ES2574204T3

ES2574204T3 - Composiciones orgánicas para tratar enfermedades relacionadas con beta-ENaC

Info

Publication number: ES2574204T3
Application number: ES11715243.9T
Authority: ES
Inventors: Antonin De Fougerolles; John L. Diener; Emma Hickman; Gregory Hinkle; Stuart Milstein; Anne-Marie Pulichino; Andrew Sprague
Original assignee: Arrowhead Research Corp
Current assignee: Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2031-04-20
Also published as: WO2011131707A8; AU2011244335B2; KR20190122893A; EP3061824A2; CA2797051C; US9752152B2; JP2022003089A; TWI434692B; JP2014169301A; JP2013525332A; US20120122960A1; JP2019214604A; US20120115934A1; EP3431604A1; US20130012571A1; US20160272979A1; US20110263681A1; KR20220008383A; CA3098080A1; EP3061824A3

Abstract

Una composición que comprende un agente de RNAi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en donde la hebra antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de un agente de RNAi específico del ß-ENaC de acuerdo con la secuencia de SEQ ID n.º 170.

Description

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imagen3

más detalle en la tabla 1, y partes de las mismas se dan a conocer en la tabla 2.

Tabla A1. Números de SEQ ID de una primera y una segunda hebras (p. ej., cadenas sentido («SS») y antisentido («AS») para agentes de RNAi del β-ENaC.

Agente de RNAi: nombre de la doble hebra: SEQ ID n.º de la secuencia modificada SEQ ID n.º de la secuencia sin modificar

AD-20805: Sentido 1 111

Antisentido: 2 112

AD-20806: Sentido 3 113

Antisentido: 4 114

AD-20807: Sentido 5 115

Antisentido: 6 116

AD-20808: Sentido 7 117

Antisentido: 8 118

AD-20809: Sentido 9 119

Antisentido: 10 120

AD-20810: Sentido 11 121

Antisentido: 12 122

AD-20811: Sentido 13 123

Antisentido: 14 124

AD-20812: Sentido 15 125

Antisentido: 16 126

AD-20813: Sentido 17 127

Antisentido: 18 128

AD-20814: Sentido 19 129

Antisentido: 20 130

AD-20815: Sentido 21 131

Antisentido: 22 132

AD-20816: Sentido 23 133

Antisentido: 24 134

AD-20817: Sentido 25 135

Antisentido: 26 136

AD-20818: Sentido 27 137

Antisentido: 28 138

AD-20819: Sentido 29 139

Antisentido: 30 140

AD-20820: Sentido 31 141

Antisentido: 32 142

AD-20821: Sentido 33 143

Antisentido: 34 144

AD-20822: Sentido 35 145

Antisentido: 36 146

AD-20823: Sentido 37 147

5

Antisentido: 38 148

AD-20824: Sentido 39 149

Antisentido: 40 150

AD-20825: Sentido 41 151

Antisentido: 42 152

AD-20826: Sentido 43 153

Antisentido: 44 154

AD-20827: Sentido 45 155

Antisentido: 46 156

AD-20828: Sentido 47 157

Antisentido: 48 158

AD-20829: Sentido 49 159

Antisentido: 50 160

AD-20830: Sentido 51 161

Antisentido: 52 162

AD-20831: Sentido 53 163

Antisentido: 54 164

AD-20832: Sentido 55 165

Antisentido: 56 166

AD-20833: Sentido 57 167

Antisentido: 58 168

AD-20834: Sentido 59 169

Antisentido: 60 170

AD-20835: Sentido 61 171

Antisentido: 62 172

AD-20836: Sentido 63 173

Antisentido: 64 174

AD-20837: Sentido 65 175

Antisentido: 66 176

AD-20838: Sentido 67 177

Antisentido: 68 178

AD-20839: Sentido 69 179

Antisentido: 70 180

AD-20840: Sentido 71 181

Antisentido: 72 182

AD-20841: Sentido 73 183

Antisentido: 74 184

AD-20842: Sentido 75 185

Antisentido: 76 186

AD-20843: Sentido 77 187

Antisentido: 78 188

AD-20844: Sentido 79 189

6

Antisentido: 80 190

AD-20845: Sentido 81 191

Antisentido: 82 192

AD-20846: Sentido 83 193

Antisentido: 84 194

AD-20847: Sentido 85 195

Antisentido: 86 196

AD-20848: Sentido 87 197

Antisentido: 88 198

AD-20849: Sentido 89 199

Antisentido: 90 200

AD-20850: Sentido 91 201

Antisentido: 92 202

AD-20851: Sentido 93 203

Antisentido: 94 204

AD-20852: Sentido 95 205

Antisentido: 96 206

AD-20861: Sentido 97 207

Antisentido: 98 208

AD-20862: Sentido 99 209

Antisentido: 100 210

AD-20863: Sentido 101 211

Antisentido: 102 212

AD-20864: Sentido 103 213

Antisentido: 104 214

AD-20865: Sentido 105 215

Antisentido: 106 216

AD-20866: Sentido 107 217

Antisentido: 108 218

AD-20867: Sentido 109 219

Antisentido: 110 220

Por ejemplo, en la tabla A1, la SEQ ID n.º 1 (la hebra sentido) y la SEQ ID n.º 2 (la hebra antisentido) representan una secuencia modificada de ejemplo del agente de RNAi AD-20805. La secuencia sin modificar del AD-20805 está representada por la SEQ ID n.º 111 (la hebra sentido) y la SEQ ID n.º 112 (la hebra antisentido). Así pues, la tabla 5 A1 presenta los números de identificación de SEQ ID de una primera y una segunda hebra de la secuencia sin modificar y al menos una secuencia modificada de ejemplo de cada uno de los diferentes agentes de RNAi del β-ENaC.

