CN101778941B - α-ENaC表达的RNAi抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过化学修饰的寡核苷酸调节α-ENaC的表达，更具体地下调α-ENaC的表达，的组合物和方法。

Description

α-ENaC表达的RNAi抑制
技术领域
本发明涉及ENaC介导的气道离子转运领域，涉及用于调节α-EnaC表达的组合物和方法，更具体地涉及利用寡核苷酸通过RNA干扰下调α-EnaC，所述寡核苷酸通过吸入/鼻内施用被局部施用至肺和鼻道，或例如通过静脉内注射进行全身性施用。
背景技术
RNA干扰或“RNAi”是最初由Fire及其同事创造的术语，用于描述当将双链RNA(dsRNA)导入蠕虫时其可阻断基因表达的观察现象(Fire等，Nature 391：806-811，1998)。短dsRNA在许多生物(包括脊椎动物)中指导基因特异性转录后沉默，并且为研究基因功能提供了新工具。该技术近来已被多次综述，参见，例如Novina，C.D：，和Sharp，P.，Nature 2004，430：161，和Sandy，P.，等，Biotechniques 2005，39：215，通过引用合并入本文。
位于环境和身体之间的界面上的粘膜表面已进化出许多保护机制。此先天防御的一个主要形式是用液体清洁这些表面。通常，粘膜表面上的液体层的量反映了上皮液体分泌(通常反映与水(和阳离子抗衡离子)偶联的阴离子(Cl-和/或HCO3-)的分泌)与上皮液体吸收(通常反映与水和抗衡阴离子(Cl-和/或HCO3-)偶联的Na+吸收)之间的平衡。粘膜表面的许多疾病由因分泌(太少)与吸收(相对太多)间失衡导致的粘膜表面太少保护液引起。表征这些粘膜机能障碍的缺陷型盐转运过程存在于粘膜表面的上皮层中。补充粘膜表面上的保护性液体层的一个方法是通过阻断Na+通道介导的液体吸收来“重平衡”该系统。介导Na+和液体吸收的限速步骤的上皮蛋白质是上皮Na+通道(ENaC)，α-EnaC位于上皮细胞的顶面，即粘膜表面-环境界面。对α-EnaC介导的Na+介导的液体吸收的抑制可达到治疗功效。因此，需要开发用于治疗和预防人和动物中牵涉α-EnaC的疾病或障碍，例如囊性纤维化的有效疗法，特别是高效疗法。高效的一个前提是活性成分在生理环境中不被太快降解。
发明概述
本发明提供了特定的组合物和方法，所述组合物和方法可以例如通过吸入、鼻内或气管内施用试剂来用于降低受试者例如哺乳动物，例如人中的α-EnaC水平。
本发明特别地提供了由α-EnaC的至少15个或更多个连续核苷酸组成的或基本上由其组成的或包含其的iRNA试剂，更特别地提供了包含来自表1A-1D中所示序列之一的15个或更多个连续核苷酸的试剂。该iRNA试剂优选包含每链少于30个核苷酸，例如21至23个核苷酸，例如表1A-1D中提供的那些。该双链iRNA试剂可具有平端，或更优选地在该试剂的一个或两个3’末端具有1至4个核苷酸的突出端(overhang)。
此外，iRNA试剂可以只包含天然的核糖核苷酸亚单位，或其可以被合成以包含一个或多个对该试剂中包括的一个或多个核糖核苷酸亚单位的糖、磷酸或碱基的修饰。iRNA试剂还可被修饰，以与选择用于改善该试剂的稳定性、分布或细胞摄取的配体，例如胆固醇连接。此外，iRNA试剂可以以分离的形式存在，或可以是用于本文所述方法的药物组合物(特别是配制用于递送至肺或鼻道或配制用于胃肠外施用的药物组合物)的部分。药物组合物可包含一种或多种iRNA试剂，在一些实施方案中，可包含两种或更多种iRNA试剂，其中每一种分别指向α-EnaC基因的不同区段。
本发明的一个方面涉及包含至少1个非天然核碱基的双链寡核苷酸。在某些实施方案中，非天然核碱基是二氟甲苯基(difluorotolyl)、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在优选实施方案中，非天然核碱基是二氟甲苯基。在某些实施方案中，在包含双链寡核苷酸的两条寡核苷酸链中只有一条包含非天然核碱基。在某些实施方案中，包含双链寡核苷酸的两条寡核苷酸链都独立地包含非天然核碱基。
本发明还提供了用于降低细胞中α-ENaC mRNA的水平的方法。此类方法包括对受试者施用本发明的一种iRNA试剂的步骤，见下面进一步的描述。本方法利用涉及RNA干扰的细胞机制，选择性地降解细胞中的靶RNA，所述方法由将细胞与本发明的一种iRNA试剂接触的步骤组成。此类方法可直接在细胞上进行，或可通过对受试者施用本发明的一种iRNA试剂/药物组合物而在哺乳动物受试者上进行。细胞中靶RNA的减少导致产生的编码蛋白质的量的减少，以及在生物体中，导致上皮电位差的降低、减少的液体吸收和增加的粘液纤毛清除率。
本发明的方法和组合物，例如本发明的方法和iRNA试剂组合物，可以以本文所述的任何剂量和/或制剂以及以本文所述的任何施用途径使用。
本发明的一个或多个实施方案的详细内容示于附图和下面的说明。根据该说明、附图、以及根据权利要求，本发明的其他特征、目的和有利方面将变得显而易见。本申请为了所有目的并入所有引用的参考文献、专利和专利申请的全文作为参考。
附图简述
在图中：
图1：用于克隆的食蟹猴α-EnaC的pXoon构建体的限制性消化图谱。
图2：食蟹猴α-EnaC的蛋白质和DNA序列。
图3：预测的脱靶(off-target)和标靶(on-target)识别位点在AY535007二元萤光素酶报告基因构建体中的克隆。片段由19nt的预测的靶位点和位于5′和3′末端的10nt侧翼序列组成。
本发明的某些优选实施方案的详细描述
为了便于说明，术语“核苷酸”或“核糖核苷酸”在本文中有时用于指RNA试剂的一个或多个单体亚单位。将理解，本文中术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”的使用，在修饰的RNA或核苷酸替代物(surrogate)的情况下，还可指如下面进一步描述的、在一个或多个位置上的修饰的核苷酸或替代物置换部分(surrogate replacement moiety)。
“RNA试剂”，如本文所使用的，是未修饰的RNA、修饰的RNA或核苷替代物，其每一个都在本文中进行了描述或是RNA合成领域中众所周知的。虽然描述了许多修饰的RNA和核苷替代物，但优选实例包括比未修饰的RNA具有更大的抗核酸酶降解抗性的那些。优选实例包括具有2’糖修饰、单链突出端(优选3’单链突出端)修饰，或特别地如果是单链，包含1个或多个磷酸基团或一个或多个磷酸基团类似物的5’-修饰的那些。
“iRNA试剂”(“干扰RNA试剂”的缩写)，如本文所使用的，是可下调靶基因例如EnaC基因SCNN1A的表达的RNA试剂。然而不希望受理论束缚，iRNA试剂可通过众多机制中的一个或多个机制起作用，包括靶mRNA的转录后切割(有时在本领域内称为RNAi)或转录前或翻译前机制。
“ds iRNA试剂”(“双链iRNA试剂”的缩写)，如本文所使用的，是包含一条以上，优选两条链的iRNA试剂，其中链间杂交可形成双链体结构区域。“链”在本文中是指核苷酸(包括非天然的或修饰的核苷酸)的连续序列。该两条或更多条链可以是分开的分子或各自形成分开的分子的一部分，或它们可共价互连，例如通过连接体例如聚乙二醇连接体共价互连，从而形成一个分子。至少一条链可包含与靶RNA充分互补的区域。这样的链称为“反义链”。包含与反义链互补的区域的dsRNA试剂的第二链称为“有义链”。然而，ds iRNA试剂还可由至少部分地自身互补从而形成例如发夹或锅柄样结构(包含双链体区域)的单个RNA分子形成。后者在本文中称为短发夹RNA或shRNA。在该情况下，术语“链”是指RNA分子中与该相同RNA分子的另一区域互补的一个区域。
尽管在哺乳动物细胞中，长ds iRNA试剂可诱导通常是有害的干扰素应答，但短ds iRNA试剂不触发干扰素应答，至少未达到对细胞和/或宿主有害的程度(Manche等，Mol.Cell.Biol.12：5238，1992；Lee等，Virology199：491，1994；Castelli等，J.Exp.Med.186：967，1997；Zheng等，RNA10：1934，2004；Heidel等，Nature Biotechnol.221579)。本发明的iRNA试剂包括足够短以致于不能在正常哺乳动物细胞中触发有害的非特异性干扰素应答的分子。因此，给受试者施用包含iRNA试剂的组合物(例如，如本文所述配制的)，可用于降低受试者中α-EnaC的表达，同时规避干扰素应答。足够短以致于不能触发有害干扰素应答的分子在本文中称为siRNA试剂或siRNA。“siRNA试剂”或“siRNA”，如本文所使用的，是指足够短以致于不能在哺乳动物，特别是人细胞中诱导有害的干扰素应答的iRNA试剂，例如ds iRNA试剂，例如，其具有少于60个，但优选少于50、40或30个核苷酸对的双链区域。
本文所述的分离的iRNA试剂，包括ds iRNA试剂和siRNA试剂，可以例如通过降解RNA，介导α-EnaC的表达降低。为方便起见，这样的RNA在本文中也称为待沉默的RNA。这样的核酸也称为“靶RNA”，有时称为“靶RNA分子”或有时称为“靶基因”。
如本文所使用的，短语“介导RNAi”是指试剂以序列特异性的方式沉默靶基因的能力。“沉默靶基因”意指这样的过程，通过该过程，在未与所述试剂接触时包含和/或表达靶基因的一定产物的细胞，在与所述试剂接触后，相比于未接触过所述试剂的相似细胞，将包含和/或表达少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的该基因产物。靶基因的此产物可以例如是信使RNA(mRNA)、蛋白质或调控元件。
如本文所使用的，术语“互补”旨在用于表示足以使本发明化合物与靶RNA分子，例如α-ENaC mRNA之间发生稳定且特异的结合的互补程度。特异结合需要足够程度的互补性，以避免在期望发生特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗性医治的情况下，在生理条件下，或在体外测定的情况下，在实施该测定的条件下)寡聚化合物与非靶序列的非特异性结合。非靶序列通常与靶序列相异至少2、3或4个核苷酸。
如本文所使用的，如果iRNA试剂减少细胞中靶RNA编码的蛋白质的产量的话，则所述iRNA试剂与靶RNA，例如靶mRNA(例如，α-ENaCmRNA)“充分互补”。iRNA试剂还可以与靶RNA“精确互补”，例如，靶RNA与iRNA试剂退火，优选地在精确互补的区域中形成专门由Watson-Crick碱基对产生的杂交体(hybrid)。“充分互补的”iRNA试剂可包括与靶α-EnaC RNA精确互补的内部区域(例如，至少10个核苷酸)。此外，在一些实施方案中，iRNA试剂可特异地区分单核苷酸差异。在该情况下，只有在单核苷酸差异区域(例如，7个核苷酸内)中存在精确互补时，iRNA试剂才介导RNAi。优选的iRNA试剂将基于表1A-1D中提供的有义和反义序列，或由其组成，或包含其。
如本文所使用的，“基本上同一(相同)”，当用于指与第二核苷酸序列相比较的第一核苷酸序列时，意指所述第一核苷酸序列除了不超过1、2或3个的核苷酸置换(例如，用尿嘧啶替代腺苷)外与第二核苷酸序列相同。“基本上保留抑制α-EnaC在培养的人细胞中表达的能力”，在本文中用于与表1A-1D的iRNA试剂之一不同但通过核苷酸的缺失、添加或置换从其衍生的iRNA试剂时，意指所述衍生的iRNA试剂的抑制活性不低于其所源自的表1A-1D的iRNA试剂的抑制活性的20％。例如，对于可以使培养的人细胞中的α-ENaC mRNA的量降低70％的表1A-1D的iRNA试剂，当衍生自其的iRNA试剂本身可以使存在于培养的人细胞中的mRNA的量降低至少50％时，则可以被认为基本上保留了抑制α-EnaC在培养的人细胞中复制的能力。任选地，本发明的iRNA试剂可以使存在于培养的人细胞中的α-ENaC mRNA的量降低至少50％。
如本文所使用的，“受试者”是指正在接受对α-EnaC介导的病症的治疗的哺乳动物生物体。受试者可以是任何哺乳动物，例如牛、马、小鼠、大鼠、狗、猪、山羊或灵长类动物。在优选实施方案中，受试者是人。
iRNA试剂的设计和选择
如本文中所使用的，“与α-EnaC表达相关的病症”是指(1)至少部分地由α-EnaC的存在来介导的和(2)可通过降低α-EnaC的存在水平来影响其结果的任何生物学或病理学状态。下面给出与α-EnaC表达相关的特定病症。
本发明所基于的是：靶向α-EnaC的iRNA试剂的设计、合成和产生，和在培养的细胞中在与iRNA试剂一起温育后体外沉默α-EnaC基因的证明，以及所得到的针对α-EnaC介导的病症的保护作用。
可基于序列信息和期望的特征来合理设计iRNA试剂。例如，可根据候选双链体的相对解链温度设计iRNA试剂。通常，双链体应当在反义链的5’末端比在反义链的3’末端具有低的解链温度。
本发明提供了包含靶向一个或多个α-ENaC转录物的(一个或多个)siRNA和/或shRNA的组合物。
对于选定的任何特定基因靶，根据本发明所使用的siRNA或shRNA的设计将优选遵循一定的指导方针。此外，在许多情况下，根据本发明递送至细胞的试剂在成为活性抑制剂之前可经历一个或多个加工步骤(关于进一步论述，参见下面)；在该情况下，本领域技术人员将理解，相关试剂优选经设计以包含对于其加工可能是必需的序列。
由上皮钠通道的机能障碍介导的疾病，包括与跨上皮膜的液体体积的调节相关的疾病。例如，气道表面液体体积是粘液纤毛清除和维持肺健康的关键调节因素。上皮钠通道的阻断将促使液体在气道上皮的粘膜侧积聚，从而促进粘液清除和预防粘液和痰在呼吸组织(包括肺气道)的积累。此类疾病包括呼吸系统疾病，例如囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、哮喘、呼吸道感染(急性和慢性的；病毒性和细菌性的)和肺癌。由上皮钠通道的阻断介导的疾病还包括除了呼吸系统疾病以外的与跨上皮的异常液体调节(可能牵涉上皮表面上的保护性表面液体的异常生理学)相关的疾病，例如，口干燥症(口腔干燥)或干燥性角膜炎(keratoconjunctivitis sire)(干眼)。此外，肾脏中，上皮钠通道的阻断可用于促进利尿，从而诱导降血压作用。
根据本发明的治疗可以是对症的或预防性的。
哮喘包括内因性(非变应性)哮喘和外因性(变应性)哮喘、轻度哮喘、中度哮喘、重度哮喘、支气管炎性气喘、运动诱发哮喘、职业性哮喘和细菌感染后诱导的哮喘。哮喘的治疗也应理解为包括治疗例如4或5岁以下、呈现喘鸣症状、被诊断为或可被诊断为“喘鸣婴儿”的受试者(已建立的主要医学关注的患者类别，现常鉴定为初期气喘或早期气喘)。(为方便起见，该特殊的哮喘状况称为“喘鸣-婴儿综合征”)
在哮喘治疗中，预防性功效可以由(例如急性哮喘的)症状性发作或支气管收缩(bronchoconstrictor)发作的频率或严重度的降低、肺功能的改善、或气道高反应性的改善来证明。其还可由对其他对症治疗的需要减少来证明，所谓其它对症治疗即在症状性发作时用于或旨在限制或中断该症状性发作的治疗，例如消炎药(例如，皮质类固醇)或支气管扩张剂(bronchodilatory)。哮喘的预防性益处特别在倾向于“晨降”(morningdipping)的受试者中可以是明显的。“晨降”是公认的哮喘综合征，对于大多数哮喘病患者来说是很普遍的，其特征在于例如大约凌晨4至6点的数小时之间，即在通常实质性远离任何之前施用的对症哮喘治疗的时间，的哮喘发作。
慢性阻塞性肺疾患包括慢性支气管炎或与其相伴的呼吸困难、肺气肿、以及由其他药物治疗，特别是其他吸入性药物治疗继发的气道高反应性的加重。本发明还可用于治疗任何类型或成因的支气管炎，包括例如急性、花生仁吸入性、卡他性、格鲁布性、慢性或结核性支气管炎。
基于本文所显示的结果，本发明提供了在培养细胞中和在受试者中例如哺乳动物，例如人中减少α-EnaC表达的iRNA试剂。表1A-1D提供了靶向α-ENaC的示例性iRNA试剂(基于表A中所示标准名称缩写)。
表1A，Seq Id No.305-608，表1B和表1D，Seq Id No.1519-1644列出了除了位于3′-末端与倒数第二的胸苷之间的一个硫代磷酸酯连接以外不包含核苷酸修饰的siRNA。表1A-1D中的其余Seq Id列出了这样的siRNA，其中在有义链中所有包含嘧啶碱基的核苷酸都是2′-O-甲基-修饰的核苷酸，且在反义链中5′-ua-3′序列背景中的所有尿苷和5′-ca-3′序列背景中的所有胞苷都是2′-O-甲基-修饰的核苷酸。
基于这些结果，本发明特别地提供了iRNA试剂，所述iRNA试剂包括具有表1A-1D中提供的试剂的有义链序列的至少15个连续核苷酸的有义链、和具有表1A-1D中提供的试剂的反义链序列的至少15个连续核苷酸的反义链。
表1A-1D中显示的iRNA试剂由与靶序列互补或同一的长度为19个核苷酸的两条链，加上3′-TT突出端，组成。本发明提供了包含来自这些序列的至少15个或至少16、17或18或19个连续核苷酸的试剂。然而，虽然这些长度可能是最佳的，但本发明的iRNA试剂并不意味着局限于这些长度。本领域技术人员清楚地认识到，更短或更长的iRNA试剂可具有相似的功效，因为，在一定的长度范围内，功效是核苷酸序列而不是链长度的函数。例如，Yang，等，PNAS 99：9942-9947(2002)，证明长度在21至30个碱基对之间的iRNA试剂具有相似的功效。其他人已经证明长度减少至大约15个碱基对的iRNA试剂可以有效沉默基因(Byrom，等，“InducingRNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase III”Tech Notes 10(1)，Ambion，Inc.，Austin，TX)。
因此，本发明可以并且本发明考虑从表1A-1D提供的序列中选择15至19个核苷酸的部分序列来产生源自表1A-1D提供的序列之一的iRNA试剂。备选地，可以向表1A-1D提供的序列之一或包含来自这些试剂之一的15个连续核苷酸的试剂添加一个或几个核苷酸，添加方式优选地但非必需地为使加入的核苷酸与靶基因例如α-EnaC的相应序列互补的方式。例如，可将来自这些试剂之一的前15个核苷酸与在α-ENaC mRNA中出现在这些序列的5’的8个核苷酸组合，以获得在有义链和反义链中具有23个核苷酸的试剂。所有这样衍生的iRNA试剂包括在本发明的iRNA试剂中，只要它们基本上保持抑制α-ENaC在培养的人细胞中复制的能力即可。
iRNA试剂的反义链在长度上应当等于或至少为14，15，16，17，18，19，25，29，40或50个核苷酸。其在长度上应当等于或少于60，50，40，或30个核苷酸。优选长度范围是15至30，17至25，19至23和19至21个核苷酸。
iRNA试剂的有义链在长度上应当等于或至少为14，15，1617，18，19，25，29，40或50个核苷酸。其在长度上应当等于或少于60，50，40，或30个核苷酸。优选长度范围是15至30，17至25，19至23，和19至21个核苷酸。
iRNA试剂的双链部分在长度上应当等于或至少为15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，29，40或50个核苷酸对。其在长度上应当等于或少于60，50，40或30个核苷酸对。优选长度范围是15至30，17至25，19至23，和19至21个核苷酸对。
通常，本发明的iRNA试剂包括与α-ENaC mRNA充分互补的区域，并且就核苷酸而言长度足够长，以便所述iRNA试剂或其片段可介导α-ENaC基因的下调。在iRNA试剂和靶基因之间不必完全互补，但相应性必须足以使iRNA试剂或其断裂产物能够例如通过RNAi切割α-ENaCmRNA而指导序列特异性沉默。
因此，本发明的iRNA试剂包括包含各含有至少16、17或18个核苷酸的序列的有义链和反义链的试剂，其中所述序列与表1A-1D的序列之一相比，除了每链各有不超过1、2或3个核苷酸已经被其它核苷酸替代(例如，用尿嘧啶替代腺苷)之外，基本上相同(如下面所定义的)，其中所述试剂基本上保留抑制α-ENaC在培养的人细胞中表达的能力。因此此类试剂具有与表1A-1D的序列之一相同的至少15个核苷酸，但相对于靶α-ENaC序列或在有义链与反义链之间导入了1、2或3个碱基错配。与靶α-ENaC RNA序列的错配，特别是在反义链中的错配，在末端区域是最耐受的，并且如果存在，优选在末端区域(一个或多个)中，例如5’和/或3’末端的6、5、4或3个核苷酸之内，最优选在有义链的5′-末端或反义链的3′-末端的6、5、4或3个核苷酸之内。有义链只需要与反义链充分互补以维持分子的总体双链特征即可。
优选，选择有义链和反义链以使iRNA试剂在分子的一个或两个末端上包含单链或未配对区域。这样，iRNA试剂包含有义和反义链，两链优选在配对后包含突出端，例如，一个或两个5或3’突出端，但优选2至3个核苷酸的3′突出端。大多数实施方案将具有3’突出端。优选的siRNA试剂将具有单链突出端，优选3’突出端，优选长1至4个或优选2或3个核苷酸，于该iRNA试剂的一个或两个末端上。突出端可以是一条链比另一条链长的结果，或可以是相同长度的两条链交错的结果。形成突出端的未配对的核苷酸可以是核糖核苷酸，或它们可以是脱氧核糖核苷酸，优选胸苷。5′-末端优选被磷酸化，或它们可以是非磷酸化的。
双链区域的优选长度，例如在上面所讨论的siRNA试剂范围中，为15至30个核苷酸，最优选为18，19，20，21，22和23个核苷酸。siRNA试剂可在长度和结构上与来自长dsRNA的天然Dicer加工产物相似。本发明还包括其中siRNA试剂的两条链连接，例如共价连接在一起的实施方案。发夹结构、或提供需要的双链区域和优选地3′突出端的其他单链结构也在本发明范围之内。
候选iRNA试剂的评估
如上面所指出的，本发明提供了鉴定可以用作α-ENaC的抑制剂的siRNA的系统。因为，如上面所指出的，shRNA经细胞内加工可以产生具有双链部分(序列与shRNA的茎结构相同)的siRNA，因此该系统同样地适用于鉴定可用作α-ENaC的抑制剂的shRNA。为了描述目的，该部分将涉及siRNA，但该系统也包括相应的shRNA。特别地，本发明显示了靶向抑制α-ENaC活性的siRNA的成功制备。如本文所述的，在此描述的技术和试剂可容易地应用于设计靶向其他基因或基因区域的潜在新型siRNA，并且检测它们在抑制α-ENaC上的活性。
在本发明的多个实施方案中，可通过将候选siRNA(一或多种)导入细胞(例如，通过外源施用、或通过将能够指导siRNA内源合成的载体或构建体导入细胞)、或通过肺或鼻施用，导入实验室动物，就对内源α-ENaC表达的抑制，检测潜在的α-ENaC抑制剂。备选地，可通过将候选siRNA(一或多种)与α-ENaC表达质粒一起瞬时共转染，在体外检测潜在的α-ENaC抑制剂。然后评估候选siRNA降低靶转录物水平和/或抑制或阻抑α-ENaC活性的一个或多个方面或特征(例如上皮电位差或气道表面液体吸收)的能力。
可将已递送了本发明的siRNA组合物的细胞或实验室动物(受试细胞/动物)，与未接受本发明组合物的相似的或可比较的细胞或实验室动物(对照细胞/动物，例如，没有接受siRNA或接受了对照siRNA例如靶向非内源转录物例如绿色荧光蛋白(GFP)的siRNA的细胞/动物)相比较。可将受试细胞/动物的离子转运表型与对照细胞/动物的该表型相比较，条件是本发明的siRNA与受试细胞类型/物种具有序列交叉反应性。可在受试细胞/动物中相对于对照细胞/动物比较α-ENaC蛋白质的产生和短路电流(体外或离体)。相似地可比较α-ENaC活性的其他指标，包括离体上皮电位差或体内粘液纤毛清除率或全身磁共振成像(MRI)。一般地，受试细胞/动物和对照细胞/动物将来自相同物种，且对于细胞，具有相似或相同的细胞类型。例如，可比较来自相同细胞系的细胞。当受试细胞是原代细胞时，通常对照细胞也将是原代细胞。
例如，候选siRNA抑制α-ENaC活性的能力可方便地通过如下方式确定：(i)将候选siRNA递送至细胞，(ii)估量相对于内源表达的对照基因，α-ENaC mRNA的表达水平，(iii)将体外细胞模型中在siRNA存在的情况下产生的氨氯吡嗪脒(amiloride)敏感性电流与在该siRNA不存在的情况下产生的量比较。此后一种测定法可用于检测靶向可间接地影响α-ENaC活性的任何靶转录物的siRNA，而不限于靶向编码ENaC通道亚基的转录物的siRNA。
