ES2439277T3 - Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde: a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1297), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1298); o b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND10630 (SEQ ID NO: 979), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND10630 (SEQ ID NO: 980).

Description

Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi
Campo técnico
La invención se refiere al campo del transporte iónico a través de las vías respiratorias mediado por ENaC, y a las composiciones y métodos para modular la expresión de alfa-ENaC, y más particularmente, con la subregulación de alfa-ENaC mediante oligonucleótidos por medio de la interferencia del ARN, que se administran localmente a los pulmones y al pasaje nasal por medio de administración por inhalación/intranasal, o se administran en forma sistémica, por ejemplo, mediante inyección intravenosa.
Antecedentes
El ARN de interferencia, o “ARNi" es un término inicialmente acuñado por Fire y colaboradores para describir la observación de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire y colaboradores, Nature 391: 806 - 811, 1998). El ARNbc corto dirige el silenciamiento posttranscripcional específico del gen en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función del gen. Esta tecnología ha sido revisada numerosas veces recientemente; véase, por ejemplo, Novina, C. D., y Sharp, P., Nature 2004, 430: 161, y Sandy, P., y colaboradores, Biotechniques 2005, 39: 215.
Las superficies mucosas en la interfase entre el medio ambiente y el cuerpo, han desarrollado una cantidad de mecanismos de protección. Una forma principal de tal defensa innata, es limpiar estas superficies con líquido. Típicamente, la cantidad de la capa de líquido sobre una superficie mucosa refleja el equilibrio entre la secreción líquida epitelial, que refleja con frecuencia la secreción de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contraión catiónico), y la absorción del líquido epitelial, que con frecuencia refleja la absorción de Na+, acoplada con agua y un contra-anión (Cl- y/o HCO3-). Muchas enfermedades de las superficies mucosas son causadas por tener muy poco líquido protector sobre estas superficies mucosas, creado por un desequilibrio entre la secreción (muy poca) y la absorción (relativamente alta). Los procesos defectuosos de transporte de sales que caracterizan estas disfunciones de las mucosas residen en la capa epitelial de la superficie mucosa. Un enfoque para reponer la capa protectora de líquido sobre las superficies mucosas es "reequilibrar" el sistema, por medio el bloqueo de Ia absorción de líquido mediada por el canal de Na+. La proteína epitelial que media la etapa limitante de la velocidad de la absorción de Na+ y de líquido es el canal epitelial de Na+ (ENaC). El alfa-ENaC se coloca sobre la superficie apical del epitelio, es decir, Ia interfase entre el medio ambiente y la superficie mucosa. La inhibición de la absorción de líquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede tener utilidad terapéutica. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar terapias efectivas para el tratamiento y la prevención de enfermedades o de trastornos en donde esté implicado la alfa-ENaC, por ejemplo, fibrosis quística en seres humanos y animales, y en particular para terapias con una alta eficiencia. Un requisito previo para una alta eficiencia es que el ingrediente activo no se degrade muy rápidamente en un medio ambiente fisiológico.
Li Tianbo y colaboradores, describe como la interferencia del ARN de alfa-ENaC inhibe la absorción de fluido en el pulmón de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649 - L660, 2006.
Resumen
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi que incluye una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:
a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1297), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1298); o
b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND10630 (SEQ ID NO: 979), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND10630 (SEQ ID NO: 980).
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi para la alfa - ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,
en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1297), y ND10630 (SEQ ID NO: 979), y
en donde la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1298) y ND10630 (SEQ ID NO: 980),
la composición comprende además un ligando del receptor epitelial.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi como se describió en la presente invención invención anteriormente para uso en terapia.
Las composiciones de la invención, por ejemplo, las composiciones del agente de ARNi pueden ser usadas con cualquier dosis y/o formulación descrita en la presente invención invención, así como con cualquier ruta de administración descrita en la presente invención invención.
Los detalles de una o más formas de realización de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y la descripción más adelante. Otras características, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de esta descripción, de los dibujos, y de las reivindicaciones.
En las Figuras:
Figura 1: Mapa de digestión de restricción de la construcción pXcon para α-EnaC del cinomólogo clonado.
Figura 2: Secuencia de ADN y de la proteína de alfa-ENaC de mono cinomólogo.
Figura 3: Clonación de los sitios de reconocimiento predichos en el objetivo y fuera del objetivo en la construcción del reportero de Iuciferasa dual AY535007. Los fragmentos consisten en 19 nucleótidos del sitio objetivo predicho, y 10 nucleótidos de la secuencia de flanqueo en ambos extremos 5’ y 3’.
Descripción detallada
Para mayor facilidad de exposición, el término “nucleótido" o “ribonucleótido" se utiliza algunas veces en la presente invención invención con referencia a una o más subunidades monoméricas de un agente de ARN. Se entenderá que el uso del término “ribonucleótido” o “nucleótido" en la presente invención invención puede, en el caso de un ARN modificado o de un sustituto de nucleótido, referirse también a un nucleótido modificado, una fracción de reemplazo sustituta, como se describe adicionalmente más adelante, en una o más posiciones.
Un “agente de ARN", como se utiliza en la presente invención invención, es un ARN no modificado, un ARN modificado, o un sustituto de nucleósido, cada uno de los cuales se describe en la presente invención invención o es bien conocido en la técnica de síntesis de ARN. Aunque se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleósidos, los ejemplos preferidos incluyen aquéllos que tienen una mayor resistencia a la degradación de la nucleasa que los ARN no modificados. Los ejemplos preferidos incluyen aquéllos que tienen una modificación del azúcar 2', una modificación en una saliente monocatenaria, preferiblemente una saliente monocatenaria 3’, o, particularmente si la cadena monocatenaria es una modificación 5’ que incluye uno o más grupos fosfato, o uno o más análogos de un grupo fosfato.
Un “agente de ARNi” (abreviatura para “agente de ARN de interferencia”), como se utiliza en la presente invención invención, es un agente de ARN que puede subregular la expresión de un gen objetivo, por ejemplo un gen SCNN1A para ENaC. Aunque sin ánimo de ceñirnos a ninguna teoría en particular, un agente de ARNi puede actuar mediante uno o más de una cantidad de mecanismos, incluyendo escisión posterior a la transcripción de un ARNm objetivo algunas veces denominado en la técnica como ARNi, o mecanismos previos a la transcripción o previos a la traducción.
Un “agente de ARNi bc" (abreviatura para "agente de ARNi bicatenario"), como se utiliza en la presente invención invención, es un agente de ARNi que incluye más de una, y preferiblemente dos cadenas, en donde la hibridación entre cadenas puede formar una región de estructura dúplex. Una "cadena" se refiere en Ia presente invención a una secuencia contigua de nucleótidos (incluyendo nucleótidos que no se presenten naturalmente o modificados). Las dos o más cadenas pueden ser, o cada una puede formar parte de moléculas separadas, o se pueden interconectar de una manera covalente, por ejemplo mediante un enlazador, por ejemplo un enlazador de polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una cadena puede incluir una región que sea suficientemente complementaria con un ARN objetivo. Tal cadena se denomina como Ia “cadena antisentido”. Una segunda cadena del agente de ARNbc, que comprende una región complementaria con la cadena antisentido, se denomina Ia “cadena sentido”. Sin embargo, también se puede formar un agente de ARNi bc a partir de una sola molécula de ARN que sea al menos parcialmente auto-complementaria, formando, por ejemplo, una estructura de horquilla o de manija, incluyendo unaregión dúplex. Éstas últimas se denominan en la presente invención invención como los ARN cortos de horquilla o ARNsh. En este caso, el término “cadena” se refiere a una de las regiones de la molécula de ARN que es complementaria a la otra región de la misma molécula de ARN.
Aunque, en células de mamífero, los agentes de ARNi bc largos pueden inducir la respuesta de interferón, que con frecuencia es nociva, los agentes de ARNi bc cortos no desencadenan la respuesta del interferón, al menos no hasta un grado en que sea perjudicial para Ia célula y/o para el huésped (Manche y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 12: 5238, 1992; Lee y colaboradores, Virology 199: 491, 1994; Castelli y colaboradores, J. Exp. Med. 186: 967, 1997; Zheng y colaboradores, RNA 10: 1934, 2004; Heidel y colaboradores, Nature Biotechnol. 22 1579). Los agentes de ARNi de la presente invención incluyen moléculas que son suficientemente cortas para no desencadenar una respuesta de interferón no específica nociva en células de mamífero normales. Por consiguiente, la administración de una composición que incluya un agente de ARNi (por ejemplo, formulada como se describe en la presente invención invención) a un sujeto, se puede utilizar para disminuir la expresión del alfa-ENaC en el sujeto, mientras que evita una respuesta del interferón. Las moléculas que son suficientemente cortas para no desencadenar una respuesta del interferón nocivo, se denominan como agentes de ARNi corto o los ARNi corto en la presente invención invención. “Agente de ARNi corto” o "ARNi corto", como se utiliza en la presente invención invención, se refiere a un agente de ARNi, por ejemplo, un agente de ARNi bc, que es suficientemente corto para no inducir una respuesta de interferón perjudicial en una célula de mamífero, y en particular de un ser humano, por ejemplo, tiene una región dúplex de menos de 60, pero preferiblemente de menos de 50, 40, o 30 pares de nucleótidos.
Los agentes de ARNi aislados descritos en la presente invención, incluyendo los agentes de ARNi bc y los agentes de ARNi corto, pueden mediar Ia expresión disminuida de alfa-ENaC, por ejemplo, mediante la degradación del ARN. Por conveniencia, este ARN también se denomina en la presente invención como el ARN que se va a silenciar. Este ácido nucleico también se denomina como un “ARN objetivo”, algunas veces “molécula de ARN objetivo”, o algunas veces “gen objetivo”.
Como se utiliza en Ia presente invención, la frase "ARNi media”, se refiere a la capacidad de un agente para silenciar, de una manera específica para la secuencia, un gen objetivo. “Silenciamiento de un gen objetivo” significa el proceso mediante el cual una célula que contiene y/o que expresa cierto producto del gen objetivo cuando no está en contacto con el agente, contendrá y/o expresará al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, o el 90% menos de ese producto genético cuando se pone en contacto con el agente, en comparación con una célula similar que no se haya puesto en contacto con el agente. Tal producto del gen objetivo, por ejemplo, puede ser un ARN mensajero (ARNm), una proteína, o un elemento regulador.
Como se utiliza en la presente invención, el término "complementario" se utiliza para indicar un grado suficiente de complementariedad, de tal manera que se presenta un enlace estable y especifico entre un compuesto y una molécula de ARN objetivo, por ejemplo ARNm para alfa-ENaC. El enlace específico requiere de un grado suficiente de complementariedad para evitar el enlace no específico del compuesto oligomérico con las secuencias no objetivo bajo condiciones en donde se desea el enlace especifico, es decir, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas en el caso de los ensayos in vivo o del tratamiento terapéutico, o en el caso de los ensayos in vitro, bajo condiciones en las que se llevan a cabo los ensayos. Las secuencias no objetivo típicamente difieren de las secuencias objetivo en al menos 2, 3, o 4 nucleótidos.
Como se utiliza en la presente invención, un agente de ARNi es “suficientemente complementario” con un ARN objetivo, por ejemplo, un ARNm objetivo (por ejemplo, ARNm para alfa-ENaC), si el agente de ARNi reduce la producción de una proteína codificada por el ARN objetivo en una célula. EI agente de ARNi también puede ser “exactamente complementario" con el ARN objetivo, por ejemplo, el ARN objetivo y el agente de ARNi se hibridan, preferiblemente para formar un híbrido hecho exclusivamente de pares de bases de Watson-Crick en la región de complementariedad exacta. Un agente de ARNi “suficientemente complementario” puede incluir una región interna (por ejemplo, de al menos 10 nucleótidos), que sea exactamente complementaria con un ARN para alfa-ENaC objetivo. Más aún, en algunas formas de realización, el agente de ARNi discrimina específicamente una diferencia de un solo nucleótido. En este caso, el agente de ARNi solamente media el ARNi si se encuentra una complementariedad exacta en Ia región (por ejemplo, dentro de 7 nucleótidos) la diferencia de un solo nucleótido. Los agentes de ARN preferidos se basarán en, o consistirán en, o comprenderán, las secuencias sentido y antisentido proporcionadas en las Tablas 1A - 1D.
Como se utiliza en la presente invención, “esencialmente idéntica”, cuando se utiliza para referirse a una primera secuencia de nucleótidos en comparación con una segunda secuencia de nucleótidos, significa que la primera secuencia de nucleótidos es idéntica a Ia segunda secuencia de nucleótidos, excepto por hasta una, dos, o tres sustituciones de nucleótidos (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo). “Que retiene esencialmente la capacidad para inhibir la expresión de alfa-ENaC en células humanas cultivadas”, como se utiliza en Ia presente invención para referirse a un agente de ARNi no idéntico a, pero derivado de, uno de los agentes de ARNi de las Tablas 1A -1D, mediante supresión, adición, o sustitución de nucleótidos, significa que el agente de ARNi derivado posee una actividad inhibidora no menor del 20% de la actividad inhibidora del agente de ARNi de las Tablas 1A 1D de donde se derivó. Por ejemplo, un agente de ARNi derivado a partir de un agente de ARNi de las Tablas 1A 1D, que disminuye la cantidad del ARNm para alfa-ENaC presente en las células humanas cultivadas en un 70%, puede por sí mismo disminuir la cantidad de ARNm presente en células humanas cultivadas en al menos un 50%, para que se considere como esencialmente retenedor de la capacidad para inhibir la replicación del alfa-ENaC en células humanas cultivadas. Opcionalmente, un agente de ARNi puede disminuir Ia cantidad del ARNn para alfa
ENaC presente en las células humanas cultivadas, en al menos un 50%.
Como se utiliza en Ia presente invención, un “sujeto" se refiere a un organismo de mamífero que experimenta el tratamiento para un trastorno mediado por alfa-ENaC. El sujeto puede ser cualquier mamífero, tal como una vaca, caballo, ratón, rata, perro, cerdo, cabra, o un primate. En la forma de realización preferida, el sujeto es un humano.
Diseño y selección de agentes de ARNi
Como se utiliza en la presente invención, "trastornos asociados con la expresión de alfa-ENaC" se refiere a cualquier estado biológico o patológico que (1) es mediado al menos en parte por la presencia de alfa-ENaC, y (2) cuyo resultado pueda ser afectado por la reducción del nivel de alfa-ENaC presente. Los trastornos específicos asociados con la expresión de alfa-ENaC se mencionan más adelante.
La presente divulgación se basa en el diseño, síntesis, y generación de agentes de ARNi que se dirigen al alfa-ENaC, y en la demostración del silenciamiento del gen para alfa-ENaC in vitro en células cultivadas después de la incubación con un agente de ARNi, y en el efecto protector resultantes para los trastornos mediados por alfa-ENaC.
Un agente de ARNi puede ser diseñado racionalmente con base en Ia información de secuencia y en las características deseadas. Por ejemplo, un agente de ARNi se puede diseñar de acuerdo con la temperatura de fusión relativa del dúplex candidato. En términos generales, el dúplex debe tener una temperatura de fusión más baja en el extremo 5’ de la cadena antisentido que en el extremo 3’ de la cadena antisentido.
La presente divulgación proporciona composiciones que contienen ARNi corto(s) y/o shARN(s) dirigidos hacia una o más transcripciones de alfa-ENaC.
Para cualquier objetivo genético particular que se seleccione, el diseño de los ARNi corto o los shARN para uso de acuerdo con la presente divulgación preferiblemente seguirá ciertos lineamientos. También, en muchos casos, el agente que se suministre a una célula de acuerdo con la presente invención, puede someterse a uno o más etapas de procesamiento antes de convertirse en un agente supresor activo (véase más adelante para una discusión adicional); en tales casos, aquellas personas ordinariamente capacitadas en este campo apreciarán que el agente relevante preferiblemente se diseñará para incluir secuencias que puedan ser necesarias para su procesamiento.
Las enfermedades mediadas por la disfunción del canal de sodio epitelial incluyen las enfermedades asociadas con la regulación de los volúmenes de fluido a través de las membranas epiteliales. Por ejemplo, el volumen de líquido superficial de las vías respiratorias es un regulador clave de la eliminación mucociliar y del mantenimiento de la salud del los pulmones. El bloqueo del canal de sodio epitelial promoverá Ia acumulación de fluido sobre el lado mucoso del epitelio de las vias respiratorias, promoviendo de esta manera la eliminación de moco, e impidiendo Ia acumulación de moco y de esputo en los tejidos respiratorios (incluyendo las vías respiratorias pulmonares). Estas enfermedades incluyen enfermedades respiratorias, tales como fibrosis quística, disquinesia ciliar primaria, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, infecciones del tracto respiratorio (agudas y crónicas; virales y bacterianas), y carcinoma pulmonar. Las enfermedades mediadas por el bloqueo del canal de sodio epitelial también incluyen enfermedades diferentes de las enfermedades respiratorias que están asociadas con la regulación anormal de fluido a través del epitelio, tal vez involucrando una fisiología anormal de los liquidos superficiales protectores sobre su superficie, por ejemplo xerostomía (boca seca) o queratoconjuntivitis sire (ojo seco). Adicionalmente, el bloqueo del canal de sodio epitelial en el riñón se podría utilizar para promover la diuresis y de esta manera inducir un efecto hipotensivo.
El tratamiento puede ser sintomático o profiláctico.
El asma incluye asma tanto intrínseca (no alérgica) como asma extrínseca (alérgica), asma leve, asma moderada, asma severa, asma bronquítica, asma inducida por el ejercicio, asma ocupacional, y asma inducida en seguida de infección bacteriana. También se debe entender que el tratamiento de asma abarca el tratamiento de sujetos, por ejemplo, de menos de 4 o 5 años de edad, que exhíban síntomas de sibilancia, y que sean diagnosticados o puedan ser diagnosticados como "bebés con sibilancia", una categoría de paciente establecida de importante preocupación médica y ahora identificada con frecuencia como de asmáticos incipientes o en fase temprana. (Para mayor conveniencia, esta condición asmática particular es denominada como “síndrome de bebé con sibilancia”).
La eficiencia profiláctica en el tratamiento de asma será evidenciada por una frecuencia o severidad reducida del ataque sintomático, por ejemplo de ataque asmático agudo o broncoconstrictor, mejoría en la función pulmonar, o mejor hiperreactividad de las vías respiratorias. Además se puede evidenciar por un requerimiento reducido de otra terapia sintomática, es decir, terapia para, o pretendida para restringir o abortar un ataque sintomático cuando se presente, por ejemplo antiinflamatorio (por ejemplo, corticosteroide) o broncodilatador. El beneficio profiláctico en asma, en particular, puede ser evidente en los sujetos susceptibles al “ahogamiento matutino”. El “ahogamiento matutino” es un sindrome asmático reconocido, común a un porcentaje sustancial de asmáticos, y caracterizado por
ataque de asma, por ejemplo entre las horas de aproximadamente de las 4 y las 6 am, es decir, en un momento por lo regular sustancialmente distante de cualquier terapia para el asma sintomática previamente administrada.
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica incluye bronquitis crónica o disnea asociada con la misma, enfisema, asi como exacerbación de la hiperreactividad de las vías respiratorias como consecuencia de otra terapia con fármacos, en particular otra terapia con fármacos inhalados. La invención también es aplicable al tratamiento de bronquitis de cualquier tipo o génesis, incluyendo, por ejemplo, bronquitis aguda, araquídica, catarral, cruposa, crónica, ftinoide.
Con base en los resultados mostrados en la presente invención, la presente divulgación proporciona agentes de ARNi que reducen la expresión de alfa-ENaC en células cultivadas y en un sujeto, por ejemplo un mamífero, por ejemplo un ser humano. Las Tablas 1A -1D proporcionan ejemplos de agentes de ARNi que se dirigen al alfa-ENaC, con base en las abreviaturas de la nomenclatura estándar suministradas en la Tabla A.
La Tabla 1A, SEQ ID NOs: 305 - 608, la Tabla 1B, y la Tabla 1D, SEQ lD NOs: 1519 - 1644, enlistan los ARNi corto que no incluyen modificaciones de nucleótidos, excepto por un enlace fosforotioato entre el terminal 3’ y las penúltimas timidinas. Las SEQ ID restantes en las Tablas 1A - 1D enlistan los ARNi corto en donde todos los nucleótidos que contienen bases de pirimidina son nucleótidos modificados por 2’-O-metilo en la cadena sentido, y todas las uridinas en un contexto de secuencia de 5’-ua-3', así como todas las citidinas en un contexto de secuencia de 5'-ca-3', son nucleótidos modificados por 2'-O-metilo en la cadena antisentido.
Con base en estos resultados, la invención proporciona específicamente un agente de ARNi que incluye una cadena sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de las secuencias de la cadena sentido de los agentes proporcionados en las Tablas 1A - 1D, y una cadena antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de las secuencias antisentido delos agentes proporcionados en las Tablas 1A - 1D.
Los agentes de ARNi mostrados en las Tablas 1A - 1D se componen de dos cadenas de 19 nucleótidos de longitud, las cuales son complementarias o idénticas a la secuencia objetivo, más una 3’-TT que sobresale. La presente invención proporciona agentes que comprenden al menos 15, o al menos 16, 17 o 18, o 19 nucleótidos contiguos a partir de estas secuencias. Sin embargo, aunque estas longitudes pueden ser potencialmente óptimas, los agentes de ARNi no pretenden limitarse a estas longitudes. La persona experta está bien consciente de que agentes de ARNi más cortos o más largos pueden ser similarmente efectivos, debido a que, dentro de ciertos intervalos de longitud, la eficacia es más bien una función de la secuencia de nucleótidos que de la longitud de la cadena. Por ejemplo, Yang, y colaboradores, PNAS 9929942-9947 (2002,), demostraron eficacias similares para agentes de ARNi de longitudes entre 21 y 30 pares de bases. Otros han demostrado un silenciamiento efectivo de genes mediante agentes de ARNi bajando hasta una longitud de aproximadamente 15 pares de bases (Byrom, y colaboradores, “lnducing RNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase lll” Tech Notes 10 (1), Ambion, lnc., Austin, TX).
Por consiguiente, es posible y es contemplado seleccionar a partir de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A - 1D, una secuencia parcial entre 15 y 19 nucleótidos para la generación de un agente de ARNi derivado apartir de una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A - 1D. De una manera alternativa, se pueden añadir uno o varios nucleótidos a una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 1A - 1D, o un agente que contenga 15 nucleótidos contiguos a partir de uno de estos agentes, preferiblemente, pero no necesariamente, de tal forma que los nucleótidos agregados sean complementarios con la respectiva secuencia del gen objetivo, por ejemplo, alfa-ENaC. Por ejemplo, los primeros 15 nucleótidos a partir de uno de los agentes se pueden combinar con los 8 nucleótidos que se encuentran 5’ con esta secuencia en el ARNm para alfa-ENaC, para obtener un agente con 23 nucleótidos en las cadenas sentido y antisentido. Todos estos agentes de ARNi derivados se incluyen en ios agentes de ARNi, siempre y cuando retengan esencialmente Ia capacidad para inhibir la replicación de alfa-ENaC en células humanas cultivadas.
La cadena antisentido de un agente de ARNi debe ser igual a, o de al menos, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40, o 50 nucleótidos de longitud. Debe ser igual a, o menor de 60, 50, 40, o 30 nucleótidos de longitud. Los intervalos preferidos son de 15 a 30, de 17 a 25, de 19 a 23, y de 19 a 21 nucleótidos de longitud.
La cadena sentido de un agente de ARNi de ser igual, o de al menos 14, 15,16,17,18, 19, 25, 29,40, o 50 nucleótidos de longitud. Debe ser igual a, o menor de 60, 50, 40, o 30 nucleótidos de longitud. Los intervalos preferidos son de 15 a 30, de 17 a 25, de 19 a 23, y de 19 a 21 nucleótidos de longitud.
La porción bicatenaria de un agente de ARNi debe ser iguala, o de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40, o 50 pares de nucleótidos de longitud. Debe ser igual a, o menor de 60, 50, 40, o 30 pares de nucleótidos de longitud. Los intervalos preferidos son de 15 - 30, de 17 a 25, de 19 a 23, y de 19 a 21 pares de nucleótidos de longitud.
En general, los agentes de ARNi incluyen una región de suficiente complementariedad para el ARNm para alfa-ENaC, y son de una longitud suficiente en términos de nucleótidos, para que el agente de ARNi, o un fragmento del mismo, pueda mediar la subregulación del gen para alfa-ENaC. No es necesario que exista una complementariedad perfecta entre el agente de ARNi y el gen objetivo, pero la correspondencia debe ser suficiente para hacer posible que el agente de ARNi, o un producto de disociación del mismo, dirija el silenciamiento específico de la secuencia, por ejemplo, mediante la disociación del ARNi de un ARNm para alfa-ENaC.
Por consiguiente, los agentes de ARNi incluyen los agentes que comprenden una cadena sentido y una cadena antisentido, cada una comprendiendo una secuencia de al menos 16, 17, o 18 nucleótidos, que sea esencialmente idéntica, como se define más adelante, a una de las secuencias de las Tablas 1A - 1D, excepto que no más de 1, 2,
o 3 nucleótidos por cadena, respectivamente, hayan sido sustituidos por otros nucleótidos (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo), mientras que retengan esencialmente Ia capacidad para inhibir Ia expresión de alfa-ENaC en células humanas cultivadas. Estos agentes poseen por lo tanto al menos 15 nucleótidos idénticos a una de las secuencias de las Tablas 1A - 1D, pero se introducen 1, 2, o 3 faltas de correspondencia de bases con respecto ya sea a la secuencia de alfa-ENaC objetivo, o bien entre las cadenas sentido y antisentido. Las faltas de correspondencia con Ia secuencia de ARN para alfa-ENaC objetivo, en particular en la cadena antisentido, son más toleradas en las regiones terminales, y si están presentes, preferiblemente en una región o regiones terminales, por ejemplo dentro de 6, 5, 4, o 3 nucleótidos de un terminal 5' y/o 3’, más preferiblemente dentro de 6, 5, 4, o 3 nucleótidos del terminal 5' de la cadena sentido, o del terminal 3’ de la cadena antisentido. La cadena sentido solamente necesita ser suficientemente complementaria con Ia cadena antisentido para mantener el carácter bicatenario global de Ia molécula.
Se prefiere que las cadenas en sentido y antisentido se escojan de tal manera que el agente de ARNi incluya una sola cadena o región no apareada en uno o ambos extremos de la molécula. Por consiguiente, un agente de ARNi contiene cadenas sentido y antisentido, preferiblemente emparejadas para contener una saliente, por ejemplo, una o dos salientes 5’ o 3', pero preferiblemente una saliente 3’ de 2 - 3 nucleótidos. La mayoría de las formas de realización tendrán una saliente 3’. Los agentes de ARNi corto preferidos tendrán salientes monocatenarias, preferiblemente salientes 3’, de 1 a 4, o preferiblemente de 2 o 3 nucleótidos de longitud, en uno o en ambos extremos del agente de ARNi. Las salientes pueden ser el resultado de que una cadena sea más larga que la otra, o el resultado de que dos cadenas de la misma longitud estén escalonadas. Los nucleótidos no emparejados que forman la saliente puede ser ribonucleótidos, o pueden ser desoxirribonucleótidos, preferiblemente timidina. Los extremos 5' preferiblemente están fosforilados, o pueden no estar fosforilados.
Las longitudes preferidas para la región dúplex están entre 15 y 30, más preferiblemente de 18, 19, 20, 21, 22, y 23 nucleótidos de longitud, por ejemplo, en el intervalo del agente de ARNi corto discutido anteriormente. Los agentes de ARNi corto pueden parecerse en longitud y estructura a los productos procesados naturales Dicer de los ARN bc largos. Las formas de realización en donde se enlazan las dos cadenas del agente de ARNi corto, por ejemplo, donde se enlazan de una manera covalente, también están incluidas. Las estructuras de cadena de horquilla, u otras monocatenarias, que proporcionan la región bicatenario preferida, y preferiblemente una saliente 3’, también están dentro de la invención.
Evaluación de los agentes de ARNi candidatos
Como se anotó anteriormente, la presente invención proporciona un sistema para identificar los ARNi corto que son útiles como inhibidores de alfa-ENaC. Ya que, como se observó anteriormente, los shARN se procesan en forma intracelular para producir los ARNi corto que tienen porciones dúplex con la misma secuencia que la estructura del tronco del shARN, el sistema es igualmente útil para identificar los shARN que son útiles como inhibidores de alfa-ENaC. Para propósitos de descripción, esta sección se referirá a los ARNi corto, pero el sistema también abarca los shARN correspondientes. Específicamente, la presente invención demuestra la preparación exitosa de los ARNi corto destinados a inhibir la actividad de alfa-ENaC. Las técnicas y reactivos descritos en la presente invención se pueden aplicar fácilmente para diseñar nuevos ARNi corto potenciales, dirigidos a otros genes o regiones genéticas, y probados para determinar su actividad en la inhibición del alfa-ENaC, como se discute en la presente invención.
En diferentes formas de realización, los inhibidores potenciales de alfa-ENaC se pueden probar para determinar la supresión de la expresión endógena de alfa-ENaC, mediante la introducción de ARNi corto candidato(s) en las células (por ejemplo, mediante administración exógena, o mediante la introducción de un vector o construcción que dirija la síntesis endógena del ARNi corto en la célula), o en animales de laboratorio, mediante administración pulmonar o nasal. Alternativamente, los inhibidores potenciales de alfa-ENaC se pueden probar in vitro mediante la cotransfección transitoria de el(los) ARNi corto candidato(s), junto con un plásmido de expresión de alfa-ENaC. Se evalúa entonces la capacidad de el(los) ARNi corto candidato(s) para reducir los niveles de transcripción objetivo y/o para inhibir o suprimir uno o más aspectos o características de la actividad del alfa-ENaC, tales como la diferencia de potencial epitelial o la absorción de fluido superficial de las vías respiratorias.
Se pueden comparar células o animales de laboratorio a los que se les ha suministrado las composiciones de ARNi corto de la invención (células/animales de prueba), con células o animales de laboratorio similares o comparables
que no hayan recibido la composición de la invención (células/animales de control, por ejemplo células/animales que no hayan recibido ni ARNi corto ni ARNi corto de control, tal como un ARNi corto dirigido a una transcripción no endógena, tal como la proteína fluorescente verde (GFP)). El fenotipo de transporte de iones de las células/animales de prueba, se puede comparar con el fenotipo de las células/animales de control, siempre y cuando el ARNi corto de la invención comparta la reactividad cruzada de secuencia con los tipos/especies de células de prueba. La producción de la proteína de alfa-ENaC y la corriente de corto circuito (in vitro o ex vivo) se pueden comparar en las células/animales de prueba en relación con las células/animales de control. De forma similar, se pueden comparar otros indicios de la actividad de alfa-ENaC, incluyendo la diferencia de potencial epitelial ex vivo, o la eliminación mucociliar in vivo, o la formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) del cuerpo completo. En términos generales, las células/animales de prueba y las células/animales de control serían de la misma especie, y, para las células, de un tipo de célula similar o idéntico. Por ejemplo, se podrían comparar las células de la misma linea celular. Cuando la célula de prueba es una célula primaria, típicamente la célula de control también sería una célula primaria.
Por ejemplo, la capacidad de ARNi corto candidato para inhibir la actividad de alfa-ENaC se puede determinar de una forma conveniente mediante (i) el suministro del ARNi corto candidato a las células, (ii) la evaluación de los niveles de expresión del ARNm para alfa-ENaC en relación con un gen de control expresado en forma endógena,
(iii) Ia comparación de la corriente sensible a Ia amilorida en un modelo celular in vitro producido en la presencia delARNi corto con la cantidad producida en ausencia del ARNi corto. Éste último ensayo se puede utilizar para probar los ARNi corto que se dirijan a cualquier transcripto objetivo que pueda tener influencia sobre la actividad de alfa-ENaC indirectamente, y no se limita a los ARNi corto que se dirigen a los transcriptos que codifican las subunidades del canal de ENaC.
La capacidad de un ARNi corto candidato para reducir el nivel de transcripto objetivo se puede evaluar midiendo la cantidad del transcripto objetivo, utilizando, por ejemplo, transferencias tipo Northern, ensayos de protección de nucleasa, hibridación de sondas, PCR de transcripción inversa (RT), RT-PCR en tiempo real, análisis de microarreglos, etc. La capacidad de un ARNi corto candidato para inhibir la producción de un polipéptido codificado por el transcripto objetivo (ya sea al niveI transcripcional o post-transcripcional) se puede medir empleando una variedad de enfoques basados en anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, transferencias tipo Western, inmunoensayos, ELISA, citometría de flujo, microarreglos de proteina, etc. En general, se puede emplear cualquier método para medir la cantidad de transcripto objetivo, o bien de un polipéptido codificado por el transcripto objetivo.
En general, ciertos inhibidores de Alfa-ENaC por medio de ARNi preferidos reducen el nivel de transcripto objetivo al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 16 veces, al menos aproximadamente 64 veces, o inclusive hasta un mayor grado en relación con el nivel que estaría presente en ausencia del inhibidor (por ejemplo, en una célula de control comparable que carezca del inhibidor). En general, ciertos inhibidores de Alfa-ENaC por medio de ARNi preferidos inhiben la actividad del canal de ENaC, de tal manera que la actividad es más ‘baja en una célula que contenga al inhibidor que en una célula de control que no contenga al inhibidor por al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente cuatro veces, más preferiblemente al menos aproximadamente ocho veces, al menos aproximadamente dieciséis veces, al menos aproximadamente 64 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, o inclusive hasta un mayor grado.
Ciertos inhibidores preferidos de alfa-ENaC por medio de ARNi inhiben la actividad del canal de ENaC durante al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 120 horas, al menos 144 horas, o al menos 168 horas, luego de la administración del ARNi corto y de la infección de las células. Ciertos inhibidores preferidos de alfa-ENaC previenen (es decir, reducen hasta niveles indetectables), o reducen de una manera significativa la actividad de alfa-ENaC durante al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, o al menos 60 horas luego de la administración del ARNi corto. De acuerdo con diferentes modalidades de la invención, una reducción significativa en la actividad de alfa-ENaC, es una reducción hasta aproximadamente menos del 90% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNi corto, una reducción hasta aproximadamente menos del 75 del nivel que se presentaría en ausencia del ARNi corto, una reducción de aproximadamente menos del 50% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNi corto, una reducción de aproximadamente menos del 25% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNi corto, o una reducción hasta aproximadamente menos del 10% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNi corto. La reducción en la actividad de alfa-ENaC se puede medir utilizando cualquier método adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a la medición de la corriente de corto circuito de la sensibilidad a la amilorida in vitro, la diferencia del potencial epitelial ex vivo o in vivo en la eliminación mucociliar en el MRl pulmonar/de todo el cuerpo.
Prueba de estabilidad, modificación, y nueva prueba de agentes de ARNi
Un agente de ARNi candidato se puede evaluar con respecto a la estabilidad, por ejemplo su susceptibilidad a la disociación mediante una endonucleasa o exonucleasa, tal como cuando se introduce el agente de ARNi en el cuerpo de un sujeto. Se pueden emplear métodos para identificar los sitios que sean susceptibles a la modificación, en particular a la disociación, por ejemplo a la disociación mediante un componente que se encuentra en el cuerpo
de un sujeto. Tales métodos pueden incluir el aislamiento y la identificación de los fragmentos más abundantes formados por la degradación del agente de ARNi candidato después de su incubación con medios biológicos aislados in vitro, por ejemplo suero, plasma, esputo, fluido cerebroespinal, u homogenatos celulares o tisulares, o después de poner en contacto a un sujeto con el agente de ARNi candidato in vivo, identificando de esta manera los sitios susceptibles a la disociación. Estos métodos se encuentran, por ejemplo, sin limitación, en Ia publicación de la solicitud de patente internacional No WO 2005115481, presentada el 27 de mayo de 2005.
Cuando se identifican los sitios susceptibles a la disociación, se puede diseñar y/o sintetizar un agente de ARNi adicional, en donde el sitio de disociación potencial se haga resistente a la disociación, por ejemplo, mediante la introducción de una modificación 2’ en el sitio de la disociación, por ejemplo, un grupo 2’-O-metilo. Este agente de ARNi adicional se puede volver a probar para determinar su estabilidad, y este proceso se puede repetir hasta encontrar un agente de ARNi que exhiba la estabilidad deseada.
Prueba in vivo
Un agente de ARNi identificado como capaz de inhibir la expresión del gen para alfa-ENaC, se puede probar para determinar su funcionalidad in vivo en un modelo animal (por ejemplo, en un mamífero, tal como en un ratón, rata, cobayo, o primate). Por ejemplo, el agente de ARNi se puede administrar a un animal, y el agente de ARNi se puede evaluar con respecto a su biodistribución, estabilidad, y a su capacidad para inhibir la expresión de alfa-ENaC, o para modular un proceso biológico o patológico mediado al menos en parte por alfa-ENaC.
El agente de ARNi se puede administrar directamente al tejido objetivo, tal como mediante inyección, o el agente de ARNi se puede administrar al modelo animal de la misma forma en que se administraria a un ser humano. Preferiblemente, el agente de ARNi se suministra a las vías respiratorias del sujeto, tal como mediante administración intranasal, inhalada, o intratraqueal.
El agente de ARNi también se puede evaluar para determinar su distribución intracelular. La evaluación puede incluir la determinación de si el agente de ARNi fue absorbido dentro de la célula. La evaluación también puede incluir determinar la estabilidad (por ejemplo, la vida media) del agente de ARNi. La evaluación de un agente de ARNi in vivo se puede facilitar mediante el uso de un agente de ARNi conjugado con un marcador rastreable (por ejemplo, un marcador fluorescente, tal como fluoresceína; un marcador radioactivo, tal como 35S, 32P, 33P, o 3H; partículas de oro; o partículas de antígeno para inmunohistoquímica).
El agente de ARNi se puede evaluar con respecto a su capacidad para subregular la expresión de alfa-ENaC. Los niveles de expresión del gen para alfa-ENaC in vivo se pueden medir, por ejemplo, mediante hibridación in situ, o mediante el aislamiento del ARN a partir del tejido antes y después de la exposición al agente de ARNi. Cuando el animal necesita ser sacrificado con el objeto de cosechar el tejido, un animal de control no tratado servirá para la comparación. El ARN para alfa-ENaC se puede detectar mediante cualquier método deseado, incluyendo, pero sin limitarse a, RT-PCR, transferencia tipo Northern, ensayo de ADN ramificado, o ensayo de protección de ARNasa. Alternativamente, o adicionalmente, se puede monitorear la expresión del gen para alfa-ENaC llevando a cabo el análisis de transferencia tipo Western, o inmunocoloración sobre extractos de tejido tratados con el agente de ARNi.
Los inhibidores potenciales de alfa-ENaC se pueden probar empleando una variedad de modelos animales que se han desarrollado. Se pueden administrar a un animal composiciones que comprendan ARNi corto candidato(s), construcciones o vectores capaces de dirigir la síntesis de tales ARNi corto dentro de una célula huésped, o células modificadas o manipuladas por ingeniería genética para contener los ARNi corto candidatos. Se evalúa la capacidad de la composición para suprimir la expresión de alfa-ENaC, y/o para modificar los fenotipos dependientes de ENaC, y/o para disminuir su severidad en relación con los animales que no hayan recibido el inhibidor potencial de alfa-ENaC. Estos modelos incluyen, pero no se limitan a, modelos de múrido, rata, cobayo, oveja, y primates no humanos para los fenotipos dependientes de ENaC, todos los cuales son conocidos en la técnica, y se utilizan para probar Ia eficacia de los productos terapéuticos potenciales de alfa-ENaC.
Utilizando los sistemas inventados para Ia identificación de los agentes terapéuticos candidatos de ARNi corto, se seleccionan los agentes terapéuticos adecuados a partir de los identificadores Dúplex ND-8302, ND-8332, ND-8348, ND-8356, ND-8357, ND-8373, ND-8381, ND-8396, ND-8450, y ND-8453, más adecuadamente seleccionados a partir de ND-8356, ND-8357 y ND-8396.
