ejemplo B8

Preparación del compuesto 1

imagen49

[0245] Una mezcla del compuesto 5 (0,372 g, 0,001 moles), DCM (20 ml), NH4OH (5 ml) y H2O (20 ml) se agitaron durante 15 min. a 25ºC. Las capas se separaron. La capa orgánica separada se lavó con H2O (20 ml), se secó (MgSO4), y se filtró. El filtrado se enfrió en hielo, y se añadió NaBH4 (0,019 g, 0,0005 moles) lentamente a la r.m. enfriada, que se agitó a 0ºC durante 2 h. Subsiguientemente, se añadió H2O (30 ml), y el producto se extrajo con EtOAc. La capa orgánica separada se secó (MgSO4), se filtró, y el disolvente se evaporó. El residuo se purificó mediante TLC preparativa (eluyente: DCM/MeOH 30/1). Rendimiento: 0,18 g del compuesto 1 (53% de rendimiento).

Ejemplo B9

Preparación del compuesto 34

imagen50

Una mezcla de intermedio 3 (0,552 g; 0,002 moles) y el intermedio 16 (0,609 g; 0,0026 moles) en EtOH (10 ml) se agitó y se puso a reflujo durante 3 horas. Después, la mezcla se enfrió y se cristalizó toda la noche. Los cristales se separaron por filtración y se secaron para producir 0,410 g del compuesto 34 (50% de rendimiento).

Ejemplo B10

Preparación del compuesto 39

imagen51

10 El intermedio 18 se convirtió en la forma de amina libre mediante la extracción básica con DCM seguido de secado sobre Na2SO4 anhidro. Esta amina libre del intermedio 18 (5,55 mmoles) se añadió a una mezcla de intermedio 16 (4,27 mmoles) en DCM anhidro (100 ml), AcOH (1747 mmoles) y un exceso de Na2SO4 anhidro. La mezcla de reacción se agitó durante 5 días. Después, la mezcla de reacción se añadió a una disolución acuosa de NaHCO3 (espumación) hasta que se hizo básica. Tras extraer con DCM, las capas orgánicas combinadas se secaron sobre

15 Na2SO4 anhidro, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para producir un bruto. El bruto obtenido se purificó con cromatografía ultrarrápida (ISOLERA 1 -Biotage®) (10% EtOAc en hexano hasta 100% EtOAc). Las fracciones deseadas se recogieron, y el disolvente se evaporó. Rendimiento: Compuesto 39 (2,5% de rendimiento).

Usando protocolos de reacción análogos descritos en los ejemplos anteriores, se han preparado los siguientes compuestos. “Comp. nº” significa número de compuesto. “Pr.” se refiere al número de ejemplo según qué protocolo

20 se sintetizó el compuesto. En el caso de que no se indique una forma de sal, se obtuvo el compuesto como base libre.

Los compuestos en los que R3 y R4 son hidrógeno y para los que no se indica estereoquímica específica para un estereocentro en la tabla 1a o 1b se obtuvieron como una mezcla racémica de enantiómeros R y S.

Tabla 1a:

Comp. nº

Pr. R1 R2 R3 R4 R5 R6 Forma salina

1

B8 7-Cl H H H H

2

B8 7-Cl 8-Cl H H H .HCl

3

B8 8-Cl 10-Cl H H H .HCl

Comp. nº

Pr. R1 R2 R3 R4 R5 R6 Forma salina

5

B5.a 7-Cl H H H H .HCl

6

B5.a 7-Cl H H H imagen52 H .HBr

8

B3.a 9-Cl H H H H

9

B3.a o B4.a 7-Cl 8-Cl H H H .HCl

11

B3.a 7-Cl 9-Cl H H H

12

B1.a 7-Cl 9-Cl H H H .HCl

14

B6.a 8-Cl 10-Cl H H H .HCl

32

B2.a 10-Cl H H H H

33

B4.a 7-F 9-F H H imagen52 H .HCl

34

B9 7-Cl 9-Cl H H HO-(CH2)2- H .HCl

35

B9 7-Cl H H H HO-(CH2)2- H .HCl

36

B9 8-Cl 10-Cl H H HO-(CH2)2- H .HCl

37

B9 7-Cl 8-Cl H H HO-(CH2)2- H .HCl

38

B9 7-Cl 10-Cl H H HO-(CH2)2- H .HCl

39

B10 9-Cl H H H HO-(CH2)2- H

40

B1.a 7-F H H H H .HCl

Comp. nº

Pr. R1 R2 R3 R4 R5 R6 Forma salina

41

B1.a 7-Cl 10-Cl H H H .HCl

15

B2.b 10-Cl H enlace imagen52 H

17

B5.b 7-Cl H enlace H

18

B3.b 9-Cl H enlace H

20

B3.b o B1.b 7-F H enlace H

21

B3.b o B1.b 7-Cl 8-Cl enlace H .HCl

22

B1.b 7-Cl 9-Cl enlace H

24

B4.b 7-F 9-F enlace H

25

B1.b 7-Cl 10-Cl enlace imagen52 H

26

B6.b 8-Cl 10-Cl enlace H

28

B7 7-Cl H enlace H

29

B7 7-F H enlace H

30

B7 7-Cl 9-Cl enlace H

Tabla 1b:

Comp. nº

Pr. R1 R2 R3 R4 R6 R5 Forma salina

4

B3.a 7-Cl H H H H

7

B4.a 7-Cl H H H F .HCl

10

B4.a 7-Cl 9-Cl H H H .HCl

13

B3.a 7-Cl 9-Cl H H F

16

B4.b 7-Cl H enlace H imagen52

19

B4.b 7-Cl H enlace F

23

B4.b 7-Cl 9-Cl enlace F

27

B7 7-Cl H enlace H

31

B7 7-Cl 9-Cl enlace H

Resultados analíticos

LCMS -Procedimiento general

5 La medida de HPLC se llevó a cabo usando un módulo 1100 de Agilent que comprende una bomba, un detector de matriz de diodos (DAD) (longitud de onda usada de 220 nm), un calentador de columna y una columna tal como se especifica en los métodos respectivos a continuación. El flujo de la columna se dividió a un aparato MSD serie G1946C y G1956A de Agilent. El detector de MS se configuró con API-ES (ionización por electropulverización a presión atmosférica). Los espectros de masas se adquirieron mediante barrido de 100 a 1000. El voltaje de la aguja

10 capilar fue 2500 V para el modo de ionización positiva y 3000 V para el modo de ionización negativa. El voltaje de fragmentación fue 50 V. La temperatura del gas de secado se mantuvo a 350ºC a un caudal de 10 l/min.