候选siRNA降低靶转录物水平的能力可通过使用例如Northern印迹法、核酸酶保护试验、探针杂交、逆转录(RT)-PCR、实时RT-PCR、微阵列分析等测量靶转录物的量来进行评估。候选siRNA抑制靶转录物编码的多肽产生(在转录或转录后水平上)的能力可使用多种基于抗体的方法来测量，包括但不限于Western印迹法、免疫测定法、ELISA、流式细胞术、蛋白质微阵列等。一般地，可使用测量靶转录物或靶转录物编码的多肽的量的任何方法。
一般地，某些优选的α-ENaC iRNA抑制剂使靶转录物水平，相对于在该抑制剂不存在时(例如，在缺乏抑制剂的可比较的对照细胞中)的水平，降低至少大约2倍，优选至少大约4倍，更优选至少大约8倍，至少大约16倍，至少大约64倍或甚至更大的程度。一般地，某些优选α-ENaC iRNA抑制剂抑制ENaC通道活性，从而在包含抑制剂的细胞中所述活性比在不包含抑制剂的对照细胞中的低至少大约2倍，优选至少大约4倍，更优选至少大约8倍，至少大约16倍，至少大约64倍，至少大约100倍，至少大约200倍或达到甚至更大的程度。
某些优选α-ENaC iRNA抑制剂在siRNA施用和细胞感染后抑制ENaC通道活性至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时或至少168小时。某些优选α-ENaC抑制剂在施用siRNA后阻止(即，减少至不可检测的水平)或显著降低α-ENaC的活性至少24小时、至少36小时、至少48小时或至少60小时。根据本发明的多个实施方案，α-ENaC活性的显著降低是指降低至低于在siRNA不存在的情况下的水平的大约90％，降低至低于在siRNA不存在的情况下的水平的大约75％，降低至低于在siRNA不存在的情况下的水平的大约50％，降低至低于在siRNA不存在的情况下的水平的大约25％，或降低至低于在siRNA不存在的情况下的水平的大约10％。可使用任何适当的方法测量α-ENaC活性的减少，包括但不限于，体外氨氯吡嗪脒敏感性的短路电流测量、离体上皮电位差或体内粘液纤毛清除或全身/肺MRI。
iRNA试剂的稳定性检测、修饰和再检测
可就稳定性，例如对核酸内切酶或核酸外切酶切割的易感性，评估候选iRNA试剂，例如在将iRNA试剂导入受试者的身体中后。可用方法鉴定对修饰，特别是切割，例如由受试者体内存在的组分引起的切割，易感的位点。此类方法可包括在候选iRNA试剂与分离的生物介质例如血清、血浆、痰、脑脊液或细胞或组织匀浆物在体外温育后，或在使受试者与候选iRNA试剂体内接触后，分离和鉴定通过候选iRNA试剂的降解而形成的最丰富的片段，从而鉴定易于切割的位点。此类方法见于，例如，但不限于2005年5月27日提交的国际专利申请公开号WO2005115481中。
当鉴定到对切割易感的位点时，可设计和/或合成另外的iRNA试剂，其中例如通过在切割位点上导入2′-修饰例如2′-O-甲基，使该潜在的切割位点抗切割。可就稳定性再检测该另外的iRNA试剂，并且可以重复该过程直至发现展示期望稳定性的iRNA试剂。
体内检测
可在动物模型中(例如，在哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠或灵长类动物中)就体内功能性检测被鉴定为能够抑制α-ENaC基因表达的iRNA试剂。例如，可对动物施用iRNA试剂，就其生物分布、稳定性和其抑制α-ENaC表达或调节至少部分由α-ENaC介导的生物学或病理学过程的能力，评估iRNA试剂。
可以例如通过注射，将iRNA试剂直接施用至靶组织，或可将iRNA试剂以与其施用给人时的方式相同的方式对动物施用。优选，通过例如鼻内、吸入或气管内施用，将iRNA试剂递送至受试者的气道。
还可就iRNA试剂的细胞内分布来对其进行评估。评估可包括确定iRNA试剂是否被摄入细胞。评估还可包括测定iRNA试剂的稳定性(例如，半衰期)。可通过使用缀合至示踪标记物(例如，荧光标记，例如荧光素；放射性标记物，例如35S，32P，33P或3H；金颗粒；或用于免疫组织化学的抗原颗粒)的iRNA试剂，促进对iRNA试剂的体内评估。
可就iRNA试剂下调α-ENaC表达的能力，对其进行评估。可以例如通过在暴露于iRNA试剂之前和之后从组织分离RNA，或通过原位杂交，测量体内α-ENaC基因表达的水平。在需要处死动物以收获组织的情况下，未处理的对照动物将用于比较。α-ENaC RNA可通过任何期望的方法来检测，包括但不限于RT-PCR、northern印迹法、分支-DNA测定法(branched-DNA assay)或RNA酶保护试验。备选地或另外地，α-ENaC基因表达可通过对用iRNA试剂处理过的组织提取物进行western印迹分析或免疫染色来监测。
可使用任何类型的已开发的动物模型来检测潜在的α-ENaC抑制剂。可对动物施用包含候选siRNA、能够指导此类siRNA在宿主细胞中合成的构建体或载体、或经工程改造或经操作而含有候选siRNA的细胞的组合物。评估组合物抑制α-ENaC表达和/或改变ENaC-依赖性表型和/或相对于未接受该潜在α-ENaC抑制剂的动物减轻它们的严重度的能力。此类模型包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、绵羊和非人灵长类动物的ENaC-依赖性表型模型，所述全部模型在本领域内是已知的并且被用于检测潜在的α-ENaC治疗剂的功效。
通过利用本发明用于鉴定候选治疗性siRNA试剂的系统，合适的治疗剂选自Duplex标识符ND-8302，ND-8332，ND-8348，ND-8356，ND-8357，ND-8373，ND-8381，ND-8396，ND-8450和ND-8453，更合适地选自ND-8356，ND-8357和ND-8396。
iRNA 化学
在此描述介导RNAi以抑制α-ENaC基因表达的分离的iRNA试剂，例如ds RNA试剂。
本文所述的RNA试剂包括未修饰的RNA以及已被修饰例如以提高功效的RNA，和核苷替代物的聚合物。未修饰的RNA是指分子中核酸的组分，即糖、碱基和磷酸部分，与天然存在的，优选在人体中天然存在的相同或基本上相同。本领域一直将稀有或罕见但天然存在的RNA称为修饰的RNA，参见，例如Limbach等Nucleic Acids Res.22：2183-2196，1994。此类通常称为修饰的RNA(明显原因是它们通常是转录后修饰的结果)的稀有或罕见RNA，在本文所使用的术语未修饰的RNA的范围内。本文中，修饰的RNA是指分子中核酸的一个或多个组分，即糖、碱基和磷酸部分，与天然存在的不同，优选与在人体中天然存在的不同。虽然它们被称为修饰的“RNA”，但它们当然，由于修饰的原因，将包括非RNA的分子。核苷替代物是其中核糖磷酸(ribophosphate)主链被非核糖磷酸构建物替代的分子，其中所述非核糖磷酸构建物允许碱基呈现正确的空间关系，以致于与利用核糖磷酸主链时观察到的杂交具有基本相似的杂交，例如，核糖磷酸主链的不带电荷的模拟物。上述实例在本文中进行了论述。
可将本文所述的修饰掺入本文所述的任何双链RNA和RNA样分子，例如iRNA试剂。可能期望修饰iRNA试剂的反义和有义链中的一条或两条链。因为核酸是亚单位或单体的聚合物，下面描述的许多修饰发生在核酸中重复的位置上，例如对碱基或磷酸部分或磷酸部分的非连接氧的修饰。在一些情况下，修饰将在核酸的所有主题位置上发生，但在许多，事实上大多数情况下，情况不是这样的。例如，修饰可能只发生在3’或5’末端位置，可能只发生在末端区域，例如末端核苷酸的位置上，或链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可发生在双链区域，单链区域或两者中。例如，非连接O位置上的硫代磷酸酯修饰可只发生在一个或两个末端，可只发生在末端区域，例如末端核苷酸的位置上、或链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中，或可发生在双链和单链区域中，特别地在末端上。类似地，修饰可在有义链、反义链或两者上发生。在一些情况下，有义链和反义链具有相同的修饰或相同类型的修饰，但在其他情况下有义链和反义链将具有不同的修饰，例如在一些情况下，可能期望只修饰一条链，例如有义链。
将修饰导入iRNA试剂的两个主要目的是它们对抗生物环境中降解的稳定化作用和对药理性质例如药效学性质的改善，这在下面进一步论述。对iRNA试剂的糖、碱基或主链的其他适宜修饰描述于2004年1月16日提交的PCT申请号PCT/US2004/01193中。iRNA试剂可包含非天然碱基，例如2004年4月16日提交的PCT申请号PCT/US2004/011822中描述的碱基。iRNA试剂可包含非天然糖，例如非糖环状载体分子。用于iRNA试剂的非天然糖的示例性特征描述于2003年4月16日提交的PCT申请号PCT/US2004/11829中。
iRNA试剂可包含用于增加核酸酶抗性的核苷酸间键(例如，手性硫代磷酸酯键)。此外，或备选地，iRNA试剂可包含核糖模拟物以增加核酸酶抗性。用于增加核酸酶抗性的示例性核苷酸间键和核糖模拟物描述于2004年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2004/07070中。
iRNA试剂可包含用于寡核苷酸合成的缀合配体的单体亚单位和单体。示例性单体描述于2004年8月10日提交的美国申请号10/916,185。
iRNA试剂可具有ZXY结构，例如2004年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2004/07070中描述的该结构。
可将iRNA试剂与两亲性部分复合。与iRNA试剂一起使用的示例性两亲性部分描述于2004年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2004/07070中。
在另一个实施方案中，可使iRNA试剂与递送试剂复合(以模块复合物(modular complex)为特征)。所述复合物可包括与一种或多种(优选两种或更多中，更优选所有三种)下列试剂连接的载体试剂(carrier agent)：(a)缩合剂(condensing agent)(例如能够通过离子或静电相互作用吸引，例如结合核酸的试剂)；(b)融合剂(例如，能够与细胞膜融合和/或能够跨细胞膜转运的试剂)；和(c)靶向性基团，细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如结合特定细胞类型的抗体。与递送剂复合的iRNA试剂描述于2004年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2004/07070中。
iRNA试剂可具有非规范配对，例如在iRNA双链体的有义和反义序列之间。非规范iRNA试剂的示例性特征描述于2004年3月8日提交的PCT申请号PCT/US2004/07070中。
增强的核酸酶抗性
iRNA试剂，例如靶向α-ENaC的iRNA试剂，可具有增强的对核酸酶的抗性。
增加抗性的一个方法是鉴定切割位点，然后修饰此类位点以抑制切割，如2004年5月4日提交的美国申请号60/559,917中所述的。例如，二核苷酸5’-ua-3’、5’-ca-3’、5’-ug-3’、5’-uu-3’或5’-cc-3’可用作切割位点。在某些实施方案中，iRNA试剂的有义链、反义链或两条链中所有嘧啶都具有2′-修饰，由此该iRNA试剂具有增强的对核酸内切酶的抗性。增强的核酸酶抗性还可通过修饰5’核苷酸，导致例如至少一个尿苷是2’-修饰核苷酸的5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-ua-3’)二核苷酸、至少一个5’-胞苷是2’-修饰核苷酸的5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-ca-3’)二核苷酸、至少一个5’-尿苷是2’-修饰核苷酸的5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-ug-3’)二核苷酸、至少一个5’-尿苷是2’-修饰核苷酸的5’-尿苷-尿苷-3’(5’-uu-3’)二核苷酸、或至少一个5’-胞苷是2’-修饰核苷酸的5’-胞苷-胞苷-3’(5’-cc-3’)二核苷酸来实现，如2005年5月27日提交的国际申请号PCT/US2005/018931中所描述的。iRNA试剂可包含至少2个，至少3个，至少4个或至少5个这样的二核苷酸。在特别优选实施方案中，有义链、反义链或两条链中所有出现的序列基序5’-ua-3’和5’-ca-3’中的5’核苷酸都是修饰的核苷酸。优选有义链、反义链或两条链中所有出现的序列基序5’-ua-3’、5’-ca-3’和5’-ug-3’中的5’核苷酸都是修饰的核苷酸。更优选，有义链中所有嘧啶核苷酸都是修饰的核苷酸，而反义链中所有出现的序列基序5’-ua-3’和5’-ca-3’中的5’核苷酸都是修饰的核苷酸，或在反义链不包含5’-ua-3’和5’-ca-3’基序的情况下，所有出现的基序5’-ug-3’中的5’核苷酸都是修饰的核苷酸。
优选，2′-修饰的核苷酸包括例如2′-修饰的核糖单位，例如可用许多不同的“氧基”或“脱氧基”取代基替代或修饰2′-羟基(OH)。
“氧基”-2′羟基基团修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如，R＝H，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；其中2′羟基例如通过亚甲基桥连接至相同核糖的4′碳的“锁”核酸(LNA)；O-AMINE和氨基烷氧基，O(CH2)nAMINE(例如，AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)。值得注意的是，只包含甲氧基乙基(MOE)，(OCH2CH2OCH3，PEG衍生物)，的寡核苷酸可以展示与具有强力硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸相当的核酸酶稳定性。
“脱氧基”修饰包括氢(即，脱氧核糖，其对部分ds RNA的突出端部分尤其合适)；卤素(例如，氟)；氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基，二芳基氨基，杂芳基氨基，二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)；-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；氰基；巯基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；和烷基，环烷基，芳基，链烯基和炔基，其可任选地被例如氨基官能团取代。
优选取代基是2′-甲氧基乙基、2′-OCH3、′-O-烯丙基、′-C-烯丙基和2′-氟。
寡核苷酸主链中包含呋喃糖也可减少内切核酸降解切割。还可以通过包含3’阳离子基团，或通过以3′-3′连接倒置3′-末端核苷酸，修饰iRNA试剂。在另一个备选方案中，可用氨基烷基封闭3’末端，例如3’C5-氨基烷基dT。其他3’缀合物可抑制3’-5’外切核酸降解切割。然而不受理论束缚，3’缀合物，例如萘普生(naproxen)或布洛芬(ibuprofen)，可通过空间阻断核酸外切酶与寡核苷酸的3′-末端结合来抑制外切核酸降解切割。甚至小烷基链、芳基或杂环缀合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)也可阻断3’-5’-核酸外切酶。
还可通过导入磷酸酯连接体修饰，例如硫代磷酸酯键，抑制核酸降解切割。因此，优选的iRNA试剂包含这样的核苷酸二聚体，该二聚体富含或纯粹仅具有特定手性形式的修饰磷酸基团，其中所述修饰的磷酸基团在通常由氧占据的非桥接位置上包含杂原子。杂原子可以是S，Se，Nr2或Br3。当杂原子是S时，富Sp连接或手性纯Sp连接是优选的。“富”意指至少70，80，90，95或99％的该优选形式。当在iRNA试剂的5′-或3′-末端位置，优选5′-末端位置，附近导入时，修饰的磷酸酯连接在抑制外切核酸降解切割方面特别有效。
5′缀合物也可抑制5′-3′外切核酸降解切割。尽管不受任何理论束缚，5′缀合物，例如萘普生或布洛芬，可通过空间阻断核酸外切酶与寡核苷酸的5′-末端结合来抑制外切核酸降解切割。甚至小烷基链、芳基或杂环缀合物或经修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)也可阻断3′-5′-核酸外切酶。
当双链的iRNA试剂在至少一个末端上包含单链核苷酸突出端时，iRNA试剂可具有增强的对核酸酶的抗性。在优选实施方案中，核苷酸突出端包含1至4个，优选2至3个未配对的核苷酸。在优选实施方案中，与末端核苷酸对直接邻接的单链突出端的未配对核苷酸含有嘌呤碱基，而该末端核苷酸对是G-C对，或者最后四个互补核苷酸对中的至少两个是G-C对。在其它实施方案中，核苷酸突变端可以具有1个或2个未配体的核苷酸，在一个示例性实施方案中，核苷酸突变端是5’-gc-3’。在优选实施方案中，核苷酸突出端在反义链的3’端。在一个实施方案中，iRNA试剂在反义链的3’端包括基序5’-cgc-3’，由此形成2-nt的突出端5’-gc-3’。
因此，iRNA试剂可以包括修饰以抑制降解，例如由受试者体内的核酸酶，例如内切核酸酶或外切核酸酶，引起的降解。这些单体在本文中称作NRM或核酸酶抵抗促进单体，相应的修饰称作NRM修饰。在许多情况下，这些修饰还调节iRNA试剂的其它性质，例如，与蛋白质，例如转运蛋白，例如血清白蛋白，或RISC成员相互作用的能力，或者第一和第二序列相互形成双链体的能力、或与其它序列，例如靶分子形成双链体的能力。
可以将一种或多种不同的NRM修饰引入iRNA试剂中或引入iRNA试剂的序列中。一种NRM修饰可以在序列中或在iRNA试剂中使用一次以上。
NRM修饰包括仅可以放置在末端的一些修饰和可以置于任何位置的其它修饰。一些NRM修饰可以抑制杂交，因此，优选仅将其用在末端区域中，并且优选不将其用于靶向主题序列或基因的序列的切割位点或切割区域中，尤其是在反义链上。只要可以维持ds iRNA试剂两链之间的充分杂交，它们可以用在有义链的任何地方。在一些实施方案中，期望将NRM置于有义链的切割位点处或切割区域中，因为这可以最小化脱靶沉默。
在许多情况下，NRM修饰根据其是包含在有义链上还是包含在反义链上而有不同的分布。如果在反义链上，干扰或抑制内切核酸酶切割的修饰不应插入接受RISC介导的切割的区域，例如切割位点或切割区域(参见Elbashir等，2001，Genes and Dev.15：188，特此并入作为参考)。靶的切割发生在20或21nt反义链的大约中部，或者与反义链互补的靶mRNA的第一个核苷酸上游大约10或11个核苷酸处。在本文中，切割位点指在靶上或在与靶杂交的iRNA试剂链上位于切割位点两侧的核苷酸。切割区域指位于切割位点在每一方向上的1、2或3个核苷酸内的核苷酸。
此类修饰可以引入有义链或反义链的末端区域，例如，末端位置或者末端2、3、4或5个位置内。
栓系配体(tethered ligand)
可以例如通过导入配体，例如栓系配体，影响和剪裁iRNA试剂的性质，包括其药理学性质。此外，当iRNA试剂可以具有或确实具有栓系配体时，可通过将配体掺入iRNA试剂的制剂中，改良iRNA试剂的药理学性质。
可将多种多样的实体例如配体栓系到iRNA试剂上，或用作制剂缀合物或添加物，例如到配体缀合的单体亚单位的载体上。在下面就缀合配体的单体亚单位描述实例，但这只是优选的，还可将实体在其他点上偶联至iRNA试剂。
优选的结构部分(moiety)是通过居间系链(intervening tether)直接或间接地偶联，优选共价地偶联，至载体的配体。在优选实施方案中，通过居间系链将配体连接至载体。当将配体缀合的单体掺入到正在生长的链中时，配体或栓系配体可存在于配体缀合的单体上。在一些实施方案中，可以在将“前体”配体缀合单体亚单位掺入到正在生长的链中之后，再将配体掺入“前体”配体缀合单体亚单位中。例如，可将具有例如以氨基结尾的系链，例如TAP-(CH2)nNH2，的单体掺入正在生长的有义或反义链。在随后的操作中，即，在将该前体单体亚单位掺入链中后，可以随后将具有亲电子基团，例如，五氟苯基酯或醛基团，的配体，通过该配体的此亲电子基团与前体配体缀合单体亚单位系链的末端亲核基团偶联，而结合到前体配体缀合单体上。
在优选实施方案中，配体改变掺入了其的iRNA试剂的分布、靶向性或寿命。在优选实施方案中，配体提供了，当例如与不存在这样的配体的物类相比时，增强的对于选择的靶，例如分子、细胞或细胞类型、区室例如细胞或器官区室、组织、器官或身体区域的亲和力。
优选的配体可提高转运、杂交和特异性性质，并且还可提高所得的天然的或修饰的寡核糖核苷酸、或包含本文所述单体和/或天然的或修饰的核糖核苷酸的任何组合的聚合分子的核酸酶抗性。
配体通常可包括治疗性调节物(modifier)，例如，以增强摄取；诊断性化合物或报告基团，例如以监测分布；交联剂；赋予核酸酶抗性的部分；和天然的或罕见的核酸碱基(nucleobases)。一般实例包括亲脂分子、脂质、凝集素、类固醇(例如乌苏醇、核柯配基(hecigenin)、薯蓣皂苷配基)、萜类(例如，三萜类，例如，萨洒皂苷配基、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)，维生素、碳水化合物(例如，葡聚糖、普鲁兰多糖、壳多糖、壳聚糖、合成(例如寡聚乳酸15-聚体)和天然(例如低和中分子量)聚合物、菊淀粉、环糊精或透明质酸)、蛋白质、蛋白质结合剂、整联蛋白靶向性分子、聚阳离子、肽、多胺和肽模拟物。其他实例包括叶酸或上皮细胞受体的配体例如转铁蛋白。
配体可以是天然发生的或重组的或合成的分子，例如合成的聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括多聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、或聚磷嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、肽模拟物多胺、树状聚体多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子结构部分，例如阳离子脂质、阴离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可包括靶向性基团，例如细胞或组织靶向剂，例如，促甲状腺激素、促黑激素、表面活性蛋白A、粘蛋白糖、糖基化的聚氨基酸、转铁蛋白、二膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、或Arg-Gly-Asp(RGD)肽或RGD肽模拟物。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，脂蛋白，例如低密度脂蛋白(LDL)，或白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)，或肽，例如对共配体具有特定亲和力的分子，或抗体，例如结合特定细胞类型例如癌细胞、内皮细胞或骨细胞的抗体。配体还可包括激素和激素受体。它们还可包括非肽物质(non-peptidic)，例如辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、或多价岩藻糖。
配体可以是能够例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间纤维来增加细胞对iRNA试剂的摄取的物质，例如药物。药物可以是例如taxon，长春花新碱、长春花碱、松胞菌素、诺可唑、japlakinolide、红海海绵素A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine、myoservin、四环素。
在一个方面，配体是脂质或基于脂质的分子。这样的脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合性配体允许缀合物分布至靶组织例如肝组织(包括肝的实质细胞)。可结合HSA的其他分子也可用作配体。例如，可使用neproxin或阿斯匹林。脂质或基于脂质的配体能够(a)增加抵抗缀合物降解的抗性，(b)增加至靶细胞或细胞膜的靶向或转运，和/或(c)可用于调节对血清蛋白例如HSA的结合。
