BRPI0813680B1 - COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM AGENTE DE iRNA PARA ALFA-ENaC, CONSTITUÍDO POR UM FITA SENSO E UMA FITA ANTISSENSO, E SEU USO - Google Patents

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM AGENTE DE iRNA PARA ALFA-ENaC, CONSTITUÍDO POR UM FITA SENSO E UMA FITA ANTISSENSO, E SEU USO Download PDF

Info

Publication number
BRPI0813680B1
BRPI0813680B1 BRPI0813680-7A BRPI0813680A BRPI0813680B1 BR PI0813680 B1 BRPI0813680 B1 BR PI0813680B1 BR PI0813680 A BRPI0813680 A BR PI0813680A BR PI0813680 B1 BRPI0813680 B1 BR PI0813680B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
strip
antisense
sense
contiguous nucleotides
Prior art date
Application number
BRPI0813680-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Van Heeke Gino
Hickman Emma
Luke Danahay Henry
Tan Pamela
Geick Anke
Vornlacher Hans-Peter
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of BRPI0813680A2 publication Critical patent/BRPI0813680A2/pt
Publication of BRPI0813680B1 publication Critical patent/BRPI0813680B1/pt
Publication of BRPI0813680A8 publication Critical patent/BRPI0813680A8/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM AGENTE DE IRNA PARA ALFA-ENAC, CONSTITUÍDO POR UM FITA SENSO E UMA FITA ANTISSENSO, E SEU USO (51) Int.CI.: C12N 15/11; A61K 31/713 (30) Prioridade Unionista: 13/08/2007 EP 07 114265.7, 15/06/2007 EP 07 110376.6 (73) Titular(es): NOVARTIS AG (72) Inventor(es): GINO VAN HEEKE; EMMA HICKMAN; HENRY LUKE DANAHAY; PAMELATAN; ANKE GEICK; HANS-PETER VORNLACHER
1/161
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM AGENTE DE iRNA PARA ALFAENaC, CONSTITUÍDO POR UM FITA SENSO E UMA FITA ANTISSENSO, E SEU USO.
Campo Técnico [001] A presente invenção se refere ao campo de transporte de íons na via aérea mediado por ENaC e composições e métodos para modular a expressão de alfa-ENaC, e mais particularmente à regulação negativa de alfa-ENaC por oligonucleotídeos via RNA de interferência que são administrados localmente aos pulmões, e passagem nasal via administração por inalação/intranasal, ou são administrados sistemicamente, por exemplo, por via de injeção intravenosa. Antecedentes [002] RNA de interferência ou RNAi é um termo inicialmente cunhado por Fire e colaboradores para descrever a observação de que RNA de fita dupla (dsRNA) pode bloquear a expressão de gene quando ele é introduzido em vermes (Fire et al., Nature 391:806-811, 1998). dsRNA curto dirige o silenciamento específico de genes, póstranscricional em muitos organismos, incluindo vertebrados e provê uma nova ferramenta para estudar a função de genes. Esta tecnologia foi estudada numerosas vezes recentemente, vide, por exemplo Novina, C.D:, e Sharp, P., Nature 2004, 430:161, e Sandy, P., et al., BioTechniques 2005, 39:215, aqui incorporados por referência.
[003] As superfícies mucosais na interface entre o meio ambiente e o corpo têm desenvolvido vários mecanismos protetores. Uma forma principal desta defesa inata é a limpeza destas superfícies com líquido. Tipicamente, a quantidade da camada de líquido sobre uma superfície mucosal reflete o equilíbrio entre a secreção líquida epitelial, com frequência refletindo a secreção de ânions (Cl- e/ou HCO3-) copulados com água (e um contraíon de cátion), e a absorção de líquido epitelial, com frequência refletindo a absorção de Na+, copulado com água e
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 6/176
2/161 contra-ânion (Cl- e/ou HCO3 -). Muitas doenças de superfícies mucosais são causadas por uma pequena quantidade de líquido protetor sobre estas superfícies mucosais criadas por um desequilíbrio entre a secreção (muito pequena) e absorção (relaçãomuito grande). Os processos de transporte de sal defeituosos que caracterizam estas disfunções mucosais residem na camada epitelial da superfície mucosal. Uma abordagem consistindo em reabastecer a camada de líquido protetora sobre as superfícies mucosais é rebalancear o sistema por bloqueio da absorção de líquido mediada por canal de Na+. A proteína epitelial que media a etapa limitada de taxa de Na+ e absorção de líquido é o canal de Na+ epitelial (ENaC). Alfa-ENaC está posicionada sobre a superfície apical do epitélio, isto é, a interface superfície mucosal - ambiente. A inibição de absorção de líquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC pode alcançar uma utilidade terapêutica. Portanto, existe a necessidade para o desenvolvimento de terapias eficazes para o tratamento e prevenção de doenças ou distúrbios em que alfa-ENaC está implicado, por exemplo, fibrose cística em humanos e animais, e particularmente para terapias com elevada eficácia. Um pré-requisito para uma eficácia elevada é que o ingrediente-ativo não seja degradado muito rapidamente em um ambiente fisiológico.
Sumário [004] A presente invenção provê composições e métodos específicos que são úteis em reduzir os níveis de alfa-ENaC em um indivíduo, por exemplo, um mamífero, tal como um humano, por exemplo, por administração inalada, intranasal ou intratraqueal de tais agentes. [005] A presente invenção especificamente provê agentes de iRNA consistindo em, consistindo essencialmente em ou compreendendo pelo menos 15 ou mais nucleotídeos contíguos para alfa-ENaC, e mais particularmente agentes compreendendo 15 ou mais nucleotídeos contíguos a partir de uma das sequências providas nas Tabelas
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 7/176
3/161
1A-1D. O agente de iRNA preferivelmente compreende menos do que 30 nucleotídeos por fita, por exemplo, 21-23 nucleotídeos, tais como aqueles providos nas Tabelas 1A-1D. O agente de iRNA de fita dupla pode ou ter extremidades cegas ou mais preferivelmente ter extremidades com cauda de 1-4 nucleotídeos de uma ou ambas as extremidades 3' do agente.
[006] Além disso, o agente de iRNA pode quer conter apenas subunidades de ribonucleotídeo ocorrendo naturalmente, ou pode ser sintetizado de modo a conter uma ou mais modificações para o açúcar, fosfato ou base de uma ou mais das subunidades de ribonucleotídeo que é incluída no agente. O agente de iRNA pode ainda ser modificado de modo a ligar-se a um ligante que é selecionado para melhorar estabilidade, liberação ou absorção celular do agente, por exemplo, colesterol. Os agentes de iRNA podem ainda estar na forma isolada ou podem ser parte de uma composição farmacêutica usada para os métodos descritos aqui, particularmente como um composição farmacêutica formulada para liberação aos pulmões ou à passagem nasal ou formulada para administração parental. As composições farmacêuticas podem conter um ou mais agentes de iRNA, e em algumas modalidades, conterá dois ou mais agentes de iRNA, cada um direcionado a um segmento diferente do gene alfa-ENaC.
[007] Um aspecto da presente invenção se refere a um oligonucleotídeo de fita dupla compreendendo pelo menos uma nucleobase não-natural. Em algumas modalidades, a nucleobase não-natural é difluortolila, nitroindolila, nitropirrolila, ou nitroimidazolila. Em uma modalidade preferida, a nucleobase não-natural é difluortolila. Em algumas modalidades, apenas uma das duas fitas de oligonucleotídeo compreendendo o oligonucleotídeo de fita dupla contém uma nucleobase não-natural. Em algumas modalidades, ambas as fitas de oligoPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 8/176
4/161 nucleotídeo compreendendo o oligonucleotídeo de fita dupla independentemente contêm uma nucleobase não-natural.
[008] A presente invenção ainda provê métodos para reduzir o nível de mRNA alfa-ENaC em uma célula. Tais métodos compreendem a etapa de administrar um dos agentes de iRNA da presente invenção a um indivíduo como ainda descrito abaixo. Os presentes métodos utilizam os mecanismos celulares envolvidos em RNA de interferência para seletivamente degradar o RNA-alvo em uma célula e são compreendidos pela etapa de contatar uma célula com um dos agentes de iRNA da presente invenção. Tais métodos podem ser realizados diretamente em uma célula ou podem ser realizados em um indivíduo mamífero por administração a um indivíduo de um dos agentes de iRNA/composições farmacêuticas da presente invenção. Redução de RNA-alvo em uma célula resulta em uma redução na quantidade de proteína codificada produzida e, em um organismo, resulta em redução de diferença de potencial epitelial, absorção de fluido diminuída e depuração mucociliar aumentado.
[009] Os métodos e composições da invenção, por exemplo, os métodos e composições de agente de iRNA podem ser usados com qualquer dosagem e/ou formulação descrita aqui, bem como com qualquer via de administração descrita aqui.
[0010] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção estão definidos nos desenhos associados e na descrição abaixo. Outros aspectos, objetivos, e vantagens da invenção serão aparentes a partir dessa descrição, dos desenhos, e das reivindicações. Esse pedido incorpora todas as referências citadas, patentes, e pedidos de patente por referências em sua totalidade para todos propósitos.
Nas Figuras:
[0011] A figura 1: Mapa de restrição da digestão da construção pXoon para α-EnaC de cinomolgo clonado.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 9/176
5/161 [0012] A figura 2: Proteína e sequência de DNA de alfa-EnaC de macaco cinomolgo.
[0013] A figura 3: Clonagens dos sítios de reconhecimento previstos fora do alvo e dentro do alvo na construção de repórter luciferase dual de AY535007. Fragmentos consistem de 19nt do sítio-alvo previsto e 10 nt de sequência de flanqueamento em ambas extremidades 5' e 3'.
Descrição Detalhada de Algumas Modalidades Preferidas da Invenção [0014] Para a facilidade de exposição o termo nucleotídeo ou ribonucleotídeo é algumas vezes usado aqui em referência a uma ou mais subunidades monoméricas de um agente de RNA. Será entendido que o uso do termo ribonucleotídeo ou nucleotídeo aqui pode, no caso de um RNA modificado ou substituto de nucleotídeo, também referir-se a um nucleotídeo modificado, ou porção de substituição do substituto, como ainda descrito abaixo, em uma ou mais posições. [0015] Um agente de RNA como usado aqui, é um RNA nãomodificado, RNA modificado, ou substituto de nucleosídeo, cada sendo descrito aqui ou bem conhecido na técnica sintética de RNA. Enquanto numerosos RNAs modificados e substitutos de nucleosídeos são descritos, exemplos preferidos incluem aqueles que têm maior resistência à degradação de nuclease do que os RNAs não-modificados. Exemplos preferidos incluem aqueles que têm uma modificação de açúcar 2', uma modificação em uma extremidade com cauda de fita simples, preferivelmente uma extremidade com cauda de fita simples de 3', ou, particularmente se for de fita simples, uma modificação de 5' que inclui um ou mais grupos de fosfato ou um ou mais análogos de um grupo de fosfato.
[0016] Um agente de iRNA (abreviação para agente de RNA interferente) como usado aqui, é um agente de RNA que pode regular de modo negativo a expressão de um gene-alvo, por exemplo gene
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 10/176
6/161
ENaC SCNN1A. Enquanto não desejando ser limitado por teoria, um agente de iRNA pode atuar por uma ou mais dentre vários mecanismos, incluindo clivagem pós-transcricional de um mRNA-alvo algumas vezes referido na técnica como RNAi, ou mecanismos prétranscricionais ou pré-translacionais.
[0017] Um agente de iRNA ds (abreviação para agente de iRNA de fita dupla), como usado aqui, é um agente de iRNA que inclui mais do que uma, e preferivelmente duas, fitas em que a hibridização de interfita pode formar uma região de estrutura duplex. Uma fita aqui se refere a uma sequência contígua de nucleotídeos (incluindo nucleotídeos de ocorrência não-natural ou modificados). As duas ou mais fitas podem ser, ou formam, cada, uma parte de, moléculas separadas, ou elas podem ser covalentemente interconectadas, por exemplo, por um ligador, por exemplo, um ligador de polietilenoglicol, para formar uma molécula. Pelo menos uma fita pode incluir uma região que é suficientemente complementar a um RNA-alvo. Tal fita é chamada fita antissenso. Um segunda fita do agente de RNA ds, que compreende uma região complementar aa fita antissenso, é chamado fita senso. Entretanto, um agente de iRNA ds pode também ser formado de uma molécula de RNA simples que é pelo menos parcialmente autocomplementar, formando, por exemplo, uma estrutura em forma de grampo de cabelo ou cabo de panela, incluindo uma região duplex. Os últimos estão aqui referidos como RNAs em forma de grampo de cabelo curtos ou shRNAs. Em tal caso, o termo fita se refere a uma das regiões da molécula de RNA que é complementar a outra região da mesma molécula de RNA.
[0018] Embora, em células de mamíferos, agentes de iRNA ds longos podem induzir à resposta de interferon que é frequentemente deletéria, agentes de iRNA ds curtos não disparam a resposta de interferon, pelo menos não para uma extensão que é deletéria à célula
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 11/176
7/161 e/ou hospedeiro (Manche et al., Mol. Cell. Biol. 12: 5238, 1992; Lee et al., Virology 199:491, 1994; Castelli et al., J. Exp. Med. 186: 967, 1997; Zheng et al., RNA 10:1934, 2004; Heidel et al., Nature Biotechnol. 22 1579). Os agentes de iRNA da presente invenção incluem moléculas que são suficientemente curtas em que elas não disparam uma resposta de interferon não-específica deletéria em células de mamíferos normais. Deste modo, a administração de uma composição incluindo um agente de iRNA (por exemplo, formulada como descrito aqui) a um indivíduo pode ser usada para diminuir a expressão de alfa-ENaC no indivíduo, enquanto evadindo uma resposta de interferon. Moléculas que são curtas o suficiente em que elas não ativam uma resposta de interferon deletéria são chamadas agentes de siRNA ou siRNAs aqui. Agente de siRNA ou siRNA como usado aqui, se refere a um agente de iRNA, por exemplo, um agente de iRNA ds, que é suficientemente curto que ele não induz uma resposta de interferon deletéria em uma célula de mamífero, e particularmente de ser humano, por exemplo, tem uma região duplexada de menos do que 60 mas preferivelmente menos do que 50, 40, ou 30 pares de nucleotídeo.
[0019] Os agentes de iRNA isolados descritos aqui, incluindo agentes de iRNA ds e agentes de siRNA, podem mediar a expressão de alfa-ENaC diminuída, por exemplo, por degradação de RNA. Por conveniência, tal RNA é também referido aqui como o RNA a ser silenciado. Tal ácido nucleico é também referido como um RNA-alvo, algumas vezes molécula de RNA-alvo ou algumas vezes gene-alvo. [0020] Como usada aqui, a frase media RNAi se refere à capacidade de um agente para silenciar, em uma maneira específica de sequência, um gene-alvo. Silenciar um gene-alvo significa o processo por meio do qual uma célula contendo e/ou expressando certo produto do gene-alvo quando não em contato com o agente, conterá e/ou expressará pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 12/176
8/161
90% menos de tal produto de gene quando contatado com o agente, como comparado a uma célula similar que não foi contatada com o agente. Tal produto do gene-alvo pode, por exemplo, ser um RNA mensageiro (mRNA), um proteína, ou um elemento regulatório.
[0021] Como usado aqui, o termo complementar é usado para indicar um grau suficiente de complementaridade tal que ligação estável e específica ocorre entre um composto da invenção e uma molécula de RNA-alvo, por exemplo, mRNA alfa-ENaC. Ligação específica requer um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não-específica do composto oligomérico a sequências não alvo sob condições em que ligação específica é desejada, isto é, sob condições fisiológicas no caso de testes in vivo ou tratamento terapêutico, ou no caso de testes in vitro, sob condições em que os testes são realizados. As sequências não alvo tipicamente diferem das sequências-alvo por pelo menos 2, 3 ou 4 nucleotídeos.
[0022] Como usado aqui, um agente de iRNA é suficientemente complementar a um RNA-alvo, por exemplo, um mRNA-alvo (por exemplo, mRNA alfa-ENaC) se o agente de iRNA reduz a produção de uma proteína codificada pelo RNA-alvo em uma célula. O agente de iRNA podem também ser exatamente complementar ao RNA-alvo, por exemplo, o RNA-alvo e o agente de iRNA anelam, preferivelmente para formar um híbrido feito exclusivamente de pares de bases de Watson-Crick na região de exata complementaridade. Um agente de iRNA suficientemente complementar pode incluir uma região interna (por exemplo, de pelo menos 10 nucleotídeos) que é exatamente complementar a um RNA alfa-ENaC alvo. Além disso, em algumas modalidades, o agente de iRNA especificamente discrimina uma diferença de nucleotídeo simples. Nesse caso, o agente de iRNA apenas media RNAi se uma complementaridade exata for encontrada na região (por exemplo, dentro de 7 nucleotídeos de) a diferença de nucleotíPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 13/176
9/161 deo simples. Agentes de iRNA preferidos serão baseados em ou consistirão em ou compreenderão as sequências senso e antissenso providas nas Tabelas 1A-1D.
[0023] Como usado aqui, essencialmente idêntica quando usado referindo-se a uma primeira sequência de nucleotídeo em comparação a uma segunda sequência de nucleotídeo significa que a primeira sequência de nucleotídeo é idêntica à segunda sequência de nucleotídeo, exceto para até uma, duas ou três substituições de nucleotídeo (por exemplo, adenosina substituída por uracila). Essencialmente retendo a capacidade para inibir a expressão de alfa-ENaC em células humanas cultivadas, como usado aqui referindo-se a um agente de iRNA não-idêntico mas derivado de um dos agentes de iRNA de Tabelas 1A-1D por deleção, adição ou substituição de nucleotídeos, significa que o agente de iRNA derivado possui uma atividade inibitória não menor do que 20% da atividade inibitória do agente de iRNA de Tabelas 1A-1D de que foi derivado. Por exemplo, um agente de iRNA derivado de um agente de iRNA de Tabelas 1A-1D que abaixa a quantidade de mRNA alfa-ENaC presente nas células humanas cultivadas por 70% pode sozinho diminuir a quantidade de mRNA presente nas células humanas cultivadas por pelo menos 50% a fim de ser consideradas como essencialmente retendo a capacidade de inibir a replicação de alfa-ENaC em células humanas cultivadas. Opcionalmente, um agente de iRNA da invenção pode diminuir a quantidade de mRNA alfa-ENaC presente nas células humanas cultivadas por pelo menos 50%.
[0024] Como usado aqui, um indivíduo se refere a um organismo de mamífero submetendo-se a tratamento para um distúrbio mediado por alfa-ENaC. O indivíduo pode ser qualquer mamífero, tal como uma vaca, cavalo, camundongo, rato, cão, porco, bode, ou um primata. Na modalidade preferida, o indivíduo é um humano.
Projeto e Seleção de agentes de iRNA
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 14/176
10/161 [0025] Como usado aqui, distúrbios associados com a expressão de alfa-ENaC se refere a qualquer estado biológico ou patológico que (1) é mediado pelo menos em parte pela presença de alfa-ENaC e (2) cujo resultado pode ser efetuado reduzindo o nível de alfa-ENaC presente. Distúrbios específicos associados com expressão de alfa-ENaC são apontados abaixo.
[0026] A presente invenção é baseada no projeto, na síntese e na geração de agentes de iRNA que marcam alfa-ENaC e a demonstração de silenciamento do gene alfa-ENaC in vitro em células cultivadas após incubação com um agente de iRNA, e o efeito protetor resultante para distúrbios mediados por alfa-ENaC.
[0027] Um agente de iRNA pode ser racionalmente projetado baseado na informação de sequência e características desejadas. Por exemplo, um agente de iRNA pode ser projetado de acordo com uma temperatura de fusão relativa do candidato de duplex. Geralmente, o duplex deve ter uma menor temperatura de fusão na extremidade 5' da fita antissenso que na extremidade 3' da fita antissenso.