Química del ARNi
En la presente invención se describen agentes de ARNi aislados, por ejemplo los agentes de ARN bc, que median el ARNi para inhibir la expresión del gen para alfa-ENaC.
Los agentes de ARN discutidos en la presente invención incluyen o bien el ARN no modificado, así como el ARN que ha sido modificado, por ejemplo, para mejorar la eficacia, y polímeros de sustitutos de nucleósidos. Un ARN no
modificado se refiere a una molécula en donde los componentes del ácido nucleico, es decir, azúcares, bases, y fracciones de fosfato, son los mismos o esencialmente los mismos que aquéllos que se presentan en la naturaleza, preferiblemente como se presentan naturalmente en el cuerpo humano. En el estado del arte se denomima como raro o inusual, pero de origen natural, los ARN como los ARN modificados; véase, por ejemplo, Limbach y colaboradores, Nucleic Acíds Res. 22: 2183 - 2196, 1994. Tales ARN raros o inusuales, a menudo denominados como ARN modificados (aparentemente debido a que son típicamente el resultado de una modificación posterior a la transcripción), están dentro del término de ARN no modificado, como se utiliza en la presente invención. El ARN modificado, como se utiliza en la presente invención, se refiere a una molécula en donde uno o más de los componentes del ácido nucleico, es decir, azúcares, bases, y fracciones de fosfato, son diferentes de aquéllos que se presentan en la naturaleza, preferiblemente diferentes de aquéllos que se presentan en el cuerpo humano. Aunque se denominan como “ARN" modificados, desde luego, debido a la modificación, incluyen moléculas que no son ARN. Los sustitutos de nucleósidos son moléculas en donde la estructura base de ribofosfato es reemplazada con una construcción que no es ribofosfato, que permite que las bases se presenten en la relación espacial correcta, de tal modo que la hibridación es sustancialmente similar a la que se ve con una estructura base de ribofosfato, por ejemplo, miméticos no cargados de la estructura principal de ribofosfato. Los ejemplos de lo anterior se discuten en Ia presente invención.
Las modificaciones descritas en la presente invención se pueden incorporar en cualquier ARN bicatenario y molécula del tipo ARN descrita en la presente invención, por ejemplo un agente de ARNi. Puede ser deseable modificar una o ambas de las cadenas antisentido y sentido de un agente de ARNi. Debido a que los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades o monómeros, muchas de las modificaciones descritas más adelante se presentan en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, por ejemplo una modificación de una base, o una fracción de fosfato, o el oxígeno no enlazante de una fracción de fosfato. En algunos casos, la modificación se presentará en todas las posiciones objetivo en el ácido nucleico, pero en muchos, y de hecho en la mayoría de los casos, no Io harán. A manera de ejemplo, una modificación solamente puede presentarse en una posición terminal 3’ o 5’, solamente puede presentarse en una región terminal, por ejemplo, en una posición sobre un nucleótido terminal, o en los últimos 2, 3, 4, 5, o 10 nucleótidos de una cadena. Una modificación puede presentarse en una región bicatenaria, o en una región monocatenaria, o en ambas. Por ejemplo, una modificación de fosforotioato en una posición de O no enlazante, solamente puede presentarse en uno o ambos terminales, y solamente puede presentarse en las regiones terminales, por ejemplo en una posición sobre un nucleótido terminal, o en los últimos 2, 3, 4, 5, o 10 nucleótidos de una cadena, o puede presentarse en las regiones bicatenarias y monocatenarias, en particular en los terminales. De una manera similar, puede presentarse una modificación sobre la cadena sentido, sobre la cadena antisentido, o sobre ambas. En algunos casos, las cadenas sentido y antisentido tendrán las mismas modificaciones o la misma clase de modificaciones, pero en otros casos, las cadenas sentido y antisentido tendrán diferentes modificaciones, por ejemplo, en algunos casos puede ser deseable modificar solamente una cadena, por ejemplo la cadena sentido.
Dos objetivos primordiales para la introducción de las modificaciones en los agentes de ARNi es su estabilización hacia Ia degradación en los medios ambientes biológicos, y la mejora de las propiedades farmacológicas, por ejemplo las propiedades farmacodinámicas, las cuales se discuten adicionalmente más adelante. Otras modificaciones adecuadas a un azúcar, base, o estructura base de un agente de ARNi, son descritas en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/01193, presentada el 16 de enero de 2004. Un agente de ARNi puede incluir una base que no sea de origen natural, tales como las bases descritas en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/011822, presentada el 16 de abril de 2004. Un agente de ARNi puede incluir un azúcar que no se de origen natural, tal como una molécula portadora cíclica que no sea un carbohidrato. Las caracteristicas que sirven de ejemplo de los azúcares que no son de origen natural para utilizarse en los agentes de ARNi, se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/11829, presentada el 16 de abril de 2003.
Un agente de ARNi puede incluir un enlace entre nucleótidos (por ejemplo, el enlace fosforotioato quiral), útil para aumentar la resistencia a Ia nucleasa. Además, o en forma alternativa, un agente de ARNi puede incluir un mimético de ribosa para una mayor resistencia a la nucleasa. Los ejemplos de enlaces entre nucleótidos y los miméticos de ribosa para una mayor resistencia a la nucleasa, se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede incluir subunidades de monómeros conjugados con Iigando y monómeros para la síntesis de oligonucleótidos. Los monómeros de ejemplo se describen en la Solicitud de los Estados Unidos No. 10/916.185, presentada el 10 de agosto de 2004.
Un agente de ARNi puede tener una estructura ZXY, tal como se describe en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede formar un complejo con una fracción anfipática. Los ejemplos de fracciones anfipáticas de para ser utilizadas con los agentes de ARNi se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
En otra forma de realización, el agente de ARNi puede formar complejo con un agente de suministro que proporcione un complejo modular. El complejo puede incluir un agente portador enlazado con uno o más de (preferiblemente dos o más, más preferiblemente los tres de): (a) un agente de condensación (por ejemplo, un agente capaz de atraer, por ejemplo enlazar, un ácido nucleico, por ejemplo a través de interacciones iónicas o electrostáticas); (b) un agente fusogénico (por ejemplo, un agente capaz de fusionarse y/o de ser transportado a través de una membrana celular); y (c) un grupo direccionador, por ejemplo, un agente direccionador a células o tejidos, por ejemplo una Iectina, glicoproteina, Iípido, o proteína, por ejemplo un anticuerpo, que se enlace con un tipo de célula especificado. Los agentes de ARN que forman complejo con un agente de suministro se describen en la Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede tener apareamientos no canónicos, tales como entre las secuencias sentido y antisentido del dúplex de ARNi. Las características que sirven de ejemplo de agentes de ARNi no canónicos se describen en Ia Solicitud PCT No. PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Mejor resistencia a la nucleasa
Un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi que elija como objetivo al alfa-ENaC, puede tener una mejor resistencia a las nucleasas.
Una forma de aumentar la resistencia es identificar los sitios de disociación, y modificar tales sitios para inhibir la disociación, como se describe en la Solicitud de los Estados Unidos No. 60/559.917, presentada el 4 de mayo de 2004. Por ejemplo, los dinucleótidos 5'-ua-3', 5'-ca-3’, 5’-ug-3', 5’-uu-3’, o 5’-cc-3’, pueden servir como sitios de disociación. En ciertas formas de realización, todas las pirimidinas de un agente de ARNi portan una modificación 2’ ya sea en la cadena sentido, en la cadena antisentido, o en ambas cadenas, y, por consiguiente, el agente de ARNi tiene una mejor resistencia a las endonucleasas. También se puede lograr una mejor resistencia a la nucleasa mediante la modificación del nucleótido 5’, dando como resultado, por ejemplo, al menos un dinucleótido de 5'uridina-adenina-3’ (5’-ua-3’), en donde la uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’citidina-adenina-3’ (5'-ca-3’), en donde la 5’-citidina es un nucieótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5'-uridina-guanina-3’ (5’-ug-3'), en donde la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’-uridina-uridina-3’ (5'-uu-3’), en donde la 5'-uridina es un nucleótido modificado en 2’; o al menos un dinucleótido de 5’-citidina-citidina-3’ (5’-cc-3’), en donde la 5'-citidina es un nucleótido modificado en 2’, como se describe en ia Solicitud Internacional No. PCT/US2005/O18931, presentada ei 27 de mayo de 2005. El agente de ARNi puede incluir al menos 2, al menos 3, al menos 4, o al menos 5 de tales dinucleótidos. En una forma de realización particularmente preferida, el nucleótido 5’ en todas las apariciones de los motivos de secuencias 5'-ua-3' y 5'-ca-3’, ya sea en la cadena sentido, en la cadena antisentido, o en ambas cadenas, es un nucleótido modificado. Preferiblemente, el nucieótido 5’ en todas las apariciones de los motivos de secuencia 5'-ua-3’, 5'-ca-3’, y 5'-ug-3', ya sea en la cadena sentido, en la cadena antisentido, o en ambas cadenas, es un nucleótido modificado. Más preferiblemente, todos los nucleótidos de pirimidina en la cadena sentido son nucleótidos modificados, y el nucleótido 5’ en todas las apariciones de los motivos de secuencia 5'-ua-3' y 5’-ca-3’ en la cadena antisentido, son nucleótidos modificados, o en donde la cadena antisentido no incluye ni un motivo 5’-ua-3’ ni 5'-ca-3', en todas las apariciones del motivo de secuencia 5'-ug-3’.
Preferiblemente, los nucleótidos modificados en 2’ incluyen, por ejemplo, una unidad de ribosa modificada en 2’, por ejemplo se puede modificar o reemplazar el grupo 2’-hidroxilo (OH) con un número de diferentes sustituyentes “oxi”
o "desoxi".
Los ejemplos de las modificaciones del grupo hidroxilo “oxi"-2’ incluyen alcoxi o ariloxi (OR, por ejemplo R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucieicos “bloqueados” (LNA), en los cuales el hidroxilo 2’ se conecta, por ejemplo, mediante un puente de metileno, con el carbono 4’ del mismo azúcar de ribosa; O-AMINA y aminoalcoxi, O(CH2)nAMINA, (por ejemplo, AMINA = NH2; aIquiIamino, diaIquilamino, heterocicIilamino, arilamino, diarilamino, heteroariIamino, o diheteroariIamino, etilén diamina, poliamino). Vale la pena observar que los oligonucleótidos que contienen solamente el grupo metoxietilo (MOE), (OCH2CH2OCH3, un derivado de PEG), exhiben estabilidades de nucleasa comparables a aquéllas modificadas con la modificación robusta de fosforotioato.
Las modificaciones “desoxi" incluyen hidrógeno (es decir, azúcares de desoxirribosa, que son de una relevancia particular para las porciones que sobresalen de los ARN bc parciales); halógeno (por ejemplo, flúor), amino (por ejemplo, NH2; aIquiIamino, diaIquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroariIamino, o aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterocicIilamino, arilamino, diarilamino, heteroariIamino, o diheteroarilamino), NHC(O)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, o azúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquilo; tioalcoxi; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo, y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con una función amino.
Los sustituyentes preferidos son 2’-metoxietilo, 2'-OCH3, 2’-O-alilo, 2’-C-aIiIo, y 2'-flúor.
La inclusión de los azúcares de furanosa en la estructura base del oligonucleótido también puede disminuir la disociación endonucleolítica. Un agente de ARNi se puede modificar adicionalmente mediante la inclusión de un grupo catiónico 3’, o invirtiendo el nucleósido en el terminal 3' con un enlace 3'-3’. En otra forma de realización alternativa, el terminal 3’ se puede bloquear con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un aminoalquilo dT de 5 carbonoa 3’. Otros conjugados de 3’ pueden inhibir la disociación exonucleolítica de 3’-5’. Aunque sin querer ceñirese a ninguna teoría en particular, un conjugado de 3’, tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir Ia disociación exonucleolítica mediante el bloqueo estérico de Ia exonucleasa para que no se enlace con el extremo 3’ del oligonucleótido. Inclusive pequeñas cadenas de alquilo, grupos arilo, o conjugados heterocíclicos, o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear las exonucleasas de 3’-5’.
La disociación nucleolítica también se puede inhibir mediante la introducción de modificaciones del enlazador de fosfato, por ejemplo enlaces fosforotioato. Por consiguiente, los agentes de ARNi preferidos incluyen dímeros de nucleótidos enriquecidos o puros para una forma quiral particular de un grupo fosfato modificado que contenga un heteroátomo en una posición que no sea de formación de puente normalmente ocupada por el oxígeno. El heteroátomo puede ser S, Se, Nr2,o Br3. Cuando el heteroátomo es S, se prefiere el enlace Sp quiralmente puro o enriquecido. Enriquecido significa al menos 70, 80, 90, 95, o 99% de la forma preferida. Los enlaces fosfato modificados son particularmente eficientes para inhibir la disociación exonucleolítica cuando se introducen cerca de las posiciones de los terminales 5' o 3’, y preferiblemente las posiciones del terminal 5’, de un agente de ARNi.
Los conjugados de 5’ también pueden inhibir la disociación exonucleolítica de 5’-3’. Aunque sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, un conjugado de 5’, tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la disociación exonucleolítica mediante el bloqueo estérico de la exonucleasa para que no se enlace con el extremo 5' del oligonucleótido. Inclusive las cadenas de alquilo pequeñas, los grupos arilo, o los conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear las exonucleasas de 3’-5’.
Un agente de ARNi puede tener una mayor resistencia a las nucleasas cuando un agente de ARNi dúplex incluye un nucleótido bicatenario que sobresale en al menos un extremo. En las formas de relización preferidas, el nucleótido que sobresale incluye de 1 a 4, preferiblemente de 2 a 3 nucleótidos no apareados. En una forma de realización preferida, el nucleótido no apareado de la cadena monocatenaria que pende que está directamente adyacente al par de nucleótidos terminales, contiene una base de purina, y el par de nucleótidos terminales es un par G-C, o al menos dos de los últimos cuatro pares de nucleótidos complementarios son pares de G-C. En las forma de realización adicionales, el nucleótidos que sobresale puede tener 1 o 2 nucleótidos no apareados, y en la forma de realización que sirve de ejemplo, el nucleótido que sobresale es 5’-gc-3’. En forma de realización preferidas, el nucleótido qu sobresale está sobre el extremo 3’ de la cadena antisentido. En una forma de realización, el agente de ARNi incluye el motivo 5'-cgc-3' sobre el extremo 3’ de la cadena antisentido, de tal manera que se forma una cadena que sobresale de dos nucleótidos 5’-gc-3’.
Por consiguiente, un agente de ARNi puede incluir modificaciones para inhibir la degradación, por ejemplo, mediante nucleasas, por ejemplo endonucleasas o exonucleasas, que se encuentran en el cuerpo de un sujeto. Estos monómeros se denominan en Ia presente invención como NRM, o monómeros que promueven la resistencia a la nucleasa, y las modificaciones correspondientes como modificaciones de NMR. En muchos casos, estas modificaciones modularán también otras propiedades del agente de ARNi, por ejemplo, la capacidad para interactuar con una proteína, por ejemplo una proteina de transporte, por ejemplo albúmina de suero, o un miembro del RISC, o la capacidad de la primera y de la segunda secuencias para formar un dúplex entre sí, o para formar un dúplex con otra secuencia, por ejemplo una molécula objetivo.
Se pueden introducir una o más modificaciones diferentes de NRM en un agente de ARNi, o en una secuencia de un agente de ARNi. Una modificación de NRM se puede utilizar más de una vez en una secuencia o en un agente de ARNi.
Las modificaciones de NRM incluyen algunas que se pueden colocar solamente en el terminal, y otras que pueden ir en cualquier posición. Algunas modificaciones de NRM pueden inhibir la hibridación, de tal manera que es preferible utilizarlas solamente en las regiones terminales, y preferiblemente no utilizarlas en el sitio de disociación o en la región de disociación de una secuencia que dirija una secuencia objetivo o gen, en particular sobre la cadena antisentido. Se pueden utilizar en cualquier parte en la cadena sentido, siempre y cuando se mantenga suficiente hibridación entre las dos cadenas del agente de ARNi bc. En algunas formas de realización, es deseable poner el NRM en el sitio de disociación o en la región de disociación de una cadena sentido, debido a que puede minimizar el silenciamiento fuera del objetivo.
En la mayoría de los casos, las modificaciones de NRM se distribuirán en forma diferente, dependiendo de si están comprendidas sobre una cadena sentido o antisentido. Si están sobre una cadena antisentido, no se deben insertar modificaciones que interfieran con, o que inhiban la disociación con endonucleasa, en la región que sea sometida a disociación mediada por RISC, por ejemplo el sitio de disociación o la región de disociación (como se describe en Elbashir y colaboradores, 2001, Genes and Dev. 15: 188, que se incorpora a la presente como referencia). La disociación del objetivo ocurre aproximadamente en la mitad de una cadena antisentido de 20 o 21 nucleótidos, o aproximadamente 10 u 11 nucleótidos en dirección 5’ del primer nucleótido sobre el ARNm objetivo que es complementario con la cadena antisentido. Como se utiliza en la presente invención, el sitio de disociación se refiere a los nucleótidos sobre cualquier lado del sitio de disociación, sobre el objetivo o sobre la cadena del agente de ARNi que se híbrida con él. La región de disociación significa los nucleótidos dentro de 1, 2, o 3 nucleótidos del sitio de disociación, en cualquier dirección.
Tales modificaciones se pueden introducir en las regiones terminales, por ejemplo en la posición terminal, o con 2, 3, 4, o 5 posiciones del terminal, de una cadena sentido o antisentido.
Ligandos atados
Se puede influir o confeccionar a la medida las propiedades de un agente de ARNi, incluyendo sus propiedades farmacológicas, por ejemplo, mediante la introducción de Iigandos, por ejemplo Iigandos atados. Además, las propiedades farmacológicas de un agente de ARNi se pueden mejorar mediante la incorporación de un Iigando en una formulación del agente de ARNi, cuando el agente de ARNi tiene o no tiene un Iigando atado.
Se pueden atar una amplia variedad de entidades, por ejemplo ligandos, a un agente de ARNi, o se pueden utilizar como un conjugado o aditivo de una formulación, por ejemplo, con el portador de una subunidad monomérica conjugada con el Iigando. Más adelante se describen ejemplos en el contexto de una subunidad monomérica conjugada con Iigando, pero que es solamente la preferida, y las entidades se pueden acoplar en otros puntos con un agente de ARNi.
Las fracciones preferidas son Iigandos, los cuales se acoplan, preferiblemente de una manera covalente, ya sea directa o indirectamente, por medio de una atadura que intervenga con el portador. En las formas de realización preferidas, el Iigando se une al portador por medio de una atadura interviniente. El Iigando, o el Iigando atado, pueden estar presentes sobre el monómero conjugado con ligando, cuando el monómero conjugado con Iigando se incorpora en la cadena en crecimiento. En algunas formas de realización, se puede incorporar el Iigando en una subunidad monomérica conjugada con Iigando "precursor", después de que la subunidad monomérica conjugada con Iigando “precursor” se haya incorporado en la cadena en crecimiento. Por ejemplo, se puede incorporar un monómero que tenga, por ejemplo, una atadura terminada en amino, por ejemplo, TAP-(CH2)nNH2, en una cadena sentido o antisentido en crecimiento. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación de la subunidad monomérica precursora en la cadena, se puede unir posteriormente un Iigando que tenga un grupo electrofílico, por ejemplo un grupo éster o aldehído de pentafluorofeniIo, al monómero conjugado con Iigando precursor, mediante el acoplamiento del grupo electrofílico del Iigando con el grupo nucleofílico terminal de la atadura de la subunidad monomérica conjugada con Iigando precursor.
En formas de realización preferidas, un Iigando altera la distribución, direccionamiento, o tiempo de vida de un agente de ARNi en el cual se incorpore. En formas de realización preferidas, un Iigando proporciona una mejor afinidad por un objetivo seleccionado, por ejemplo una molécula, célula, o tipo de célula, compartimiento, por ejemplo un compartimiento celular o de un órgano, tejido, órgano, o región del cuerpo, por ejemplo, como se compara con una especie ausente tal como un Iigando.
Los ligandos preferidos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación, y especificidad, y también pueden mejorar la resistencia a la nucleasa del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o de una molécula polimérica que comprenda cualquier combinación de monómeros descritos en la presente invención, y/o ribonucleótidos naturales o modificados.
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo para mejorar la absorción; compuestos de diagnóstico o grupos reporteros, por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes de entrecruzamiento; fracciones que confieran resistencia a Ia nucleasa; y nucleobases naturales o inusuales. Los ejemplos generales incluyen moléculas Iipofílicas, lípidos, lectinas, esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo sarsasapogenina, Friedelin, ácido Iitocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polímeros sintéticos (por ejemplo, Oligo Lactato de 15 mer) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio), inulina, ciclodextrina, o ácido hialurónico), proteínas, agentes enlazantes de proteínas, moléculas destinadas a la integrina, policatiónicos, péptidos, poliaminas, e imitaciones de péptidos. Otros ejemplos incluyen ligandos receptores de células epiteliales o de ácido fólico, tales como transferrina.
El ligando puede ser una molécula de origen natural o reoombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen polilisina (PLL), poliácido L-aspártico, poliácido L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-láctico-co-glicolado), copolímero de diviniIéter - anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropiI)metacriIamida (HMPA), polietilén glicol (PEG), poIivinlI alcohol (PVA), poIiuretano, poli(ácido 2-etiIacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina,
poliamina, poliamina pseudopeptídica, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, fracciones catiónicas, por ejemplo lípido catlónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo un agente de direccionamiento a una célula o tejido, por ejemplo una tirotropina, melanotropina, proteína A tensoactiva, carbohidrato de mucina, un poIiaminoácido glicosilado, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un péptido de Arg-Gly-Asp (RGD), o un mimético de péptido RGD.
Los ligandos pueden ser proteinas, por ejemplo glicoproteínas, Iipoproteínas, por ejemplo Iipoproteína de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), o péptidos, por ejemplo moléculas que tengan una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se enlace con un tipo de célula especificado, tal como una célula cancerosa, una célula endotelial, o una célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, o fucosa multivalente.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un fármaco, que pueda aumentar la absorción del agente de ARNi dentro de Ia célula, por ejemplo mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, por ejemplo mediante la alteración de los microtúbulos, microfilamentos, y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastína, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, mioservina, tetraciclina.
En un aspecto, el Iigando es un lípido, o una molécula a base de lípido. Tal molécula de lípido o a base de lípido preferiblemente se enlaza con una proteína de suero, por ejemplo albúmina de suero humano (HSA). Un Iigando que se enlaza con HSA permite la distribución del conjugado con un tejido objetivo, por ejemplo tejido de hígado, incluyendo células parenquimales del hígado. Otras moléculas que pueden enlazar HSA también se pueden utilizar como Iigandos. Por ejemplo, se pueden utilizar neproxina o aspirina. Un lípido o Iigando basado en lípido puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte hacia una célula o membrana celular objetivo, y/o (c) se puede utilizar para ajustar el enlazamiento con una proteína de suero, por ejemplo HSA.
Un Iigando a base de lípido se puede utilizar para modular, por ejemplo para controlar el enlazamiento del conjugado con un tejido objetivo. Por ejemplo, un lípido o un Iigando a base de lípido que se enlaza con HSA más fuertemente, tendrá menos posibilidades de dirigirse hacia el riñón, y por consiguiente, menos probabilidades de ser eliminado del cuerpo.
En una forma de realización preferida, el Iigando a base de lípido se enlaza con HSA. Preferiblemente, se enlaza con HSA con una afinidad suficiente para que el conjugado se distribuya preferiblemente hacia un tejido que no sea el riñón. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte como para que no se pueda revertir el enlace del Iigando de HSA.
En otro aspecto, el Iigando es una fracción, por ejemplo una vitamina o un nutriente, que es absorbido por una célula objetivo, por ejemplo una célula en proliferación. Éstos son particularmente útiles para el tratamiento de los trastornos caracterizados por una proliferación celular indeseada, por ejemplo del tipo maligno o no maligno, por ejemplo células cancerosas. Los ejemplos de vitaminas incluyen vitamina A, E, y K. Otros ejemplos de vitaminas incluyen las vitaminas B, por ejemplo ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal, u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las células cancerosas.
En otro aspecto, el Iigando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un ejemplo de agente es un péptido, tal como tat o antenapedia. Si el agente es un péptido, se puede modificar, incluyendo un mimético de peptidilo, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudo-peptídicos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal preferiblemente es un agente alfahelicoidal, que preferiblemente tiene una fase lipofílica y una fase Iipofóbica. El agente de permeación celular se puede enlazar covalentemente al agente de ARNi, o puede ser parte de un complejo de ARNi-péptido.
Modificaciones de fosfato 5’
En formas de realización preferidas, los agentes de ARNi están 5' fosforilados, o incluyen un análogo de fosforilo en el terminal principal 5’. Las modificaciones del fosfato 5’ de la cadena antisentido incluyen aquéllas que son compatibles con el silenciamiento del gen mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5’monofosfato ((HO)2(O)P-O-5’); 5’-difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5‘; 5'-trifosfato ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-OP(HO)(O)-O-5'); tapa de 5'-guanosina (7-metilada o no metilada) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O5'); tapa de 5'-adenosina (Appp), y cualquier estructura de tapa de nucleótido modificada o no modificada (N-O-5'(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'); 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato, y trifosfato reemplazados por oxigeno/azufre (por ejemplo, 5'-alfa-tiotrifosfato, 5'-gammatiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-aIquiIfosfonatos (R = alquilo = metilo, etilo, isopropilo, propilo, etc., por ejemplo RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-); 5'-alquiléterfosfonatos (R = aIquiléter = metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etc., por ejemplo, RP(OH)(O)-O-5'-).
La cadena sentido se puede modificar con el objeto de inactivar la cadena sentido y prevenir la formación de un RISC activo, reduciendo de esta manera potencialmente los efectos fuera del objetivo. Esto se puede lograr mediante una modificación que impida la fosforiIación 5’ de la cadena sentido, por ejemplo mediante Ia modificación con un ribonucleótido de 5’-O-metilo (véase, Nykänen y colaboradores, (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309 - 321). También se pueden emplear otras modificaciones que impidan la fosforilación, por ejemplo simplemente sustituyendo el 5’-OH por H en lugar de O-Me. Alternativamente, se puede agregar un grupo voluminoso grande al 5'-fosfato, convirtiéndolo en un enlace de fosfodiéster.
Nucleobases no naturales
El nitropirrolilo y el nitroindolilo son nucleobases no naturales que son miembros de una clase de compuestos conocidos como bases universales. Las bases universales son aquéllos compuestos que pueden reemplazar a cualquiera de las cuatro bases que se presentan naturalmente, sin afectar sustancialmente el comportamiento de fusión o Ia actividad del dúplex de oligonucleótidos. En contraste con la estabilización, las interacciones de enlazamiento de hidrógeno asociadas con las nucleobases de origen natural, se postula que los dúplexes de oligonucleótidos que contienen nucleobases de 3-nitropirrolilo se estabilizan exclusivamente mediante las interacciones de apilación. La ausencia de interacciones de enlace de hidrógeno significativas con las nucleobases de nitropirrolilo obvia la especificidad para una base complementaria específica. Además, diferentes reportes confirman que el 4-, 5-, y 6-nitroindolilo exhiben muy poca especificidad por las cuatro bases naturales. De manera muy interesante, un dúplex de oligonucleótido que contenga 5-nitroindolilo es más estable que los oligonucleótidos correspondientes que contienen 4-nitroindolilo y 6-nitroindolilo. Los procedimientos para la preparación de 1-(2'-Ometil-β-D-ribofuranosil)-5-nitroindol se describen en Gaubert, G.; Wengel, J. Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629. Otras bases universales incluyen hipoxantinilo, isoinosinilo, 2-aza-inosinilo, 7-desaza-inosinilo, nitroimidazolilo, nitropirazolilo, nitrobencimidazolilo, nitroindazolilo, aminoindolilo, pirrolopirimidinilo, y los derivados estructurales de los mismos. Para una discusión más detallada, incluyendo los procedimientos sintéticos, de nitropirrolilo, nitroindolilo, y otras bases universales mencionadas anteriormente, véase Vallone y colaboradores, Nucleic Acids Research, 27(17): 3589 - 3596 (1999); Loakes y colaboradores, J. Mol. Bio., 270: 426 - 436 (1997); Loakes y colaboradores, Nucleic Acids Research, 22(20): 4039 -4043 (1994); Oliver y colaboradores, Organic Letters, Vol. 3(13): 1977 - 198O (2001); Amosova y colaboradores, Nucleic Acíds Research, 25(10): 1930 - 1934 (1997); Loakes y colaboradores, Nucleic Acids Research, 29(12): 2437 - 2447 (2001); Bergstrom y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 117: 1201 - 1209 (1995); Franchetti y colaboradores, Biorg. Med. Chem. Lett. 11: 67 - 69 (2001); y Nair y colaboradores, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 20(4 - 7): 735 - 738 (2001).
El difluorotolilo es una nucleobase no natural que funciona como una base universal. El difluorotolilo es un isóstero de la nucleobase natural timina. Pero a diferencia de la timina, el difluorotolilo no muestra una selectividad apreciable por cualquiera de las bases naturales. Otros compuestos aromáticos que funcionan como bases universales y que son susceptibles para la presente invención son 4-fluoro-6-metilbencimidazol y 4-metilbencimidazol. Además, los derivados de isocarboestirilo relativamente hidrofóbicos de 3-metiI isocarboestirilo, 5-metil isocarboestirilo, y 3-metiI7-propinil isocarboestirilo son bases universales que provocan solamente una ligera desestabilización de los dúplexes de oligonucleótidos, en comparación con la secuencia del oligonucleótido que contiene solamente bases naturales. Otras nucleobases no naturales incluyen 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metilimidizopiridlnilo, pirroIopirizinilo, isocarboestirilo, 7-propinil isocarboestirilo, propiniI-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetil-fenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetiIindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbenilo, tetracenilo, pentacenilo, y los derivados estructurales de los mismos. Para una discusión más detallada, incluyendo los procedimientos sintéticos, de difluorotolilo, 4-fIuoro-6-metiIbencimidazol, 4-metilbencimidazol, y otras bases no naturales mencionadas anteriormente, véase: Schweitzer y colaboradores, J. Org. Chem., 59: 7238 - 7242 (1994); Berger y colaboradores, Nucleic Acids Research, 28(15): 2911 - 2914 (2000); Moran y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 119: 2056 - 2057 (1997); Morales y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 121: 2323 - 2324 (1999); Guckian y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 122(6): 1001 - 1007 (2000); McMinn y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 121: 11585 - 11586 (1999); Guckian y colaboradores, J. Org. Chem., 63: 9652 - 9656 (1998); Moran y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 10506 10511 (1997); Das y colaboradores, J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 197 - 206 (2002); Shibata y colaboradores, J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1605 - 1611 (2001); Wu y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 122(32): 7621 - 7632 (2000); O'Neill y colaboradores, J. Org. Chem., 67: 5869 - 5875 (2002); Chaudhuri y colaboradores, J. Am. Chem. Soc., 117: 10434 - 10442 (1995); y la Patente de los Estados Unidos No. 6.218.108.
Transporte de agentes de ARNi dentro de las células
Sin querer ceñirse a ninguna teoría en particular, la similitud química entre los agentes de ARNi conjugados con colesterol y ciertos constituyentes de las Iipoproteínas (por ejemplo, colesterol, colesteril ésteres, fosfolípidos), puede conducir a la asociación de los agentes de ARNi con Iipoproteínas (por ejemplo, LDL, HDL) en la sangre, y/o a la interacción del agente de ARNi con los componentes celulares que tienen afinidad por el colesterol, por ejemplo los componentes de Ia ruta de transporte de colesterol. Las Iipoproteínas, así como sus constituyentes, son absorbidas y procesadas por las células mediante diferentes mecanismos de transporte activo y pasivo, por ejemplo, sin limitación, mediante endocitosis del LDL enlazado con el receptor de LDL, endocitosis de las LDL oxidadas o bien modificadas, a través de la interacción con el receptor depurador A, la absorción de colesterol HDL en el hígado mediada por el receptor depurador B1, pinocitosis, o transporte de colesterol a través de las membranas mediante las proteínas transportadoras de ABC (casete de enlazamiento de ATP), por ejemplo ABC-A1, ABC-G1 o ABC-G4. Por consiguiente, los agentes de ARNi conjugados con colesterol podrian disfrutar de una absorción facilitada por parte de las células que poseen estos mecanismos de transporte, por ejemplo las células del hígado. Como tal, la presente invención proporciona evidencia y métodos generales para dirigir agentes de ARNi hacia las células que expresan ciertos componentes de la superficie celular, por ejemplo receptores, mediante la conjugación de un Iigando natural para tal componente (por ejemplo, colesterol) con el agente de ARNi, o mediante la conjugación de una fracción química (por ejemplo, colesterol) con el agente de ARNi que se asocia con, o que se enlaza con un Iigando natural para el componente (por ejemplo, LDL, HDL).
Otras formas de realización
Un agente de ARNi, puede ser producido en una célula in vivo, por ejemplo, a partir de plantillas de ADN exógeno, que se suministran dentro de la célula. Por ejemplo, las plantillas de ADN se pueden insertar en los vectores, y se pueden utilizar como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica se pueden suministrar a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, administración local (Patente de los Estados Unidos No. 5.328.470), o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91: 3054 3057, 1994). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir al vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en donde se incruste el vehículo de suministro génico. Las plantillas de ADN, por ejemplo, pueden incluir dos unidades de transcripción, una que produzca una transcripción que incluya la cadena superior de un agente de ARNi, y una que produzca una transcripción que incluya la cadena inferior de un agente de ARNi. Cuando se transcriben las plantillas, se produce el agente de ARNi, y se procesa en fragmentos de agente de ARNi corto que median el silenciamiento génico.
Formulación
La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen a los compuestos de ARN bc de la invención. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una cantidad de formas, dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistémico, y del área que se vaya a tratar. La administración puede ser tópica, pulmonar, por ejemplo mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica, y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intra-arterial, subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo intratecal o intraventricular.
Las composiciones farmacéuticas y formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos, y polvos. Pueden ser necesarios o deseables los vehículos farmacéuticos convencionales, acuosos, en polvo, o bases oleosas, espesantes, y similares. También pueden ser útiles condones recubiertos, guantes, y similares. Las formulaciones tópicas preferidas incluyen aquellas en donde los ARN bc están en mezcla con un agente de suministro tópico, tal como lípidos, Iiposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes, y tensoactivos. Los lípidos y Iiposomas preferidos incluyen los neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidiletanolamina = DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina = DMPC, diestearoiIfosfatidilcolina), los negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidiI glicerol = DMPG), y los caliónicos (por ejemplo, dioIeoiItetrametiIaminopropilo = DOTAP, y dioleoilfosfatidiI etanolamina = DOTMA), por ejemplo bromuro de (+/-)-N-(3-amino-propil)-N,N-dimetiI-2,3-bis-(dodeciloxi)-1-propanaminio = GAP-DLRIE). Los ARN bc de la invención se pueden encapsular dentro de Iiposomas, o pueden formar complejos con los mismos, en particular con los Iiposomas catiónicos. De una manera alternativa, los ARN bc pueden formar complejos con lípidos, en particular con los lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres preferidos incluyen, pero no se limitan a, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido Iinoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1dodeciI-azacicIoheptan-2-ona, una acilcarnitina, una aciIcolina, o un éster de alquilo de 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, miristato de isopropilo, IPM), monoglicérido, diglicérido, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Las formulaciones tópicas se describen con detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con número de serie 09/315.298, presentada el 20 de mayo de 1999.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones, o soluciones en agua o en medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, pastillas, tabletas, o minitabletas. Pueden ser deseables los espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes,
auxiliares de dispersión, o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son aquéllas en donde los ARN bc se administran junto con uno o más potenciadores de penetración, tensoactivos, y quelantes. Los tensoactivos preferidos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares preferidos incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA), y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio, y gIicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos preferidos incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido Iáurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido Iinoleico, ácido Iinolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2ona, una aciIcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, de sodio). También se prefieren las combinaciones de potenciadores de penetración, por ejemplo ácidos grasos / sales en combinación con ácidos biliares / sales. Una combinación particularmente preferida es la sal sódica del ácido Iáurico, del ácido caprílico, y UDCA. Otros potenciadores de penetración incluyen lauril éter de poIioxietiIeno-9, cetiI éter de poIioxietileno-20. Los ARN bc se pueden suministrar en forma oral, en una forma granular, incluyendo las particulas secadas por pulverización, o pueden formar complejos para formar micro o nanopartículas. Los agentes formadores de complejos de ARN bc incluyen los poli-aminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos; polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG), y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas de DEAE, polulanos, celulosas, y almidones. Los agentes formadores de complejos particularmente preferidos incluyen quitosano, Ntrimetilquitosano, poIi-L-Iisina, polihistidina, poIiornitina, poIiesperminas, protamina, poliviniIpiridina, poIitiodietiIaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etiIcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutiIcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acriIamida, DEAE-albúmina, y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG). Las formulaciones orales para ARN bc y su preparación se describen con detalle en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos con serial No. 08/886.829 (presentada el 1 de julio de 1997), con serial No. 09l108.673 (presentada el 1 de julio de 1998), con serial No. 09/256.515 (presentada el 23 de febrero de 1999), con serial No. 09/082.624 (presentada el 21 de mayo de 1998), y con serial No. 09/315.298 (presentada el 20 de mayo de 1999).
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal, o intraventricular, pueden incluir soluciones acuosas estériles, las cuales también pueden contener reguladores del pH, diluyentes, y otros aditivos adecuados, tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de penetración, compuestos portadores, y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen Iiposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsionantes, y semisólidos auto-emulsionantes.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, las cuales convenientemente se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los ingredientes activos con el(los) vehículo(s) o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntima a los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, se le da forma al producto.
Las composiciones se pueden formular en cualquiera de muchas posibles formas de dosificación, tales como, pero sin limitarse a, tabletas, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios, y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos, o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
En una forma de realización, las composiciones farmacéuticas se pueden formular y utilizar como espumas. Las espumas farmacéuticas incluyen formulaciones tales como, pero sin limitarse a, emulsiones, microemulsiones, cremas, jaleas, y Iiposomas. Aunque son básicamente de una naturaleza similar, estas formulaciones varían en los componentes y en la consistencia del producto final. La preparación de estas composiciones y formulaciones es en general conocida por los expertos en Ia técnica farmacéutica y de formulación, y se pueden aplicar a la formulación de las composiciones.
Emulsiones
Las composiciones se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en la forma de gotas que normalmente exceden a un diámetro de 0,1 µm (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 2, página 335; Higuchi y colaboradores, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, página 301). Las emulsiones son con frecuencia sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersadas una en la otra. En general, las emulsiones pueden ser de Ia variedad de agua en aceite (a/ac) o de aceite en agua (ac/a). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa como gotas diminutas en una fase oleosa en mayor volumen, la composición resultante se denomina como una emulsión de agua en aceite (a/ac). De una manera alternativa, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa como gotas diminutas en una fase acuosa en mayor volumen, la composición resultante se denomina como una emulsión de aceite en agua (ac/a). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas, y el fármaco activo que puede estar presente como una solución ya sea en la fase acuosa, la fase oleosa, o por si mismo como una fase separada. También pueden estar presentes excipientes farmacéuticos, tales como emulsionantes, estabilizantes, colorantes, y antioxidantes en las emulsiones, según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que cuenten con más de dos fases, tales como, por ejemplo, en el caso de las emulsiones de aceite en agua en aceite (ac/a/ac) y de agua en aceite en agua (a/ac/a). Estas formulaciones complejas con frecuencia proporcionan ciertas ventajas que no proporcionan las emulsiones binarias simples. Las emulsiones múltiples en donde las gotitas de aceite individuales de una emulsión de aceite en agua encierran a las pequeñas gotitas de agua, constituyen una emulsión de agua/aceite/agua. De la misma forma, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa, proporciona una emulsión de aceite/agua/aceite.