基于脂质的配体可用于调节例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，更强地结合HSA的脂质或基于脂质的配体靶向肾的可能性更低，从而从身体清除的可能性更低。
在优选实施方案中，基于脂质的配体结合HSA。优选，其以足够的亲和力结合HSA，这样缀合物优选地将被分配至非肾组织。然而，优选亲和力不要太强以至HSA-配体结合不能被逆转。
在另一个方面，配体是被靶细胞例如增殖细胞摄取的部分，例如维生素或营养物。这些配体尤其可以用于治疗以不期望的细胞增殖，例如恶性或非恶性类型的，例如癌细胞，为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛、或其他被癌细胞摄取的维生素或营养物。
在另一方面，配体是细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂(helicalcell-permeation agent)。优选，该细胞渗透试剂是两亲性的。示例性试剂是肽，例如tat或antennapedia。如果试剂是肽，则其可被修饰，包括肽模拟物、invertomer、非肽或假肽连接，以及使用D-氨基酸。螺旋剂优选是α-螺旋剂，其优选具有亲脂和疏脂相。细胞渗透剂可与iRNA试剂共价连接，或其是iRNA-肽复合物的一部分。
5′-磷酸修饰
在优选实施方案中，iRNA试剂为5’磷酸化的或在5’引物末端包含磷酰基类似物。反义链的5′-磷酸修饰包括与RISC-介导的基因沉默相容的修饰。适宜的修饰包括：5′-一磷酸酯((HO)2(O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)，和任何修饰的或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-硫代一磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5′)；5′-二硫代一磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5′)，5′-磷酸硫酯((HO)2(O)P-S-5′)；氧/硫代的一磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何其它组合(例如5′-α-硫代三磷酸酯、5′-γ-硫代三磷酸酯等)、5′-磷酰胺((HO)2(O)P-NH-5′、(HO)(NH2)(O)P-O-5′)、5′-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5′-、(OH)2(O)P-5′-CH2-)、5′-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5′-)。
可修饰有义链以使有义链失活并且阻止活性RISC的形成，从而潜在地减少脱靶效应。这可通过防止有义链的5′-磷酸化的修饰，例如通过利用5′-O-甲基核糖核苷酸的修饰，以实现(参见
Figure GPA00001026085100241
等，(2001)ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA interferencepathway.Cell 107，309-321.)。还可使用防止磷酸化的其他修饰，例如，用H而非O-Me简单地替代5′OH。备选，将大体积基团加至5′-磷酸，以将其转变成磷酸二酯键。
非天然核酸碱基(nucleobase)
硝基吡咯基和硝基吲哚基是非天然核酸碱基，是称为通用碱基的一类化合物的成员。通用碱基是可替代四种天然碱基之任何一种而不实质性影响寡核苷酸双链体的解链行为或活性的化合物。与和天然核酸碱基相关的起稳定作用的氢键相互作用不同，据推测包含3-硝基吡咯基核酸碱基的寡核苷酸双链体只依靠堆积相互作用来稳定。与硝基吡咯基核酸碱基的显著氢键相互作用的缺乏，消除了对于特定互补碱基的特异性。此外，不同的报导证实4-，5-和6-硝基吲哚基展示对4种天然碱基非常小的特异性。有趣的是，包含5-硝基吲哚基的寡核苷酸双链体比包含4-硝基吲哚基和6-硝基吲哚基的相应寡核苷酸更稳定。用于制备1-(2’-O-甲基-β-D-呋喃核糖基)-5-硝基吲哚的方法描述于Gaubert，G；Wengel，J.Tetrahedron Letters2004，45，5629.中。其他适用于本发明的通用碱基包括次黄嘌呤基、异肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-脱氮杂-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、和其结构衍生物。关于更详细的论述，包括硝基吡咯基，硝基吲哚基和其他上面提及的通用碱基的合成方法，参见Vallone等，Nucleic Acids Research，27(17)：3589-3596(1999)；Loakes等，J.Mol.Bio.，270：426-436(1997)；Loakes等，Nucleic Acids Research，22(20)：4039-4043(1994)；Oliver等，Organic Letters，Vol.3(13)：1977-1980(2001)；Amosova等，Nucleic AcidsResearch，25(10)：1930-1934(1997)；Loakes等，Nucleic Acids Research，29(12)：2437-2447(2001)；Bergstrom等，J.Am.Chem.Soc.，117：1201-1209(1995)；Franchetti等，Biorg.Med.Chem.Lett.11：67-69(2001)；和Nair等，Nucelosides，Nucleotides & Nucleic Acids，20(4-7)：735-738(2001)。
二氟代甲苯基是可以充当通用碱基的非天然核酸碱基。二氟代甲苯基是天然核酸碱基胸腺嘧啶的等构物。但与胸腺嘧啶不同，二氟代甲苯基没有显示对于任何天然碱基的可感知的选择性。可以充当通用碱基和适用于本发明的其他芳香族化合物是4-氟-6-甲基苯并咪唑和4-甲基苯并咪唑。此外，相对疏水的异喹诺酮基衍生物3-甲基异喹诺酮基、5-甲基异喹诺酮基、和3-甲基-7-炔丙基异喹诺酮基是与只包含天然碱基的寡核苷酸序列相比仅引起轻微的寡核苷酸双链体失稳定的通用碱基。本发明考虑的其他非天然核酸碱基包括7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、pyrrolopyrizinyl、异喹诺酮基、7-炔丙基异喹诺酮基、炔丙基-7-氮杂吲哚基、2，4，5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4，6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基(phenanthracenyl)、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、和其结构衍生物。关于更详细的论述，包括二氟代甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑和上面提及的其他非天然碱基的合成方法，参见：Schweitzer等，J.Org.Chem.，59：7238-7242(1994)；Berger等，Nucleic Acids Research，28(15)：2911-2914(2000)；Moran等，J.Am.Chem.Soc.，119：2056-2057(1997)；Morales等，J.Am.Chem.Soc.，121：2323-2324(1999)；Guckian等，J.Am.Chem.Soc.，118：8182-8183(1996)；Morales等，J.Am.Chem.Soc.，122(6)：1001-1007(2000)；McMinn等，J.Am.Chem.Soc.，121：11585-11586(1999)；Guckian等，J.Org.Chem.，63：9652-9656(1998)；Moran等，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：10506-10511(1997)；Das等，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.，1：197-206(2002)；Shibata等，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.，1：1605-1611(2001)；Wu等，J.Am.Chem.Soc.，122(32)：7621-7632(2000)；O’Neill等，J.Org.Chem.，67：5869-5875(2002)；Chaudhuri等，J.Am.Chem.Soc.，117：10434-10442(1995)；和美国专利6,218,108。
iRNA试剂至细胞内的转运
不希望受任何理论束缚，缀合有胆固醇的iRNA试剂与某些脂蛋白的组分(例如胆固醇、胆固醇酯、磷脂)之间的化学相似性，可导致iRNA试剂在血液中与脂蛋白(例如LDL、HDL)结合、和/或导致iRNA试剂与具有胆固醇亲和力的细胞组分(例如胆固醇转运途径的组分)的相互作用。脂蛋白及其组分通过各种主动和被动转运机制被细胞摄取和加工，所述转运机制是例如但不限于：与LDL-受体结合的LDL的内吞、氧化的或其它方式修饰的LDL通过与清道夫受体A相互作用而发生的内吞、肝中清道夫受体B1介导的HDL胆固醇摄取、胞饮、或通过ABC(ATP-结合盒)转运蛋白例如ABC-A1、ABC-G1或ABC-G4进行的胆固醇跨膜转运。因此，对于具有此类转运机制的细胞，例如肝细胞，缀合有胆固醇的iRNA试剂可具有被促进的细胞摄取。这样，本发明提供了将iRNA试剂靶向表达某些细胞表面组分(例如受体)的细胞的证据和一般方法，即通过将这样的组分的天然配体(例如胆固醇)缀合至iRNA试剂，或通过将与所述组分的天然配体(例如LDL、HDL)缔合或结合的化学部分(例如胆固醇)缀合至iRNA试剂上，实现靶向。
其他实施方案
可在体内在细胞中，例如从递送入细胞的外源DNA模板，产生iRNA试剂。例如，可将DNA模板插入载体并且用作基因治疗载体。可通过例如静脉内注射、局部施用(美国专利5,328,470)，或通过立体定位注射(参见，例如，ChEN等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057，1994)，将基因治疗载体递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可在可接受的稀释剂中包含基因治疗载体，或可包含其中包埋了基因递送载体的缓释基质。DNA模板例如可包括两个转录单位，一个产生包含iRNA试剂的上链(topstrand)的转录物，一个产生包含iRNA试剂的下链(bottom strand)的转录物。当模板被转录时，iRNA试剂产生并且被加工成可以介导基因沉默的siRNA试剂片段。
制剂
本发明还包括包含本发明的dsRNA化合物的药物组合物和制剂。取决于期望局部治疗还是全身性治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本发明的药物组合物。施用可以是局部、经肺，例如，通过粉剂或气雾剂的吸入或吹入(包括利用雾化器)；气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如，鞘内(intrathecal)或脑室内施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂，霜剂，凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载体(水性的、粉末的或油基的)、增稠剂等可以是必需的或期望的。具包衣的避孕套、手套等也可以是有用的。优选的局部制剂包括其中本发明的dsRNA与局部递送剂例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂相混合的制剂。优选的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰乙醇胺＝DOPE、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱＝DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴离子的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油＝DMPG)和阳离子的(例如二油酰四甲基氨基丙基＝DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺＝DOTMA)，例如溴化(+/-)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十二烷基氧)-1-丙铵＝GAP-DLRIE)。本发明的dsRNA可被包封在脂质体中或可与其，特别是与阳离子脂质体，形成复合物。备选地，可将dsRNA复合至脂质，特别地阳离子脂质。优选的脂肪酸和酯类包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十碳烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、二月桂精、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱或C1-10烷基酯(例如异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受盐。局部制剂详细地描述于1999年5月20日提交的美国专利申请系列号09/315,298中，其以其全文通过引用合并入本文。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒、悬浮剂、或水或非水介质中的溶液、胶囊剂、凝胶胶囊剂、囊剂、片剂或小片。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期望的。优选口服制剂是其中将本发明的dsRNA与一种或多种穿透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合施用的制剂。优选表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯类或其盐、胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐包括鹅去氧胆酸(CDCA)和熊去氧胆酸(UDCA)、胆酸、去氢胆酸、去氧胆酸、甘胆酸(glucholicacid)、甘氨胆酸(glycholic acid)、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺-24，25-二氢-梭链孢酸钠和甘氨二氢梭链孢酸钠。优选的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、二月桂精、甘油1-单癸酸酯，1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱或甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受盐(例如钠盐)。还优选的是穿透促进剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。特别优选的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。另外的穿透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明的DsRNA可以以颗粒形式，包括喷雾干燥的微粒，口服递送，或可以复合以形成微粒或纳米颗粒。DsRNA复合剂(complexing agent)包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、polyoxethane、聚烷基氰丙烯酸酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亚胺、普鲁兰多糖、纤维素和淀粉。特别优选的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、多聚-L-赖氨酸、多组氨酸、多鸟氨酸、多精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、多硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如对-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂和它们的制备详细地描述于美国申请系列号08/886,829(1997年7月1日提交)、系列号09/108,673(1998年7月1日提交)、系列号09/256,515(1999年2月23日提交)、系列号09/082,624(1998年5月21日提交)和系列号09/315,298(1999年5月20日提交)，其各自以其全文通过引用合并入本文。
用于胃肠外、鞘内或室内施用的组合物可包括无菌水溶液，该无菌水溶液还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他适当的添加剂例如但不限于穿透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和包含脂质体的制剂。此类组合物可从多种组分，包括但不限于预制的液体、自乳化的固体和自乳化的半固体，产生。
可按照制药工业中公知的常规技术制备本发明的药物制剂，其可方便地以单位剂型提供。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般地，通过使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果必要的话，使产品成形，以制备制剂。
本发明的组合物可配制成多种可能剂型中的任一种，例如但不限于，片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可配制为在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可进一步包含增加悬浮液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可包含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，可以以泡沫的形式配制和使用药物组合物。药物泡沫包括诸如但不限于乳剂、微乳剂、霜剂、冻胶剂(jellies)和脂质体等制剂。虽然性质上基本相似，但这些制剂在终产物的组分和粘稠度上是不同的。此类组合物和制剂的制备对于药学和药剂学领域内的技术人员是公知的并且可用于配制本发明的组合物。
乳剂
可将本发明的组合物制备和配制为乳剂。乳剂通常是一种液体分散在另一种液体中形成直径通常大于0.1μm的小滴的非均质系统(Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199；Rosoff，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245；Block inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第2卷，p.335；Higuchi等，inRemington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.301)。乳剂通常是两相系统，包含紧密混合的并且彼此分散的两种不相混溶的液相。一般，乳剂可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)型。当水相被细分成微滴并且以微滴的形式分散入大体积的油相中时，所得的乳剂称为油包水(w/o)乳剂。备选地，当油相被细分成微滴并且以微滴形式分散入大体积水相中时，所得的组合物称为水包油(o/w)乳剂。乳剂可包含除了分散相以外的额外组分和活性药物，所述活性药物可以在水相、油相中或本身作为一个单独的相以溶液形式存在。如果需要，乳剂中还可存在药物赋形剂例如乳化剂、稳定剂、着色剂和抗氧化剂。药物乳剂还可以是多相乳剂，由两个以上的相组成，例如，在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况下。这样的复合制剂通常提供了简单的二元乳剂所没有的某些优势。在o/w乳剂的单个油小滴中包封小水滴的多相乳剂构成了w/o/w乳剂。同样，在稳定于连续油相中的小水球中包封油小滴的系统提供了o/w/o乳剂。
乳剂以极小的热力学稳定性或无热力学稳定性为特征。通常，通过乳化剂的作用或制剂的粘度，乳剂的分散相或不连续相可以充分地分散至外部相或连续相中，并且维持该形式。乳剂的任一相都可以是半固体或固体，乳剂类型的软膏基质和霜的情况也是这样。稳定乳剂的其他方法需要使用可被掺入乳剂的任一相的乳化剂。乳化剂宽范地分类为4类：合成的表面活性剂、天然乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(Idson，in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。
合成表面活性剂，也称为表面活化剂，已广泛用于乳剂配制并且已综述于文献中(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.285；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，第1卷，p.199)。表面活性剂通常是两亲性的并且包含亲水和疏水部分。表面活性剂的亲水性对疏水性的比值被称为亲水/亲油平衡值(HLB)并且是制剂的制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可基于亲水基的性质分为不同类型：非离子型、阴离子型、阳离子型和两性型(Rieger，in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.285)。
用于乳剂制剂的天然乳化剂包括羊毛脂，蜂蜡，磷脂类，卵磷脂和阿拉伯胶。吸收基质具有亲水性质，这样它们可吸收水以形成w/o乳液，但仍然保留它们的半固体稠度，例如无水羊毛脂和亲水凡士林。细碎的固体也一直被用作良好的乳化剂(尤其是与表面活性剂组合的形式)和用在粘稠制剂中。此类固体包括极性无机固体，例如重金属氢氧化物、非膨胀粘土例如膨润土、硅镁土、水辉石，高岭土，蒙脱石、胶态硅酸铝和胶态硅酸镁铝、色素，和非极性固体例如碳或三硬脂酸甘油酯。
多种多样的非乳化材料也可以包含于乳剂制剂中并且为乳剂的性质作出贡献。此类材料包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.335；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。
亲水胶体或水胶体包括天然树胶(gum)和合成聚合物，例如多糖(例如，阿拉伯胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、瓜尔豆胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(例如，卡波姆，纤维素醚和羧基乙烯基聚合物)。这些在水中分散或膨胀，从而形成胶体溶液，该胶体溶液可以通过在分散相小滴周围形成强界面膜和通过增加外相的粘度来稳定乳剂。