Un agente de RNAi que comprende una hebra antisentido descrita en la presente memoria

Se describe una composición que comprende un agente de RNAi que comprende una hebra antisentido, en donde la

10 hebra antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la hebra antisentido de un agente de RNAi del β-ENaC seleccionado de las hebras antisentido de las dobles hebras específicas dadas a conocer en la presente memoria y que se recogen, por ejemplo, en la tabla 1.

En una realización, la composición comprende además un segundo agente de RNAi del β-ENaC. En diversas realizaciones, el segundo agente de RNAi está físicamente separado del primero, o los dos están en conexión física

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(p. ej., unidos covalentemente o, si no, conjugados).

En una realización, la hebra antisentido tiene unos 30 nt o menos de longitud.

En una realización, la hebra sentido y la hebra antisentido forman una región bicatenaria con una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 parejas de nucleótidos.

5 En una realización, la hebra antisentido tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 36 nt de longitud, que incluye de aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nt de longitud, y además incluye de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nt de longitud. En una realización, la cadena antisentido tiene al menos la longitud seleccionada de aproximadamente 15 nt, aproximadamente 16 nt, aproximadamente 17 nt, aproximadamente 18 nt, aproximadamente 19 nt, aproximadamente 20 nt, aproximadamente 21 nt, aproximadamente 22 nt,

10 aproximadamente 23 nt, aproximadamente 24 nt, aproximadamente 25 nt, aproximadamente 26 nt, aproximadamente 27 nt, aproximadamente 28 nt, aproximadamente 29 nt y aproximadamente 30 nt.

En una realización, el agente de RNAi comprende una modificación que ocasiona que el agente de RNAi tenga aumentada la estabilidad en una muestra biológica o entorno, p. ej., suero sanguíneo o líquido de lavado intestinal.

En una realización, el agente de RNAi comprende al menos una modificación en la cadena de azúcar (p. ej., unión a

15 fosforotioato) y/o al menos un nucleótido con el 2' modificado. En una realización, todas las pirimidinas son nucleótidos modificados por 2'-O-metilación.

En una realización, el agente de RNAi comprende: al menos un dinucleótido 5'-uridina-adenina-3' (5'-ua-3'), en donde la uridina es un nucleótido con el 2' modificado; y/o al menos un dinucleótido 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleótido con el 2' modificado; y/o al menos un dinucleótido 5'-citidina-adenina-3' (5'

20 ca-3'), en donde la 5'-citidina es un nucleótido con el 2' modificado; y/o al menos un dinucleótido 5'-uridina-uridina-3' (5'-uu-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleótido con el 2' modificado.

En una realización, el agente de RNAi comprende una modificación en 2' seleccionada del grupo que consiste en: 2'desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metil, 2'-O-metoxietil (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetil (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropil (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietil (2'-O-DMAEOE), y 2'-O-N

25 metilacetamido (2'-O-NMA). En una realización, todas las pirimidinas son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo.

En una realización, el agente de RNAi comprende un extremo romo.

En una realización, el agente de RNAi comprende un extremo protuberante que tiene de 1 a 4 nucleótidos desapareados.

En una realización, el agente de RNAi comprende un extremo protuberante en el extremo 3' de la hebra antisentido 30 del agente de RNAi.

En una realización, el agente de RNAi está ligado a uno o varios compuestos de diagnóstico, grupo indicador, agente de entrecruzamiento, resto que confiere resistencia a nucleasas, nucleobase natural o inusual, molécula lipófila, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado del epifriedelanol, vitamina, glúcido, dextrano, pululano, quitina, quitosano,

35 glúcido sintético, oligolactato de 15 restos, polímero natural, polímero de masa molecular baja o media, inulina, ciclodextrina, ácido hialurónico, proteína, agente de fijación a proteínas, molécula que actúa selectivamente sobre la integrina, policatiónico, péptido, poliamina, imitador peptídico y/o transferrina.

En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos aproximadamente el 60% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

40 En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos aproximadamente el 70% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos aproximadamente el 80% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos 45 aproximadamente el 90% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

En una realización, el RNAi tiene una CE50 de no más de aproximadamente 0,1 nM.

En una realización, el RNAi tiene una CE50 de no más de aproximadamente 0,01 nM.

En una realización, el RNAi tiene una CE50 de no más de aproximadamente 0,001 nM.

Un agente de RNAi que comprende una primera y segunda hebras descritas en la presente memoria

50 Se describe una composición que comprende un agente de RNAi que comprende una primera hebra y una segunda

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hebra, en donde la primera hebra y la segunda hebra comprenden al menos 15 nucleótidos contiguos, en donde cada un difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la primera y segunda hebras, respectivamente, de un agente de RNAi específico del β-ENaC seleccionado de las dobles hebras específicas descritas en la presente memoria y recogidas,

p. ej., en la tabla 1.