[0028] A presente invenção provê composições contendo siRNA(s) e/ou shRNA(s) marcadas para um ou mais transcritos de alfa-ENaC. [0029] Para qualquer marcação de gene particular que é selecionada, o projeto de siRNAs ou shRNAs para uso de acordo com a presente invenção preferivelmente seguirá certas diretrizes. Também, em muitos casos, o agente que é liberado a uma célula de acordo com a presente invenção pode submeter-se a uma ou mais etapas de processamento antes de tornar-se um agente de supressão ativo (vide abaixo para outra discussão); em tais casos, os versados na técnica apreciarão que o agente relevante preferivelmente será projetado para incluir sequências que podem ser necessárias para seu processamento.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 15/176
11/161 [0030] Doenças mediadas por disfunção do canal de sódio epitelial incluem doenças associadas com a regulação de volumes fluidos através de membranas epiteliais. Por exemplo, o volume de líquido de superfície de vias respiratórias é um regulador chave de depuração mucociliar e a manutenção de saúde pulmonar. O bloqueio do canal de sódio epitelial promoverá acúmulo de fluido na lateral mucosal do epitélio da via respiratória por meio disso promovendo a depuração de muco e prevenindo a acumulação de muco e escarro em tecidos respiratórios (incluindo vias respiratórias pulmonares). Tais doenças incluem doenças respiratórias, tais como fibrose cística, discinesia ciliar primária, bronquite crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, infecções de trato respiratório (aguda e crônica; viral e bacteriana) e carcinoma pulmonar. Doenças mediadas por bloqueio do canal de sódio epitelial também incluem doenças diferentes de doenças respiratórias que são associadas com regulação de fluido anormal através de um epitélio, talvez envolvendo fisiologia anormal dos líquidos de superfície protetora na sua superfície, por exemplo, xerostomia (boca seca) ou ceratoconjuntivite sire (olho seco). Além disso, bloqueio do canal de sódio epitelial no rim poderia ser usado para promover diurese e por meio disso induzir um efeito hipotensivo.
[0031] Tratamento de acordo com a invenção pode ser sintomático ou profilático.
[0032] Asma inclui tanto asma intrínseca (não-alérgica) como asma extrínseca (alérgica), asma branda, asma moderada, asma severa, asma brônquica, asma induzida por exercício, asma ocupacional e asma induzida seguinte infecção bacteriana. Tratamento de asma é também para ser entendido como englobando tratamento de indivíduos, por exemplo, de menos do que 4 ou 5 anos de idade, exibindo sintomas de chiados e diagnosticados ou diagnosticáveis como crianças com chiado, uma categoria de paciente estabelecida de maior
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 16/176
12/161 preocupação médica e agora frequentemente identificada como incipiente ou asmáticos em fase inicial. (Por conveniência esse particular condição de asmático é referida como síndrome da criança com chiado.) [0033] Eficácia profilática no tratamento de asma será evidenciada por frequência reduzida ou severidade de ataque sintomático, por exemplo, de ataque asmático agudo ou bronco constritor, melhoria em função pulmonar ou hiperatividade das vias respiratórias melhorada. Pode ainda ser evidenciado pelo requerimento reduzido para outra, terapia sintomática, isto é, terapia para ou destinada para restringir ou abortar ataque sintomático quando ocorre, por exemplo, antiinflamatório (por exemplo, corticosteroide) ou broncodilatatório. Benefício profilático em asma pode, em particular, ser aparente em indivíduos propensos a morning dipping'. Morning dipping' é uma síndrome asmática reconhecida, comum a uma porcentagem substancial de asmáticos e caracterizada por ataque de asma, por exemplo, entre as horas de cerca de 4-6 da manhã, isto é, em um tempo normalmente substancialmente distante de qualquer terapia de asma sintomática previamente administrada.
[0034] Doença pulmonar obstrutiva crônica inclui bronquite crônica ou dispneia que lhe é associada, enfisema, bem como exacerbação de hiperatividade de vias respiratórias consequente a outra terapia de fármaco, em particular, a outra terapia de fármaco inalada. A invenção é também aplicável ao tratamento de bronquite de qualquer tipo ou gênese incluindo, por exemplo, bronquite aguda, araquídica, catarral, crupe, crônica ou ftinoide.
[0035] Com base nos resultados mostrados aqui, a presente invenção provê agentes de iRNA que reduzem expressão de alfa-ENaC em células cultivadas e em um indivíduo, por exemplo um mamífero, por exemplo um humano. Tabelas 1A-1D provêem agentes de iRNA
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 17/176
13/161 exemplares marcando alfa-ENaC, baseados nas abreviações de nomenclatura-padrão dada na Tabela A.
[0036] Tabela 1A, SEQ. ID NOs 305-608, tabela 1B e tabela 1D, SEQ ID NOs 1519-1644 listam siRNAs que não compreendem modificações de nucleotídeo exceto para uma ligação de fosforotioato entre o término 3' e as penúltimas timidinas. As Seq Ids restantes nas Tabelas 1A-1D listam siRNAs onde todos nucleotídeos compreendendo bases de pirimidina são 2'-O-metil-nucleotídeo modificados na fita senso, e todas uridinas em um contexto de sequência de 5'-ua-3' bem como todas citidinas em um contexto de sequência de ou 5'-ca-3' são 2'-Ometil-nucleotídeo modificados na fita antissenso.
[0037] Com base nestes resultados, a invenção especificamente provê um agente de iRNA que inclui uma fita senso tendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da fita de sequências de senso do agentes providos nas Tabelas 1A-1D, e uma fita antissenso tendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da sequências de senso do agentes providos nas Tabelas 1A-1D.
[0038] Os agentes de iRNA mostrados nas Tabelas 1A-1D são compostos de duas fitas de 19 nucleotídeos em comprimento que são complementares ou idênticos à sequência-alvo, mais uma extremidade com cauda de 3'-TT. A presente invenção provê agentes que compreendem pelo menos 15, ou pelo menos 16, 17, ou 18, ou 19 nucleotídeos contíguos destas sequências. Entretanto, enquanto estes comprimentos podem potencialmente ser ótimos, os agentes de iRNA não pretendem ser limitados a estes comprimentos. O versado conhece bem que agentes de iRNA mais curtos ou mais longos podem ser similarmente eficazes, uma vez que, dentro de certas faixas de comprimento, a eficácia é bem mais uma função da sequência de nucleotídeo do que do comprimento da fita. Por exemplo, Yang, et al., PNAS 99: 9942-9947 (2002), demonstrou eficácias similares para agentes de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 18/176
14/161 iRNA de comprimentos entre 21 e 30 pares de base. Outros autores mostraram silenciamento eficaz de genes por agentes de iRNA abaixo de um comprimento de aproximadamente 15 pares de base (Byrom, et al., Inducing RNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase III Tech Notes 10(1), Ambion, Inc., Austin, TX).
[0039] Portanto, é possível e contemplado pela presente invenção selecionar a partir das sequências providas nas Tabelas 1A-1D, uma sequência parcial de entre 15 a 19 nucleotídeos para a geração de um agente de iRNA derivado a partir de uma das sequências providas nas Tabelas 1A-1D. Alternativamente, pode-se adicionar um ou vários nucleotídeos a uma das sequências providas nas Tabelas 1A-1D, ou um agente compreendendo 15 nucleotídeos contíguos de um destes agentes, preferivelmente, mas não necessariamente, em tal maneira que os nucleotídeos adicionados são complementares à respectiva sequência do gene-alvo, por exemplo, alfa-ENaC. Por exemplo, os primeiros 15 nucleotídeos de um dos agentes podem ser combinados com os 8 nucleotídeos encontrados 5' a esta sequência em mRNA alfa-ENaC para obter um agente com 23 nucleotídeos nas fitas senso e antissenso. Todos dentre tais agentes de iRNA derivados estão incluídos nos agentes de iRNA da presente invenção, desde que eles essencialmente retenham a capacidade de inibir a replicação de alfaENaC em células humanas cultivadas.
[0040] A fita antissenso de um agente de iRNA deve ser igual a ou pelo menos, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40, ou 50 nucleotídeos em comprimento. Deve ser igual a ou menos do que 60, 50, 40, ou 30 nucleotídeos em comprimento. Faixas preferidas são 15-30, 17 a 25, 19 a 23, e 19 a 21 nucleotídeos em comprimento.
[0041] A fita senso de um agente de iRNA deve ser igual a ou pelo menos 14, 15, 16 17, 18, 19, 25, 29, 40, ou 50 nucleotídeos em comprimento. Deve ser igual a ou menos do que 60, 50, 40, ou 30 nucleoPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 19/176
15/161 tídeos em comprimento. Faixas preferidas são 15-30, 17 a 25, 19 a 23, e 19 a 21 nucleotídeos em comprimento.
[0042] A porção de fita dupla de um agente de iRNA deve ser igual a ou pelo menos, 15, 16 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40, ou 50 pares de nucleotídeo em comprimento. Deve ser igual a ou menos do que 60, 50, 40, ou 30 pares de nucleotídeos em comprimento. Faixas preferidas são 15-30, 17 a 25, 19 a 23, e 19 a 21 pares de nucleotídeos em comprimento.
[0043] Geralmente, os agentes de iRNA da presente invenção incluem um região de complementaridade suficiente ao mRNA alfaENaC, e são de comprimento suficiente em termos de nucleotídeos, que o agente de iRNA, ou um fragmento do mesmo, pode mediar a regulação negativa do gene alfa-ENaC. Não é necessário que exista complementaridade perfeita entre o agente de iRNA e o gene-alvo, mas a correspondência deve ser suficiente para possibilitar ao agente de iRNA, ou a um produto de clivagem do mesmo, direcionar o silenciamento específico da sequência, por exemplo, por clivagem de RNAi de um mRNA alfa-ENaC.
[0044] Portanto, os agentes de iRNA da presente invenção incluem agentes compreendendo uma fita senso e uma fita antissenso cada compreendendo uma sequência de pelo menos 16, 17 ou 18 nucleotídeos que é essencialmente idêntica, como definido abaixo, a uma das sequências de Tabelas 1A-1D, exceto que não mais que 1, 2 ou 3 nucleotídeos por fita, respectivamente, foram substituídos por outros nucleotídeos (por exemplo adenosina substituída por uracila), enquanto essencialmente retendo a capacidade para inibir a expressão de alfa-ENaC em células humanas cultivadas. Estes agentes irão assim possuir pelo menos 15 nucleotídeos idênticos a uma das sequências de Tabelas 1A-1D, mas 1, 2 ou 3 desalinhamentos de base com relação a quer a sequência de alfa-ENaC alvo ou entre a fita senso ou anPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 20/176
16/161 tissenso serão introduzidos. Os desalinhamentos na sequência de RNA alfa-ENaC alvo, particularmente na fita antissenso, são mais tolerados nas regiões terminais e se presentes estão preferivelmente em uma região ou regiões terminais, por exemplo, dentro de 6, 5, 4, ou 3 nucleotídeos de um terminal 5' e/ou 3', mais preferivelmente dentro de 6, 5, 4, ou 3 nucleotídeos do terminal 5' da fita senso ou o terminal 3' da fita antissenso. A fita senso necessita apenas ser suficientemente complementar com a fita antissenso para manter o caráter de fita dupla global da molécula.
[0045] É preferido que as fitas de senso e antissenso sejam escolhidas tal que o agente de iRNA inclua uma fita simples ou região nãopareada em uma ou ambas extremidades da molécula. Deste modo, um agente de iRNA contém fitas senso e antissenso, preferivelmente pareados para conter uma extremidade com cauda, por exemplo, uma ou duas extremidades com cauda 5' ou 3' mas preferivelmente uma extremidade com cauda 3' de 2-3 nucleotídeos. A maior parte das modalidades terá uma extremidade com cauda 3'. Agentes de siRNA preferidos terão extremidades com cauda de fitas simples, preferivelmente extremidades com cauda 3', de 1 a 4, ou preferivelmente 2 ou 3 nucleotídeos, em comprimento, em uma ou ambas extremidades do agente de iRNA. As extremidades com cauda podem ser o resultado de uma fita sendo mais longa que a outra, ou o resultado de duas fitas do mesmo comprimento serem escalonadas. Os nucleotídeos nãopareados formando a extremidade com cauda podem ser ribonucleotídeos, ou eles podem ser desoxiribonucleotídeos, preferivelmente timidina. Extremidades 5' são preferivelmente fosforiladas, ou elas podem ser não-fosforiladas.
[0046] Comprimentos preferidos para região duplexada são entre e 30, mais preferivelmente 18, 19, 20, 21, 22, e 23 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, na faixa de agente de siRNA discutida
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 21/176
17/161 acima. Agentes de siRNA pode assemelhar-se em comprimento e estrutura aos produtos processados Dicer naturais de dsRNAs longos. Modalidades em que as duas fitas do agente de siRNA são ligadas, por exemplo, covalentemente ligadas, são também incluídas. Em forma de grampo de cabelo, ou outras estruturas simples de fita que provêem a requerida região de fita dupla, e preferivelmente uma extremidade com cauda 3' também estão dentro da invenção.
Avaliação de Agentes de iRNA Candidatos [0047] Como notado acima, a presente invenção provê um sistema para identificar siRNAs que são úteis como inibidores de alfa-ENaC. Uma vez que, como notado acima, shRNAs são processados intracelularmente para produzir siRNAs tendo porções duplex com a mesma sequência como a estrutura de tronco do shRNA, o sistema é igualmente útil para identificar shRNAs que são úteis como inibidores de alfa-ENaC. Para propósitos de descrição, esta seção faz referência a siRNAs, mas o sistema também engloba shRNAs correspondentes. Especificamente, a presente invenção demonstra a preparação de sucesso de siRNAs marcados para inibir a atividade de alfa-ENaC. As técnicas e reagentes descritos aqui podem prontamente ser aplicados para projetar siRNAs de novo potencial, marcados a outros genes ou regiões de gene, e testados para sua atividade em inibir alfa-ENaC como discutido aqui.
[0048] Em várias modalidades da invenção inibidores potenciais de alfa-ENaC podem ser testados para supressão de expressão endógena de alfa-ENaC introduzindo siRNA(s) candidato(s) nas células (por exemplo, por administração exógena ou introdução de um vetor ou construção que direciona a síntese endógena de siRNA na célula), ou em animais de laboratório por administração pulmonar ou nasal. Alternativamente, inibidores potenciais de alfa-ENaC podem ser testados in vitro por cotransfecção transiente de siRNA(s) candidato(s) junPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 22/176
18/161 to com um plasmídeo de expressão de alfa-ENaC. A capacidade dos siRNA(s) candidato(s) de reduzir os níveis de transcrito-alvo e/ou inibir ou suprimir um ou mais aspectos ou caracteres de atividade de alfaENaC tal como diferença de potencial epitelial ou absorção de fluido de superfície de via respiratória é então avaliada.
[0049] Células ou animais de laboratório para os quais as composições de siRNA inventivas foram liberadas (células/animais de teste) podem ser comparadas com similares ou comparáveis a células ou animais de laboratório que não receberam a composição inventiva (células/animais de controle, por exemplo, células/animais que não receberam quer siRNA ou siRNA de controle, tal como um siRNA marcado para um transcrito não-endógeno tal como proteína fluorescente verde (GFP)). Os fenótipos de transporte de íons das células/animais de teste podem ser comparados com o fenótipo de células/animais de controle, desde que o siRNA inventivo divida a reatividade cruzada de sequência com o tipo/espécie de célula de teste. Produção de proteína de alfa-ENaC e corrente de curto-circuito (in vitro ou ex vivo) podem ser comparadas nas células/animais de teste relativo às células/animais de controle. Outros indícios de atividade de alfa-ENaC, incluindo diferença de potencial epitelial ex vivo ou depuração mucociliar in vivo ou ressonância magnética de corpo completo (MRI), podem ser similarmente comparados. Geralmente, células/animais de teste e células/animais de controle seriam da mesma espécie e, para células, de tipo celular similar ou idêntico. Por exemplo, células da mesma linhagem celular poderiam ser comparadas. Quando a célula de teste é uma célula primária, tipicamente a célula de controle também seria uma célula primária.
[0050] Por exemplo, a capacidade de um siRNA candidato para inibir a atividade de alfa-ENaC pode ser convenientemente determinada (i) liberando o siRNA candidato a células (ii) avaliando os níveis de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 23/176
19/161 expressão de mRNA alfa-ENaC relativa a um gene de controle expressado endogenamente (iii) comparando a corrente sensível a amilorida em um modelo celular in vitro produzido na presença do siRNA com a quantidade produzida na ausência do siRNA. Este último teste pode ser usado para testar siRNAs que marcam qualquer transcritoalvo que pode influenciar a atividade de alfa-ENaC indiretamente e não é limitado a siRNAs que marcam os transcritos que codificam as subunidades de canal de ENaC.
[0051] A capacidade de um siRNA candidato reduzir o nível do transcrito-alvo pode ser avaliada medindo a quantidade do transcritoalvo usando, por exemplo, Northern blots, testes de proteção de nuclease, hibridização de sonda, transcrição reversa (RT)-PCR, RT-PCR de tempo real, análise em micromatriz, etc. A capacidade de um siRNA candidato de inibir a produção de um polipeptídeo codificado pelo transcrito-alvo (quer no nível transcricional ou pós-transcricional) pode ser medida usando uma variedade de abordagens baseadas em anticorpo incluindo, mas limitadas a, Western blots, imunotestes, ELISA, citometria de fluxo, micromatrizes de proteína, etc. Em geral, qualquer método de medir a quantidade de quer o transcrito-alvo ou um polipeptídeo codificado pelo transcrito-alvo pode ser usado.
[0052] Em geral, alguns inibidores de iRNA alfa-ENac preferidos reduzem o nível de transcrito-alvo pelo menos cerca de 2 vezes, preferivelmente pelo menos cerca de 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 16 vezes, pelo menos cerca de 64 vezes ou para um grau ainda maior relativo ao nível que poderia estar presente na ausência do inibidor (por exemplo, em uma célula de controle comparável faltando o inibidor). Em geral, alguns inibidores de iRNA alfa-ENac preferidos inibem atividade de canal de ENaC, de modo que a atividade é menor em uma célula contendo o inibidor que em uma célula de controle não contendo o inibidor por pePetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 24/176
20/161 lo menos cerca de 2 vezes, preferivelmente pelo menos cerca de 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 16 vezes, pelo menos cerca de 64 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, ou a um grau ainda maior.
[0053] Alguns inibidores de iRNA alfa-ENac preferidos inibem atividade de canal de ENaC por pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 60 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 96 horas, pelo menos 120 horas, pelo menos 144 horas ou pelo menos 168 horas seguindo administração do siRNA e infecção das células. Alguns inibidores de alfaENaC preferidos previnem (isto é, reduzem para níveis nãodetectáveis) ou significantemente reduzem atividade de alfa-ENaC por pelo menos 24 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 48 horas, ou pelo menos 60 horas seguindo administração do siRNA. De acordo com modalidades da invenção uma redução significante na atividade de alfa-ENaC é uma redução para menos do que aproximadamente 90% do nível que ocorreria na ausência do siRNA, uma redução para menos do que aproximadamente 75% do nível que ocorreria na ausência do siRNA, uma redução para menos do que aproximadamente 50% do nível que ocorreria na ausência do siRNA, um redução para menos do que aproximadamente 25% do nível que ocorreria na ausência do siRNA, ou uma redução para menos do que aproximadamente 10% do nível que ocorreria na ausência do siRNA. Redução na atividade de alfa-ENaC pode ser medida usando qualquer método apropriado incluindo, mas não-limitado a, medição de corrente de curto-circuito de sensibilidade a amilorida in vitro, diferença de potencial epitelial ex vivo ou em depuração mucociliar in vivo ou MRI de corpo completo/pulmão.
Teste de estabilidade, modificação, e reteste de agentes de iRNA
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 25/176
21/161 [0054] Um agente de iRNA candidato pode ser avaliado com relação a estabilidade, por exemplo, sua suscetibilidade à clivagem por uma endonuclease ou exonuclease, tal como quando o agente de iRNA é introduzido no corpo de um indivíduo. Métodos podem ser empregados para identificar os sítios que são suscetíveis à modificação, particularmente clivagem, por exemplo, clivagem por um componente encontrado no corpo de um indivíduo. Tais métodos podem incluir o isolamento e a identificação de fragmentos mais abundantes formados por degradação do agente de iRNA candidato após sua incubação com meios de cultura biológicos isolados in vitro, por exemplo soro, plasma, catarro, fluido cerebrospinal, ou célula ou homogenados de tecido, ou após contatar um indivíduo com o agente de iRNA candidato in vivo, assim identificando sítios aptos à clivagem. Tais métodos são encontrados, por exemplo, sem limitação, em Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO2005115481, depositado em 27 de Maio de 2005.
[0055] Quando sítios suscetíveis à clivagem são identificados, um outro agente de iRNA pode ser projetado e/ou sintetizado em que a sítio de clivagem potencial é tornado resistente à clivagem, por exemplo, por introdução de uma modificação 2' no sítio de clivagem, por exemplo um grupo de 2'-O-metila. Este outro agente de iRNA pode ser retestado para estabilidade, e este processo pode ser repetido até um agente de iRNA ser encontrado exibindo a estabilidade desejada.