因为乳剂通常包含许多可容易地支持微生物生长的成分，例如碳水化合物、蛋白质、固醇和磷脂，因此这些制剂通常包含防腐剂。乳剂制剂中包含的常用防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，季铵盐，苯扎氯铵，对羟基苯甲酸的酯类和硼酸。抗氧化剂也通常加入乳剂制剂以防止制剂变质。所使用的抗氧化剂可以是自由基清除剂例如生育酚，烷基没食子酸酯，丁化羟基茴香醚，丁化羟基甲苯、或还原剂例如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂协同剂例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
通过皮肤学的、口服的和胃肠外的途径施用乳剂制剂和它们的制造方法已综述于文献中(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。用于口服递送的乳剂制剂由于容易配制以及从吸收和生物利用度的角度来看非常有效而已得到广泛使用(Rosoff，in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245；Idson，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。矿物油基轻泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂在常作为o/w乳剂口服施用的材料之列。
在本发明的一个实施方案中，将dsRNA和核酸的组合物配制为微乳剂。微乳剂可定义为水、油和两亲化合物的系统，该系统是单一光学各向同性的热力学稳定液体溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245)。典型地，微乳剂是通过如下方式制备的系统：首先将油分散在水性表面活性剂溶液中，然后加入充足量的第四组分，通常为中等链长度的醇，以形成透明系统。因此，微乳剂已被描述为不相混溶的两种液体的热力学稳定的、各向同性的清澈分散体，其通过表面活性分子的界面膜来稳定(Leung和Shah，in：Controlled Release of Drugs：Polymersand Aggregate Systems，Rosoff，M.，Ed.，1989，VCH Publishers，New York，pages 185-215)。微乳剂通常通过3至5种组分(包括油、水、表面活性剂、共表面活性剂和电解质)的组合来制备。微乳剂是油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所用的油和表面活性剂的性质以及取决于表面活性剂分子的极性头和烃尾的结构和几何包装(Schott，in Remington′sPharmaceutical SciENces，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.271)。
利用相图的现象学方法已得到了深入研究并且已为本领域技术人员产生了关于微乳剂配制的全面知识(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，第1卷，p.335)。与常规乳剂相比较，微乳剂提供了在自发形成的热力学稳定小滴制剂中溶解水不溶性药物的优势。
用于制备微乳剂的表面活性剂包括但不限于，离子型表面活性剂、非离子型表面活性、Brij 96，聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油sequioleate(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，单独地或与共表面活性剂组合。共表面活性剂，通常为短链醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，可以通过穿透入表面活性剂膜并由此导致无序膜(因在表面活性剂分子之间产生的空隙空间)而用于增加界面流动性。然而，可在不使用共表面活性剂的情况下制备微乳剂，不含醇的自乳化微乳剂系统在本领域内是已知的。水相通常可以是但不限于，水、药物、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇衍生物的水溶液。油相可包括但不限于材料例如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中等链长(C8-C12)甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯、聚氧乙基化的脂肪酸甘油酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强药物吸收的角度来看，微乳剂是特别有意义的。已经提出基于脂质的微乳(o/w和w/o)可以增强药物(包括肽)的口服生物利用度(Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993，13，205)。微乳剂提供了如下优势：提高药物溶解、防止药物被酶促水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和通透性的改变而导致的药物吸收的可能增强、易于制备、比固体剂型易于口服施用、提高的临床潜力和减少的毒性(Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11，1385；Ho等，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。当在环境温度将微乳剂的组分聚在一起时，微乳剂通常可自发形成。在配制不耐热的药物、肽和dsRNA时，这可能是特别有利的。微乳剂在化妆品和药物应用中在活性组分的透皮递送方面也一直是有效的。预期本发明的微乳剂组合物和制剂将有助于增加dsRNA和核酸从胃肠道的全身性吸收以及促进dsRNA和核酸在胃肠道、阴道、口腔和其他施用区域内的局部细胞摄取。
本发明的微乳剂还可包含额外的组分和添加剂，例如脱水山梨醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和穿透促进剂，以改善制剂的性质和增强本发明的dsRNA和核酸的吸收。用于本发明微乳剂的穿透促进剂可分类为属于以下5大类之一：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。这些类型的每一种都已在上面进行了论述。
脂质体
除了微乳剂外，还存在许多有序表面活性剂结构已被研究并且被用于药物配制。这些结构包括单层、微胶束、双层和小泡(vesicle)。小泡例如脂质体从药物递送的观点来看由于它们的特异性和它们所赋予的作用持续时间而引起了人们的极大观注。如本发明中所使用的，术语“脂质体”意指由以球形双层或双层排列的两亲性脂质组成的小泡。
脂质体是具有从亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层或多层小泡。水性部分包含待递送的组合物。阳离子型脂质体具有能够与细胞壁融合的优势。非阳离子型脂质体，虽然不能够同样有效地与细胞膜融合，但可以在体内被巨噬细胞摄取。
为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂质小泡必须在适宜的透皮递度的影响下穿过一系列细微小孔，每个小孔具有50nm以下的直径。因此，可能期望使用高度可变形的并且能够通过此类细孔的脂质体。
脂质体的另外优势包括：从天然磷脂获得的脂质体是生物相容性的和生物可降解的；脂质体可掺入多种多样的水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护封装在它们内部区室中的药物免遭代谢和降解(Rosoff，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245)。脂质体制剂的制备中，重要的考虑问题是脂质的表面电荷、小泡的大小和脂质体的水性体积。
脂质体可以用于将活性成分转移和递送至作用部位。因为脂质体膜在结构上与生物膜相似，因此当将脂质体用于组织时，脂质体开始与细胞膜发生融合，并且随着脂质体和细胞融合的进展，脂质体内容物将被排空到细胞内，在此处活性剂可以发挥作用。
脂质体制剂作为许多药物的递送模式一直是广泛研究的焦点。有越来越多的证据表明对于局部施用，脂质体提供了数种优于其他制剂的优势。这些优势包括：减少与施用药物的高全身性吸收相关的副作用、增加施用药物在期望的靶位置的累积、以及能够将多种多样的药物(亲水性和疏水性的)施用至皮肤内。
几篇报导已详述了脂质体递送药剂，包括高分子量DNA，进入皮肤的能力。已将包括镇痛药、抗体、激素和高分子量DNA在内的化合物施用至皮肤。大部分应用导致了对上表皮的靶向。
脂质体落在两个大类中。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的DNA分子相互作用，从而形成稳定的复合物。带正电荷的DNA/脂质体复合物可以结合带负电荷的细胞表面并且被内化入内体(endosome)。由于内体的酸性pH，脂质体破裂，将它们的内容物释放入细胞质(Wang等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。
pH-敏感的或带负电荷的脂质体将截留DNA而非与其复合。因为DNA和脂质体两者具有相似的电荷，因而相互排斥而非形成复合物。然而，一些DNA可以被截留在这些脂质体的水性内部。pH-敏感性脂质体已用于向培养的细胞单层递送编码胸苷激酶基因的DNA。在靶细胞中检测到了该外源基因的表达(Zhou等，Journal of Controlled Release，1992，19，269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型包括磷脂而非天然来源的磷脂酰胆碱。中性脂质体组合物例如可从二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常从二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子促融脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)，例如大豆PC和蛋PC形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇形成。
几个研究已评估了脂质体药物制剂向皮肤的局部递送。将包含干扰素的脂质体应用到豚鼠皮肤导致了皮肤疱疹疼痛的减少，而通过其他方式(例如以溶液或以乳剂的方式)进行的干扰素递送是无效的(Weiner等，Journal of Drug Targeting，1992，2，405-410)。此外，另外的研究检测了作为脂质体制剂的一部分施用的干扰素相对于使用水性系统的干扰素施用的功效，得出结论——脂质体制剂优于水性施用(du Plessis等，AntiviralResearch，1992，18，259-265)。
也已对非离子型脂质体系统，特别是包含非离子型表面活性剂和胆固醇的系统，进行了调查，以测定它们在药物的皮肤递送中的效用。包含Novasome.TM.I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和包含Novasome.TM.II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子型脂质体制剂已经用于递送环孢菌素-A入小鼠皮肤的真皮。结果显示此类非离子型脂质体系统有效地促进环孢菌素-A在皮肤的不同层中沉积(Hu等S.T.P.Pharma.Sci.，1994，4，6，466)。
脂质体还包括“立体稳定”脂质体，该术语在本文中是指包含一种或多种专门的脂质的脂质体，该专门的脂质当掺入脂质体时导致相对于缺乏此专门脂质的脂质体增加的循环寿命。立体稳定脂质体的实例是这样的脂质体，其中脂质体的形成小泡的脂质部分中有一部分(A)包含一种或多种糖脂例如单唾液酸神经节苷脂Gm1，或(B)用一种或多种亲水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)结构部分，衍生化。然而不希望受任何理论束缚，在本领域内认为，至少对于包含神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂质的立体稳定脂质体来说，立体稳定脂质体的增加的循环半衰期来源于减少的网状内皮系统(RES)细胞摄取(AllEN等，FEBS Letters，1987，223，42；Wu等，Cancer Research，1993，53，3765)。
包含一种或多种糖脂的各种脂质体在本领域内是已知的。Papahadjopoulos等(Ann.N.Y. Acad.Sci.，1987，507，64)报导了单唾液酸神经节苷酯Gm1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇提高脂质体的血液半衰期的能力。Gabizon等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，85，6949)对这些发现进行了详细说明。美国专利4,837,028和WO 88/04924，两者都属于AllEN等，公开了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂Gm1或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。美国专利5,543,152(Webb等)公开了包含鞘磷脂的脂质体。在WO 97/13499(Lim等)中公开了包含1，2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
包含用一种或多种亲水聚合物衍生的脂质的脂质体和制备其的方法在本领域内是已知的。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2778)描述了包含非离子型去垢剂2C1215G(其包含PEG部分)的脂质体。Illum等(FEBS Lett.，1984，167，79)注意到，用聚合甘醇亲水包被聚苯乙烯颗粒导致显著增加的血液半衰期。Sears(美国专利4,426,330和4,534,899)描述了通过连接聚亚烷基二醇(例如，PEG)的羧基而修饰的合成磷脂。Klibanov等(FEBS Lett.，1990，268，235)描述的实验证明包含用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体具有显著增加的血液循环半衰期。Blume等(Biochimica et Biophysica Acta，1990，1029，91)将此观察扩展至其他PEG衍生的磷脂，例如，DSPE-PEG(由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成)。在外表面上具有共价键合的PEG部分的脂质体描述在Fisher的欧洲专利EP 0 445 131 B1和WO 90/04384中。包含1-20摩尔百分比的PEG衍生的PE的脂质体组合物和其使用方法描述于Woodle等(美国专利5,013,556和5,356,633)以及Martin等(美国专利5,213,804和欧洲专利EP 0 496 813 B1)中。包含许多其他脂质-聚合物缀合物的脂质体公开于WO 91/05545和美国专利5,225,212(两者都属于Martin等)中和WO 94/20073(Zalipsky等)中。包含PEG-修饰的神经酰胺脂质的脂质体描述于WO 96/10391(Choi等)中。美国专利5,540,935(Miyazaki等)和美国专利5,556,948(Tagawa等)描述了可进一步用官能性部分在其表面上进行衍生的包含PEG的脂质体。
有限数目的包含核酸的脂质体在本领域内是已知的。Thierry等的WO96/40062公开了用于将高分子量核酸封装在脂质体中的方法。Tagawa等的美国专利5,264,221公开了蛋白质-键合的脂质体并且声称此类脂质体的内含物可包含dsRNA。Rahman等的美国专利5,665,710描述了将寡聚脱氧核苷酸封装入脂质体的某些方法。Love等的WO 97/04787公开了包含靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
转运体(transfersome)是另一类脂质体，是高度可变形的脂质聚集体，是极吸引人的药物递送运载工具候选物。转运体可描述为小液滴，其高度可变形以致于能够容易地穿过比小滴更小的小孔。转运体能够适应于使用它们的环境，例如它们可以自优化(适应于皮肤中的孔的形状)、自修复，通常到达它们的靶点而无片段化，并且通常可以自装截。为了制备转运体，可以向标准脂质体组合物中加入表面边缘激活剂(edge-activator)，通常为表面活性剂。转运体已被用于血清白蛋白的皮肤递送。血清白蛋白的转运体介导的递送已经被证实与皮下注射包含血清白蛋白的溶液一样有效。
表面活性剂广泛用于制剂例如乳剂(包括微乳剂)和脂质体。最常用的对许多不同类型的表面活性剂(天然的和合成的)的性质进行分类和评级的方法是：使用亲水/亲油平衡值(HLB)。亲水基团(也称为“头部”)的性质提供了最有用的对用于制剂的不同表面活性剂分类的方法(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285)。
如果表面活性剂分子未离子化，则其可被分类为非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂广泛用于药物和化妆品，并且可在宽广的pH值范围内使用。通常，取决于它们的结构，它们的HLB值范围在2至大约18之间。非离子型表面活性剂包括非离子酯类，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯和乙氧基化的酯。非离子型链烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段共聚物，也包括在该分类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子型表面活性剂类的最普及成员。
当表面活性剂分子溶解或分散在水中时，如果其带有负电荷，那么该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧酸盐类，例如皂、酰基乳酸盐、氨基酸的酰基酰胺类、硫酸的酯例如烷基硫酸盐和乙氧基化烷基硫酸盐，磺酸盐例如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐、及磷酸盐。阴离子表面活性剂类的最重要成员是烷基硫酸盐和皂。
当表面活性剂分子溶解或分散在水中时，如果其携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是该类的最常用成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂类。
已对表面活性剂在药物产品、制剂中以及在乳剂中的用途进行了综述(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p.285)。
穿透促进剂
在一个实施方案中，本发明使用各种穿透促进剂来实现核酸，特别是dsRNA，至动物皮肤的有效递送。大多数药物以离子化和非离子化两种形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或亲脂性药物能容易地穿过细胞膜。已发现，如果用穿透促进剂处理待跨越的细胞膜，则甚至是非亲脂药物也可穿过膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜外，穿透促进剂还增强亲脂药物的渗透性。
穿透促进剂可分类为属于5个大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非-表面活性剂(Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。下面将更详细地描述上面提及的每一类穿透促进剂。
表面活性剂：在本发明中，表面活性剂(或“surface-active agents”)是当溶解在水溶液中时可以减少溶液的表面张力或水溶液与另一种液体之间的界面张力，从而增强dsRNA通过粘膜的吸收的化学实体。除了胆汁盐和脂肪酸外，此类穿透促进剂包括例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚)(Lee等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems，1991，p.92)；和全氟化合物乳剂，例如FC-43(TakaHSAhi等，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252).。
脂肪酸：用作穿透促进剂的各种脂肪酸和它们的衍生物包括，例如油酸、月桂酸、癸酸(正-十碳烷酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯(1-单油酰基-rac-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、其C1-C10烷基醚(例如，甲基、异丙基和叔-丁基)，以及其甘油一酯和二酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carryier Systems，1991，p.92；Muranishi，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；El Hariri等，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654).
胆汁盐：胆汁的生理作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38 in：Goodman & Gilman′s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第9版，Hardman等Eds.，McGraw-Hill，New York，1996，pp.934-935)。各种天然的胆汁盐和它们的合成衍生物可以用作穿透促进剂。因此术语“胆汁盐”包括任何天然胆汁组分以及任何其合成衍生物。本发明的胆汁盐包括，例如，胆酸(或其药学上可接受的钠盐，胆酸钠)、去氢胆酸(去氢胆酸纳)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅去氧胆酸(鹅去氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24，25-二氢-梭链孢酸钠(STDHF)、甘氨二氢梭链孢酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，92页；Swinyard，Chapter 39 In：Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro，ed.，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1990，782-783页；Muranishi，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Yamamoto等，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita等，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583).