5 En una realización, la composición comprende además un segundo agente de RNAi específico del β-ENaC. En diferentes realizaciones, el segundo agente de RNAi está físicamente separado del primero, o los dos están físicamente conectados (p. ej., covalentemente unidos o, si no, conjugados).

En una realización, la hebra antisentido tiene 30 nt de longitud, o menos.

En una realización, la hebra sentido y la hebra antisentido forman una región bicatenaria de aproximadamente 15 a 10 aproximadamente 30 pares de bases de longitud.

En una realización, la hebra antisentido tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 36 nt de longitud, que incluye de aproximadamente 18 a aproximadamente 23 nt de longitud, y que incluye de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 nt de longitud. En una realización, la hebra antisentido tiene al menos la longitud seleccionada de aproximadamente 15 nt, aproximadamente 16 nt, aproximadamente 17 nt, aproximadamente 18 nt,

15 aproximadamente 19 nt, aproximadamente 20 nt, aproximadamente 21 nt, aproximadamente 22 nt, aproximadamente 23 nt, aproximadamente 24 nt, aproximadamente 25 nt, aproximadamente 26 nt, aproximadamente 27 nt, aproximadamente 28 nt, aproximadamente 29 nt y aproximadamente 30 nt.

En una realización, el agente de RNAi comprende una modificación que hace que el agente de RNAi tenga un incremento de la estabilidad en una muestra biológica o entorno, p. ej., suero sanguíneo o líquido del lavado

20 intestinal.

En una realización, el agente de RNAi comprende al menos una modificación del esqueleto de azúcar (p. ej., unión de fosforotioato) y/o al menos un nucleótido con el 2' modificado. En una realización, todas las pirimidinas son nucleótidos modificados por 2'-O-metilación.

En una realización, el agente de RNAi comprende: al menos un dinucleótido 5'-uridina-adenina-3' (5'-ua-3'), en

25 donde la uridina es un nucleótido con el 2' modificado; y/o al menos un dinucleótido 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleótido con el 2' modificado; y/o al menos un dinucleótido 5'-citidina-adenina-3' (5'ca-3'), en donde la 5'-citidina es un nucleótido con el 2' modificado; y/o al menos un dinucleótido 5'-uridina-uridina-3' (5'-uu-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleótido con el 2' modificado.

En una realización, el agente de RNAi comprende una modificación en 2' seleccionada del grupo que consiste en: 2'

30 desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metil, 2'-O-metoxietil (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetil (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropil (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietil (2'-O-DMAEOE), y 2'-O-Nmetilacetamido (2'-O-NMA).

En una realización, el agente de RNAi comprende un extremo romo.

En una realización, el agente de RNAi comprende un extremo protuberante que tiene de 1 a 4 nucleótidos 35 desapareados.

En una realización, el agente de RNAi comprende un extremo protuberante en el extremo 3' de la hebra antisentido del agente de RNAi.

En una realización, el agente de RNAi está ligado a uno o varios compuestos de diagnóstico, grupo indicador, agente de entrecruzamiento, resto que confiere resistencia a nucleasas, nucleobase natural o inusual, molécula

40 lipófila, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado del epifriedelanol, vitamina, glúcido, dextrano, pululano, quitina, quitosano, glúcido sintético, oligolactato de 15 restos, polímero natural, polímero de masa molecular baja o media, inulina, ciclodextrina, ácido hialurónico, proteína, agente de fijación a proteínas, molécula que actúa selectivamente sobre la integrina, policatiónico, péptido, poliamina, imitador peptídico y/o transferrina.

45 En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos aproximadamente el 60% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos aproximadamente el 70% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos 50 aproximadamente el 80% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

En una realización, el agente de RNAi es capaz de inhibir la expresión del gen del β-ENaC al menos aproximadamente el 90% a una concentración de 10 nM en las células H441 in vitro.

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Los codones de inicio (ATG) y parada (TAA) de las secuencias de cyno y de humano están subrayadas. Los nucleótidos que coinciden entre las secuencias de humano y cyno están marcados con un asterisco (*).

5 Se describe que el agente de RNAi del β-ENaC comprende una secuencia que es idéntica en los ARNm del β-ENaC de humano, rata y cyno. Esta identidad de secuencia facilita las pruebas con animales antes de las pruebas con humanos. Se describe que el agente de RNAi del β-ENaC comprende una secuencia que es idéntica en los ARNm del β-ENaC de humano, ratón y cyno.

Otras descripciones de un agente de RNAi específico del β-ENaC

10 Se describe que el agente de RNAi del β-ENaC comprende una secuencia que no coincide con ningún otro ARNm o gen. Se describe que el agente de RNAi del β-ENaC comprende una secuencia que difiere de todos los demás ARNm o genes conocidos que no son del β-ENaC en al menos 0, 1, 2 o 3 nucleótidos.

Se describe que el agente de RNAi del β-ENaC se administra a un paciente que lo necesita (p. ej., un paciente que

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(eT) y fosfato de 2-hidroxietilo (hp).