Método 1 de LCMS

5

10

15

Además del procedimiento general: Se llevó a cabo HPLC de fase inversa en una columna YMC-Pack ODS-AQ, 50x2,0 mm 5 m con un caudal de 0,8 ml/min. Se usaron dos fases móviles (fase móvil A: agua con 0,1% de TFA; fase móvil B: acetonitrilo con 0,05% de TFA). En primer lugar, se mantuvo 100% de A durante 1 minuto. Luego se aplicó un gradiente hasta 40% de A y 60% de B en 4 minutos y se mantuvo durante 2,5 minutos. Se usaron volúmenes de inyección típicos de 2 l. La temperatura del horno fue 50ºC. (Polaridad de MS: positiva)

Método 2 de LCMS

Además del procedimiento general: Se llevó a cabo HPLC de fase inversa en una columna YMC-Pack ODS-AQ, 50x2,0 mm 5 m con un caudal de 0,8 ml/min. Se usaron 2 fases móviles (fase móvil A: agua con 0,1% de TFA; fase móvil B: CH3CN con 0,05% de TFA). En primer lugar, se mantuvo 90% de A y 10% de B durante 0,8 min. Luego se aplicó un gradiente hasta 20% de A y 80% de B en 3,7 min y se mantuvo durante 3 minutos. Se usaron volúmenes de inyección típicos de 2 l. La temperatura del horno fue 50ºC. (Polaridad de MS: positiva)

Puntos de fusión

Para varios compuestos, se determinaron los puntos de fusión (p.f.) con un aparato de punto de fusión WRS-2A adquirido de Shanghai Precision and Scientific Instrument Co. Ltd. Los puntos de fusión se midieron con una velocidad de calentamiento lineal de 0,2-5,0ºC/min. Los valores indicados son intervalos de fusión. La temperatura máxima fue 300ºC.

Los resultados de las medidas analíticas se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: Tiempo de retención (Rt) en min., pico de [M+H]+ (molécula protonada) y p.f. (punto de fusión en ºC). (“n.d.” significa no determinado; “desc” significa descompuesto).

Comp. nº

Rt [M+H]+ Método de LCMS p.f. (°C)

1

3,02 339 2 118,5-121,2

2

4,33 373 1 215,3-216,7

3

3,58 373 2 n.d.

4

3,30 337 2 dec

5

3,07 337 2 dec

6

n.d. n.d. - n.d.

7

4,32 355 1 174,3-176,0

8

3,44 337 2 185,4-186,9

9

3,36 371 2 253,3-256,1

10

3,63 371 2 274,2-274,3

11

3,70 371 2 204,8-206,6

12

3,42 371 2 dec

13

3,52 389 2 n.d.

14

3,63 371 2 259,3-264,5

15

3,21 335 2 171,4-171,8

16

3,24 335 2 n.d.

17

3,05 335 2 252,3-252,6

18

3,18 335 2 114,4-115,7

19

3,07 353 2 146,2-147,7

20

3,91 319 1 215,2-216,0

21

3,16 369 2 209,2-212,3

22

3,62 369 2 250,2-254,2

37

5

10

15

20

25

Comp. nº

Rt [M+H]+ Método de LCMS p.f. (°C)

23

3,41 387 2 192,3-193,4

24

3,98 337 1 226,9-230,0

25

3,49 369 2 n.d.

26

3,58 369 2 183,6-186,7

27

4,05 371 1 189,8-191,0

28

4,00 371 1 218,5-219,9

29

3,83 355 1 92,0-95,0

30

3,20 405 2 n.d.

31

3,29 405 2 221,2-221,5

32

n.d. n.d. - -

33

n.d. n.d. - dec

34

3,48 373 2 -

35

4,27 339 1 237,3-239,9

36

3,61 373 2 248,7-250,3

37

3,37 373 2 244,9-245,5

38

3,36 373 2 236,3-237,9

1H RMN

Para varios compuestos, los espectros de 1H RMN se registraron en un espectrómetro DPX-300 de Bruker, DPX-400 de Bruker, o en un espectrómetro con secuencias de pulso convencionales, que funcionan a 300 MHz y 400 MHz respectivamente, usando CLOROFORMO-d (cloroformo deuterado, CDCl3) o DMSO-d6 (DMSO deuterado, dimetild6 sulfóxido) como disolventes. Los desplazamientos químicos () se indican en partes por millón (ppm) con respecto a tetrametilsilano (TMS), que se usó como patrón interno.

Compuesto 1: 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,30 (d, J=6,4 Hz, 3H), 3,52 (d, J=13,5 Hz, 1H), 4,22 (d, J=13,5 Hz, 1H), 4,65 -4,76 (m, 2H), 5,10 (d, J=4,2 Hz, 1H), 5,34 -5,39 (m, 1H), 6,11 (t, J=3,2 Hz, 1H), 7,12 (dd, J=3,0, 1,5 Hz, 1H), 7,26 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,36 (d, J=7,9 Hz, 2H), 7,41 -7,48 (m, 3H).

Compuesto 5: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,63 (s, 3H), 3,88 (d a, J=14,1 Hz, 1H), 4,59 (d, J=13,8 Hz, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,83 (s, 1H), 6,30 (s, 1H), 7,44 (s, 1H), 7,60 -7,74 (m, 3H), 7,92 (d, J=8,0 Hz, 2H), 8,06 (d, J=8,0 Hz, 2H), 10,58 (s a, 1H), 10,45 (s a, 1H).

Compuesto 15: 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,60 (s, 3H), 4,12 (d, J=10,9 Hz, 1H), 4,92 (d, J=11,0 Hz, 1H), 6,46 (dd, J=3,8, 2,8 Hz, 1H), 6,49 (dd, J=3,8, 1,7 Hz, 1H), 7,39 (t, J=7,8 Hz, 1H), 7,62 (d, J=7,8 Hz, 2H), 7,70 (dd, J=2,8, 1,6 Hz, 1H), 7,83 (d, J=8,3 Hz, 2H), 7,99 (d, J=8,5 Hz, 2H).