螯合剂：螯合剂，在本发明中，可定义为通过与金属离子形成络合物而从溶液中除去金属离子的化合物，结果增强了dsRNA通过粘膜的吸收。在本发明中作为穿透促进剂应用时，螯合剂还具有额外的优势：还可以充当DNA酶抑制剂，因为大多数已经表征的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并因此可以被螯合剂抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339).本发明的螯合剂包括但不限于，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠，5-甲氧基水杨酸盐和高香兰酸盐(homovanilate))、胶原蛋白的N-酰基衍生物、β-二酮(烯胺)类的月桂基醚-9(laureth-9)和N-氨基酰基衍生物(Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，page 92；Muranishi，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur等，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。
非螯合非表面活性剂：如本文所使用的，非螯合非表面活性剂穿透促进化合物可定义为没有显示显著的作为螯合剂或作为表面活性剂的活性，但却增强dsRNA通过消化道粘膜的吸收的化合物(Muranishi，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。该类型的穿透促进剂包括例如，不饱和环脲类，1-烷基-和1-链烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，page92)；和非类固醇抗炎剂例如双氯酚酸钠，吲哚美辛和二苯丁唑酮(Yamashita等，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。
还可将增强dsRNA在细胞水平上的吸收的试剂加入本发明的药物和其他组合物。例如，也已知阳离子脂质，例如lipofectin(Junichi等，美国专利5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子例如多聚赖氨酸(Lollo等，PCT申请WO 97/30731)和其他肽可以增强dsRNA的细胞摄取。
可使用其他试剂增强施用的核酸的穿透，包括甘醇类，例如乙二醇和丙二醇，吡咯类例如2-吡咯、氮卓酮类、和萜类例如苧烯和薄荷酮。
载体(carrier)
本发明的某些组合物还将载体化合物掺入在制剂中。如本文所使用的，″载体化合物″或″载体″可以指如下核酸或其类似物，所述核酸或类似物是惰性的(即，本身不具有生物活性)，但可以被如下体内过程识别为核酸，所述体内过程通过例如降解生物活性核酸或促进其从循环中清除，而降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物(通常后者过量)的共施用可导致肝、肾或其他循环外贮库中回收的核酸的量显著减少，推测原因是载体化合物与核酸之间对共同受体的竞争。例如，当与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4′异硫氰基-二苯乙烯-2，2′-二磺酸共施用时，可降低肝组织中部分硫代磷酸酯的dsRNA的回收(Miyao等，AntisENse Res.Dev.，1995，5，115-121；Takakura等，AntisENse&Nucl.Acid Drug Dev.，1996，6，177-183。
赋形剂
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药理学上惰性的媒介物，其用于将一种或多种核酸递送至动物。赋形剂可以是液体或固体，并且可按照想要的计划施用方式进行选择，以在与核酸和给定的药物组合物的其他成分组合时，提供期望的体积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于，粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉、硅藻土、二氧化硅胶体、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；和湿润剂(例如，月桂基硫酸钠等)。
还可将适于非胃肠外施用的、不与核酸发生有害反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂用于配制本发明的组合物。适当的药学上可接受的载体包括但不限于，水、盐溶液、醇类、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡油、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于核酸的局部施用的制剂可包括在常用溶剂例如醇中的无菌和非无菌水溶液、非水性溶液，或在液态或固态油基质中的核酸溶液。溶液还可包含缓冲剂、稀释剂和其他适当的添加剂。可使用适于非胃肠外施用的、不与核酸发生有害反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适宜的药学上可接受的赋形剂包括但不限于，水、盐溶液、醇类、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡油、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于呼吸道递送的药物组合物
本发明的另一个方面提供了iRNA试剂至呼吸道(特别地以治疗囊性纤维化)的递送。呼吸道包括上气道(包括口咽和喉)，然后是下气道(其包括气管，接着是进入支气管和细支气管的分叉)。上气道和下气道称为传导性气道。终末细支气管之后分成呼吸性细支气管，其然后通向最终的呼吸区、肺泡或深肺部。传导性气道的上皮是吸入的用于递送iRNA试剂例如α-ENaC iRNA试剂的治疗性气雾剂的主要靶。
肺递送组合物可通过患者吸入分散体来递送，这样分散体中的组合物，优选iRNA试剂，可到达肺，在肺中其可以例如通过肺泡区域而被容易地直接吸收进血液循环。肺递送对于治疗肺部疾病的全身性递送和局部递送都是有效的。
肺递送可通过下列不同方法来实现，包括使用雾化的、气雾化的、胶束的和基于干粉的制剂；通过吸入的施用可以是口服和/或经鼻施用。可利用液体雾化器、基于气雾剂的吸入器和干粉分散装置来实现递送。计量给药装置是优选的。使用喷雾器或吸入器的益处之一是污染的可能性减少至最低限度，因为装置是自含式的。干粉分散装置可以例如递送可容易地配制为干粉的药物。iRNA组合物可以自身以冻干的或喷雾干燥的粉末形式稳定贮存，或与适当的粉末载体组合而稳定贮存。用于吸入的组合物的递送可由给药定时元件来介导，该给药定时元件可包括定时器、剂量计数器、时间测量装置或时间指示器，当整合在装置中时其使得能够在气雾剂药物的施用过程中进行剂量跟踪、顺应性监控和/或对患者进行给药触发。
用于气雾剂递送的药用装置的实例包括计量给药吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和空气喷射雾化器。可容易地调整以适应于主题iRNA试剂的递送的示例性吸入递送系统描述于，例如，美国专利5,756,353；5,858,784；和PCT申请WO98/31346；WO98/10796；WO00/27359；WO01/54664；WO02/060412。可用于递送iRNA试剂的其他气雾剂制剂描述于美国专利6,294,153；6,344,194；6,071,497，和PCT申请WO02/066078；WO02/053190；WO01/60420；WO00/66206中。此外，用于递送iRNA试剂的方法可从用于通过吸入递送其他寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)的方法，例如Templin等，AntisENse Nucleic Acid Drug Dev，2000，10：359-68；Sandrasagra等，Expert Opin Biol Ther，2001，1：979-83；Sandrasagra等，AntisENse NucleicAcid Drug Dev，2002，12：177-81中描述的方法改造而来。
本发明试剂的递送还可包括施用所谓的“前体药物”，即治疗性物质的制剂或化学修饰——其需要受试生物体天生的系统对其进行一些形式的加工或转运，以释放，优选地在期望起作用的部位，释放治疗性物质；此后一种实施方案可以与呼吸道递送结合使用，而且也可与本发明的其他实施方案一起使用。例如，人肺可在从数分钟至数小时的时间内清除或快速降解可水解断裂的沉积气雾剂。在上气道中，纤毛上皮贡献了“粘液纤毛自动扶梯(mucociliary excalator)”，通过该粘液纤毛自动扶梯可将颗粒从气道清扫向口部。Pavia，D.，″Lung Mucociliary Clearance，″in Aerosolsand the Lung：Clinical and ExperimENtal Aspects，Clarke，S.W.和Pavia，D.，Eds.，Butterworths，London，1984。在深肺中，肺泡巨噬细胞能够在颗粒沉积后不久将其吞噬。Warheit等Microscopy Res.Tech.，26：412-422(1993)；和Brain，J.D.，″Physiology and Pathophysiology of PulmonaryMacrophages，″in The ReticuloENdothelial System，S.M.Reichard和J.Filkins，Eds.，PlENum，New.York.，pp.315-327，1985。
在优选实施方案中，特别是在期望全身性给药iRNA试剂的情况下，可以将气雾化的iRNA试剂配制为微粒。具有0.5至10微米直径的微粒可透过肺，通过大多数天然屏障。少于10微米的直径是绕开咽喉所必需的；0.5微米或更大的直径是避免被呼出所必需的。
其他成分
本发明的组合物可另外地以相应领域内建立的使用水平包含常规见于药物组合物中的其他辅助组分。因此，例如，组合物可包含另外的相容性药学活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉药或抗炎剂，或可包含另外的可以用于物理上配制各种剂型的本发明组合物的物质，例如着色剂、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类物质，当加入时，不应当过度干扰本发明组合物的成分的生物活性。可对制剂进行灭菌，必要时，可将其与不和制剂中的核酸发生有害相互作用的助剂，例如，润滑剂，防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、香料和/或芳香物质等，混合。
水性悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可包含稳定剂。
本发明的某些实施方案提供了包含(a)一种或多种dsRNA试剂和(b)一种或多种其他通过非RNA干扰机制起作用的治疗剂的药物联合和组合物。
因此，本发明包括本发明的iRNA与抗炎剂、支气管扩张剂，抗组胺剂、镇咳药、抗生素或DNA酶药物物质的联合，所述上皮钠通道阻断剂和所述药物物质存在于相同的或不同的药物组合物中。
适当的抗生素包括大环内酯类抗生素，例如，妥布拉霉素(TOBI)。
适当的DNA酶药物物质包括α链道酶(PulmozymeTM)，一种高度纯化的重组人脱氧核糖核酸酶I(rhDNA酶)溶液，其选择性切割DNA。α链道酶用于治疗囊性纤维化。
上皮钠通道阻断剂与抗炎药的其他有用组合是与趋化因子受体的拮抗剂的组合，所述趋化因子受体的拮抗剂是例如CCR-1、CCR-2、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9和CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、特别地CCR-5的拮抗剂，例如Schering-Plough拮抗剂SC-351125，SCH-55700和SCH-D；Takeda拮抗剂，例如氯化N-[[4-[[[6，7-二氢-2-(4-甲基-苯基)-5H-苯并-环庚烯-8-基]羰基]氨基]苯基]-甲基]四氢-N，N-二甲基-2H-吡喃-4-铵(TAK-770)；和USP6,166,037(特别地权利要求18和19)、WO 00/66558(特别地权利要求8)、WO 00/66559(特别地权利要求9)、WO 04/018425和WO 04/026873中描述的CCR-5拮抗剂。
适当的抗炎药包括类固醇，特别地糖皮质类固醇，例如布地萘德、倍氯美松双丙酸酯、丙酸氟地松、环索奈德或糠酸莫米他松、或WO 02/88167、WO 02/12266、WO 02/100879、WO 02/00679(特别地实施例3、11、14、17、19、26、34、37、39、51、60、67、72、73、90、99和101中的类固醇)，WO03/35668、WO 03/48181、WO 03/62259、WO 03/64445、WO03/72592、WO 04/39827和WO 04/66920中所述的类固醇；非类固醇糖皮质激素受体激动剂，例如DE 10261874、WO 00/00531、WO 02/10143、WO 03/82280、WO 03/82787、WO 03/86294、WO 03/104195、WO03/101932、WO 04/05229、WO 04/18429、WO 04/19935和WO 04/26248中所述的那些；LTD4拮抗剂，例如孟鲁司特(montelukast)和扎鲁司特(zafirlukast)；PDE4抑制剂，例如西洛司特(cilomilast，
Figure GPA00001026085100471
GlaxoSmithKline)、罗氟司特(roflumilast，Byk GuldEN)，V-11294A(Napp)、BAY19-8004(Bayer)、SCH-351591(Schering-Plough)、阿罗茶碱(arofylline，Almirall Prodesfarma)、PD189659/PD168787(Parke-Davis)、AWD-12-281(Asta Mcdica)、CDC-801(CelgENe)、SelCID(TM)CC-10004(Celgene)、VM554/UM565(Vernalis)、T-440(Tanabe)、KW-4490(Kyowa HakkoKogyo)、和WO 92/19594、WO 93/19749、WO 93/19750、WO 93/19751、WO 98/18796、WO 99/16766、WO 01/13953、WO 03/104204、WO03/104205、WO 03/39544、WO 04/000814、WO 04/000839、WO 04/005258、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO04/018431、WO 04/018449、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/019944、WO 04/019945、WO 04/045607和WO04/037805中公开的那些；腺苷A2B受体拮抗剂，例如WO 02/4229中描述的；和β-2肾上腺素受体激动，例如沙丁胺醇(柳丁氨醇(salbutamol))、异丙喘宁、叔丁喘宁、沙美特罗、非诺特罗、异丙喹喘宁，特别地、福莫特罗、卡莫特罗和其药学上可接受的盐，和WO 0075114(该资料通过引用合并入本文)的式(I)化合物(游离或盐或溶剂化物形式)，优选其实施例的化合物，特别地indacaterol和其药学上可接受的盐，以及WO 04/16601的式(I)化合物(游离或盐或溶剂化物形式)，还有EP 1440966，JP05025045、WO 93/18007、WO 99/64035、USP 2002/0055651、WO 01/42193、WO 01/83462、WO 02/66422、WO 02/70490、WO 02/76933、WO 03/24439、WO 03/42160、WO 03/42164、WO 03/72539、WO 03/91204、WO 03/99764、WO 04/16578、WO 04/22547、WO 04/32921、WO 04/33412、WO 04/37768、WO 04/37773、WO 04/37807、WO 04/39762、WO 04/39766、WO 04/45618、WO 04/46083、WO 04/80964、WO 04/108765和WO 04/108676的化合物。
适当的支气管扩张药物包括抗胆碱能或抗毒蕈碱药物，特别地异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托铵(tiotropium)盐和CHF 4226(Chiesi)以及甘罗溴铵，以及EP 424021、USP 3,714,357、USP 5,171,744、WO 01/04118、WO02/00652、WO 02/51841、WO 02/53564、WO 03/00840、WO 03/33495、WO 03/53966、WO 03/87094、WO 04/018422和WO 04/05285中描述的药物。
适当的双重抗炎和支气管扩张药物包括双重β-2肾上腺素受体激动剂/毒蕈碱拮抗剂，例如USP 2004/0167167、WO 04/74246和WO 04/74812中描述的。
适当的抗组胺药包括盐酸西替立嗪(cetirizine hydrochloride)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、富马酸氯苯苄咯(clemastine fumarate)、普鲁本近(promethazine)、氯雷他定(loratidine)、脱羧氯雷他定(desloratidine)、苯海拉明(diphenhydramine)和盐酸非索那定(fexofenadine hydrochloride)、阿伐斯丁(activastine)、阿司咪唑(astemizole)、氮卓斯汀(zaelastine)、依巴斯汀(ebastine)、依匹那丁(epinastine)、咪唑斯汀(mizolastine)和特非那丁(tefenadine)，以及JP 2004107299、WO 03/099807和WO 04/026841中公开的那些。
本发明的试剂与抗炎药物的其他有用组合是与趋化因子受体的拮抗剂的组合，所述趋化因子的拮抗剂是例如CCR-1、CCR-2、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9和CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、特别地CCR-5的拮抗剂、例如Schering-Plough拮抗剂SC-351125，SCH-55700和SCH-D；Takeda拮抗剂，例如氯化N-[[4-[[[6，7-二氢-2-(4-甲基-苯基)-5H-苯并-环庚烯-8-基]羰基]氨基]苯基]-甲基]四氢-N，N-二甲基-2H-吡喃-4-铵(TAK-770)；和USP 6,166,037(特别地权利要求18和19)、WO 00/66558(特别地权利要求8)、WO 00/66559(特别地权利要求9)、WO 04/018425和WO 04/026873中描述的CCR-5拮抗剂。
其他有用的额外治疗剂还可选自细胞因子结合分子，特别地其他细胞因子的抗体，特别地组合抗-IL4抗体(例如如PCT/EP2005/00836中所描述的)、抗-IgE抗体例如
Figure GPA00001026085100491
抗-IL31抗体、抗-IL31R抗体、抗-TSLP抗体、抗-TSLP受体抗体、抗-endoglin抗体、抗-IL1b抗体或抗-IL13抗体，如WO05/00769中所描述的。
组合的两种或更多种化合物可以于单个制剂中一起使用，分开使用，相伴使用或相继使用。
可通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测量此类化合物的毒性和治疗功效，例如以测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可表示为LD50/ED50比。展示高治疗指数的化合物是优选的。
可以使用从细胞培养物试验和动物研究获得的数据，配制一系列剂量用于人。本发明组合物的剂量通常在一个具有极小毒性或无毒性的包括ED50在内的循环浓度范围内。取决于所用剂型和所用的施用途径，剂量可在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何化合物，均可根据细胞培养试验初步估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以实现化合物或适当时，靶序列的多肽产物(例如，获得降低的多肽浓度)的如下循环血浆浓度范围，该浓度范围包括在细胞培养物中测定的IC50(即，获得症状的半最大抑制的受试化合物浓度)。该信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。可以例如利用高效液相色谱测量血浆中的水平。
除了如上所述将本发明的dsRNA单个地或多重地施用以外，还可将本发明的dsRNA与在ENaC相关病症的治疗中有效的其他已知活性剂组合施用。无论如何，施药医生可基于使用本领域内已知的或本文所述的标准功效测量法所观察到的结果，调整dsRNA施用的量和时间。
治疗方法和递送途径
可以通过多种途径，将包含iRNA试剂，例如靶向α-ENaC的iRNA试剂，的组合物递送给受试者，以实现向作用部位的局部递送或实现向受试者的全身递送。示例性途径包括对治疗部位，例如肺、鼻道的直接局部施用、以及静脉内、鼻、口和眼递送。施用本发明的iRNA试剂的优选方法是以液体、气雾剂或雾化溶液的形式对肺和鼻道直接施用。
用于吸入或胃肠性外施用的制剂在本领域内是公知的。这样的制剂可包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可包含缓冲剂、稀释剂和其他适当的添加剂。为了静脉内使用，应当控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
优选通过任何适当的方法对受试者的肺或鼻道施用本文所公开的活性化合物。可通过施用能被受试者吸入的包含活性化合物(一种或多种)的可吸入颗粒的混悬型气雾剂来施用活性化合物。可以以多种形式雾化活性化合物，例如但不限于干粉吸入剂、计量吸入剂或液体/液体悬浮剂。可吸入颗粒可以是液体或固体。颗粒可任选地包含其他治疗成分，例如氨氯吡嗪脒(amiloride)、benzamil或phenamil，其中以有效地抑制从气道粘液分泌物重吸收水的量包含该选择的化合物，如美国专利4,501,729中所描述的。
可任选地将颗粒药物组合物与载体组合以帮助分散或转运。可以以任何适当的比例(例如，按重量计算1∶1)将适当的载体例如糖(即，乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇)与活性化合物混合。
由用于实施本发明的活性化合物组成的颗粒应当包括可吸入大小的颗粒，即，颗粒大小足够小以致于可以在吸入时通过口或鼻和喉并且进入支气管和肺泡。一般地，范围在大约1至10微米大小(更特别地，小于大约5微米的尺寸)的颗粒是可吸入的。包含在气雾剂中的具有不可吸入性大小的颗粒倾向于沉积在咽喉并被吞咽，优选使气雾剂中的不可吸入性颗粒的量减少至最少。为了经鼻施用，优选使用范围在10-500um内的颗粒大小以确保停留在鼻腔中。
用于产生气雾剂的活性化合物的脂质药物组合物可通过将活性化合物与适当的媒介物例如无菌无热源水组合来制备。用于本发明的高渗盐水溶液优选是无菌无热原溶液，包含1至15％(按重量计算)的生理可接受盐，更优选按重量计算3至7％的生理可接受盐。
包含活性化合物的液态颗粒的气雾剂可通过任何适当的方法来产生，例如使用压力驱动的喷射雾化器或超声雾化器。参见，例如，美国专利4,501,729。雾化器是可商购获得的装置，其通过使压缩气体(通常是空气或氧气)加速通过狭窄的文丘里管或通过超声搅拌，将活性成分的溶液或悬浮液转化成治疗性气雾。
在雾化器中使用的适宜制剂可以由在液体载体中的活性成分组成，活性成分可以占制剂的高达40％w/w，但优选低于20％w/w。载体通常是水(最优选无菌无热原水)或稀释的水性醇溶液，优选使其与体液等渗，但可通过加入例如氯化钠使其对体液是高渗的。任选的添加剂包括防腐剂例如羟苯甲酸甲酯(如果制剂未经灭菌的话)、抗氧化剂、调味剂、挥发油、缓冲剂和表面活性剂。
包含活性化合物的固体颗粒的气雾剂同样可用任何固体颗粒治疗性气雾发生器来产生。用于将固体颗粒治疗剂施用给受试者的气雾发生器产生可吸入的颗粒，并以适于人施用的速率产生包含预定计量的治疗剂的一定体积气雾。固体颗粒气雾发生器的一个示例性类型是吹入器。通过吸入法施用的适宜制剂包含细碎的粉末，该粉末可利用吹入器递送或以鼻吸的方式吸入鼻腔。在吹入器中，粉末(例如，有效实施本文所述治疗的其计量剂量)被装在通常由明胶或塑料制造的胶囊或药筒中，所述胶囊或药筒可在原位被刺穿或打开，粉末通过在吸入时或利用手动泵抽过装置的空气来递送。用于吹入器的粉末可以只由活性成分组成或由包含活性成分、适当的粉末稀释剂例如乳糖、和任选的表面活性剂的粉末混合物组成。活性成分通常占制剂的0.1至100w/w。
第二类型的示例性气雾发生器包括计量给药吸入器。计量给药吸入器是加压的气雾分配器，通常在液化的抛射剂中包含活性成分的悬浮液或溶液制剂。在使用过程中，此类装置将制剂射过经改造适合递送计量体积(通常10至200ul)的阀门，从而产生包含活性成分的细颗粒喷雾。适当的抛射剂包括某些氯氟化碳化合物例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和其混合物。制剂可额外地包含一种或多种共溶剂，例如乙醇、表面活性剂例如油酸或脱水山梨糖醇三油酸酯、抗氧化剂和适当的调味剂。
可将iRNA试剂掺入适于施用的药物组合物中。例如，组合物可包含一种或多种iRNA试剂和药学上可接受的载体。如本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意在包括可与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类用于药物活性物质的介质和试剂的使用在本领域内是公知的。除非与活性化合物不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本发明组合物中。也可将增补性活性化合物掺入组合物。
可由受试者或由另一个人例如看护者提供施用。看护者可以是参与照料该人的任何实体：例如医院、收容所、医生办公室、门诊部；健康护理工作者，例如医生、护士或其他执业者；或配偶或监护人例如父母。可以以测量好的剂量提供药物，或在递送计量剂量的分配器中提供药物。
术语“治疗有效量”是指存在于组合物中的、为在待治疗的受试者中提供期望的药物水平以产生预期的生理反应所需的量。
术语“生理有效剂量”是指递送给受试者以产生期望的缓解性或治愈性效果的量。
术语“药学上可接受的载体”意指载体可被吸入肺而对肺无显著有害的毒理作用。
术语“共施用”是指对受试者施用两种或更多种活性剂，特别地两种或更多种iRNA试剂。这些活性剂可包含在单个药物组合物中并且同时施用，或可包含在分开的制剂中，并且相继对受试者施用。只要两种活性剂可同时在受试者中被检测到，那么就说这两种活性剂是共施用的。
用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂例如人血清白蛋白(HSA)、填充剂例如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐例如氯化钠；等。这些载体可以以晶体或无定形的形式存在或可以是两者的混合物。
特别有价值的填充剂包括相容的碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合。适宜的碳水化合物包括单糖例如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、海藻糖等；环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖，例如棉子糖、麦芽糖糊精、葡聚糖等；糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇等。优选类型的碳水化合物包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精和甘露糖醇。适当的多肽包括阿斯巴甜。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，甘氨酸是优选的。