Parrish et al. 2000, Molecular Cell 6: 1077-1087, analizaron determinadas modificaciones químicas que actúan selectivamente sobre el gen unc-22 en C. elegans mediante el uso de transcritos de siRNA largos (> 25 nt). Los autores describen la introducción de restos de tiofosfato en estos transcritos de siRNA mediante la incorporación de 5 análogos de nucleótidos con tiofosfato mediante las ARN polimerasas de T3 y T7, y observaron que los ARN con dos bases modificadas con fosforotioato también tenían disminuciones sustanciales en la eficacia de la RNAi. Además, Parrish et al describieron que la modificación con fosforotioato de más de dos restos desestabilizaba enormemente los ARN in vitro de tal manera que las actividades de interferencia no se podían ensayar. Id. en 1081. Los autores también analizaron determinadas modificaciones en la posición 2' del azúcar nucleotídico en los 10 transcritos de siRNA largos y encontraron que la sustitución de los desoxinucleótidos por ribonucleótidos producía una disminución sustancial de la actividad de interferencia, en especial en el caso de las sustituciones de uridina por timidina y/o citidina por desoxicitidina. Id. Además, los autores analizaron determinadas modificaciones de bases, entre ellas, la sustitución, en las hebras sentido y antisentido del siRNA, por 4-tiouracilo, 5-bromouracilo, 5yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo en lugar de uracilo, e inosina en lugar de guanosina. Mientras que la sustitución

15 por 4-tiouracilo y 5-bromouraiclo parecía tolerarse bien, Parrish describió que la inosina producía una disminución sustancial en la actividad de interferencia cuando se incorporaba en cualquier hebra. Parrish también describió que la incorporación de 5-yodouracilo y 3-(aminoalil)uracilo en la hebra antisentido también daba lugar a una disminución sustancial de la actividad de RNAi.

Los expertos en la técnica apreciarán que es posible sintetizar y modificar los siRNA cuando se desee, mediante el

20 uso de cualquier método convencional conocido en la técnica (véase Henschel et al., 2004, «DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs». Nucleic Acids Research 32 (Web Server Issue): W113-W120). Además, será evidente para los expertos en la técnica que hay una serie de secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores constitutivos o inducibles, promotores específicos del tejido o fragmentos funcionales de los mismos, etc.) que son útiles para el oligonucleótido antisentido, siRNA, o construcción de expresión de shRNA/vector.

25 Hay varios ejemplos en la técnica que describen modificaciones en el azúcar, base, fosfato y esqueleto que se pueden introducir en las moléculas de ácido nucleico con una mejora significativa de su estabilidad y eficacia ante las nucleasas. Por ejemplo, los oligonucleótidos se modifican para mejorar la estabilidad y/o mejorar la actividad biológica mediante la modificación con grupos resistentes a las nucleasas, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-H, modificaciones de las bases de los nucleótidos (para una revisión, véase Usman y

30 Cedergren 1992 TIBS. 17: 34; Usman et al. 1994 Nucleic. Acids Symp. Ser. 31: 163; Burgin et al. 1996 Biochemistry

35: 14090). La modificación del azúcar de las moléculas de ácido nucleico se describe extensivamente en la técnica.

Se han descrito modificaciones y conjugaciones de agentes de RNAi adicionales. Soutschek et al. 2004 Nature 432: 173-178 presentaron la conjugación del colesterol al extremo en 3' de la hebra sentido de una molécula de siRNA por medio de un conector de pirrolidina, lo que generó un conjugado covalente e irreversible. También se pueden

35 realizar modificaciones químicas (entre ellas la conjugación con otras moléculas) de los agentes de RNAi para mejorar el tiempo de retención farmacocinética y la eficacia in vivo.

El agente de RNAi del β-ENaC puede comprender al menos un dinucleótido 5'-uridina-adenina-3' (5'-ua-3'), en donde la uridina es un nucleótido con modificación en 2'; al menos un dinucleótido 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleótido con modificación en 2'; al menos un dinucleótido 5'-citidina-adenina-3' (5'-ca-3'),

40 en donde la 5'-citidina es un nucleótido con modificación en 2'; y/o al menos un dinucleótido 5'-uridina-uridina-3' (5'uu-3'), en donde la 5'-uridina es un nucleótido con modificación en 2'.

El agente de RNAi puede comprender una modificación en 2' seleccionada del grupo que consiste en: 2'-desoxi, 2'desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metil, 2'-O-metoxietil (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetil (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropil (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietil (2'-O-DMAEOE) y 2'-O-N-metilacetamido

45 (2'-O-NMA).

Se describe que el RNAi comprende un hueco o le falta una base. Por ejemplo, el esqueleto de fosfato-azúcar puede

estar presente, pero faltar la base.

Se describe que el agente de RNAi tiene una mella monocatenaria (p. ej., una rotura o ausencia de enlace en el esqueleto). En diferentes realizaciones, una mella monocatenaria puede estar en la hebra sentido o bien en la hebra

50 antisentido, o en ambas.

Esta muesca puede estar, por ejemplo, en la hebra sentido, que produce un ARN interferente pequeño internamente segmentado o sisiRNA, que puede tener menos efectos inespecíficos que el correspondiente agente de RNAi sin una mella.

El ácido nucleico antisentido o agente de RNAi puede tener también un esqueleto alternativo, tal como los ácidos

55 nucleicos bloqueados (LNA), morfolinos, ácidos peptidonucleicos (PNA), ácido nucleico de treosa (TNA) o ácido glicolonucleico (GNA) y/o puede estar marcado (p. ej., radiomarcado o, si no, etiquetado).

Una o ambas hebras pueden comprender un esqueleto alternativo.