Compuesto 16: 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,56 (s, 3H), 4,14 (s a, 1H), 5,47 (s a, 1H), 6,35 -6,49 (m, 2H), 7,15 -7,36 (m, 4H), 7,41 (t, J=7,7 Hz, 1H), 7,87 (d, J=7,7 Hz, 1H), 7,97 (d, J=7,8 Hz, 1H), 8,22 (s, 1H).

Compuesto 17: 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) δppm 2,63 (s, 3 H) 4,23 (s a., 1 H) 5,53 (s a., 1 H) 6,33 6,60 (m, 2 H) 7,28 -7,44 (m, 4 H) 7,72 -7,90 (m, 2 H) 7,89 -8,10 (m, 2 H).

Compuesto 18: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,64 (s, 3H), 4,71 (s a, 2H), 6,49 -6,54 (m, 1H), 6,54 6,61 (m, 1H), 7,32 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,48 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,98 (d, J=8,0 Hz, 2H).

Compuesto 19: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,65 (d, J=4,7 Hz, 3H), 4,16 (s a, 1H), 5,51 (s a, 1H), 6,46 (s, 2H), 7,16 (dd, J=10,6, 8,6 Hz, 1H), 7,28 -7,43 (m, 4H), 7,93 -8,03 (m, 1H), 8,17 (dd, J=7,2, 2,4 Hz, 1H).

Compuesto 20: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,63 (s, 3 H) 4,69 (s a., 2 H) 6,39 -6,54 (m, 2 H) 7,09 (t, J=8,5 Hz, 1 H) 7,19 (d, J=8,0 Hz, 1 H) 7,30 -7,43 (m, 2 H) 7,81 (m, J=8,3 Hz, 2 H) 7,96 (m, J=8,3 Hz, 2 H).

Compuesto 21: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d/ a 0 grados!) δ ppm 2,65 (s, 3 H), 4,23 (d a, J=11,4 Hz, 1 H), 5,60 (d a, J=11,4 Hz, 1 H), 6,47 -6,51 (m, 2 H), 7,25 (d, J=8,6 Hz, 1 H), 7,36 (t, J=2,2 Hz, 1 H), 7,51 (d, J=8,6 Hz, 1 H), 7,81 (d, J=8,3 Hz, 2 H), 7,96 (d, J=8,4 Hz, 2 H).

Compuesto 22: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,63 (s, 3H), 4,17 (s a, 1H), 5,50 (s a, 1H), 6,43 -6,56 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,80 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,96 (d, J=8,0 Hz, 2H).

Compuesto 23: 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,65 (d, J=4,7 Hz, 3 H) 4,13 (s a., 1 H) 5,45 (s a., 1 H) 6,47 (m, J=2,3 Hz, 2 H) 7,17 (dd, J=10,5, 8,7 Hz, 1 H) 7,30 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,35 (t, J=2,2 Hz, 1 H) 7,41 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,83 -8,02 (m, 1 H) 8,16 (dd, J=7,1, 2,4 Hz, 1 H).

Compuesto 24: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,64 (s, 3 H) 4,72 (s a., 2 H) 6,49 (m, J=2,3 Hz, 2 H) 6,85 (td, J=8,9, 2,3 Hz, 1 H) 6,96 (d, J=9,0 Hz, 1 H) 7,35 (t, J=2,0 Hz, 1 H) 7,80 (m, J=8,3 Hz, 2 H) 7,96 (m, J=8,3 Hz, 2 H).

Compuesto 25: 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 2,64 (s, 3 H) 4,11 (d, J=11,5 Hz, 1 H) 5,52 (d, J=9,3 Hz, 1 H) 6,35 -6,64 (m, 2 H) 7,35 -7,48 (m, 2 H) 7,54 -7,68 (m, 1 H) 7,85 -8,09 (m, 4 H).

Compuesto 26: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,60 (s, 3H), 4,10 (d, J=11,0 Hz, 1H), 4,94 (d, J=11,0 Hz, 1H), 6,45 -6,53 (m, 2H), 7,71 (s a., 1H), 7,77 -7,88 (m, 4H), 7,99 (d, J=8,1 Hz, 2H).

Compuesto 27: 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 3,06 (s, 3 H) 4,21 (s a., 1 H) 5,55 (s a., 1 H) 6,49 (s a., 2 H) 7,28 -7,47 (m, 4 H) 7,61 (t, J=7,7 Hz, 1 H) 7,97 -8,13 (m, 2 H) 8,29 (s a., 1 H).

Compuesto 28: 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,25 (s, 3 H) 4,16 (s a., 1 H) 5,32 (s a., 1 H) 6,54 (m, J=2,3 Hz, 2 H) 7,38 -7,60 (m, 3 H) 7,79 (t, J=2,2 Hz, 1 H) 7,83 -7,93 (m, 2 H) 7,93 -8,00 (m, 2 H).

Compuesto 29: 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 3,06 (s, 3H), 4,81 (s a, 2H), 6,48 -6,57 (m, 2H), 7,12 (t, J=8,5 Hz, 1H), 7,19 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,38 (td, J=8,3, 5,8 Hz, 1H), 7,45 (t, J=2,3 Hz, 1H), 7,90 -8,02 (m, 4H).

Compuesto 30: 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) δppm 3,06 (s, 3 H) 4,19 (s a., 1 H) 5,50 (s a., 1 H) 6,38 6,60 (m, 2 H) 7,30 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,35 -7,40 (m, 1 H) 7,43 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,84 -8,04 (m, 4 H).

Compuesto 31: 1H RMN (300 MHz, CLOROFORMO-d) δ ppm 3,05 (s, 3 H) 4,17 (s a., 1H) 5,49 (s a., 1 H) 6,36 -6,58 (m, 2 H) 7,31 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,35 -7,40 (m, 1 H) 7,42 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,60 (t, J=7,7 Hz, 1 H) 8,03 (m, J=7,7 Hz, 2 H) 8,27 (s, 1 H).

Compuesto 34: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,75 (t, J=6,8 Hz, 2 H) 3,61 (t, J=6,8 Hz, 2 H) 3,81 (d, J=14,3 Hz, 1 H) 4,53 (d, J=14,1 Hz, 1 H) 4,65 (s a., 1 H) 5,29 (s a., 1 H) 5,87 (s a., 1 H) 6,28 (s a., 1 H) 7,33 (d, J=7,8 Hz, 2 H) 7,46 (s a., 1 H) 7,56 (d, J=7,8 Hz, 2 H) 7,78 (s, 1 H) 7,83 (s, 1 H) 9,66 (s a., 1 H) 10,38 (s a., 1 H).