适宜的pH调节剂或缓冲剂包括从有机酸和碱制备的有机盐，例如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；柠檬酸钠是优选的。
剂量
可以以低于大约75mg/kg体重，或低于大约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重，以及低于200nmol的iRNA试剂(例如，大约4.4x 1016拷贝)/kg体重，或低于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmol的iRNA试剂/kg体重的单位剂量，施用iRNA试剂。例如，可通过注射(例如，静脉内或肌内、鞘内或直接至器官内)、吸入给药或局部应用来施用单位剂量。
剂量可以是有效地治疗或预防疾病或病症的量。其可以预防性提供或作为治疗方案的主体或一部分提供。
在一个实施方案中，单位剂量施用频率低于一天一次，例如，低于每2、4、8或30天一次。在另一个实施方案中，不按频率(例如，不定期)施用单位剂量。例如，单位剂量可以一次施用。因为iRNA试剂介导的沉默可在施用iRNA试剂组合物后持续数天，因此在许多情况下，可以以低于每天一次的频率施用组合物，或者对于一些情况，对于整个治疗方案，只施用一次。
在一个实施方案中，给受试者施用iRNA试剂，例如双链iRNA试剂或siRNA试剂(例如，前体，例如可被加工成siRNA试剂的更大iRNA试剂，或编码iRNA试剂，例如双链iRNA试剂或siRNA试剂或其前体的DNA)的起始剂量，和一个或多个维持剂量。维持剂量(一个或多个)通常低于起始剂量，例如比起始剂量少一半。维持方案可包括用范围在0.01至75mg/kg体重/天，例如70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重/天的剂量(一个或多个)治疗受试者。优选维持剂量的施用不超过每5天、10天或30天一次。此外，治疗方案可持续一段时间，该时间将视具体疾病的性质、其严重度和患者的总体状况而变。在优选实施方案中，剂量的递送可以不超过每天1次，例如不超过每24、36、48或更多小时1次，例如不超过每5天或8天1次。在治疗后，可就患者的状况的变化和就疾病状态的症状的缓和来监控患者。可以在患者对当前剂量水平没有产生显著反应的情况下，增加化合物的剂量，或者在观察到疾病状态的症状缓和时，在疾病状态已消除时、或在观察到不期望的副作用时，减少剂量。
有效剂量可以，按需或在特定情况下认为适当时，以单剂量或以两个或更多个剂量施用。如果期望有利于重复的或频繁的输注，植入递送装置例如泵、半永久性支架(stent)(例如，静脉内、腹膜内、池内或囊内)可能是值得推荐的。
在成功地治疗后，可能期望使患者经历维持疗法以防止疾病状态的复发，其中本发明的化合物以范围在0.001g至100g/kg体重的维持剂量施用(参见US 6,107,094)。
iRNA试剂组合物的浓度是足以在人中有效地治疗或预防病症或调节生理状况的量。施用的iRNA试剂的浓度或量将取决于针对该试剂和施用方法(例如鼻、口腔或肺施用)所确定的参数。例如，鼻制剂倾向于需要浓度低得多的一些成分以避免刺激或灼烧鼻道。有时期望稀释口服制剂多达10至100倍以提供适当的鼻制剂。
某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重度、之前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄和存在的其他疾病。也将认识到，用于治疗的iRNA试剂例如siRNA的有效剂量可在特定的治疗过程中增加或减少。剂量的变化可由诊断试验的结果导致并变得显而易见。例如，可在施用iRNA试剂组合物后监控受试者。基于来自监控的信息，可施用额外量的iRNA试剂组合物。
剂量取决待治疗的疾病状况的严重度和反应性，疗程持续数天至数月，或直至治愈或实现疾病状况的减轻。最佳给药方案可根据药物在患者体内的积累的测量结果来计算。本领域技术人员可容易地确定最佳剂量、剂量给药方法和重复速率。最佳剂量可视各单个化合物的相对效力而变化，并且通常可基于在体外和体内动物模型(如上所述的)中发现有效的EC50来估计。
如本文所述的本发明iRNA试剂可用于治疗和预防(在适宜的情况下)任一下列疾病/病症：囊性纤维化、利德尔综合征、肾机能不全、高血压、电解质失衡。
特别地在一些实施方案中，本发明的iRNA试剂可用于治疗和/或预防这些疾病/病症的不良临床表现。
通过下列不应当解释为限制性的实施例，进一步举例说明本发明。
实施例
试剂来源
在本文未明确给出试剂来源的情况下，此类试剂可根据分子生物学中应用的质量/纯度标准从任何分子生物学试剂提供商处获得。
实施例1：序列的选择
为了鉴定下调上皮钠通道ENaC的α亚基(α-ENaC)表达的治疗性siRNA，基于生物信息学分析确定筛选组。设计该筛选组的关键驱动因素是预测的siRNA针对相关物种的转录组的特异性。为了鉴定α-ENaCsiRNA和有效的递送系统，使用了一个三管齐下的方法：选择大鼠作为受试物种以着眼于在气管内递送后体内的沉默功效，而选择豚鼠作为疾病模型生物以证明α-ENaC mRNA的降低导致可测量的功能效应。治疗性siRNA分子必须靶向人α-ENaC以及至少一种毒理学相关物种(在本案中为恒河猴)的α-ENaC序列。
相关α-ENaC mRNA序列的初步分析揭示，几乎不能鉴定到既满足特异性的需要同时又在所有相关物种中靶向α-ENaC mRNA的序列。因此，决定针对治疗性siRNA和针对替代物分子设计独立的筛选组以在相关疾病模型中接受检测(表1A，1B，1C和1D)。
由于人细胞培养系统(H441，参见下面)被选择用于测定体外活性，故所有siRNA均识别人α-ENaC序列。因此所有siRNA均可在治疗背景中用于靶向人α-ENaC mRNA。
治疗性筛选组经设计只包含与人和恒河猴α-ENaC序列完全互补的siRNA序列。
靶向α-ENaC的siRNA(SCNN1A)的设计和in silico选择
进行siRNA设计以鉴定用于4个之前确定的组的siRNA(参见上面)
a)“起始筛选组”
b)“扩展筛选组”
c)“用于大鼠的体内替代物组”
d)“用于豚鼠的体内替代物组”。
起始筛选组
起始筛选组的in silico选择目标是鉴定特异地靶向人α-ENaC以及其恒河猴直系同源物的siRNA。在整个siRNA选择过程中，从NCBI来源(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？CMD＝search&DB＝nucleotide)下载人靶mRNA(NM_001038.4)。为了鉴定该α-EnaC的恒河猴(Macaca mulatta)直系同源物，使用该人序列在Baylor医药大学(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast/？organism＝Mmulatta)针对截止到2004年10月01日的恒河猴重叠群(Mmulatta contig)进行Blastn搜索。提取所有命中区域，然后利用CAP组装工具进行组装，从而产生第一装配序列。此外，使用该人序列在UCSC(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/ hgBlat？command＝start&org＝Rhesus&db＝rheMac2&hgsid＝84859356)针对 2005年3月12日Rhesus Freeze进行BLAST搜索。下载scaffold hit 84554，通过CAP用于与第一装配序列一起产生最终的恒河猴α-ENaC共有序列。
在从人mRNA中提取出所有重叠的19mer序列后，鉴定在装配的恒河猴共有序列中具有相同序列的保守19mer。这些19mer序列被定义为人-恒河猴交叉反应性siRNA(有义)序列库，其由1185个19mer代表。
产生相应的反义序列并就在人中对其特异性进行检测。为此，将预测的它们与不相关靶mRNA相互作用的潜能(脱靶潜能)取作参数。具有低脱靶潜能的序列被确定为优选的并预测具有更高特异性。
为了进一步选择，根据预测的候选siRNA与其他宿主序列(在此为，但不限于，人)相互作用的潜能，对候选siRNA评级。具有低脱靶潜能的siRNA被假定为在体内更具特异性。为了预测siRNA-特异的脱靶潜能，进行了下列假设：
1)链的脱靶潜能可根据针对脱靶的错配的数目和分布来推导
2)最相关的脱靶，即由于对错配的耐受性而被预测具有最高的被沉默的概率的基因，决定链的脱靶潜能
3)链的位置2至9(按5′至3′计数)(种子区域)可比序列的其余部分(即，非种子和切割位点区域)对脱靶潜能有更大的贡献(Haley，B.，和Zamore，P.D.，Nat Struct Mol Biol.2004，11：599)。
4)链的位置10和11(按5′至3′计数)(切割位点区域)可比非种子区域(即位置12至18，按5′至3′计数)对脱靶潜能有更大的贡献
5)各链的位置1和19与脱靶相互作用不相关
6)脱靶潜能可用最相关脱靶的脱靶分数来表示，脱靶分数在考虑假设3-5的情况下，基于链与脱靶基因中最高同源区域的错配数目和位点来计算。
7)假定导入的内部修饰对有义链活性的潜在消除，则只有反义链的脱靶潜能是相关的。
为了鉴定潜在的脱靶基因，将19mer反义序列针对可公共获得的人mRNA序列(假定代表人全部转录组)进行同源性搜索。
为了实现该目的，使用所有19mer序列针对人RefSeq数据库(2005年11月18日从ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/可获得的版本)进行fastA(版本3.4)搜索。使用参数——值-对——f 30-g 30进行FastA搜索，以考虑在无任何空位的情况下的19mer全长上的同源性。此外，为了确保所有相关脱靶命中事件都列于fastA输出文件中，使用了参数E 15000。
针对每个输出序列，搜索产生了一列潜在的脱靶，按照下降的与全长19mer的序列同源性列出。
为了按照假定3至5对所有潜在的脱靶进行评级，以及据此鉴定最相关的脱靶基因和其脱靶分数，利用perl script对fastA输出文件进行分析。
Script针对每一个19mer输出序列以及每一个脱靶基因提取出下列脱靶性质，以计算脱靶分数：
●非种子区域中的错配数目
●种子区域中的错配数目
●切割位点区域中的错配数目
通过考虑假定3至5分，如下计算了脱靶分数：
脱靶分数＝种子错配的数目＊10
        +切割位点错配的数目＊1.2
        +非种子错配的数目＊1
每个19mer序列的最相关脱靶基因被定义为具有最低脱靶分数的基因。因此，最低脱靶分数被定义为代表每个siRNA(由分析的19mer反义序列代表)的脱靶潜能。
计算的脱靶潜能被用作分选参数(按脱靶分数递减)，以对所有人-恒河猴交叉反应性siRNA序列产生评级。
3或更高的脱靶分数被确定为siRNA选择的前提条件，然而连续包含4或更多个G(poly-G序列)的所有序列被排除，这导致总共152个靶向人和恒河猴ENaCα的siRNA的选择(参见表1a)。
扩展筛选组
扩展筛选组的in silico选择的目标是鉴定具有足够特异性的靶向人α-ENaC的所有其他siRNA，这些siRNA由于缺少与恒河猴的交叉反应性而被排除在起始组外。采用源于人α-ENaC的19mer库中之前还未进行过分析的其余序列，产生相应的反义序列。如“起始筛选组”部分中所述，计算最相关的脱靶基因和其相应脱靶分数。
为了测定与小鼠和豚鼠(荷兰猪(Cavia porcellus)/天竺鼠(cobya))的交叉反应性，从NCBI核苷酸数据库1下载了这些物种的α-ENaC序列(分别地，登录号NM_011324.1和AF071230(全长)/DQ109811(部分cds))。两个豚鼠序列用于产生豚鼠α-ENaC共有序列。检测每一个人19mer序列在小鼠和豚鼠序列中的存在。阳性序列被分配至人-小鼠交叉反应性siRNA(有义)序列库，或人-豚鼠交叉反应性siRNA(有义)序列库。在排除所有poly-G序列后，选择具有3或更高的脱靶分数的序列，以及具有2.2或2.4的脱靶分数并且与小鼠、恒河猴或豚鼠具有交叉反应性的序列。扩展筛选库中siRNA的总数是344(参见表1b)。
体内大鼠替代物组
体内大鼠替代物组的in silico选择的目标是鉴定在大鼠中具有足够特异性的靶向人和大鼠α-ENaC的所有siRNA。为了鉴定人-大鼠交叉反应性siRNA，从NCBI核苷酸数据库(登录号，NM_031548.2)下载大鼠α-ENaC mRNA序列，然后从人19mer库中检测出存在于大鼠序列中的所有序列，代表人-大鼠交叉反应性siRNA(有义)序列库。
产生相应的反义序列并在大鼠中对其特异性进行检测。为此，使用大鼠mRNA组(RefSeq数据库)而非人转录物，如“起始筛选组”部分中所述，计算了大鼠中的最相关脱靶基因和其相应的脱靶分数。在排除所有poly-G序列后，通过第一优先考虑大鼠脱靶分数以及第二优先考虑人脱靶分数，产生了评级。最终选择了该列表的最前部的48个序列，代表体内大鼠替代物组(参见表1c)。
体内豚鼠替代物组
体内豚鼠替代物组的in silico选择的目标是鉴定未在前述组中被选择的、靶向人和豚鼠α-ENaC的所有siRNA。按照人脱靶分数，对之前确定的人-豚鼠交叉反应性siRNA(有义)序列组中的剩余siRNA进行评级。选择最靠前的63个序列(排除poly-G序列)，代表体内豚鼠替代物组(参见表1d)。
实施例2：siRNA合成
包含天然碱基的核苷酸的合成
由于来自筛选组的siRNA都潜在地旨在用于体内施用，因此利用保护siRNA免受生物环境中的核酸内切酶和核酸外切酶降解的改良策略，合成了siRNA。在该策略中，利用3′-末端最后两个核酸碱基之间的硫代磷酸酯连接来保护两条链的3′-末端免受3′-＞5′-外切核酸活性。为了抑制siRNA的内切核酸降解，将siRNA的有义链中的所有嘧啶用相应的2′-O-甲基-修饰的核糖核苷酸替代。为了减少反义链(其是更具活性的链，从而对修饰更敏感)中修饰的数目，我们利用2′-O-甲基只对之前鉴定的主要核酸酶切割位点中的嘧啶进行了修饰。主要的切割位点是下列两个序列基序：5′-UA-3′和5′-CA-3′。
由于还考虑到在潜在地保护RNA免受肺中核酸水解生物环境影响的制剂中使用siRNA，因此也合成了无任何内切核酸降解保护的相同siRNA组。
在试剂的来源未在本文中明确给出的情况下，这样的试剂可以根据用于分子生物学的质量/纯度标准从任何分子生物学试剂提供商获得。
使用Expedite 8909合成仪(Applied Biosystems，Applera DeutschlandGmbH，Darmstadt，Germany)，以可控多孔玻璃(CPG，
Figure GPA00001026085100601
ProligoBiochemic GmbH，Hamburg，Germany)作为固相支持物，以1μmole级固相合成产生单链RNA。分别利用相应的亚磷酰胺和2′-O-甲基亚磷酰胺(Proligo Biochemie GmbH，Hamburg，Germany)通过固相合成产生RNA和包含2′-O-甲基核苷酸的RNA。使用标准核苷亚磷酰胺化学(例如Current protocols in nucleic acid chemistry，Beaucage，S.L.等(Edrs.)，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA中描述的)，将这些构件掺入寡核糖核苷酸链序列中的选定位点。通过用Beaucage试剂(Chruachem Ltd，Glasgow，UK)在乙腈(1％)中的溶液替代碘氧化剂溶液，导入硫代磷酸酯连接。可从Mallinckrodt Baker(Griesheim，Germany)获得其他辅助试剂。
按照已建立的方法对粗制寡核糖核苷酸进行去保护和利用阴离子交换HPLC进行纯化。使用分光光度计(DU 640B，Beckman Coulter GmbH，Unterschleiβheim，Germany)测量各RNA溶液在260nm波长处的UV吸收，由此确定产率和浓度。通过在退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH 6.8；100mM氯化钠)中混合等摩尔的互补链溶液，在85-90℃水浴中加热3分钟，然后经3至4小时冷却至室温，产生双链RNA。将退火的RNA溶液稀释至50μmole双链RNA/L的浓度，然后在使用前在-20℃贮存。
实施例3：siRNA的体外检测
在人细胞系中体外检测或在大鼠中体内检测iRNA试剂抑制α-ENaC表达的能力。通过例如转染将iRNA试剂转染入细胞，允许其作用于细胞一定时间，例如，24小时，然后通过分支-DNA分析来测定α-ENaC mRNA的水平。备选地，通过气管内途径体内施用iRNA试剂，然后通过对靶器官进行分支-DNA分析来测定α-ENaC mRNA表达的抑制。作为这些直接测定法的补充，我们针对哺乳动物宿主细胞中重组表达的α-ENaCmRNA，检测了RNAi试剂对靶基因表达的抑制。
细胞系
从美国典型培养物保藏中心(ATCC-号：HTB-174，LCG PromochemGmbH，Wesel，Germany)获得H441细胞，将其在37℃于5％CO2/95％空气下培养于RPMI 1640，10％胎牛血清，100u青霉素/100μg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10nM Hepes和1mM丙酮酸钠(全部来自Biochrom AG，Berlin，Germany)中。
从Cambrex(Cat#CC-2540)获得原代人支气管上皮细胞，将其常规培养在具有singlequots(Cambrex Cat#CC-3170减去三碘苏氨酸)的BEGM培养基中。为了在气液界面极化和生长，将细胞培养在BEGM∶DMEM的1∶1混合物中，所述混合物补充有4.5g/L D-葡萄糖(Gibco BRL Cat # 41965-039)和补充有singlequot(Cambrex Cat #CC-4175)，如上但除去了三碘苏氨酸和GA1000等分试样并且存在50μg/mL庆大霉素(Gibco Brl Cat # 10131-015)。由于细胞维持在无血清培养基中，因此在传代步骤中使用胰蛋白酶中和溶液(Cambrex Cat # CC-5002)。为了在气-液界面极化和培养，将细胞培养在半透性(0.4微米)聚碳酸酯支持物(Corning Costar Cat # 3407 #3460)上，并且始终在37℃、5％CO2/95％空气下培养。
将Cos-1非洲绿猴肾细胞(ATCC # CRL-1650)培养在Dulbecco’sMEM，4.5g/L葡萄糖，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠(Gibco BRL)，100u青霉素/100μg/mL链霉素中。
实施例3.1：在H441中体外筛选活性α-ENaC siRNA和测定IC50
在转染前1天，通过加入100nM地塞米松在H441细胞(ATCC-号：HTB-174，LCG Promochem GmbH，Wesel，Germany)中诱导ENaC-α表达。即将转染前，在96孔板(Greiner Bio-One GmbH，Frickenhausen，Germany)上，将细胞以1.5x 104个细胞/孔接种在75μL生长培养基(RPMI1640，10％胎牛血清，100u青霉素/100μg/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，10nM Hepes和1mM丙酮酸钠，全部来自Biochrom AG，Berlin，Germany)中。以一式四份重复进行转染。对于每一个孔，将0.5μL Lipofectamine2000(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)与12μL Opti-MEM(Invitrogen)混合并且在室温温育15分钟。对于在100μL转染体积中50nM的siRNA浓度，每孔将1μL的5μM siRNA与11.5μL Opti-MEM混合，与Lipofectamine2000-Opti-MEM混合物组合，然后再于室温温育15分钟。将siRNA-Lipofecta mine2000-复合物完全(每孔各25μL)用于细胞，将细胞在37℃和5％CO2下于潮湿的培养箱(Heraeus GmbH，Hanau)中温育24小时。
通过对每一个包含100μL生长培养基的孔使用50μL裂解混合物(来自Genospectra，Fremont，USA的QuantiGene bDNA-试剂盒的内含物)，收获细胞，并53℃裂解30分钟。之后，将50μL裂解物与特异于人ENaC-α和人GAPDH的探针组(探针组的序列参见下面)一起温育，并且按照QuantiGen e的厂商说明书进行反应。最后，在Victor2-Light(Perkin Elmer，Wiesbaden，Germany)中以RLU(相对光单位)测量化学发光，将使用hENaC探针组获得的值相对于各孔的相应GAPDH值进行标准化。将利用抗ENaC-α的siRNA获得的值与利用非特异性siRNA(抗HCV)获得的值(被设定为100％)关联起来。siRNA实例的α-ENaC残留表达百分比示于表1A-1D。
通过剂量响应曲线进一步表征来自该筛选的有效siRNA。按照上述方案以下列浓度进行剂量响应曲线的转染：100nM，16.7nM，2.8nM，0.46nM，77picoM，12.8picoM，2.1picoM，0.35picoM，59.5fM，9.9fM和模拟品(无siRNA)，用Opti-MEM稀释至12.5μl的终浓度。使用MicrosoftExcel add-in软件XL-fit 4.2(IDBS，Guildford，Surrey，UK)和应用S型曲线模型Number 606进行数据分析。
探针组：
人α-ENaC：
FPL名称     成员         功能  序列                                              SEQ.I.D.NO：
hENAC001    .235.255.CE  CE    gtctgtccagggtttccttccTTTTTctcttggaaagaaagt        1645
hENAC002    .274.293.CE  CE    actgccattcttggtgcagtTTTTTctcttggaaagaaagt         1646
hENAC003    .344.367.CE  CE    ctctcctggaagcaggagtgaataTTTTTctcttggaaagaaagt     1647
hENAC004    .391.411.CE  CE    gccgcggatagaagatgtaggTTTTTctcttggaaagaaagt        1648
hENAC005    .501.521.CE  CE    gcacttggtgaaacagcccagTTTTTctcttggaaagaaagt        1649
hENAC006    .539.560.CE  CE    agcagagagctggtagctggtcTTTTTctcttggaaagaaagt       1650
hENAC007    .256.273.LE  LE    cgccataatcgcccccaaTTTTTaggcataggacccgtgtct        1651
hENAC008    .368.390.LE  LE    cacagccacactccttgatcatgTTTTTaggcataggacccgtgtct   1652
hENAC009    .412.431.LE  LE    acagtactccacgttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct      1653
hENAC010    .455.477.LE  LE    ggagcttatagtagcagtaccc cTTTTTaggcataggacccgtgtct  1654
hENAC011    .522.538.LE  LE    acgctgcatggcttccgTTTTTaggcataggacccgtgtct         1655
hENAC012    .561.580.LE  LE    gagggccatcgtgagtaaccTTTTTaggcataggacccgtgtct      1656
hENAC013    .214.234.BL  BL    Tcatgctgatggaggtctcca                             1657
hENAC014    .294.318.BL  BL    Ggtaaaggttctcaacaggaacatc                         1658
hENAC015    .319.343.BL  BL    Cacacctgctgtgtgtactttgaag                         1659
hENAC016    .432.454.BL  BL    Caggaactgtgctttctgtagtc                           1660
hENAC017    .478.500.BL  BL    Gtggtctgaggagaagtcaacct                           1661
hENAC018    .581.599.BL  BL    Ccattcctgggatgtcacc                               1662
人GAPDH：
FPL名称    成员                 功能  序列                                           SEQ.I.D.NO：
hGAP001    AF261085.252.271.CE  CE    gaatttgccatgggtggaatTTTTTctcttggaaagaaagt      1663
hGAP002    AF261085.333.352.CE  CE    ggagggatctcgctcctggaTTTTTctcttggaaagaaagt      1664
hGAP003    AF261085.413.431.CE  CE    ccccagccttctccatggtTTTTTctcttggaaagaaagt       1665
hGAP004    AF261085.432.450.CE  CE    gctcccccctgcaaatgagTTTTTctcttggaaagaaagt       1666
hGAP005    AF261085.272.289.LE  LE    agccttgacggtgccatgTTTTTaggcataggacccgtgtct     1667
hGAP006    AF261085.290.310.LE  LE    gatgacaagcttcccgttctcTTTTTaggcataggacccgtgtct  1668
hGAP007    AF261085.311.332.LE  LE    agatggtgatgggatttccattTTTTTaggcataggacccgtgtct 1669
hGAP008    AF261085.353.372.LE  LE    gcatcgccccacttgattttTTTTTaggcataggacccgtgtct   1670
hGAP009    AF261085.373.391.LE  LE    cacgacgtactcagcgccaTTTTTaggcataggacccgtgtct    1671
hGAP010    AF261085.451.472.LE  LE    ggcagagatgatgacccttttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1672
hGAP011    AF261085.392.412.BL  BL    Ggtgaagacgccagtggactc                          1673
siRNA实例的IC50示于表2A和2B。
实施例3.2：原代人支气管上皮模型中瞬时α-EnaC降低：
在转染前1天，在24孔板中将人支气管上皮细胞(供体参考号4F1499)以1x105个细胞/孔接种在0.5mL生长培养基中。在siRNA转染当天细胞达到70％的汇合。