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Se describe que el agente de RNAi empleado por los métodos descritos puede incluir una molécula de ácido nucleico α-anomérico. Una molécula de ácido nucleico α-anomérico forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el que, al contrario que las unidades β habituales, las hebras corren paralelas la una a la otra. Gaultier et al. 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641.

5 La molécula de ácido nucleico antisentido puede también comprender un 2'-O-metilribonucleótido (Inoue et al. 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. 1987 FEBS Lett. 215: 327330).

Se describe un agente de RNAi que es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad

ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, con el cual tiene

10 una región complementaria. Así pues, las ribozimas [p. ej., ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff et al. 1988, Nature 334: 585-591)] se pueden utilizar para escindir catalíticamente los transcritos del ARNm del β-ENaC, mediante lo cual inhiben la traducción del ARNm del β-ENaC.

Como alternativa, la expresión génica se puede inhibir al actuar selectivamente sobre las secuencias nucleotídicas

complementarias a la región reguladora del β-ENaC (p. ej., el promotor y/o los potenciadores) para formar

15 estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen del β-ENaC. Véase, para una visión general, Helene 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene et al. 1992. Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27-36; y Maher 1992, Bioassays 14 (12): 807-15.

Producción de agentes de RNAi

El agente de RNAi se puede producir biológicamente mediante un vector de expresión en el cual se ha subclonado

20 un ácido nucleico en una orientación antisentido (a saber, el ARN transcrito desde el ácido nucleico insertado estará en una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). El agente de RNAi también se puede producir biológicamente mediante un vector de expresión dentro del cual se ha subclonado un ácido nucleico como una construcción de shRNA (a saber, el ARN transcrito desde el ácido nucleico insertado tendrá una primera región en una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, una segunda región que

25 comprende un bucle o bisagra, y una tercera región en una orientación sentido con respecto al ácido nucleico diana de interés, en donde las primera y tercera regiones del transcrito se hibridan preferiblemente entre ellas, con lo que se forma una estructura de tallo y bucle).

Los métodos para producir los agentes de RNAi se conocen bien en la técnica y están disponibles para los expertos

en la técnica.

30 Los kits para la síntesis de la RNAi están comercialmente disponibles de, p. ej., New England Biolabs y Ambion.

Administración de los agentes de RNAi

Los agentes de RNAi de la presente descripción se pueden administrar o introducir (p. ej., en una célula in vitro, en

un animal problema, o en un humano) mediante los medios conocidos en la técnica.

Los agentes de RNAi de la presente descripción se administran típicamente a un sujeto o se generan in situ de tal

35 manera que se hibridan con el ARNm celular y/o el ADN genómico que codifica el β-ENaC e inhiben la expresión al inhibir su transcripción y/o traducción. Un ejemplo de una vía de administración del agente de RNAi incluye una inyección directa en un sitio del tejido. Como alternativa, los agentes de RNAi se pueden modificar para que actúen selectivamente sobre determinadas células y a continuación administrarse sistémicamente. Por ejemplo, para la administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar de tal manera que se fijen de forma

40 específica a los receptores o antígenos que se expresan en una superficie celular seleccionada, p. ej., mediante la conexión de las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores de la superficie celular o antígenos. Las moléculas del ácido nucleico antisentido se pueden administrar en las células con vectores bien conocidos en la técnica y que se describen en, por ejemplo, la patente de los EE. UU n.º US20070111230. Para conseguir la concentración intracelular suficiente de las moléculas antisentido, se prefieren

45 las construcciones de vectores en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte de pol II o pol III.

«Introducir en una célula», cuando se refiere a un agente de RNAi, significa facilitar o efectuar la captación o absorción en la célula, como conocen los expertos en la técnica. La absorción o captación de un agente de RNAi se puede producir a través de procesos celulares de difusión activa o pasiva, o mediante agentes o dispositivos 50 auxiliares. El significado de este término no se limita a las células in vitro; un agente de RNAi también se puede «introducir en una célula», en donde la célula es parte de un organismo vivo. En tal ejemplo, la introducción en la célula incluirá la administración en el organismo. Por ejemplo, para la administración in vivo, un agente de RNAi se puede inyectar en un sitio del tejido o se puede administrar sistémicamente. La administración in vivo también puede ser un sistema de administración de β-glucano, tales como los descritos en las patentes de los EE. UU. n.os

55 5.032.401 y 5.607.677, y la publicación de los EE. UU. n.º 2005/0281781. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica, tales como la electroporación y la lipofección. En la presente memoria se describen más estrategias o se conocen en la técnica.

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La composición farmacéutica puede comprender otros componentes que ayudan en la administración, estabilidad,

eficacia o reducción de la inmunogenia.

Composición farmacéutica que comprende un agente de RNAi del β-ENaC

Los componentes adicionales de una composición farmacéutica que comprende un agente de RNAi del β-ENaC se 5 pueden añadir para ayudar a la administración, estabilidad, eficacia o reducción de la inmunogenia.

Los liposomas se han utilizado previamente para la administración del fármaco (p. ej., administración de una antineoplásico). Los liposomas (p. ej., liposomas catiónicos) se describen en las publicaciones PCT de patente internacional WO 02/100435A1, WO 03/015757A1 y WO 04029213A2; las patentes de los EE. UU n.os 5.962.016,

5.030.453 y 6.680.068; y la solicitud de patente de los EE. UU. n.º 2004/0208921. Un proceso para fabricar

10 liposomas se describe también en la solicitud de patente internacional WO 04/002453A1. Además, se han incorporado lípidos neutros en los liposomas catiónicos (p. ej., Farhood et al., 1995).