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. Con frecuencia, la fase dispersada o discontinua de la emulsión se dispersa bien en la fase externa o continua, y se mantiene en esta forma a través del medio de los emulsionantes o de la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de las bases de ungüentos y cremas estilo emulsión. Otros medios para estabilizar las emulsiones implican el uso de emulsionantes, que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar en forma amplia en cuatro categorías: tensoactivos sintéticos, emulsionantes de origen natural, bases de absorción, y sólidos finamente dispersados (ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 199).
Los tensoactivos sintéticos, también conocidos como agentes activos de superficie, han encontrado una amplia aplicabilidad en al formulación de emulsiones, y han sido revisados en la literatura (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 285; ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., 1988, Volumen 1, página 199). Los tensoactivos son típicamente anfifllicos, y comprenden una porción hidrofilica y una porción hidrófoba. La proporción de la naturaleza hidrofílica con respecto a la hidrófoba del tensoactivo se ha denominado como el equilibrio hidrofílico/Iipofílico (HLB), y es una valiosa herramienta en la categorización y selección de los tensoactivos en Ia preparación de formulaciones. Los tensoactivos se pueden clasificar en diferentes clases con base en la naturaleza del grupo hidrofílico: no iónicos, aniónicos, catiónicos, y anfotéricos (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 285).
Los emulsionantes de origen natural utilizados en las formulaciones en emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina, y acacia. Las bases de absorción poseen propiedades hidrofílicas tales que pueden absorber agua para formar emulsiones de agua en aceite y todavía retener sus consistencias semisólidas, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrofílica. También se han utilizado sólidos finamente divididos como buenos emulsionantes,especialmente en combinación con tensoactivos y en preparaciones viscosas. Éstos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas que no se hinchan, tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal, y silicato de magnesio y aluminio coloidal, pigmentos, y sólidos no polares, tales como carbono o triestearato de glicerilo.
También se incluye una gran variedad de materiales no emulsionantes en las formulaciones en emulsión, ycontribuyen a las propiedades de las emulsiones. Éstos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrofílicos, conservantes, y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 335; ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 199).
Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen gomas de origen natural, y polímeros sintéticos, tales como polisacáridos (por ejemplo, acacia, ágar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma de karaya, y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (porejemplo, carbómeros, éteres de celulosa, y polímeros de carboxivinilo). Éstos se dispersan o se hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones mediante la formación de películas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas en fase dispersa, y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Debido a que las emulsiones con frecuencia contienen una cantidad de ingredientes, tales como carbohidratos, proteínas, esteroles, y fosfatidos, que pueden soportar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones con frecuencia incorporan conservantes. Los conservantes comúnmente utilizados incluidos en las formulaciones en emulsión incluyen metiI parabeno, propil parabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, y ácido bórico. Los antioxidantes también se agregan comúnmente a las formulaciones en emulsión para prevenir el deterioro de Ia formulación. Los antioxidantes utilizados pueden ser depuradores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o agentes reductores, tales como ácido ascórbico y metabisuifito de sodio, y sinergistas de antioxidantes, tales como ácido cítrico, ácido lartárico, y Iecitina.
La aplicación de las formulaciones en emulsión por medio de las vías dermatológica, oral, y parenteral, y los métodos para su fabricación, se han revisado en la literatura (ldson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 199). Las formulaciones en emulsión para suministro oral se han utilizado muy ampliamente, debido a su facilidad de formulación, así como a la eficacia desde el punto de vista de la absorción y la biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
N. Y., Volumen 1, página 199). Los Iaxantes con base en aceite mineral, las vitaminas solubles en aceite, y las preparaciones nutritivas altas en grasas, están entre los materiales que se han administrado comúnmente de forma oral como emulsiones de aceite en agua.
En una forma de realización, las composiciones de los ARN bc y ácidos nucleicos, se formulan como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite, y anfifilo, que es una sola solución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 245). Típicamente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando en primer lugar un aceite en una solución tensoactiva acuosa, y luego se agrega una cantidad suficiente de un cuarto componente, en general un alcohol de una longitud de cadena intermedia, para formar un sistema transparente. Por consiguiente, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables e isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas de actividad superficial (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Editor, 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185 - 215). Las microemulsiones comúnmente se preparan mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensoactivo, cotensoactivo, y electrolito. El que la microemulsión sea del tipo de agua en aceite (a/ac) o de aceite en agua (ac/a) depende de las propiedades del aceite y del tensoactivo utilizados, y de la estructura y empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y de las colas hidrocarbonadas de las moléculas de tensoactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing .Co., Easton, Pa., 1985, página 271).
El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fases se ha estudiado extensamente, y ha producido un conocimiento exhaustivo, para un experto en la materia, de la manera en la que se formulan las microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 335). Comparando con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar los fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman de una manera espontánea.
Los tensoactivos utilizados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensoactivos iónicos, tensoactivos no iónicos, Brij 96, oleil éteres de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquiolato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con cotensoactivos. El cotensoactivo, usualmente un alcohol de cadena corta, tal como etanol, 1-propanol, y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial mediante su penetración en la película del tensoactivo, y en consecuencia, para crear una película desordenada debido al espacio vacío entre las moléculas del tensoactivo. Sin embargo, las microemulsiones se pueden preparar sin el uso de cotensoactivos, y en la técnica se conocen sistemas en microemulsión auto-emulsionantes exentas de alcohol. La fase acuosa puede ser típicamente, pero no se limita a, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, polietilenglicoles, y derivados de etilén glicol. La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di, y triglicéridos de cadena mediana (de 8 a 12 atomos de carbono), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos de 8 a 10 átomos de carbono poliglicolizados saturados, aceites vegetales, y aceite de silicona.
Las microemulsiones son particularmente interesantes desde el punto de vista de la solubilización del fármaco y de la mejor absorción de los fármacos. Las microemulsiones con base en lípido (tanto de aceite en agua como de agua en aceite) han sido propuestas para mejorar la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides y colaboradores, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385 - 1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. PharmacoI., 1993, 13, 205). Las microemulsiones tienen la ventaja de una mejor solubilización del fármaco, protección del fármaco de la hidrólisis enzimática, posible mejora de la absorción del fármaco debido a las alteraciones inducidas por el tensoactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral sobre las formas de dosificación sólidas, mejor potencia clínica, y toxicidad reducida (Constantinides y colaboradores, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho y colaboradores, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138 - 143). Con frecuencia las microemulsiones pueden formarse de una manera espontánea cuando se juntan sus componentes a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente conveniente cuando se formulan fármacos termolábiles, péptidos, o los ARN bc. Las microemulsiones también han sido efectivas en el suministro transdérmico de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones en microemulsión faciliten Ia mayor absorción sistémica de los ARN bc y de los ácidos nucleicos del tracto gastrointestinal, así como que mejoren Ia absorción celular local de los ARN bc y de los ácidos nucleicos dentro del tracto gastrointestinal, la vagina, la cavidad bucal, y otras áreas de administración.
Las microemulsiones también pueden contener componentes y aditivos adicionales, tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3), Labrasol, y potenciadores de penetración, para mejorar las propiedades de la formulación, y para mejorar la absorción de los ARN bc y de los ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de penetración utilizados en las microemulsiones se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías: tensoactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensoactivos no quelantes (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92). Cada una de estas clases se ha discutido anteriormente.
Liposomas
Existen muchas estructuras tensoactivas organizadas además de las microemulsiones que se han estudiado yutilizado para la formulación de fármacos. Éstas incluyen monocapas, micelas, bicapas, y vesículas. Las vesículas, tales como los Iiposomas, han atraído un gran interés, debido a su especificidad y a la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista del suministro de fármacos. El término “Iiposoma” significa una vesícula compuesta de lípidos anfifilicos configurados en una bicapa o bicapas esféricas.
Los Iiposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material Iipofílico, y un interior acuoso. La porción acuosa contiene a la composición que se va a suministrar. Los Iiposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse con la pared celular. Los Iiposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficientemente con la membrana celular, son absorbidos por los macrófagos in vivo.
Con el objeto de cruzar la piel intacta del mamífero, las vesículas de lípido deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por consiguiente, es deseable utilizar un Iiposoma que sea altamente deformable, y que sea capaz de pasar a través de estos poros tan finos.
Las ventajas adicionales de los Iiposomas incluyen: los liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los Iiposomas pueden incorporar un amplio rango de fármacos solubles en agua y en lipido; los Iiposomas pueden proteger a los fármacos encapsulados en sus compartimientos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., Volumen 1, página 245). Las consideraciones importantes en Ia preparación de formulaciones de Iiposomas son la carga superficial de lípido, el tamaño de vesícula, y el volumen acuoso de los Iiposomas.
Los Iiposomas son útiles para la transferencia y suministro de ingredientes activos al sitio de acción. Debido a que Ia membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican Iiposomas a un tejido, los Iiposomas empiezan a fusionarse con las membranas celulares, y a medida que progresa la fusión del Iiposoma y la célula, se vacia el contenido Iiposomal al interior de la célula, en donde puede actuar el agente activo.
Las formulaciones liposomales han sido el foco de una extensa investigación como el modo de suministro de muchos fármacos. Existe una evidencia creciente de que, para la administración tópica, los Iiposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Estas ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en el objetivo deseado, y la capacidad para administrar una amplia variedad de farmacos, tanto hidrofilicos como hidrofóbicos, a la piel.
Varios reportes han detallado la capacidad de los Iiposomas para suministrar agentes, incluyendo ADN de alto peso molecular, a la piel. Los compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas, y los ADN de alto peso molecular, han sido administrados a la piel. La mayoría de las aplicaciones dieron como resultado el
direccionamiento a la epidermis superior.
Los Iiposomas caen en dos amplias clases. Los Iiposomas catiónicos son Iiposomas positivamente cargados que interactúan con las moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. El complejo de ADN/liposoma positivamente cargado se enlaza con la superficie celular negativamente cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los Iiposomas se rompen, liberando su contenido en el citoplasma celular (Wang y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980 - 985).
Los Iiposomas que son sensibles al pH, o que están negativamente cargados, atrapan el ADN en lugar de formar un complejo con él. Debido a que tanto el ADN como el lípido están similarmente cargados, se presenta el rechazo en lugar de la formación de complejo. No obstante, algo de ADN es atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han utilizado para suministrar ADN que codifica el gen de la timidina quinasa a las monocapas celulares en cultivo. La expresión del gen endógeno se detectó en las células objetivo (Zhou y colaboradores, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269 - 274).
Un tipo importante de composición liposomal incluye fosfolípidos diferentes de la fosfatidilcolina derivada en forma natural. Las composiciones de liposomas neutras, por ejemplo, se pueden formar a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), o de dipalmitoiI fosfatidiIcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos generalmente se forman a partir de dimiristoil fosfatidilgIicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman primordialmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC), tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidiIcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado el suministro tópico de formulaciones de fármacos liposomales a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a Ia piel del cobayo, dieron como resultado una reducción de las llagas provocadas por herpes de la piel, mientras que el suministro de interferón por otros medios (por ejemplo, como una solución o como una emulsión) fue inefectivo (Weiner y colaboradores, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405 410). Además, un estudio adicional probó la eficacia del interferón administrado como parte de una formulación Iiposomal, en comparación con la administración de interferón utilizando un sistema acuoso, y concluyó que Ia formulación liposomal fue superior a Ia administración acuosa (du Plessis y colaboradores, Antiviral Research, 1992, 18, 259 - 265).
También se han examinado los sistemas Iiposomaies no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular los sistemas que contienen tensoactivo no iónico y colesterol. Las formulaciones Iiposomaies no iónicas que contienen Novasome™ I (dilaurato de gliceriIo / coIesterol / estearil éter de polioxietileno10), y Novasome™ II (diestearato de gIicerilo / colesteroI / estearil éter de polioxietiIeno-10), se usaron para suministrar ciclosporina A a la dermis de la piel del ratón. Los resultados indicaron que estos sistemas Iiposomales no iónicos fueron efectivos para facilitar el depósito de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu y colaboradores, S. T. P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los Iiposomas también incluyen liposomas “estéricamente estabiIizados", un término que, como se utiliza en la presente invención, se refiere a los Iiposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en Iiposomas, dan como resultado mejores tiempos de vida en la circulación en relación con los Iiposomas que carecen de estos lípidos especializados. Los ejemplos de los Iiposomas estéricamente estabilizados son aquéllos en donde parte de la porción de Iipido que forma la vesícula del Iiposoma (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como monosialogangliósido Gm1, o (B) forma un derivado con uno o más polímeros hidrofílicos, tales como una fracción de polietilén glicol (PEG). Aunque sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, se piensa en la técnica que, al menos para los Iiposomas estéricamente estabilizados que contienen gangliósidos, esfingomielina, o lípidos derivados de PEG, la mejor vida media en circulación de estos Iiposomas estéricamente estabilizados se deriva de una absorción reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen y colaboradores, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu y colaboradores, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Se conocen en el estado del arte diferentes Iiposomas que contienen uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos y colaboradores (Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) reportaron la capacidad del monosialogangliósido Gm1, el sulfato de galactocerebrosido y fosfatidilinositol, para mejorar las vidas medias en sangre de los Iiposomas. Estos hallazgos fueron expuestos por Gabizon y colaboradores, (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 1988, 85, 6949). La Patente de los Estados Unidos No. 4.837.028 y la Publicación Internacional No. WO 88/04924, ambas de Allen y colaboradores, dan a conocer Iiposomas que comprenden (1) esfingomielina, y (2) el gangliósido Gm1 o un éster de sulfato de galactocerebrosida. La Patente de los Estados Unidos No. 5.543.152 (Webb y colaboradores) da a conocer Iiposomas que contienen esfingomielina. Los Iiposomas que contienen 1,2-sn-dimiristoilfosfatidiIcolina se dan a conocer en la Publicación Internacional No. WO 97/13499 (Lim y colaboradores).
Muchos Iiposomas que comprenden lípidos que forman derivados con uno o más polímeros hidrofílicos, y los métodos para su preparación, se conocen en el arte. Sunamoto y colaboradores (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C121543, que contiene una fracción de PEG.
lllum y colaboradores (FEBS Lett., 1984, 167, 79) observaron que el recubrimiento hidrofílico de las partículas de poliestireno con glicoles poliméricos da como resultado vidas medias en sangre significativamente mejoradas. Los fosfolípidos sintéticos modificados mediante la unión de grupos carboxílicos de polialquilén glicoles (por ejemplo, PEG) son descritos por Sears (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov y colaboradores (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidil etanolamina (PE) que forman derivados con PEG o con estearato de PEG, tienen incrementos significativos en las vidas medias en la circulación sanguínea. Blume y colaboradores (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron estas observaciones hasta otros fosfolípidos derivados de PEG, por ejemplo DSPE-PEG, formado a partir de Ia combinación de diestearoilfosfatidiIetanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen fracciones de PEG covalentemente enlazadas sobre su superficie externa se describen en la Patente Europea No. EP 0 445 131 B1 y en Ia Publicación Internacional No. WO 90/04384 de Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen del 1 al 20% en moles de PE que forma derivado con PEG, y los métodos para su utilización, son descritas por Woodle y colaboradores (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.013.556 y 5.356.633) y Martin y colaboradores (Patente de los Estados Unidos No. 5.213.801 y Patente Europea No. EP 0 496 813 B1). Los liposomas que comprenden una cantidad de otros conjugados de lípido-polímero se dan a conocer en la Publicación Internacional No. WO 91/05545 y en la Patente delos Estados Unidos No. 5.225.212 (ambas de Martin y colaboradores), y en la Publicación internacional No. WO 94/20073 (ZaIipsky y colaboradores). Los liposomas que contienen lípidos de ceramida modificados por PEG se describen en la Publicación Internacional No. WO 96/10391 (Choi y colaboradores). La Patente de los Estados Unidos No. 5.540.935 (Miyazaki y colaboradores) y la Patente de los Estados Unidos No. 5.556.948 (Tagawa y colaboradores) describen liposomas que contienen PEG, que se pueden formar derivados adicionalmente con fracciones funcionales sobre sus superficies.
En la técnica se conoce un número limitado de liposomas que comprenden ácidos nucleicos. La Publicación Internacional No. WO 96/40062 a Thierry y colaboradores, da a conocer métodos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La Patente de los Estados Unidos No. 5.264.221 de Tagawa y colaboradores, da a conocer liposomas enlazados con proteínas, y asevera que el contenido de estos liposomas puede incluir ARN bc. La Patente de los Estados Unidos No. 5.665.710 de Rahman y colaboradores, describe ciertos métodos para encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. La Publicación internacional No. WO 97/04787 de Love y colaboradores, da a conocer liposomas que comprenden ARN bc dirigidos al gen raf.
Los transfersomas son incluso otro tipo de liposomas, y son agregados de lípido altamente deformables que son candidatos atractivos para los vehículos de suministro de fármacos. Los transfersomas se pueden describir como gotitas de lípido que son tan altamente deformables que son fácilmente capaces de penetrar a través de los poros que sean más pequeños que la gotita. Los transfersomas se pueden adaptar al medio ambiente en el que se utilicen, por ejemplo, son auto-optimizantes (adaptables a la forma de los poros de Ia piel), auto-reparadores, con frecuencia alcanzan sus objetivos sin fragmentación, y con frecuencia se auto-cargan. Para elaborar los transfersomas, es posible agregar activadores del borde de la superficie, usualmente tensoactivos, a una composición Iiposomal estándar. Los transfersomas se han utilizado para suministrar albúmina de suero a la piel. El suministro de albúmina de suero mediado por transfersomas ha demostrado ser tan efectivo como la inyección subcutánea de una solución que contenga albúmina de suero.
Los tensoactivos encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y Iiposomas. La manera más común de clasificar y ordenar las propiedades de muchos tipos diferentes de tensoactivos, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrofílico/lipofílico (HLB). La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como la “cabeza”) proporciona el medio más útil para categorizar los diferentes tensoactivos utilizados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms Marcel Dekker, lnc., Nueva York, N. Y., 1988, página 285).
Si la molécula de tensoactivo no está ionizada, se clasifica como un tensoactivo no iónico. Los tensoactivos no iónicos encuentran una amplia aplicación en los productos farmacéuticos y cosméticos, y son útiles sobre un amplio rango de valores de pH. En general, sus valores de HLB están en el intervalo desde 2 hasta aproximadamente 18, dependiendo de su estructura. Los tensoactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos, tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa, y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas y los éteres no iónicos, tales como etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilados, y copolímeros en bloque etoxilados/propoxilados, también se incluyen en esta clase. Los tensoactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensoactivos no iónicos.
Si Ia molécula de tensoactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como aniónico. Los tensoactivos aniónicos incluyen carboxilatos, tales como jabones, Iactilatos de acilo, acil-amidas de aminoácido, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquil-benceno, y cetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de Ia clase de tensoactivos aniónicos son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molécula de tensoactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como catiónico. Los tensoactivos actiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más utilizados de esta clase.
Si la molécula de tensoactivo tiene la capacidad para portar ya sea una carga positiva o negativa, el tensoactivo se clasifica como anfotérico. Los tensoactivos anfotéricos incluyen derivados de ácido acrílico, alquil-amidas sustituidas, N-alquiI-betainas, y fosfátidos.
El uso de tensoactivos en productos farmacológicos, formulaciones, y en emulsiones, ha sido revisado (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N. Y., 1988, página 285).
Potenciadores de penetración
En una forma de realización, la presente invención emplea diferentes potenciadores de penetración para efectuar el suministro eficiente de ácidos nucleicos, en particular ARN bc, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto en la forma ionizada como no ionizada. Sin embargo, usualmente sólo los fármacos solubles en lípido o lipofílicos cruzan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que inclusive los fármacos no lipofílicos pueden cruzar las membranas celulares, si la membrana que se va a cruzar se trata con un potenciador de penetración. Además, para ayudar a la difusión de los fármacos no lipofílicos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también mejoran la permeabilidad de los fármacos lipofílicos.
Los potenciadores de penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensoactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no tensoactivos no quelantes (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92). Cada una de las clases anteriormente mencionadas de potenciadores de penetración se describen a continuación con mayor detalle.
Tensoactivos: En relación con la presente invención, los tensoactivos (o “agentes de actividad superficial”) son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución,
o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro liquido, con el resultado de que se mejora la absorción de los ARN bc a través de la mucosa. Además, de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, IauriI-sulfato de sodio, lauril-éter de poIioxietiIeno-9, y cetiI-éter de polioxietileno20 (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43 (Takahashi y colaboradores, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: Diferentes ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido Iáurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína (1-mono-oleoiI-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, aciIcarnitinas, aciIcolinas, ésteres de alquilo de 1 a 10 átomos de carbono de las mismas (por ejemplo, metilo, isopropilo, y terbutilo), y mono y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 -33; E1 Hariri y colaboradores, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651 -654).
Sales biliares: El papel fisiológico de la bilis incluye facilitar la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, Capítulo 38, en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9na Edición, Hardman y colaboradores, Editores, McGraw-Hill, Nueva York, 1996, páginas 934 - 935). Diferentes sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de la penetración. Por consiguiente, el término “sales biliares” incluye cualquiera de los componentes de la bilis, así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal sódica farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio, y lauriléter de polioxietileno-9 (POE) (Lee y colaboradores, Critical Reviews ln Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39, en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ava Edición, Gennaro, editor, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782 - 783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 - 33; Yamamoto y colaboradores, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita y colaboradores, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579 - 583).
Agentes quelantes: Los agentes quelantes, pueden definirse como compuestos que remueven los iones metálicos de la solución, mediante Ia formación de complejos con los mismos, con el resultado de que se mejora la absorción de los ARN bc a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de penetración, los agentes quelantes tienen la ventaja adicional de servir también como inhibidores de ADNasa, debido a que la mayoría de las nucleasas de ADN caracterizadas requieren de un ión metálico divalente para la catálisis, y son por lo tanto, inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogn, 1993, 618, 315 - 339). Los agentes quelantes incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminatetraacetato disódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato, y homovanilato), derivados de N-acilo de colágeno, Iaureth-9, y derivados de N-aminoacilo de las beta-dicetonas (enaminas) (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 - 33; Buur y colaboradores, J. Control Rel., 1990, 14, 43 - 51).
No tensoactivos no quelantes: Como se utiliza en la presente invención, los compuestos potenciadores de penetración no tensoactivos no quelantes se pueden definir como los compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o como tensoactivos, pero que no obstante, mejoran la absorción de los ARN bc a través de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews ln Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1alquiI- y 1-aIqueniIazacicloalcanona (Lee y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes anti-inflamatorios no esteroideos, tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita y colaboradores, J. Pharm. PharmacoI., 1987, 39, 621 - 626).
Los agentes que mejoran la absorción de los ARN bc al nivel celular, también se pueden agregar a las composiciones farmacéuticas y a otras composiciones. Por ejemplo, también se sabe que los lípidos catiónicos, tales como lipofectina (Junichi y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5.705.188), los derivados de glicerol catiónicos, y las moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo y colaboradores, Solicitud PCT No. WO 97/30731), y otros péptidos, mejoran la absorción celular de los ARN bc.
Se pueden utilizar otros agentes para mejorar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles, tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles, tales como 2-pirrol, azonas, y terpenos tales como limoneno y mentona.
Portadores
Ciertas composiciones también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se utiliza en la presente invención, “compuesto portador" o “portador" puede referirse a un ácido nucleico o análogo del mismo, que sea inerte (es decir, no posee actividad biológica por sí mismo), pero que es reconocido como un ácido nucleico por los procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tenga actividad biológica, por ejemplo, mediante la degradación del ácido nucleico biológicamente activo, o promoviendo su remoción de la circulación. La co-administración de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de la última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón, u otros depósitos extracirculatorios, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARN bc parcialmente de fosforotioato en el tejido hepático, se puede reducir cuando se co-administra con ácido poli-inosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico, o ácido 4-acetamido-4’-isotiociano-estilben-2,2’-disulfónico (Miyao y colaboradores, Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115 - 121; Takakura y colaboradores, Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177 - 183.
Excipientes
En contraste con un compuesto portador, un “portador farmacéutico” o “excipiente" es un solvente, agente de suspensión, o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte, farmacéuticamente aceptable, para suministrar uno
o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido, y se selecciona, teniendo en mente la planeación de la administración, para proporcionar el volumen, consistencia, etc., deseados, cuando se combine con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz previamente gelatinizado, poIiviniIpirrolidona o hidroxipropilmetiIceIuIosa, etc.); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etiI-celulosa, poliacrilatos, o fosfato ácido de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).
Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral, que no reaccionan perjudicialmente con los ácidos nucleicos, también se pueden utilizar para formular las composiciones. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilengicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroxi-metiI-celulosa, polivinil-pirrolidona y similares.
Las formulaciones para administración tópica de los ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y
no estériles, soluciones no acuosas en solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener reguladores del pH, diluyentes, y otros aditivos adecuados. Se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral, que no reaccionen perjudicialmente con los ácidos nucleicos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetiIcelulosa, poIiviniIpirrolidona, y similares.
Composiciones farmacéuticas para el suministro al tracto respiratorio
Otro aspecto proporciona el suministro de agentes de ARNi al tracto respiratorio, en particular para el tratamiento de fibrosis quística. El tracto respiratorio incluye las vías respiratorias superiores, incluyendo la orofaringe y la laringe, seguidas por las vías respiratorias inferiores, las cuales incluyen la tráquea, seguida por las bifurcaciones en los bronquios y los bronquiolos. Las vías respiratorias superiores e inferiores se denominan como las vías respiratorias conductoras. Los bronquiolos terminales se dividen entonces en los bronquiolos respiratorios, que luego conducen hasta la zona respiratoria final, los alvéolos, o el pulmón profundo. El epitelio de las vías respiratorias conductoras es el objetivo primario de los aerosoles terapéuticos inhalados, para el suministro de los agentes de ARNi, tales como los agentes de alfa-ENaC por medio de ARNi.
Las composiciones de suministro pulmonar se pueden suministrar mediante inhalación por el paciente, de una dispersión, de tal manera que la composición, preferiblemente el agente de ARNi, dentro de la dispersión, pueda alcanzar al pulmón en donde puede, por ejemplo, ser fácilmente absorbida a través de la región alveolar directamente dentro de la circulación sanguínea. El suministro pulmonar puede ser efectivo tanto por suministro sistémico como por suministro localizado con el fin de tratar enfermedades de los pulmones.
El suministro pulmonar se puede lograr mediante diferentes enfoques, incluyendo el uso de formulaciones nebulizadas, en aerosol, micelares, y con base en polvo seco; la administración mediante inhalación puede ser oral y/o nasal. El suministro se puede lograr con nebulizadores líquidos, inhaladores basados en aerosol, y dispositivos de dispersión de polvo seco. Se prefieren los dispositivos dosificadores. Uno de los beneficios de utilizar un atomizador o inhalador, es que se minimiza el potencial de contaminación, debido a que los dispositivos están autocontenidos. Los dispositivos de dispersión de polvo seco, por ejemplo, suministran los fármacos que pueden ser fácilmente formulados como polvos secos. Una composición de ARNi se puede almacenar en forma estable como polvos liofilizados o secados por pulverización por sí mismos, o en combinación con portadores adecuados en polvo. El suministro de una composición para inhalación puede ser mediada por un elemento de tiempo de dosificación, el cual puede incluir un cronómetro, un contador de dosis, un dispositivo medidor de tiempo, o un indicador de tiempo que, cuando se incorpora en el dispositivo, hace posible el rastreo de la dosis, el monitoreo del cumplimiento y/o el disparo de la dosis a un paciente durante la administración del medicamento en aerosol.
Los ejemplos de los dispositivos farmacéuticos para suministro en aerosol incluyen inhaladores dosificadores (MDl), inhaladores de polvo seco (DPI), y nebulizadores de chorro de aire. Los ejemplos de sistemas de suministro mediante inhalación que se pueden adaptar fácilmente para el suministro de los agentes de ARN objetivo se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.756.353 y 5.858.784; y en las Solicitudes del PCT No. WO 98/31346; WO 98/10796; WO 00/27359; WO 01/54664; WO 02/060412. Otras formulaciones en aerosol que se pueden utilizar para suministrar los agentes de ARNi se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.294.153; 6.344.194; 6.071.497, y en las Solicitudes PCT Nos. WO 02/066078; WO 02/053190; WO 01/60420; WO 00/66206. Además, los métodos para suministrar los agentes de ARN se pueden adaptar a partir de aquéllos empleados en el suministro de otros oligonucleótidos (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) mediante inhalación, tal como se describe en Templin y colaboradores, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000, 10: 359 - 68; Sandrasagra y colaboradores, Expert Opin Biol Ther, 2001, 1: 979 - 83; Sandrasagra y colaboradores, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12: 177 - 81.
EI suministro de los agentes también puede involucrar Ia administración de los denominados “pro-fármacos", es decir, formulaciones o modificaciones químicas de una sustancia terapéutica que requiera de alguna forma de procesamiento o transporte mediante los sistemas innatos del organismo sujeto para liberar la sustancia terapéutica, preferiblemente en el sitio en donde se desee su acción; ésta última forma de realización se puede utilizar junto con el suministro al tracto respiratorio, pero también junto con otras formas de realización de la presente divulgación. Por ejemplo, los pulmones humanos pueden remover o degradar rápidamente los aerosoles depositados hidrolíticamente disociables durante períodos en el intervalo desde minutos hasta horas. En las vías respiratorias superiores, el epitelio ciliado contribuye al “excalador mucociliar", mediante el cual las particulas son barridas de las vías respiratorias hacia la boca. Pavia, D., "Lung Mucociliary Clearance", en Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, S. W. y Pavia, ll, Editores, Butterworths, Londres, 1984. En los pulmones profundos, los macrófagos alveolares son capaces de fagocitosar las partículas tan pronto se depositan. Warheit y colaboradores, Microscopy Res. Tech., 26: 412 -422 (1993); y Brain, J. D., “Physiology and Pathophysiology of
Pulmonary Macrophages", en The Reticuloendothelial System, S. M. Reichard y J. Filkins, Editores, Plenum, Nueva York, páginas 315 - 327,1985.
En formas de realización preferidas, en particular en donde se desee una dosificación sistémica con el agente de ARNi, los agentes de ARNii en aerosol se formulan como micropartículas. Las micropartículas que tienen un diámetro de entre 0,5 y 10 micras, pueden penetrar los pulmones, pasando a través de la mayoría de las barreras naturales. Se requiere un diámetro de menos de 10 micras para evitar la garganta; se requiere un diámetro de 0,5 micras o más para evitar ser exhaladas.
Otros componentes
Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes auxiliares convencionalmente encontrados en las composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Por consiguiente, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales, tales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales, o agentes anti-inflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diferentes formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como colorantes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes, y estabilizantes. Sin embargo, estos materiales, cuando se añaden no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones. Las formulaciones se pueden esterilizar, y si se desea se pueden mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar la presión osmótica, reguladores del pH, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares, que no interactúen de una manera perjudicial con el(los) ácido(s) nucleico(s) de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumenten Ia viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Ciertas formas de realización proporcionan combinaciones farmacéuticas y composiciones que contienen: (a) uno o más agentes de ARN bc, y (b) uno o más agentes terapéuticos diferentes que funcionen mediante un mecanismo de interferencia que no sea de ARN.
De conformidad con lo anterior, la invención incluye una combinación de un ARNi con una sustancia farmacológica anti-inflamatoria, broncodilatadora, anti-histamínica, anti-tusiva, antibiótica, o de ADNasa, estando dicho bloqueador del canal de sodio epitelial y dicha sustancia farmacológica en la misma o en diferente composición farmacéutica.
Los antibióticos adecuados incluyen antibióticos de macrólidos, por ejemplo tobramicina (TOBI™).
Las sustancias farmacológicas adecuadas de ADNasa incluyen dornasa alfa (PulmozymeTM), una solución altamente purificada de desoxiribonucleasa I humana recombinante (rhADNasa), que disocia selectivamente el ADN. La dornasa alfa se utiliza para tratar fibrosis quística.
Otras combinaciones útiles de bloqueadores del canal de sodio epitelial con fármacos anti-inflamatorios, son aquéllas con antagonistas de los receptores de quimioquina, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, y CCR-10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5, tales como antagonistas de Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 y SCH-D; los antagonistas Takeda, tales como cloruro de N-[[4-[[[6,7-dihidro-2-(4-metil-feniI)-5H-benzo-ciclohepten-8-il]carbonil]amino]feniI]metiI]tetrahidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-aminio (TAK-770); y antagonistas de CCR-5 descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6.166.037 (particularmente en las reivindicaciones 18 y 19), en la Publicación internacional No. WO 00/66558 (particularmente en la reivindicación 8), en la Publicación internacional No. WO 00/66559 (en particular en la reivindicación 9), en la Publicación internacional No. WO 04/018425, y en la Publicación internacional No. WO 04/026873.
Los fármacos anti-inflamatorios adecuados incluyen esteroides, en particular glucocorticosteroides, tales como budesonida, dipropionato de beclametasona, propionato de fluticasona, ciclesonida, o furoato de mometasona, o los esteroides descritos en Ias Publicaciones Internacionales Nos. WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (especialmente aquéllos de los Ejemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 y 101), WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 y WO 04/66920; agonistas del receptor glucocorticoide no esteroideos, tales como aquéllos descritos en el documento DE 10261874, en las Publicaciones internacionales Nos. WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 y WO 04/26248; antagonistas de LTD4, tales como montelukast y zafirlukast; inhibidores de PDE4, tales como cilomilast (Ariflo® GIaxoSmithKIine), Roflumilast (Byk Gulden), V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), Arofilina (Almirall Prodesfarma), PD189659/PD168787 (Parke-Davis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (Celgene), SeICID(TM)
CC-10004 (Celgene), VM5541UM565 (VernaIis), T-440 (Tanabe), KW-4490 (Kyowa Hakko Kogyo), y aquéllos que se dan a conocer en las Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/19594, WO 93/19749, WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945, WO 04/045607 y WO 04/037805; antagonistas del receptor de adenosina A2B, tales como los descritos en la Publicación internacional WO 02/42298; y agonistas del adrenoceptor beta-2, tales como albuterol (salbutamol), metaproterenol, terbutalina, salmeterol, fenoterol, procaterol, y especialmente, formoterol, carmoterol, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y los compuestos (en forma libre o de sal o de solvato) de Fórmula (l) de la Publicación internacional WO 00/75114, preferiblemente los compuestos de los ejemplos de la misma, en especial indacaterol y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo, así como los compuestos (en forma libre o de sal o de solvato) de la Fórmula (l) de la Publicación internacional WO 04/16601, y también los compuestos de los documentos EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, USP 200210055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618, WO 04/46083, WO 04/80964, WO 04/108765 y WO 04/108676.
Los fármacos broncodilatadores adecuados incluyen agentes anticolinérgicos o antimuscarínicos, en particular bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, sales de tiotropio y CHF 4226 (Chiesi), y glicopirrolato, pero también los que se describen en os documentos EP 424021, USP 3.714.357, USP 5.171.744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 y WO 04/05285.
Los fármacos anti-inflamatorios y broncodilatadores duales adecuados incluyen al antagonistas del adrenoceptor beta-2/antagonistas muscarinicos, tales como aquellos divulgados en los documentos USP 2004/0167167, WO 04/74246 y WO 04/74812.
Las sustancias armacológicas anti-histamínicas adecuadas incluyen clorhidrato de cetirizina, acetaminofen, fumarato de clemastina, prometazina, loratidina, desloratidina, difenhidramina, y clorhidrato de fexofenadina, activastina, astemizol, azelastina, evastina, epinastina, mizolastina y tefenadina, así como los que se dan a conocer en los documentos JP 2004107299, WO 03/099807 y WO 04/026841.
Otras combinaciones útiles de agentes con fármacos anti-inflamatorios son aquéllas con antagonistas de receptores de quimiocina, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 y CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente los antagonistas de CCR-5 tales como los antagonistas Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 y SCH-D; los antagonistas Takeda, tales como cloruro de N-[[4-[[[6,7dihidro-2-(4-metil-feniI)-5H-benzo-ciclohepten-B-iH-carbonill-amino]feniI]metill-tetrahidro-N,N-dimetiI-2H-piran-4 aminio (TAK-770), y los antagonistas de CCR-S descritos en la Patente de los Estados Unidos No. USP 6.166.037 (en particular en las reivindicaciones 18 y 19), en la Publicación internacional WO 00/66558 (en particular en la reivindicación 8), en Ia Publicación internacional WO 00/66559 (en particular en la reivindicación 9), y en las Publicaciones Internacionales WO 04/018425 y WO 04/026873.
Otros agentes terapéuticos adicionales útiles también se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en las moléculas enlazadoras de citoquina, particularmente anticuerpos de otras citoquinas, en particular una combinación con un anticuerpo anti-IL4, tal como se describe en el documento PCT Número PCT/EP2005/00836, un anticuerpo anti-lgE, tal como XoIair®, un anticuerpo anti-lL31, un anticuerpo anti-IL31R, un anticuerpo anti-TSLP, un anticuerpo receptor anti-TSLP, un anticuerpo anti-endoglina, un anticuerpo anti-IL1b, o un anticuerpo anti-IL13, tal como se describen en la Publicación internacional WO 05/007699.
Se pueden utilizar dos o más compuestos combinados juntos en una sola formulación, en forma separada, en forma concomitante o en forma secuencial.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de estos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y Ia ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como Ia relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiban altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de los estudios con animales, se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de las composiciones de la invención está generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen Ia ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante del compuesto, o, cuando sea apropiado, del producto de polipéptido de una secuencia objetivo (por ejemplo, para alcanzar una concentración reducida del polipéptido) que incluya la lC50 (es decir, Ia concentración del compuesto de prueba que logre una inhibición media-máxima de los síntomas), como se determina en cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar más precisamente las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
Además a su administración individualmente o como una pluralidad, como se discutió anteriormente, los ARN bc se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos efectivos en el tratamiento de trastornos relacionados con ENaC. En cualquier caso, el médico que administre puede ajustar la cantidad y el tiempo de administración del ARN bc con base en los resultados observados utilizando medidas de eficacia estándar conocidas en la técnica o descritas en la presente invención.
Métodos de tratamiento y vías de suministro
Una composición que incluya un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi que se dirija al alfa-ENaC, se puede suministrar a un sujeto mediante una variedad de vías para alcanzar el suministro local en el sitio de acción, o para el suministro sistémico al sujeto. Los ejemplos de vías incluyen la administración local directa en el sitio de tratamiento, tal como en los pulmones o en el pasaje nasal, así como el suministro intravenoso, nasal, oral y ocular. Los medios preferidos para administrar los agentes de ARNi son a través de la administración directa a los pulmones y al pasaje nasal como una solución líquida, en aerosol o nebulizada.
Las formulaciones para inhalación o para administración parenteral son bien conocidas enel arte. Esta formulación puede incluir soluciones acuosas estériles, las cuales también pueden contener reguladores del pH, diluyentes y otros aditivos adecuados. Para uso intravenoso, la concentración total de los solutos debe controlarse para hacer que la preparación sea isotónica.
Los compuestos activos dados a conocer en la presente invención, preferiblemente se administran a el(los) pulmon(es) o al pasaje nasal de un sujeto por cualquier medio apropiado. Los compuestos activos se pueden administrar mediante la administración de una suspensión en aerosol de particulas respirables que contienen el compuesto activo o los compuestos activos, los cuales son inhalados por el sujeto. El compuesto activo puede formar un aerosol en una variedad de formas, tales como, pero sin limitarse a, inhalantes de polvo seco, inhaladores con dosificador o suspensiones líquido/líquido. Las particulas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Las partículas opcionalmente pueden contener otros ingredientes terapéuticos, tales como amilorida, benzamil o fenamil, con el compuesto seleccionado incluido, en una cantidad efectiva para inhibir la reabsorción de agua desde las secreciones mucosas de las vías respiratorias, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No.