Teste In vivo [0056] Um agente de iRNA identificado como sendo capaz de inibir a expressão de gene de alfa-ENaC pode ser testado para funcionalidade in vivo em um modelo animal (por exemplo, em um mamífero, tal como em camundongo, rato, porquinho-da-índia ou primata). Por exemplo, o agente de iRNA pode ser administrado a um animal, e o agente de iRNA avaliado com respeito a sua bioliberação, estabilidaPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 26/176
22/161 de, e sua capacidade para inibir a expressão de alfa-ENaC ou modular um processo biológico ou patológico mediado pelo menos em parte por alfa-ENaC.
[0057] O agente de iRNA pode ser administrado diretamente ao tecido-alvo, tal como por injeção, ou o agente de iRNA pode ser administrado ao modelo animal na mesma maneira que seria administrada a um humano. Preferivelmente, o agente de iRNA é liberado às vias respiratórias do indivíduo, tal como por administração intranasal, inalada ou intratraqueal.
[0058] O agente de iRNA pode ser também avaliado para sua liberação intracelular. A avaliação pode incluir determinar se o agente de iRNA foi absorvido dentro da célula. A avaliação pode também incluir determinar a estabilidade (por exemplo, a meia-vida) do agente de iRNA. Avaliação de um agente de iRNA in vivo pode ser facilitada por uso de um agente de iRNA conjugado a um marcador rastreável (por exemplo, um marcador fluorescente tal como fluoresceína; um rótulo radioativo, tal como 35S, 32P, 33P, ou 3H; partículas de ouro; ou partículas de antígeno para imuno-histoquímica).
[0059] O agente de iRNA pode ser avaliado com relação à sua capacidade para regular de modo negativo a expressão de alfa-alfaENaC. Níveis de expressão de gene alfa-ENaC in vivo podem ser medidos, por exemplo, por hibridização in situ, ou pela isolamento de RNA do tecido antes de e após a exposição ao agente de iRNA. Onde o animal necessita ser sacrificado a fim de coletar o tecido, um animal de controle não-tratado servirá para comparação. Alfa-ENaC RNA pode ser detectado por qualquer método desejado, incluindo mas nãolimitado a RT-PCR, Northern blot, teste de DNA ramificado, ou teste de proteção de RNAase. Alternativamente, ou adicionalmente, a expressão de gene de alfa-ENaC pode ser monitorada realizando a análise
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 27/176
23/161 de Western blot ou imunocoloração em extratos de tecido tratado com o agente de iRNA.
[0060] Inibidores potenciais de alfa-ENaC podem ser testados usando qualquer variedade de animais modelos que foram desenvolvidos. Composições compreendendo siRNA(s) candidato(s), construções ou vetores capazes de dirigir a síntese de tais siRNAs dentro de uma célula hospedeira, ou células engenheiradas ou manipuladas para conter siRNA candidatos podem ser administradas a um animal. A capacidade da composição para suprimir a expressão de alfa-ENaC e/ou para modificar fenótipos dependentes de ENaC e/ou diminuir sua severidade relativa a animais que não receberam o inibidor de alfaENaC potencial é avaliada. Tais modelos incluem, mas não são limitados a, modelos de murino, rato, porquinho-da-índia, ovelha e primatas não-humanos para fenótipos dependentes de ENaC, todos sendo conhecidos na técnica e são usados para testar a eficácia de terapêutica de alfa-ENaC potencial.
[0061] Utilizando os sistemas inventados para identificar agentes de siRNA terapêutico candidato, agentes terapêuticos apropriados são selecionados de identificadores Duplex ND-8302, ND-8332, ND-8348, ND-8356, ND-8357, ND-8373, ND-8381, ND-8396, ND-8450 e ND8453, mais apropriadamente selecionados ND-8356, ND-8357 e ND8396.
Química de iRNA [0062] São descritos aqui agentes de iRNA isolados, por exemplo, agentes de ds RNA que mediam RNAi para inibir a expressão do gene alfa-ENaC.
[0063] Agentes de RNA discutidos aqui incluem de outra forma
RNA não-modificado bem como RNA que foi modificado, por exemplo, para melhorar a eficácia, e polímeros de substitutos de nucleosídeos.
RNA não-modificado se refere a uma molécula em que os componenPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 28/176
24/161 tes do ácido nucleico, isto é, açúcares, bases, e porções de fosfato, são os mesmos ou essencialmente os mesmos que ocorrem na natureza, preferivelmente como ocorrem naturalmente no corpo humano. A técnica fez referência a RNAs raros ou incomuns, mas de ocorrência natural, como RNA modificados, vide, por exemplo, Limbach et al. Nucleic acids Res. 22: 2183-2196, 1994. Tais RNAs raros e não-comuns frequentemente chamados RNA modificados (aparentemente porque eles são tipicamente o resultado de uma modificação póstranscricional) estão dentro do termo RNA não-modificado, como usado aqui. RNA modificado como usado aqui se refere a uma molécula em que um ou mais dos componentes do ácido nucleico, isto é, açúcares, bases, e porções de fosfato, são diferentes daqueles que ocorrem em natureza, preferivelmente diferentes daquele que ocorrem no corpo humano. Apesar de serem referidos como RNAs modificados, eles irão, como evidente, devido à modificação, incluir moléculas que não são RNAs. Substitutos de nucleosídeos são moléculas em que a estrutura dorsal de ribofosfato é substituída com uma construção nãoribofosfato que permite às bases a serem apresentadas na relação espacial correta, tal que hibridização é substancialmente similar à que é vista com uma estrutura dorsal de ribofosfato, por exemplo, miméticos não-carregados da estrutura dorsal de ribofosfato. Exemplos dos acima são discutidos aqui.
[0064] Modificações descritas aqui podem ser incorporadas em qualquer RNA de fita dupla e molécula como RNA descrita aqui, por exemplo, um agente de iRNA. Pode ser desejável modificar um ou ambos das fitas antissenso e senso de um agente de iRNA. Como os ácidos nucleicos são polímeros de subunidades ou monômeros, muitas das modificações descritas abaixo ocorrem em uma posição que é repetida dentro de um ácido nucleico, por exemplo, uma modificação de uma base, ou uma porção de fosfato, ou o oxigênio não-ligante de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 29/176
25/161 uma porção de fosfato. Em alguns casos a modificação ocorrerá em todas das posições do indivíduo no ácido nucleico mas em muitos casos, e de fato na maioria, não irá ocorrer. A título de exemplo, uma modificação pode apenas ocorrer em uma posição terminal 3' ou 5', pode apenas ocorrer em uma região terminal, por exemplo em uma posição e um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5, ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região de fita dupla, uma região de fita simples, ou em ambos. Por exemplo, uma modificação de fosforotioato em uma posição O não-ligante pode apenas ocorrer em um ou ambos os términos, pode apenas ocorrer em regiões terminais, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5, ou 10 nucleotídeos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões de fita dupla e fita simples, particularmente no terminal. Similarmente, uma modificação pode ocorrer na fita senso, fita antissenso, ou ambas. Em alguns casos, a fita senso ou antissenso terá as mesmas modificações ou a mesma classe de modificações, mas em outros casos a fita senso ou antissenso terá diferentes modificações, por exemplo, em alguns casos pode ser desejável modificar apenas uma fita, por exemplo, a fita senso.
[0065] Dois objetivos principais para a introdução de modificações em agentes de iRNA é sua estabilização com relação à degradação em meios biológicos e a melhora de propriedades farmacológicas, por exemplo propriedades farmacodinâmicas, que são ainda discutidas abaixo. Outras modificações apropriadas a um açúcar, base, ou estrutura dorsal de um agente de iRNA são descritas em Pedido PCT N° PCT/US2004/01193, depositado em 16 de Janeiro de 2004. Um agente de iRNA pode incluir uma base de ocorrência não-natural, tal como as bases descritas no Pedido PCT N° PCT/US2004/011822, depositado em 16 de Abril de 2004. Um agente de iRNA pode incluir um açúcar de ocorrência não-natural, tal como um molécula de veículo cíclico não
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 30/176
26/161 carboidrato. Os aspectos exemplares de açúcares de ocorrência nãonatural para uso em agentes de iRNA são descritos em Pedido PCT N° PCT/US2004/11829, depositado em 16 de Abril de 2003.
[0066] Um agente de iRNA pode incluir uma ligação de internucleotídeo (por exemplo, a ligação quiral de fosforotioato) útil para aumentar a resistência de nuclease. Além disso, ou na alternativa, um agente de iRNA pode incluir um mimético de ribose para resistência aumentada de nuclease. Ligação exemplar de internucleotídeos e miméticos de ribose para resistência aumentada de nuclease são descritos em Pedido PCT N° PCT/US2004/07070, depositado em 8 de março de 2004. [0067] Um agente de iRNA pode incluir subunidades de monômero conjugadas a ligante e monômeros para síntese de oligonucleotídeo. Monômeros exemplares são descritos em Pedido U.S N° 10/916,185, depositado em 10 de agosto de 2004.
[0068] Um agente de iRNA pode ter uma estrutura ZXY, tal como é descrito no Pedido PCT N° PCT/US2004/07070, depositado em 8 de março de 2004.
[0069] Um agente de iRNA pode ser complexado com um porção anfipática. Porções anfipáticas exemplares para uso com agentes de iRNA são descritos em Pedido PCT N° PCT/US2004/07070, depositado em 8 março de 2004.
[0070] Em outras modalidades, o agente de iRNA pode ser complexado a um agente de liberação que caracteriza um complexo modular. O complexo pode incluir um agente portador ligado a uma ou mais de (preferivelmente dois ou mais, mais preferivelmente todos três de): (a) um agente condensante (por exemplo, um agente capaz de atrair, por exemplo, ligando, um ácido nucleico, por exemplo, através de interações iônicas ou eletroestáticas); (b) um agente fusogênico (por exemplo, um agente capaz de fusionar e/ou sendo transportado através de uma membrana celular); e (c) um grupo de marcação, por
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 31/176
27/161 exemplo, uma célula ou agente-alvo de tecido, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídio ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que liga a um tipo de célula especificada. Agentes de iRNA complexados a um agente de liberação são descritos no Pedido PCT N° PCT/US2004/07070, depositado em 8 de março de 2004.
[0071] Um agente de iRNA pode ter pareamentos não-canônicos, tal como entre as sequências senso e antissenso do iRNA duplex. Aspectos exemplares de agentes de iRNA não-canônicos são descritos no Pedido PCT N° PCT/US2004/07070, depositado em 8 de março de 2004.
Resistência aumentada a nuclease [0072] Um agente de iRNA, por exemplo, um agente de iRNA que marca alfa-ENaC, pode ter resistência melhorada a nucleases.
[0073] Uma forma de aumentar a resistência é para identificar sítios de clivagem e modificar tais sítios para inibir a clivagem, como descrito em Pedido U.S N° 60/559.917, depositado em 4 de maio de 2004. Por exemplo, os dinucleotídeos 5’-ua-3’, 5’-ca-3’, 5’-ug-3’, 5’-uu3', ou 5’-cc-3’ podem servir como sítios de clivagem. Em algumas modalidades, todas as pirimidinas de um agente de iRNA carregam uma modificação 2’ tanto na fita senso, na fita antissenso, ou ambas as fitas, e o agente de iRNA assim melhora a resistência a endonucleases. A resistência aumentada a nuclease pode também ser realizada modificando o 5' nucleotídeo, resultando, por exemplo, em pelo menos um 5' uridina-adenina-3’ (5’-ua-3’) dinucleotídeo em que a uridina é um 2'nucleotídeo modificado; pelo menos um 5’-citidina-adenina-3’ (5’-ca-3’) dinucleotídeo em que a citidina-5' é um 2’-nucleotídeo modificado; pelo menos um 5’-uridina-guanina-3’ (5’-ug-3’) dinucleotídeo, em que a 5’uridina é um 2'-nucleotídeo modificado; pelo menos um 5'-uridinauridina-3’ (5’-uu-3’) dinucleotídeo, em que a 5’-uridina é um 2'nucleotídeo modificado; ou pelo menos uma 5' citidina-citidina-3’ (5’Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 32/176
28/161 cc-3’) dinucleotídeo, em que a citidina-5' é um 2'-nucleotídeo modificado, como descrito no Pedido Internacional N° PCT/US2005/018931, depositado em 27 de maio de 2005. O agente de iRNA pode incluir pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou pelo menos 5 de tais dinucleotídeos. Em uma modalidade particularmente preferida, o 5' nucleotídeo em todas as ocorrências dos motivos de sequência 5’-ua3’ e 5’-ca-3’ tanto na fita senso, na fita antissenso, ou ambas fitas é um nucleotídeo modificado. Preferivelmente, o 5' nucleotídeo em todas as ocorrências dos motivos de sequência 5’-ua-3’, 5’-ca-3’ e 5’-ug-3’ em quer a fita senso, a fita antissenso, ou ambos as fitas é um nucleotídeo modificado. Mais preferivelmente, todos os nucleotídeos de pirimidina na fita senso são nucleotídeo modificados, e o 5' nucleotídeo em todas ocorrências dos motivos de sequência 5’-ua-3’ e 5’-ca-3’ na fita antissenso são nucleotídeo modificados, ou onde a fita antissenso não compreende nem de um motivo 5’-ua-3’ e um 5’-ca-3’, em todas ocorrências do motivo de sequência 5’-ug-3’.
[0074] Preferivelmente, os nucleotídeos modificados de 2’ incluem, por exemplo, uma unidade de 2’ ribose modificada, por exemplo, o grupo 2’-hidroxila (OH) pode ser modificado ou substituído com um número de substituintes óxi ou desóxi diferentes.
[0075] Exemplos de modificações de grupo de 2’ hidroxila óxiincluem alcóxi ou arilóxi (OR, por exemplo, R = H, alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar); polietilenoglicóis (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucleicos travados (LNA) em que a 2' hidroxila é conectada, por exemplo, por uma ponte de metileno, para o 4' carbono do mesmo açúcar de ribose; O-AMINA e aminoalcóxi, O(CH2)nAMINA, (por exemplo, AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil amino, arilamino, diaril amino, heteroarila amino, ou diheteroarila amino, etileno diamina, poliamino). É digno de nota que oligonucleotídeos contendo apenas o grupo etoximetila (MOE),
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 33/176
29/161 (OCH2CH2OCH3, uma PEG derivada), exibem estabilidades à nuclease comparáveis àquelas modificadas com a modificação robusta de fosforotioato.
[0076] Modificações desóxi incluem hidrogênio (isto é, açúcares desoxirribose, que são de particular relevância para as porções de extremidade com cauda de RNA parcialmente ds); halo (por exemplo, flúor); amino (por exemplo NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diaril amino, heteroarila amino, di-heteroarila amino, ou aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil amino, arilamino, diaril amino, heteroarila amino,ou di-heteroarila amino), -NHC(O)R (R = alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar), ciano; mercapto; alquil-tioalquila; tioalcóxi; e alquila, cicloalquila, arila, alquenila e alquinila, que pode ser opcionalmente substituída com, por exemplo, uma funcionalidade amino.
[0077] Substituintes preferidos são 2'-metoxietila, 2'-OCH3, 2'-Oalila, 2'-C- alila, e 2'-flúor.
[0078] A inclusão de açúcares de furanose na estrutura dorsal de oligonucleotídeo pode também diminuir a clivagem endonucleolítica. Um agente de iRNA pode ser ainda modificado incluindo um grupo catiônico 3', ou invertendo o nucleosídeo no término 3' com uma ligação 3'-3'. Em outra alternativa, o término 3' pode ser bloqueado com um grupo aminoalquila, por exemplo, um C5-aminoalquila dT de 3'. Outros conjugados de 3' podem inibir a clivagem exonucleolítica de 3'-5'. Apesar de não-limitado pela teoria, um conjugado de 3', tal como naproxeno ou ibuprofeno, podem inibir a clivagem exonucleolítica estereo-quimicamente bloqueando a exonuclease de ligação para a extremidade 3' de oligonucleotídeo. Mesmo pequenas cadeias de alquila, grupos arila, ou conjugados heterocíclicos ou açúcares modificados
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 34/176
30/161 (D-ribose, desoxiribose, glicose etc.) podem bloquear as 3’5’exonucleases.
[0079] Clivagem nucleolítica pode também ser inibida pela introdução de modificações de ligador de fosfato, por exemplo, ligação de fosforotioatos. Deste modo, agentes de iRNA preferidos incluem dímeros de nucleotídeos enriquecidos ou puros para uma forma quiral particular de um grupo modificado de fosfato contendo um heteroátomo em uma posição não-ligante normalmente ocupado por oxigênio. O heteroátomo pode ser S, Se, Nr2, ou Br3. Quando o heteroátomo é S, ligação Sp enriquecida ou quiralmente pura é preferida. Meios enriquecidos pelo menos 70, 80, 90, 95, ou 99% da forma preferida. Ligações de fosfato modificadas são particularmente eficazes para inibir a clivagem exonucleolítica quando introduzidas próximo às posições terminais 5' ou 3’, e preferivelmente as posições terminais 5', de um agente de iRNA.
[0080] Conjugados 5’ podem também inibir clivagem exonucleolítica 5’-3’. Apesar de não-limitado por teoria, um conjugado 5’, tal como naproxeno ou ibuprofeno, pode inibir a clivagem exonucleolítica estereo-quimicamente bloqueando a exonuclease de ligação para a extremidade 5’ de oligonucleotídeo. Mesmo pequenas cadeias de alquila, grupos arila, ou conjugados heterocíclicos ou açúcares modificados (D-ribose, desoxiribose, glicose etc.) podem bloquear exonucleases 3’5’.
[0081] Um agente de iRNA pode ter resistência aumentada a nucleases quando um agente de iRNA duplexado inclui uma extremidade com cauda de nucleotídeo de fita simples em pelo menos uma extremidade. Em modalidades preferidas, a extremidade com cauda de nucleotídeo inclui 1 a 4, preferivelmente 2 a 3, nucleotídeos nãopareados. Em uma modalidade preferida, o nucleotídeo não-pareado da extremidade com cauda de fita simples que está diretamente adjaPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 35/176
31/161 cente ao par de nucleotídeos terminais contém uma base de purina, e o par de nucleotídeo terminal é um par G-C, ou pelo menos dois dos últimos quatro pares complementares de nucleotídeo são pares G-C. Em outras modalidades, a extremidade com cauda de nucleotídeo pode ter 1 ou 2 nucleotídeos não-pareados, e em uma modalidade exemplar a extremidade com cauda de nucleotídeo é 5’-gc-3’. Em modalidades preferidas, a extremidade com cauda de nucleotídeo está na extremidade 3’ da fita antissenso. Em uma modalidade, o agente de iRNA inclui o motivo 5'-cgc-3' na extremidade 3’ da fita antissenso, tal que uma extremidade com cauda de 2-nt 5'-gc-3' é formada.
[0082] Deste modo, um agente de iRNA pode incluir modificações de modo a inibir degradação, por exemplo, por nucleases, por exemplo, endonucleases ou exonucleases, encontradas no corpo de um indivíduo. Estes monômeros são referidos aqui como NRMs, ou monômeros promovendo resistência a nuclease, as modificações correspondentes como modificações de NRM. Em muitos casos, estas modificações modularão outras propriedades do agente de iRNA bem como, por exemplo, a capacidade para interagir com uma proteína, por exemplo, uma proteína de transporte, por exemplo, albumina de soro, ou um membro do RISC, ou a capacidade da primeira e segunda sequências de formar um duplex com uma outra ou de formar um duplex com outra sequência, por exemplo, uma molécula-alvo.
[0083] Uma ou mais modificações diferentes de NRM podem ser introduzidas em um agente de iRNA ou em uma sequência de um agente de iRNA. Uma modificação de NRM pode ser usada mais de uma vez em uma sequência ou em um agente de iRNA.
[0084] Modificações de NRM incluem algumas que podem ser substituídas apenas no término e outras que podem ir para qualquer posição. Algumas modificações de NRM podem inibir a hibridização, de modo que é preferível usá-las em regiões terminais, e é preferível
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 36/176
32/161 não usá-las no sítio de clivagem ou na região de clivagem de uma sequência que marca um sequência ou gene de indivíduo, particularmente na fita antissenso. Elas podem ser usadas em qualquer lugar em uma fita senso, providas que suficiente hibridização entre as duas fitas do agente de iRNA ds seja mantida. Em algumas modalidades é desejável colocar NRM no sítio de clivagem ou na região de clivagem de uma fita senso, como pode minimizar silenciamento fora do alvo.