Se han utilizado liposomas catiónicos para administrar el agente de RNAi a diferentes tipos de células (Sioud y

Sorensen 2003; solicitud de patente de los EE. UU. 2004/0204377; Duxbury et al., 2004; Donze y Picard, 2002).

El uso de liposomas neutros se describe en Miller et al. 1998 y en la solicitud de patente de los EE. UU. 15 2003/0012812.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «SNALP» se refiere a una partícula lipídica estable con ácido nucleico. Un SNALP representa una vesícula de lípidos que reviste un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico, tal como un iRNA o un plásmido, del cual se transcribe un iRNA. Los SNALP se describen, p. ej., en las publicaciones de solicitud de patente de los EE. UU. n.os 20060240093, 20070135372 y en la

20 solicitud de patente internacional n.º WO 2009082817.

La transfección química mediante técnicas basadas lípidos, basadas en polímeros y basadas en aminas, se describe en productos de Ambion Inc., Austin, Tex; y Novagen, EMD Biosciences, Inc., una empresa afiliada de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania); Ovcharenko D. (2003) «Efficient delivery of siRNAs to human primary cells». Ambion TechNotes 10 (5): 15-16). Adicionalmente, Song et al. (Nat. Med. Publicado en línea (Fete I 0, 2003) doi:

25 10.1038/nm828) y otros [Caplen et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.), 98: 9742-9747; y McCaffrey et al. Nature 414: 34-39] describen que los hepatocitos se pueden transfectar con eficacia mediante la inyección del siRNA en el aparato circulatorio de un mamífero.

Se han utilizado una serie de moléculas para la administración específica de célula del agente de RNAi. Por ejemplo,

la propiedad condensadora de ácidos nucleicos que tiene la protamina se ha combinado con anticuerpos específicos

30 para administrar los siRNA. Song et al. 2005 Nat. Biotech. 23: 709-717. La polietilenimina policatiónica PEGilada de autoensamblaje (PEI) también se ha utilizado para condensar y proteger los siRNA. Schiffelers et al. 2004 Nucl. Acids Res. 32: e149, 141-1 10.

Las nanopartículas que contienen siRNA se administraron con éxito a continuación a una neovasculatura tumoral

que sobreexpresa integrinas. Hu-Lieskovan et al. 2005 Cancer Res. 65: 8984-8992.

35 Los agentes de RNAi de la presente descripción se pueden administrar a través, por ejemplo, de nanopartículas lipídicas (NPL); liposomas neutros (LN); nanopartículas de polímeros; motivos de fijación al ARN bicatenario (dsRBM, por su nombre en inglés); o a través de la modificación del agente de RNAi (p. ej., unión covalente al dsRNA).

Las nanopartículas lipídicas (NPL) son sistemas con lípidos catiónicos que se autoensamblan. Pueden comprender, por ejemplo, un lípido neutro (la base del liposoma); un lípido catiónico (para la carga del siRNA); colesterol (para

40 estabilizar los liposomas); y lípidos PEGilados (para estabilizar la formulación, apantallar las cargas y prolongar la circulación en el torrente circulatorio).

El lípido catiónico puede comprender, por ejemplo, un grupo de cabeza, un conector, una cola y una cola de colesterol. El NPL puede tener, por ejemplo, buena administración al tumor, prolongada circulación en la sangre, partículas pequeñas (p. ej., menos de 100 nm) y estabilidad en el microentorno tumoral (que tiene un pH bajo y es

45 hipóxico).

Los liposomas neutros (LN) son partículas con lípidos no catiónicos

Las nanopartículas de polímeros son partículas hechas de polímeros que se autoensamblan.

Los motivos de fijación al ARN bicatenario (dsRBM) son proteínas autoensamblantes de fijación al ARN, que

necesitarán modificaciones.

50 El agente de RNAi del β-ENaC se puede ligar a uno o varios compuestos diagnósticos, grupo indicador, agente de entrecruzamiento, resto que confiere resistencia a las nucleasas, nucleobase inusual o natural, molécula lipófila, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado del epifriedelanol, vitamina, glúcido, dextrano, pululano, quitina, quitosano, glúcido sintético,

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oligolactato de 15 restos, polímero natural, polímero de masa molecular baja o media, inulina, ciclodextrina, ácido hialurónico, proteína, agente de fijación a proteínas, molécula de acción selectiva sobre la integrina, policatiónico, péptido, poliamina, imitador peptídico y/o transferrina.

Los agentes de RNAi de la presente descripción se pueden preparar en una composición farmacéutica que 5 comprende diferentes componentes adecuados para el método particular de administración del agente de RNAi.