4.501.729.
La composición farmacéutica en partículas opcionalmente se puede combinar con un portador para ayudar a la dispersión o al transporte. Se puede mezclar un portador adecuado, tal como un azúcar (es decir, lactosa, sacarosa, trehalosa, manitol) con el compuesto o los compuestos activos, en cualquier proporción adecuada (por ejemplo, una proporción en peso de 1 a 1).
Las partículas abarcadas por el compuesto activo deben incluir partículas de un tamaño respirable, es decir, partículas de un tamaño suficientemente pequeño para pasar a través de la boca o la nariz y la laringe después de su inhalación y en los bronquios y los alvéolos de los pulmones. En general, las partículas en el intervalo de tamaños de aproximadamente 1 a 10 micras (más particularmente, de un tamaño menor de aproximadamente 5 micras) son respirables. Las partículas de un tamaño no respirable que se incluyan en el aerosol, tienden a depositarse en la garganta y a ser tragadas, y la cantidad de partículas no respirables en el aerosol de preferencia se minimiza. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partículas en el intervalo de 10 a 500 micras, para asegurar la retención en la cavidad nasal.
Las composiciones farmacéuticas líquidas del compuesto activo para producir un aerosol se pueden preparar mediante la combinación del compuesto activo con un vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de pirógenos. Las soluciones salinas hipertónicas utilizadas son preferiblemente soluciones estériles libres de pirógenos, que comprenden del uno a quince por ciento (en peso) de la sal fisiológicamente aceptable y más preferiblemente de tres a siente por ciento en peso de la sal fisiológicamente aceptable.
Los aerosoles de partículas líquidas que comprendan al compuesto activo, se pueden producir por cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador a chorro a presión o un nebulizador ultrasónico. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4.501.729. Los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman las soluciones o suspensiones del ingrediente activo en una niebla de aerosol terapéutica, ya sea por medio de aceleración de gas comprimido, típicamente aire u oxígeno, a través de un orificio venturi angosto, o por medio de agitación ultrasónica.
Las formulaciones adecuadas para utilizarse en los nebulizadores consisten del ingrediente activo en un portador líquido, comprendiendo el ingrediente activo hasta el 40% p/p de la formulación, pero preferiblemente menos del 20% p/p. El portador es típicamente agua (y más preferiblemente agua ésteril libre de pirógenos) o una solución alcohólica acuosa diluida, preferiblemente hecha isotónica, pero puede ser hipertónica con los fluidos corporales mediante la adición, por ejemplo, de cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen conservantes si la formulación no se hace estéril, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, agentes saborizantes, aceites volátiles, agentes reguladores del pH y tensoactivos.
De la misma manera, los aerosoles de particulas sólidas que comprenden al compuesto activo, se pueden producir con cualquier generador de aerosol terapéutico de partículas sólidas. Los generadores de aerosol para administrar compuestos terapéuticos sólidos en partículas a un sujeto, producen partículas que son respirables y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida previamente determinada de un producto terapéutico, en una proporción adecuada para la administración a seres humanos. Un tipo ilustrativo de un generador de aerosol de partículas sólidas es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para administración mediante insuflación incluyen polvos finamente triturados que pueden suministrarse por medio de un insuflador o que pueden llevarse hasta la cavidad nasal en forma de un aspirado. En el insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo efectiva para llevar a cabo los tratamientos descritos en la presente invención) está contenido en cápsulas o cartuchos, típicamente hechas de gelatina o de plástico, que se perforan o se abren in situ, y se suministra el polvo mediante el aire aspirado a través del dispositivo después de la inhalación o por medio de una bomba operada manualmente. El polvo empleado en el insuflador consiste ya sea exclusivamente del ingrediente activo o bien en una mezcla en polvo que comprenda al ingrediente activo, un diluyente de polvo adecuado, tal como lactosa, y un tensoactivo opcional. El ingrediente activo típicamente comprende de 0,1 a 100% p/p de la formulación.
Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador on dosificador. Los inhaladores con dosificador son dispensadores en aerosol presurizados, que contienen típicamente una formulación en suspensión o en solución del ingrediente activo en un propelente licuado. Durante su uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para suministrar un volumen medido, típicamente de 10 a 200 microlitros, para producir un aerosol en partículas finas que contiene al ingrediente activo. Los propelentes adecuados incluyen ciertos compuestos de clorofIuorocarbono, por ejemplo dicIorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismos. La formulación puede contener adicionalmente uno o más co-solventes, por ejemplo, etanol, tensoactivos, tales como ácido oleico, o trioleato de sorbitán, agentes antioxidantes y saborizantes adecuados.
Se puede incorporar un agente de ARNi en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir una o más especies de un agente de ARNi, y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente invención, a expresión “portador farmacéuticamente aceptable” pretende incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y contra hongos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en la medida en que el medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También se pueden incorporar en las composiciones, compuestos activos complementarios.
La administración puede ser efectuada por el sujeto o por otra persona, por ejemplo, un cuidador. Un cuidador puede ser cualquier entidad involucrada en proporcionar cuidado al ser humano: por ejemplo, un hospital, hospicio, consultorio médico, clínica de pacientes externos; un trabajador del cuidado de la salud, tal como un doctor, enfermera, u otro practicante; o una esposa o tutor, tal como un padre. El medicamento se puede proporcionar en dosis medidas, o en un dosificador que suministre una dosis medida.
El término “cantidad terapéuticamente efectiva” es la cantidad presente en Ia composición que se necesita para proporcionar el nivel deseado de fármaco al sujeto que se esté siendo tratando, para suministrar la respuesta fisiológica anticipada.
EI término “cantidad fisiológicamente efectiva" es la cantidad suministrada a un sujeto para suministrar el efecto paliativo o curativo deseado.
El término "portador farmacéuticamente aceptable” significa que el portador puede ser llevado hasta los pulmones sin efectos toxicológicos adversos significativos sobre los pulmones.
El término “coadministración" se refiere a la administración a un sujeto de dos o más agentes, y en particular dos o más agentes de ARNi. Los agentes pueden estar contenidos en una sola composición farmacéutica, o se pueden administrar al mismo tiempo, o los agentes pueden estar contenidos en una formulación separada, y se pueden administrar en serie al sujeto. Siempre que los dos agentes se puedan detectar en el sujeto al mismo tiempo, se dice que los dos agentes son coadministrados.
Los tipos de excipientes farmacéuticos que son útiles como portadores incluyen estabilizantes, tales como albúmina de suero humano (HSA), agentes de carga tales como carbohidratos, aminoácidos y polipéptidos; ajustadores o reguladores del pH; sales, tales como cloruro de sodio; y similares. Estos vehículos pueden estar en una forma cristalina o amorfa, o pueden ser una mezcla de los dos.
Los agentes de carga que son particularmente valiosos incluyen carbohidratos compatibles, polipéptidos, aminoácidos, o combinaciones de los mismos. Los carbohidratos adecuados incluyen monosacáridos, tales como galactosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tales como lactosa, trehalosa, y similares; ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina; y polisacáridos, tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos, y similares; alditoles, tales manitol, xilitol, y similares. Un grupo preferido de carbohidratos incluye lactosa, trehalosa, rafinosa, maltodextrinas, y manitol. Los polipéptidos adecuados incluyen aspartame. Los aminoácidos incluyen alanina y glicina, siendo preferida la glicina.
Los ajustadores o reguladores del pH adecuados incluyen sales orgánicas preparadas a partir de ácidos y bases orgánicos, tales como citrato de sodio, ascorbato de sodio, y similares; se prefiere el citrato de sodio.
Dosificación
Un agente de ARNi se puede administrar en una dosis unitaria aproximadamente menor a 75 mg por kg de peso corporal, o aproximadamente menor a 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, o 0.0005 mg por kg de peso corporal, y menor de 200 nmoles de agente de ARNi (por ejemplo, aproximadamente 4,4 x 1016 copias) por kg de peso corporal, o menor de 1.500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015 nmoles de agente de ARNi por kg de peso corporal. La dosis unitaria, por ejemplo, se puede administrar mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o intramuscular, intratecal, o directamente en un órgano), una dosis inhalada, o una aplicación tópica.
La dosificación puede ser una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno. Se puede suministrar en forma profiláctica, o como la parte principal una parte de un protocolo de tratamiento.
En una forma de realización, Ia dosis unitaria se administra con menos frecuencia que una vez al día, por ejemplo menos de cada 2, 4, 8, o 30 dias. En otra forma de realización, la dosis unitaria no se administra con una frecuencia (por ejemplo, no tiene una frecuencia regular). Por ejemplo, la dosis unitaria se puede administrar una sola vez. Debido a que el silenciamiento mediado por el agente de ARNi puede persistir durante varios días después de la administración de la composición del agente de ARNi, en muchos casos, es posible administrar la composición con una frecuencia de menos de una vez al día, o para algunas instancias, solamente una vez para todo el régimen terapéutico.
En una forma de realización, se administra a un sujeto una dosis inicial, y una o más dosis de mantenimiento de un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi bicatenario, o un agente de ARNi corto (por ejemplo, un precursor, por ejemplo un agente de ARNi más grande que se pueda procesar hasta un agente de ARNi corto, o un ADN que codifique un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi bicatenario, o un agente de ARNi corto, o un precursor de los mismos). La dosis o las dosis de mantenimiento generalmente son más bajas que la dosis inicial, por ejemplo menos de la mitad de la dosis inicial. Un régimen de mantenimiento puede incluir el tratamiento del sujeto con una dosis o unas dosis en el intervalo de 0,01 a 75 mg/kg de peso corporal al día, por ejemplo de 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, o 0.0005 mg por kg de peso corporal al día. Las dosis de mantenimiento preferiblemente se administran no más de una vez cada 5, 10, o 30 días. Además, el régimen de tratamiento puede durar un período de tiempo que variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad particular, de su severidad, y de la condición general del paciente. En las formas de realización preferidas, la dosificación se puede suministrar no más de una vez al día, por ejemplo no más de una vez cada 24, 36, 48, o más horas, por ejemplo, no más de una vez cada 5 u 8 días. Después del tratamiento, se puede monitorear al paciente para ver los cambios en su condición, y el alivio de los síntomas del estado de enfermedad. La dosificación del compuesto se puede aumentar en el caso en que el paciente no responda de una manera significativa a los niveles de dosificación actuales, o se puede disminuir la dosis si se observa un alivio de los síntomas del estado de enfermedad, si se ha reducido el estado de enfermedad, o si se observan efectos secundarios indeseados.
La dosis efectiva se puede administrar en una sola dosis o en dos o más dosis, como se desee o como se considere apropiado de acuerdo con las circunstancias específicas. Si se desea facilitar las infusiones repetidas o frecuentes, puede ser recomendable el implante de un dispositivo de suministro, por ejemplo una bomba, una cánula intraluminal semipermanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal, o intracapsular), o un depósito.
Después de un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a la terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de enfermedad, en donde el compuesto de la invención se administra en dosis de mantenimiento en el intervalo de 0,001 g a 100 g por kg de peso corporal (véase la Patente de los Estados Unidos No. 6.107.094).
La concentración de la composición del agente de ARNi es una cantidad suficiente para ser efectiva en el tratamiento o en la prevención de un trastorno, o para regular una condición fisiológica en seres humanos. La concentración o la cantidad del agente de ARNi administrada dependerá de los parámetros administrados para el agente, y del método de administración, por ejemplo nasal, bucal, o pulmonar. Por ejemplo, las formulaciones nasales tienden a requerir concentraciones mucho más bajas de algunos ingredientes con el objeto de evitar irritación o quemadura de los pasajes nasales. Algunas veces es recomendable diluir una formulación oral de 10 a 100 veces, con el objeto de proporcionar una formulación nasal adecuada.
Ciertos factores pueden tener influencia sobre la dosificación requerida para tratar efectivamente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la severidad de la enfermedad o del trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. También se apreciará que la dosificación efectiva de un agente de ARNi, tal como un ARNi corto utilizado para el tratamiento, puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento particular. Pueden resultar cambios en la dosificación y llegar a ser evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, se puede monitorear el sujeto después de la administración de una composición de agente de ARNi. Con base en la información del monitoreo, se puede administrar una cantidad adicional de la composición del agente de ARNi.
La dosificación depende de Ia severidad y respuesta de la enfermedad o condición que se vaya a tratar, durando el curso de tratamiento desde varios días hasta varios meses, o hasta que se efectúe una cura o se logre una disminución del estado de enfermedad. Se pueden calcular programas de dosificación óptima a partir de mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Las personas ordinariamente capacitadas en el arte pueden determinar fácilmente las dosificaciones óptimas, las metodologías de dosificación, y los índices de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los compuestos individuales, y en general se pueden estimar con base en las EC50 que se encontró que eran efectivas en los modelos animales in vitro e in vivo, como se describió anteriormente.
Los agentes de ARNi como se describe en la presente invención, pueden ser útiles en el tratamiento, y (cuando sea apropiado) en la prevención de cualquiera de las siguientes enfermedades/trastornos:
Fibrosis quística, síndrome de Liddles, insuficiencia renal, hipertensión, desequilibrios de electrolitos.
En particular, en algunas formas de realización, los agentes de ARNi de la invención se pueden utilizar para tratar y/o prevenir las manifestaciones clínicas adversas de estas enfermedades/trastornos.
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse como una limitación adicional.
Ejemplos
Fuente de los reactivos
Cuando no se suministre la fuente de un reactivo específicamente, este reactivo se puede obtener con cualquier proveedor de reactivos para biología molecular, con una calidad/pureza estándar para aplicaciones en biología molecular.
Ejemplo 1: Selección de secuencias
Con el objeto de identificar los ARNi corto terapéuticos para disminuir la expresión de la subunidad alfa del canal de sodio epitelial ENaC (α-ENaC), se definieron grupos de cribado basándose en un análisis bioinformático. Los operadores clave para el diseño de los grupos de cribado fueron la especificidad predicha de los ARNi corto contra el transcriptoma de las especies relevantes. Para la identificación de los ARNi corto para alfa-ENaC, y un sistema de suministro eficiente, se utilizó un enfoque de tres puntos: se seleccionó la rata como la especie de prueba para abordar la eficacia del silenciamiento in vivo después del suministro intratraqueal; se seleccionó el cobayo como el organismo modelo de la enfermedad para demostrar que la reducción del ARNm para alfa-ENaC da como resultado un efecto funcional mensurable. La molécula de ARNi corto terapéutica tiene que dirigirse al alfa-ENaC humano, asi como a la secuencia de alfa-ENaC de al menos una especie toxicológicamente relevante; en este caso, el mono Rhesus.
El análisis inicial de la secuencia relevante del ARNm para alfa-ENaC, reveló que se pueden identificar pocas secuencias que satisfagan los requerimientos de especificidad, y al mismo tiempo el ARNm objetivo para alfa-ENaC en todas las especies relevantes. Por consiguiente, se decidió diseñar grupos de cribado independientes para el ARNi corto terapéutico y para las moléculas sustitutas que se fueran a probar en el modelo de enfermedad relevante (Tablas 1A, 1B, 1C y 1D).
Todos los ARNi corto reconocen la secuencia del alfa-ENaC humano, debido a que se seleccionó un sistema de cultivo celular humano para Ia determinación de la actividad in vitro (H441, véase más adelante). Por consiguiente, todos los ARNi corto se pueden utilizar para dirigirse al ARNm para alfa-ENaC humano en un escenario terapéutico.
Los grupos de cribado terapéuticos se diseñaron para contener solamente secuencias de ARNi corto que sean completamente complementarias con las secuencias de alfa-ENaC humano y de mono Rhesus.
Diseño y selección in silico de ARNi corto que se dirigen al alfa-ENaC (SCNN1A)
Se llevó a cabo el diseño del ARNi corto para identificar los ARNi corto para los cuatro grupos previamente definidos (véase más arriba).
a) "Conjunto de cribado inicial”.
b) “Conjunto de cribado extendido".
c) "Conjunto sustituto in vivo para rata".
d) “Conjunto sustituto in vivo para cobayo”.
Conjunto de cribado inicial
El objetivo para la selección in silico de un conjunto de cribado inicial, fue identificar los ARNi corto que se dirigieran específicamente al alfa-ENaC humano, asi como a su ortólogo de mono Rhesus. El ARNm objetivo humano NM_001038.4) se descargó del recurso del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nihgov/entrezlquery.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide) durante el procedimiento de selección completo de ARNi corto. Con el objeto de identificar el ortóiogo de alfa-ENaC de Rhesus (Macaca mulatta), se utilizó la secuencia humana en una búsqueda con blastn en el Baylor College of Medicine (http://www.hgsc.bcm,tmc.edu/blast/?organism=Mmulatta) contra los cóntigos de Mmulatta a partir de 2004 10 01. Todas las regiones encontradas se extrajeron y se ensamblaron mediante la herramienta de ensamble CAP para generar una primera secuencia de ensamble. Además, se llevó a cabo una búsqueda con BLAST con la secuencia humana en UCSC (httpz/lgenome.ucsc.edu/cgibin/hgBIat?command=start&org=Rhesus&db=rheMac2&hgsid=84859356) contra Rhesus congelada el 12 de marzo de 2005. EI encuentro del andamiaje 84554 se descargó y se utilizó junto con la primera secuencia de ensamble mediante CAP, para generar la secuencia en consenso final para el alfa-ENaC de Rhesus.
En seguida de la extracción de todas las secuencias de 19 mer traslapadas fuera del ARNm humano, se identificaron los 19 mer conservados que tenían secuencias idénticas en la secuencia en consenso ensamblada de Rhesus. Estas secuencias de 19 mer se definieron como la reserva de secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-Rhesus, representadas por 1185 de 19 mers.
Se generaron las secuencias antisentido correspondientes y se probaron para determinar su especificidad en seres humanos. Para esto, se tomó como parámetro su potencial predicho para interactuar con los ARNm objetivo irrelevantes (potencial fuera del objetivo), que se tomó como un parámetro. Las secuencias con un bajo potencial fuera del objetivo se definieron como preferibles, y se predijo que eran más especificas.
Para una selección adicional, los ARNi corto candidatos se clasificaron de acuerdo con su potencial predicho para interactuar con otras secuencias huésped (aquí, sin limitación, un ser humano). Se asumió que los ARNi corto con un bajo potencial fuera del objetivo eran más específicos in vivo. Para predecir el potencial fuera del objetivo específico del ARNi corto, se hicieron las siguientes suposiciones:
1) El potencial fuera del objetivo de una cadena se puede deducir a partir del número y de la distribución de los malos emparejamientos con un fuera de objetivo;
2) EI fuera de objetivo más relevante, que es el gen que se predijo que tiene la más alta probabilidad de ser silenciado debido a la tolerancia de malos emparejamientos, determina el potencial fuera del objetivo de la cadena;
3) Las posiciones 2 a 9 (contando de 5' a 3’) de una cadena (región de siembra) pueden contribuir más al potencial fuera del objetivo que el resto de la secuencia (es decir, Ia región que no es de siembra y del sitio de disociación) (Haley, B., y Zamore, P. D., Nat. Struct. Mol Biol. 2004, 11: 599);
4) Las posiciones 10 y 11 (contando de 5’ a 3’) de una cadena (región del sitio de disociación) pueden contribuir más al potencial fuera del objetivo que la región que no es de siembra (es decir, las posiciones 12 a 18, contando de 5’ a
3’);
5) Las posiciones 1 y 19 de cada cadena no son relevantes para las interacciones fuera del objetivo;
6) El potencial fuera del objetivo se puede expresar mediante el puntaje fuera de objetivo del fuera de objetivo más relevante, calculado con base en el número y en la posición de malos emparejamientos de la cadena, con la región más homóloga en el gen fuera del objetivo, considerando las suposiciones 3 a 5;
7) Suponiendo un fracaso potencial de la actividad de la cadena sentido mediante las modificaciones internas introducidas, solamente será relevante el potencial fuera del objetivo de la cadena antisentido.
Para identificar los genes potenciales fuera del objetivo, se sometieron las secuencias antisentido de 19 mer a una búsqueda de homologías contra las secuencias de ARNm humanas públicamente disponibles, que se supone que representaban el transcriptoma exhaustivo humano.
Para este propósito, se llevaron a cabo búsquedas con fastA (versión 3.4) con todas las secuencias de 19 mer contra una base de datos RefSeq humana (versión disponible en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/ el 18 de noviembre de 2005). La búsqueda con fastA se realizó con parámetros-valores-pares -f 30 -g 30 con el propósito de tomar en consideración la homología sobre la longitud completa de las 19 mer sin ninguna brecha. Además, con el fin de asegurar el listado de todos los encuentros fuera del objetivo relevantes en el archivo producido por fastA, se utilizó el parámetro -E 15000.
La búsqueda dio como resultado un listado de fuera del objetivo potenciales para cada secuencia de entrada enlistada por homología de secuencia descendente sobre la de 19 mer completa.
Con el fin de clasificar todos los fuera del objetivo potenciales de acuerdo con las suposiciones 3 a 5, y mediante esto identificar el gen fuera del objetivo más relevante y su puntaje fuera del objetivo, se analizaron los archivos producidos por fastA mediante un guión perl.
EI guión extrajo las siguientes propiedades fuera del objetivo para cada secuencia introducida de 19 mer y para cada gen fuera del objetivo, para calcular el puntaje fuera del objetivo:
Número de malos emparejamientos en la región que no es de siembra.
Número de malos emparejamientos en la región de siembra.
Número de malos emparejamientos en la región del sitio de disociación.
El puntaje fuera del objetivo se calculó considerando las suposiciones 3 a 5 como sigue:
Puntaje fuera del objetivo = Número de malos emparejamientos de siembra * 10.
+
número de malos emparejamientos del sitio de disociación * 1,2.
+
número de malos emparejamientos que no son de siembra * 1.
EI gen fuera del objetivo más relevante para cada secuencia de 19 mer se definió como el gen con el puntaje fuera del objetivo más bajo. De acuerdo con lo anterior, el puntaje fuera del objetivo más bajo se definió como el representativo del potencial fuera del objetivo de cada ARNi corto, representado por la secuencia antisentido de 19 mer analizada.
Se utilizó el potencial fuera del objetivo calculado como el parámetro de selección (descendente por el puntaje fuera del objetivo), con el propósito de generar una clasificación para todas las secuencias de ARNi corto de reactividad cruzada de humano-Rhesus.
Un puntaje fuera del objetivo de tres o más se definió como un requisito previo para la selección de ARNi corto, mientras que todas las secuencias que contenían cuatro o más de G en una fila (secuencias poli-G) fueron excluidas, conduciendo a la selección de un total de 152 ARNi corto que se dirigen al alfa-ENaC humano y de Rhesus (véase la Tabla 1a).
Conjunto de cribado extendido
El objetivo para la selección in silico del conjunto de cribado extendido, fue identificar todos los ARNi corto
adicionales que se dirigen al alfa-ENaC humano con suficiente especificidad, que se excluyeron del grupo inicial debido a la pérdida de reactividad cruzada con Rhesus. Se tomaron las secuencias restantes de la reserva de 19 mers derivadas a partir del alfa-ENaC humano que no se han analizado antes, y se generaron las secuencias antisentido correspondientes. El gen fuera del objetivo más relevante y sus correspondientes puntajes fuera del objetivo, se calcularon como se describe en la sección del "conjunto de cribado inicial”.
Para la determinación de la reactividad cruzada con el ratón y el de cobayo (Cavia porcel/usicobya), se descargaron las secuencias de alfa-ENaC de estas especies de la base de datos de nucleótidos del NCBI 1 (números de acceso NM_011324.1 y AF071230 (longitud completa)/DQ109811 (cds parcial), respectivamente). Las dos secuencias de cobayo se utilizaron para generar una secuencia en consenso de alfa-ENaC de cobayo. Se probó cada secuencia de 19 mer humana para determinar su presencia en las secuencias de ratón y de cobayo. Las secuencias positivas se asignaron a la reserva de secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-ratón, o de las secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-cobayo. Después de la exclusión de todas las secuencias de poli-G, se seleccionaron las secuencias con puntajes fuera del objetivo de 3 o más, así como aquéllas con puntajes fuera del objetivo de 2,2 o de 2,4 y reactividad cruzada con ratón, Rhesus, o cobayo. El número total de ARNi corto en la reserva de cribado extendida fue de 344 (véase la Tabla 1b).
Conjunto sustituto de rata in vivo
El objetivo de la selección in silico del conjunto sustituto de rata in vivo fue identificar todos los ARNi corto que se dirigieran al alfa-ENaC humano y de rata con suficiente especificidad en rata. Para la identificación de los ARNi corto de reactividad cruzada de humano-rata, se descargó la secuencia de ARNm para alfa-ENaC de rata de la base de datos de nucleótidos del NCBI (número de acceso NM_031548.2), y todas las secuencias fuera de la reserva de 19 mers humanas se analizaron para determinar la presencia en la secuencia de rata, que representaba la reserva de las secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-rata.
Se generaron las secuencias antisentido correspondientes, y se probaron para determinar su especificidad en rata. Para esto, se calcularon el gen fuera del objetivo más relevante en rata y sus correspondientes puntajes fuera del objetivo, como se describe en la sección del “conjunto de cribado inicial”, utilizando el conjunto de ARNm (base de datos RefSeq) en lugar de los transcriptos humanas. Después de Ia exclusión de todas las secuencias poli-G, se generó una clasificación, considerando el puntaje fuera del objetivo de rata en primera prioridad, y el puntaje fuera del objetivo humano con segunda prioridad. Las 48 secuencias desde la parte superior de la lista fueron finalmente seleccionadas, representando al conjunto sustituto de rata in vivo (véase la Tabla 1c).
Conjunto sustituto de cobayo in vivo
El objetivo de la selección in silico del conjunto sustituto de cobayo in vivo, fue identificar todos los ARNi corto que se dirigieran al alfa-ENaC humano y de cobayo, que no se hubieran seleccionado en grupos anteriores. Los ARNi corto restantes del conjunto previamente determinado de las secuencias de ARNi corto (sentido) de reactividad cruzada de humano-cobayo, se clasificaron de acuerdo con los puntajes fuera del objetivo humanos. Se seleccionaron las 63 secuencias superiores (excluyendo las secuencias poli-G), que representaban el conjunto sustituto de cobayo in vivo (véase la Tabla 1d).
Ejemplo 2: Síntesis de ARNi corto
Síntesis de los nucleótidos que comprenden bases naturales
Debido a que los ARNi corto de los conjuntos de cribado son todos potencialmente pretendidos para administración in vivo, se sintetizaron los ARNi corto con una estrategia de modificación que protege a los ARNi corto de la degradación por las endo y exonucleasas, en un medio ambiente biológico. En esta estrategia, se protegen los extremos 3' de ambas cadenas de una actividad exonucleolitica 3' -> 5’, mediante un enlace fosforotioato entre las dos últimas nucleobases en el extremo 3’. Con el objeto de inhibir la degradación endonucleolítica del ARNi corto, todas las pirimidinas en la cadena sentido del ARNi corto fueron reemplazadas con el ribonucleótido modificado por 2'-O-metilo correspondiente. Para reducir el número de modificaciones en la cadena antisentido, que es la cadena más activa, y por consiguiente, más sensible a las modificaciones, solamente se modificaron las pirimidinas en el contexto de los sitios de disociación de la nucleasa principal previamente identificada con los grupos 2'-O-metiIo. Los sitios de disociación principales son los siguientes dos motivos de secuencia: 5'-UA-3' y 5’-CA-3’.
Debido a que también se ha considerado utilizar los ARNi corto en formulaciones que protejan potencialmente a los ARNs del medio ambiente biológico nucleolítico en el pulmón, también se sintetizó el mismo conjunto de los ARNi corto sin protección alguna de la degradación endonucleolítica.
Cuando la fuente de un reactivo no se suministra específicamente en la presente invención, este reactivo se puede obtener con cualquier proveedor de reactivos para biología molecular, con un estándar de calidad / pureza para
aplicación en biología molecular.
Los ARN monocatenarios se produjeron mediante síntesis en fase sólida a una escala de 1 µmol, utilizando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania), y vidrio deporos controlados (CPG, 500 Ángstroms, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como el soporte sólido. El ARN, y el ARN que contenía los nucleótidos de 2’-O-metilo, se generaron mediante sintesis en fase sólida, empleando las fosforamiditas y las fosforamiditas de 2’-O-metilo correspondientes, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Estos bloques de construcción se incorporaron en los sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena del oligorribonucleótido, utilizando química de fosforamidita de nucleósido convencional, tal como se describe en Current Protocols in Nucleic acid chemistry, Beaucage, S. L. y colaboradores (Editores), John Wiley Sons, Inc., Nueva York, NY, EUA. Los enlaces de fosforotioato se introdujeron mediante el reemplazo de la solución oxidante de yodo, con una solución del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd., Glasgow, Reino Unido) en acetonitrilo (al 1%). Otros reactivos auxiliares se obtuvieron a través de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).
La desprotección y purificación de los oIigorribonucleótidos sin procesar mediante HPLC de intercambio de aniones se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos establecidos. Los rendimientos y las concentraciones se determinaron mediante absorción ultravioleta de una solución del ARN respectivo, a una longitud de onda de 260 nm, utilizando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleiβheim, Alemania). Se generó el ARN bicatenario mezclando una solución equimolar de cadenas complementarias en el regulador de hibridación (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8; cloruro de sodio 100 mM), se calentó en un baño de agua a 85 - 90° C durante 30 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente durante un período de 3 a 4 horas. La solución de ARN hibridado se diluyó hasta una concentración de 50 µmoles de ARN bicatenario / L, y se almacenó a -20° C hasta su uso.
Ejemplo 3: Ensayo del ARNi corto in vitro
Se probó la capacidad de los agentes de ARNi para inhibir la expresión de alfa-ENaC en líneas celulares humanas in vitro, o en ratas in vivo. El agente de ARNi se transfecta en las células, por ejemplo, mediante transfección, se deja actuar sobre las células durante cierto tiempo, por ejemplo 24 horas, y se determinan los niveles de ARNm para alfa-ENaC mediante análisis de ARN ramificado. Alternativamente, el agente de ARNi se administra in vivo a través de la via intratraqueal, y se determina la inhibición de la expresión del ARNm para alfa-ENaC mediante el análisis del ADN ramificado sobre el órgano objetivo. Complementando estos ensayos directos, se analizó Ia inhibición de la expresión del gen objetivo por los agentes de ARNi para el ARNm para alfa-ENaC expresado en forma recombinante en células huésped de mamífero.
Lineas celulares
Se obtuvieron células H441 de la American Type Culture Collection (ATCC Número: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania), y se cultivaron en RPMI 1640, suero fetal de ternero al 10%, 100 u de penicilina / 100 µg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, y piruvato de sodio 1 mM (todos de Biochrom AG, Berlín, Alemania) a 37°C, bajo una atmósfera del 5% de CO2 / 95% de aire atmosférico.
Las células epiteliales bronquiales humanas primarias se obtuvieron a través de Cambrex (Cat # CC-2540), y se cuitivaron rutinariamente en un medio BEGM con SingleQuots (Cambrex Cat # CC-3170 sin tri-yodotreonina). Para la polarización y el crecimiento en la interfase aire-líquido, se cultivaron las células en una mezcla en proporción 1:1 de BEGM:DMEM complementado con 4,5 g/L de D-Glucosa (Gibco BRL Cat # 41965-039), y se complementaron con SingleQuots (Cambrex Cat # CC-4175), como anteriormente, pero sin la tri-yodotreonina y las alícuotas de GA1000, y en presencia de 50 µg/mL de Gentamicina (Gibco BRL Cat # 10131-015). Debido a que las células se mantuvieron en un medio libre de suero, se utilizó la solución de neutralización de tripsina durante las etapas de pasada (Cambrex Cat # CC-5002). Para la polarización y el cultivo en la interfase aire-líquido, se cultivaron las células sobre soportes de policarbonato semipermeables (0,4 micras) (Corning Costar Cat # 3407 #3460), y se cuitivaron todo el tiempo a 37° C bajo una atmósfera del 5% de CO2 / 95% de aire.
Las células de riñón de mono verde africano Cos-1 (ATCC # CRL-1650) se cuitivaron en MEM de Dulbecco, 4,5 g/L de glucosa, suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio (Gibco BRL), 100 unidades de penicilina/100 µg/mL de estreptomicina.
Ejemplo 3.1: Cribadi in vitro para la determinación de los ARNi corto para alfa-ENaC activos y de lC50 en H441
Un día antes de la transfección, se indujo la expresión de alfa-ENaC en células H441 (ATCC Número: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania), mediante la adición de 100 nM de dexametasona. Directamente antes de la transfección, se sembraron las células a razón 1,5 x 104 células/pozo, en placas de 96 pozos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) en 75 µL de medio de cultivo (RPMI 1640, suero fetal de ternera al 10%, 100 unidades de penicilina/100 µg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 nM, y piruvato de sodio 1 mM, todos de Biochrom AG, Berlín, Alemania). Las transfecciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. Para cada pozo, se mezclaron 0,5 µL de Lipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) con 12 µL de Opti-MEM (Invitrogen), y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para la concentración del ARNi corto con una concentración de 50 nM en el volumen de transfección de 100 µL, se mezcló 1 µL de un ARNi corto 5 µM con 11,5 µL de Opti-MEM por pozo, se combinó con la mezcla de Lipofectamina 2000-Opti-MEM, y nuevamente se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los complejos de ARNi corto -Lipofectamina 2000 se aplicaron completamente (25 microlitros cada vez por pozo) a las células, y se incubaron las células durante 24 horas a 37°C y CO2 al 5% en una incubadora humidificada (Heraeus GmbH, Hanau).
Se cosecharon las células mediante la aplicación de 50 µL de mezcla de lisis (contenido del kit QuantiGene bDNA de Genospectra, Fremont, EUA) a cada pozo que contenía 100 µL de medio de cultivo, y se Iisaron a 53°C durante 30 minutos. Después, se incubaron 50 µL de los Iisados con conjuntos de sondas específicos para alfa-ENaC humana y GAPDH humano (para las secuencias de los conjuntos de sondas, véase más abajo), y se procedió de acuerdo con el protocolo del fabricante para QuantiGene. AI final, se midió Ia quimiluminiscencia en un Victor2-Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Alemania) como la RLU (unidades relativas de luz), y se normalizaron los valores obtenidos con el conjunto de sondas hENaC con los valores respectivos de GAPDH para cada pozo. Los valores obtenidos con los ARNi corto dirigidos contra alfa-ENaC se relacionaron con el valor obtenido con un ARNi corto no específico (dirigido contra HCV), que se fijó en el 100%. El porcentaje de expresión residual de alfa-ENaC para los ejemplos de ARNi corto, se muestra en las Tablas 1A - 1D.
Los ARNi corto efectivos del cribado, se caracterizaron adicionalmente mediante curvas de respuesta a la dosis. Se llevaron a cabo transfecciones de curvas de respuesta a la dosis con las siguientes concentraciones: 100 nM, 16,7 nM, 2,8 nM, 0,46 nM, 77 picoM, 12,8 picoM, 2,1 picoM, 0,35 picoM, 59,5 fM, 9,9 fM y simulado (sin ARNi corto), y se diluyeron con Opti-MEM hasta una concentración final de 12,5 µL, de acuerdo con el protocolo anterior. El análisis de datos se llevó a cabo utilizando el complemento de software de Microsoft Excel, XL-fit 4.2 (IDBS, Guildford, Surrey, Reino Unido), y aplicando el número de modelo sigmoidal 606.
Conjuntos de Sondas:
alfa-ENaC humana:
Nombre FPL Miembros Función Secuencia SEQ
ID NO: hENAC001 .235.255.CE CE gtctgtccagggtttccttccTTTTTctcttggaaagaaagt 1645 hENAC002 .274.293.CE CE actgccattcttggtgcagtTTTTTctcttggaaagaaagt 1646 hENAC003 .344.367.CE CE ctctcctggaagcaggagtgaataTTTTTctcttggaaagaaagt 1647 hENAC004 .391.411.CE CE gccgcggatagaagatgtaggTTTTTctcttggaaagaaagt 1648 hENAC005 .501.521.CE CE gcacttggtgaaacagcccagTTTTTctcttggaaagaaagt 1649 hENAC006 .539.560.CE CE agcagagagctggtagctggtcTTTTTctcttggaaagaaagt 1650 hENAC007 .256.273.LE LE cgccataatcgcccccaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1651 hENAC008 .368.390.LE LE cacagccacactccttgatcatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1652 hENAC009 .412.431.LE LE acagtactccacgttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1653 hENAC010 .455.477.LE LE ggagcttatagtagcagtaccccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1654 hENAC011 .522.538.LE LE acgctgcatggcttccgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1655 hENAC012 .561.580.LE LE gagggccatcgtgagtaaccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1656 hENAC013 .214.234.BL BL Tcatgctgatggaggtctcca 1657 hENAC014 .294.318.BL BL Ggtaaaggttctcaacaggaacatc 1658 hENAC015 .319.343.BL BL Cacacctgctgtgtgtactttgaag 1659 hENAC016 .432.454.BL BL Caggaactgtgctttctgtagtc 1660 hENAC017 .478.500.BL BL Gtggtctgaggagaagtcaacct 1661 hENAC018 .581.599.BL BL Ccattcctgggatgtcacc 1662
GAPDH humana:
hGAP001 AF261085.252.271.CE CE gaatttgccatgggtggaatTTTTTctcttggaaagaaagt 1663 hGAP002 AF261085.333.352.CE CE ggagggatctcgctcctggaTTTTTctcttggaaagaaagt 1664 hGAP003 AF261085.413.431.CE CE ccccagccttctccatggtTTTTTctcttggaaagaaagt 1665 hGAP004 AF261085.432.450.CE CE gctcccccctgcaaatgagTTTTTctcttggaaagaaagt 1666 hGAP005 AF261085.272.289.LE LE agccttgacggtgccatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1667 hGAP006 AF261085.290.310.LE LE gatgacaagcttcccgttctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1668 hGAP007 AF261085.311.332.LE LE agatggtgatgggatttccattTTTTTaggcataggacccgtgtct 1669 hGAP008 AF261085.353.372.LE LE gcatcgccccacttgattttTTTTTaggcataggacccgtgtct 1670 hGAP009 AF261085.373.391.LE LE cacgacgtactcagcgccaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1671 hGAP010 AF261085.451.472.LE LE ggcagagatgatgacccttttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1672 hGAP011 AF261085.392.412.BL BL Ggtgaagacgccagtggactc 1673
Las lC50 para los ejemplos de ARNi corto se muestran en las Tablas 2A y 2B.
Ejemplo 3.2: Desactivación genética transitoria de alfa-ENaC en un modelo epitelial bronquial humano primario
Se sembraron células epiteliales bronquiales humanas (referencia del donador 4F1499) en placas de 24 pozos a razón de 1 x 105 células por pozo, en 0,5 mL de medio de cultivo, 1 día antes de la transfección. Las células eran 70% confluentes el día de la transfección del ARNi corto.
Cada ARNi corto se volvió a suspender a razón de 100 nM en 1 miL de Optimem 1 (Invitrogen), y en un tubo separado, se diluyó Lipofectamina 2000 (lnvitrogen) a razón de 6 µL/mL en Optimem, produciendo una cantidad suficiente para la transfección de cuatro réplicas en una placa de 24 pozos. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, se combinaron las mezclas para obtener la concentración final deseada de ARNi corto 50 nM y 3 µL/mL de Lipofectamina 2000. Se incubó la mezcla de transfección durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente, y se agregaron 420 µL del complejo de ARNi corto/reactivo a cada pozo, de acuerdo con el diseño experimental. Se sacudieron suavemente las placas para asegurar una mezcla completa, y luego se incubaron a 37° C en una incubadora con 5% de CO2 / 95% de aire durante 4 horas. Posteriormente, se aspiró la mezcla de transfección, y se regresaron las células a las condiciones de cultivo normales durante 20 horas adicionales.