[0085] Na maioria dos casos, modificações de NRM serão liberadas diferentemente dependendo de elas estão compreendidas em uma fita senso ou antissenso. Se em uma fita antissenso, modificações que interferem com ou inibem a clivagem de endonuclease não devem ser inseridas na região que é submetida à clivagem mediada por RISC, por exemplo, o sítio de clivagem ou a região de clivagem (como descrito em Elbashir et al., 2001, Genes e Dev. 15: 188, aqui incorporado por referência). Clivagem do alvo ocorre em cerca de no meio de uma fita antissenso de 20 ou 21 nt, ou cerca de 10 ou 11 nucleotídeos a montante do primeiro nucleotídeo no mRNA-alvo que é complementar aa fita antissenso. Como usado aqui sítio de clivagem se refere aos nucleotídeos em ambos os lados do sítio de clivagem, no alvo ou na fita de agente de iRNA que hibridiza no mesmo. Região de clivagem significa os nucleotídeos dentro de 1, 2, ou 3 nucleotídeos do sítio de clivagem, em qualquer direção.
[0086] Tais modificações podem ser introduzidas nas regiões terminais, por exemplo, na posição terminal ou com 2, 3, 4, ou 5 posições do terminal, de uma fita senso e antissenso.
Ligantes captivos [0087] As propriedades de um agente de iRNA, incluindo suas propriedades farmacológicas, podem ser influenciadas e adequadas, por exemplo, pela introdução de ligantes, por exemplo, ligantes captivos. Além disso, propriedades farmacológicas de um agente de iRNA
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 37/176
33/161 podem ser melhoradas incorporando um ligante em uma formulação do agente de iRNA quando o agente de iRNA quer tem ou de fato tem um ligante captivo.
[0088] Uma ampla variedade de entidades, por exemplo, ligantes, podem ser tornados captivos a um agente de iRNA ou usados como conjugado ou aditivo de formulação, por exemplo, ao portador de uma subunidade de monômero conjugado com ligante. Exemplos são descritos abaixo no contexto de uma subunidade de monômero conjugado com ligante, mas que é apenas preferida, entidades podem ser copuladas em outros pontos a um agente de iRNA.
[0089] Porções preferidas são ligantes, que são copulados, preferivelmente covalentemente, quer diretamente ou indiretamente, através de um captivo interveniente para o carreador. Em modalidades preferidas, o ligante é fixado ao carreador através de um captivo interveniente. O ligante ou ligante captivo pode estar presente no monômero conjugado ao ligante quando o monômero conjugado a um ligante é incorporado na fita em crescimento. Em algumas modalidades, o ligante pode ser incorporado em uma subunidade de monômero precursor conjugado ao ligante após uma subunidade de monômero precursor conjugado ao ligante ser incorporada na fita em crescimento. Por exemplo, um monômero tendo, por exemplo, um captivo aminoterminado, por exemplo, TAP-(CH2)nNH2 pode ser incorporado em uma fita em crescimento senso e antissenso. Em uma operação subsequente, isto é, após a incorporação da subunidade de monômero precursor na fita, um ligante tendo um grupo eletrofílico, por exemplo, um grupo aldeído ou éster de pentafluorfenila, pode subsequentemente ser fixado ao monômero precursor conjugado ao ligante copulando o grupo eletrofílico do ligante com o grupo nucleofílico terminal do captivo da subunidade de monômero precursor conjugado a ligante.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 38/176
34/161 [0090] Em modalidades preferidas, um ligante altera a liberação, marcação ou tempo de vida de um agente de iRNA em que é incorporado. Em modalidades preferidas um ligante provê uma afinidade melhorada para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo celular, compartimento, por exemplo, um compartimento celular ou de órgão, tecido, órgão ou região do corpo, como, por exemplo, comparado a espécies ausentes como um ligante.
[0091] Ligantes preferidos podem melhorar transporte, hibridização, e propriedades de especificidade e podem também melhorar resistência a nuclease do oligorribonucleotídeo natural ou modificado resultante, ou uma molécula polimérica compreendendo qualquer combinação de monômeros descrita aqui e/ou ribonucleotídeos naturais ou modificados.
[0092] Ligantes em geral podem incluir modificadores terapêuticos, por exemplo, para aumentar a absorção; compostos diagnóstico ou grupos-repórter por exemplo, para monitorar a liberação; agentes reticulantes; porções conferindo resistência a nuclease; e nucleobases naturais ou não-usuais. Exemplos gerais incluem moléculas lipofílicas, lípidios, lectinas, esteroides (por exemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por exemplo, triterpenos, por exemplo, sarsasapogenina, Friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas, carboidratos (por exemplo, um dextrano, pululano, quitina, quitosana, polímeros sintético (por exemplo Oligo Lactato 15 mer) e natural (por exemplo peso molecular baixo e médio), inulina, ciclodextrina ou ácido hialurônico), proteínas, agentes ligantes de proteína, moléculas alvo de integrina, policatiônicos, peptídeos, poliaminas, e peptídeos miméticos. Outros exemplos incluem ácido fólico ou ligantes dos receptores de célula epitelial, tal como transferina.
[0093] O ligante pode ser uma molécula ocorrendo naturalmente ou recombinante ou sintética, tal como um polímero sintético, por
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 39/176
35/161 exemplo, um poliaminoácido sintético. Exemplos de poliaminoácidos incluem polilisina (PLL), ácido poli L-aspártico, poli ácido L-glutâmico, copolímero anidrido de ácido estireno-maleico, copolímero de poli(Llactídeo-co-glicolídeo), copolímero anidrido maleico de divinil éter, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietileno glicol (PEG), álcool de polivinila (PVA), poliuretano, poli(2-ácido etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, ou polifosfazina. Exemplos de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, porções catiônicas, por exemplo, lipídio catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina, ou um peptídeo alfa helical.
[0094] Ligantes podem também incluir grupos de marcação, por exemplo, uma célula ou agente-alvo de tecido, por exemplo, um tirotropina, melanotropina, proteína A tensoativa, carboidrato de mucina, um poliaminoácido glicosilado, transferrina, bisfosfanato, poliglutamato, poliasparato, ou um peptídeo Arg-Gly-Asp (RGD) ou peptídeo mimético RGD.
[0095] Ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas, lipoproteínas, por exemplo lipoproteína de baixa densidade (LDL), ou albuminas, por exemplo albumina humana de soro (HSA), ou peptídeos, por exemplo, moléculas tendo uma afinidade específica para um co-ligante, ou anticorpos por exemplo, um anticorpo, que liga a um tipo de célula especificada tal como uma célula de câncer, célula endotelial, ou célula óssea. Ligantes podem também incluir hormônios e receptores de hormônio. Eles podem também incluir espécies não peptídicas, tal como cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manose multivalente, ou fucose multivalente.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 40/176
36/161 [0096] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um fármaco, que pode aumentar a absorção do agente de iRNA na célula, por exemplo, rompendo o citoesqueleto celular, por exemplo, rompendo os microtúbulos celulares, microfilamentos, e/ou filamentos intermediários. O fármaco pode ser, por exemplo, taxona, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, mioservina, tetraciclina.
[0097] Em um aspecto, o ligante é um lipídio ou molécula à base de lipídio. Tal lipídio ou molécula à base de lipídio preferivelmente liga uma proteína de soro, por exemplo, albumina humana de soro (HSA). Um ligante do ligante de HSA permite a liberação do conjugado para um tecido-alvo, por exemplo, tecido hepático, incluindo células do parênquima do fígado. Outras moléculas que podem ligar HSA podem também ser usadas como ligantes. Por exemplo, neproxina ou aspirina podem ser usadas. Um lipídio ou ligante à base de lipídio pode (a) aumentar a resistência à degradação do conjugado, (b) aumentar a marcação ou transporte em uma célula-alvo ou membrana celular, e/ou (c) pode ser usado para ajustar a ligação a uma proteína de soro, por exemplo, HSA.
[0098] Um ligante à base de lipídio pode ser usado para modular, por exemplo, controlar a ligação do conjugado a um tecido-alvo. Por exemplo, um lipídio ou ligante à base de lipídio que liga um HSA mais fortemente será menos provável de ser direcionado ao rim e portanto menos provável de ser depurado do corpo.
[0099] Em uma modalidade preferida, o ligante à base de lipídio liga-se a HSA. Preferivelmente, ele liga HSA com uma afinidade suficiente tal que o conjugado será preferivelmente distribuído a um tecido não-rim. Entretanto, é preferido que a afinidade não seja tão forte que a ligação de HSA-ligante não possa ser revertida.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 41/176
37/161 [00100] Em outro aspecto, o ligante é uma porção, por exemplo, uma vitamina ou nutriente, que é absorvida por uma célula alvo, por exemplo, uma célula proliferante. Estas são particularmente úteis para tratar distúrbios caracterizados por proliferação de célula indesejada, por exemplo, do tipo maligno ou não-maligno, por exemplo, de células de câncer. Vitaminas exemplares incluem vitamina A, E, e K. Outras vitaminas exemplares incluem as vitaminas B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes absorvidas por células de câncer.
[00101] Em outro aspecto, o ligante é um agente de permeação de célula, preferivelmente um agente helicoidal de permeação de célula. Preferivelmente, o agente é anfipático. Um agente exemplar é um peptídeo tal como tat ou antennapedia. Se o agente é um peptídeo, ele pode ser modificado, incluindo um peptidilmimético, invertômeros, ligações de não-peptídicas ou pseudo-peptídicas, e uso de Daminoácidos. O agente helicoidal é preferivelmente um agente alfahelicoidal, que preferivelmente tem uma fase lipofílica e uma lipofóbica. O agente de permeação de célula pode ser ligado covalentemente ao agente de iRNA ou ser parte de um complexo de iRNA-peptídeo. Modificações de 5'-Fosfato [00102] Em modalidades preferidas, agentes de iRNA são 5' fosforilados ou incluem um análogo de fosforila no terminal 5' primordial. As modificações 5'-fosfato da fita antissenso incluem aquelas que são compatíveis com silenciamento de genes mediado por RISC. As modificações apropriadas incluem: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P-O-5'); 5'difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfato ((HO)2(O)P-O(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-extremidade guanosina (7-metilada ou não-metilada) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); extremidade 5'-adenosina (Appp), e qualquer estrutura terminal de nucleotídeo modificada ou não-modificada (N-O-5'-(HO)(O)P-OPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 42/176
38/161 (HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); qualquer combinação adicional de monofosfato, difosfato e trifosfatos substituídos com oxigênio/enxofre (por exemplo 5'-alfa-tiotrifosfato, 5'-gama-tiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'alquilfosfanatos (R=alquila=metila, etila, isopropila, propila, etc., por exemplo RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-alquileterfosfanatos (R=alquiléter=metoximetila (MeOCH2-), etoximetila, etc., por exemplo RP(OH)(O)-O-5'-).
[00103] A fita senso pode ser modificada a fim de inativar a fita senso e evitar a formação de um RISC-ativo, assim potencialmente reduzindo os efeitos de marcação fora do alvo. Isto pode ser obtido por uma modificação que evita a 5'-fosforilação da fita senso, por exemplo, por modificação com um 5'-O-metil ribonucleotídeo (vide Nykanen et al., (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321.) Outras modificações que evitam a fosforilação também podem ser usadas por exemplo, simplesmente substituindo o 5'-OH por H em vez de por O-Me. Alternativamente, um grupo volumoso grande pode ser adicionado ao 5'fosfato tornando o mesmo uma ligação fosfodiéster.
Nucleobases não-naturais [00104] Nitropirrolila e nitroindolila são nucleobases não-naturais que são membros de uma classe de compostos conhecidos como bases universais. As bases universais são os compostos que podem substituir qualquer uma dentre quatro bases de ocorrência natural sem afetar substancialmente o comportamento de fusão e a atividade do duplex de oligonucleotídeo. Em contraste com a interação de ligação, hidrogênio estabilizante associado com nucleobases de ocorrência natural, é postulado que os duplexes de oligonucleotídeos contendo nuPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 43/176
39/161 cleobases de 3-nitropirrolila são estabilizados apenas por empilhamento de interações. A ausência de interações de ligação de hidrogênio significantes com nucleobases de nitropirrolila torna óbvia a especificidade para uma base complementar específica. Além disso, vários relatos confirmam que a 4-, 5- e 6-nitroindolila demonstra uma especificidade muito pequena para as quatro bases naturais. De modo interessante, um duplex de oligonucleotídeo contendo 5-nitroindolila foi mais estável do que os oligonucleotídeos correspondentes contendo 4nitroindolila e 6-nitroindolila. Procedimentos para a preparação de 1(2’-O-metil-p-D-ribofuranosil)-5-nitroindol são descritos em Gaubert, G.; Wengel, J. Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629. Outras bases universais que levaram à presente invenção incluem hipoxantinila, isoinosinila, 2-aza-inosinila, 7-deaza-inosinila, nitroimidazolila nitropirazolila, nitrobenzimidazolila, nitroindazolila, aminoindolila, pirrolopirimidinila, e derivados estruturais das mesmas. Para uma discussão mais detalhada, incluindo procedimentos sintéticos, de bases de nitropirrolila, nitroindolila, e outras bases universais mencionadas acima vide Vallone et al., Nucleic Acids Research, 27(17):3589-3596 (1999); Loakes et al., J. Mol. Bio., 270:426-436 (1997); Loakes et al., Nucleic Acids Research, 22(20):4039-4043 (1994); Oliver et al., Organic Letters, Vol. 3(13):1977-1980 (2001); Amosova et al., Nucleic Acids Research, 25(10):1930-1934 (1997); Loakes et al., Nucleic Acids Research, 29(12):2437-2447 (2001); Bergstrom et al., J. Am. Chem. Soc., 117:1201-1209 (1995); Franchetti et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 11:6769 (2001); e Nair et al., Nucelosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 20(4-7):735-738 (2001).
[00105] Difluortolila é uma nucleobase não-natural que funciona como uma base universal. Difluortolila é um isoéster da nucleobase natural timina. Mas diferente de timina, difluortolila não mostra seletividade apreciável para qualquer uma das bases naturais. Outros comPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 44/176
40/161 postos aromáticos que funcionam como bases universais e que conduzem à presente invenção são 4-flúor-6-metilbenzimidazol e 4metilbenzimidazol. Além disso, os derivados de isocarbostirilila hidrofóbicos 3-metil isocarbostirilila, 5-metil isocar-bostirilila, e 3-metil-7propinil isocarbostirilila são bases universais que causam apenas uma leve desestabilização de duplexes de oligonucleotídeos comparados à sequência de oligonucleotídeos contendo somente bases naturais. Outras nucleobases não-naturais contempladas na presente invenção incluem 7-azaindolila, 6-metil-7-azaindolila, imidizopiridinila, 9-metil-imidizopiridinila, pirrolopirizinila, isocarbostirilila, 7-propinil isocarbosti-rilila, propinil-7-azaindolila, 2,4,5-trimetilfenila, 4-metilindolila,
4,6-dimetili-dolila, fenila, naftalenila, antracenila, fenantracenila, pirenila, estilbenila, tetracenila, pentacenila, e derivados estruturais das mesmas. Para uma discussão mais detalhada, incluindo procedimentos sintéticos, difluortolila, 4-flúor-6-metilbenzimidazol, 4metilbenzimidazol, e outras bases não-naturais mencionadas acima, vide: Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122(32):7621-7632 (2000); O’Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434-10442 (1995); e Patente U.S. N° 6.218.108.
[00106] Transporte de agentes de iRNA para dentro das células
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 45/176
41/161 [00107] Não desejando ser limitado por qualquer teoria, a similaridade química entre agentes de iRNA conjugados a colesterol e alguns constituintes de lipoproteínas (por exemplo colesterol, ésteres de colesterila, fosfolípidos) pode levar à associação de agentes de iRNA com lipoproteínas (por exemplo LDL, HDL) no sangue e/ou a interação do agente de iRNA com componentes celulares tendo uma afinidade para colesterol, por exemplo componentes da via de transporte de colesterol. Lipoproteínas, bem como seus constituintes são absorvidos e processados pelas células por vários mecanismos de transporte passivos e ativos, por exemplo, sem limitação, endocitose de LDL ligada ao receptor de LDL, endocitose de LDLs oxidados ou de outra forma modificados através de interação com receptor de captação A, absorção mediada por receptor de captação B1 de colesterol HDL no fígado, pinocitose, ou transporte de colesterol através de membranas por proteínas transportadororas ABC (cassete de ligação de ATP-), por exemplo ABC-A1, ABC-G1 ou ABC-G4. Assim, agentes de iRNA conjugados a colesterol podem desfrutar de uma absorção facilitada por células possuindo estes mecanismos de transporte, por exemplo células de fígado. Como tal, a presente invenção provê evidência e métodos gerais para a marcação de agentes de iRNA para células expressando alguns componentes de superfície de célula, por exemplo receptores, por conjugação de um ligante natural para este componente (por exemplo colesterol) para o agente de iRNA, ou por conjugação de uma porção química (por exemplo colesterol) para o agente de iRNA que se associa com ou se liga a um ligante natural para o componente (por exemplo LDL, HDL).
Outras Modalidades [00108] Um agente de iRNA, pode ser produzido em uma célula in vivo, por exemplo, a partir de moldes de DNA exógeno que são liberados na célula. Por exemplo, os moldes de DNA podem ser inseridos
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 46/176
42/161 em vetores e usados como vetores para terapia gênica. Os vetores de terapia gênica podem ser liberados a um indivíduo por, por exemplo, injeção intravenosa, administração local (Patente U.S. N° 5.328.470), ou por injeção estereotática (vide, por exemplo, Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057, 1994). A preparação farmacêutica do vetor de terapia gênica pode incluir o vetor de terapia gênica em um diluente aceitável, ou pode compreender uma matriz de liberação lenta em que o veículo de liberação de genes é incrustado. Os moldes de DNA, por exemplo, podem incluir duas unidades de transcrição, uma que produz um transcrito que inclui a fita de topo de um agente de iRNA e uma que produz um transcrito que inclui a fita de fundo de um agente de iRNA. Quando os moldes são transcritos, o agente de iRNA é produzido, e processados nos fragmentos do agente de siRNA que mediam o silenciamento de genes.
Formulação [00109] A presente invenção também inclui composições farmacêuticas e formulações que incluem os compostos dsRNA da invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em vários modos dependendo do que se deseja, um tratamento local ou sistêmico, e sobre a área a ser tratada. A administração pode ser tópica, pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou intracranial, por exemplo, administração intratecal ou intraventricular.
[00110] Composições farmacêuticas e formulações para administração tópica podem incluir curativos transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós.
Os veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, de pó ou
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 47/176
43/161 oleosas, espessadores e outros podem ser necessários ou desejáveis. Os preservativos, luvas e outros revestidos também podem ser utilizáveis. As formulações tópicas preferidas incluem aquelas em que dsRNAs da invenção estão em mistura com um agente de ligação tópico, como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. Preferidos lipídios e lipossomas incluem neutros (por exemplo dioleoilfosfatidil etanolamina = DOPE, dimiristoilfosfatidil colina = DMPC, distearolifosfatidil colina), negativos (por exemplo dimiristoilfosfatidil glicerol = DMPG) e catiônico (por exemplo dioleoiltetrametilaminopropila = DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina = DOTMA), por exemplo brometo de (+/-)-N-(3aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis (dodecilóxi)-1-propanamínio = GAPDLRIE). DsRNAs da invenção podem ser encapsulados dentro de lipossomas ou podem formar complexos com os mesmos em particular para lipossomas catiônicos. Alternativamente, dsRNAs podem ser complexados em lípidos, em particular a lípidos catiônicos. Preferidos ácidos graxos e ésteres incluem, mas não são limitados a, ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um éster de C1-10 alquila (por exemplo miristato de isopropila IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. As formulações tópicas são descritas em detalhes no pedido de patente US N° de série 09/315.298 depositado em 20 de maio de 1999 que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00111] Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meios não-aquosos, cápsulas, cápsulas de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 48/176
44/161 gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes flavorizantes, diluentes, emulsificadores, ajudantes de dispersão ou ligantes podem ser desejáveis. Formulações orais preferidas são aquelas em que dsRNAs da invenção são administrados em conjunto com um ou mais melhoradores da penetração, tensoativos, e quelantes. Preferidos tensoativos incluem ácidos graxos e/ou ésteres ou sais do mesmo, ácidos biliares e/ou sais dos mesmos. Preferidos ácidos biliares/sais incluem ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glidesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio e glicodi-hidrofusidato de sódio. Preferidos ácidos graxos incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, gliceril-1-monocaprato, 1-dodecilazaciclo-heptan2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, sódio). Também preferidas são combinações de melhoradores da penetração, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação particularmente preferida é o sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros melhoradores da penetração incluem polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. DsRNAs da invenção podem ser liberados oralmente, em forma granular incluindo partículas secas por pulverização, ou complexados para formar micro ou nanopartículas. Agentes complexando DsRNA incluem poli-aminoácidos; poli-iminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poli-iminas derivadas de DEAE, polulanos, cePetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 49/176
45/161 luloses e amidos. Agentes complexantes particularmente preferidos incluem quitosana, N-trimetilquitosana, poli-L-lisina, poli-histidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por exemplo p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(iso-hexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAEdextrano, polimetilacrilato, poli-hexilacrilato, ácido poli(D,L-lático), ácido co-glicólico poli(DL-látic (PLGA), alginato, e polietilenoglicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhes no pedido US número de série 08/886,829 (depositado 1 de julho de 1997), número de série 09/108,673 (depositado 1 de julho de
1998) , número de série 09/256,515 (depositado 23 de fevereiro de
1999) , número de série 09/082,624 (depositado 21 de maio de 1998) e número de série 09/315,298 (depositado 20 de maio de 1999), cada sendo incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00112] Composições e formulações para administração parenteral, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos apropriados tais como, mas não-limitados a, melhoradores da penetração, compostos veículos e outros veículos farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes.