Compuesto 35: 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,76 (t, J=6,8 Hz, 2 H) 3,62 (t, J=6,9 Hz, 2 H) 3,84 (d, J=12,5 Hz, 1 H) 4,53 (d, J=14,1 Hz, 1 H) 4,67 (s a., 1 H) 5,17 (s a., 1 H) 5,84 (s a., 1 H) 6,28 (t, J=3,1 Hz, 1 H) 7,32 (d, J=8,0 Hz, 2 H) 7,39 (s a., 1 H) 7,56 -7,74 (m, 5 H) 10,13 (s a., 1 H) 10,42 (s a., 1 H).

Compuesto 36: 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,76 (t, J=6,8 Hz, 2 H) 3,51 -3,69 (m, 3 H) 4,36 (d, J=13,9 Hz, 1 H) 4,67 (s a., 1 H) 5,26 (s a., 1 H) 5,91 (d, J=3,8 Hz, 1 H) 6,28 (t, J=3,4 Hz, 1 H) 7,33 (m, J=7,9 Hz, 2 H) 7,38 (dd, J=3,0, 1,5 Hz, 1 H) 7,63 (m, J=7,9 Hz, 2 H) 7,78 (d, J=2,3 Hz, 1 H) 8,06 (d, J=2,3 Hz, 1 H) 9,77 (s a., 1 H) 10,31 (s a., 1 H).

Compuesto 37: 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,76 (t, J=6,8 Hz, 2 H) 3,62 (t, J=7,0 Hz, 2 H) 3,88 (d, J=13,9 Hz, 1 H) 4,58 (d, J=13,9 Hz, 1 H) 5,25 (s a., 1 H) 5,86 (d, J=3,4 Hz, 1 H) 6,29 (t, J=3,4 Hz, 1 H) 7,33 (d, J=8,3 Hz, 2 H) 7,41 (dd, J=2,8, 1,7 Hz, 1 H) 7,59 -7,68 (m, 3 H) 7,96 (d, J=9,0 Hz, 1 H) 10,15 (s a., 1 H) 10,44 (s a., 1 H).

El espectro de 1H RMN del compuesto 39 se registró en un espectrómetro de 400 MHz Bruker Avance III nanobay: (DMSO-d6) δ ppm 2,71 (t, J=8 Hz, 2H), 3,48 (s, 1H), 3,57 (dt, J=8 Hz, 4 Hz, 2H), 3,86 (d, J=12 Hz, 1H), 4,65 (t, J= 4Hz, 1H), 4,71 (s, 1H), 5,36 (m, 1H), 6,10 (t, J= 4Hz, 1H), 7,16 (d, J= 8Hz, 2H), 7,17 (m, 1H),7,33 (d, J= 8Hz, 2H), 7,39 (dd, J=8 Hz, 2 Hz, 1H), 7,42 (d, J=8 Hz, 1H), 7,57 (d, J=2 Hz, 1H).

D. Ejemplos farmacológicos

Ejemplo D.1: Medida de la actividad antifúngica in vitro

El examen de susceptibilidad convencional se realizó en placas de 96 pocillos (fondo en U, Greiner Bio-One). Se prepararon diluciones en serie (2 veces o 4 veces) de disoluciones madre de compuesto 20 mM en DMSO al 100%, seguido de una etapa de dilución intermedia en agua. Entonces se colocaron estas diluciones en serie (10 l) sobre placas de ensayo que pudiesen almacenarse en la oscuridad a 4ºC durante un periodo máximo de 2 semanas. Se incluyó un intervalo de dosis amplio adecuado con 64 M como la concentración más alta en el ensayo. El medio de cultivo RPMI-1640 se complementó con L-glutamina, glucosa al 2%, y se tamponó con ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) a pH 7,0 ± 0,1.

Las diferentes especies fúngicas/aislados (Tabla 3a) se crioconservaron y se diluyeron 1/1000 en medio, justo antes de su uso. Entonces se añadió a cada pocillo un inóculo convencional de 200 l que contenía 103 unidades formadoras de colonias (ufc). En cada placa se incluyó un control positivo (crecimiento del 100% = cultivo fúngico sin antifúngico) y un control negativo (crecimiento del 0% = medio RPMI-MOPS). La temperatura y el tiempo de 5 incubación óptimos dependían de la especie fúngica, y variaron de 24 h para levaduras (37ºC) hasta una semana o más para dermatofitos (27ºC). Se midió la inhibición del crecimiento fúngico tras añadir 10 l de resazurina al 0,005% (p/v) (Sigma Aldrich) a cada pocillo, basándose en el principio de que las células vivas convierten la resazurina azul no fluorescente en la resorufina rosa y fluorescente, permitiendo la lectura fluorimétrica (ex550 nm y em 590 nm) tras un periodo de incubación adicional (tiempo “resa.” mencionado en la Tabla 3a). Los resultados se

10 muestran en la Tabla 3b como valores de pIC50.

Tabla 3a: Condiciones de incubación para las diferentes especies fúngicas. “Tiempo resa.” representa el tiempo de incubación adicional tras la adición de resazurina al sistema de ensayo.

Especie

Temperatura (ºC) Tiempo Tiempo resa.