Se prepararon los lisados celulares para el análisis de ADN ramificado. Se preparó una mezcla en proporción 2:1 de medio:amortiguador de lisis (Panomics), y se lisaron las células en 200 µL a 53°C durante 30 minutos. Después de una verificación visual para determinar la lisis completa, se almacenaron los lisados celulares a -80°C para el
siguiente análisis. El análisis de ADN ramificado se llevó a cabo como se describió anteriormente, con la expresión de alfa-ENaC normalizada contra GAPDH. El protocolo de análisis de ADN ramificado utilizado difiere del anterior solamente en que se aplicaron 20 µL de muestra a cada pozo en este caso.
La Tabla 2C muestra la expresión de alfa-ENaC en HBEC primario para los ejemplos de ARNi corto.
Ejemplo 3.3: Inhibición in vitro de la expresión del gen para alfa-ENaC cinomolgo clonado expresado en forma exógena, para los agentes de ARNi seleccionados, en células Cos-1
Clonación de la secuencia de alfa-ENaC de cinomolgo
Las secuencias cebadoras para la amplificación de la 5'-UTR y las CDS (los nucleótidos mostrados entre paréntesis corresponden a la secuencia de cADN para α-ENaC de Macaca mulatta (mono Rhesus)):
P745: 5’- CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3’ (nt 1427) (SEQ ID NO: 1674)
P733: 5’- CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3’ (nt 1) (SEQ ID NO: 1675)
P734: 5- CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3’ (nt 17) (SEQ ID NO: 1676)
P735: 5’- GGCCGCTGCACCTGTAGGG-3’ (nt 28) (SEQ ID NO: 1677)
Las secuencias cebadoras para la amplificación de CDS y 3'-UTR:
P737: 5’- ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3’ (nt 1422) (SEQ ID NO: 1678)
P740: 5’- TTGAGCATCTGCCTACTTG-3’ (nt 3113) (SEQ ID NO: 1679)
Las secuencias cebadoras para la amplificación de la parte interna de CDS:
P713: 5’-5’-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3’ (nt 1182) (SEQ ID NO: 1679)
P715: 5’-5’-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3’ (nt 2108) (SEQ ID NO: 1680)
El ARN total de pulmón de cinomolgo (Macaca fascicularis) (# R1534152-Cy-BC) se adquirió a través de BioCat (Alemania). La síntesis del ADNc se llevó a cabo utilizando el Sistema de Síntesis de la Primera Cadena SuperScript III (lnvitrogen). La síntesis del ADNc se llevó a cabo utilizando ya sea hexámeros aleatorios o bien cebadores de oligo dT. Además, el ADNc de Ia primera cadena de pulmón de cinomolgo también se adquirió a través de BioCat (# C1534160-Cy-BC). Para la amplificación por PCR, se utilizó el kit Advantage 2 PCR (# K1910-1, Clontech). La amplificación de la 5’-UTR y de partes de Ia CDS, se realizó utilizando P745 y una mezcla equimolar de P733, P734, y P735. Para Ia amplificación por PCR de la CDS y Ia 3’-UTR, se utilizaron los cebadores P737 y P740. Se utilizaron los cebadores P713 y P715 para la amplificación de partes de la CDS.
Todos los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y luego se clonaron en el vector pCR2.1 utilizando el kit de clonación TOPO TA (lnvitrogen) en bacterias TOP10. Luego se recogieron los clones, y se aisló el ADN utilizando el kit Qiagen Miniprep. Después de la digestión con enzima de restricción EcoRI, y del análisis mediante electroforesis en gel de agarosa, se sometió el ADN de los clones correctos a secuenciación.
Se alinearon luego las secuencias con Ia secuencia de ADNc para alfa-ENaC de mono Rhesus, y se alinearon las secuencias de los clones individuales entre sí. Luego se clonó la longitud completa del ADNc para alfa-ENaC de cinomolgo mediante digestión de Ia parte 5’ (5’-UTR y CDS, clon 55) con EcoR l y Not l, digestión de la parte media de la CDS con Not l y BstE II (clon 15), y la parte 3' (CDS y 3’-UTR) mediante BstE Il y EcoR V (clon 80). Los fragmentos de ADN digeridos se subclonaron entonces en pcDNA3.1, digerido con EcoR I y EcoR V. El ADNc de longitud completa para alfa-ENaC de cinomólogo en pcDNA3.1 se sometió entonces a secuenciación de longitud completa (lngenetix, Viena, Austria). La secuencia del ADNc para alfa-ENaC de cinomolgo corresponde a los nucleótidos 28 a 3113 de la secuencia de ADNc para alfa-ENaC de Rhesus. Finalmente, se separó luego el ADNc para alfa-ENaC de cinomolgo del alfa-ENaC de cinomoIgo pcDNA3.1 mediante digestión con BamH l y EcoR V, y se subclonó en el vector pXOON. El mapa del plásmido se ilustra en la Figura 1. La Figura 2 describe la secuencia de proteína (SEQ ID NO: 1681) y del ADN (SEQ ID NO: 1682) del alfa-ENaC de cinomolgo.
Transfecciones:
Se sembraron las células Cos-1 a razón de 6 x 104 células/pozo, en placas de 24 pozos cada una, en 0,5 mL de
medio de cultivo. Un día después de la siembra, se cotransfectaron las células con el plásmido de expresión de alfa-ENaC de cinomolgo pXOON, y el ARNi corto indicado. Para cada pozo, se cotransfectaron 4 ng de plásmido de expresión de alfa-ENaC y 600 ng de plásmido portador (pNFAT-luc) con el ARNi corto relevante (concentración final de 45 nM), utilizando el reactivo de transfección génica X-treme (Roche) a razón de 3.75 µL/pozo, en un volumen total de 720 µL/pozo de Opti-MEM (Invitrogen) como se describe a continuación.
Las transfecciones se llevaron a cabo por triplicado para cada muestra. Se prepararon mezclas maestras de plásmido/ARNi corto (cada una para 3,5 pozos) de la siguiente forma: 14 ng de plásmido de expresión de alfa-ENaC, 2,1 µg de plásmido portador, y 112 pmoles del ARNi corto relevante, en un volumen total de 210 µL (Opti-MEM). Se preparó una mezcla maestra de lípido para la transfección completa (105 µL de lípido más 1575 µL de Opti-MEM para ocho muestras de transfección por triplicado). Se mezclaron el plásmido/ARNi corto y el lípido en un volumen igual, para producir un volumen total de 420 µL de mezcla de transfección por muestra triplicada (3,5 veces). Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 120 µL de Ia mezcla de transfección relevante a cada pozo de células, en un volumen de transfección final de 720 µL (opti-MEM). Se transfectaron las células durante 24 horas a 37° C y CO2 al 5% en una incubadora humidificada (Heraeus GmbH, Hanau, Alemania), y se las cosechó para el análisis del ADN ramificado.
Se prepararon Iisados celulares para el análisis del ADN ramificado. Se preparó una mezcla en proporción de 2:1 de medio:amortiguador de lisis (Panomics), y se lisaron las células en 200 µL a 53°C durante 30 minutos. Después de una verificación visual para comprobar la lisis completa, se almacenaron los Iisados celulares a -80°C para el siguiente análisis. El análisis del ADN ramificado se llevó a cabo como se describió anteriormente, con la expresión de alfa-ENaC de cinomolgo normalizada contra eGFP del plásmido de expresión. El protocolo de análisis de ADN ramificado empleado difiere del anterior solamente en que se aplicaron 20 µL de muestra a cada pozo en este caso.
Conjunto de sondas:
Alfa-ENaC de cinomólogo:
Nombre FLP
Función Secuencia SEQ ID NO:
cyENa001
CE cgccgtgggctgctgggTTTTTctcttggaaagaaagt 1683
cyENa002
CE ggtaggagcggtggaactcTTTTTctcttggaaagaaagt 1684
cyENa003
CE cagaagaactcgaagagctctcTTTTTctcttggaaagaaagt 1685
cyENa004
CE cccagaaggccgtcttcatTTTTTctcttggaaagaaagt 1686
cyENa005
LE ggtgcagagccagagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt 1687
cyENa006
LE gtgccgcaggttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1688
cyENa007
LE gatcagggcctcctcctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1689
cyENa008
LE ccgtggatggtggtattgttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1690
cyENa009
LE gcggttgtgctgggagcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1691
cyENa0010
LE ttgccagtacatcatgccaaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1692
cyENa0011
BL acaccaggcggatggcg 1693
eGFP:
Nombre FLP
Función Secuencia SEQ ID NO:
EGFP001
CE ggcacgggcagcttgcTTTTTctcttggaaagaaagt 1694
EGFP002
CE ggtagcggctgaagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt 1695
EGFP003
CE cctggacgtagccttcgggTTTTTctcttggaaagaaagt 1696
EGFP004
CE ccttgaagaagatggtgcgctTTTTTctcttggaaagaaagt 1697
EGFP005
LE cgaacttcacctcggcgcTTTTTtcttggaaagaaagt 1698
EGFP006
LE ccttcagctcgatgcggtTTTTTctcttggaaagaaagt 1699
EGFP007
LE gtcacgagggtgggccagTTTTTaggcataggacccgtgtct 1700
EGFP008
LE cacgccgtaggtcagggtgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1701
EGFP009
LE gtgctgcttcatgtggtcggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1702
EGFP010
LE tcaccagggtgtcgccctTTTTTaggcataggacccgtgtct 1703
EGFP011
BL cggtggtgcagatgaacttca 1704
EGFP012
BL catggcggacttgaagaagtc 1705
EGFP013
BL cgtcctccttgaagtcgatgc 1706
La Tabla 2C muestra la expresión de alfa-ENaC en especies cinomólogas para los ejemplos de ARNi corto. Ejemplo 3.4: Cribado para la inducción del interferón-α Con el fin de evaluar la capacidad del ARNi corto para estimular la liberación del interferón- α (lFNα), se incubó ARNi
corto con células mononucleares de sangre periférica recién purificadas (PMBC) in vitro durante 24 horas. Se añadió
el ARNi corto ya sea directamente a las PMBC, o primero se formó un complejo con un agente de transfección de lípido (agente de transfección GenePorter 2 o Lipofectamina 2000 o DOTAP), y posteriormente se incubó con las PMBC. Como los controles positivos para la inducción de lFNα, se incluyeron las secuencias de control no modificadas Dl_A_2216 y DI_A_5167.
DI_A_2216: es una molécula de ADN antisentido monocatenaria.
5’-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-3’ (SEQ ID NO: 1707).
DI_A_5167 es un ARNi corto conjugado con colesterol.
5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-chol -3’
3'-CsAsCAGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5’ (SEQ ID NO: 1708)
Después de 24 horas, se midió el IFNα mediante ELISA. Se determinó el nivel basal de lFNα para las células no tratadas, y siempre estuvo muy cerca del control que solamente tenía agua. La adición del agente de transfección solo no produjo incremento o muy poco de los niveles de lFNα. Se agregaron oligonucleótidos estimuladores conocidos a las células, ya sea directamente, o bien en Ia presencia de transfectante, y se observaron los incrementos esperados del lFNα. Esta disposición permite determinar la estimulación de IFNα en las PBMC humanas mediante el ARNi corto (u otros oligonucleótidos).
Aislamiento de las PBMC humanas: Se obtuvo una fracción concentrada de leucocitos (recubrimiento esponjoso) en el Blood Bank Suhl, Institute for Transfusion Medicine, Alemania. Estas células eran negativas para una variedad de patógenos, incluyendo VIH, HCV, y otros. El recubrimiento esponjoso se diluyó en proporción 1:1 con PBS, se lo agregó a un tubo que contenía Ficoll, y se centrifugó durante 20 minutos a 2.200 rpm para permitir elfraccionamiento. Ésto fue seguido por la remoción de la capa turbia de glóbulos blancos, y se la transfirió a un tubo con PBS fresco y Ficoll, que se centrifugó durante 15 minutos a 2.200 rpm. Se removió nuevamente la capa turbia de glóbulos blancos, se la transfirió a un medio de cultivo de RPMI 1640, y se centrifugó durante 5 minutos a 1.200 rpm para precipitar los glóbulos blancos. Se resuspendieron las células en RPMI, se precipitó como anteriormente, y resuspendió en el medio con FCS al 10% hasta 1 x 106 /mL.
Medición de interferón-α: Se combinaron las células en cultivo ya sea con oligonucleótido 500 nM (o 1 µM) en Optimem, o bien con oligonucleótido 133 nM en GP2 o en Lipofectamina 2000 o en agente de transfección DOTAP durante 24 horas a 37°C. Se midió el interferón-α se midió con el kit ELISA instantáneo Bender Med Systems (Viena, Austria) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La selección de las secuencias terapéuticas líder se basó en un nivel de inducción de lFNα de menos del 15% del control positivo.
Ejemplo 3.5: Determinación de la estabilidad del ARNi corto en el esputo de pacientes con fibrosis quística
Las muestras de esputo fueron recolectadas por el Dr. Ahmet Uluer, Children’s Hospital Boston. Después de la recolección, se trataron las muestras de esputo con antibiótico, y se irradiaron con ultravioleta para reducir el contenido bacteriano. Con el objeto de determinar la estabilidad del ARNi corto en las muestras de esputo, se incubaron los ARNi corto en 30 µL de esputo en una concentración de 5 µM a 37°C durante los períodos indicados. La reacción se terminó mediante la adición de proteinasa K, y se incubaron las muestras a 42° C durante otros 20 minutos. Se agregó una molécula de ARN de 40 mer elaborada a partir de nucleótidos L (“Spiegelmer") resistente a la degradación por la nucleasa, y sirvió como estándar de calibración. Las muestras se filtraron a través de una membrana de 0,2 µm para remover el desecho restante. Las muestras se analizaron mediante HPLC de intercambio de iones desnaturalizante sobre una columna DNAPac PA 200 (Dionex) a un pH de 11,0 utilizando un gradiente de perclorato de sodio para la elución. Los ARNi corto y los productos de la degradación se cuantificaron mediante Ia determinación del área debajo del pico para cada muestra. La concentración se normalizó hasta la concentración en las muestras no incubadas.
La selección de las secuencias terapéuticas líder (ND8356, ND8357, y ND8396) se basó en una estabilidad in vitro observada en el esputo con fibrosis quística con una vida media superior a 60 minutos.
Ejemplo 3.6: Verificación cruzada de las secuencias terapéuticas líder contra los polimorfismos conocidos en el gen SCNN1A humano
Con el fin de excluir los polimorfismos conocidos de los sitios objetivo de los candidatos líder, se verificaron las secuencias de ARNi corto líder contra la base de datos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/iquery.fcgi?CMD=search&DB=snp). De los 10 polimorfismos de exones
conocidos en el gen SCNN1A humano, ninguno mostró estar presente en los sitios objetivo de cualquiera de los 10 candidatos terapéuticos líder más potentes.
Ejemplo 3.7: Perfilación in vitro de las 5 secuencias principales predichas fuera del objetivo
Se seleccionó una lista de alineaciones para cada secuencia mediante homologia sobre la región de 19 mer. Se calificó a las secuencias fuera del objetivo con base en el número y en la posición de los malos emparejamientos de acuerdo con los criterios descritos en el Ejemplo 1. Se identificaron las 5 secuencias principales fuera del objetivo para cada una de las secuencias terapéuticas líder (ND8356, ND8357, y ND8396). Las secuencias en y fuera del objetivo se clonaron individualmente en el sistema reportero doble de luciferasa. Cada fragmento clonado abarcó los 19 nucleótidos objetivo además de la región de flanqueo de 10 nucleótidos, tanto 5' como 3' de la secuencia objetivo. Se clonaron los fragmentos en múltiples sitios de clonación 3’ con Ia secuencia de luciferasa de Renilla, bajo el control de un promotor SV40. La actividad de cada ARNi corto contra ambas secuencias en y fuera del objetivo se determinó mediante la fluorescencia relativa de la luciferasa objetivo de Renilla con la luciferasa de luciérnaga, siendo ésta última controlada independientemente por el promotor HSV-TK. Inicialmente, se llevaron a cabo las transfecciones en células COS-7 con una concentración de ARNi corto de 50 nM. Las lecturas de luciferasa se tomaron a las 24 horas después de la transfección. Con esta alta concentración de ARNi corto, no se observó ninguna desactivación genética de más del 30% contra cualquier secuencia fuera del objetivo para cualquiera de los tres ARNi corto líder. La actividad contra la secuencia en el objetivo se demostró con una reducción relativa en la actividad de luciferasa de Renilla de aproximadamente el 80%. También se generaron las curvas de IC50 para cada ARNi corto contra la secuencia en el objetivo, y se controlaron con las secuencias fuera del objetivo identificadas anteriormente. Para cada ARNi corto líder, las IC50 en el objetivo en este ensayo reportero, fueron de un orden de magnitud similar (de 10 a 50 pM) a las IC50 obtenidas contra el objetivo endógeno en H441 (Ejemplo 3.3), indicando que para ND8356, ND8357, y ND8396, la potencia contra la secuencia en el objetivo fue al menos de 1.000 a 5.000 veces más alta que para cualquiera de las secuencias predichas fuera del objetivo.
Ejemplo 3.8: Perfilación de genotoxicidad
1.
Determinación de la citotoxicidad: La citotoxicidad se determinó utilizando un contador de células para la evaluación del número de células en cultivo.
2.
Es bien sabido que la prueba de las concentraciones citotóxicas in vitro puede inducir a efectos genotóxicos, tales como la formación de micronúcleos. Por consiguiente, se consideró que cantidades crecientes de células que contenían micronúcleos que aparecían en los recuentos celulares de alrededor del 50% o menos (comparado con el control negativo concurrente) estaban relacionados con la citotoxicidad, si no se podía observar ya un incremento dependiente de la dosis en las células micronucleadas con concentraciones que mostraran una toxicidad moderada cuando mucho. Se requiere el análisis de una concentración que muestre al menos 50% de reducción en el recuento de células por los lineamientos que regulan los ensayos celulares de mamífero in vitro (OECD, y los lineamientos de ICH para la conducción de la prueba de aberración de cromosomas). Además, los protocolos de OECD requieren de la prueba de compuestos no tóxicos para incluir al menos una concentración precipitante (siempre que ésta no exceda de 10 mM o 5 mg/mL, lo que sea más bajo). Debido a que la prueba de micronúcleos in vitro tiene como objetivo predecir el resultado de los ensayos reguladores, es decir, la prueba de aberración cromosómica in vitro, el protocolo para la prueba de micronúcleos in vitro se diseñó para satisfacer los requerimientos para estas pruebas.
3.
Sistema de prueba: Las células TK6 son células transfectadas con el virus de Epstein-Barr y células inmortalizadas (origen Iinfoblastoide humano derivado del bazo). Determinación del potencial clastogénico y/o aneugénico en la prueba de micronúcleos in vitro con células TK6 con/sin homogenato de hígado S9 (2%) de ratas macho (previamente tratadas con Aroclor 1254). Tiempo de tratamiento: 20 horas (-S9), 3 horas (+S9). Tiempo de muestreo: 24 horas después del inicio del tratamiento de 3 horas, 48 horas después del inicio del tratamiento de 20 horas. Para cada sustancia, se analizaron al menos tres concentraciones (2 cultivos por concentración), y 2.000 células por concentración.
4.
El efecto inductor de micronúcleo para una concentración probada se consideró positivo si la frecuencia de las células micronucleadas era:
•
>= 2%, y mostraba al menos una duplicación del valor de control de solvente concurrente, O
•
< 2% y mostraba al menos un aumento de tres veces sobre el valor de control de solvente concurrente.
5.
Para concluir que un experimento es positivo, se tiene que tomar en cuenta Ia relación dosis-efecto y Ia citotoxicidad.
6.
7.
Resumen: Las secuencias terapéuticas líder ND8396, ND8356, ND8357 no indujeron mayores números de céluias conteniendo micronúcleos después del tratamiento durante 20 horas sin activación metabólica, ni después del tratamiento de 3 horas con o sin S9. No se pudo analizar ninguna concentración citotóxica hasta el límite de prueba de 5 mg/mL.
5 Ejemplo 3.9: Eficacia funcional in vitro en H441:ND8396
Con el objeto de demostrar la eficacia funcional in vitro del ARNi corto líder contra alfa-ENaC, se transfectaron las células H441 con el ARNi corto, y se prepararon para el análisis de la cámara Ussings de transporte de iones. Para la transfección, se sembraron en placa las células H441 en matraces T25 a razón de 2x106 células por matraz, en un medio de cultivo complementado con dexametasona 200 mM. Se transfectaron las células de cada matraz ya sea 10 con ND8396, o bien con un ARNi corto de control no de direccionamiento, en ARNi corto 30 nM y 4 mL/mL de Lipofectamina 2000 en un volumen total de 5 mL (medio sin suero). Un día después de la transfección, se sembraron en placa las células sobre insertos Snapwell de 1 cm2 hasta confluencia (2 x 105 células por inserto), para minimizar el tiempo requerido para Ia diferenciación y la formación de uniones apretadas, y se suministraron con el medio tanto en la cámara apical como en la cámara basolateral. Después de un día de cultivo adicional, se removió
15 el medio apical, y se reemplazó el medio basolateral, llevando de esta manera a las células al cultivo de interfase aire-Iiquido (ALI). Las células se mantuvieron en la ALI durante 6 días adicionales antes del análisis de transporte de iones.
8. Para el análisis funcional en las cámaras Ussings, se montaron los insertos Snapyvell en Cámaras de Difusión Vertical (Costar), y se bañaron con solución de Ringer continuamente gasificada (CO2 al 5% en O2; pH 7,4) 20 mantenida a 37°C, conteniendo: NaCl 120 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 3,3 mM, K2HPO4 0,8 mM, CaCI2 1,2 mM, MgCl2 1,2 mM, y glucosa 10 mM. Se determinó la osmlolaridad de la solución dentro del intervalo de 280 a 300 mosmoles/kg de H2O. Se sujetaron las células al voltaje a 0 mV (modelo EVC4000; WPI). Se midió la resistencia transepitelial (RT) aplicando un pulso de 1 o 2 mV a intervalos de 30 s, o utilizando la diferencia de potencial inicial a través de las células y la corriente inicial medida, y luego se calculó Ia RT mediante Ia ley de Ohm. Se registraron los
25 datos utilizando una estación de trabajo PowerLab (ADlnstruments). Después del tratamiento con el ARNi corto, se registraron las características basales de las células, y la corriente de corto circuito sensible a la amilorida (ISC en seguida de la aplicación de amilorida 10 µM; lado apical solamente). Se determinó la actividad del canal de ENaC en cada cultivo mediante la lSC sensible a la amilorida en cada caso.
9. En seguida del ensayo, se lisaron las células sobre los insertos individuales para el análisis del ARN. Una
30 desactivación genética del 75% al nivel del ARN en el momento del ensayo (ND8396, comparado con el control sin direccionamiento) se correlacionó con una desactivación genética funcional de la corriente sensible a amilorida de aproximadamente el 30% (ND8396 comparado con el control sin direccionamiento).
Las secuencias de ácido nucleico se representan a continuación utilizando la nomenclatura estándar, y específicamente las abreviaturas de la Tabla A.
Abreviatura a
Nucleótido(s)
A
adenosina-5’-fosfato
C
citidina-5’-fosfato
G
guanosina-5’-fosfato
T
2’-desoxi-timidina-5’-fosfato
U
uridina-5’-fosfato
c
2’-O-metilcitidina-5’-fosfato
u
2’-O-metiluridina-5’-fosfato
Ts
2’-desoxi-timidina-5’-fosforotioato
Tabla 1A: ARNi corto seleccionados en el conjunto de cribado inicial (ARNi corto de reactividad cruzada de alfa-ENaC de humano-Rhesus). Se identificaron un total de 152 secuencias de ARNi como un conjunto de cribado inicial, tanto con (cadenas de secuencias 1-304) como sin (cadenas de secuencias 305-608) modificación de la estructura
40 base. Las secuencias de ARNi se diseñaron para ser completamente complementarias para ambas secuencias de alfa-ENaC humana y de mono Rhesus, de acuerdo con los criterios de diseño descritos en la sección de ejemplos. Se muestra el porcentaje de expresión residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfección de una sola dosis independientes (haga referencia a la sección de ejemplos para verlos métodos empleados).
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del 1ercribado@ 50nM en H441;MV SD 2do cribado@ 50nM en H441 SD
ND8285
1 AGcccGuAGcGuGGccuccTsT 2 GGAGGCcACGCuACGGGCUTsT 92% 4% 114% 15%
ND8286
3 ccGGGuAAuGGuGcAcGGGTsT 4 CCCGUGcACcAUuACCCGGTsT 60% 1% 84% 4%
ND8287
5 AuGcuAucGcGAcAGAAcATsT 6 UGUUCUGUCGCGAuAGcAUTsT 27% 2% 35% 3%
ND8288
7 uGcuAucGcGAcAGAAcAATsT 8 UUGUUCUGUCGCGAuAGcATsT 23% 1% 32% 4%
ND8289
9 GcccGuuuAuGuAuGcuccTsT 10 GGAGcAuAcAuAAACGGGCTsT 64% 2% 93% 8%
ND8290
11 GcccGuAGcGuGGccuccATsT 12 UGGAGGCcACGCuACGGGCTsT 83% 2% 115% 5%
ND8291
13 ccGGAAAuuAAAGAGGAGcTsT 14 GCUCCUCUUuAAUUUCCGGTsT 54% 2% 79% 10%
ND8292
15 ccGAAGGuuccGAAGccGATsT 16 UCGGCUUCGGAACCUUCGGTsT 40% 1% 54% 8%
ND8293
17 GcAAuucGGccuGcuuuucTsT 18 GAAAAGcAGGCCGAAUUGCTsT 41% 2% 51% 4%