[00113] Composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, soluções, emulsões, e formulações contendo lipossomas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não são limitados a, líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes.
[00114] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem convenientemente ser apresentadas em forma unidade de doPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 50/176
46/161 sagem, podem ser preparadas de acordo com técnica convencional bem como conhecida na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de trazer em associação os ingredientes ativos com os carreador(es) farmacêutico(s) ou excipiente(s). Em geral, as formulações são preparadas uniformemente e intimamente trazem em associação os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, moldam o produto. [00115] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis tais como, mas não-limitada a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis suaves, supositórios, e enemas. As composições da presente invenção podem também ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não-aquosos ou misturados. Suspensões aquosas podem ainda conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode também conter estabilizadores.
[00116] Em uma modalidade da presente invenção estas composições farmacêuticas podem ser formuladas e usadas como espumas. Espumas farmacêuticas incluem formulações tais como, mas nãolimitado a, emulsões, microemulsões, cremes, geléias e lipossomas. Enquanto basicamente similar em natureza, as formulações variam nos componentes e na consistência do produto final. A preparação de tais composições e formulações é geralmente conhecida pelos versados nas técnicas farmacêuticas e formulação e pode ser aplicada à formulação das composições da presente invenção.
Emulsões [00117] As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. Emulsões são tipicamente sistemas heterogêneos de um líquido dispersado em outro na forma de gotícuPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 51/176
47/161 las geralmente excedendo 0,1 pm em diâmetro (Idson, em Pharmaceutic Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, em Pharmaceutic dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutic Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., em Remington's Pharmaceutic Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Emulsões são frequentemente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersadas com cada outra. Em geral, emulsões podem ser de quer uma variedade água em óleo (w/o) ou uma de óleo em água (o/w). Quando uma fase aquosa é finamente dividida em e dispersada como gotículas minúsculas em uma fase oleosa volumosa, a composição resultante é chamada de uma emulsão água em óleo (w/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa é finamente dividida em e dispersada como gotículas minúsculas em uma fase aquosa volumosa, a composição resultante é chamada de uma emulsão óleo em água (o/w). Emulsões podem conter componentes adicionais em adição às fases dispersadas, e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução em quer a fase aquosa, fase oleosa ou por si só como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos tal como emulsificadores, estabilizadores, corantes, e anti-oxidantes podem também estar presentes em emulsões conforme necessário. Emulsões farmacêuticas podem também ser emulsões múltiplas que são compreendidas de mais de duas fases tal como, por exemplo, no caso de emulsões óleo em água em óleo (o/w/o) e água em óleo em água (w/o/w). Tais formulações complexas frequentemente provêem certas vantagens que emulsões binárias simples não fazem. Emulsões múltiplas em que gotículas de óleo individuais de uma emulsão o/w englobam pequenas
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 52/176
48/161 gotículas de água constituem uma emulsão w/o/w. Do mesmo modo que um sistema de gotículas de óleo englobadas em glóbulos de água estabilizada em uma fase contínua oleosa provê uma emulsão o/w/o. [00118] Emulsões são caracterizadas por estabilidade termodinâmica pequena ou inexistente. Frequentemente, a fase dispersada ou descontínua da emulsão é bem-dispersada na fase externa ou contínua e mantida nessa forma através dos meios de emulsificadores ou a viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como é o caso de bases de pomada de estilo de emulsão e cremes. Outros meios de estabilizar emulsões requerem o uso de emulsificadores que podem ser incorporados em qualquer fase da emulsão. Emulsificadores podem amplamente ser classificados em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificadores ocorrendo naturalmente, bases de absorção, e sólidos finamente dispersados (Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
[00119] Tensoativos sintéticos, também conhecidos como agentes ativos de superfície, encontraram ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revistos na literatura (Rieger, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Tensoativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e uma hidrofóbica. A relação da natureza hidrofílica para a hidrofóbica do tensoativo foi chamada de equilíbrio hidrofílico/lipofílico (HLB) e é uma valiosa ferramenta em categorizar e selecionar tensoativos na preparação de formulações. Tensoativos podem ser classificados em classes diferentes baseadas na natureza do grupo hidrofílico: não-iônica, aniônica,
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 53/176
49/161 catiônica e anfotérica (Rieger, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
[00120] Emulsificadores ocorrendo naturalmente usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatídeos, lecitina e acácia. Bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas tal que elas podem absorver água para formar emulsões w/o e ainda conservar suas consistências semissólidas, tal como lanolina anidra e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos também foram usados como bons emulsificadores especialmente em combinação com tensoativos e em preparações viscosas. Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tal como hidróxidos de metal pesado, argilas não inchadas tal como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio de magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não polares tal como carbono ou triestearato de glicerila.
[00121] Uma ampla variedade de materiais não emulsificantes são também incluídos nas formulações de emulsão e contribuem às propriedades de emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, alcóois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos, conservantes e antioxidantes (Block, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
[00122] Coloides hidrofílicos ou hidrocoloides incluem gomas de ocorrência natural e polímeros sintéticos tal como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenana, goma de guar, goma de karaya, e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose), e polímeros sintéticos
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 54/176
50/161 (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose, e polímeros de carboxivinila). Estes são dispersos ou intumescidos em água para formar soluções coloidais que estabilizam as emulsões formando filmes interfaceais fortes envoltos por gotículas de fase dispersada e aumentando a viscosidade da fase externa.
[00123] Uma vez que emulsões frequentemente contêm um número de ingredientes tal como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos que podem prontamente suportar o crescimento de micróbios, estas formulações frequentemente incorporam conservantes. Conservantes comumente usados incluídos em formulações de emulsão incluem metil parabeno, propil parabeno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, e ácido bórico. Antioxidantes são também comumente adicionados a formulações de emulsão para prevenir deterioração da formulação. Antioxidantes usados podem ser captações de radicais livres tal como tocoferóis, alquil galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores tal como ácido ascórbico e metabisulfito de sódio, e sinérgicos antioxidantes tal como ácido cítrico, ácido tartárico, e lecitina.
[00124] A aplicação de formulações de emulsão através de vias dermatológicas, orais e parenterais e métodos para sua fabricação foram revistos na literatura (Idson, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Formulações de emulsão para liberação oral foram muito amplamente usadas devido à facilidade de formulação, bem como eficácia de um ponto de vista de absorção e biodisponibilidade (Rosoff, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Laxantes à base de óleo mineral, vitaminas solúveis em óleo e
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 55/176
51/161 preparações nutritivas com alto teor de gordura estão entre os materiais que foram comumente administrados oralmente como emulsões o/w.
[00125] Em uma modalidade da presente invenção, as composições de dsRNAs e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema anfifílico de água e óleo e que é uma solução opticamente isotrópica simples e líquida termodinamicamente estável (Rosoff, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Tipicamente microemulsões são sistemas que são preparados primeiro dispersando um óleo em uma solução tensoativa aquosa e então adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool de cadeia de comprimento intermediário para formar um sistema transparente. Portanto, microemulsões também foram descritas como termodinamicamente estáveis, dispersões isotropicamente claras de dois líquidos imiscíveis que são estabilizados por filmes interfaciais de moléculas ativas na superfície (Leung e Shah, em: Controlled Release of Drugs: Polimers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pags. 185-215). Microemulsões comumente são preparadas através de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, cotensoativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água em óleo (w/o) ou uma óleo em água (o/w) é dependente das propriedades do óleo e tensoativo usados e da estrutura e envelopagem geométrica das cabeças polares e caudas de hidrocarbonetos das moléculas tensoativas (Schott, em Remington's Farmacêutico Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271). [00126] A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fase foi extensivamente estudada e rendeu um conhecimento compreensivo, ao versado na técnica, de como formular microemulsões (Rosoff,
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 56/176
52/161 em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). Comparadas a emulsões convencionais, microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar fármacos solúveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que são formadas espontaneamente.
[00127] Tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, mas não são limitados a, tensoativos iônicos, tensoativos nãoiônicos, Brij 96, polioxietileno oleil éter, ésteres de ácidos graxos poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), mono-oleato de tetraglicerol (MO310), mono-oleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), sozinhos ou em combinação com cotensoativos. O cotensoativo, geralmente um álcool de cadeia curta tal como etanol, 1-propanol, e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial penetrando no filme tensoativo e consequentemente criando um filme desordenado devido ao espaço vazio gerado entre as moléculas tensoativas. Microemulsões podem, entretanto, ser preparadas sem o uso de cotensoativos e sistemas de microemulsão autoemulsificantes livres de álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode tipicamente ser, mas não é limitada a, água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propileno glicóis, e derivados de etileno glicol. A fase de óleo pode incluir, mas não é limitada a, materiais tal como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos graxos, mono, di, e tri-glicerídeos de cadeia média (C8-C12), gliceril ésteres de ácidos graxos polioxietilados,
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 57/176
53/161 alcóois graxos, glicerídeos poliglicolizados, glicerídeos C8-C10 poliglicolizados saturados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[00128] Microemulsões são particularmente de interesse a partir do ponto de vista de solubilização de fármaco e a absorção aumentada de fármacos. Lipídio com base em microemulsões (ambos o/w e w/o) foi proposto para aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (Constantinides et al., Pharmaceutic Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Microemulsões proporcionam vantagens de solubilização de fármaco melhoradas, proteção de fármaco a partir de hidrólise enzimática, aumento possível de absorção de fármaco devido a alterações induzidas por tensoativo na fluidez e permeabilidade de membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral sobre formas de dosagem sólidas, potência clínica melhorada, e toxicidade diminuída (Constantinides et al., Pharmaceutic Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Frequentemente microemulsões podem formar espontaneamente quando seus componentes são colocados juntos em temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso quando formulando fármacos termolábeis, peptídeos ou dsRNAs. Microemulsões também foram eficazes na liberação transdérmica de componentes ativos em ambas aplicações, cosmética e farmacêutica. É esperado que as composições de microemulsão e formulações da presente invenção facilitarão a absorção sistêmica aumentada de dsRNAs e ácidos nucleicos do trato gastrointestinal, bem como melhora da absorção celular local de dsRNAs e ácidos nucleicos dentro do trato gastrointestinal, vagina, poço bucal e outras áreas de administração .
[00129] Microemulsões da presente invenção podem também conter componentes adicionais e aditivos tal como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol, e melhoradores da penetração para melhorar
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 58/176
54/161 as propriedades da formulação e para aumentar a absorção dos dsRNAs e ácidos nucleicos da presente invenção. Melhoradores da penetração usado nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencendo a uma das cinco amplas categorias de tensoativos, ácidos graxos, sais de bile, agentes quelantes, e nãotensoativos não-quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Vehycle Systems, 1991, p. 92). Cada dessas classes foram discutidas acima.
Lipossomas [00130] Existem muitas estruturas tensoativas organizadas além de microemulsões que foram estudadas e usadas para a formulação de fármacos. Essas incluem monocamadas, micelas, bicamadas e vesículas. Vesículas, tal como lipossomas, atraíram grande interesse devido a sua especificidade e a duração de ação que elas oferecem a partir do ponto de vista de liberação de fármaco. Como usado na presente invenção, o termo lipossoma significa uma vesícula composta de lipídios anfifílicos arrumados em uma bicamada esférica ou bicamadas. [00131] Lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição a ser liberada. Lipossomas catiônicos possuem a vantagem de ser aptos a unir-se a parede celular. Lipossomas não catiônicos, embora não aptos a unir-se tão eficazmente com a membrana celular, são capturados por macrófagos in vivo.
[00132] A fim de cruzar a pele de mamíferos de modo intacto, as vesículas de lipídio devem passar através de uma série de poros finos, cada com um diâmetro menor do que 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico apropriado. Portanto, é desejável usar um lipossoma que é altamente deformável e apto a passar através de tais poros finos.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 59/176
55/161 [00133] Outras vantagens de lipossomas incluem; lipossomas obtidos a partir de fosfolipídios natural são biocompatíveis e biodegradáveis; lipossomas podem incorporar uma ampla faixa de água e fármacos solúveis em lipídio; lipossomas podem proteger fármacos encapsulados em seus compartimentos internos de metabolismo e degradação (Rosoff, em Pharmaceutic dosage forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Considerações importantes na preparação de formulações de lipossoma são a carga de superfície de lipídio, tamanho de vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.
[00134] Lipossomas são úteis para a transferência e liberação de ingredientes ativos ao sítio de ação. Devido à membrana lipossomal é estruturalmente similar a membranas biológicas, quando lipossomas são aplicados a um tecido, os lipossomas começam a fundir com as membranas celulares e como a fusão do lipossoma e célula progride, os conteúdos lipossomais são esvaziados na célula onde o agente ativo pode agir.
[00135] Formulações lipossomais têm sido o foco de extensiva investigação como o modo de liberação para muitos fármacos. Existe evidência de crescimento que para administração tópica, lipossomas presenciam várias vantagens sobre outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos colaterais reduzidos relacionados à elevada absorção sistêmica do fármaco administrado, acumulação aumentada do fármaco administrado no alvo desejado, e a capacidade para administrar uma ampla variedade de fármacos, ambos hidrofílicos e hidrofóbicos, na pele.
[00136] Vários relatórios detalharam a capacidade de lipossomas para liberar agentes incluindo DNA de peso molecular alto na pele.
Compostos incluindo analgésicos, anticorpos, hormônios e DNA de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 60/176
56/161 peso molecular alto foram administrados à pele. A maioria das aplicações resultou na marcação da epiderme superior.
[00137] Lipossomas se dividem em duas grandes classes. Lipossomas catiônicos são lipossomas positivamente carregados que interagem com as moléculas de DNA negativamente carregadas para formar um complexo estável. O DNA positivamente carregado/complexo de lipossoma liga à superfície de célula negativamente carregada e é internalizado em um endossoma. Devido ao pH acídico dentro do endossoma, os lipossomas são rompidos, liberando seus conteúdos no citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[00138] Lipossomas que são sensíveis a pH ou negativamente carregados, absorvem o DNA ao invés de complexar-se com o mesmo. Uma vez que ambos o DNA e o lipídio são similarmente carregados, ocorre repulsão ao invés de formação de complexo. Todavia, algum DNA é absorvido dentro do interior aquoso desses lipossomas. Lipossomas sensíveis a pH foram usados para liberar DNA codificando o gene de timidina quinase para monocamadas de células em cultura. Expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvos (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[00139] Um maior tipo de composição lipossomal inclui fosfolipídios diferentes da fosfatidilcolina naturalmente derivada. Composições de lipossoma neutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipamitoil fosfatidilcolina (DPPC). Composições de lipossoma aniônicas geralmente são formadas a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto lipossomas fusogênicos aniônicos são formados primariamente de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossomal é formada de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, soja PC, e ovo PC. Outro tipo é
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 61/176
57/161 formado a partir de misturas de fosfolipídio e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[00140] Vários estudos avaliaram a liberação tópica de formulações de fármaco lipossomal à pele. Aplicação de lipossomas contendo interferon para pele de porquinho-da-índia resultou em uma redução de soros de herpes de pele enquanto liberação de interferon através de outros meios (por exemplo, como uma solução ou como uma emulsão) não foram eficazes (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Além disso, um estudo adicional testou a eficácia de interferon administrado como parte de uma formulação lipossomal para a administração de interferon usando um sistema aquoso, e concluiu que a formulação lipossomal foi superior à administração aquosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
[00141] Sistemas lipossomais não-iônicos também foram examinados para determinar sua utilidade na liberação de fármacos para a pele, em sistemas particulares compreendendo tensoativo não-iônico e colesterol. Formulações lipossomais não-iônicas compreendendo Novasome.TM. I (gliceril dilaurato/colesterol/polioxietileno-10-éter estearílico) e Novasome. TM. II (gliceril diestearato/colesterol/polioxietileno10-éter estearílico) foram usadas para liberar ciclosporina-A na derme de pele de camundongo. Resultados indicaram que tais sistemas lipossomais não-iônicos foram eficazes em facilitar o depósito de ciclosporina-A em diferentes camadas da pele (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
[00142] Lipossomas também incluem lipossomas estereoquimicamente estabilizados, um termo que, como usado aqui, se refere a lipossomas compreendendo um ou mais lipídios especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em existência de circulação melhorada relativa a lipossomas faltando tais lipídios especializados. Exemplos de lipossomas estereoquimicamente estabilizados
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 62/176
58/161 são aqueles em que parte da porção de lipídio formando vesícula do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolípidos, tal como monossialogangliosídeo Gm1, ou (B) é derivado com um ou mais polímeros hidrofílicos, tal como uma porção de polietileno glicol (PEG). Enquanto não desejando ser limitado por qualquer teoria particular, pensa-se na técnica que, pelo menos para lipossomas estereoquimicamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina, ou lipídios derivados de PEG, a meia-vida em circulação aumentada destes lipossomas estereoquimicamente estabilizados deriva-se a partir de absorção reduzida em células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765). [00143] Vários lipossomas compreendendo um ou mais glicolipídios são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) relatou a capacidade de monossialogangliosídeo Gm1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol para melhorar as meias-vidas no sangue de lipossomas. Estas descobertas foram expostas por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). Patente U.S. N° 4.837.028 e WO 88/04924, ambos para Allen et al., descreve lipossomas compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo Gm1 ou um éster de sulfato de galactocerebrosídeo. Patente U.S. N° 5.543.152 (Webb et al.) descreve lipossomas compreendendo esfingomielina. Lipossomas compreendendo 1,2-sndimiristoilfosfatidilcolina estão descritos em WO 97/13499 (Lim et al). [00144] Muitos lipossomas compreendendo lipídios derivados com um ou mais polímeros hidrofílicos, e métodos de preparação dos mesmos, são conhecidos na técnica. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) descreveram lipossomas compreendendo um detergente não-iônico, 2C1215G, que contém uma porção de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) notaram que revestimento hidrofílico de partículas de poliestireno com glicóis poliméricos resultou
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 63/176
59/161 em meias-vidas no sangue significantemente aumentadas. Fosfolipídios sintéticos modificados pela fixação de grupos carboxílicos de polialquileno glicóis (por exemplo, PEG) são descritos por Sears (Patente U.S. N°s 4.426.330 e 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) experimentos descritos demonstrando que lipossomas compreendendo fosfatidiletanolamina (PE) derivados com PEG ou estearato de PEG têm aumentos significantes em meias-vidas na circulação sanguínea. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) estendeu tais observações a outros Fosfolipídeos derivados de PEG, por exemplo, DSPE-PEG, formado da combinação de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) e PEG. Lipossomas tendo porções PEG covalentemente ligadas em sua superfície externa são descritos em Patente Européia N° EP 0 445 131 B1 e WO 90/04384 a Fisher. Composições de lipossoma contendo 1-20% em mols de PE derivado com PEG, e métodos de uso dos mesmos, são descritos por Woodle et al. (Patente U.S. N°s 5.013.556 e 5.356.633) e Martin et al. (Patente U.S. N° 5.213.804 e Patente Européia N° EP 0.496.813 B1). Lipossomas compreendendo um número de outros conjugados de polímero de lipídio são estão descritos em WO 91/05545 e Patente U.S. N° 5.225.212 (ambos para Martin et al.) e in WO 94/20073 (Zalipsky et al.) Lipossomas compreendendo lipídios de ceramida de PEG modificado são descritos em WO 96/10391 (Choi et al). Patente U.S. N° 5.540.935 (Miyazaki et al.) e Patente U.S. N° 5.556.948 (Tagawa et al.) descreve lipossomas contendo PEG que pode ser ainda derivado com porções funcionais na suas superfícies.