Microsporum canis

27 9 días 24 horas

Trichophyton mentagrophytes

27 7 días 24 horas

Trichophyton rubrum

27 7 días 24 horas

Scedosporium apiospermum

37 48 horas 17 horas

Scedosporium prolificans

37 48 horas 17 horas

Sporothrix schenkii

27 4 días 24 horas

Aspergillus fumigatus

27 48 horas 17 horas

Candida parapsilosis

37 24 horas 4 horas

Cryptococcus neoformans

37 24 horas 4 horas

Rhizopus oryzae

37 24 horas 6 horas

Rhizomucor miehei

37 48 horas 17 horas

Mucor circinelloides

27 48 horas 17 horas

Tabla 3b: Actividades de los compuestos de ensayo in vitro

(“n.d.” significa no determinado; “Inf.” significa infección; los valores son valores de pIC50) Inf. 'A': Sporothrix schenkii B62482 Inf. 'G': Trichophyton mentagrophytes B70554 Inf. 'B': Microsporum cans B68128 Inf. 'H': Scedosporium apiospermum IHEM3817 Inf. 'C': Trichophyton rubrum B68183 Inf. 'I': Scedosporium prolificans IHEM21157 Inf. 'D': Candida p arapsilosis B66126 Inf. 'J': Rhizopus oryzae IHEM5223 Inf. 'E': Aspergillus fumigatus B42928 Inf. 'K': Rhizomucor miehei IHEM13391 Inf. 'F': Cryptococcus neoformans B66663 Inf. 'L': Mucor circinelloides IHEM21105

Comp. nº

Inf. A Inf. B Inf. C Inf. D Inf. E Inf. F Inf. G Inf. H Inf. I Inf. J Inf. K

5

4,4 6,1 6,3 5,1 5,7 4,6 6,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

6

4,7 6,2 6,4 < 4,2 4,5 < 4,2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

17

<4,5 6,7 7,4 < 4,5 < 4,5 < 4,5 6,6 < 4,2 <4,2 <4,2 <4,2

9

5,0 5,6 5,7 < 4,2 < 4,2 4,5 4,5 n.d. n.d. n.d. n.d.

14

4,6 5,6 6,2 < 4,2 < 4,2 4,3 4,6 n.d. n.d. n.d. n.d.

26

5,9 6,2 7,1 < 4,2 5,8 5,0 5,4 n.d. n.d. n.d. n.d.

1

<4,2 5,5 5,5 < 4,2 < 4,2 4,2 4,9 n.d. n.d. n.d. n.d.

21

<4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

2

<4,2 4,7 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

3

< 4,2 5,0 6 < 4,2 < 4,2 4,7 4,4 n.d. n.d. n.d. n.d.

4

< 4,2 5,0 5,3 < 4,2 < 4,2 < 4,2 4,6 n.d. n.d. n.d. n.d.

11

4,3 6,0 5,7 < 4,2 < 4,2 5,2 5,3 n.d. n.d. n.d. n.d.

12

< 4,2 4,9 5,7 < 4,2 < 4,2 < 4,2 5,1 n.d. n.d. n.d. n.d.

10

< 4,2 5,3 5,7 < 4,2 < 4,2 < 4,2 5,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

22

5,4 7,0 7,3 4,6 6,6 5,0 6,5 4,3 5,9 <4,2 <4,2

16

4,6 6,5 7,3 < 4,2 6,2 < 4,2 6,4 < 4,2 < 4,2 <4,2 <4,2

25

< 4,2 5,5 5,3 < 4,2 < 4,2 < 4,2 5,0 n.d. n.d. n.d. n.d.

27

< 4,2 5,2 5,1 < 4,2 < 4,2 4,2 5,1 n.d. n.d. n.d. n.d.

31

< 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

29

< 4,2 5,0 5,6 < 4,2 4,3 4,5 5,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

28

< 4,2 5,9 5,7 < 4,2 < 4,2 < 4,2 5,6 < 4,2 5,1 <4,2 <4,2

13

< 4,2 5,1 5,7 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

30

4,3 5,4 5,7 < 4,2 4,2 4,8 5,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

8

4,5 < 4,2 5,7 < 4,2 4,9 4,3 5,3 n.d. n.d. n.d. n.d.

7

< 4,2 5,1 6,0 < 4,2 < 4,2 < 4,2 5,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

23

< 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 < 4,2 n.d. n.d. n.d. n.d.

15

5,8 6,2 6,9 < 4,2 6,3 5,7 6,4 5,0 5,7 <4,2 5,1

19

< 4,2 5,8 6,7 < 4,2 5,7 < 4,2 6,1 < 4,2 5,9 <4,2 <4,2

18

5,1 5,7 6,5 4,2 6,3 5,8 6,0 4,4 4,9 <4,2 <4,2

24

4,7 5,7 6,9 5,4 6,1 5,0 6,2 5,1 5,6 <4,2 <4,2

20

< 4,2 5,9 7,0 < 4,2 6,3 < 4,2 6,4 < 4,2 6,2 <4,2 <4,2

34

< 4,2 5,7 4,9 < 4,2 < 4,2 4,5 4,7 n.d. n.d. n.d. n.d.

35

< 4,2 4,4 5,1 < 4,2 < 4,2 4,3 4,9 n.d. n.d. n.d. n.d.

36

< 4,2 4,3 4,5 < 4,2 < 4,2 4,6 4,7 n.d. n.d. n.d. n.d.

37

4,8 < 4,2 4,5 < 4,2 4,4 5,0 4,4 n.d. n.d. n.d. n.d.

38

< 4,2 5,7 5,1 < 4,2 < 4,2 4,7 4,7 n.d. n.d. n.d. n.d.

Ejemplo D.2: Ensayo de estabilidad metabólica del hígado

Los valores de PIC50 para Inf. 'J' se determinaron para los compuestos 15, 16, 18, 19, 20, 22, 24, y 28, y fueron <4,2.

Las preparaciones hepáticas (fracciones microsómicas) se obtuvieron de BD Gentest (San Jose, Ca, US). La estabilidad metabólica se evaluó usando las siguientes condiciones de ensayo. Todas las incubaciones se realizaron agitando mezclas de reacción (250 l) que contienen 1 mg de preparación proteica microsómica/ml, sistema generador de NADPH (“NADPH” significa -nicotinamida adenina dinucleótido fosfato, forma reducida) (NADP 0,1

mM, MgCl2 5,0 mM, glucosa-6-fosfato 1,65 mM y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0,125 U), y amortiguador de fosfato de sodio y potasio 0,5 M (pH 7,4). La mezcla se preincubó a 37ºC durante 5 min., y la reacción enzimática se inició añadiendo compuesto de ensayo 5 M. Tras 0 (control) y 15 minutos (min.), las reacciones se terminaron mediante adición de DMSO (500 l). El material precipitado se eliminó mediante centrifugación a 1200 g durante 10 5 min. El sobrenadante se analizó mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas de trampa de iones ThermoFinnigan LCQ Deca XP equipado con una fuente de ionización química a presión atmosférica. El cálculo del % de compuesto que queda fue como se describió por Kantharaj et al. 2003 ((Kantharaj E., Tuytelaars A, Proost PEA, Ongel Z, van Assouw HP y Gilissen RAHJ (2003). Simultaneous measurement of drug metabolic stability and identification of metabolites using ion-trap mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Sprectrom, vol 17, 2661-2668),

10 y el % de compuesto metabolizado se calculó mediante la siguiente ecuación:

% de compuesto metabolizado = 100% -% de compuesto que queda.

Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: % de compuesto metabolizado usando microsomas hepáticos humanos (hLM), microsomas hepáticos de ratón (mLM) y microsomas de cobaya (gpLM)

Comp. nº

% compuesto metabolizado _Met_hLM % compuesto metabolizado Met_mLM % compuesto metabolizado Met_gpLM

5

59 72 88

17

50 70 84

26

19 45 44

21

17 24 64

22

27 37 73

16

87 97 100

25

80 n.d. n.d.

13

69 n.d. 95

23

22 n.d. 39

15

17 n.d. 44

19

36 n.d. 80

18

17 n.d. 36

24

20 n.d. 53

20

26 n.d. 88

28

2 41 21

1

43 51 86

Ejemplo D.3: Ensayo de unión a proteína plasmática

15

Se preparó plasma de forma reciente mediante centrifugación de sangre de cobaya durante 10 min. a 1900 g en tubos recubiertos con K3-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). La unión de los compuestos a proteína plasmática se evaluó a concentraciones de 5 M como se describe por Van Liemp et al. 2010 (Van Liemp S, Morrison D, 20 Sysmans L, Nelis P y Mortishire-Smith R (2010). Development and Validation of a Higher-Throughput Equilibrium Dialysis Assay for Plasma Protein Binding. Journal of the Association for Laboratory Automation, 2010, en prensa) usando un dispositivo de equilibro rápido (RED). De forma breve, se mezcló plasma de cobaya con compuesto de ensayo 5 M y después se aplicó al RED. El equilibrio se logró después de 4 h de incubación a 37ºC. Las concentraciones de compuesto en el amortiguador y en el compartimiento plasmático del dispositivo se midieron

25 mediante LC-MS/MS.

Para el compuesto 15, la fracción unida fue 98,48%.

Ejemplo D.4: Ensayos de inhibición del citocromo P450

Protocolo A: Resultados de citocromo P450 (% de inhibición) usando proteínas expresadas por ADNc. Todos los ensayos fluorogénicos se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos negras Costar según Crespi et al 1997, con pequeñas modificaciones (Crespi CL, Miller VP y Penman BW (1997). Microtiter plate assays for inhibition of human, drug-metabolizing cytochromes P450. Anal. Biochem. Vol 248, 1898-1900). Las condiciones del ensayo se

5 esquematizan en la Tabla 5a. Para citocromo P450 3A4, se usaron tres sustratos fluorogénicos diferentes. Cada mezcla de reacción consistió en la concentración apropiada de enzima, sistema generador de NADPH (“NADPH” significa -nicotinamida adenina dinucleótido fosfato, forma reducida), sustrato en amortiguador de sodio/potasio (pH 7,4). Para cada lote de citocromo P450, las cinéticas de Michealis-Menten se determinaron usando 11 concentraciones.

10 Para determinar los valores de IC50 o el % de inhibición a 10 M con los sustratos fluorogénicos, se obtuvieron disoluciones madre de inhibidor de 5 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). Después, se obtuvieron diluciones adicionales en acetonitrilo. La concentración de disolvente orgánico final, que provoca una inhibición menor que 10%, fue 2% (v/v). Los compuestos se diluyeron en serie para dar concentraciones finales que oscilan desde 1 nM a 10 M. Las mezclas de reacción, en las que 1 l de amortiguador se sustituyó por disolución de compuesto, se calentaron

15 previamente durante 5 min. a 37ºC, y la reacción se inició mediante adición de -nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+). Las reacciones se terminaron mediante adición de reactivo de parada, y la fluorescencia se midió usando un Fluoroscan (Labsystems, Bruselas, Bélgica).

Tabla 5a: Condiciones del ensayo de inhibición de citocromo P450

Condición

CYP1A2 CYP2C9 CYP2D6 CYP3A4

Cantidad de enzima (pmol de P450/ml)

5 60 42 84/20/5

Tiempo de incubación (min)

15 30 45 30/30/10

Sustrato

CEC MFC AMMC BFC/BQ/DBF

Concentración del sustrato (M)

5 10 3 150/150/150

Excitación (nm)

410 405 405 405/405/485

Emisión (nm)

460 535 460 535/535/535

20 En la Tabla 5a, se usaron las siguientes abreviaturas: 3-ciano-7-etocicumarina (CEC), 7-metoxi-4trifluorometilcumarina (MFC), 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMMC), 7-benciloxitrifluorometil cumarina (BFC), 7-benciloxiquinolina (BQ) y dibencil fluoresceína (DBF).

Tabla 5b muestra los resultados de citocromo P450 (% de inhibición) usando proteínas expresadas por ADNc a 10 M

Comp. nº

hCYP3A4_ BFC_ Pct_Inh hCYP3A4_ BQ_ Pct_Inh hCYP3A4_ DBF_ Pct_Inh hCYP2C9_ MFC_ Pct_Inh hCYP2D6_ AMMC_ Pct_Inh hCYP1A2_ CEC_ Pct_Inh

26

33 32 55 69 74 34

21

0 26 26 54 39 27

22

39 63 89 85 53 20

16

29 46 64 84 55 55

25

21 29 21 45 11 21

13

81 78 91 61 51 64

23

51 56 40 51 3 17

15

1 40 16 60 63 38

19

26 49 49 60 33 44

24

3 39 3 54 3 18

20

1 25 5 43 20 18

Tabla 5c resultados de citocromo P450 (% de inhibición) usando proteínas expresadas por ADNc a 10 M – presente solicitud frente a técnica anterior

hCYP3A4_ BFC_ Pct_Inh

hCYP3A4_ BQ_ Pct_Inh hCYP3A4_ DBF_ Pct_Inh hCYP2C9_ MFC_ Pct_Inh hCYP2D6_ AMMC_ Pct_Inh hCYP1A2_ CEC_ Pct_Inh

Compuesto 5 de la presente solicitud

57

57

70 54 53 12

Sal de ácido clorhídrico del compuesto 2 del documento WO02/34752

64

57 69 68 96 48

Compuesto 18 de la presente solicitud

7

50 40 69 20 21

Compuesto 23 del documento WO02/34752

55

66 70 50 33 40

Compuesto 17 de la presente solicitud

2

33 21 82 18 33

5

10

15

20

25

30

35

Compuesto 22 del documento WO02/34752

45

62 64 41 52 60

Compuesto 28 de la presente solicitud

5

17 1 48

5

5

Protocolo B: Ensayos de inhibición de citocromo P450 microsómico de hígado humano.