ND8294
19 GGcGAAuuAcucucAcuucTsT 20 GAAGUGAGAGuAAUUCGCCTsT 19% 1% 25% 5%
ND8295
21 GcGAAuuAcucucAcuuccTsT 22 GGAAGUGAGAGuAAUUCGCTsT 19% 5% 20% 1%
ND8296
23 AAccAGGcGAAuuAcucucTsT 24 GAGAGuAAUUCGCCUGGUUTsT 92% 4% 115% 19%
ND8297
25 GGuAAuGGuGcAcGGGcAGTsT 26 CUGCCCGUGcACcAUuACCTsT 79% 2% 104% 14%
ND8298
27 cucAcGAuGGcccucGGuGTsT 28 cACCGAGGGCcAUCGUGAGTsT 61% 3% 97% 14%
ND8299
29 GcuccGAAGGuuccGAAGCTsT 30 GCUUCGGAACCUUCGGAGCTsT 16% 2% 19% 3%
ND8300
31 GccGAuAcuGGucuccAGGTsT 32 CCUGGAGACcAGuAUCGGCTsT 50% 5% 55% 5%
ND8301
33 ccGAuAcuGGucuccAGGcTsT 34 GCCUGGAGACcAGuAUCGGTsT 53% 2% 65% 6%
ND8302
35 uGcuGuuGcAccAuAcuuuTsT 36 AAAGuAUGGUGcAAcAGcATsT 19% 1% 25% 3%
ID del Duplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @ 50 nM en H441;MV SD 2do cribado@ 50nM en H441 SD
ND8303
37 AAcGGucuGucccuGAuGcTsT 38 GcAUcAGGGAcAGACCGUUTsT 90% 3% 96% 11%
ND8304
39 uuAAcuuGcGGccuGGcGuTsT 40 ACGCcAGGCCGcAAGUuAATsT 97% 3% 101% 11%
ND8305
41 GcuGGuuAcucAcGAuGGcTsT 42 GCcAUCGUGAGuAACcAGCTsT 73% 2% 78% 7%
ND8306
43 uuAcucAcGAuGGcccucGTsT 44 CGAGGGCcAUCGUGAGuAATsT 91% 7% 93% 6%
ND8307
45 GAAGccGAuAcuGGucuccTsT 46 GGAGACcAGuAUCGGCUUCTsT 71% 3% 73% 6%
ND6308
47 GAuAcuGGucuccAGGccGTsT 48 CGGCCUGGAGACcAGuAUCTsT 86% 1% 90% 9%
ND8309
49 AuAcuGGucuccAGGccGATsT 50 UCGGCCUGGAGACcAGuAUTsT 71% 5% 70% 8%
ND8310
51 cAAcGGucuGucccuGAuGTsT 52 cAUcAGGGAcAGACCGUUGTsT 80% 2% 84% 9%
ND8311
53 uuuAAcuuGcGGccuGGcGTsT 54 CGCcAGGCCGcAAGUuAAATsT 95% 2% 107% 15%
ND8312
55 uAcucAcGAuGGcccucGGTsT 56 CCGAGGGCcAUCGUGAGuATsT 44% 2% 97% 9%
ND8313
57 uuucGGAGAGuAcuucAGcTsT 58 GCUGAAGuACUCUCCGAAATsT 14% 2% 16% 2%
ND8314
59 GcAGAcGcucuuuGAccuGTsT 60 cAGGUcAAAGAGCGUCUGCTsT 55% 4% 58% 5%
ND8315
61 cuAcAucuucuAuccGcGGTsT 62 CCGCGGAuAGAAGAUGuAGTsT 20% 3% 26% 4%
ND8316
63 AGGcGAAuuAcucucAcuuTsT 64 AAGUGAGAGuAAUUCGCCUTsT 24% 1% 25% 2%
ND8317
65 ccGcuucAAccAGGucuccTsT 66 GGAGACCUGGUUGAAGCGGTsT 62% 5% 64% 4%
ND8318
67 cAAccGcAuGAAGAcGGccTsT 68 GGCCGUCUUcAUGCGGUUGTsT 54% 6% 54% 4%
ND8319
69 AuGAAGAcGGccuucuGGGTsT 70 CCcAGAAGGCCGUCUUcAUTsT 44% 4% 44% 6%
ND8320
71 AGcAcAAccGcAuGAAGAcTsT 72 GUCUUcAUGCGGUUGUGCUTsT 15% 1% 16% 1%
ND8321
73 ucGAGuuccAccGcuccuATsT 74 uAGGAGCGGUGGAACUCGATsT 85% 5% 89% 13%
ND8322
75 cuGcuucuAccAGAcAuAcTsT 76 GuAUGUCUGGuAGAAGcAGTsT 46% 4% 44% 3%
ND8323
77 GAGGGAGuGGuAccGcuucTsT 78 GAAGCGGuACcACUCCCUCTsT 60% 7% 56% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND8324
79 ccuuuAuGGAuGAuGGuGGTsT 80 CcACcAUcAUCcAuAAAGGTsT 83% 9% 82% 1%
ND8325
81 uGAGGGAGuGGuAccGcuuTsT 82 AAGCGGuACcACUCCCUcATsT 77% 6% 72% 2%
ND8326
83 ccuGcAAccAGGcGAAuuATsT 84 uAAUUCGCCUGGUUGcAGGTsT 41% 4% 44% 7%
ND8327
85 GGccuGGcGuGGAGAccucTsT 86 GAGGUCUCcACGCcAGGCCTsT 101% 5% 95% 4%
ND8328
87 uGcuuuucGGAGAGuAcuuTsT 88 AAGuACUCUCCGAAAAGcATsT 36% 1% 29% 2%
ND8329
89 cccGuAGcGuGGccuccAGTsT 90 CUGGAGGCcACGCuACGGGTsT 52% 1% 51% 2%
ND8330
91 ccGuAGcGuGGccuccAGcTsT 92 GCUGGAGGCcACGCuACGGTsT 86% 9% 84% 3%
ND8331
93 ccAGGcGAAuuAcucucAcTsT 94 GUGAGAGuAAUUCGCCUGGTsT 15% 2% 13% 1%
ND8332
95 GAAAcuGcuAuAcuuucAATsT 96 UUGAAAGuAuAGcAGUUUCTsT 10% 1% 10% 1%
ND8333
97 GcccGGGuAAuGGuGcAcGTsT 98 CGUGcACcAUuACCCGGGCTsT 83% 6% 82% 4%
ND8334
99 cccGGGuAAuGGuGcAcGGTsT 100 CCGUGcACcAUuACCCGGGTsT 56% 4% 71% 10%
ND8335
101 cGGGuAAuGGuGcAcGGGcTsT 102 GCCCGUGcACcAUuACCCGTsT 42% 3% 91% 8%
ND8336
103 GGGuAAuGGuGcAcGGGcATsT 104 UGCCCGUGcACcAUuACCCTsT 65% 5% 71% 7%
ND8337
105 uAAuGGuGcAcGGGcAGGATsT 106 UCCUGCCCGUGcACcAUuATsT 46% 3% 46% 4%
ND8338
107 cuGGuuAcucAcGAuGGccTsT 108 GGCcAUCGUGAGuAACcAGTsT 74% 5% 79% 10%
ND8339
109 GuuAcucAcGAuGGcccucTsT 110 GAGGGCcAUCGUGAGuAACTsT 85% 6% 92% 8%
ND8340
111 uGucAcGAuGGucAcccucTsT 112 GAGGGUGACcAUCGUGAcATsT 85% 4% 74% 5%
ND8341
113 uGcuccGAAGGuuccGAAGTsT 114 CUUCGGAACCUUCGGAGcATsT 37% 2% 32% 3%
ND8342
115 uccGAAGGuuccGAAGccGTsT 116 CGGCUUCGGAACCUUCGGATsT 60% 4% 47% 5%
ND8343
117 uuccGAAGccGAuAcuGGuTsT 118 ACcAGuAUCGGCUUCGGAATsT 15% 1% 13% 2%
ND8344
119 AGccGAuAcuGGucuccAGTsT 120 CUGGAGACcAGuAUCGGCUTsT 49% 3% 41% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND8345
121 cuuGGuAcuGccucuGAAcTsT 122 GUUcAGAGGcAGuACcAAGTsT 55% 2% 47% 4%
ND8346
123 cucccGuAGcAcAcuAuAATsT 124 UuAuAGUGUGCuACGGGAGTsT 67% 3% 57% 5%
ND8347
125 ucccGuAGcAcAcuAuAAcTsT 126 GUuAuAGUGUGCuACGGGATsT 29% 1% 26% 3%
ND8348
127 uGcAccAuAcuuucuuGuATsT 128 uAcAAGAAAGuAUGGUGcATsT 17% 1% 15% 3%
ND8349
129 uuGcccGuuuAuGuAuGcuTsT 130 AGcAuAcAuAAACGGGcAATsT 68% 2% 50% 4%
ND8350
131 uGcccGuuuAuGuAuGcucTsT 132 GAGcAuAcAuAAACGGGcATsT 59% 8% 44% 6%
ND8351
133 GGAcccuAGAccucuGcAGTsT 134 CUGcAGAGGUCuAGGGUCCTsT 86% 11% 82% 2%
ND8352
135 ccuAGAccucuGcAGcccATsT 136 UGGGCUGcAGAGGUCuAGGTsT 69% 7% 79% 3%
ND8353
137 uGGcAuGAuGuAcuGGcAATsT 138 UUGCcAGuAcAUcAUGCcATsT 58% 4% 52% 4%
ND8354
139 uAcuGGcAAuucGGccuGcTsT 140 GcAGGCCGAAUUGCcAGuATsT 101% 4% 100% 4%
ND8355
141 AAuucGGccuGcuuuucGGTsT 142 CCGAAAAGcAGGCCGAAUUTsT 49% 1% 43% 6%
ND8356
143 cuGcuuuucGGAGAGuAcuTsT 144 AGuACUCUCCGAAAAGcAGTsT 17% 3% 16% 1%
ND8357
145 uucGGAGAGuAcuucAGcuTsT 146 AGCUGAAGuACUCUCCGAATsT 13% 3% 16% 2%
ND8358
147 AGcAGAcGcucuuuGAccuTsT 148 AGGUcAAAGAGCGUCUGCUTsT 73% 9% 71% 5%
ND8359
149 cuuGcAGcGccuGAGGGucTsT 150 GACCCUcAGGCGCUGcAAGTsT 57% 9% 64% 7%
ND8360
151 uGGcuuuAAcuuGcGGccuTsT 152 AGGCCGcAAGUuAAAGCcATsT 102% 12% 106% 10%
ND8361
153 GcuuuAAcuuGcGGccuGGTsT 154 CcAGGCCGcAAGUuAAAGCTsT 83% 5% 62% 8%
ND8362
155 uAAcuuGcGGccuGGcGuGTsT 156 cACGCcAGGCCGcAAGUuATsT 119% 2% 115% 6%
ND8363
157 AccuuuAcccuucAAAGuATsT 158 uACUUUGAAGGGuAAAGGUTsT 17% 3% 13% 2%
ND8364
159 GGuuAcucAcGAuGGcccuTsT 160 AGGGCcAUCGUGAGuAACCTsT 104% 9% 117% 17%
ND8365
161 cAcGAuGGcccucGGuGAcTsT 162 GUcACCGAGGGCcAUCGUGTsT 140% 13% 100% 9%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel primercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND8366
163 AGAuGcuAucGcGAcAGAATsT 164 UUCUGUCGCGAuAGcAUCUTsT 46% 2% 70% 6%
ND8367
165 AcGAuGGucAcccuccuGuTsT 166 AcAGGAGGGUGACcAUCGUTsT 85% 6% 128% 10%
ND8368
167 cuccGAAGGuuccGAAGccTsT 168 GGCUUCGGAACCUUCGGAGTsT 12% 2% 18% 1%
ND8369
169 AAGGuuccGAAGccGAuAcTsT 170 GuAUCGGCUUCGGAACCUUTsT 63% 7% 114% 19%
ND8370
171 GGuAcuGccucuGAAcAcuTsT 172 AGUGUUcAGAGGcAGuACCTsT 36% 3% 71% 6%
ND8371
173 AGcuuuGAcAAGGAAcuuuTsT 174 AAAGUUCCUUGUcAAAGCUTsT 17% 1% 21% 1%
ND8372
175 uuuGAcAAGGAAcuuuccuTsT 176 AGGAAAGUUCCUUGUcAAATsT 16% 2% 26% 4%
ND8373
177 uGAcAAGGAAcuuuccuAATsT 178 UuAGGAAAGUUCCUUGUcATsT 12% 1% 22% 5%
ND8374
179 cccGuAGcAcAcuAuAAcATsT 180 UGUuAuAGUGUGCuACGGGTsT 41% 2% 75% 3%
ND8375
181 cAcuAuAAcAucuGcuGGATsT 182 UCcAGcAGAUGUuAuAGUGTsT 17% 1% 26% 2%
ND8376
183 uuGcuGuuGcAccAuAcuuTsT 184 AAGuAUGGUGcAAcAGcAATsT 45% 4% 69% 6%
ND8377
185 GuAcuGGcAAuucGGccuGTsT 186 cAGGCCGAAUUGCcAGuACTsT 60% 6% 120% 8%
ND8378
187 uucGGccuGcuuuucGGAGTsT 188 CUCCGAAAAGcAGGCCGAATsT 57% 5% 86% 11%
ND8379
189 ccuGcuuuucGGAGAGuAcTsT 190 GuACUCUCCGAAAAGcAGGTsT 43% 5% 50% 3%
ND8380
191 GcuuuucGGAGAGuAcuucTsT 192 GAAGuACUCUCCGAAAAGCTsT 16% 2% 24% 2%
ND8381
193 cuuuucGGAGAGuAcuucATsT 194 UGAAGuACUCUCCGAAAAGTsT 12% 1% 16% 3%
ND8382
195 cAAccucAAcucGGAcAAGTsT 196 CUUGUCCGAGUUGAGGUUGTsT 33% 2% 39% 3%
ND8383
197 cuAccAGAcAuAcucAucATsT 198 UGAUGAGuAUGUCUGGuAGTsT 13% 1% 23% 6%
ND8384
199 cuGucGAGGcuGccAGAGATsT 200 UCUCUGGcAGCCUCGAcAGTsT 11% 1% 18% 3%
ND8385
201 AAAcuGcuAuAcuuucAAuTsT 202 AUUGAAAGuAuAGCAGUUUTsT 48% 8% 64% 11%
ND8386
203 GGcuuuAAcuuGcGGccuGTsT 204 cAGGCCGcAAGUuAAAGCCTsT 55% 7% 70% 8%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND8387
205 cuuuAAcuuGcGGccuGGcTsT 206 GCcAGGCCGcAAGUuAAAGTsT 40% 11% 87% 14%
ND8388
207 AGGuGuGuAuucAcuccuGTsT 208 cAGGAGUGAAuAcAcACCUTsT 45% 3% 41% 5%
ND8389
209 AcGAuGGcccucGGuGAcATsT 210 UGUcACCGAGGGCcAUCGUTsT 43% 2% 60% 9%
ND8390
211 cuGAAcAcucuGGuuucccTsT 212 GGGAAACcAGAGUGUUcAGTsT 33% 2% 48% 11%
ND8391
213 cuAuAAcAucuGcuGGAGuTsT 214 ACUCcAGcAGAUGUuAuAGTsT 16% 1% 17% 4%
ND8392
215 GcAccAuAcuuucuuGuAcTsT 216 GuAcAAGAAAGuAUGGUGCTsT 19% 1% 22% 4%
ND8393
217 uGucuAGcccAucAuccuGTsT 218 cAGGAUGAUGGGCuAGAcATsT 69% 3% 92% 15%
ND8394
219 AGGAcccuAGAccucuGcATsT 220 UGcAGAGGUCuAGGGUCCUTsT 94% 5% 86% 13%
ND8395
221 ccAccGcuccuAccGAGAGTsT 222 CUCUCGGuAGGAGCGGUGGTsT 55% 1% 65% 6%
ND8396
223 uAccGAGAGcucuucGAGuTsT 224 ACUCGAAGAGCUCUCGGuATsT 11% 1% 11% 1%
ND8397
225 AAcAuccuGucGAGGcuGcTsT 226 GcAGCCUCGAcAGGAUGUUTsT 90% 7% 72% 11%
ND8398
227 GAAccuuuAcccuucAAAGTsT 228 CUUUGAAGGGuAAAGGUUCTsT 22% 2% 25% 4%
ND8399
229 GGuuccGAAGccGAuAcuGTsT 230 cAGuAUCGGCUUCGGAACCTsT 93% 9% 89% 9%
ND8400
231 AAGccGAuAcuGGucuccATsT 232 UGGAGACcAGuAUCGGCUUTsT 35% 2% 42% 9%
ND8401
233 ucuAGcccAucAuccuGcuTsT 234 AGcAGGAUGAUGGGCuAGATsT 95% 8% 95% 14%
ND8402
235 cGGcGccAuccGccuGGuGTsT 236 cACcAGGCGGAUGGCGCCGTsT 81% 8% 89% 17%
ND8403
237 uuuucGGAGAGuAcuucAGTsT 238 CUGAAGuACUCUCCGAAAATsT 13% 1% 13% 1%
ND8404
239 GAGAGuAcuucAGcuAcccTsT 240 GGGuAGCUGAAGuACUCUCTsT 71% 3% 100% 10%
ND8405
241 GAcGcucuuuGAccuGuAcTsT 242 GuAcAGGUcAAAGAGCGUCTsT 84% 5% 92% 13%
ND8406
243 uGuGuAuucAcuccuGcuuTsT 244 AAGcAGGAGUGAAuAcAcATsT 78% 2% 89% 8%
ND8407
245 AAcAAcAAGAGAAAuGGAGTsT 246 CUCcAUUUCUCUUGUUGUUTsT 66% 3% 88% 21%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND8408
247 AuuGAAGGAuGuGcAGGGcTsT 248 GCCCUGcAcAUCCUUcAAUTsT 25% 1% 36% 6%
ND8409
249 ucucAGAGccGcccAAAcuTsT 250 AGUUUGGGCGGCUCUGAGATsT 18% 1% 24% 2%
ND8410
251 AAAcAcAAccAAGGGuAcATsT 252 UGuACCCUUGGUUGUGUUUTsT 21% 1% 35% 2%
ND8411
253 uAcccGuGcccucAcAGAGTsT 254 CUCUGUGAGGGcACGGGuATsT 57% 2% 67% 4%
ND8412
255 uAGcAcAcuAuAAcAucuGTsT 256 cAGAUGUuAuAGUGUGCuATsT 30% 2% 41% 1%
ND8413
257 GGuGuGuAuucAcuccuGcTsT 258 GcAGGAGUGAAuAcAcACCTsT 73% 1% 90% 9%
ND8414
259 cAuGAucAAGGAGuGuGGcTsT 260 GCcAcACUCCUUGAUcAUGTsT 65% 2% 67% 5%
ND8415
261 AcucAcGAuGGcccucGGuTsT 262 ACCGAGGGCcAUCGUGAGUTsT 96% 6% 95% 6%
ND8416
263 GGAGcuuuGAcAAGGAAcuTsT 264 AGUUCCUUGUcAAAGCUCCTsT 24% 1% 28% 4%
ND8417
265 AuAcccGuGcccucAcAGATsT 266 UCUGUGAGGGcACGGGuAUTsT 54% 1% 62% 2%
ND8418
267 GGAGuGGccAAAGucAAcATsT 268 UGUUGACUUUGGCcACUCCTsT 93% 2% 86% 11%
ND8419
269 AAcuAcAAAAccAAuucuGTsT 270 cAGAAUUGGUUUUGuAGUUTsT 101% 5% 108% 19%
ND8420
271 uGcuGGAGuGuuGcuGuuGTsT 272 cAAcAGcAAcACUCcAGcATsT 29% 1% 26% 1%
ND8421
273 AGGucuccuGcAAccAGGcTsT 274 GCCUGGUUGcAGGAGACCUTsT 95% 10% 91% 17%
ND8422
275 cuuuGGcAuGAuGuAcuGGTsT 276 CcAGUAcAUcAUGCcAAAGTsT 86% 3% 84% 6%
ND8423
277 cAucuGcAcccucAAucccTsT 278 GGGAUUGAGGGUGcAGAUGTsT 82% 11% 73% 4%
ND8424
279 cGAcuGcAccAAGAAuGGcTsT 280 GCcAUUCUUGGUGcAGUCGTsT 70% 8% 69% 7%
ND8425
281 AAAAcAcAAccAAGGGuAcTsT 282 GuACCCUUGGUUGUGUUUUTsT 95% 6% 106% 12%
ND8426
283 cAucuGcuGGAGuGuuGcuTsT 284 AGcAAcACUCcAGcAGAUGTsT 30% 2% 37% 1%
ND8427
285 ccuAcAucuucuAuccGcGTsT 286 CGCGGAuAGAAGAUGuAGGTsT 42% 6% 30% 1%
ND8428
287 GccuAcAucuucuAuccGcTsT 288 GCGGAuAGAAGAUGuAGGCTsT 65% 7% 54% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribadon @ 50nM enH441 SD
ND8429
289 GAGuGGuAccGcuuccAcuTsT 290 AGUGGAAGCGGuACcACUCTsT 95% 11% 86% 19%
ND8430
291 GGuAccGcuuccAcuAcAuTsT 292 AUGuAGUGGAAGCGGuACCTsT 111% 19% 96% 14%
ND8431
293 GuGGuAccGcuuccAcuAcTsT 294 GuAGUGGAAGCGGuACcACTsT 98% 13% 52% 26%
ND8432
295 GAAuuAcucucAcuuccAcTsT 296 GUGGAAGUGAGAGuAAUUCTsT 111% 21% 73% 27%
ND8433
297 AAuuAcucucAcuuccAccTsT 298 GGUGGAAGUGAGAGuAAUUTsT 109% 22% 105% 7%
ND8434
299 uAcucucAcuuccAccAccTsT 300 GGUGGUGGAAGUGAGAGuATsT 106% 23% 95% 7%
ND8435
301 AGuGGuAccGcuuccAcuATsT 302 uAGUGGAAGCGGuACcACUTsT 109% 18% 102% 9%
ND8436
303 GGGcAAcuucAucuucGccTsT 304 GGCGAAGAUGAAGUUGCCCTsT 109% 18% 107% 14%
ND-8501
305 AGCCCGUAGCGUGGCCUCCTsT 306 GGAGGCCACGCUACGGGCUTsT 84% 14% 69% 3%
ND-8502
307 CCGGGUAAUGGUGCACGGGTsT 308 CCCGUGCACCAUUACCCGGTsT 41% 6% 30% 2%
ND-8503
309 AUGCUAUCGCGACAGAACATsT 310 UGUUCUGUCGCGAUAGCAUTsT 11% 2% 10% 2%
ND-8504
311 UGCUAUCGCGACAGAACAATsT 312 UUGUUCUGUCGCGAUAGCATsT 15% 2% 10% 0%
ND-8505
313 GCCCGUUUAUGUAUGCUCCTsT 314 GGAGCAUACAUAAACGGGCTsT 23% 3% 16% 1%
ND-8506
315 GCCCGUAGCGUGGCCUCCATsT 316 UGGAGGCCACGCUACGGGCTsT 32% 3% 22% 1%
ND-8507
317 CCGGAAAUUAAAGAGGAGCTsT 318 GCUCCUCUUUAAUUUCCGGTsT 35% 4% 24% 1%
ND-8508
319 CCGAAGGUUCCGAAGCCGATsT 320 UCGGCUUCGGAACCUUCGGTsT 19% 2% 13% 1%
ND-8509
321 GCAAUUCGGCCUGCUUUUCTsT 322 GAAAAGCAGGCCGAAUUGCTsT 12% 1% 8% 1%
ND-8510
323 GGCGAAUUACUCUCACUUCTsT 324 GAAGUGAGAGUAAUUCGCCTsT 21% 2% 18% 1%
ND-8511
325 GCGAAUUACUCUCACUUCCTsT 326 GGAAGUGAGAGUAAUUCGCTsT 12% 2% 8% 1%
ND-8512
327 AACCAGGCGAAUUACUCUCTsT 328 GAGAGUAAUUCGCCUGGUUTsT 99% 11% 79% 5%
ND-8513
329 GGUAAUGGUGCACGGGCAGTsT 330 CUGCCCGUGCACCAUUACCTsT 61% 6% 42% 4%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1er cribado@50 nM en H441;MV SD 2do cribado@ 50nM en H441 SD
ND-8514
331 CUCACGAUGGCCCUCGGUGTsT 332 CACCGAGGGCCAUCGUGAGTsT 94% 11% 70% 4%
ND-8515
333 GCUCCGAAGGUUCCGAAGCTsT 334 GCUUCGGAACCUUCGGAGCTsT 18% 2% 17% 2%
ND-8516
335 GCCGAUACUGGUCUCCAGGTsT 336 CCUGGAGACCAGUAUCGGCTsT 14% 1% 12% 1%
ND-8517
337 CCGAUACUGGUCUCCAGGCTsT 338 GCCUGGAGACCAGUAUCGGTsT 42% 5% 33% 2%
ND-8518
339 UGCUGUUGCACCAUACUUUTsT 340 AAAGUAUGGUGCAACAGCATsT 10% 1% 9% 0%
ND-8519
341 AACGGUCUGUCCCUGAUGCTsT 342 GCAUCAGGGACAGACCGUUTsT 60% 7% 52% 8%
ND-8520
343 UUAACUUGCGGCCUGGCGUTsT 344 ACGCCAGGCCGCAAGUUAATsT 82% 25% 77% 18%
ND-8521
345 GCUGGUUACUCACGAUGGCTsT 346 GCCAUCGUGAGUAACCAGCTsT 36% 4% 34% 7%
ND-8522
347 UUACUCACGAUGGCCCUCGTsT 348 CGAGGGCCAUCGUGAGUAATsT 105% 21% 113% 21%
ND-8523
349 GAAGCCGAUACUGGUCUCCTsT 350 GGAGACCAGUAUCGGCUUCTsT 24% 2% 18% 2%
ND-8524
351 GAUACUGGUCUCCAGGCCGTsT 352 CGGCCUGGAGACCAGUAUCTsT 30% 5% 25% 3%
ND-8525
353 AUACUGGUCUCCAGGCCGATsT 354 UCGGCCUGGAGACCAGUAUTsT 12% 1% 11% 2%
ND-8526
355 CAACGGLJCUGUCCCUGAUGTsT 356 CAUCAGGGACAGACCGUUGTsT 24% 7% 24% 2%
ND-8527
357 UUUAACUUGCGGCCUGGCGTsT 358 CGCCAGGCCGCAAGUUAAATsT 122% 6% 107% 9%
ND-8528
359 UACUCACGAUGGCCCUCGGTsT 360 CCGAGGGCCAUCGUGAGUATsT 78% 6% 84% 7%
ND-8529
361 UUUCGGAGAGUACUUCAGCTsT 362 GCUGAAGUACUCUCCGAAATsT 87% 18% 80% 17%
ND-8530
363 GCAGACGCUCUUUGACCUGTsT 364 CAGGUCAAAGAGCGUCUGCTsT 14% 2% 13% 0%
ND-8531
365 CUACAUCUUCUAUCCGCGGTsT 366 CCGCGGAUAGAAGAUGUAGTsT 20% 4% 18% 3%
ND-8532
367 AGGCGAAUUACUCUCACUUTsT 368 AAGUGAGAGUAAUUCGCCUTsT 25% 5% 18% 1%
ND-8533
369 CCGCUUCAACCAGGUCUCCTsT 370 GGAGACCUGGUUGAAGCGGTsT 30% 11% 22% 2%
ND-8534
371 CAACCGCAUGAAGACGGCCTsT 372 GGCCGUCUUCAUGCGGUUGTsT 33% 4% 23% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND-8535
373 AUCAAGACGGCCUUCUGGGTsT 374 CCCAGAAGGCCGUCUUCAUTsT 114% 12% 84% 15%
ND-8536
375 AGCACAACCGCAUGAAGACTsT 376 GUCUUCAUGCGGUUGUGCUTsT 18% 1% 16% 3%
ND-8537
377 UCGAGUUCCACCGCUCCUATsT 378 UAGGAGCGGUGGAACUCGATsT 25% 0% 26% 3%
ND-8538
379 CUGCUUCUACCAGACAUACTsT 380 GUAUGUCUGGUAGAAGCAGTsT 12% 1% 13% 2%
ND-8539
381 GAGGGAGUGGUACCGCUUCTsT 382 GAAGCGGUACCACUCCCUCTsT 43% 1% 47% 14%
ND-8540
383 CCUUUAUGGAUGAUGGUGGTsT 384 CCACCAUCAUCCAUAAAGGTsT 61% 5% 60% 8%
ND-8541
385 UGAGGGAGUGGUACCGCUUTsT 386 AAGCGGUACCACUCCCUCATsT 36% 5% 35% 5%
ND-8542
387 CCUGCAACCAGGCGAAUUATsT 388 UAAUUCGCCUGGUUGCAGGTsT 19% 2% 16% 1%
ND-8543
389 GGCCUGGCGUGGAGACCUCTsT 390 GAGGUCUCCACGCCAGGCCTsT 28% 7% 20% 2%
ND-8544
391 UGCUUUUCGGAGAGUACUUTsT 392 AAGUACUCUCCGAAAAGCATsT 22% 5% 17% 1%
ND-8545
393 CCCGUAGCGUGGCCUCCAGTsT 394 CUGGAGGCCACGCUACGGGTsT 25% 3% 22% 2%
ND-8546
395 CCGUAGCGUGGCCUCCAGCTsT 396 GCUGGAGGCCACGCUACGGTsT 62% 5% 57% 9%
ND-8547
397 CCAGGCGAAUUACUCUCACTsT 398 GUGAGAGUAAUUCGCCUGGTsT 23% 11% 16% 2%
ND-8548
399 GAAACUGCUAUACUUUCAATsT 400 UUGAAAGUAUAGCAGUUUCTsT 9% 3% 3% 0%
ND-8549
401 GCCCGGGUAAUGGUGCACGTsT 402 CGUGCACCAUUACCCGGGCTsT 87% 9% 92% 14%
ND-8550
403 CCCGGGUAAUGGUGCACGGTsT 404 CCGUGCACCAUUACCCGGGTsT 19% 12% 14% 1%
ND-8551
405 CGGGUAAUGGUGCACGGGCTsT 406 GCCCGUGCACCAUUACCCGTsT 68% 11% 73% 3%
ND-8552
407 GGGUAAUGGUGCACGGGCATsT 408 UGCCCGUGCACCAUUACCCTsT 30% 6% 33% 2%
ND-8553
409 UAAUGGUGCACGGGCAGGATsT 410 UCCUGCCCGUGCACCAUUATsT 29% 3% 31% 1%
ND-8554
411 CUGGUUACUCACGAUGGCCTsT 412 GGCCAUCGUGAGUAACCAGTsT 74% 15% 66% 8%
ND-8555
413 GUUACUCACGAUGGCCCUCTsT 414 GAGGGCCAUCGUGAGUAACTsT 91% 21% 88% 10%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @ 50 nM en H441;MV SD 2do cribado@ 50nM en H441 SD
ND-8556
415 UGUCACGAUGGUCACCCUCTsT 416 GAGGGUGACCAUCGUGACATsT 72% 4% 76% 12%
ND-8557
417 UGCUCCGAAGGUUCCGAAGTsT 418 CUUCGGAACCUUCGGAGCATsT 51% 2% 59% 18%
ND-8558
419 UCCGAAGGUUCCGAAGCCGTsT 420 CGGCUUCGGAACCUUCGGATsT 109% 11% 77% 13%
ND-8559
421 UUCCGAAGCCGAUACUGGUTsT 422 ACCAGUAUCGGCUUCGGAATsT 46% 20% 33% 6%
ND-8560
423 AGCCGAUACUGGUCUCCAGTsT 424 CUGGAGACCAGUAUCGGCUTsT 15% 6% 10% 1%
ND-8561
425 CUUGGUACUGCCUCUGAACTsT 426 GUUCAGAGGCAGUACCAAGTsT 16% 3% 12% 3%
ND-8562
427 CUCCCGUAGCACACUAUAATsT 428 UUAUAGUGUGCUACGGGAGTsT 14% 6% 10% 1%
ND-8563
429 UCCCGUAGCACACUAUAACTsT 430 GUUAUAGUGUGCUACGGGATsT 43% 11% 36% 4%
ND-8564
431 UGCACCAUACUUUCUUGUATsT 432 UACAAGAAAGUAUGGUGCATsT 17% 6% 13% 3%
ND-8565
433 UUGCCCGUUUAUGUAUGCUTsT 434 AGCAUACAUAAACGGGCAATsT 84% 2% 103% 12%
ND-8566
435 UGCCCGUUUAUGUAUGCUCTsT 436 GAGCAUACAUAAACGGGCATsT 69% 25% 93% 4%
ND-8567
437 GGACCCUAGACCUCUGCAGTsT 438 CUGCAGAGGUCUAGGGUCCTsT 29% 8% 33% 2%
ND-8568
439 CCUAGACCUCUGCAGCCCATsT 440 UGGGCUGCAGAGGUCUAGGTsT 18% 2% 19% 1%
ND-8569
441 UGGCAUGAUGUACUGGCAATsT 442 UUGCCAGUACAUCAUGCCATsT 19% 3% 20% 5%
ND-8570
443 UACUGGCAAUUCGGCCUGCTsT 444 GCAGGCCGAAUUGCCAGUATsT 86% 15% 83% 16%
ND-8571
445 AAUUCGGCCUGCUUUUCGGTsT 446 CCGAAAAGCAGGCCGAAUUTsT 19% 3% 24% 4%
ND-8572
447 CUGCUUUUCGGAGAGUACUTsT 448 AGUACUCUCCGAAAAGCAGTsT 8% 2% 12% 2%
ND-8573
449 UUCGGAGAGUACUUCAGCUTsT 450 AGCUGAAGUACUCUCCGAATsT 27% 3% 40% 5%
ND-8574
451 AGCAGACGCUCUUUGACCUTsT 452 AGGUCAAAGAGCGUCUGCUTsT 15% 0% 19% 4%
ND-8575
453 CUUGCAGCGCCUGAGGGUCTsT 454 GACCCUCAGGCGCUGCAAGTsT 35% 1% 40% 4%
ND-8576
455 UGGCUUUAACUUGCGGCCUTsT 456 AGGCCGCAAGUUAAAGCCATsT 47% 3% 53% 8%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND-8577
457 GCUUUAACUUGCGGCCUGGTsT 458 CCAGGCCGCAAGUUAAAGCTsT 20% 2% 25% 5%
ND-8578
459 UAACUUGCGGCCUGGCGUGTsT 460 CACGCCAGGCCGCAAGUUATsT 75% 7% 82% 4%
ND-8579
461 ACCUUUACCCUUCAAAGUATsT 462 UACUUUGAAGGGUAAAGGUTsT 14% 2% 17% 3%
ND-8580
463 GGUUACUCACGAUGGCCCUTsT 464 AGGGCCAUCGUGAGUAACCTsT 63% 5% 70% 11%
ND-8581
465 CACGAUGGCCCUCGGUGACTsT 466 GUCACCGAGGGCCAUCGUGTsT 56% 2% 50% 5%
ND-8582
467 AGAUGCUAUCGCGACAGAATsT 468 UUCUGUCGCGAUAGCAUCUTsT 18% 1% 18% 1%
ND-8583
469 ACGAUGGUCACCCUCCUGUTsT 470 ACAGGAGGGUGACCAUCGUTsT 48% 3% 52% 6%
ND-8584
471 CUCCGAAGGUUCCGAAGCCTsT 472 GGCUUCGGAACCUUCGGAGTsT 18% 2% 20% 5%
ND-8585
473 AAGGUUCCGAAGCCGAUACTsT 474 GUAUCGGCUUCGGAACCUUTsT 26% 2% 28% 1%
ND-8586
475 GGUACUGCCUCUGAACACUTsT 476 AGUGUUCAGAGGCAGUACCTsT 12% 1% 12% 1%
ND-8587
477 AGCUUUGACAAGGAACUUUTsT 478 AAAGUUCCUUGUCAAAGCUTsT 17% 2% 18% 2%
ND-8588
479 UUUGACAAGGAACUUUCCUTsT 480 AGGAAAGUUCCUUGUCAAATsT 78% 5% 73% 2%
ND-8589
481 UGACAAGGAACUUUCCUAATsT 482 UUAGGAAAGUUCCUUGUCATsT 14% 1% 16% 1%
ND-8590
483 CCCGUAGCACACUAUAACATsT 484 UGUUAUAGUGUGCUACGGGTsT 9% 1% 11% 2%
ND-8591
485 CACUAUAACAUCUGCUGGATsT 486 UCCAGCAGAUGUUAUAGUGTsT 18% 2% 20% 2%
ND-8592
487 UUGCUGUUGCACCAUACUUTsT 488 AAGUAUGGUGCAACAGCAATsT 23% 2% 25% 8%
ND-8593
489 GUACUGGCAAUUCGGCCUGTsT 490 CAGGCCGAAUUGCCAGUACTsT 66% 3% 62% 4%
ND-8594
491 UUCGGCCUGCUUUUCGGAGTsT 492 CUCCGAAAAGCAGGCCGAATsT 97% 7% 86% 8%
ND-8595
493 CCUGCUUUUCGGAGAGUACTsT 494 GUACUCUCCGAAAAGCAGGTsT 11% 2% 14% 3%
ND-8596
495 GCUUUUCGGAGAGUACUUCTsT 496 GAAGUACUCUCCGAAAAGCTsT 12% 1% 17% 2%
ND-8597
497 CUUUUCGGAGAGUACUUCATsT 498 UGAAGUACUCUCCGAAAAGTsT 11% 1% 14% 2%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única delprimercribado @ 50 nM en H441;MV SD 2do cribado@ 50nM en H441 SD
ND-8598
499 CAACCUCAACUCGGACAAGTsT 500 CUUGUCCGAGUUGAGGUUGTsT 15% 2% 16% 2%
ND-8599
501 CUACCAGACAUACUCAUCATsT 502 UGAUGAGUAUGUCUGGUAGTsT 17% 1% 18% 2%
ND-8600
503 CUGUCGAGGCUGCCAGAGATsT 504 UCUCUGGCAGCCUCGACAGTsT 17% 0% 16% 1%
ND-8601
505 AAACUGCUAUACUUUCAAUTsT 506 AUUGAAAGUAUAGCAGUUUTsT 28% 1% 26% 1%
ND-8602
507 GGCUUUAACUUGCGGCCUGTsT 508 CAGGCCGCAAGUUAAAGCCTsT 21% 2% 18% 1%
ND-8603
509 CUUUAACUUGCGGCCUGGCTsT 510 GCCAGGCCGCAAGUUAAAGTsT 81% 2% 69% 6%
ND-8604
511 AGGUGUGUAUUCACUCCUGTsT 512 CAGGAGUGAAUACACACCUTsT 47% 4% 40% 1%
ND-8605
513 ACGAUGGCCCUCGGUGACATsT 514 UGUCACCGAGGGCCAUCGUTsT 40% 6% 35% 2%
ND-8606
515 CUGAACACUCUGGUUUCCCTsT 516 GGGAAACCAGAGUGUUCAGTsT 60% 2% 75% 4%
ND-8607
517 CUAUAACAUCUGCUGGAGUTsT 518 ACUCCAGCAGAUGUUAUAGTsT 17% 1% 24% 3%
ND-8608
519 GCACCAUACUUUCUUGUACTsT 520 GUACAAGAAAGUAUGGUGCTsT 10% 1% 15% 3%
ND-8609
521 UGUCUAGCCCAUCAUCCUGTsT 522 CAGGAUGAUGGGCUAGACATsT 62% 2% 75% 12%
ND-8610
523 AGGACCCUAGACCUCUGCATsT 524 UGCAGAGGUCUAGGGUCCUTsT 61% 5% 73% 10%
ND-8611
525 CCACCGCUCCUACCGAGAGTsT 526 CUCUCGGUAGGAGCGGUGGTsT 21% 2% 29% 5%
ND-8612
527 UACCGAGAGCUCUUCGAGUTsT 528 ACUCGAAGAGCUCUCGGUATsT 13% 1% 22% 3%
ND-8613
529 AACAUCCUGUCGAGGCUGCTsT 530 GCAGCCUCGACAGGAUGUUTsT 57% 2% 70% 4%
ND-8614
531 GAACCUUUACCCUUCAAAGTsT 532 CUUUGAAGGGUAAAGGUUCTsT 13% 3% 16% 2%
ND-8615
533 GGUUCCGAAGCCGAUACUGTsT 534 CAGUAUCGGCUUCGGAACCTsT 18% 1% 24% 2%
ND-8616
535 AAGCCGAUACUGGUCUCCATsT 536 UGGAGACCAGUAUCGGCUUTsT 19% 1% 25% 2%
ND-8617
537 UCUAGCCCAUCAUCCUGCUTsT 538 AGCAGGAUGAUGGGCUAGATsT 93% 3% 101% 3%
ND-8618
539 CGGCGCCAUCCGCCUGGUGTsT 540 CACCAGGCGGAUGGCGCCGTsT 85% 4% 99% 4%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel primercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND-8619
541 UUUUCGGAGAGUACUUCAGTsT 542 CUGAAGUACUCUCCGAAAATsT 63% 2% 77% 3%
ND-8620
543 GAGAGUACUUCAGCUACCCTsT 544 GGGUAGCUGAAGUACUCUCTsT 26% 1% 30% 4%
ND-8621
545 GACGCUCUUUGACCUGUACTsT 546 GUACAGGUCAAAGAGCGUCTsT 17% 2% 19% 3%
ND-8622
547 UGUGUAUUCACUCCUGCUUTsT 548 AAGCAGGAGUGAAUACACATsT 49% 3% 58% 11%
ND-8623
549 AACAACAAGAGAAAUGGAGTsT 550 CUCCAUUUCUCUUGUUGUUTsT 74% 7% 70% 4%
ND-8624
551 AUUGAAGGAUGUGCAGGGCTsT 552 GCCCUGCACAUCCUUCAAUTsT 85% 6% 87% 12%
ND-8625
553 UCUCAGAGCCGCCCAAACUTsT 554 AGUUUGGGCGGCUCUGAGATsT 53% 3% 51% 6%
ND-8626
555 AAACACAACCAAGGGUACATsT 556 UGUACCCUUGGUUGUGUUUTsT 17% 2% 18% 2%
ND-8627
557 UACCCGUGCCCUCACAGAGTsT 558 CUCUGUGAGGGCACGGGUATsT 58% 3% 55% 3%
ND-8628
559 UAGCACACUAUAACAUCUGTsT 560 CAGAUGUUAUAGUGUGCUATsT 64% 3% 64% 15%
ND-8629
561 GGUGUGUAUUCACUCCUGCTsT 562 GCAGGAGUGAAUACACACCTsT 25% 3% 23% 2%
ND-8630
563 CAUGAUCAAGGAGUGUGGCTsT 564 GCCACACUCCUUGAUCAUGTsT 32% 2% 28% 2%
ND-8631
565 ACUCACGAUGGCCCUCGGUTsT 566 ACCGAGGGCCAUCGUGAGUTsT 96% 1% 88% 4%
ND-8632
567 GGAGCUUUGACAAGGAACUTsT 568 AGUUCCUUGUCAAAGCUCCTsT 14% 1% 14% 2%
ND-8633
569 AUACCCGUGCCCUCACAGATsT 570 UCUGUGAGGGCACGGGUAUTsT 21% 2% 16% 1%
ND-8634
571 GGAGUGGCCAAAGUCAACATsT 572 UGUUGACUUUGGCCACUCCTsT 21% 3% 16% 1%
ND-8635
573 AACUACAAAACCAAUUCUGTsT 574 CAGAAUUGGUUUUGUAGUUTsT 49% 5% 37% 3%
ND-8636
575 UGCUGGAGUGUUGCUGUUGTsT 576 CAACAGCAACACUCCAGCATsT 27% 3% 21% 2%
ND-8637
577 AGGUCUCCUGCAACCAGGCTsT 578 GCCUGGUUGCAGGAGACCUTsT 62% 8% 61% 4%
ND-8638
579 CUUUGGCAUGAUGUACUGGTsT 580 CCAGUACAUCAUGCCAAAGTsT 66% 6% 52% 8%
ND-8639
581 CAUCUGCACCCUCAAUCCCTsT 582 GGGAUUGAGGGUGCAGAUGTsT 50% 7% 40% 4%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50nM enH441 SD
ND-8640
583 CGACUGCACCAAGAAUGGCTsT 584 GCCAUUCUUGGUGCAGUCGTsT 67% 6% 54% 5%
ND-8641
585 AAAACACAACCAAGGGUACTsT 586 GUACCCUUGGUUGUGUUUUTsT 14% 2% 14% 1%
ND-8642
587 CAUCUGCUGGAGUGUUGCUTsT 588 AGCAACACUCCAGCAGAUGTsT 13% 2% 13% 1%
ND-8643
589 CCUACAUCUUCUAUCCGCGTsT 590 CGCGGAUAGAAGAUGUAGGTsT 15% 4% 13% 0%
ND-8644
591 GCCUACAUCUUCUAUCCGCTsT 592 GCGGAUAGAAGAUGUAGGCTsT 14% 3% 11% 1%
ND-8645
593 GAGUGGUACCGCUUCCACUTsT 594 AGUGGAAGCGGUACCACUCTsT 16% 0% 20% 1%
ND-8646
595 GGUACCGCUUCCACUACAUTsT 596 AUGUAGUGGAAGCGGUACCTs 12% 0% 14% 1%
ND-8647
597 GUGGUACCGCUUCCACUACTsT 598 GUAGUGGAAGCGGUACCACTsT 42% 4% 44% 3%
ND-8648
599 GAAUUACUCUCACUUCCACTsT 600 GUGGAAGUGAGAGUAAUUCTsT 10% 1% 11% 3%
ND-8649
601 AAUUACUCUCACUUCCACCTsT 602 GGUGGAAGUGAGAGUAAUUTsT 105% 10% 102% 8%
ND-8650
603 UACUCUCACUUCCACCACCTsT 604 GGUGGUGGAAGUGAGAGUATsT 55% 6% 54% 8%
ND-8651
605 AGUGGUACCGCUUCCACUATsT 606 UAGUGGAAGCGGUACCACUTsT 57% 6% 59% 12%
ND-8652
607 GGGCAACUUCAUCUUCGCCTsT 608 GGCGAAGAUGAAGUUGCCCTsT 47% 12% 36% 7%
Tabla1B: ARNi corto seleccionados en el conjunto de cribado extendido (ARNi corto “humanos solamente”). Se identificaron 344 secuencias de ARNi adicionales y sediseñaron para ser completamente complementarios para las secuencias de alfa-ENaC humanas, de acuerdo con los criterios de diseño descritos en la sección deejemplos. Todos los ARNi corto enlistados en este conjunto de cribado se modificaron solamente con un enlace de fosforotioato en el extremo 3’ entre los nucleótidos 20 y21 de cada cadena. Se muestra el porcentaje de expresión residual de alfa-ENaC en el ensayo de transfección de una sola dosis (remítase a la sección de ejemplos para verlos los métodos empleados).