将各siRNA以100nM重悬浮于1mL Optimem I(Invitrogen)中，并在分开的管中，将Lipofectamine 2000(Invitrogen)于Optimem中稀释至6μL/mL，从而产生足以在24孔板中用于一式四份重复转染的量。在室温下5分钟后，组合混合物以产生期望的终浓度，50nM siRNA和3μL/mLLipofectamine 2000。在室温再温育转染混合物20分钟，按照实验设计的规定向每孔中加入420μL该siRNA/试剂复合物。轻轻摇动板以确保完全混合，然后在37℃于培养箱中在5％CO2/95％空气下温育4小时。随后，吸出转染混合物，使细胞返回正常培养条件再20小时。
制备用于分支-DNA分析的细胞裂解物。制备2∶1培养基∶裂解缓冲液(Panomics)混合物，将细胞在200μL中于53℃裂解30分钟。在目测完全裂解后，将细胞裂解物于-80℃贮存以待以后分析。如上所述进行分支-DNA分析，针对GAPDH对α-ENaC表达进行标准化。所使用的分支DNA分析方案与上述方案的不同仅在于在本情况下每孔应用20μL样品。
表2C显示针对siRNA实例在原代HBEC中的α-ENaC表达。
实施例3.3：Cos-1细胞中选择的RNAi试剂对外源表达的克隆食蟹猴 α-ENaC基因表达的体外抑制
食蟹猴α-ENaC序列的克隆
用于扩增5′-UTR和CDS的引物序列(括号内显示的核苷酸相应于Macaca mulatta(恒河猴)的α-ENaC cDNA序列)：
P745：5′-CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3′(nt 1427)(SEQ.I.D.NO：1674)
P733：5′-CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3′(nt 1)(SEQ.I.D.NO：1675)
P734：5-CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3′(nt17)(SEQ.I.D.NO：1676)
P735：5′-GGCCGCTGCACCTGTAGGG-3′(nt 28)(SEQ.I.D.NO：1677)
用于扩增CDS和3′-UTR的引物序列：
P737：5′-ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3′(nt1422)(SEQ.I.D.NO：1678)
P740：5′-TTGAGCATCTGCCTACTTG-3′(nt 3113)(SEQ.I.D.NO：1679)
用于扩增CDS的内部部分的引物序列：
P713：5′-5’-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3’(nt 1182)(SEQ.I.D.NO：1709)
P715：5′-5’-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3’(nt 2108)(SEQ.I.D.NO：1680)
食蟹猴(Macaca fascicularis)的肺总RNA(#R1534152-Cy-BC)购自BioCat(Germany)。使用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)进行cDNA的合成。使用随机六聚物或寡dT引物进行cDNA的合成。此外，食蟹猴肺第一链cDNA也购自BioCat/#C1534160-Cy-BC)。为了进行PCR扩增，使用Advantage 2PCR试剂盒(#K1910-1，Clontech)。使用P745和等摩尔的P733、P734和P735的混合物进行5’-UTR和CDS的部分的扩增。为了PCR扩增CDS和3’-UTR，使用引物P737和P740。引物P713和P715用于扩增CDS的部分。
通过琼脂糖凝胶电泳分析所有PCR产物，然后使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将其克隆在pCR2.1载体中于TOP10细菌中。然后挑取克隆，使用Qiagen Miniprep试剂盒分离DNA。在用EcoRI进行限制性内切酶降解后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。将来自正确克隆的DNA测序。
然后将序列与恒河猴的α-ENaC cDNA序列比对，将各单个克隆的序列相互比对。然后如下克隆全长食蟹猴α-ENaC cDNA：用EcoR I和Not I消化5’-部分(5’-UTR和CDS，克隆55)，利用Not I和BstE II消化CDS的中间部分(克隆15)，以及用BstE II和EcoR V消化3’-部分(CDS和3’-UTR)(克隆80)。然后将消化的DNA片段亚克隆入用EcoR I和EcoR V消化的pcDNA3.1。然后将pcDNA3.1中的全长食蟹猴α-ENaC cDNA进行全长测序(Ingenetix，Vienna，Austria)。食蟹猴α-ENaC cDNA序列相应于恒河猴α-ENaC cDNA序列的nt 28-3113。最后通过用BamH I和EcoRV消化，从pcDNA3.1-食蟹猴α-ENaC切取食蟹猴α-ENaC cDNA，然后亚克隆入载体pXOON。图1中给出了质粒图谱。图2描述了食蟹猴α-ENaC的蛋白质(SEQ.I.D.NO：1681)和DNA(SEQ.I.D.NO：1682)序列。
转染：
在24孔板上，将COS-1细胞以6x104个细胞/孔接种在0.5mL生长培养基中。在接种后1天，用pXOON食蟹猴α-ENaC表达质粒和所示的siRNA共转染细胞。对于每一个孔，4ng α-ENaC表达质粒和600ng载体质粒(pNFAT-luc)与相关siRNA(终浓度45nM)进行共转染，其中在720μL总体积/孔Opti-MEM(Invitrogen)中以3.75μL/孔使用X-treme基因转染试剂(Roche)。
对于各样品以一式三份重复进行转染。如下制备质粒/siRNA母混合液(mastermix)(每一个用于3.5个孔)：在总体积210μL(Opti-MEM)中14ng α-ENaC表达质粒，2.1μg载体质粒和112pmole相关siRNA。制备用于整个转染的脂质母混合液(mastermix)(105μl脂质+1575μl Opti-MEM用于8个一式三份重复转染样品)。将质粒/siRNA和脂质以等体积混合以产生总体积420μl的转染混合物/一式三份重复样品(3.5x)。在室温温育20分钟后，向每一个孔的细胞加入120μL的相关转染混合物，终转染体积720μl(Opti-MEM)。将细胞在潮湿的培养箱(Heraeus GmbH，Hanau，Germany)中于37℃和5％CO2下转染24小时，然后收获以进行分支-DNA分析。
制备用于分支DNA分析的细胞裂解物。制备2∶1的培养基：裂解缓冲液(Panomics)混合物，将细胞在200μL中于53℃裂解30分钟。在目测完全裂解后，将细胞裂解于-80℃贮存以待以后分析。如上所述进行分支-DNA分析，并针对来自表达质粒的eGFP，对食蟹猴α-ENaC表达进行标准化。所用的分支-DNA分析方案与上述方案的不同只在于在本情况下对每一个孔应用20μL的样品。
探针组：
食蟹猴α-ENaC：
FPL名称     功能  序列                                         SEQ.I.D.NO：
cyENa001    CE    cgccgtgggctgctgggTTTTTctcttggaaagaaagt       1683
cyENa002    CE    ggtaggagcggtggaactcTTTTTctcttggaaagaaagt     1684
cyENa003    CE    cagaagaactcgaagagctctcTTTTTctcttggaaagaaagt  1685
cyENa004    CE    cccagaaggccgtcttcatTTTTTctcttggaaagaaagt     1686
cyENa005     LE    ggtgcagagccagagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt        1687
cyENa006     LE    gtgccgcaggttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct        1688
cyENa007     LE    gatcagggcctcctcctcTTTTTaggcataggacccgtgtct       1689
cyENa008     LE    ccgtggatggtggtattgttgTTTTTaggcataggacccgtgtct    1690
cyENa009     LE    gcggttgtgctgggagcTTTTTaggcataggacccgtgtct        1691
cyENa0010    LE    ttgccagtacatcatgccaaaTTTTTaggcataggacccgtgtct    1692
cyENa0011    BL    acaccaggcggatggcg                                1693
eGFP：
FPL名称     功能  序列                                            SEQ.I.D.NO：
EGFP001     CE    ggcacgggcagcttgcTTTTTctcttggaaagaaagt           1694
EGFP002     CE    ggtagcggctgaagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt        1695
EGFP003     CE    cctggacgtagccttcgggTTTTTctcttggaaagaaagt        1696
EGFP004     CE    ccttgaagaagatggtgcgctTTTTTctcttggaaagaaagt      1697
EGFP005     LE    cgaacttcacctcggcgcTTTTTctcttggaaagaaagt         1698
EGFP006     LE    ccttcagctcgatgcggtTTTTTctcttggaaagaaagt         1699
EGFP007     LE    gtcacgagggtgggccagTTTTTaggcataggacccgtgtct      1700
EGFP008     LE    cacgccgtaggtcagggtgTTTTTaggcataggacccgtgtct     1701
EGFP009     LE    gtgctgcttcatgtggtcggTTTTTaggcataggacccgtgtct    1702
EGFP0010    LE    tcaccagggtgtcgccctTTTTTaggcataggacccgtgtct      1703
EGFP0011    BL    cggtggtgcagatgaacttca                           1704
EGFP0012    BL    catggcggacttgaagaagtc                           1705
EGFP0013    BL    cgtcctccttgaagtcgatgc                           1706
表2C显示针对siRNA实例的α-ENaC在食蟹猴物种中的表达。
实施例3.4筛选干扰素-α的诱导
为了评估siRNA刺激干扰素-α(IFN-A)释放的能力，将siRNA与新鲜纯化的外周血单核细胞(PBMCs)体外温育24小时。将siRNA直接加入PBMC，或首先将其与脂质转染剂(GenePorter 2或Lipofectamine 2000或DOTAP转染剂)复合，然后再与PBMC一起温育。包括未修饰的对照序列DI_A_2216和DI_A_5167，作为IFN-α诱导的阳性对照。
DI_A_2216：是单链反义DNA分子
5’-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-3’
(SEQ.I.D.NO：1707)
DI_A_5167是缀合有胆固醇的siRNA
5′-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-chol-3′
3′-CsAsCAGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5′(SEQ.I.D.NO：1708)
在24小时后，通过ELISA测量IFN-α。针对未处理的细胞测定基线IFN-α水平，其总是非常接近只有水的对照。单独的转染剂的加入不产生或几乎不产生IFN-α水平的增加。直接或在转染子存在的情况下向细胞中加入已知的刺激性寡核苷酸，观察到预期的IFN-α增加。该设置使得能够测定siRNA(或其他寡核苷酸)对人PBMC中IFN-α的刺激。
人PBMC的分离：白细胞的浓缩的级分(血沉棕黄层)获自the BloodBank Suhl，Institute for Transfusion Medicine，Germany。这些细胞对于多种病原体，包括HIV、HCV等是阴性的。用PBS以1∶1稀释血沉棕黄层，加入至装有Ficoll的试管，然后以2200rpm离心20分钟进行分级分离。之后取出浑浊的白细胞层，转移至装有新鲜PBS和Ficoll的试管中，以2200rpm离心15分钟。再次取出浑浊的白细胞层，转移至RPMI 1640培养基中，以1,200rpm离心5分钟以沉淀白细胞。将细胞重悬浮于RPMI中，如上进行沉淀，重悬浮于具有10％FCS的培养基中至1x 106/mL。
干扰素-α的测量：在37℃将培养的细胞与500nM(或1μM)在Optimem中的寡核苷酸或133nM在GP2或Lipofectamine2000或DOTAP转染剂中的寡核苷酸混合24小时。按照厂商说明书使用Bender MedSystems(Vienna，Austria)instant ELISA试剂盒测量干扰素-α。
基于低于阳性对照的15％的IFN-α诱导水平，选择了前驱治疗性序列。
实施例3.5在CF患者的痰中测定siRNA的稳定性
痰样品由Dr.Ahmet Uluer，Children′s Hospital Boston收集。收集后，用抗生素处理痰样品，然后进行UV-照射以减少细菌含量。为测定痰样品中siRNA的稳定性，将siRNA以5μM的浓度在37℃于30μL痰中温育指定的时间。通过加入蛋白酶K终止反应，将样品在42℃再温育另外20分钟。加入由L-核苷酸(“Spiegelmer”)制造的抗核酸酶降解的40-mer RNA分子，其用作校准标准。将样品过滤通过0.2μm滤膜以除去剩余的碎片。在DNAPac PA 200柱(Dionex)，pH 11.0上通过变性离子交换HPLC分析样品，其中高氯酸钠梯度用于洗脱。通过针对每一个样品测定峰下面积，定量siRNA和降解产物。将浓度相对于在未温育样品中的浓度进行标准化。
基于观察到的在CF痰中具有长于60分钟的半衰期的体外稳定性，选择了前驱治疗性序列(ND8356、ND8357和ND8396)。
实施例3.6针对已知的人SCNN1A基因中的多态性对前驱治疗性序 列进行交叉检查
为了从前驱候选物的靶位点中排除已知的多态性，针对NCBI单核苷酸多态性(SNP)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？CMD＝search&DB＝snp)检查前驱siRNA序列。在人SCNN1A基因的10个已知外显子多态性中，没有1个显示存在于10个最有效的前驱治疗性候选物之任一个的靶位点中。
实施例3.7：最靠前的5个预测的脱靶序列的体外特征
根据19-mer区域上的同源性分选各序列的比对列。按照实施例1中描述的标准，基于错配的数目和位置，对脱靶进行评分。对于各前驱治疗性序列(ND8356，ND8357和ND8396)鉴定了最靠前的5个脱靶序列。将标靶和脱靶序列单个地克隆入双重萤光素酶报告系统。每一个克隆的片段除了10个核苷酸侧翼区(靶序列的5’和3’)以外还包含19个核苷酸的靶。将片段克隆入位于海肾萤光素酶序列3’的多克隆位点，于SV40启动子控制之下。通过海肾萤光素酶靶相对于萤火虫萤光素酶的相对荧光，确定每个siRNA针对标靶和脱靶序列的活性，其中萤火虫萤光素酶独立地受HSV-TK启动子控制。最初，以50nM的siRNA浓度在COS-7细胞中进行转染。在转染后24小时采集萤光素酶的读出值。在该高siRNA浓度，对于3个前驱siRNA中的任一个，没有观察到针对任何脱靶序列的大于30％的下调。大约80％的海肾萤光素酶活性的相对降低证明了针对标靶序列的活性。还产生各siRNA相对于标靶序列的IC50曲线，并以上面鉴定的脱靶序列来检验(control)。对于每个前驱siRNA，在该报告试验中标靶的IC50与在H441中针对内源靶获得的IC50(实施例3.3)具有相似的数量级(10-50pM)，这表明对于ND8356、ND8357和ND8396，在标靶序列上的效力比在任何预测的脱靶序列上高至少1000-5000倍。
实施例3.8：基因毒性谱
细胞毒性测定：通过使用细胞计数评估培养细胞的数目来测定细胞毒性。
众所周知，在体外检测细胞毒性浓度可诱导基因毒性效应，例如微核形成。因此，如果在显示至多中等毒性的浓度下未能观察到剂量依赖性的微核化细胞的增加，则我们认为在大约50％或更少细胞计数(与并行的阴性对照相比较)出现的包含微核的细胞的数目增加是与细胞毒性相关的。管理体外哺乳动物细胞试验的指南(用于执行染色体畸变试验的OECD和ICH指南)要求分析显示细胞计数至少50％降低的浓度。此外，OECD方案要求检测无毒化合物以包括至少一个陡降浓度(precipitatingconcentration)(只要该浓度不超过10mM或5mg/ml，无论哪一个更低)。因为体外微核试验旨在预测该规制试验，即体外染色体畸变试验，的结果，因此该体外微核试验的方案经设计以满足这些试验的要求。
试验系统：TK6细胞是EB病毒(Ebstein-Barr-Virus)转染的和永生化的细胞(来源于脾脏的人类淋巴母细胞来源)。在使用/不使用来自雄性大鼠(Aroclor 1254-预处理的)的S9-肝匀浆物(2％)的情况下，使用TK6细胞在体外微核试验中测定诱裂潜力和/或致非整倍性潜力。处理时间：20小时(-S9)，3小时(+S9)。取样时间：在3小时的处理开始后24小时，在20小时的处理开始后48小时。对于每一种物质，分析至少3个浓度(每浓度2个培养物)和每浓度2000个细胞。
如果微核化细胞的频率：
●＞＝2％并且显示是并行溶剂对照值的至少加倍，或
●＜2％并且显示超过并行溶剂对照值至少3倍的增加，
则受试浓度的微核诱导效应被认为是阳性的。
为得出一个实验为阳性的结论，必须考虑剂量-效应关系和细胞毒性。
总结：前驱治疗性序列ND8396、ND8356、ND8357既不在无代谢活化的20小时处理后诱导包含微核的细胞的数目增加，也不在使用或不使用S9的3小时处理后诱导包含微核的细胞的数目增加。直至达到5mg/ml的检测限，未能分析到细胞毒性浓度。
实施例3.9H441中的体外功效：ND8396
为了证明前驱siRNA抗α-ENaC的体外功效，用siRNA转染H441细胞，并预备该细胞用于离子转运的Ussings chamber分析。为了转染，将H441细胞在补充有200nM地塞米松的培养基中以2x 106个细胞/瓶接种T25培养瓶。每瓶用ND8396或非靶向性对照siRNA(以30nM siRNA)和4mL/mL Lipofectamine 2000在5mL(无血清培养基)总体积中转染细胞。转染后1天，将细胞在汇合下种在1cm2 Snapwell插片(insert)上(2x105个细胞/插片)，以使分化和形成紧密连接所需的时间减少至最少，在顶和底外侧小室中提供培养基，在又培养一天后，移去顶培养基，更换底外侧的培养基，由此将细胞置于气-液界面(ALI)培养。在进行离子转运分析前将细胞在ALI再维持6天。
为了在Ussings chamber中进行功能分析，将Snapwell插片置于Vertical Diffusion Chambers(Costar)中，用维持在37℃的持续通气的林格液(5％CO2于O2中；pH 7.4)浸浴，该林格液包含：120mM NaCl，25mMNaHCO3，3.3mM KH2PO4，0.8mM K2HPO4，1.2mM CaCl2，1.2mMMgCl2和10mM葡萄糖。溶液的渗透摩尔浓度经测定在280至300mosmol/kgH2O的范围内。对细胞实施电压钳至0mV(EVC4000型；WPI)。通过以30秒间隔施用1或2-mV的脉冲，或使用跨细胞的初始电位差以及测量的初始电流，然后利用欧姆定律计算RT，测量了跨上皮电阻(RT)。使用PowerLab工作站(ADInstruments)记录数据。在siRNA处理后，记录细胞的基础特征和氨氯吡嗪脒敏感性的短路电流(在应用10μM氨氯吡嗪脒后的ISC；仅顶侧)。在每一种情况下，通过氨氯吡嗪脒敏感性ISC，确定了各培养物的ENaC通道活性。
在试验后，将各插片上的细胞分别裂解用于RNA分析。测定时RNA水平的75％降低(ND8396相比于非靶向性对照)与大约30％的氨氯吡嗪脒敏感性电流的功能性降低(ND8396相比于非靶向性对照)相关。
下面使用标准命名法，特别地表A中的缩写来表示核酸序列。
表A：用于核酸序列表示的核苷酸单体的缩写。要理解，这些单体，当存在于寡核苷酸中时，相互之间通过′-3′-磷酸二酯键连接。
  缩写a   核苷酸
  A   腺苷-5’-磷酸
  C   胞苷-5’-磷酸
  G   鸟苷-5’-磷酸
  T   2’-脱氧-胸苷-5’-磷酸
  U   尿苷-5’-磷酸
  c   2′-O-甲基胞苷-5’-磷酸
  u   2′-O-甲基尿苷-5’-磷酸
  Ts   2′-脱氧-胸苷-5’-硫代磷酸
表1A：起始筛选组中的选择的siRNA(人-恒河猴α-ENaC交叉反应性siRNA)。总共152个iRNA序列被鉴定为起始筛选组，具有(序列链1-304)和不具有(序列链305-608)主链修饰。按照实施例部分描述的设计标准，iRNA序列经设计与人和恒河猴α-ENaC序列两者完全互补。显示了两个独立单剂量转染实验中的α-ENaC残留表达百分数(关于使用的方法参看实施例部分)。
Figure GPA00001026085100751
Figure GPA00001026085100771
Figure GPA00001026085100781
Figure GPA00001026085100791
Figure GPA00001026085100801
Figure GPA00001026085100811
Figure GPA00001026085100821
Figure GPA00001026085100831
Figure GPA00001026085100841
Figure GPA00001026085100851
Figure GPA00001026085100861
表1B：扩展筛选组中的选择的siRNA(“仅人”siRNA)。鉴定了另外344个iRNA序列，按照实施例部分描述的设计标准，其经设计与人α-ENaC序列完全互补。该筛选组中所列的所有siRNA只具有在每链的核苷酸20和21之间的3′-末端硫代磷酸酯连接修饰。显示了在单剂量转染试验中α-ENaC的残留表达百分比(关于所用方法参看实施例部分)。
Figure GPA00001026085100871
Figure GPA00001026085100881
Figure GPA00001026085100891
Figure GPA00001026085100901
Figure GPA00001026085100911
Figure GPA00001026085100921
Figure GPA00001026085100931
Figure GPA00001026085100941
Figure GPA00001026085100951
Figure GPA00001026085100961
Figure GPA00001026085100971
Figure GPA00001026085101011
Figure GPA00001026085101021
Figure GPA00001026085101041
Figure GPA00001026085101051
Figure GPA00001026085101061
Figure GPA00001026085101071
Figure GPA00001026085101091
表1C：体内大鼠替代物组中的选择的siRNA(在大鼠中具有最高特异性的人-大鼠交叉反应siRNA)。鉴定了具有48个人和大鼠交叉反应性α-ENaC iRNA序列的筛选组。显示了两个独立的单剂量转染实验中α-ENaC的残留表达百分比(关于所用方法参看实施例部分)。
Figure GPA00001026085101101
Figure GPA00001026085101111
表1D：体内豚鼠替代物组中的选择的siRNA(人-豚鼠交叉反应siRNA)。鉴定和合成了具有63个人和豚鼠交叉反应性α-ENaC iRNA序列的筛选组，具有(序列链1393-1518)和不具有(序列链1519-1644)主链修饰。显示了两个独立的单剂量转染实验中α-ENaC的残留表达百分比(关于所用方法参看实施例部分)。
Figure GPA00001026085101121
Figure GPA00001026085101131
Figure GPA00001026085101141
Figure GPA00001026085101151
Figure GPA00001026085101171
表2A：表1A的示例性iRNA试剂的50％抑制浓度(IC50)
              IC50[nM]      IC50[nM]
              第1DRC        第2DRC
Duplex ID     在H441中      在H441中
ND8294        0.1949        0.0468
ND8295        0.1011        0.0458
ND8299        0.5986        0.5638
ND8302        0.0144        0.0134
ND8313        0.0315        0.0124
ND8320        0.0796        0.0078
ND8331        0.0213        0.0158
ND8332        0.0205        0.0089
ND8343        0.0523        0.0293
ND8348        0.0156        0.0182
ND8356        0.0241        0.0099
ND8357        0.0054        0.0032
ND8363        0.1186        0.0337
ND8368        0.0487        0.1209
ND8371        0.0811        0.0911
ND8372        0.0584        0.0425
ND8373        0.0066        0.0165
ND8375        0.1176        0.1187
ND8380        0.6817        0.5747
ND8381        0.0037        0.0041
ND8383        0.0275        0.1257
ND8384        0.0357        0.0082
ND8391        0.0260        0.0349
ND8392        0.3831        0.4775
ND8396        0.0023        0.0052
ND8403        0.0808        0.0759
表2B：表1D的示例性iRNA试剂的50％抑制浓度(IC50)
              IC50[nM]      IC50[nM]
              第1DRC        第2DRC
Duplex ID     在H441中      在H441中
ND8441        0.6738        0.8080
ND8443        0.0346        0.0263
ND8449        0.0120        0.0067
ND8450        0.0257        0.0106
ND8451        0.1320        0.0931