Administración de un agente de RNAi

La composición farmacéutica que comprende un β-ENaC se puede administrar por las vías yugal, inhalación (que incluye la insuflación y la inhalación profunda), nasal, oral, parenteral, implante, inyección o infusión por vía epidural, intraarterial, intraarticular, intracapsular, intracardíaca, intracerebroventricular, intracraneal, intradérmica, 10 intramuscular, intraorbital, intraperitoneal, intraespinal, intaesternal, intratecal, intravenosa, subaracnoide, subcapsular, subcutánea, subcuticular, transendotelial, transtraqueal, transvascular, rectal, sublingual, tópica y/o vaginal. Esto puede ser mediante inyección, infusión, parche dérmico o cualquier otro método conocido en la técnica. La formulación puede ser en polvo, nebulizada, en aerosol, granulada o de cualquier otra manera que esté preparada adecuadamente para la administración. La administración, si es líquida, puede ser lenta o mediante bolo,

15 aunque, en algunas circunstancias conocidas en la técnica, las inyecciones en embolada pueden conducir a la pérdida de material a través de los riñones.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de RNAi del β-ENaC se pueden administrar con los productos sanitarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización concreta, un agente de RNAi se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tales como los dispositivos descritos en las 20 patentes de los EE. UU. n.os 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente descripción incluyen: la patente de los EE. UU. n.º 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar la medicación a una velocidad controlada; la patente de los EE. UU. n.º 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicaciones a través de la piel; la patente de los EE. UU. n.º 4.447.233, que describe una bomba de infusión de la 25 medicación para administrar la medicación a una velocidad de infusión precisa; la patente de los EE. UU. n.º 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua del fármaco; la patente de los EE. UU. n.º 4.439.196, que describe un sistema de administración osmótica del fármaco que tiene compartimentos con varias cámaras; y la patente de los EE. UU. n.º 4.475.196, que describe un sistema de administración osmótica del fármaco. Los expertos en la técnica conocen muchos otros de tales implantes,

30 sistemas de administración y módulos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de RNAi se pueden formular para asegurar la distribución adecuada in vivo. La administración de un agente de RNAi del β-ENaC puede ser sistémica (todo el cuerpo) o, en particular, de acción selectiva sobre tejidos u órganos que expresan (o sobreexpresan o muestran su hiperactividad) el β-ENaC, tal como pulmón, riñón, colon y glándulas. Los métodos para actuar selectivamente sobre

35 estos tejidos u órganos concretos se describen en la presente memoria y/o se conocen en la técnica. Por ejemplo, se pueden formular en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, p. ej., las patentes de los EE. UU. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o varios restos que se transportan selectivamente al interior de células u órganos específicos; así pues, mejoran la administración dirigida del fármaco (véase, p. ej., V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685).

40 Los restos direccionantes de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.º 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de la proteína tensioactiva A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), diferentes especies las cuales pueden comprender las formulaciones de las presentes descripciones, así como componentes de las moléculas inventadas;

45 p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

Se describen composiciones farmacéuticas que comprenden uno o varios agentes de RNAi del β-ENaC, que pueden facultativamente comprender diferentes modificaciones y/o componentes adicionales, para el uso en el tratamiento de las enfermedades relacionadas con el β-ENaC.

50 Enfermedades relacionadas con el β-ENaC

La presente descripción abarca los agentes de RNAi específicos del β-ENaC.

Con «enfermedad relacionada con el β-ENaC» se quiere hacer referencia a cualquier enfermedad relacionada con una disfunción del nivel, de la expresión y/o de la actividad del β-ENaC y/o de cualquier enfermedad que se puede tratar y/o mejorar mediante la modulación del nivel, de la expresión y/o de la actividad del β-ENaC. En concreto,

55 incluye fibrosis quística, pseudohipoaldosteronismo de tipo 1 (PHA1), síndrome de Liddle, hipertensión, alcalosis, hipopotasiemia e hipertensión asociada a la obesidad.

Con «fibrosis quística» o «FQ» se quiere hacer referencia a la enfermedad hereditaria corriente asociada a

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Las modificaciones de las secuencias de los agentes de RNAi de las SEQ ID n.os 111 a 220 las concibe con facilidad el experto en la técnica. Los ejemplos y modificaciones no limitantes de estas secuencias se conciben y también se recogen en la tabla 1, p. ej., las secuencias sentido y antisentido (AS) en las SEQ ID n.os 1 a 110.

Algunas modificaciones se colocan en los sitios que se predice que son sensibles a las endonucleasas. Algunas

5 modificaciones se diseñan para eliminar una respuesta inmunitaria contra el siRNA a la vez que que se conserva la actividad. En general, la hebra sentido está muy modificada y la hebra antisentido ligeramente modificada. Algunas modificaciones sirven para más de un propósito.

Las secuencias de la tabla 1 y las otras tablas se representan con estas abreviaturas:

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concentraciones finales de doble hebra de 0,1 nM o 10 nM para cribados a cada dosis con cada una de las 55 dobles hebras del β-ENaC. La «fracción restante de mensajero» indica el nivel residual del gen, a 10 nM o 0,1 nM. Así pues, «0,17» en la segunda columna para AD-20832-b1 indica que, a una concentración de 10 nM, había un nivel residual del gen del 17%, o una atenuación de la expresión del 83%. Obsérvese también que el sufijo «b1»

5 indica «lote 1». Así pues, por ejemplo, un agente de RNAi con la denominación «AD-20832-b1» tiene la misma secuencia que un agente de RNAi denominado «AD-20832».