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado@ 50nMen H441; MV SD
ND10445
609 CUGCGGCUAAGUCUCUUUUTsT 610 AAAAGAGACUUAGCCGCAGTsT 94% 8%
ND10446
611 AUCGCGACAGAACAAUUACTsT 612 GUAAUUGUUCUGUCGCGAUTsT 13% 2%
ND10447
613 UCGCGACAGAACAAUUACATsT 614 UGUAAUUGUUCUGUCGCGATsT 18% 1%
ND10448
615 CCCGUUUAUGUAUGCUCCATsT 616 UGGAGCAUACAUAAACGGGTsT 41% 1%
ND10449
617 CCCGGGUAAGUAAAGGCAGTsT 618 CUGCCUUUACUUACCCGGGTsT 23% 1%
ND10450
619 GGUACCCGGAAAUUAAAGATsT 620 UCUUUAAUUUCCGGGUACCTsT 14% 2%
ND10451
621 GCUAUCGCGACAGAACAAUTsT 622 AUUGUUCUGUCGCGAUAGCTsT 24% 2%
ND10452
623 UAUCGCGACAGAACAAUUATsT 624 UAAUUGUUCUGUCGCGAUATsT 12% 1%
ND10453
625 UGCGGCUAAGUCUCUUUUUTsT 626 AAAAAGAGACUUAGCCGCATsT 46% 3%
ND10454
627 GGCGAUUAUGGCGACUGCATsT 628 UGCAGUCGCCAUAAUCGCCTsT 14% 0%
ND10455
629 AUGUCUAGCCCAUCAUCCUTsT 630 AGGAUGAUGGGCUAGACAUTsT 12% 2%
ID deDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1er cribado@ 50 nMen H441; MV SD
ND10456
631 CUACAGGUACCCGGAAAUUTsT 632 AAUUUCCGGGUACCUGUAGTsT 28% 2%
ND10457
633 CCGUCGAGCCCGUAGCGUGTsT 634 CACGCUACGGGCUCGACGGTsT 27% 3%
ND10458
635 CGCGACAGAACAAUUACACTsT 636 GUGUAAUUGUUCUGUCGCGTsT 39% 7%
ND10459
637 AGGUACCCGGAAAUUAAAGTsT 638 CUUUAAUUUCCGGGUACCUTsT 30% 3%
ND10460
639 CAUGCACGGGUUUCCUGCCTsT 640 GGCAGGAAACCCGUGCAUGTsT 95% 6%
ND10461
641 AGCUUGCGGGACAACAACCTsT 642 GGUUGUUGUCCCGCAAGCUTsT 94% 8%
ND10462
643 ACUGCGGCUAAGUCUCUUUTsT 644 AAAGAGACUUAGCCGCAGUTsT 13% 2%
ND10463
645 CAUCCCUUAGAACCCUGCUTsT 646 AGCAGGGUUCUAAGGGAUGTsT 18% 1%
ND10464
647 ACCCGGGUAAGUAAAGGCATsT 648 UGCCUUUACUUACCCGGGUTsT 41% 1%
ND10465
649 GAUUAUGGCGACUGCACCATsT 650 UGGUGCAGUCGCCAUAAUCTsT 23% 1%
ND10466
651 CUCGGACAAGCUCGUCUUCTsT 652 GAAGACGAGCUUGUCCGAGTsT 14% 2%
ND10467
653 GCGAUUAUGGCGACUGCACTsT 654 GUGCAGUCGCCAUAAUCGCTsT 24% 2%
ID deDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10468
655 AAUUACACCGUCAACAACATsT 656 UGUUGUUGACGGUGUAAUUTsT 12% 1%
ND10469
657 AACUGCCGUUGAUGUGUGGTsT 658 CCACACAUCAACGGCAGUUTsT 46% 3%
ND10470
659 AACUGCGGCUAAGUCUCUUTsT 660 AAGAGACUUAGCCGCAGUUTsT 14% 0%
ND10471
661 CCGCUGAUAACCAGGACAATsT 662 UUGUCCUGGUUAUCAGCGGTsT 12% 2%
ND10472
663 AAGGGUACACGCAGGCAUGTsT 664 CAUGCCUGCGUGUACCCUUTsT 28% 2%
ND10473
665 CCGGGUAAGUAAAGGCAGATsT 666 UCUGCCUUUACUUACCCGGTsT 27% 3%
ND10474
667 CCCAUACCAGGUCUCAUGGTsT 668 CCAUGAGACCUGGUAUGGGTsT 39% 7%
ND10475
669 AUUAUGGCGACUGCACCAATsT 670 UUGGUGCAGUCGCCAUAAUTsT 30% 3%
ND10476
671 AUGCACGGGUUUCCUGCCCTsT 672 GGGCAGGAAACCCGUGCAUTsT 95% 6%
ND10477
673 CUAGCCCUCCACAGUCCACTsT 674 GUGGACUGUGGAGGGCUAGTsT 43% 7%
ND10478
675 CAGGUACCCGGAAAUUAAATsT 676 UUUAAUUUCCGGGUACCUGTsT 11% 1%
ND10479
677 AAUACAGCUCCUUCACCACTsT 678 GUGGUGAAGGAGCUGUAUUTsT 30% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @ 50 nM en H441; MV SD
ND10480
679 CACGGGUUUCCUGCCCAGCTsT 680 GCUGGGCAGGAAACCCGUGTsT 19% 1%
ND10481
681 GGACUGAAUCUUGCCCGUUTsT 682 AACGGGCAAGAUUCAGUCCTsT 14% 2%
ND10482
683 CGUUUAUGUAUGCUCCAUGTsT 684 CAUGGAGCAUACAUAAACGTsT 15% 1%
ND10483
685 GGGUACUGCUACUAUAAGCTsT 686 GCUUAUAGUAGCAGUACCCTsT 11% 0%
ND10484
687 UCGGUGUUGUCUGUGGUGGTsT 688 CCACCACAGACAACACCGATsT 65% 5%
ND10485
689 AAACUGCCGUUGAUGUGUGTsT 690 CACACAUCAACGGCAGUUUTsT 73% 6%
ND10486
691 GCGAAACUUGGAGCUUUGATsT 692 UCAAAGCUCCAAGUUUCGCTsT 8% 1%
ND10487
693 GGCCCGUCGAGCCCGUAGCTsT 694 GCUACGGGCUCGACGGGCCTsT 26% 3%
ND10488
695 GCGACAGAACAAUUACACCTsT 696 GGUGUAAUUGUUCUGUCGCTsT 10% 2%
ND10489
697 GCGACGGCUUAAGCCAGCCTsT 698 GGCUGGCUUAAGCCGUCGCTsT 50% 1%
ND10490
699 GACCCGGGUAAGUAAAGGCTsT 700 GCCUUUACUUACCCGGGUCTsT 74% 1%
ND10491
701 UUGAUCAGUCCGCCUUCUCTsT 702 GAGAAGGCGGAGUGAUCAATsT 80% 7%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única delprimer cribado@ 50 nM enH441; MV SD
ND10492
703 UCUAGCCCUCCACAGUCCATsT 704 UGGACUGUGGAGGGCUAGATsT 69% 4%
ND10493
705 GUUUCACCAAGUGCCGGAATsT 706 UUCCGGCACUUGGUGAAACTsT 23% 3%
ND10494
707 CUCAACUCGGACAAGCUCGTsT 708 CGAGCUUGUCCGAGUUGAGTsT 45% 6%
ND10495
709 CAACUCGGACAAGCUCGUCTsT 710 GACGAGCUUGUCCGAGUUGTsT 23% 3%
ND10496
711 ACCCGGAAAUUAAAGAGGATsT 712 UCCUCUUUAAUUUCCGGGUTsT 13% 2%
ND10497
713 CCCGGAAAUUAAAGAGGAGTsT 714 CUCCUCUUUAAUUUCCGGGTsT 19% 1%
ND10498
715 CACCACUCUCGUGGCCGGCTsT 716 GCCGGCCACGAGAGUGGUGTsT 94% 11%
ND10499
717 CGUCGAGCCCGUAGCGUGGTsT 718 CCACGCUACGGGCUCGACGTsT 13% 1%
ND10500
719 GCUUGCGGGACAACAACCCTsT 720 GGGUUGUUGUCCCGCAAGCTsT 49% 2%
ND10501
721 GAAUCAACAACGGUCUGUCTsT 722 GACAGACCGUUGUUGAUUCTsT 18% 2%
ND10502
723 GGGCGAUUAUGGCGACUGCTsT 724 GCAGUCGCCAUAAUCGCCCTsT 8% 1%
ND10503
725 CGAUUAUGGCGACUGCACCTsT 726 GGUGCAGUCGCCAUAAUCGTsT 17% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10504
727 UCUGCUGGUUACUCACGAUTsT 728 AUCGUGAGUAACCAGCAGATsT 38% 4%
ND10505
729 CUAUCGCGACAGAACAAUUTsT 730 AAUUGUUCUGUCGCGAUAGTsT 9% 1%
ND10506
731 CAAUUACACCGUCAACAACTsT 732 GUUGUUGACGGUGUAAUUGTsT 11% 1%
ND10507
733 ACCGUCAACAACAAGAGAATsT 734 UUCUCUUGUUGUUGACGGUTsT 9% 1%
ND10508
735 CUCCUCGGUGUUGUCUGUGTsT 736 CACAGACAACACCGAGGAGTsT 78% 5%
ND10509
737 GGAGGUAGCCUCCACCCUGTsT 738 CAGGGUGGAGGCUACCUCCTsT 18% 1%
ND10510
739 GGAGAGGUUUCUCACACCATsT 740 UGGUGUGAGAAACCUCUCCTsT 13% 1%
ND10511
741 CUGCCGUUGAUGUGUGGAGTsT 742 CUCCACACAUCAACGGCAGTsT 19% 2%
ND10512
743 UGCCGUUGAUGUGUGGAGGTsT 744 CCUCCACACAUCAACGGCATsT 82% 4%
ND10513
745 AGAUGGGUAAGGGCUCAGGTsT 746 CCUGAGCCCUUACCCAUCUTsT 24% 1%
ND10514
747 AGAACAGUAGCUGAUGAAGTsT 748 CUUCAUCAGCUACUGUUCUTsT 15% 0%
ND10515
749 GCGGCUAAGUCUCUUUUUCTsT 750 GAAAAAGAGACUUAGCCGCTsT 13% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10516
751 CCUAAGAAACCGCUGAUAATsT 752 UUAUCAGCGGUUUCUUAGGTsT 6% 0%
ND10517
753 GAAACCGCUGAUAACCAGGTsT 754 CCUGGUUAUCAGCGGUUUCTsT 13% 0%
ND10518
755 AACCGCUGAUAACCAGGACTsT 756 GUCCUGGUUAUCAGCGGUUTsT 42% 2%
ND10519
757 ACCGCUGAUAACCAGGACATsT 758 UGUCCUGGUUAUCAGCGGUTsT 11% 1%
ND10520
759 CCAAGGGUACACGCAGGCATsT 760 UGCCUGCGUGUACCCUUGGTsT 19% 1%
ND10521
761 CAAGGGUACACGCAGGCAUTsT 762 AUGCCUGCGUGUACCCUUGTsT 12% 0%
ND10522
763 AGGGUACACGCAGGCAUGCTsT 764 GCAUGCCUGCGUGUACCCUTsT 23% 1%
ND10523
765 GUACACGCAGGCAUGCACGTsT 766 CGUGCAUGCCUGCGUGUACTsT 27% 1%
ND10524
767 AGGCAUGCACGGGUUUCCUTsT 768 AGGAAACCCGUGCAUGCCUTsT 14% 0%
ND10525
769 GGCAUGCACGGGUUUCCUGTsT 770 CAGGAAACCCGUGCAUGCCTsT 18% 3%
ND10526
771 ACGGGUUUCCUGCCCAGCGTsT 772 CGCUGGGCAGGAAACCCGUTsT 30% 1%
ND10527
773 GAGCAGACCCGGGUAAGUATsT 774 UACUUACCCGGGUCUGCUCTsT 24% 2%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10528
775 AGCAGACCCGGGUAAGUAATsT 776 UUACUUACCCGGGUCUGCUTsT 24% 2%
ND10529
777 GGGUAAGUAAAGGCAGACCTsT 778 GGUCUGCCUUUACUUACCCTsT 39% 3%
ND10530
779 AGCCUCAUACCCGUGCCCUTsT 780 AGGGCACGGGUAUGAGGCUTsT 82% 5%
ND10531
781 GUGAACGCUUCUGCCACAUTsT 782 AUGUGGCAGAAGCGUUCACTsT 13% 1%
ND10532
783 AAAUUGAUCACUCCGCCUUTsT 784 AAGGCGGAGUGAUCAAUUUTsT 18% 2%
ND10533
785 AAUUGAUCACUCCGCCUUCTsT 786 GAAGGCGGAGUGAUCAAUUTsT 19% 0%
ND10534
787 GCCUUGCGGUCAGGGACUGTsT 788 CAGUCCCUGACCGCAAGGCTsT 12% 1%
ND10535
789 CUUGCGGUCAGGGACUGAATsT 790 UUCAGUCCCUGACCGCAAGTsT 11% 0%
ND10536
791 UUGCGGUCAGGGACUGAAUTsT 792 AUUCAGUCCCUGACCGCAATsT 12% 0%
ND10537
793 AUGUAUGCUCCAUGUCUAGTsT 794 CUAGACAUGGAGCAUACAUTsT 21% 1%
ND10538
795 AGCAAGUAGGCAGGAGCUCTsT 796 GAGCUCCUGCCUACUUGCUTsT 19% 1%
ND10539
797 CAGCCCAUACCAGGUCUCATsT 798 UGAGACCUGGUAUGGGCUGTsT 27% 2%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10540
799 CAGCCGUCGCGACCUGCGGTsT 800 CCGCAGGUCGCGACGGCUGTsT 44% 4%
ND10541
801 GGGCCCGUCGAGCCCGUAGTsT 802 CUACGGGCUCGACGGGCCCTsT 71% 6%
ND10542
803 CGUAGCGUGGCCUCCAGCUTsT 804 AGCUGGAGGCCACGCUACGTsT 84% 9%
ND10543
805 GGUGAGGGAGUGGUACCGCTsT 806 GCGGUACCACUCCCUCACCTsT 108% 8%
ND10544
807 AAAGUACACACAGCAGGUGTsT 808 CACCUGCUGUGUGUACUUUTsT 140% 7%
ND10545
809 CCAGGUUGACUUCUCCUCATsT 810 UGAGGAGAAGUCAACCUGGTsT 18% 2%
ND10546
811 UGUUUCACCAAGUGCCGGATsT 812 UCCGGCACUUGGUGAAACATsT 31% 2%
ND10547
813 UGCUGGUUACUCACGAUGGTsT 814 CCAUCGUGAGUAACCAGCATsT 144% 10%
ND10548
815 UCCUCGGUGUUGUCUGUGGTsT 816 CCACAGACAACACCGAGGATsT 106% 14%
ND10549
817 AGGUAGCCUCCACCCUGGCTsT 818 GCCAGGGUGGAGGCUACCUTsT 74% 15%
ND10550
819 GCCGUUGAUGUGUGGAGGGTsT 820 CCCUCCACACAUCAACGGCTsT 26% 4%
ND10551
821 GAUGGGUAAGGGCUCAGGATsT 822 UCCUGAGCCCUUACCCAUCTsT 22% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10552
823 CCCAACUGCGGCUAAGUCUTsT 824 AGACUUAGCCGCAGUUGGGTsT 18% 2%
ND10553
825 CCAAGCGAAACUUGGAGCUTsT 826 AGCUCCAAGUUUCGCUUGGTsT 16% 1%
ND10554
827 GGGUACACGCAGGCAUGCATsT 828 UGCAUGCCUGCGUGUACCCTsT 19% 2%
ND10555
829 UGCACGGGUUUCCUGCCCATsT 830 UGGGCAGGAAACCCGUGCATsT 28% 2%
ND10556
831 CUCCUCUAGCCUCAUACCCTsT 832 GGGUAUGAGGCUAGAGGAGTsT 109% 8%
ND10557
833 UCCUCUAGCCUCAUACCCGTsT 834 CGGGUAUGAGGCUAGAGGATsT 117% 7%
ND10558
835 UCUAGCCUCAUACCCGUGCTsT 836 GCACGGGUAUGAGGCUAGATsT 128% 9%
ND10559
837 UUCAUACCUCUACAUGUCUTsT 838 AGACAUGUAGAGGUAUGAATsT 52% 4%
ND10560
839 UCUACAUGUCUGCUUGAGATsT 840 UCUCAAGCAGACAUGUAGATsT 15% 2%
ND10561
841 AUAUUUCCUCAGCCUGAAATsT 842 UUUCAGGCUGAGGAAAUAUTsT 15% 2%
ND10562
843 AACUCCUAUGCAUCCCUUATsT 844 UAAGGGAUGCAUAGGAGUUTsT 14% 1%
ND10563
845 GCAUCCCUUAGAACCCUGCTsT 846 GCAGGGUUCUAAGGGAUGCTsT 20% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10564
847 UGAUCACUCCGCCUUCUCCTsT 848 GGAGAAGGCGGAGUGAUCATsT 67% 7%
ND10565
849 UGUAAGUGCCUUGCGGUCATsT 850 UGACCGCAAGGCACUUACATsT 17% 2%
ND10566
851 CCUUGCGGUCAGGGACUGATsT 852 UCAGUCCCUGACCGCAAGGTsT 14% 1%
ND10567
853 AAUCUUGCCCGUUUAUGUATsT 854 UACAUAAACGGGCAAGAUUTsT 13% 2%
ND10568
855 CCGUUUAUGUAUGCUCCAUTsT 856 AUGGAGCAUACAUAAACGGTsT 19% 6%
ND10569
857 UGUAUGCUCCAUGUCUAGCTsT 858 GCUAGACAUGGAGCAUACATsT 87% 13%
ND10570
859 CAUGUCUAGCCCAUCAUCCTsT 860 GGAUGAUGGGCUAGACAUGTsT 33% 4%
ND10571
861 AGUAGGCAGGAGCUCAAUATsT 862 UAUUGAGCUCCUGCCUACUTsT 11% 1%
ND10572
863 CCUACAGGUACCCGGAAAUTsT 864 AUUUCCGGGUACCUGUAGGTsT 22% 3%
ND10573
865 CCCGUCGAGCCCGUAGCGUTsT 866 ACGCUACGGGCUCGACGGGTsT 23% 1%
ND10574
867 GCGGUGAGGGAGUGGUACCTsT 868 GGUACCACUCCCUCACCGCTsT 30% 1%
ND10575
869 UUAUGGCGACUGCACCAAGTsT 870 CUUGGUGCAGUCGCCAUAATsT 77% 6%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis únicadel 1ercribado @ 50 nM en H441; MV SD
ND10576
871 CUAUAAGCUCCAGGUUGACTsT 872 GUCAACCUGGAGCUUAUAGTsT 11% 1%
ND10577
873 UAUAAGCUCCAGGUUGACUTsT 874 AGUCAACCUGGAGCUUAUATsT 42% 8%
ND10578
875 AGGUUGACUUCUCCUCAGATsT 876 UCUGAGGAGAAGUCAACCUTsT 13% 3%
ND10579
877 CUGGGCUGUUUCACCAAGUTsT 878 ACUUGGUGAAACAGCCCAGTsT 19% 6%
ND10580
879 AACAAUUACACCGUCAACATsT 880 UGUUGACGGUGUAAUUGUUTsT 13% 1%
ND10581
881 UGGGUAAGGGCUCAGGAAGTsT 882 CUUCCUGAGCCCUUACCCATsT 20% 3%
ND10582
883 GGGUAAGGGCUCAGGAAGUTsT 884 ACUUCCUGAGCCCUUACCCTsT 22% 3%
ND10583
885 CACCCAACUGCGGCUAAGUTsT 886 ACUUAGCCGCAGUUGGGUGTsT 22% 10%
ND10584
887 ACCCAACUGCGGCUAAGUCTsT 888 GACUUAGCCGCAGUUGGGUTsT 22% 5%
ND10585
889 CCAACUGCGGCUAAGUCUCTsT 890 GAGACUUAGCCGCAGUUGGTsT 14% 2%
ND10586
891 CUUGGAUCAGCCAAGCGAATsT 892 UUCGCUUGGCUGAUCCAAGTsT 15% 1%
ND10587
893 GCCAAGCGAAACUUGGAGCTsT 894 GCUCCAAGUUUCGCUUGGCTsT 17% 2%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM en H441; MV SD
ND10588
895 UCCUAAGAAACCGCUGAUATsT 896 UAUCAGCGGUUUCUUAGGATsT 11% 2%
ND10589
897 GCAUGCACGGGUUUCCUGCTsT 898 GCAGGAAACCCGUGCAUGCTsT 24% 8%
ND10590
899 UGUUACUUAGGCAAUUCCCTsT 900 GGGAAUUGCCUAAGUAACATsT 48% 10%
ND10591
901 CUAGGGCUAGAGCAGACCCTsT 902 GGGUCUGCUCUAGCCCUAGTsT 58% 10%
ND10592
903 CUCUAGCCUCAUACCCGUGTsT 904 CACGGGUAUGAGGCUAGAGTsT 34% 5%
ND10593
905 UUAGAACCCUGCUCAGACATsT 906 UGUCUGAGCAGGGUUCUAATsT 14% 1%
ND10594
907 UGUGAACGCUUCUGCCACATsT 908 UGUGGCAGAAGCGUUCACATsT 15% 0%
ND10595
909 AUUGAUCACUCCGCCUUCUTsT 910 AGAAGGCGGAGUGAUCAAUTsT 43% 1%
ND10596
911 UCACUCCGCCUUCUCCUGGTsT 912 CCAGGAGAAGGCGGAGUGATsT 90% 5%
ND10597
913 GCGGUCAGGGACUGAAUCUTsT 914 AGAUUCAGUCCCUGACCGCTsT 11% 0%
ND10598
915 GGUCAGGGACUGAAUCUUGTsT 916 CAAGAUUCAGUCCCUGACCTsT 13% 1%
ND10599
917 GUAUGCUCCAUGUCUAGCCTsT 918 GGCUAGACAUGGAGCAUACTsT 28% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10600
919 CCAUGUCUAGCCCAUCAUCTsT 920 GAUGAUGGGCUAGACAUGGTsT 12% 1%
ND10601
921 GAUCGAGUUCCACCGCUCCTsT 922 GGAGCGGUGGAACUCGAUCTsT 17% 1%
ND10602
923 GGACUCUAGCCCUCCACAGTsT 924 CUGUGGAGGGCUAGAGUCCTsT 41% 4%
ND10603
925 UCACCACUCUCGUGGCCGGTsT 926 CCGGCCACGAGAGUGGUGATsT 83% 3%
ND10604
927 CAGCUUGCGGGACAACAACTsT 928 GUUGUUGUCCCGCAAGCUGTsT 21% 1%
ND10605
929 CAUCUUCUAUCCGCGGCCCTsT 930 GGGCCGCGGAUAGAAGAUGTsT 26% 2%
ND10606
931 AUAAGCUCCAGGUUGACUUTsT 932 AAGUCAACCUGGAGCUUAUTsT 15% 1%
ND10607
933 CUGCUGGUUACUCACGAUGTsT 934 CAUCGUGAGUAACCAGCAGTsT 85% 8%
ND10608
935 GAACAAUUACACCGUCAACTsT 936 GUUGACGGUGUAAUUGUUCTsT 13% 1%
ND10609
937 AUUACACCGUCAACAACAATsT 938 UUGUUGUUGACGGUGUAAUTsT 12% 0%
ND10610
939 CUGUGGUUCGGCUCCUCGGTsT 940 CCGAGGAGCCGAACCACAGTsT 53% 2%
ND10611
941 GAAGUGCCUUGGCUCCAGCTsT 942 GCUGGAGCCAAGGCACUUCTsT 24% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM en H441; MV SD
ND10612
943 GAUCAGCCAAGCGAAACUUTsT 944 AAGUUUCGCUUGGCUGAUCTsT 12% 0%
ND10613
945 AGAAACCGCUGAUAACCAGTsT 946 CUGGUUAUCAGCGGUUUCUTsT 12% 1%
ND10614
947 UGAUAACCAGGACAAAACATsT 948 UGUUUUGUCCUGGUUAUCATsT 7% 1%
ND10615
949 CACGCAGGCAUGCACGGGUTsT 950 ACCCGUGCAUGCCUGCGUGTsT 12% 0%
ND10616
951 GCUCUCCAGUAGCACAGAUTsT 952 AUCUGUGCUACUGGAGAGCTsT 9% 1%
ND10617
953 CAGACCCGGGUAAGUAAAGTsT 954 CUUUACUUACCCGGGUCUGTsT 55% 3%
ND10618
955 AGACCCGGGUAAGUAAAGGTsT 956 CCUUUACUUACCCGGGUCUTsT 72% 8%
ND10619
957 AUCACUCCGCCUUCUCCUGTsT 958 CAGGAGAAGGCGGAGUGAUTsT 63% 6%
ND10620
959 CACUCCGCCUUCUCCUGGGTsT 960 CCCAGGAGAAGGCGGAGUGTsT 28% 1%
ND10621
961 AACUAGACUGUAAGUGCCUTsT 962 AGGCACUUACAGUCUAGUUTsT 23% 1%
ND10622
963 UAUGCUCCAUGUCUAGCCCTsT 964 GGGCUAGACAUGGAGCAUATsT 98% 2%
ND10623
965 CCCGAUGUAUGGAAACUGCTsT 966 GCAGUUUCCAUACAUCGGGTsT 11% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM en H441; MV SD
ND10624
967 GUACUGCUACUAUAAGCUCTsT 968 GAGCUUAUAGUAGCAGUACTsT 19% 1%
ND10625
969 AGCGUGACCAGCUACCAGCTsT 970 GCUGGUAGCUGGUCACGCUTsT 49% 2%
ND10626
971 ACAAUUACACCGUCAACAATsT 972 UUGUUGACGGUGUAAUUGUTsT 8% 0%
ND10627
973 AUGCUCCUCUGGUGGGAGGTsT 974 CCUCCCACCAGAGGAGCAUTsT 76% 5%
ND10628
975 AACAGUAGCUGAUGAAGCUTsT 976 AGCUUCAUCAGCUACUGUUTsT 22% 1%
ND10629
977 CUGACUCCCGAGGGCUAGGTsT 978 CCUAGCCCUCGGGAGUCAGTsT 34% 2%
ND10630
979 GUGCAACCAGAACAAAUCGTsT 980 CGAUUUGUUCUGGUUGCACTsT 10% 1%
ND10631
981 UGCAACCAGAACAAAUCGGTsT 982 CCGAUUUGUUCUGGUUGCATsT 48% 4%
ND10632
983 CUUCAAAGUACACACAGCATsT 984 UGCUGUGUGUACUUUGAAGTsT 20% 1%
ND10633
985 CAGCGUGACCAGCUACCAGTsT 986 CUGGUAGCUGGUCACGCUGTsT 35% 1%
ND10634
987 AGAACAAUUACACCGUCAATsT 988 UUGACGGUGUAAUUGUUCUTsT 14% 0%
ND10635
989 GAUAACCAGGACAAAACACTsT 990 GUGUUUUGUCCUGGUUAUCTsT 11% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10636
991 ACAACCAAGGGUACACGCATsT 992 UGCGUGUACCCUUGGUUGUTsT 17% 1%
ND10637
993 CCCAGCGACGGCUUAAGCCTsT 994 GGCUUAAGCCGUCGCUGGGTsT 27% 2%
ND10638
995 CUCCCGAGGGCUAGGGCUATsT 996 UAGCCCUAGCCCUCGGGAGTsT 23% 1%
ND10639
997 UAGAACCCUGCUCAGACACTsT 998 GUGUCUGAGCAGGGUUCUATsT 35% 2%
ND10640
999 CCUGGGCUGUUUCACCAAGTsT 1000 CUUGGUGAAACAGCCCAGGTsT 14% 1%
ND10641
1001 GGAUCAGCCAAGCGAAACUTsT 1002 AGUUUCGCUUGGCUGAUCCTsT 16% 3%
ND10642
1003 AAGAAACCGCUGAUAACCATsT 1004 UGGUUAUCAGCGGUUUCUUTsT 17% 1%
ND10643
1005 ACCAAGGGUACACGCAGGCTsT 1006 GCCUGCGUGUACCCUUGGUTsT 37% 4%
ND10644
1007 GUAGCACAGAUGUCUGCUCTsT 1008 GAGCAGACAUCUGUGCUACTsT 13% 3%
ND10645
1009 UUUCAUACCUCUACAUGUCTsT 1010 GACAUGUAGAGGUAUGAAATsT 88% 8%
ND10646
1011 CCAACCAUCUGCCAGAGAATsT 1012 UUCUCUGGCAGAUGGUUGGTsT 16% 2%
ND10647
1013 GUCAGGGACUGAAUCUUGCTsT 1014 GCAAGAUUCAGUCCCUGACTsT 16% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10648
1015 AGCAUGAUCAAGGAGUGUGTsT 1016 CACACUCCUUGAUCAUGCUTsT 50% 7%
ND10649
1017 GCAGCGUGACCAGCUACCATsT 1018 UGGUAGCUGGUCACGCUGCTsT 40% 6%
ND10650
1019 CAGCUCUCUGCUGGUUACUTsT 1020 AGUAACCAGCAGAGAGCUGTsT 56% 5%
ND10651
1021 GUUCGGCUCCUCGGUGUUGTsT 1022 CAACACCGAGGAGCCGAACTsT 68% 5%
ND10652
1023 GCAGAUGCUCCUCUGGUGGTsT 1024 CCACCAGAGGAGCAUCUGCTsT 26% 5%
ND10653
1025 AGGAAGUUGCUCCAAGAACTsT 1026 GUUCUUGGAGCAACUUCCUTsT 18% 2%
ND10654
1027 AACGCUUCUGCCACAUCUUTsT 1028 AAGAUGUGGCAGAAGCGUUTsT 18% 1%
ND10655
1029 CACCUGGGCUGUUUCACCATsT 1030 UGGUGAAACAGCCCAGGUGTsT 17% 2%
ND10656
1031 AAGCCAUGCAGCGUGACCATsT 1032 UGGUCACGCUGCAUGGCUUTsT 27% 3%
ND10657
1033 CGAGGGCUAGGGCUAGAGCTsT 1034 GCUCUAGCCCUAGCCCUCGTsT 30% 1%
ND10658
1035 GGAAACCCUGGACAGACUUTsT 1036 AAGUCUGUCCAGGGUUUCCTsT 14% 1%
ND10659
1037 GUAGCUGAUGAAGCUGCCCTsT 1038 GGGCAGCUUCAUCAGCUACTsT 19% 1%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1er cribado @50 nM enH441; MV SD
ND10660
1039 UCUUUUUCCCUUGGAUCAGTsT 1040 CUGAUCCAAGGGAAAAAGATsT 88% 4%
ND10661
1041 CUCCAGUAGCACAGAUGUCTsT 1042 GACAUCUGUGCUACUGGAGTsT 10% 1%
ND10662
1043 CCAAAAUUGAUCACUCCGCTsT 1044 GCGGAGUGAUCAAUUUUGGTsT 25% 3%
ND10663
1045 CAGACCACCUGGGCUGUUUTsT 1046 AAACAGCCCAGGUGGUCUGTsT 24% 2%
ND10664
1047 CCCUUCCCAACUAGACUGUTsT 1048 ACAGUCUAGUUGGGAAGGGTsT 15% 2%
ND10665
1049 CGCAGCCGUCGCGACCUGCTsT 1050 GCAGGUCGCGACGGCUGCGTsT 45% 2%
ND10666
1051 UUCUCACACCAAGGCAGAUTsT 1052 AUCUGCCUUGGUGUGAGAATsT 25% 2%
ND10667
1053 CACCACCAUCCACGGCGCCTsT 1054 GGCGCCGUGGAUGGUGGUGTsT 35% 3%
ND10668
1055 CCAUUACUUUUGUGAACGCTsT 1056 GCGUUCACAAAAGUAAUGGTsT 19% 4%
ND10669
1057 CCAAGAACAGUAGCUGAUGTsT 1058 CAUCAGCUACUGUUCUUGGTsT 23% 4%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1er cribado@50 nM en H441; MV SD Dosis única del2do cribado @ 50 nM en H441; MV SD
ND10670
1059 AGGAGAGGUUUCUCACACCTsT 1060 GGUGUGAGAAACCUCUCCUTsT 18% 3% 17% 1%
ND10671
1061 AUCAUCCUGCUUGGAGCAATsT 1062 UUGCUCCAAGCAGGAUGAUTsT 33% 3% 24% 2%
ND10672
1063 GCAUCACAGAGCAGACGCUTsT 1064 AGCGUCUGCUCUGUGAUGCTsT 29% 2% 27% 4%
ND10673
1065 AGGAGGUAGCCUCCACCCUTsT 1066 AGGGUGGAGGCUACCUCCUTsT 63% 6% 61% 3%
ND10674
1067 ACAACCGCAUGAAGACGGCTsT 1068 GCCGUCUUCAUGCGGUUGUTsT 94% 2%
ND10675
1069 GCAUGAAGACGGCCUUCUGTsT 1070 CAGAAGGCCGUCUUCAUGCTsT 20% 2% 18% 1%
ND10676
1071 GUCACGAUGGUCACCCUCCTsT 1072 GGAGGGUGACCAUCGUGACTsT 66% 5% 60% 4%
ND10677
1073 CCCUGCUCAGACACCAUUATsT 1074 UAAUGGUGUCUGAGCAGGGTsT 15% 3% 18% 1%
ND10678
1075 UCACGAUGGUCACCCUCCUTsT 1076 AGGAGGGUGACCAUCGUGATsT 80% 6% 70% 4%
ND10679
1077 UCAACCUCAACUCGGACAATsT 1078 UUGUCCGAGUUGAGGUUGATsT 20% 3% 21% 1%
ND10680
1079 UGACCAGCUACCAGCUCUCTsT 1080 GAGAGCUGGUAGCUGGUCATsT 88% 22% 77% 5%
ND10681
1081 GAUGGCCCUCGGUGACAUCTsT 1082 GAUGUCACCGAGGGCCAUCTsT 88% 18% 60% 4%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1er cribado@50 nM en H441; MV SD Dosis única del2do cribado@50 nM en SD
ND10682
1083 GCUUUGACAAGGAACUUUCTsT 1084 GAAAGUUCCUUGUCAAAGCTsT 19% 7% 14% 2%
ND10683
1085 CGAUACUGGUCUCCAGGCCTsT 1086 GGCCUGGAGACCAGUAUCGTsT 27% 5% 27% 2%
ND10684
1087 UCUGGAUGUCUUCCAUGCCTsT 1088 GGCAUGGAAGACAUCCAGATsT 92% 13% 89% 3%
ND10685
1089 CAGGACCCUAGACCUCUGCTsT 1090 GCAGAGGUCUAGGGUCCUGTsT 58% 14% 50% 2%
ND10686
1091 GACCCUAGACCUCUGCAGCTsT 1092 GCUGCAGAGGUCUAGGGUCTsT 27% 2%
ND10687
1093 ACCCUAGACCUCUGCAGCCTsT 1094 GGCUGCAGAGGUCUAGGGUTsT 21% 1%
ND10688
1095 CAGCCCACGGCGGAGGAGGTsT 1096 CCUCCUCCGCCGUGGGCUGTsT 55% 4%
ND10689
1097 CUCUUCGAGUUCUUCUGCATsT 1098 UGCAGAAGAACUCGAAGAGTsT 13% 3%
ND10690
1099 UUGGCAUGAUGUACUGGCATsT 1100 UGCCAGUACAUCAUGCCAATsT 16% 2%
ND10691
1101 GGCAUGAUGUACUGGCAAUTsT 1102 AUUGCCAGUACAUCAUGCCTsT 13% 1%
ND10692
1103 UGUACUGGCAAUUCGGCCUTsT 1104 AGGCCGAAUUGCCAGUACATsT 45% 2%
ND10693
1105 ACUGGCAAUUCGGCCUGCUTsT 1106 AGCAGGCCGAAUUGCCAGUTsT 38% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10694
1107 GGCAAUUCGGCCUGCUUUUTsT 1108 AAAAGCAGGCCGAAUUGCCTsT 10% 1%
ND10695
1109 CAAUUCGGCCUGCUUUUCGTsT 1110 CGAAAAGCAGGCCGAAUUGTsT 12% 1%
ND10696
1111 UCGGAGAGUACUUCAGCUATsT 1112 UAGCUGAAGUACUCUCCGATsT 12% 1%
ND10697
1113 CAACAUCCUGUCGAGGCUGTsT 1114 CAGCCUCGACAGGAUGUUGTsT 35% 7%
ND10698
1115 CAUCCUGUCGAGGCUGCCATsT 1116 UGGCAGCCUCGACAGGAUGTsT 26% 6%
ND10699
1117 UGCUGCAACCAGGCGAAUUTsT 1118 AAUUCGCCUGGUUGCAGGATsT 28% 6%
ND10700
1119 GGAAACUGCUAUACUUUCATsT 1120 UGAAAGUAUAGCAGUUUCCTsT 7% 2%
ND10701
1121 ACGGUCUGUCCCUGAUGCUTsT 1122 AGCAUCAGGGACAGACCGUTsT 28% 7%
ND10702
1123 GGUCUGUCCCUGAUGCUGCTsT 1124 GCAGCAUCAGGGACAGACCTsT 33% 2%
ND10703
1125 GGCCCGGGUAAUGGUGCACTsT 1126 GUGCACCAUUACCCGGGCCTsT 47% 10%
ND10704
1127 CAGGAUGAACCUGCCUUUATsT 1128 UAAAGGCAGGUUCAUCCUGTsT 59% 2%
ND10705
1129 GAUGAACCUGCCUUUAUGGTsT 1130 CCAUAAAGGCAGGUUCAUCTsT 77% 7%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10706
1131 GGUGGCUUUAACUUGCGGCTsT 1132 GCCGCAAGUUAAAGCCACCTsT 47% 8%
ND10707
1133 GUGGCUUUAACUUGCGGCCTsT 1134 GGCCGCAAGUUAAAGCCACTsT 17% 2%
ND10708
1135 UUGCGGCCUGGCGUGGAGATsT 1136 UCUCCACGCCAGGCCGCAATsT 52% 3%
ND10709
1137 UGCGGCCUGGCGUGGAGACTsT 1138 GUCUCCACGCCAGGCCGCATsT 81% 4%
ND10710
1139 GCGGCCUGGCGUGGAGACCTsT 1140 GGUCUCCACGCCAGGCCGCTsT 57% 4%
ND10711
1141 CAGGUGUGUAUUCACUCCUTsT 1142 AGGAGUGAAUACACACCUGTsT 24% 2%
ND10712
1143 GUGUAUUCACUCCUGCUUCTsT 1144 GAAGCAGCtAGUGAAUACACTsT 20% 1%
ND10713
1145 GGCCCUCGGUGACAUCCCATsT 1146 UGGGAUGUCACCGAGGGCCTsT 40% 3%
ND10714
1147 GAUGCUAUCGCGACAGAACTsT 1148 GUUCUGUCGCGAUAGCAUCTsT 24% 2%
ND10715
1149 ACUACAAAACCAAUUCUGATsT 1150 UCAGAAUUGGUUUUGUAGUTsT 19% 2%
ND10716
1151 CAAUUCUGAGUCUCCCUCUTsT 1152 AGAGGGAGACUCAGAAUUGTsT 35% 3%
ND10717
1153 CUCUGUCACGAUGGUCACCTsT 1154 GGUGACCAUCGUGACAGAGTsT 41% 4%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10718
1155 CUGCUCCGAAGGUUCCGAATsT 1156 UUCGGAACCUUCGGAGCAGTsT 16% 3%
ND10719
1157 AGGUUCCGAAGCCGAUACUTsT 1158 AGUAUCGGCUUCGGAACCUTsT 16% 2%
ND10720
1159 GUUCCGAAGCCGAUACUGGTsT 1160 CCAGUAUCGGCUUCGGAACTsT 21% 2%
ND10721
1161 CGAAGCCGAUACUGGUCUCTsT 1162 GAGACCAGUAUCGGCUUCGTsT 16% 1%
ND10722
1163 AAGAUUGAAGGAUGUGCAGTsT 1164 CUGCACAUCCUUCAAUCUUTsT 25% 2%
ND10723
1165 GAUUGAAGGAUGUGCAGGGTsT 1166 CCCUGCACAUCCUUCAAUCTsT 26% 1%
ND10724
1167 UGCCUCUGAACACUCUGGUTsT 1168 ACCAGAGUGUUCAGAGGCATsT 45% 3%
ND10725
1169 CCUCUGAACACUCUGGUUUTsT 1170 AAACCAGAGUGUUCAGAGGTsT 15% 2%
ND10726
1171 GACAAGGAACUUUCCUAAGTsT 1172 CUUAGGAAAGUUCCUUGUCTsT 105% 14%
ND10727
1173 CAGGACAAAACACAACCAATsT 1174 UUGGUUGUGUUUUGUCCUGTsT 32% 5%
ND10728
1175 AACACAACCAAGGGUACACTsT 1176 GUGUACCCUUGGUUGUGUUTsT 60% 13%
ND10729
1177 UUGAACUUGGGUGGGAAACTsT 1178 GUUUCCCACCCAAGUUCAATsT 23% 8%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM inH441; MV SD
ND10730
1179 UGAACUUGGGUGGGAAACCTsT 1180 GGUUUCCCACCCAAGUUCATsT 18% 4%
ND10731
1181 ACCCGUGCCCUCACAGAGCTsT 1182 GCUCUGUGAGGGCACGGGUTsT 19% 1%
ND10732
1183 ACUAUAACAUCUGCUGGAGTsT 1184 CUCCAGCAGAUGUUAUAGUTsT 17% 5%
ND10733
1185 AUCUGCUGGAGUGUUGCUGTsT 1186 CAGCAACACUCCAGCAGAUTsT 119% 20%
ND10734
1187 CUGCUGGAGUGUUGCUGUUTsT 1188 AACAGCAACACUCCAGCAGTsT 58% 13%
ND10735
1189 CUAGCCCAUCAUCCUGCUUTsT 1190 AAGCAGGAUGAUGGGCUAGTsT 20% 6%
ND10736
1191 CUCUGGAUGUCUUCCAUGCTsT 1192 GCAUGGAAGACAUCCAGAGTsT 28% 8%
ND10737
1193 AGCAGGACCCUAGACCUCUTsT 1194 AGAGGUCUAGGGUCCUGCUTsT 36% 2%
ND10738
1195 UUCGAGUUCUUCUGCAACATsT 1196 UGUUGCAGAAGAACUCGAATsT 13% 1%
ND10739
1197 CACCAUCCACGGCGCCAUCTsT 1198 GAUGGCGCCGUGGAUGGUGTsT 13% 2%
ND10740
1199 CCACGGCGCCAUCCGCCUGTsT 1200 CAGGCGGAUGGCGCCGUGGTsT 44% 4%
ND10741
1201 CAGCACAACCGCAUGAAGATsT 1202 UCUUCAUGCGGUUGUGCUGTsT 23% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nMen H441; MV SD
ND10742
1203 CCUUUGGCAUGAUGUACUGTsT 1204 CAGUACAUCAUGCCAAAGGTsT 12% 1%
ND10743
1205 AUCCUGUCGAGGCUGCCAGTsT 1206 CUGGCAGCCUCGACAGGAUTsT 14% 3%
ND10744
1207 UCUCCUGCAACCAGGCGAATsT 1208 UUCGCCUGGUUGCAGGAGATsT 12% 1%
ND10745
1209 UGCAACCAGGCGAAUUACUTsT 1210 AGUAAUUCGCCUGGUUGCATsT 45% 5%
ND10746
1211 ACCUCCAUCAGCAUGAGGATsT 1212 UCCUCAUGCUGAUGGAGGUTsT 82% 7%
ND10747
1213 GCGACUGCACCAAGAAUGGTsT 1214 CCAUUCUUGGUGCAGUCGCTsT 82% 19%
ND10748
1215 ACCAAGAAUGGCAGUGAUGTsT 1216 CAUCACUGCCAUUCUUGGUTsT 54% 18%
ND10749
1217 UGGUUACUCACGAUGGCCCTsT 1218 GGGCCAUCGUGAGUAACCATsT 45% 7%
ND10750
1219 AGAAAUGGAGUGGCCAAAGTsT 1220 CUUUGGCCACUCCAUUUCUTsT 11% 3%
ND10751
1221 GGAGCUGAACUACAAAACCTsT 1222 GGUUUUGUAGUUCAGCUCCTsT 15% 3%
ND10752
1223 CCUCUGUCACGAUGGUCACTsT 1224 GUGACCAUCGUGACAGAGGTsT 18% 5%
ND10753
1225 AGAUUGAAGGAUGUGCAGGTsT 1226 CCUGCACAUCCUUCAAUCUTsT 26% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10754
1227 GAGCUUUGACAAGGAACUUTsT 1228 AAGUUCCUUGUCAAAGCUCTsT 14% 2%
ND10755
1229 CUUUGACAAGGAACUUUCCTsT 1230 GGAAAGUUCCUUGUCAAAGTsT 50% 8%
ND10756
1231 UCAGACACCAUUACUUUUGTsT 1232 CAAAAGUAAUGGUGUCUGATsT 32% 4%
ND10757
1233 AGCACACUAUAACAUCUGCTsT 1234 GCAGAUGUUAUAGUGUGCUTsT 11% 2%
ND10758
1235 GCACAACCGCAUGAAGACGTsT 1236 CGUCUUCAUGCGGUUGUGCTsT 34% 3%
ND10759
1237 ACUGCUUCUACCAGACAUATsT 1238 UAUGUCUGGUAGAAGCAGUTsT 11% 1%
ND10760
1239 GAAGACGGCCUUCUGGGCATsT 1240 UGCCCAGAAGGCCGUCUUCTsT 16% 2%
ND10761
1241 AAGACGGCCUUCUGGGCAGTsT 1242 CUGCCCAGAAGGCCGUCUUTsT 58% 21%
ND10762
1243 ACAUCAACCUCAACUCGGATsT 1244 UCCGAGUUGAGGUUGAUGUTsT 14% 3%
ND10763
1245 UGGAAGGACUGGAAGAUCGTsT 1246 CGAUCUUCCAGUCCUUCCATsT 109% 29%
ND10764
1247 ACAUCCUGUCGAGGCUGCCTsT 1248 GGCAGCCUCGACAGGAUGUTsT 101% 13%
ND10765
1249 CAACCAGGCGAAUUACUCUTsT 1250 AGAGUAAUUCGCCUGGUUGTsT 19% 5%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @50 nM enH441; MV SD
ND10766
1251 CAGGCGAAUUACUCUCACUTsT 1252 AGUGAGAGUAAUUCGCCUGTsT 24% 4%
ND10767
1253 AGCAGAAUGACUUCAUUCCTsT 1254 GGAAUGAAGUCAUUCUGCUTsT 40% 8%
ND10768
1255 AUGAUGGUGGCUUUAACUUTsT 1256 AAGUUAAAGCCACCAUCAUTsT 85% 8%
ND10769
1257 AGAACCUUUACCCUUCAAATsT 1258 UUUGAAGGGUAAAGGUUCUTsT 22% 4%
ND10770
1259 CCUUUACCCUUCAAAGUACTsT 1260 GUACUUUGAAGGGUAAAGGTsT 21% 4%
ND10771
1261 GAGCCUGUGGUUCGGCUCCTsT 1262 GGAGCCGAACCACAGGCUCTsT 28% 1%
ND10772
1263 UGGUACUGCCUCUGAACACTsT 1264 GUGUUCAGAGGCAGUACCATsT 58% 4%
ND10773
1265 CUCAUACCCGUGCCCUCACTsT 1266 GUGAGGGCACGGGUAUGAGTsT 15% 2%
ND10774
1267 CCGUAGCACACUAUAACAUTsT 1268 AUGUUAUAGUGUGCUACGGTsT 24% 6%
ND10775
1269 CGUAGCACACUAUAACAUCTsT 1270 GAUGUUAUAGUGUGCUACGTsT 21% 4%
ND10776
1271 GCAGGACCCUAGACCUCUGTsT 1272 CAGAGGUCUAGGGUCCUGCTsT 25% 4%
ND10777
1273 GCCUGCUUUUCGGAGAGUATsT 1274 UACUCUCCGAAAAGCAGGCTsT 18% 4%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nMen H441; MV SD
ND10778
1275 GGGCCCGGGUAAUGGUGCATsT 1276 UGCACCAUUACCCGGGCCCTsT 16% 2%
ND10779
1277 CAACAACAAGAGAAAUGGATsT 1278 UCCAUUUCUCUUGUUGUUGTsT 17% 0%
ND10780
1279 GCUGUUGCACCAUACUUUCTsT 1280 GAAAGUAUGGUGCAACAGCTsT 14% 1%
ND10781
1281 CUACCGAGAGCUCUUCGAGTsT 1282 CUCGAAGAGCUCUCGGUAGTsT 24% 3%
ND10782
1283 ACCUGCCUUUAUGGAUGAUTsT 1284 AUCAUCCAUAAAGGCAGGUTsT 115% 10%
ND10783
1285 UUGACAAGGAACUUUCCUATsT 1286 UAGGAAAGUUCCUUGUCAATsT 16% 1%
ND10784
1287 GCUGGAGUGUUGCUGUUGCTsT 1288 GCAACAGCAACACUCCAGCTsT 12% 1%
ND10785
1289 UCGGUGACAUCCCAGGAAUTsT 1290 AUUCCUGGGAUGUCACCGATsT 28% 1%
ND10786
1291 GCUGCCCAGAAGUGCCUUGTsT 1292 CAAGGCACUUCUGGGCAGCTsT 15% 2%
ND10787
1293 AGUACACACAGCAGGUGUGTsT 1294 CACACCUGCUGUGUGUACUTsT 12% 1%
ND10788
1295 CAAGUGCCGGAAGCCAUGCTsT 1296 GCAUGGCUUCCGGCACUUGTsT 94% 2%
Tabla 1C: Los ARNi corto seleccionados en el conjunto sustituto in vivo (ARNi corto de reactividad cruzada de humano-rata con la más alta especificidad en rata). Se identificó un conjunto de cribado de 48 secuencias de alfa-ENaC por medio de ARNi de reactividad cruzada de humano y rata. Se muestra el porcentaje de expresión residual de alfa-ENaC en dos experimentos de transfección independientes de una sola dosis (remítase a la sección de ejemplos para ver los métodos empleados).