ND8453        0.0079        0.0033
ND8489        0.1640        0.1593
ND8496        0.0387        0.0185
表2C：实施例3中描述的测定试验中示例性RNAi抑制α-ENaC基因表达的活性％
Duplex标识符           ％原代HBEC中         食蟹猴α-ENaC表达(对
                       α-ENaC表达(对照     照的％)45nM siRNA
                        的％)50nM siRNA
未转染的                77.2                 n/a
非靶向性对照            100                  93.3
阴性对照(非食蟹猴       n/a                  100
α-ENaC)ND8449
ND-8302                 30.2                 57
ND-8332                 24.7                 54.3
ND-8348                 40.1                 56.2
ND-8356                 36.6                 55.8
ND-8357                 29.6                 50.4
ND-8373                 30.4                 53.8
ND-8381                 32.5                 40.4
ND-8396                 34.1                 46.3
ND-8450                 45.9                 78.9
ND-8453                 30.1                 55.3

Claims (32)

1.包含第一链和第二链的iRNA试剂，其中：
a.第一链和第二链的序列是ND8453的第一链和第二链的序列SEQID NO：1425和1426、或ND8669的第一链和第二链的序列SEQ ID NO：1551和1552；或者
b.第一链和第二链的序列是ND8489的第一链和第二链的序列SEQID NO：1497和1498、或ND8705的第一链和第二链的序列SEQ ID NO：1623和1624；或者
c.第一链和第二链的序列是ND8456的第一链和第二链的序列SEQID NO：1431和1432、或ND8672的第一链和第二链的序列SEQ ID NO：1557和1558，
其中，核酸序列中，缩写A代表腺苷-5’-磷酸，C代表胞苷-5’-磷酸，G代表鸟苷-5’-磷酸，T代表2’-脱氧-胸苷-5’-磷酸，U代表尿苷-5’-磷酸，c代表2′-O-甲基胞苷-5’-磷酸，u代表2′-O-甲基尿苷-5’-磷酸，Ts代表2′-脱氧-胸苷-5’-硫代磷酸。
2.权利要求1的iRNA试剂，其包含引起所述iRNA试剂在生物样品中具有增加的稳定性的修饰。
3.权利要求1的iRNA试剂，其包含硫代磷酸酯或2’-修饰的核苷酸。
4.权利要求1的iRNA试剂，其包含：
至少一个其中尿苷是2’-修饰的核苷酸的5’-尿苷-腺嘌呤-3’二核苷酸；
至少一个其中5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸的5’-尿苷-鸟嘌呤-3’二核苷酸；
至少一个其中5’-胞苷是2’-修饰的核苷酸的5’-胞苷-腺嘌呤-3’二核苷酸；或
至少一个其中5’-尿苷是2’-修饰的核苷酸的5’-尿苷-尿苷-3’二核苷酸。
5.权利要求1的iRNA试剂，其中所述iRNA试剂包含2′-修饰，该2’-修饰选自：2′-脱氧、2′-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、2′-O-氨基丙基、2′-O-二甲基氨基乙基、2′-O-二甲基氨基丙基、2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基和2′-O-N-甲基乙酰氨基。
6.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂是ND8453。
7.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂是ND8489。
8.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂是ND8456。
9.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接一个或多个诊断化合物、报告基团、交联剂、赋予核酸酶抗性的部分、天然的或稀有的核酸碱基、亲脂分子、胆固醇、脂质、凝集素、类固醇、萜类、维生素、碳水化合物、蛋白质、蛋白质结合剂、整联蛋白靶向性分子、聚阳离子、肽、多胺、和/或肽模拟物。
10.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接葡聚糖、普鲁兰多糖、壳多糖、壳聚糖、菊淀粉、环糊精、或透明质酸。
11.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接低或中分子量聚合物。
12.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接转铁蛋白。
13.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接乌苏醇、核柯配基、或薯蓣皂苷配基。
14.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接三萜类。
15.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接萨洒皂苷配基、无羁萜、或表无羁萜醇衍生的石胆酸。
16.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接合成的碳水化合物。
17.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接天然聚合物。
18.权利要求1的iRNA试剂，其中该iRNA试剂连接寡聚乳酸15-聚体。
19.权利要求1的iRNA试剂，其包含上皮受体配体。
20.权利要求19的iRNA试剂，其中上皮受体配体为转铁蛋白。
21.权利要求1的iRNA试剂，其包含叶酸作为配体。
22.包含权利要求1至21的任一项的iRNA试剂的组合物。
23.权利要求1至21的任一项的iRNA试剂或权利要求22的组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗具有至少部分由α-ENaC表达介导的病理状态的人受试者。
24.权利要求23的用途，其中所述病理状态是囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾患、哮喘、呼吸道感染、肺癌、利德尔综合征、高血压、肾机能不全、和/或电解质失衡。
25.包含针对α-ENaC的iRNA试剂的组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗具有至少部分由α-ENaC表达介导的病理状态的人受试者，其中所述组合物以治疗有效的量施用给所述受试者，
其中所述iRNA试剂包含第一链和第二链，其中
a.第一链和第二链的序列是ND8453的第一链和第二链的序列SEQID NO：1425和1426、或ND8669的第一链和第二链的序列SEQ ID NO：1551和1552；或者
b.第一链和第二链的序列是ND8489的第一链和第二链的序列SEQID NO：1497和1498、或ND8705的第一链和第二链的序列SEQ ID NO：1623和1624；或者
c.第一链和第二链的序列是ND8456的第一链和第二链的序列SEQID NO：1431和1432、或ND8672的第一链和第二链的序列SEQ ID NO：1557和1558，
其中，核酸序列中，缩写A代表腺苷-5’-磷酸，C代表胞苷-5’-磷酸，G代表鸟苷-5’-磷酸，T代表2’-脱氧-胸苷-5’-磷酸，U代表尿苷-5’-磷酸，c代表2′-O-甲基胞苷-5’-磷酸，u代表2′-O-甲基尿苷-5’-磷酸，Ts代表2′-脱氧-胸苷-5’-硫代磷酸。
26.权利要求25的用途，其中以充分地降低α-ENaC在受试者的细胞或组织中的表达水平的量施用所述组合物。
27.权利要求25的用途，其中所述病理状态是囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾患、哮喘、呼吸道感染、肺癌、利德尔综合征、高血压、肾机能不全、和/或电解质失衡。
28.一种药物组合物，其包含：
a.)权利要求1至21的任一项的iRNA试剂；和
b.)药学上可接受的载体。
29.权利要求1至21的任一项的iRNA试剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗患有囊性纤维化的人受试者的方法中，该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的所述iRNA试剂。
30.权利要求1至21的任一项的iRNA试剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗患有利德尔综合征的人受试者的方法中，该方法包括对所述患者施用治疗有效量的所述iRNA试剂。
31.权利要求1至21的任一项的iRNA试剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防人受试者中高血压和/或肾机能不全的方法中，该方法包括对所述患者施用治疗有效量的所述iRNA试剂。
32.权利要求1至21的任一项的iRNA试剂在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防人受试者中电解质失衡的方法中，该方法包括对所述患者施用治疗有效量的所述iRNA试剂。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003261231A1 (en) * 2002-07-26 2004-02-16 Chiron Corporation Modified small interfering rna molecules and methods of use
KR100473148B1 (ko) * 2002-11-27 2005-03-10 (주)텔리언 버스트모드 패킷 전달을 위한 정합장치 및 방법
EP1796732B1 (en) * 2004-10-01 2013-10-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Modified small interfering rna molecules and methods of use
US8765704B1 (en) 2008-02-28 2014-07-01 Novartis Ag Modified small interfering RNA molecules and methods of use
AR066984A1 (es) 2007-06-15 2009-09-23 Novartis Ag Inhibicion de la expresion de la subunidad alfa del canal epitelial de sodio (enac) por medio de arni (arn de interferencia)
JP2012509688A (ja) * 2008-11-26 2012-04-26 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介阻害
EP2756845B1 (en) * 2009-04-03 2017-03-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA
EP2415869A4 (en) * 2009-04-03 2013-06-19 Biomics Biotechnologies Co Ltd MODIFIED OLIGO-NUCLEIC ACID MOLECULE, PROCESS FOR PREPARATION AND USES THEREOF
CN103275978B (zh) * 2009-04-03 2014-10-29 百奥迈科生物技术有限公司 修饰的小干扰核酸及其制备方法
US20120207818A1 (en) * 2009-07-14 2012-08-16 Shinohara Fumikazu Composition for suppressing expression of target gene
US20130079382A1 (en) * 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
MX339050B (es) * 2009-12-18 2016-05-09 Novartis Ag Composiciones organicas para tratar las enfermedades relacionadas con hsf1.
DK2561077T3 (en) 2010-04-23 2016-08-01 Arrowhead Res Corp Organic compositions for the treatment of beta-ENaC-related diseases
WO2012138416A1 (en) * 2011-04-08 2012-10-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Pcr reaction mixtures with decreased non-specific activity
BR112013027070A2 (pt) 2011-04-20 2019-09-24 J Smith Larry métodos e composições para diminuir expressão de gene utilizando componentes que auto montam em células e produzem atividade de rnai
JP2014525435A (ja) 2011-09-02 2014-09-29 ノバルティス アーゲー Ｈｓｆ１関連疾患を処置するための有機組成物
CA3039618A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Alpha-v beta-6 integrin ligands and uses thereof
TN2019000308A1 (en) * 2017-07-06 2021-05-07 Arrowhead Pharmaceuticals Inc RNAi AGENTS FOR INHIBITING EXPRESSION OF ALPHA-ENaC AND METHODS OF USE
KR20200079505A (ko) * 2017-10-31 2020-07-03 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 ENaC 발현의 조절제
JP7445594B2 (ja) * 2017-11-01 2024-03-07 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド インテグリンリガンドおよびその使用
CN109364248B (zh) * 2018-10-16 2021-05-18 哈尔滨医科大学 ENaC及其抑制剂在预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化中的应用
US20220339136A1 (en) * 2019-08-30 2022-10-27 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Liposomal troponoid compound formulations
US11957178B2 (en) 2021-11-15 2024-04-16 Apackaging Group Llc Aerosol actuator

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4837026A (en) * 1985-10-03 1989-06-06 Rajakhyaksha Vithal J Transdermal and systemic preparation and method
DE3604625C2 (de) * 1986-02-14 1994-01-20 Bmw Rolls Royce Gmbh Gasturbine
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5451670A (en) * 1987-12-09 1995-09-19 City Of Hope Restriction fragment length polymorphism test for haplotyping domesticated fowl
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5013566A (en) * 1988-12-19 1991-05-07 Sampson Michael James Process for obtaining improved yields from plants used for hay making by using a coating agent
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
RU2123492C1 (ru) 1993-02-19 1998-12-20 Ниппон Синяку Ко., Лтд Производные глицерина, средство для доставки физиологически активного вещества и фармацевтическая композиция
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
CA2137297C (en) 1993-12-06 2000-04-18 Tsuyoshi Miyazaki Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
JP3543347B2 (ja) * 1994-01-24 2004-07-14 日本油脂株式会社 点火薬造粒物の製造方法
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
CA2227989A1 (en) 1995-08-01 1997-02-13 Karen Ophelia Hamilton Liposomal oligonucleotide compositions
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6218108B1 (en) 1997-05-16 2001-04-17 Research Corporation Technologies, Inc. Nucleoside analogs with polycyclic aromatic groups attached, methods of synthesis and uses therefor
US5865710A (en) * 1996-08-01 1999-02-02 Wilson-Hyde; Cynthia Step aerobic platform
AU742598B2 (en) * 1997-03-11 2002-01-10 Yale University Method to diagnose and treat pathological conditions resulting from deficient ion transport such as pseudohypoaldosteronism type-1
CA2294988C (en) 1997-07-01 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US5976849A (en) 1998-02-05 1999-11-02 Zeneca Limited Human E3 ubiquitin protein ligase
WO2000053722A2 (en) 1999-03-10 2000-09-14 Phogen Limited Delivery of nucleic acids and proteins to cells
KR100909681B1 (ko) * 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
BR0209646A (pt) 2001-05-16 2006-10-10 Novartis Ag genes expressos em cáncer de mama como alvos de prognósticos e terapêuticos
EP1478655A4 (en) 2001-12-31 2006-05-10 Algos Therapeutics Inc METHODS AND SUBSTANCES FOR ENAC-BETA MODULATION
AU2003261231A1 (en) * 2002-07-26 2004-02-16 Chiron Corporation Modified small interfering rna molecules and methods of use
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
GB0218970D0 (en) 2002-08-14 2002-09-25 Creative Peptides Sweden Ab Fragments of Insulin c-peptide
EP1560931B1 (en) * 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
WO2004050894A2 (en) 2002-11-27 2004-06-17 Artesian Therapeutics, Inc. Heart failure gene determination and therapeutic screening
EP1567549A1 (en) 2002-11-29 2005-08-31 Basf Aktiengesellschaft Methods for the production of methionine
DE10305213A1 (de) * 2003-02-07 2004-08-26 Florian Prof. Dr.med. Lang Verwendung eines neuen Polymorphismus im hsgk1-Gen zur Diagnose der Hypertonie und Verwendung der sgk-Genfamilie zur Diagnose und Therapie des Long-Q/T-Syndroms
AU2004227915A1 (en) * 2003-03-31 2004-10-21 John F. Engelhardt Pharmico-gene theraphy of epithelial sodium channel associated disoders
US7723509B2 (en) * 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
AU2003224132A1 (en) 2003-04-24 2004-11-19 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
US20050256071A1 (en) * 2003-07-15 2005-11-17 California Institute Of Technology Inhibitor nucleic acids
JP4530335B2 (ja) * 2004-02-03 2010-08-25 独立行政法人科学技術振興機構 膀胱に発現する上皮型ナトリウムチャネルに対する阻害薬
AU2005248147A1 (en) * 2004-05-11 2005-12-08 Alphagen Co., Ltd. Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same
SE0402832D0 (sv) * 2004-11-18 2004-11-18 Astrazeneca Ab Methods
US7923206B2 (en) * 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Method of determining a cellular response to a biological agent
AU2005316384B2 (en) * 2004-12-14 2012-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of MLL-AF4 and uses thereof
US8101741B2 (en) * 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US20070149456A1 (en) * 2005-12-13 2007-06-28 University Of Pittsburgh Epithelial sodium channel inhibiting agents and uses therefor
AU2007285782B2 (en) 2006-08-18 2010-06-24 Arrowhead Research Corporation Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
SG166778A1 (en) 2006-10-11 2010-12-29 Max Planck Gesellschaft Influenza targets
AR066984A1 (es) * 2007-06-15 2009-09-23 Novartis Ag Inhibicion de la expresion de la subunidad alfa del canal epitelial de sodio (enac) por medio de arni (arn de interferencia)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRIESENBACH UTA ET AL..Inefficient cationic lipid-mediated siRNA and antisense oligonucleotide transfer to airway epithelial cells in vivo.《RESPIRATORY RESEARCH》.2006,第7卷(第1期), *
Tianbo Li et al..RNA interference for α-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo.《American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology》.2006,第290卷(第4期), *
汉农等.RNAi-基因沉默指南.《RNAi-基因沉默指南》.2004, *

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Publication number Publication date
US9914927B2 (en) 2018-03-13
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