El potencial de inhibición de CYP450 también se determinó para el compuesto 18 usando microsomas hepáticos humanos frente a citocromo 1A2 y 2D6.

Los compuestos de ensayo (TCs) se incubaron a lo largo de un intervalo de concentraciones (0 a 30 micromolar) con microsomas hepáticos humanos y sustratos de sonda separados (resorufina para CYP1A2 y dextrometorfano para CYP2D6) para estimar el valor de IC50 para la inhibición del sustrato de sonda mediante el TC. Los TCs se disolvieron en la condición A de disolvente 0,15% de DMSO + 0,46% de acetonitrilo) o condición B (0,30% de DMSO

+ 0,68% de acetonitrilo). Los ensayos se llevaron a cabo en amortiguador de fosfato 0,1 M (pH 7,4), que contiene 1,0 mg/ml de microsomas hepáticos humanos (BD Gentest) y el sustrato de sonda (ya sea resorufina o dextrometorfano) y un intervalo de concentraciones de compuestos de ensayo (0 a 30 micromolar) en un volumen total de 250 microlitros. Después de una preincubación durante 10 min. a 37ºC, la reacción se inició con adición de NADPH a una concentración final de 1,0 mM. Después de una incubación de 10 min. a 37ºC, la reacción se paralizó con 2 volúmenes de DMSO enfriado. Las muestras se centrifugan durante 10 min. a 4ºC a 4000 rpm, y se analiza el sobrenadante. El análisis para CYP1A2 con resorufina se llevó a cabo mediante fluorescencia, mientras que el potencial de inhibición de CY2D6 se evaluó usando detección mediante LC-MS.

No se pudieron construir curvas de IC50 para determinar los valores de IC50 para el Compuesto 18 puesto que el % de inhibición para los dos citocromos P450 (1A2 y 2D6) fue débil: para CYP1A2 que usa la condición A de disolvente, la inhibición fue 20-25% a 30 M; y usando la condición B de disolvente, la inhibición fue 25-35% a 30 M. Para CYP2D6 usando la condición B de disolvente, la inhibición fue 40-45% a 30 M.

Protocolo C: Ensayo de inhibición de cóctel de citocromos P450 microsómicos hepáticos humanos

Los compuestos de ensayo (TCs) se incubaron a lo largo de un intervalo de concentraciones (0 a 30 micromolar) con microsomas hepáticos humanos y sustratos de sonda para cada uno de los seis citocromos P450, para estimar el valor de IC50 para la inhibición del sustrato de sonda mediante el TC.

Los sustratos de sonda y las concentraciones del ensayo finales con el patrón interno apropiado se esquematizan en la Tabla 6a.

Los ensayos se llevaron a cabo en amortiguador de fosfato 0,1 M (pH 7,4), que contiene 0,2 mg/ml de microsomas hepáticos humanos (BD Gentest) y una mezcla de sustratos de sonda que consiste en: fenacetina, tolbutamida, Smepenitoína, dextrometorfano, amodiaquina y midazolam (Tabla 6a) y un intervalo de concentraciones de compuestos de ensayo (0 a 30 micromolar) en un volumen total de 100 microlitros. Después de una preincubación durante 10 min. a 37ºC, la reacción se inició con adición de NADPH a una concentración final de 1,0 mM. El disolvente orgánico final en la incubación es 0,15% de DMSO y 0,8% de acetonitrilo. Tras una incubación de 10 min. a 37ºC, la reacción se paralizó con 1,6 volúmenes de disolución de paralización enfriada, que consiste en DMSO y los patrones internos (Tabla 6a). Las muestras se centrifugaron durante 10 min. a 4ºC a 4000 rpm, y se diluyeron 60 microlitros de sobrenadante con 180 microlitros de agua. Cada muestra se inyectó en un sistema de UPLC/MS para la medida simultánea de los metabolitos del sustrato de sonda y sus patrones internos deuterados asociados. El porcentaje de inhibición se calcula según:

% de inhibición = (1 – Ri/R) * 100, en la que Ri y R son las relaciones de las áreas de los picos de metabolito a patrón interno en presencia y ausencia de inhibidor respectivamente.

Los datos del porcentaje de inhibición se representan frente al logaritmo de la concentración de compuesto de ensayo transformada y, después de ajustar la curva, se determina el valor de IC50.

Tabla 6a: Sustrato de sonda y patrones internos para el ensayo de inhibición de cóctel de P450 microsómico hepático humano.

Citocromo P450

Sustrato de sonda Concentración de sustrato de sonda (microM) Patrón interno

1A2

Fenacetina 80 Acetaminofeno-D4

2C8

Amodiaquina 2 N-desetilamodiaquina-D4

2C9

Tolbutamida 100 4-hidroxitolbutamida-D9

2C19

S-Mefenitoína 30 4-hidroximefenitoína-D3

2D6

Dextrometorfano 3 Dextrometorfano-D3

3A4/5

Midazolam 2 l’-hidroximidazolam-D4

Tabla 6b muestra los valores de pIC50 – presente solicitud frente a técnica anterior