Tabla 3. Atenuación del β-ENaC a 10 nM y a 0,1 nM

Fracción restante de mensajero a 10 nM: Fracción restante de mensajero a 0,1 nM Desviación a 10 nM estándar Desviación estándar a 0,1 nM

AD-20832-b1: 0,17 0,33 0,04 0,03

AD-20848-b1: 0,17 0,49 0,01 0,04

AD-20807-b1: 0,18 0,26 0,02 0,05

AD-20826-b1: 0,19 0,49 0,02 0,22

AD-20837-b1: 0,19 0,51 0,04 0,04

AD-20861-b1: 0,19 0,71 0,02 0,29

AD-20834-b1: 0,20 0,34 0,06 0,05

AD-20806-b1: 0,22 0,60 0,02 0,15

AD-20851-b1: 0,23 0,55 0,04 0,07

AD-20865-b1: 0,24 0,64 0,02 0,05

AD-20811-b1: 0,25 0,52 0,17 0,23

AD-20819-b1: 0,27 0,60 0,01 0,07

AD-20839-b1: 0,27 0,55 0,06 0,05

AD-20835-b1: 0,28 0,63 0,07 0,21

AD-20825-b1: 0,30 0,72 0,11 0,15

AD-20867-b1: 0,30 0,68 0,00 0,20

AD-20813-b1: 0,34 0,56 0,17 0,36

AD-20823-b1: 0,34 0,75 0,05 0,05

AD-20805-b1: 0,36 0,86 0,02 0,09

AD-20831-b1: 0,36 0,60 0,01 0,21

AD-20862-b1: 0,38 0,93 0,02 0,29

AD-20808-b1: 0,40 0,81 0,13 0,16

AD-20827-b1: 0,40 2,55 0,07 1,44

AD-20828-b1: 0,42 0,89 0,11 0,25

AD-20812-b1: 0,47 0,74 0,32 0,36

AD-20836-b1: 0,48 1,07 0,11 0,27

AD-20822-b1: 0,49 0,94 0,11 0,09

AD-20810-b1: 0,53 0,87 0,25 0,20

AD-20824-b1: 0,54 1,12 0,08 0,33

AD-20844-b1: 0,55 0,98 0,07 0,28

AD-20814-b1: 0,60 1,30 0,09 0,12

AD-20838-b1: 0,65 1,18 0,07 0,18

AD-20816-b1: 0,66 1,38 0,05 0,17

AD-20845-b1: 0,72 1,18 0,01 0,27

AD-20820-b1: 0,75 0,89 0,06 0,14

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AD-20830-b1: 0,75 0,94 0,04 0,24

AD-20866-b1: 0,77 1,24 0,03 0,57

AD-20809-b1: 0,78 1,05 0,05 0,03

AD-20833-b1: 0,79 0,99 0,01 0,35

AD-20821-b1: 0,80 0,99 0,07 0,14

AD-20846-b1: 0,83 1,13 0,10 0,15

AD-20818-b1: 0,88 1,36 0,04 0,62

AD-20817-b1: 0,89 1,11 0,11 0,19

AD-20843-b1: 0,92 1,64 0,11 0,16

AD-20840-b1: 0,93 1,13 0,15 0,30

AD-20847-b1: 0,94 0,99 0,64 0,12

AD-20815-b1: 0,96 2,06 0,23 0,99

AD-20842-b1: 0,96 1,37 0,16 0,28

AD-20852-b1: 0,96 1,30 0,17 0,17

AD-20863-b1: 0,99 0,84 0,24 0,11

AD-20864-b1: 0,99 1,36 0,05 0,74

AD-20850-b1: 1,00 1,22 0,14 0,14

AD-20829-b1: 1,08 1,39 0,26 0,70

AD-20849-b1: 1,11 1,31 0,27 0,17

AD-20841-b1: 1,12 1,37 0,10 0,48

Todos los agentes de RNAi del β-ENaC utilizados en estos experimentos eran las secuencias modificadas (SEQ ID n.os 1 a 110) recogidas en la tabla 1.

La tabla 4 muestra los resultados de los experimentos, en donde un subconjunto de dobles hebras que muestran un 5 silenciamiento robusto de los cribados a 10 nM y 0,1 nM se ensaya a lo largo de un margen de concentraciones de 10 nM a 10 fM mediante diluciones en serie para determinar su CI50.

Tabla 4. Escrutinio de respuesta del β-ENaC a la dosis

H441 nueva (media de 4 replicas): H441 vieja (media de 8 replicas)

ID de la doble hebra: CI50 nM CI50 Desviación estándar CI50 nM CI50 Desviación estándar

AD-20807: 0,05 0,03 0,04 0,06

AD-20826: 0,14 0,05 0,05 0,07

AD-20832: 0,05 0,02 0,04 0,05

AD-20834: 0,06 0,03 0,03 0,06

AD-20848: 0,25 0,14 0,13 0,17

AD-20861: 0,13 0,08 0,09 0,06

Ejemplo 4 10 Análisis in vivo de los agentes de RNAi del β-ENaC AD-20807 y AD-20832 En experimentos in vivo, dos agentes de RNAi del β-ENaC, AD-20807 y AD-20832, se les analiza su capacidad para

atenuar el nivel del gen del β-ENaC en pulmones enteros de ratas. El propósito es determinar la respuesta en función de la dosis. También se mide la inmunoestimulación. La cepa de rata utilizada es Sprague-Dawley; los individuos tienen una masa aproximada de 280-300 g. Las ratas se

15 dosifican una vez al día durante dos días. A continuación se sacrifican aproximadamente 24 h después de la 74

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Claims

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