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribado@ 50 nM en H441 SD
ND-9201
1297 uGuGcAAccAGAAcAAAucTsT 1298 GAUUUGUUCUGGUUGcAcATsT 8% 1% 8% 1%
ND-9202
1299 uuuAuGGAuGAuGGuGGcuTsT 1300 AGCcACcAUcAUCcAuAAATsT 80% 9% 82% 6%
ND-9203
1301 GccuuuAUGGAUGAuGGuGTsT 1302 CACcAUcAUCcAuAAAGGCTsT 76% 8% 76% 2%
ND-9204
1303 cACAAccGcAuGAAGAcGGTsT 1304 CCGUCUUcAUGCGGUUGUGTsT 73% 18% 57% 3%
ND-9205
1305 AccGcAuGAAGAcGGccuuTsT 1306 AAGGCCGUCUUcAUGCGGUTsT 35% 3% 37% 2%
ND-9206
1307 AGGAcuGGAAGAucGGcuuTsT 1308 AAGCCGAUCUUCcAGUCCUTsT 17% 3% 16% 3%
ND-9207
1309 GAAGGAcuGGAAGAucGGcTsT 1310 GCCGAUCUUCcAGUCCUUCTsT 96% 18% 81% 5%
ND-9208
1311 GGAcuGGAAGAucGGcuucTsT 1312 GAAGCCGAUCUUCcAGUCCTsT 58% 6% 57% 3%
ND-9209
1313 AGuuccAccGcuccuAccGTsT 1314 CGGuAGGAGCGGUGGAACUTsT 85% 8% 94% 4%
ND-9210
1315 GAcuGGAAGAucGGcuuccTsT 1316 GGAAGCCGAUCUUCcAGUCTsT 79% 5% 82% 2%
ND-9211
1317 cGcAuGAAGAcGGccuucuTST 1318 AGAAGGCCGUCUUcAUGCGTsT 50% 1% 51% 1%
ND-9212
1319 GccAGuGGAGccuGuGGuuTsT 1320 AACcAcAGGCUCcACUGGCTsT 26% 3% 23% 2%
ND-9213
1321 uGccuuuAuGGAuGAuGGuTsT 1322 ACcAUcAUCcAuAAAGGcATsT 77% 5% 76% 4%
ND-9214
1323 uccuGuccAAccuGGGcAGTsT 1324 CUGCCcAGGUUGGAcAGGATsT 74% 9% 83% 6%
ND-9215
1325 AGGGAGuGGuAccGcuuccTsT 1326 GGAAGCGGuACcACUCCCUTsT 79% 6% 89% 4%
ND-9216
1327 GGcuGuGccuAcAucuucuTsT 1328 AGAAGAUGuAGGcAcAGCCTsT 11% 1% 13% 1%
ND-9217
1329 GAAAuuAAAGAGGAGcuGGTsT 1330 CcAGCUCCUCUUUAAUUUCTsT 84% 14% 78% 5%
ND-9218
1331 AcuGGAAGAucGGcuuccATsT 1332 UGGAAGCCGAUCUUCcAGUTsT 50% 4% 55% 3%
ND-9219
1333 ccuGuccAAccuGGGcAGcTsT 1334 GCUGCCcAGGUUGGAcAGGTsT 78% 6% 85% 5%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribado@ 50 nM en H441 SD
ND-9220
1335 ccuGccuuuAuGGAuGAuGTsT 1336 cAUcAUCcFuAAAGGcAGGTsT 76% 5% 77% 9%
ND-9221
1337 AAccGcAuGAAGAcGGccuTsT 1338 AGGCCGUCUUcAUGCGGUUTsT 79% 8% 66% 3%
ND-9222
1339 uGuccAAccuGGGcAGccATsT 1340 UGGCUGCCcAGGUUGGAcATsT 70% 4% 57% 4%
ND-9223
1341 GuccAAccuGGGcAGccAGTsT 1342 CUGGCUGCCcAGGUUGGACTsT 95% 10% 76% 4%
ND-9224
1343 AAAuuAAAGAGGAGcuGGATsT 1344 UCcAGCUCCUCUUuAAUUUTsT 83% 6% 69% 2%
ND-9225
1345 GGAAGGAcuGGAAGAucGGTsT 1346 CCGAUCUUCcAGUCCUUCCTsT 41% 2% 30% 2%
ND-9226
1347 GuGAGGGAGuGGuACCGcuTsT 1348 AGCGGuACcACUCCCUcACTsT 21% 1% 17% 0%
ND-9227
1349 AcuuucAAuGAcAAGAAcATsT 1350 UGUUCUUGUcAUUGAAAGUTsT 13% 1% 10% 0%
ND-9228
1351 ucAAuGAcAAGAAcAAcucTsT 1352 GAGUUGUUCUUGUcAUUGATsT 36% 2% 28% 0%
ND-9229
1353 cuuuAuGGAuGAuGGUGGcTsT 1354 GCcACcAUcAUCcAuAAAGTsT 24% 1% 20% 1%
ND-9230
1355 GccuGGcGuGGAGAccuccTsT 1356 GGAGGUCUCcACGCcAGGCTsT
ND-9231
1357 uGGcGuG-GAGAccuccAucTsT 1358 GAUGGAGGUCUCcACGCcATsT 45% 4% 35% 2%
ND-9232
1359 GAGuuccAccGcuccuAccTsT 1360 GGuAGGAGCGGUGGAACUCTsT 89% 4% 86% 8%
ND-9233
1361 cAGAGcAGAAuGAcuucAuTsT 1362 AUGAAGUcAUUCUGCUCUGTsT 21% 1% 17% 0%
ND-9234
1363 uucAcuccuGcuuccAGCATsT 1364 UCCUGGAAGcAGGAGUGAATsT 85% 4% 74% 6%
ND-9235
1365 ucAcuccuGcuuccAGGAGTsT 1366 CUCCUGGAAGcAGGAGUGATsT
ND-9236
1367 cuGuGcAAccAGAACAAAuTsT 1368 AUUUGUUCUGGUUGcAcAGTsT 23% 1% 17% 2%
ND-9237
1369 cuGcAAcAAcAccAccAucTsT 1370 GAUGGUGGUGUUGUUGcAGTsT 34% 2% 27% 2%
ND-9238
1371 uGuGGcuGuGccuAcAucuTsT 1372 AGAUGuAGGcAcAGCCACATsT 86% 4 % 73% 10%
ND-9239
1373 uGGcuGuGccuAcAucuucTsT 1374 GAAGAUGuAGGcAcAGCcATsT 68% 6% 53% 4%
ND-9240
1375 cuGuccAAccuGGGcAGccTsT 1376 GGCUGCCcAGGUUGGAcAGTsT 80% 5% 73% 9%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1er cribado@ 50 nMen H441; MV SD 2do cribado@ 50 nM en H441 SD
ND-9241
1377 cccuGcuGuccAcAGuGAcTsT 1378 GUcACUGUGGAcAGcAGGGTsT 83% 5% 71% 5%
ND-9242
1379 GcAGccAGuGGAGccuGuGTsT 1380 cAcAGGCUCcACUGGCUGCTsT 105% 9% 90% 5%
ND-9243
1381 uucAAuGACAAGAAcAAcvTsT 1382 AGUUGUUCUUGUcAUUGAATsT 23% 3% 21% 1%
ND-9244
1383 cuGccuuuAuGGAuGAuGGTsT 1384 CcAUcAUCcAuAAAGGcAGTsT 74% 6% 64% 7%
ND-9245
1385 AAuGAcAAGAAcAAcuccATST 1386 UGGAGUUGUUCUUGUcAUUTsT 21% 1% 21% 1%
ND-9246
1387 uGGGcAGccAGuGGAGccuTsT 1388 AGGCUCcACUGGCUGCCcATsT 83% 3% 73% 2%
ND-9247
1389 cuccuGuccAAccuGGGcATsT 1390 UGCCcAGGUUGGAcAGGAGTsT 86% 3% 84% 1%
ND-9248
1391 GGcGuGGAGAccuccAucATsT 1392 UGAUGGAGGUCUCcACGCCTsT 92% 4% 88% 3%
Tabla 1D: Los ARNi corto seleccionados en el conjunto sustituto de cobayo in vivo (ARNi corto de reactividad cruzada de humano-cobayo). Se identificó un conjunto decribado de 63 secuencias de ARNi para alfa-ENaC de reactividad cruzada de humano y cobayo, y se sintetizaron, tanto con (cadenas de secuencias 1393 - 1518) como sin (cadenas de secuencias 1519 - 1644) modificación de la estructura base. Se muestra el porcentaje de expresión residual de alfa-ENaC en dos experimentos detransfección de una sola dosis independientes (referirse a la sección de ejemplos para ver los métodos empleados).
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado @ 50 nM enH441; MV SD 2do cribado@ 50 nMen H441 SD
ND8437
1393 AAucGGAcuGcuucuAccATsT 1394 UGGuAGAAGcAGUCCGAUUTsT 48% 7% 46% 5%
ND8438
1395 AucGGAcuGcuucuAccAGTsT 1396 CUGGuAGAAGCAGUCCGAUTsT 85% 5% 93% 13%
ND8439
1397 AAAucGGAcuGcuucuAccTsT 1398 GGuAGAAGcAGUCCGAUUUTsT 36% 3% 42% 6%
ND8440
1399 ucGGAcuGcuucuAccAGATsT 1400 UCUGGuAGAAGcAGUCCGATsT 45% 3% 50% 4%
ND8441
1401 AccAGAAcAAAucGGAcuGTsT 1402 cAGUCCGAUUUGUUCUGGUTsT 23% 3% 24% 6%
ND8442
1403 ccAGAAcAAAucGGAcuGcTsT 1404 GcAGUCCGAUUUGUUCUGGTsT 50% 6% 39% 9%
ND8443
1405 cAGAAcAAAucGGAcuGcuTsT 1406 AGcAGUCCGAUUUGUUCUGTsT 22% 2% 24% 1%
ND8444
1407 cuucGccuGccGcuucAAcTsT 1408 GUUGAAGCGGcAGGCGAAGTsT 111% 6% 109% 4%
ND8445
1409 uGGuAccGcuuccAcuAcATsT 1410 UGuAGUGGAAGCGGuACcATsT 84% 7% 97% 13%
ND8446
1411 AucuucGccuGccGcuucATsT 1412 UGAAGCGGcAGGCGAAGAUTsT 90% 3% 121% 13%
ND8447
1413 uucGccuGccGcuucAAccTsT 1414 GGUUGAAGCGGcAGGCGAATsT 92% 2% 105% 17%
ND8448
1415 cAcccucAAucccuAcAGGTsT 1416 CCUGuAGGGAUUGAGGGUGTsT 79% 3% 90% 13%
ND8449
1417 AGAAcAAAucGGAcuGcuuTsT 1418 AAGcAGUCCGAUUUGUUCUTsT 11% 0% 17% 3%
ND8450
1419 GAAcAAAucGGAcuGcuucTsT 1420 GAAGcAGUCCGAUUUGUUCTsT 21% 1% 30% 5%
ND8451
1421 cGGAcuGcuucuAccAGAcTsT 1422 GUCUGGuAGAAGcAGUCCGTsT 24% 2% 32% 5%
ND8452
1423 AGccucAAcAucAAccucATsT 1424 UGAGGUUGAUGUUGAGGCUTsT 51% 3% 57% 4%
ND8453
1425 GccucAAcAucAAccucAATsT 1426 UUGAGGUUGAUGUUGAGGCTsT 16% 1% 26% 3%
ND8454
1427 GucAGccucAAcAucAAccTsT 1428 GGUUGAUGUUGAGGCUGACTsT 62% 5% 68% 6%
ND8455
1429 ucAGccucAAcAucAAccuTsT 1430 AGGUUGAUGUUGAGGCUGATsT 77% 4% 87% 6%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribado@ 50 nM enH441 SD
ND8456
1431 cAGccucAAcAucAAccucTsT 1432 GAGGUUGAUGUUGAGGCUGTsT 34% 2% 51% 8%
ND8457
1433 GGAGcuGGAccGcAucAcATsT 1434 UGUGAUGCGGUCcAGCUCCTsT 26% 2% 17% 1%
ND8458
1435 GuAccGcuuccAcuAcAucTsT 1436 GAUGuAGUGCT AAGCGGuACTsT 101% 9% 99% 11%
ND8459
1437 ccGcuuccAcuAcAucAAcTsT 1438 GUUGAUGuAGUGGAAGCGGTsT 85% 8% 80% 6%
ND8460
1439 cGcuuccAcuAcAucAAcATsT 1440 UGUUGAUGuAGUGGAAGCGTsT 56% 6% 48% 3%
ND8461
1441 uuccAcuAcAucAAcAuccTsT 1442 GGAUGUUGAUGuAGUGGAATsT 77% 5% 82% 7%
ND8462
1443 uGGGcAAcuucAucuucGcTsT 1444 GCGAAGAUGAAGUUGCCcATsT 21% 0% 36% 6%
ND8463
1445 GcAAcuucAucuucGccuGTsT 1446 cAGGCGAAGAUGAAGUUGCTsT 80% 4% 84% 13%
ND8464
1447 cAAcuucAucuucGccuGcTsT 1448 GcAGGCGAAGAUGAAGUUGTsT 101% 1% 102% 14%
ND8465
1449 AAcuucAucuucGccuGccTsT 1450 GGcAGGCGAAGAUGAAGUUTsT 100% 4% 95% 12%
ND8466
1451 AcuucAucuucGccuGccGTsT 1452 CGGcAGGCGAAGAUGAAGUTsT 51% 4% 49% 5%
ND8467
1453 cuucAucuucGccuGccGcTsT 1454 GCGGcAGGCGAAGAUGAAGTsT 95% 5% 89% 4%
ND8468
1455 ucAucuucGccuGccGcuuTsT 1456 AAGGGGcAGGCGAAGAUGATsT 91% 4% 85% 6%
ND8469
1457 cAucuucGccuGccGcuucTsT 1458 GAAGCGGcAGGCGAAGAUGTsT 66% 4% 55% 4%
ND8470
1459 ucuucGccuGccGcuucAATsT 1460 UUGAAGCGGcAGGCGAAGATsT 97% 2% 99% 11%
ND8471
1461 cGccuGccGcuucAAccAGTsT 1462 CUGGUUGAAGCGGcAGGCGTsT 96% 4% 100% 7%
ND8472
1463 GccuGccGcuucAAccAGGTsT 1464 CCUGGUUGAAGCGGcAGGCTsT 90% 4% 82% 5%
ND8473
1465 AuuAcucucAcuuccAccATsT 1466 UGGUGGAAGUGAGAGuAAUTsT 81% 3% 72% 4%
ND8474
1467 uuAcucucAcuuccAccAcTsT 1468 GUGGUGGAAGUGAGAGuAATsT 72% 2% 76% 9%
ND8475
1469 AcucucAcuuccAccAcccTsT 1470 GGGUGGUGGAAGUGAGAGUTsT 90% 3% 97% 4%
ND8476
1471 ucuGcAcccucAAucccuATsT 1472 uAGGGAUUGAGGGUGcAGATsT 61% 1% 63% 3%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribado@ 50 nM enH441 SD
ND8477
1473 cuGcAcccucAAucccuAcTsT 1474 GuAGGGAUUGAGGGUGcAGTsT 74% 3% 73% 1%
ND8478
1475 uGcAcccucAAucccuAcATsT 1476 UGuAGGGAUUGAGGGUGcATsT 98% 4% 85% 1%
ND8479
1477 AcccucAAucccuAcAGGuTsT 1478 ACCUGuAGGGAUUGAGGGUTsT 55% 5% 48% 3%
ND8480
1479 cccucAAucccuAcAGGuATsT 1480 uACCUGuAGGGAUUGAGGGTsT 20% 1% 14% 1%
ND8481
1481 ccucAAucccuAcAGGuAcTsT 1482 GuACCUGuAGGGAUUGAGGTsT 40% 2% 31% 3%
ND8482
1483 AAccAGAAcAAAucGGAcuTsT 1484 AGUCCGAUUUGUUCUGGUUTsT 57% 2% 52% 0%
ND8483
1485 AAcAAAucGGAcuGcuucuTsT 1486 AGAAGcAGUCCGAUUUGUUTsT 102% 5% 86% 12%
ND8484
1487 AcAAAucGGAcuGcuucuATsT 1468 uAGAAGcAGUCCGAUUUGUTsT 40% 2% 28% 3%
ND8485
1489 cAAAucGGAcuGcuucuAcTsT 1490 GuAGAAGcAGUCCGAUUUGTsT 41% 4% 38% 2%
ND8486
1491 GcAcccucAAucccuAcAGTsT 1492 CUGuAGGGAUUGAGGGUGCTsT 91% 7% 94% 4%
ND8487
1493 ccucAAcAucAAccucAAcTsT 1494 GUUGAGGUUGAUGUUGAGGTsT 46% 2% 37% 3%
ND8488
1495 cucAAcAucAAccucAAcuTsT 1496 AGUUGAGGUUGAUGUUGAGTsT 48% 2% 39% 3%
ND8489
1497 ucAAcAucAAccucAAcucTsT 1498 GAGUUGAGGUUGAUGUUGATsT 17% 1% 17% 1%
ND8490
1499 uAccGcuuccAcuAcAucATsT 1500 UGAUGuAGUGGAAGCGGuATsT 90% 5% 74% 8%
ND8491
1501 AccGcuuccAcuAcAucAATsT 1502 UUGAUGuAGUGGAAGCGGUTsT 103% 5% 91% 15%
ND8492
1503 GcuuccAcuAcAucAAcAuTsT 1504 AUGUUGAUGuAGUGGAAGCTsT 85% 5% 71% 10%
ND8493
1505 cuuccAcuAcAucAAcAucTsT 1506 GAUGUUGAUGuAGUGGAAGTsT 60% 5% 45% 3%
ND8494
1507 uccAcuAcAucAAcAuccuTsT 1508 AGGAUGUUGAUGuAGUGGATsT 33% 3% 41% 3%
ND8495
1509 ccAcuAcAucAAcAuccuGTsT 1510 cAGGAUGUUGAUGuAGUGGTsT 60% 5% 55% 2%
ND8496
1511 cuGGGcAAcuucAucuucGTsT 1512 CGAAGAUGAAGUUGCCcAGTsT 18% 0% 20% 0%
ND8497
1513 GGcAAcuucAucuucGccuTsT 1514 AGGCGAAGAUGAAGUUGCCTsT 76% 1% 77% 2%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribado@ 50nM en H441 SD
ND8498
1515 uucAucuucGccuGccGcuTsT 1516 AGCGGcAGGCGAAGAUGAATsT 65% 4% 74% 12%
ND8499
1517 ucGccuGccGcuucAAccATsT 1518 UGGUUGAAGCGGcAGGCGATsT 86% 5% 77% 3%
ND-8653
1519 AAUCGGACUGCUUCUACCATsT 1520 UGGUAGAAGCAGUCCGAUUTsT 16% 2% 20% 3%
ND-8654
1521 AUCGGACUGCUUCUACCAGTsT 1522 CUGGUAGAAGCAGUCCGAUTsT 54% 8% 67% 11%
ND-8655
1523 AAAUCGGACUGCUUCUACCTsT 1524 GGUAGAAGCAGUCCGAUUUTsT 25% 4% 28% 2%
ND-8656
1525 UCGGACUGCUUCUACCAGATsT 1526 UCUGGUAGAAGCAGUCCGATsT 12% 2% 17% 1%
ND-8657
1527 ACCAGAACAAAUCGGACUGTsT 1528 CAGUCCGAUUUGUUCUGGUTsT 33% 3% 35% 1%
ND-8658
1529 CCAGAACAAAUCGGACUGCTsT 1530 GCAGUCCGAUUUGUUCUGGTsT 27% 3% 30% 2%
ND-8659
1531 CAGAACAAAUCGGACUGCUTsT 1532 AGCAGUCCGAUUUGUUCUGTsT 15% 1% 22% 3%
ND-8660
1533 CUUCGCCUGCCGCUUCAACTsT 1534 GUUGAAGCGGCAGGCGAAGTsT 69% 17% 75% 10%
ND-8661
1535 UGGUACCGCUUCCACUACATsT 1536 UGUAGUGGAAGCGGUACCATsT 16% 2% 20% 3%
ND-8662
1537 AUCUUCGCCUGCCGCUUCATsT 1538 UGAAGCGGCAGGCGAAGAUTsT 19% 2% 25% 4%
ND-8663
1539 UUCGCCUGCCGCUUCAACCTsT 1540 GGUUGAAGCGGCAGGCGAATsT 90% 4% 97% 10%
ND-8664
1541 CACCCUCAAUCCCUACAGGTsT 1542 CCUGUAGGGAUUGAGGGUGTsT 19% 2% 25% 3%
ND-8665
1543 AGAACAAAUCGGACUGCUUTsT 1544 AAGCAGUCCGAUUUGUUCUTsT 13% 1% 22% 2%
ND-8666
1545 GAACAAAUCGGACUGCUUCTsT 1546 GAAGCAGUCCGAUUUGUUCTsT 11% 2% 18% 2%
ND-8667
1547 CGGACUGCUUCUACCAGACTsT 1548 GUCUGGUAGAAGCAGUCCGTsT 13% 1% 16% 2%
ND-8668
1549 AGCCUCAACAUCAACCUCATsT 1550 UGAGGUUGAUGUUGAGGCUTsT 17% 4% 21% 3%
ND-8669
1551 GCCUCAACAUCAACCUCAATsT 1552 UUGAGGUUGAUGUUGAGGCTsT 13% 1% 21% 3%
ND-8670
1553 GUCAGCCUCAACAUCAACCTsT 1554 GGUUGAUGUUGAGGCUGACTsT 43% 11% 27% 3%
ND-8671
1555 UCAGCCUCAACAUCAACCUTsT 1556 AGGUUGAUGUUGAGGCUGATsT 90% 17% 53% 13%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribado@ 50 nM enH441 SD
ND-8672
1557 CAGCCUCAACAUCAACCUCTsT 1558 GAGGUUGAUGUUGAGGCUGTsT 17% 3% 11% 3%
ND-8673
1559 GGAGCUGGACCGCAUCACATsT 1560 UGUGAUGCGGUCCAGCUCCTsT 25% 3% 18% 3%
ND-8674
1561 GUACCGCUUCCACUACAUGTsT 1562 GAUGUAGUGGAAGCGGUACTsT 21% 4% 16% 4%
ND-8675
1563 CCGCUUCCACUACAUCAACTsT 1564 GUUGAUGUAGUGGAAGCGGTsT 25% 4% 19% 3%
ND-8676
1565 CGCUUCCACUACAUCAACATsT 1566 UGUUGAUGUAGUGGAAGCGTsT 16% 3% 14% 1%
ND-8677
1567 UUCCACUACAUCAACAUCCTsT 1568 GGAUGUUGAUGUAGUGGAATsT 110% 19% 97% 9%
ND-8678
1569 UGGGCAACUUCAUCUUCGCTsT 1570 GCGAAGAUGAAGUUGCCCATsT 50% 8% 40% 5%.
ND-8679
1571 GCAACUUCAUCUUCGCCUGTsT 1572 CAGGCGAAGAUGAAGUUGCTsT 19% 3% 17% 2%
ND-8680
1573 CAACUUCAUCUUCGCCUGCTsT 1574 GCAGGCGAAGAUGAAGUUGTsT 25% 2% 23% 2%
ND-8681
1575 AACUUCAUCUUCGCCUGCCTsT 1576 GGCAGGCGAAGAUGAAGUUTsT 104% 7% 85% 10%
ND-8682
1577 ACUUCAUCUUCGCCUGCCGTsT 1578 CGGCAGGCGAAGAUGAAGUTsT 91% 8% 63% 9%
ND-8683
1579 CUUCAUCUUCGCCUGCCGCTsT 1580 GCGGCAGGCGAAGAUGAAGTsT 88% 6% 58% 6%
ND-8684
1581 UCAUCUUCGCCUGCCGCUUTsT 1582 AAGCGGCAGGCGAAGAUGATsT 76% 3% 64% 4%
ND-8685
1583 CAUCUUCGCCUGCCGCUUCTsT 1584 GAAGCGGCAGGCGAAGAUGTsT 15% 1% 18% 3%
ND-8686
1585 UCUUCGCCUGCCGCUUCAATsT 1586 UUGAAGCGGCAGGCGAAGATsT 109% 22% 31% 3%
ND-8687
1587 CGCCUGCCGCUUCAACCAGTsT 1588 CUGGUUGAAGCGGCAGGCGTsT 90% 21% 49% 2%
ND-8688
1589 GCCUGCCGCUUCAACCAGGTsT 1590 CCUGGUUGAAGCGGCAGGCTsT 43% 9% 24% 7%
ND-8689
1591 AUUACUCUCACUUCCACCATsT 1592 UGGUGGAAGUGAGAGUAAUTsT 27% 4% 19% 2%
ND-8690
1593 UUACUCUCACUUCCACCACTsT 1594 GUGGUGGAAGUGAGAGUAATsT 109% 7% 85% 8%
ND-8691
1595 ACUCUCACUUCCACCACCCTsT 1596 GGGUGGUGGAAGUGAGAGUTsT 93% 11% 87% 12%
ND-8692
1597 UCUGCACCCUCAAUCCCUATsT 1598 UAGGGAUUGAGGGUGCAGATsT 31% 12% 17% 2%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribado@ 50 nM enH441 SD
ND-8693
1599 CUGCACCCUCAAUCCCUACTsT 1600 GUAGGGAUUGAGGGUGCAGTsT 41% 25% 31% 4%
ND-8694
1601 UGCACCCUCAAUCCCUACATsT 1602 UGUAGGGAUUGAGGGUGCATsT 75% 25% 43% 3%
ND-8695
1603 ACCCUCAAUCCGUACAGGUTsT 1604 ACCUGUAGGGAUUGAGGGUTsT 65% 26% 25% 5%
ND-8696
1605 CCCUCAAUCCCUACAGGUATsT 1606 UACCUGUAGGGAUUGAGGGTsT 18% 2% 13% 1%
ND-8697
1607 CCUCAAUCCCUACAGGUACTsT 1608 GUACCUGUAGGGAUUGAGGTsT 16% 4% 13% 2%
ND-8698
1609 AACCAGAACAAAUCGGACUTsT 1610 AGUCCGAUUUGUUCUGGUUTsT 40% 2% 30% 2%
ND-8699
1611 AACAAAUCGGACUGCUUCUTsT 1612 AGAAGCAGUCCGAUUUGUUTsT 56% 4% 45% 3%
ND-8700
1613 ACAAAUCGGACUGCUUCUATsT 1614 UAGAAGCAGUCCGAUUUGUTsT 18% 3% 12% 1%
ND-8701
1615 CAAAUCGGACUGCUUCUACTsT 1616 GUAGAAGCAGUCCGAUUUGTsT 15% 2% 15% 4%
ND-8702
1617 GCACCCUCAAUCCCUACAGTsT 1618 CUGUAGGGAUUGAGGGUGCTsT 53% 4% 46% 20%
ND-8703
1619 CCUCAACAUCAACCUCAACTsT 1620 GUUGAGGUUGAUGUUGAGGTsT 25% 6% 26% 9%
ND-8704
1621 CUCAACAUCAACCUCAACUTsT 1622 AGUUGAGGUUGAUGUUGAGTsT 30% 8% 37% 26%
ND-8705
1623 UCAACAUCAACCUCAACUCTsT 1624 GAGUUGAGGUUGAUGUUGATsT 55% 1% 50% 10%
ND-8706
1625 UACCGCUUCCACUACAUCATsT 1626 UGAUGUAGUGGAAGCGGUATsT 36% 7% 31% 7%
ND-8707
1627 ACCGCUUCCACUACAUCAATsT 1628 UUGAUGUAGUGGAAGCGGUTsT 23% 5% 27% 10%
ND-8708
1629 GCUUCCACUACAUCAACAUTsT 1630 AUGUUGAUGUAGUGGAAGCTsT 16% 4% 24% 12%
ND-8709
1631 CUUCCACUACAUCAACAUCTsT 1632 GAUGUUGAUGUAGUGGAAGTsT 62% 3% 74% 27%
ND-8710
1633 UCCACUACAUCAACAUCCUTsT 1634 AGGAUGUUGAUGUAGUGGATsT 45% 8% 41% 1%
ND-8711
1635 CCACUACAUCAACAUCCUGTsT 1636 CAGGAUGUUGAUGUAGUGGTsT 23% 4% 27% 10%
ND-8712
1637 CUGGGCAACUUCAUCUUCGTsT 1638 CGAAGAUGAAGUUGCCCAGTsT 34% 4% 26% 5%
ND-8713
1639 GGCAACUUCAUCUUCGCCUTsT 1640 AGGCGAAGAUGAAGUUGCCTsT 30% 3% 23% 2%
ID delDúplex
Seq ID Sentido Seq ID Antisentido Dosis única del1ercribado@ 50 nM en H441; MV SD 2do cribadon @ 50 nM enH441 SD
ND-8714
1641 UUCAUCUUCGCCUGCCGCUTsT 1642 AGCGGCAGGCGAAGAUGAATsT 90% 14% 85% 14%
ND-8715
1643 UCGCCUGCCGCUUCAACCATsT 1644 UGGUUGAAGCGGCAGGCGATsT 23% 2% 20% 4%
Tabla 2A: Concentración en una inhibición del 50% (IC50) para los agentes de ARNi de ejemplo de la Tabla 1A.
ID del Dúplex ND8294 ND8295 ND8299 ND8302 ND8313 ND8320 ND8331 ND8332 ND8343 ND8348 ND8356 ND8357 ND8363 ND8368 ND8371 ND8372 ND8373 ND8375 ND8380 ND8381 ND8383 ND8384 ND8391 ND8392 ND8396 ND8403
IC50 [nM]
1er DRC en
H441 0,1949 0,1011 0,5986 0,0144 0,0315 0,0796 0,0213 0,0205 0,0523 0,0156 0,0241 0,0054 0,1186 0,0487 0,0811 0,0584 0,0066 0,1176 0,6817 0,0037 0,0275 0,0357 0,0260 0,3831 0,0023 0,0808
IC50 [nM]
2do DRC en
H441 0,0468 0,0458 0,5638 0,0134 0,0124 0,0078 0,0158 0,0089 0,0293 0,0182 0,0099 0,0032 0,0337 0,1209 0,0911 0,0425 0,0165 0,1187 0,5747 0,0041 0,1257 0,0082 0,0349 0,4775 0,0052 0,0759
Tabla 2B: Concentración en una inhibición del 50% (lC50) y para los agentes de ARNi de ejemplo de la Tabla 1D.
IC50 [nM] IC50 [nM] 1er DRC en 2do DRC en
ID del Dúplex H441 H441 ND8441 0,6738 0,8080 ND8443 0,0346 0,0263 ND8449 0,0120 0,0067 ND8450 0,0257 0,0106 ND8451 0,1320 0,0931 ND8453 0,0079 0,0033 ND8489 0,1640 0,1593 ND8496 0,0387 0,0185
Tabla 2C: Porcentaje de actividad del ARNi de ejemplo hacia la inhibición de la expresión del gen para alfa-ENaC en los ensayos descritos en el Ejemplo 3.
Identificador del dúplex
No transfectado Control no direccionado Control negativo (sin alfa-ENaC de cinomólogo) ND8449
ND-8302 ND-8332 ND-8348 ND-8356 ND-8357 ND-8373 ND-8381 ND-8396 ND-8450 ND-8453
Listado de secuencias
<110> NOVARTIS AG
Van Heeke, Gino
Hickman, Emma
Danahay, Henry
Tan, Pamela
Geick, Anke
Vornlocher, Hans-Peter
% de expresión de alfa-ENaC en HBEC primario (% de control) ARNi corto 50 nM 77,2 100 n/a 30,2 24,7 40,1 36,6 29,6 30,4 32,5 34,1 45,9 30,1
<120> Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi
<130> 50662-WO-PCT
<140> PCT/EP2008/057476<141> 2008-06-13
<150>
EP 07110376.6<151> 2007-06-15
<150>
EP 07114265.7<151> 2007-08-13
<160> 1710
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
Expresión de alfa-ENaC de cinomólogo (% de control) ARNi corto 45nM
n/a
93,3
54,3
56,2
55,8
50,4
53,8
40,4
46,3
78,9
55,3
<223> Secuencia sintética: ARNi corto que reacciona en forma cruzada con ENaC alfa de humano - rhesus
<220>
<221> base modificada
<222> (3) .. (5)
<223> cm

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición que comprende un agente de ARNi que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde:
    a. la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1297), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND9201 (SEQ ID NO: 1298); o
    b . la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de ND10630 (SEQ ID NO: 979), y la cadena antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de ND10630 (SEQ ID NO: 980).
  2. 2.
    La composición de la reivindicación 1, en donde la cadena sentido es de 30 o menos nucleótidos de longitud, y en donde la cadena sentido y la cadena antisentido forman una región dúplex de 15 a 30 pares de nucleótidos de longitud.
  3. 3.
    La composición de la reivindicación 1, en donde la cadena antisentido y la cadena sentido son cada una de 19 a 23 nucleótidos de longitud.
  4. 4.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificación que provoca que el agente de ARNi tenga una mayor estabilidad en una muestra biológica.
  5. 5.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un fosforotioato o un nucleótido
    modificado en 2’.
  6. 6.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende:
    al menos un dinucleótido de 5'-uridina-adenina-3’ (5’-ua-3’), en donde la uridina es un nucleótido modificado en 2’;al menos un dinucleótido de 5'-uridina-guanina-3’ (5’-ug-3’), en donde la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’;al menos un dinucleótido de 5’-citidina-adenina-3’ (5'-ca-3’), en donde la 5’-citidina es un nucleótido modificado en 2’;o al menos un dinucleótido de 5’-uridina-uridina-3’ (5'-uu-3’), en donde la 5'-uridina es un nucleótido modificado en 2’.
  7. 7.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende una modificación 2’ seleccionada a partir del grupo que consiste en: 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2’-O-metilo, 2'-O-metoxi-etilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo (2’-O-AP), 2’-O-dimetÍI-amino-etiio (2’-O-DMAOE), 2'-O-dimetil-amino-propilo (2’-O-DMAP), 2’-O-dimetiIamino-etiIoxi-etiio (2’-O-DMAEOE), y 2’-O-N-metiI-acetamido (2’-O-NMA).
  8. 8.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un extremo romo.
  9. 9.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleótido que sobresale que tiene de 1 a 4 nucleótidos no emparejados.
  10. 10.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi comprende un nucleótido que sobresale en el
    extremo 3’ de la cadena antisentido del agente de ARNi.
  11. 11.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi es ND9201 (SEQ ID NOs: 1297 y 1298).
  12. 12.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi es ND10630 (SEQ ID NOs: 979 y 980).
  13. 13.
    La composición de la reivindicación 1, en donde el agente de ARNi está ligado a uno o más compuestos de diagnóstico, grupo reportero, agente de entrecruzamiento; fracción que confiera resistencia a Ia nucleasa, nucleobase natural o inusual, molécula Iipofílica, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelina, ácido Iitocólico derivado de epifriedelanol, vitamina, carbohidrato, dextrano, pululano, quitina, quitosano, carbohidrato sintético, Oligo Lactato de 15 mer, polímero natural, polímero de peso molecular bajo o medio, inulina, ciclodextrina, o ácido hialurónico, proteína, agente enlazante de proteína, molécula destinada a la integrina, policatiónico, péptido, poliamina, imitación de péptido, y/o transferrina.
  14. 14.
    Una composición que comprende un agente de ARNi para alfa-ENaC, en donde el agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido,
    en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1297) y ND10630 ( SEQ ID NO: 979), y
    en donde la cadena sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la cadena antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND9201 (SEQ ID NO: 1298) y ND10630 (SEQ ID NO: 980),
    la composición comprende además un ligando del receptor epitelial.
  15. 15. La composición de la reivindicación 14, en donde el ligando del receptor epitelial es (i) transferrina, o (ii) ácido 5 fólico.
  16. 16.
    La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 14 para uso en terapia.
  17. 17.
    La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 14 para uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por disfunción del canal de sodio epitelial seleccionada de: fibrosis quística, discinesia ciliar primaria, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma, infección del tracto respiratorio,
    10 carninoma pulmonar, síndrome de Liddles, hipertensión, insuficiencia renal y desequilibrio de electrolitos.
    Figura 2…
    Traducción:
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