1A2_Phen

2C8_Amod 2C9Tolbut 2C19_S-Meph 2D6_Dextro 3A4_mido

Compuesto 17 de la presente solicitud

<5,0

<5,0

<5,0

<5,0

<5,0

<5,0

imagen53

Compuesto 22 del documento WO02/34752

<5,0

<5,0

<5,0

5,8

<5,0

<5,0

Compuesto 28 de la presente solicitud

<5,0

<5,0

<5,0

<5,0

5,12 No determinado

Compuesto 5 de la presente solicitud

<5,0

5,1 5,5 5,5 5,5 5,1

Sal de ácido clorhídrico del compuesto 2 del documento WO02/34752

<5,0

<5,0

5,0 6,0 5,5 5,2

Compuesto 6 de la presente solicitud

<5,0

5,1 5,6 5,9 5,7 5,3

Compuesto 1 de la presente solicitud

<5,0

<5,0

<5,0

5,29

<5,0

<5,0

Compuesto 2 del documento WO02/34752

<5,0

<5,0

5,1 6,1 5,7

<5,0

Compuesto 4 de la presente solicitud

<5,0

5,1 5,8 6,8 5,5 5,6

Compuesto 25 del documento WO02/34752

<5,0

<5,0

5,2 5,9 5,7 5,6

Compuesto 8 de la presente solicitud

<5,0

5,1 5,2 5,5 5,1 5,0

Compuesto 16 del documento WO02/34752

<5,0

<5,0

5,0 6,5 5,4 5,2

Ejemplo D.5: Logaritmo calculado del coeficiente de reparto octanol/agua (ClogP)

El logaritmo calculado del coeficiente de reparto octanol/agua se obtuvo usando el software Bio-Loom (BioByte). Tabla 7: ClogP

Compuesto (presente solicitud)

ClogP

18

4,13

17

3,92

28

3,10

5

3,71

8

3,91

6

3,71

4

3,71

1

3,54

Compuesto (técnica anterior)

ClogP

25 (WO02/34752)

5,30

23 (WO02/34752)

5,47

22 (WO02/34752)

5,47

32 (WO02/34752)

5,30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

16 (WO02/34752)

5,30

2 (WO02/34752)

5,30

Sal de HCl del compuesto 2 del documento WO02/34752

5,30

E. Ejemplo de composición

“Principio activo”, tal como se usa a lo largo de todos estos ejemplos, se refiere a un compuesto de fórmula (I), incluyendo cualquier forma estereoquímicamente isomérica del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un solvato del mismo; en particular a uno cualquiera de los compuestos mostrados a modo de ejemplo.

Ejemplo E1: Disolución inyectable.

Se disuelven 1,8 gramos de 4-hidroxibenzoato de metilo y 0,2 gramos de hidróxido de sodio en aproximadamente 0,5 l de agua hirviendo para inyección. Tras enfriar hasta aproximadamente 50ºC, se añaden con agitación 0,05 gramos de propilenglicol y 4 gramos del principio activo. La disolución se enfría hasta temperatura ambiente y se complementa con agua para inyección c.s. hasta 1 l, dando una disolución que comprende 4 mg/ml de principio activo. La disolución se esteriliza mediante filtración y se llenan envases estériles con la misma.

Ejemplo E2: Composición transungueal.

Se añaden 0,144 g de KH2PO4, 9 g de NaCl, 0,528 g de Na2HPO4.2H2O a 800 ml de H2O y se agita la mezcla. El pH se ajusta a 7,4 con NaOH y se añaden 500 mg de NaN3. Se añade etanol (42% v/v) y el pH se ajusta a 2,3 con HCl. Se añaden 15 mg de principio activo a 2,25 ml de PBS (disolución salina tamponada con fosfato)/etanol (42%; pH 2,3) y la mezcla se agita y se trata con ultrasonidos. Se añaden 0,25 ml de PBS/etanol (42%; pH 2,3) y la mezcla se agita adicionalmente y se trata con ultrasonidos hasta que se disuelve todo el principio activo, proporcionando la composición transungueal deseada.

Ejemplo E3: Gotas orales

Se disuelven 500 gramos del p.a. en 0,5 l de una disolución de hidróxido de sodio y 1,5 l del polietilenglicol a 6080ºC. Tras enfriar hasta 3040ºC, se añaden 35 l de polietilenglicol y se agita bien la mezcla. Entonces se añade una disolución de 1750 gramos de sacarina sódica en 2,5 l de agua purificada, y mientras se agita, se añaden 2,5 l de aromatizante de cacao y polietilenglicol c.s. hasta un volumen de 50 l, proporcionando una disolución de gotas orales que comprende 10 mg/ml de p.a. Se llenan envases adecuados con la disolución resultante.

Ejemplo E4: Cápsulas

Se agitan vigorosamente juntos 20 gramos del p.a., 6 gramos de laurilsulfato de sodio, 56 gramos de almidón, 56 gramos de lactosa, 0,8 gramos de dióxido de silicio coloidal y 1,2 gramos de estearato de magnesio. A continuación se llenan 1000 cápsulas duras de gelatina adecuadas con la mezcla resultante, comprendiendo cada una 20 mg del principio activo.

Ejemplo E5: Comprimidos recubiertos con película

Preparación del núcleo de comprimido

Se mezcla bien una mezcla de 100 gramos del p.a., 570 gramos de lactosa y 200 gramos de almidón, y después de eso se humedece con una disolución de 5 gramos dodecilsulfato de sodio y 10 gramos de polivinilpirrolidona en aproximadamente 200 ml de agua. La mezcla de polvo húmedo se tamiza, se seca y se tamiza de nuevo. Entonces se añaden 100 gramos de celulosa microcristalina y 15 gramos de aceite vegetal hidrogenado. El conjunto se mezcla bien y se comprime para dar comprimidos, dando 10.000 comprimidos, conteniendo cada uno 10 mg del principio activo.

Recubrimiento

A una disolución de 10 gramos de metilcelulosa en 75 ml de etanol desnaturalizado se le añade una disolución de 5 gramos de etilcelulosa en 150 ml de diclorometano. Entonces se añaden 75 ml de diclorometano y 2,5 ml de 1,2,3propanotriol. Se funden 10 gramos de polietilenglicol y se disuelven en 75 ml de diclorometano. Se añade esta última disolución a la anterior y entonces se añaden 2,5 gramos de octadecanoato de magnesio, 5 gramos de polivinilpirrolidona y 30 ml de suspensión concentrada de color, y el conjunto se homogeneiza. Los núcleos de comprimido se recubren con la mezcla así obtenida en un aparato de recubrimiento.

Ejemplo E6: Crema al 2%

Se introducen alcohol estearílico (75 mg), alcohol cetílico (20 mg), monostearato de sorbitán (20 mg) y miristato de isopropilo (10 mg) en un vasija encamisada de doble pared y se calientan hasta que la mezcla se ha fundido completamente. Esta mezcla se añade a una mezcla preparada por separado de agua purificada, propilenglicol (200

imagen54

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2