[00145] Um número limitado de lipossomas compreendendo ácidos nucleicos é conhecido na técnica. WO 96/40062 para Thierry et al.
descreve métodos para encapsular ácidos nucleicos em peso molecular elevado em lipossomas. Patente U.S. N° 5.264.221 a Tagawa et al.
descreve lipossomas ligados à proteínas e declara que os conteúdos
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 64/176
60/161 de tais lipossomas podem incluir dsRNA. Patente U.S. N° 5.665.710 a Rahman et al. descreve certos métodos de encapsular oligodesoxinucleotídeos em lipossomas. WO 97/04787 para Love et al. descreve lipossomas compreendendo dsRNAs marcados para o gene raf.
[00146] Transfersomas são ainda um outro tipo de lipossomas, e são agregados de lipídios altamente deformáveis que são candidatos atrativos para veículos de liberação de fármaco. Transfersomas podem ser descritos como gotículas de lipídios que são tão altamente deformáveis que elas são facilmente aptas a penetrar através de poros que são menores que a gotícula. Transfersomas são adaptáveis ao meio em que elas são usadas, por exemplo eles são auto-otimizantes (adaptáveis ao formato de poros na pele), auto-reparadores, frequentemente alcançam seus alvos sem fragmentar, e frequentemente autocarregadores. Para fazer transfersomas é possível adicionar ativadores de ponte de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossomal padrão. Transfersomas foram usadas para liberar albumina de soro para a pele. A liberação mediada por transfersoma de albumina de soro foi mostrada para ser tão eficaz como injeção subcutânea de uma solução contendo albumina de soro.
[00147] Tensoativos encontram ampla aplicação em formulações tal como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. A forma mais comum de classificar e categorizar as propriedades dos muitos tipos diferentes de tensoativos, ambos natural e sintético, é pelo uso do equilíbrio hidrofílico/lipofílicoo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecido como a cabeça) provê o meio mais útil para categorizar os diferentes tensoativos usados em formulações (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
[00148] Se a molécula tensoativa não é ionizada, ela é classificada como um tensoativo não-iônico. Tensoativos não-iônicos encontram
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 65/176
61/161 ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são usáveis sobre uma ampla faixa de valores de pH. Em geral sua faixa de valores de HLB a partir de 2 a cerca de 18 dependendo da sua estrutura. Tensoativos não-iônicos incluem ésteres não-iônicos tal como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose, e ésteres etoxilados. Alcanolamidas não-iônicas e éteres tal como etoxilados de álcool graxo, alcóois propoxilados, e polímeros de bloco etoxilados/propoxilados são também incluídas nessa classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensoativo não-iônico.
[00149] Se a molécula tensoativa carrega uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersada em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Os tensoativos iônicos incluem carboxilados tal como sabões, acil lactilatos, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tal como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tal como alquil benzeno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe de tensoativo aniônico são os alquil sulfatos e os sabões.
[00150] Se a molécula tensoativa carrega uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersada em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternários e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternários são os membros mais usados dessa classe.
[00151] Se a molécula tensoativa tem a capacidade de efetuar quer uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Tensoativos anfotéricos incluem derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 66/176
62/161 [00152] O uso de tensoativos em produtos de fármacos, formulações e em emulsões foi revisto (Rieger, em Pharmaceutical Dosage forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Melhoradores da penetração [00153] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários melhoradores da penetração para efetuar a liberação eficaz de ácidos nucleicos, particularmente dsRNAs, para a pele de animais. A maioria de fármacos está presente na solução em ambas as formas, ionizada e não ionizada. Entretanto, geralmente somente lipídio solúvel ou fármacos lipofílicos reticulam prontamente as membranas celulares. Descobriu-se que mesmo fármacos não lipofílicos podem reticular membranas celulares se a membrana for reticulada é tratada com um melhorador da penetração. Além disso, de auxiliar na difusão de fármacos não lipofílicos e reticulação das membranas celulares, melhoradores da penetração também aumentam a permeabilidade de fármacos lipofílicos.
[00154] Melhoradores da penetração podem ser classificados como pertencendo a uma das cinco amplas categorias, isto é, tensoativos, ácidos graxos, sais de bile, agentes quelantes, e não-tensoativos nãoquelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Vehycle Systems, 1991, p.92). Cada das classes acima mencionadas de melhoradores da penetração são descritas abaixo em maiores detalhes. [00155] Tensoativos: Em conexão com a presente invenção, tensoativos (ou agentes ativos na superfície) são entidades químicas que, quando dissolvidas em solução aquosa, reduz a tensão de superfície da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado que absorção de dsRNAs através da mucosa é aumentada. Em adição a sais de bile e ácidos graxos, estes melhoradores da penetração incluem, por exemplo, lauril sulfato de sódio, polioxietileno-9-lauril éter e polioxietileno-20-cetil éter) (Lee et al., Critical
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 67/176
63/161
Reviews in Therapeutic Drugs Carrier Systems, 1991, p.92); e Perfluorochemical emulsions, tal como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[00156] Ácidos graxos: vários ácidos graxos e seus derivados que agem como melhoradores da penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína (1-mono-oleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, glicerol 1-monocaprato, 1dodecilazaciclo-heptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, C1 - C10 alquil ésteres dos mesmos (por exemplo, metila, isopropila e t-butila), e mono- e di-glicerídeos dos mesmos (isto é, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[00157] Sais de bile: O papel fisiológico de bile inclui a facilitação de dispersão e absorção de lipídios e vitaminas lipossolúveis (Brunton, Chapter 38 em: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis de Therapeutics, 9a. Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Vários sais de bile naturais, e seus derivados sintéticos, agem como melhoradores da penetração. Deste modo o termo sais de bile inclui qualquer dos componentes de bile naturalmente ocorrendo, bem como qualquer de seus derivados sintéticos. Os sais de bile da invenção incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glidesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 68/176
64/161 de sódio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sódio), ácido urso desoxicólico (UDCA), tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodi-hidrofusidato de sódio e polioxietileno-9-lauril éter (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92; Swinyard, Cap. 39 Em: Remington's Pharmaceutic Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, págs. 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579583).
[00158] Agentes quelantes: Agentes quelantes, como usados em conexão com a presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos da solução formando complexos com eles, com o resultado que absorção de dsRNAs através da mucosa é aumentada. Com relação ao seu uso como melhoradores da penetração na presente invenção, agentes quelantes têm a vantagem adicionada de também servir como inibidores de DNase, como as nucleases de DNA mais caracterizadas requerem um íon de metal divalente para catálise e são deste modo inibidas por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes quelantes da invenção incluem, mas não são limitados a, etilenodiaminatetraacetato dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxissalicilato e homovanilato), derivados de N-acil de colágeno, laureth-9 e derivados de N-amino acil de beta-dicetonas (enaminas)(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00159] Não-tensoativos não-quelantes: Como usado aqui, compostos que aumentam a penetração não-tensoativos e não-quelantes poPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 69/176
65/161 dem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensoativos mas que todavia aumentam absorção de dsRNAs através da mucosa alimentar (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drugs Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de melhoradores da penetração inclui, por exemplo, uréias cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- e 1-alquenilazacicloalcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drugs Carrier Systems, 1991, pag. 92); e agentes anti-inflamatórios não-esteroidais tal como diclofenaco sódico, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[00160] Agentes que aumentam a absorção de dsRNAs no nível celular podem também ser adicionados ao fármaco e outras composições da presente invenção. Por exemplo, lipídios catiônicos, tal como lipofectina (Junichi et al, Patente U.S. N° 5.705.188), derivados de glicerol catiônico, e moléculas policatiônicas, tal como polilisina (Lollo et al., Pedido PCT WO 97/30731) e outros peptídeos, são também conhecidos como aumentando a absorção celular de dsRNAs.
[00161] Outros agentes podem ser utilizados para aumentar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis tal como etileno glicol e propileno glicol, pirróis tal como 2-pirrol, azonas, e terpenos tal como limoneno e mentona.
Veículos [00162] Algumas composições da presente invenção também incorporam compostos veículos na formulação. Como usado aqui, composto veículo ou veículo pode fazer referência a um ácido nucleico, ou análogo do mesmo, que é inerte (isto é, não possui atividade biológica por si) mas é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo atividade biológica por, por exemplo, degradar o ácido nucleico biologicamente ativo ou promovendo sua remoção de circulação. A
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 70/176
66/161 coadministração de um ácido nucleico e um composto veículo, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, provavelmente devido à competição entre o composto veículo e o ácido nucleico para um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzido quando é coadministrado com ácido poli-inossínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'dissulfônico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183. Excipientes [00163] Em contraste a um composto veículo, um fármaco veículo ou excipiente é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para liberar um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com a maneira planejada de administração em mente, de modo a prover para o volume desejado, consistência, etc., quando combinada com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Veículos farmacêuticos típicos incluem, mas não são limitados a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose, etc.); cargas (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etil celulose, poliacrilatos ou hidrogeno-fosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silicone coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, glicoPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 71/176
67/161 lato de amido de sódio, etc.); e agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc).
[00164] Excipiente orgânico ou inorgânico farmaceuticamente aceitável apropriado para administração não parenteral que deleteriamente não reage com ácidos nucleicos pode também ser usado para formular as composições da presente invenção. Veículos apropriados farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, água, soluções de sal, alcóois, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
[00165] Formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções nãoaquosas em solventes comuns tal como alcóois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases de óleo líquidas ou sólidas. As soluções podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos apropriados. Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis apropriados para administração não parenteral que deleteriamente não reage com ácidos nucleicos pode ser usada.
[00166] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem, mas não são limitados a, água, soluções de sal, álcool, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
Composições farmacêuticas para a liberação ao trato respiratório [00167] Outro aspecto da invenção se refere à liberação de agentes de iRNA ao trato respiratório, particularmente para o tratamento de fibrose cística. O trato respiratório inclui as vias aéreas superiores, incluindo a orofaringe e laringe, seguido pelas vias aéreas inferiores, que incluem a traquéia seguida por bifurcações nos brônquios e bronquíolos. As vias aéreas superiores e inferiores são chamadas vias aéPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 72/176
68/161 reas condutoras. O bronquíolo terminal então divide em bronquíolo respiratório que então conduz a última zona respiratória, o alvéolo, ou pulmão profundo. O epitélio das vias aéreas condutoras é o alvo primário de aerossóis terapêuticos inalados para entrega de agentes de iRNA tal como agentes de iRNA alfa-ENaC.
[00168] Composições de liberação pulmonar podem ser liberadas por inalação pelo paciente de uma dispersão de modo que a composição, preferivelmente o agente de iRNA, dentro da dispersão pode alcançar o pulmão onde pode, por exemplo, ser prontamente absorvida através da região alveolar diretamente na circulação sanguínea. Liberação pulmonar pode ser eficaz ambos para liberação sistêmica e para liberação localizada para tratar doenças dos pulmões.
[00169] Liberação pulmonar pode ser realizada por diferentes abordagens, incluindo o uso de formulações nebulizadas, aerossolizadas, micelulares e baseadas em pó seco; administração por inalação pode ser oral e/ou nasal. A liberação pode ser realizada com nebulizadores líquidos, inaladores baseados em aerossóis, e dispositivos de dispersão de pó seco. Dispositivos de dose medida são preferidos. Um dos benefícios de usar um atomizador ou inalador é que o potencial para contaminação é minimizado devido ao fato dos dispositivos serem autocontidos. Dispositivos de dispersão de pó seco, por exemplo, liberam fármacos que pode ser prontamente formulados como pós secos. Uma composição de iRNA pode ser estavelmente armazenada como pós liofilizados ou secos a seco por si só ou em combinação com veículos de pó apropriados. Uma liberação de uma composição para inalação pode ser mediada por um elemento temporizador de dosagem que pode incluir um temporizador, um contador de dose, dispositivo medindo tempo, ou um indicador de tempo que quando incorporados no dispositivo possibilita monitoramento de dose, monitoramento de flexibilidaPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 73/176
69/161 de, e/ou do disparo da dose em um paciente durante a administração do medicamento em aerossol.
[00170] Exemplos de dispositivos farmacêuticos para liberação por aerossol incluem inaladores de dose medida (MDIs), inaladores de pó seco (DPIs), e nebulizadores de jato de ar. Sistemas de liberação exemplares por inalação que podem ser prontamente adaptados para liberação dos agentes de iRNA de indivíduo são descritos em, por exemplo, Patente U.S. N°s 5.756.353; 5.858.784; e pedidos PCT WO98/31346; WO98/10796; WO00/27359; WO01/54664;
WO02/060412. Outras formulações de aerossol que podem ser usadas para liberar os agentes de iRNA são descritos na Patente U.S. N°s 6.294.153; 6.344.194; 6.071.497, e pedidos PCT WO02/066078; WO02/053190; WO01/60420; WO00/66206. Além disso, métodos para liberar agentes de iRNA podem ser adaptados a partir daqueles usados na liberação de outros oligonucleotídeos (por exemplo, um oligonucleotídeo antissenso) por inalação, tal como descritos em Templin et al., Antisense Nucleic acid drug Dev, 2000, 10:359-68; Sandrasagra et al., Expert Opin Biol Ther, 2001, 1:979-83; Sandrasagra et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12:177-81.
[00171] Uma liberação dos agentes inventivos podem também envolver a administração de assim chamados profármacos, isto é, formulações ou modificações químicas de uma substância terapêutica que requerem alguma forma de processamento ou transporte por sistemas inatos ao organismo de indivíduo para liberar a substância terapêutica, preferivelmente no sítio onde sua ação é desejada; esta última modalidade pode ser usada em conjunto com a liberação no trato respiratório, mas também junto com outras modalidades da presente invenção. Por exemplo, os pulmões humanos podem remover ou rapidamente degradar aerossóis depositados hidroliticamente cliváveis sobre períodos variando de minutos a horas. Nas vias aéreas superioPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 74/176
70/161 res, epitélios ciliados contribuem para o escalador mucociliar por que partículas são varridas das vias aéreas em direção à boca. Pavia, D., Lung Transport Mucociliary, em Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, S. W. e Pavia, D., Eds., Butterworths, London, 1984. Nos pulmões profundos, macrófagos alveolares são capazes de fagocitosar partículas logo após seu depósito. Warheit et al. Microscopy Res. Tech., 26: 412-422 (1993); e Brain, J. D., Physiology and Pathophysiology of Pulmonar Macrofages, em The Reticuloendothelial System, S. M. Reichard e J. Filkins, Eds., Plenum, New. York., pp. 315-327, 1985.
[00172] Em modalidades preferidas, particularmente onde a dosagem sistêmica com o agente de iRNA é desejada, os agentes de iRNA aerossolizados são formulados como micropartículas. Micropartículas tendo um diâmetro de entre 0,5 e dez mícrons podem penetrar os pulmões, passando através da maioria das barreiras naturais. Um diâmetro de menos do que dez mícrons é requerido para derivar na garganta; um diâmetro de 0,5 mícrons ou maior é requerido para evitar ser exalado.
Outros Componentes [00173] Composições da presente invenção podem adicionalmente conter outros componentes adjuntos convencionalmente encontrados em composições farmacêuticas, em seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Deste modo, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais, compatíveis, ativos farmaceuticamente tais como, por exemplo, antipruríticos, astringentes, anestesias locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis em fisicamente formular várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tal como corantes, agentes flavorizantes, conservantes, antioxidantes, opacificadores, agentes de espessamento e estabilizadores. Entretanto, tais materiais, quando adicionados, não devem
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 75/176
71/161 indevidamente interferir com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizadores, agentes umectantes, emulsificadores, sais para influenciar pressão osmótica, tampões, colorantes, flavorizantes e/ou substâncias aromáticas e similares que não deleteriamente interagem com os ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[00174] Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode também conter estabilizadores.
[00175] Certas modalidades da invenção proveem combinações e composições farmacêuticas contendo (a) um ou mais agentes de RNA ds e (b) um ou mais outros agentes terapêuticos que funcionam por um mecanismo de interferência não RNA.
[00176] Consequentemente, a invenção inclui uma combinação de um iRNA da presente invenção com um anti-inflamatório, broncodilatador, anti-histamina, anti-tussígeno, antibiótico ou substância de fármaco de DNase, referido bloqueador de canal de sódio epitelial e referida substância de fármaco estando na mesma ou diferente composição farmacêutica.
[00177] Apropriados antibióticos incluem antibióticos macrólideos, por exemplo, tobramicina (TOB®).
[00178] Substâncias de fármacos de DNase apropriadas incluem dornase alfa (Pulmozyme®), uma solução altamente purificada de desoxirribonuclease I humana recombinante (rhDNase), que seletivamente cliva DNA. Dornase alfa é usada para tratar fibrose cística. [00179] Outras combinações úteis de bloqueadores de canal de sódio epitelial com fármacos anti-inflamatórios são aquelas com antagoPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 76/176
72/161 nistas de receptores de quimiocinas, por exemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 e CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5, tal como antagonistas de Scheri ng-Plough SC-351125, SCH-55700 e SCH-D; antagonistas de Takeda, tal como cloreto de N[[4-[[[6,7-di-hidro-2-(4-metil-fenil)-5H-benzo-ciclo-hepten-8il]carbonil]amino]fenil]-metil]tetra-hidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-amin-io (TAK-770); e antagonistas CCR-5 descritos em USP 6.166.037 (particularmente reivindicações 18 e 19), WO 00/66558 (particularmente reivindicação 8), WO 00/66559 (particularmente reivindicação 9), WO 04/018425 e WO 04/026873.
[00180] Fármacos anti-inflamatórios apropriados incluem esteroides, em particular, glucocorticosteroides, tal como budesonida, diproprionato de beclametasona, proprionato de fluticasona, ciclesonida ou furoato de mometasona, ou esteroides descritos em WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (especialmente aqueles de Exemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 e 101), WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 e WO 04/66920; agonistas receptores de glucocorticoide não-esteroidais, tal como aqueles descritos em DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 e WO 04/26248; antagonistas de LTD4, tal como montelucaste e zafirlucaste; inibidores de PDE4, tal como cilomilast (Ariflo® GlaxoSmithKline), Roflumilast (Byk Gulden),V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), Arofilina (Almirall Prodesfarma), PD189659 / PD168787 (Parke-Davis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (Celgene), SelCID(TM) CC-10004 (Celgene), VM554/UM565 (Vernalis), T-440 (Tanabe), KW-4490 (Kyowa Hakko Kogyo), e os descritos em
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 77/176
73/161
WO 92/19594, WO 93/19749, WO 93/19750 , WO ' 93/19751, WO
98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO
03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO
04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO
04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO
04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO
04/019945, WO 04/045607 e WO 04/037805; antagonistas receptores de adenosina A2B tal como aqueles descritos em WO 02/42298; e agonistas adrenorreceptores de beta-2, tal como albuterol (salbutamol), metaproterenol, terbutalina, salmeterol fenoterol, procaterol, e especialmente, formoterol, carmoterol e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e compostos (em forma livre ou de sal ou de solvato) de formula (I) de WO 0075114, cujo documento é incorporado aqui por referência, preferivelmente composto dos exemplos dos mesmos, especialmente indacaterol e sais farmaceuticamente aceitável dos mesmos, bem como compostos (em forma livre ou de sal ou de solvato) de fórmula (I) de WO 04/16601, e também compostos de EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, USP 2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618, WO 04/46083, WO 04/80964, WO 04/108765 e WO 04/108676.
[00181] Fármacos broncodilatadores apropriados incluem agentes anticolinérgicos ou antimuscarínicos, em particular, brometo de ipratrópio, brometo de oxitrópio, sais de tiotrópio e CHF 4226 (Chiesi), e glicopirrolato, mas também aqueles descritos em EP 424021, USP 3.714.357, USP 5.171.744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 78/176
74/161
02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 e WO 04/05285.
[00182] Fármacos anti-inflamatórios e broncodilatadores duais apropriados incluem agonista adrenorreceptor de beta-2 dual/antagonistas muscarínicos tal como aqueles descritos em USP 2004/0167167, WO 04/74246 e WO 04/74812.
[00183] Substâncias de fármacos anti-histamina apropriados incluem cloridrato de cetirizina, acetaminofeno, fumarato de clemastina, prometazina, loratidina, desloratidina, difenoidramina e cloridrato de fexofenadina, activastina, astemizol, azelastina, ebastina, epinastina, mizolastina e tefenadina, bem como aquelas descritas em JP 2004107299, WO 03/099807 e WO 04/026841.
[00184] Outras combinações úteis de agentes da invenção com fármacos anti-inflamatórios são aquelas com antagonistas de receptores de quimiocinas, por exemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 e CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5, tal como antagonistas de Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 e SCH-D; antagonistas de Takeda, tal como cloreto de W-[[4-[[[6,7-dihidro-2-(4-metilfenil)-5H-benzo-ciclo-hepten-8-il]carbonil]amino]fenil]metil]tetra-hidroW,W-dimetil-2H-piran-4-amino (TAK-770), e antagonistas de CCR-5 descritos em USP 6.166.037 (particularmente reivindicações 18 e 19), WO 00/66558 (particularmente reivindicação 8), WO 00/66559 (particularmente reivindicação 9), WO 04/018425 e WO 04/026873.
[00185] Outros agentes terapêuticos adicionais úteis podem também ser selecionados dentre o grupo consistindo em moléculas ligante de citocina, particularmente anticorpos de outras citocinas, em particular uma combinação com um anticorpo anti-IL4, tal como descritos em
PCT/EP2005/00836, um anticorpo anti-IgE, tal como Xolair®, um antiPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 79/176
75/161 corpo anti-IL31, um anticorpo anti-IL31R, um anticorpo anti-TSLP, um anticorpo anti- receptor TSLP, um anticorpo anti-endoglina, um anticorpo anti-IL1b ou um anticorpo anti-IL13, tal como descritos em WO05/007699.
[00186] Dois ou mais compostos combinados podem ser usados juntos em uma formulação simples, separadamente, concomitantemente ou sequencialmente.
[00187] A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar o LD50 (a dose letal para 50% da população) e o ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressada como a razão LD50/ED50. Compostos que exibem índices terapêuticos elevados são preferidos.
[00188] Os dados obtidos dos testes de cultura celular e estudos de animais podem ser usados em formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de composições da invenção encontra-se geralmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pequena ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de testes de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em animais modelos para realizar uma faixa de concentração de plasma circulante do composto ou, quando apropriado, do produto de polipeptídeo de uma sequência-alvo (por exemplo, realizar uma concentração diminuída do polipeptídeo) que inclui o IC50 (isto é, a concentração do compostos de teste que realiza uma inibição média máxima de sintomas) como determinado em cultuPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 80/176
76/161 ra celular. Tais informações podem ser usadas para mais precisamente determinar doses úteis em seres humanos. Níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.
[00189] Em adição a sua administração individualmente ou como uma pluralidade, como discutido acima, os dsRNAs da invenção podem ser administrados em combinação com outros conhecidos agentes eficazes no tratamento de distúrbios relacionados a ENaC. Em qualquer evento, o médico encarregado pode ajustar a quantidade e tempo de administração de dsRNA na base de resultados observados usando medidas padrão de eficácia conhecidas na técnica ou descrita aqui.
Métodos de Tratamento e Vias de Liberação [00190] Uma composição que inclui um agente de iRNA, por exemplo, um agente de iRNA que marca alfa-ENaC, pode ser liberada a um indivíduo por uma variedade de vias para realizar quer liberação local ao sítio de ação ou liberação sistêmica ao indivíduo. Vias exemplares incluem administração local direta ao sítio de tratamento, tal como os pulmões e passagem nasal bem como liberação intravenosa, nasal, oral, e ocular. O meio preferido de administrar os agentes de iRNA da presente invenção é através de administração direta aos pulmões e passagem nasal como uma solução líquida, aerossol ou nebulizada. [00191] Formulações para inalação ou administração parenteral são bem conhecidas na técnica. Tais formulações podem incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos apropriados. Para uso intravenoso, a concentração total de solutos deve ser controlada para render a preparação isotônica. [00192] Os compostos ativos descritos aqui são preferivelmente administrados ao(s) pulmão(ões) ou passagem nasal de um indivíduo por qualquer meio apropriado. Compostos ativos podem ser adminisPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 81/176
77/161 trados administrando uma suspensão aerossol de partículas respiráveis compreendida do composto ativo ou compostos ativos, que o indivíduo inala. O composto ativo pode ser aerossolizado em uma variedade de formas, tais como, mas não-limitadas a, inalantes de pó seco, inalantes de dose medida, ou líquido/suspensões líquidas. As partículas respiráveis podem ser líquidas ou sólidas. As partículas podem opcionalmente conter outros ingredientes terapêuticos tal como amilorida, benzamil ou fenamil, com o composto selecionado incluído em uma quantidade eficaz para inibir a reabsorção de água das secreções da mucosa da via respiratória, como descrito em Patente U.S. N° 4.501.729.
[00193] A composição farmacêutica particulada pode opcionalmente ser combinada com um veículo para auxiliar na dispersão ou transporte. Um veículo apropriado tal como um açúcar (isto é, lactose, sacarose, trealose, manitol) pode ser misturado com o composto ativo ou compostos em qualquer razão apropriada (por exemplo, a 1 to 1 razão em peso).
[00194] Partículas compreendidas do composto ativo para praticar a presente invenção devem incluir partículas de tamanho respirável, que é, partículas de um tamanho suficientemente pequeno para passar através da boca ou nariz e laringe em inalação e no brônquio e alvéolo dos pulmões. Em geral, partículas variando de cerca de 1 a 10 mícrons em tamanho (mais particularmente, menor do que cerca de 5 mícrons em tamanho) são respiráveis. Partículas de tamanho não respirável que são incluídas no aerossol tendem a depositar-se na garganta e ser engolidas, e a quantidade de partículas não respiráveis no aerossol é preferivelmente minimizada. Para administração nasal, um tamanho de partícula na faixa de 10-500 uM é preferido para assegurar retenção na poço nasal.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 82/176
78/161 [00195] Composições farmacêuticas líquidas de composto ativo para produzir um aerossol podem ser preparadas combinando-se o composto ativo com um veículo apropriado, tal como água livre de pirogênio estéril. As soluções salinas hipertônicas usadas para efetuar a presente invenção são preferivelmente estéreis, soluções livres de pirogênio, compreendendo de um a quinze por cento (em peso) do sal fisiologicamente aceitável, e mais preferivelmente de três a sete por cento em peso do sal fisiologicamente aceitável.
[00196] Aerossóis de partículas líquidas compreendendo o composto ativo podem ser produzidos por qualquer meio apropriado, tal como com um nebulizador a jato conduzido por pressão ou um nebulizador ultrassônico. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.501.729. Nebulizadores são dispositivos comercialmente disponíveis que transformam soluções ou suspensões do ingrediente-ativo em uma névoa de aerossol terapêutico quer por meio de aceleração de gás comprimido, tipicamente ar ou oxigênio, através de um orifício de Venturi estreito ou por meio de agitação ultrassônica.
[00197] Formulações apropriadas para uso em nebulizadores consistem No ingrediente-ativo em um veículo líquido, o ingrediente-ativo compreendendo até 40% em peso da formulação, mas preferivelmente menos do que 20% em peso. O veículo é tipicamente água (e mais preferivelmente água livre de pirogênio estéril) ou uma solução alcoólica aquosa diluída, preferivelmente feita isotônica, mas pode ser hipertônica com fluidos corporais pela adição de, por exemplo, cloreto de sódio. Aditivos opcionais incluem conservantes se a formulação não é feita estéril, por exemplo, hidroxibenzoato de metila, antioxidantes, agentes flavorizantes, óleos voláteis, agentes tamponados e tensoativos.
[00198] Aerossóis de partículas sólidas compreendendo o composto ativo podem igualmente ser produzidos com qualquer gerador de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 83/176
79/161 aerossol terapêutico particulado de sólido. Geradores de aerossol para administração terapêutica de particulado sólido a um indivíduo produzem partículas que são respiráveis e geram um volume de aerossol contendo uma dose medida predeterminada de uma terapêutica na faixa apropriada para administração de ser humano. Um tipo ilustrativo de gerador de aerossol de particulado sólido é um insuflador. Formulações apropriadas para administração por insuflação incluem finamente pós fragmentados que podem ser liberados por meio de um insuflador ou tomados na poço nasal da maneira de uma fungada. No insuflador, o pó (por exemplo, uma dose medida eficaz do mesmo para efetuar os tratamentos descritos aqui) está contida em cápsulas ou cartuchos, tipicamente feitos de gelatina ou plástico, que são quer perfurados ou abertos in situ e os pós liberados por ar aspirado através do dispositivo na inalação ou por meio de uma bomba operada manualmente. O pó empregado no insuflador consiste quer unicamente do ingredienteativo ou de uma mistura de pó compreendendo o ingrediente-ativo, um pó diluente apropriado, tal como lactose, e um tensoativo opcional. O ingrediente-ativo tipicamente compreende de 0,1 a 100 p/p da formulação.
[00199] Um segundo tipo de gerador de aerossol ilustrativo compreende um inalador de dose medida. Inaladores de dose medida são dispensadores de aerossol pressurizado, tipicamente contendo uma suspensão ou formulação de solução do ingrediente-ativo em um propelente liquefeito. Durante uso, esses dispositivos descarregam a formulação através de uma válvula adaptada para liberar um volume medido, tipicamente de 10 a 200 ul, para produzir um pulverizador de partícula fina contendo o ingrediente-ativo. Propelentes apropriados incluem certos compostos de clorofluorcarbono, por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluormetano e misturas dos mesmos. A formulação pode adicionalmente conter um ou mais cosPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 84/176
80/161 solventes, por exemplo, etanol, tensoativos, tal como ácido oleico ou trioleato sorbitano, agentes antioxidantes e flavorizantes apropriados. [00200] Um agente de iRNA pode ser incorporado nas composições farmacêuticas apropriadas para administração. Por exemplo, composições podem incluir uma ou mais espécies de um agente de iRNA e um veículo farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui a expressão veículo farmaceuticamente aceitável se destina a incluir qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de atraso isotônicos e de absorção, e similares, compatíveis com administração farmacêutica . O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto a medida que quaisquer meios convencionais ou agente é incompatível com o composto ativo, uso dos mesmos nas composições é contemplado. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.
[00201] Administração pode ser provida pelo indivíduo ou por outra pessoa, por exemplo, um cuidador na área de saúde. Um cuidador pode ser qualquer entidade envolvida para proporcionar cuidado ao ser humano: por exemplo, um hospital, hospício, consultório médico, ambulatório; um agente de saúde tal como um médico, enfermeira, ou outros profissionais da área médica; ou uma esposa ou acompanhante, tal como um parente. A medicação pode ser provida nas doses medidas ou em um dispensador que distribui uma dose medida.
[00202] O termo quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade presente na composição que é necessária para proporcionar o nível desejado de fármaco no indivíduo a ser tratado para dar resposta fisiológica antecipada.
[00203] O termo quantidade fisiologicamente eficaz é a quantidade liberada a um indivíduo para dar o paliativo desejado ou efeito curativo.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 85/176
81/161 [00204] O termo veículo farmaceuticamente aceitável significa que o veículo pode ser tomado nos pulmões sem efeitos toxicológicos adversos significantes nos pulmões.
[00205] O termo coadministração se refere a administrar a um indivíduo dois ou mais agentes, e em particular dois ou mais agentes de iRNA. Os agentes podem estar contidos em uma composição farmacêutica simples e ser administrados ao mesmo tempo, ou os agentes podem ser contidos em formulação separada e administrados serialmente a um indivíduo. Enquanto os dois agentes podem ser detectados no indivíduo ao mesmo tempo, os dois agentes são referidos para serem coadministrados.
[00206] Os tipos de excipientes farmacêuticos que são úteis como veículos incluem estabilizadores tal como albumina humana de soro (HSA), agentes volumosos tal como carboidratos, aminoácidos e polipeptídeos; ajustadores de pH ou tampões; sais tal como cloreto de sódio; e similares. Estes veículos podem estar em uma forma cristalina ou amorfa ou podem ser uma mistura dos dois.
[00207] Agentes volumosos que são particularmente valiosos incluem carboidratos compatíveis, polipeptídeos, aminoácidos ou combinações dos mesmos. Carboidratos apropriados incluem monossacarídeos tal como galactose, D-manose, sorbose, e similares; dissacarídeos, tal como lactose, trehalose, e similares; ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-.beta.-ciclodextrina; e polissacarídeos, tal como rafinose, maltodextrinas, dextranos, e similares; alditóis, tal como manitol, xilitol, e similares. Um grupo preferido de carboidratos inclui lactose, trehalose, maltodextrinas rafinose, e manitol. Polipeptídeos apropriados incluem aspartame. Aminoácidos incluem alanina e glicina, com glicina sendo preferida.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 86/176
82/161 [00208] Ajustadores de pH apropriados ou tampões incluem sais orgânicos preparados de ácidos e bases orgânicos, tal como citrato de sódio, ascorbato de sódio, e similares; citrato de sódio é preferido. Dosagem [00209] Um agente de iRNA pode ser administrado em uma dose unitária menor do que cerca de 75mg por kg em peso corporal, ou menor do que cerca de 70; 60; 50; 40; 30; 20; 10; 5; 2; 1; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01; 0,005; 0,001, ou 0,0005 mg por kg em peso corporal, e menos do que 200 nmol de agente de iRNA (por exemplo, cerca de 4,4 x 1016 cópias) por kg em peso corporal, ou menor do que 1500; 750; 300; 150; 75; 15; 7,5; 1,5; 0,75; 0,15; 0,075; 0,015; 0,0075; 0,0015; 0,00075; 0,00015 nmol de agente de iRNA por kg em peso corporal. A dose unitária, por exemplo, pode ser administrada por injeção (por exemplo, intravenosa ou intramuscular, intratraquealmente, ou diretamente no órgão), uma dose inalada, ou uma aplicação tópica.
[00210] A dosagem pode ser uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio. Pode ser dado profilaticamente ou como o primário ou uma parte de um protocolo de tratamento.
[00211] Em uma modalidade, a dose unitária é administrada com menor frequência do que uma vez ao dia, por exemplo, menos do que cada 2, 4, 8 ou 30 dias. Em outras modalidades, a dose unitária não é administrada com uma frequência (por exemplo, não uma frequência regular). Por exemplo, a dose unitária pode ser administrada um tempo simples. Porque o silenciamento mediado por agente de iRNA pode persistir por vários dias após administrar o agente de composição de iRNA, em muitos exemplos, é possível administrar a composição com uma frequência de menos do que uma vez por dia, ou, para alguns exemplos, somente uma vez para o regime terapêutico completo. [00212] Em uma modalidade, em um indivíduo é administrado uma dose inicial, e uma ou mais doses de um agente de iRNA de manutenPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 87/176
83/161 ção, por exemplo, um agente de iRNA de fita dupla, ou agente de siRNA, (por exemplo, um precursor, por exemplo, um maior agente de iRNA que pode ser processado em um agente de siRNA, ou um DNA que codifica um agente de iRNA, por exemplo, um agente de iRNA de fita dupla, ou agente de siRNA, ou precursor dos mesmos). A dose de manutenção ou doses são geralmente menor que a dose inicial, por exemplo, um meio menor do que da dose inicial. Um regime de manutenção pode incluir o tratamento do indivíduo com uma dose ou doses variando de 0,01 a 75 mg/kg em peso corporal por dia, por exemplo, 70; 60; 50; 40; 30; 20; 10; 5; 2; 1; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01; 0,005; 0,001; ou 0,0005 mg por kg em peso corporal por dia. As doses de manutenção são preferivelmente administradas não mais do que uma vez a cada 5, 10, ou 30 dias. Além disso, o regime de tratamento pode durar por um período de tempo que variará dependendo da natureza da doença particular, sua severidade e a condição global do paciente. Em modalidades preferidas a dosagem pode ser liberada não mais do que uma vez por dia, por exemplo, não mais do que uma vez por 24, 36, 48, ou mais horas, por exemplo, não mais do que uma vez cada 5 ou 8 dias. Após o tratamento, o paciente pode ser monitorado para mudanças em sua condição e para alívio dos sintomas do estado de doença. A dosagem do composto pode quer ser aumentada no evento que o paciente não responde significantemente aos níveis de dosagem correntes, ou a dose pode ser diminuída se um alívio dos sintomas do estado de doença é observado, se o estado de doença foi retirado, ou se efeitos colaterais indesejados são observados.
[00213] A dose eficaz pode ser administrada em uma dose simples ou em duas ou mais doses, como desejado ou considerado apropriado sob as circunstâncias específicas. Se desejado para facilitar infusões repetidas ou frequentes, implantação de um dispositivo de liberação, por exemplo, uma bomba, dispositivo stent semipermanente (por
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 88/176
84/161 exemplo, intravenoso, intraperitoneal, intracisternal ou intracapsular), ou reservatório pode ser aconselhável.
[00214] Após o tratamento bem sucedido, pode ser desejável levar o paciente a passar por terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado de doença, onde o composto da invenção é administrado em doses de manutenção, variando de 0,001 g a 100 g por kg em peso corporal (vide US 6.107.094).
[00215] A concentração da composição do agente de iRNA é uma quantidade suficiente para ser eficaz no tratamento ou prevenção de um distúrbio ou para regular uma condição fisiológica em humanos. A concentração ou quantidade de agente de iRNA administrado dependerá dos parâmetros determinados para o agente e o método de administração, por exemplo nasal, bucal, ou pulmonar. Por exemplo, formulações nasais tendem a requerer concentrações muito maiores de alguns ingredientes a fim de evitar irritação ou queima das passagens nasais. É algumas vezes desejável diluir uma formulação oral até 10-100 vezes a fim de prover uma formulação nasal apropriada.
[00216] Alguns fatores podem influenciar a dosagem requerida para efetivamente tratar um indivíduo, incluindo mas não-limitado à severidade da doença ou distúrbio, tratamentos prévios, a saúde geral e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Também será apreciado que a dosagem eficaz de um agente de iRNA tal como um siRNA usada para tratamento pode aumentar ou diminuir sobre o curso de um tratamento particular. Mudanças na dosagem podem resultar e tornar-se aparentes dos resultados de testes de diagnósticos. Por exemplo, o indivíduo pode ser monitorado após administrar uma composição de agente de iRNA. Com base na informação da monitoração, uma quantidade adicional da composição de agente de iRNA pode ser administrada.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 89/176
85/161 [00217] Dosagem é dependente da severidade e da sensibilidade da condição de doença a ser tratada, com o curso de tratamento durando de vários dias a vários meses, ou até uma cura ser efetuada ou uma diminuição de estado de doença é realizada. Programações de dosagens ótimas podem ser calculadas por medições de acúmulo de fármaco no corpo do paciente. Pessoas versadas podem prontamente determinar as dosagens ótimas, metodologias de dosagem e taxas de repetição. Dosagens ótimas podem variar dependendo da potência relativa de compostos individuais, e pode geralmente ser estimada com base nos EC50s encontrados para ser eficazes em animais modelos in vitro e in vivo como descritos acima.
[00218] Agentes de iRNA da presente invenção como descrita aqui podem ser úteis no tratamento e (onde apropriado) na prevenção de qualquer uma das seguintes doenças/distúrbios;
[00219] Fibrose cística, Síndrome de Liddles, insuficiência renal, hipertensão, desequilíbrio eletrolíticos.
[00220] Em particular em algumas modalidades, agentes de iRNA da invenção podem ser usados para tratar e/ou prevenir manifestações clínica adversas destas doenças/distúrbios.
[00221] A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser construídos como limitativos.
EXEMPLOS
Fonte de reagentes [00222] Onde a fonte de um reagente não é especificamente dada aqui, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular em um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular.
Exemplo 1: Seleção de sequências [00223] A fim de identificar siRNAs terapêuticos para modular de modo negativo a expressão da subunidade alfa do canal de sódio epiPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 90/176
86/161 telial ENaC (α-ENaC), conjuntos de triagens foram definidos com base em uma análise de bioinformática. Os veículos chaves para o projeto do conjunto de triagem foram previstos pela especificidade do siRNAs contra o transcriptoma das espécies relevantes. Para a identificação de siRNAs alfa-ENaC, um sistema de liberação eficaz, uma abordagem de três frentes foi usado: rato foi selecionado como a espécie de teste para se dirigir à eficácia de silenciamento in vivo após liberação intratraqueal, porquinho-da-índia foi selecionado como o organismo de modelo de doença para demonstrar que a redução de mRNA alfaENaC resulta em um efeito funcional mensurável. A molécula de siRNA terapêutica precisa marcar alfa-ENaC humano bem como a sequência de alfa-ENaC de pelo menos uma espécie de toxicologia relevante, neste caso, macaco reso.
[00224] Análise inicial da sequência de mRNA relevante de alfaENaC revelou que algumas sequências podem ser identificadas que atendem às exigências de especificidade e ao mesmo tempo mRNAalvo de alfa-ENaC em todas espécies relevantes. Portanto foi decidido projetar conjuntos de triagem independentes para o siRNA terapêutico e para as moléculas de substituto a serem testadas no modelo de doença relevante (Tabelas 1A,1B,1C e 1D).
[00225] Todos os siRNAs reconhecem a sequência de alfa-ENaC humano, conforme um sistema de cultura celular humana foi selecionado para a determinação de atividade in vitro (H441, vide abaixo). Portanto todos os siRNAs podem ser usados para objetivar mRNA alfa-ENaC humano em uma configuração terapêutica.
[00226] Os conjuntos de triagem terapêuticos foram projetados para conter somente sequências de siRNA que são completamente complementares às sequências de alfa-ENaC de ser humano e macaco reso.
Projeto e seleção in silico de siRNAs objetivando alfa-ENaC (SCNN1A)
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 91/176
87/161 [00227] Projeto de si RN A foi efetuado para identificar siRNAs para os quatro conjuntos previamente definidos (vide acima)
a) Conjunto de triagem inicial
b) Conjunto de triagem estendido
c) Conjunto de substituto in vivo para rato
d) Conjunto de substituto in vivo para porquinho-daíndia
Conjunto de triagem inicial [00228] O objetivo para seleção in silico de um conjunto de triagem inicial foi identificar siRNAs especificamente objetivando alfa-ENaC humano, bem como de macaco reso ortólogo. O mRNA-alvo humano (NM_001038.4) foi obtido de uma pesquisa em NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucl eotide)_durante o procedimento de seleção de siRNA completo. A fim de identificar o alfa-ENaC de reso (Macaca mulatta) ortólogo, a sequência de ser humano foi usada em uma pesquisa de blastn em Baylor College of Medicine (http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast/?organism=Mmulatta) contra contigs de Mmulatta como de 01 do 10 de 2004. Todas as regiões críticas foram extraídas e reunidas pela ferramenta de reunião CAP para gerar uma primeira sequência de montagem. Além disso, uma busca de BLAST foi realizada com a sequência de ser humano em UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi- bin/hgBlat?command=start&org=Resos&db=rheMac2&hgsid=8485935 6) contra reso congelado, 12 de março de 2005. A dica scaffold 84554 foi obtida na internet e usada junto com a primeira sequência de montagem por CAP para gerar a sequência de consenso final para alfaENaC de reso.
[00229] Extração seguinte de todas as sequências de 19 mers, sobrepostas fora do mRNA humano, 19 mers conservados, foram identificados que tiveram sequências idênticas na sequência de consenso
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 92/176
88/161 de reso reunido. Aquelas sequências de 19 mers foram definidas como reservatório de sequências (senso) de siRNA cruzados reativos a humano-resos, representado aqui por 19 mers 1185.
[00230] As sequências de antissenso correspondentes foram geradas e testadas para especificidade em humanos. Para isso, seu potencial previsto para interagir com mRNA-alvos irrelevantes (potencial fora do alvo) foi tomado como parâmetro. Sequências com baixo potencial fora do alvo foram definidas como preferíveis e prognósticas para serem mais específicas.
[00231] Para outra seleção, siRNAs candidatos foram categorizados de acordo com seu potencial previsto para interagir com outras sequências de hospedeiro (aqui, sem limitação, humano) . siRNAs com baixo potencial indesejados (off-target) são assumidos como sendo mais específicos in vivo. Para prever o potencial indesejado específico de siRNA, as seguintes suposições foram feitas:
1) potencial indesejado de uma fita pode ser deduzido a partir do número e liberação de desalinhamento indesejado
2) o fora do alvo mais relevante, isto é, o gene previsto como tendo a maior probabilidade de ser silenciado devido à tolerância de desalinhamento, determina o potencial fora do alvo da fita
3) posições 2 a 9 (contagem 5' para 3') de uma fita (região de semente) podem contribuir mais para potencial fora do alvo que resto da sequência (que é região de não-semente e de sítio de clivagem) (Haley, B., e Zamore, P.D., Nat Struct Mol Biol. 2004, 11:599).
4) posições 10 e 11 (contagem 5' para 3') de uma fita (região de sítio de clivagem) podem contribuir mais para potencial fora do alvo que região não-semeada (que é posições 12 a 18, contagem 5' para 3')
5) posições 1 e 19 de cada fita não são relevantes para interações fora do alvo
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 93/176
89/161
6) potencial fora do alvo pode ser expressado pela contagem do fora do alvo mais relevante, calculado baseado no número e posição de desalinhamento da fita para a região mais homóloga no gene fora do alvo considerando suposições de 3 para 5
7) assumindo aborto potencial da atividade da fita senso por modificações internas introduzidas, somente será relevante potencial fora do alvo da fita antissenso.
[00232] Para identificar potencial de genes fora de alvo, sequências de antissenso de 19 mers foram submetidas à pesquisa de homologia contra sequências de mRNA humano publicamente disponíveis, assumidas para representar o transcriptoma compreensivo humano. [00233] Para este propósito, pesquisas de fastA (versão 3.4) foram realizadas com todas sequências de 19 mers contra um banco de dados de RefSeq humano (versão disponível a partir de ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/ em 18 de Novembro de 2005).Pesquisa de FastA foi realizada com pares de valores de parâmetros -f 30 -g 30 a fim de considerar a homologia sobre o comprimento completo de 19 mers sem quaisquer aberturas. Além disso, a fim de assegurar a listagem de todas áreas críticas fora do alvo relevantes no arquivo de saída fastA, o parâmetro -E 15000 foi usado.
[00234] Uma busca resultou em uma lista de potenciais fora do alvo para cada sequência de entrada listada por sequência de homologia descendente completa sobre os 19 mers.
[00235] Para contar todos os potenciais fora do alvo de acordo com suposições 3 para 5, e assim identificar o gene fora de alvo mais relevante e sua categoria fora do alvo, arquivos de saída fastA foram analisados por um script em perl.
[00236] O roteiro extraiu as seguintes propriedades fora do alvo para cada sequência de 19 mers de entrada e cada gene fora do alvo para calcular a contagem fora do alvo:
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 94/176
90/161 · Número de desalinhamentos em região não-semente · Número de desalinhamentos em região semente · Número de desalinhamentos em região de sítio de clivagem [00237] A contagem fora do alvo foi calculada considerando-se as suposições 3 para 5 como a seguir:
Contagem fora do alvo = número de desalinhamentos sementes* 10 + número de desalinhamentos em sítio de clivagem * 1,2 +número de desalinhamento não-sementes* 1 [00238] O gene fora de alvo mais relevante para cada sequência de 19 mers foi definido como o gene com a menor contagem de fora do alvo. Consequentemente, a menor contagem de fora do alvo foi definida como representativa para o potencial fora do alvo de cada siRNA, representado pela sequência antissenso de 19 mers analisada.
[00239] Potencial calculado fora do alvo foi usado como parâmetro de seleção (descendente por contagem fora do alvo) a fim de gerar uma classificação para todas as sequências de siRNA cruzadas reativas a humano-reso.
[00240] Uma contagem fora do alvo de 3 ou mais foi definida como pré-requisito para seleção de siRNA, considerando que todas as sequências contendo 4 ou mais G's em linha (sequências poli-G) foram excluídas, conduzindo a seleção de um total de 152 siRNAs objetivando alfa ENaC humano e resos (vide tabela 1a).
Conjunto de triagem estendido [00241] O objetivo para a seleção in silico do conjunto de triagem estendido foi identificar todos os outros siRNAs objetivando alfa-ENaC humano com suficiente especificidade, que foram excluídos do conjunto inicial devido à perda de reatividade cruzada para resos. As sequências restantes do reservatório de 19 mers derivaram de alfaENaC humano que não foram analisados antes de serem tomadas e
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 95/176
91/161 sequências de senso correspondentes foram geradas. O gene fora de alvo mais relevante e suas contagens de fora do alvo correspondentes foram calculados como descrito em seção Conjunto de triagem inicial.
[00242] Para determinar a reatividade cruzada para camundongo e porquinho-da-índia (Cavia porcellus/cobya), sequências de alfa-ENaCs destas espécies foram obtidas do banco de dados de nucleotídeo NCBI 1 (números de acesso NM_011324.1 e AF071230 (comprimento completo)/DQ109811 (cds parciais), respectivamente). As duas sequências de porquinho-da-índia foram usadas para gerar uma sequência de consenso alfa-ENaC de porquinho-da-índia. Cada sequência de 19 mers de ser humano foi testada para a presença nas sequências de camundongo e de porquinho-da-índia. Sequências positivas foram avaliadas para o pool de sequências (senso) de siRNA com reatividade cruzada humano-camundongo, ou sequências (senso) de siRNA com reatividade cruzada humano-porquinho-da-índia. Após a exclusão de todas as sequências poli-G, sequências foram selecionadas com contagens de fora do alvo de 3 ou mais bem como aquelas com contagem de fora do alvos de 2,2 ou 2,4 e reatividade cruzada a camundongo, resos ou porquinho-da-índia. O número total de siRNAs no pool de triagem estendido foi 344 (vide tabela 1b).
Conjunto de substitutos de rato in vivo [00243] O objetivo para seleção in silico do conjunto de substituto de rato in vivo foi identificar todos os siRNAs objetivando alfa-ENaC humano e de rato com suficiente especificidade em rato. Para identificação de siRNAs com reatividade cruzada humano-rato, sequência alfa-ENaC de mRNA de rato foi baixada a partir e banco de dados de nucleotídeo NCBI (número de acesso, NM_031548.2), e todas sequências fora do pool de 19 mers humano foram testadas para prePetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 96/176
92/161 sença na sequência de rato, representando o pool de sequências (senso) de siRNA com reatividade cruzada humano-rato.
[00244] As sequências senso correspondentes foram geradas e testadas para especificidade em rato. Para isso, o gene fora de alvo mais relevante em rato e suas contagens de fora do alvo correspondentes foram calculadas como descrito em seção Conjunto de triagem inicial usando o conjunto de mRNA de rato (banco de dados RefSeq) ao invés dos transcritos humanos. Após exclusão de todas sequências poliG, uma classificação foi gerada considerando a contagem de fora do alvo de rato na primeira prioridade e a contagem de fora do alvo de ser humano com segunda prioridade. Aquelas 48 sequências do topo da lista foram finalmente selecionadas representando um conjunto de substituto de rato in vivo (vide tabela 1c).
Conjunto de substituto de porquinho-da-índia in vivo [00245] O objetivo para seleção in silico do conjunto de substituto de porquinho-da-índia in vivo foi identificar todos siRNAs objetivando alfa-ENaC de ser humano e de porquinho-da-índia que não foram selecionados em conjuntos anteriores. Os siRNAs restantes do conjunto de sequências (senso) de siRNA com reatividade cruzada humanoporquinho-da-índia previamente determinados foram classificados de acordo com contagens de fora do alvo de ser humano. As 63 sequências de topo (excluindo sequências poli-G) foram selecionadas, representando o conjunto de substituto de porquinho-da-índia in vivo (vide tabela 1d).
Exemplo 2: síntese de siRNA
Síntese de nucleotídeos compreendendo bases naturais [00246] Como os siRNAs dos conjuntos de triagem são todos potencialmente destinados para administração in vivo, siRNAs foram sintetizados com uma estratégia de modificação que protege os siRNAs de degradação por endo e exonucleases em um meio biológico. Nesta
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 97/176
93/161 estratégia, as extremidades 3' de ambas fitas são protegidas de uma atividade exonucleotídica de 3'-> 5' por uma ligação de fosforotioato entre as duas últimas nucleobases na extremidade 3'. A fim de inibir a degradação endo-nucleolítica do siRNA todas as pirimidinas na fita senso do siRNA foram substituídas com o ribonucleotídeo 2'-0-metilmodificado correspondente. Para reduzir o número de modificações na fita antissenso, que é a fita mais ativa e portanto mais sensível a modificações, os requerentes somente modificaram as pirimidinas no contexto de sítios de clivagem principais de nuclease identificados previamente com grupo de 2'-O-metilas. Os sítios de clivagem principais são os dois seguintes motivos de sequência : 5'-UA-3' e 5'-CA-3'. [00247] Uma vez que também foram considerados para uso siRNAs em formulações que potencialmente protegem os RNAs do meio biológico nucleotídico no pulmão, os mesmos conjuntos de siRNAs foram também sintetizados sem qualquer proteção de degradação endonucleolítica.
[00248] Onde a fonte de um reagente não é especificamente dada aqui, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular em um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular.
[00249] RNAs de fitas simples foram produzidos por síntese em fase sólida em uma escala de 1 pmole usando um sintetizador Expedite 8909 (Biosystems Applied, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemanha) e vidro de poro controlado (CPG, 500Â, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Alemanha) como suporte de sólido. RNA e RNA contendo 2'-O-metil nucleotídeos foram gerados por síntese de fase sólida empregando os fosforamiditos correspondentes e 2'-O-metil fosforamiditos, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Alemanha). Estes blocos de construção foram incorporados em sítios selecionados dentro da sequência da cadeia de oligorribonucleotídeo
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 98/176
94/161 usando química de fosforamidito de nucleosídeo padrão tal como descritos em Protocolos correntes em química de ácido nucleico, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA. Ligações de fosforotioato foram introduzidas por substituição da solução oxidante de iodo com uma solução do reagente de Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, UK) em acetonitrila (1%). Outros reagentes anciliares foram obtidos de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemanha). [00250] Desproteção e purificação dos oligorribonucleotídeos brutos por HPLC de troca iônica foram realizadas de acordo com procedimentos estabelecidos. A produção e concentrações foram determinadas por absorção de UV de uma solução do respectivo RNA em um comprimento de onda de 260 nm usando um fotômetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, UnterschleiBheim, Alemanha). RNA de fita dupla foi gerado misturando uma solução equimolar de fitas complementares em tampão de anelamento (20 mM de fosfato de sódio, pH 6,8; 100 mM de cloreto de sódio), aquecidos em um banho de água a 85 - 90°C por 3 minutos e resfriados para temperatura ambiente durante um período de 3 - 4 horas. A solução de RNA anelada foi diluída para uma concentração de 50 pmole de RNA/L de fita dupla e armazenada a -20°C até uso.
Exemplo 3: teste de siRNA in vitro [00251] A capacidade dos agentes de iRNA de inibirem a expressão de alfa-ENaC foi testada em linhagens celulares de ser humano in vitro, ou em ratos in vivo. O agente de iRNA é transfectado nas células, por exemplo, por transfecção, permitiu reagir em células por um certo tempo, por exemplo, 24 horas, e níveis de mRNA alfa-ENaC foram determinados por análise de DNA ramificado. Alternativamente, o agente de iRNA é administrado in vivo através da via intratraqueal e a expressão de inibição de mRNA alfa-ENaC determinada por análise de DNA ramificado no órgão alvo. Complementando esses testes diretos, os
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 99/176
95/161 requerentes testaram a inibição de expressão de gene-alvo por agentes de RNAi para mRNA alfa-ENaC recombinantemente expressado nas células de mamífero hospedeiras.
Linhagens celulares [00252] Células H441 foram obtidas da American Type Culture Collection (Número ATCC: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemanha) e foram cultivadas em RPMI 1640, 10% de soro bovino fetal, 100u penicilina/100 pg/mL de estreptomicina, 2 mM de Lglutamina, 10 nM de Hepes e 1 mM de Sódio-Piruvato (todos de Biochrom AG, Berlin, Alemanha) a 37°C sob uma atmosfera de 5% de CO2/95% de ar.
[00253] Células epiteliais bronquiais humanas primárias foram obtidas de Cambrex (Cat # CC-2540) e foram rotineiramente cultivadas em meios de cultura de BEGM com alíquotas únicas (Cambrex Cat # CC-3170 menos tri-iodotreonina). Para polarização e crescimento em interface de ar líquido, as células foram cultivadas em uma mistura de 1:1 BEGM:DMEM suplementada com 4,5 g/L de D-Glicose (Gibco BRL Cat # 41965-039) e suplementadas com alíquotas únicas (Cambrex Cat # CC-4175), como acima mas menos a tri-iodotreonina e GA1000 alíquotas e na presença de 50 pg/mL de Gentamicina (Gibco Brl Cat # 10131-015). As células foram mantidas em meios de cultura sem soro, solução de neutralização de tripsina foi usada durante etapas de passagem (Cambrex Cat # CC-5002). Para polarização e cultura em interface ar-líquido as células foram cultivadas em suportes de policarbonato semipermeáveis (0,4 mícron) (Corning Costar Cat # 3407 #3460) e cultivadas a 37°C sob uma atmosfera de 5% de CO 2/95% de ar.
[00254] Células de rim de macaco verde africano Cos-1 (ATCC #
CRL-1650) foram cultivadas em Dulbecco's MEM, 4,5 g/L de glicose,
10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (Gibco BRL), 100μ de penicilina / 100 pg/mL estreptomicina.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 100/176
96/161
Exemplo 3.1: triagem in vitro para siRNAs alfa-ENaC ativos e determinação de IC50 em H441 [00255] Um dia antes de transfecção, a expressão de alfa-ENaC foi induzida em células H441 (Número ATCC: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemanha) adicionando 100 nM de dexametasona. Diretamente antes de transfecção, células foram semeadas a 1,5 x 104 células/ poço em placas de 96 poços (Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemanha) em 75 pL de meio de crescimento (RPMI 1640, 10% de soro bovino fetal, 100μ de penicilina / 100 pg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 10 nM de Hepes e 1 mM de SódioPiruvato, todos de Biochrom AG, Berlin, Alemanha). Transfecções foram realizadas em quadruplicatas. Para cada poço 0,5 pL de Lipofectamina2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha) foi misturada com 12 pL de Opti-MEM (Invitrogen) e incubada por 15 min a temperatura ambiente. Para a concentração de siRNA sendo 50 nM nos 100 pL de volume de transfecção, 1 pL de 5 pM de siRNA foi misturado com 11,5 pL de Opti-MEM por poço, combinados com a mistura de Lipofectamina2000-Opti-MEM e novamente incubada por 15 minutos a temperatura ambiente. Complexos de siRNA-Lipofectamina2000 foram aplicados completamente (25 pL cada por poço) às células e células foram incubadas por 24 h a 37°C e 5% de CO 2 em uma incubadora umidificada (Heraeus GmbH, Hanau).
[00256] Células foram coletadas aplicando 50 pL de mistura de lise (teor do kit de bDNA QuantiGene de Genospectra, Fremont, USA) a cada poço contendo 100 pL de meio de crescimento e foram lisadas a 53°C por 30 min. Posteriormente, 50 pL dos lisados foram incubados com conjuntos de sondas específicas para alfa-ENaC humano e GAPDH humano (sequência de conjuntos de sondas vide abaixo) e procedeu-se de acordo com o protocolo do fabricante para QuantiGene. No final, quimoluminescência foi medida em um Victor2-Light (Perkin
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 101/176
97/161
Elmer, Wiesbaden, Alemanha) conforme RLUs (unidades de luz relativas) e valores obtidos com um conjunto de sondas hENaC foram normalizados para os respectivos valores de GAPDH para cada poço. Valores obtidos com siRNAs direcionados contra Alfa-ENaC foram relacionados ao valor obtido com um siRNA não-específico (direcionado contra HCV) que foi configurado para 100%. A expressão de porcentagem residual de alfa-ENaC para exemplos de siRNA é mostrada em Tabelas 1A-1D.
[00257] siRNAs eficazes da triagem foram ainda caracterizados por curvas de dose resposta. Transfecções de curvas de dose resposta foram realizadas nas seguintes concentrações: 100 nM, 16,7 nM, 2,8 nM, 0,46 nM, 77 picoM, 12,8 picoM, 2,1 picoM, 0,35 picoM, 59,5 fM, 9,9 fM e simulado (no siRNA) e diluídos com Opti-MEM para uma concentração final de 12,5 pl de acordo com o protocolo acima. Análise de dados foi realizada usando o software Microsoft Excel add-in XL-fit 4.2 (IDBS, Guildford, Surrey, UK) e aplicando o modelo sigmoidal número 606.
Conjuntos de sondas: alfa-ENaC humano:
Nome FPL Membros Função Sequência SEQ. I.D. N°:
hENAC001 .235.255.CE CE gtctgtccagggtttccttccTTTTTctcttggaaagaaagt 1645
hENAC002 .274.293.CE CE actgccattcttggtgcagtTTTTTctcttggaaagaaagt 1646
hENAC003 .344.367.CE CE ctctcctggaagcaggagtgaataTTTTTctcttggaaagaaagt 1647
hENAC004 .391.411.CE CE gccgcggatagaagatgtaggTTTTTctcttggaaagaaagt 1648
hENAC005 .501.521.CE CE gcacttggtgaaacagcccagTTTTTctcttggaaagaaagt 1649
hENAC006 .539.560.CE CE agcagagagctggtagctggtcTTTTTctcttggaaagaaagt 1650
hENAC007 .256.273.LE LE cgccataatcgcccccaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1651
hENAC008 .368.390.LE LE cacagccacactccttgatcatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1652
hENAC009 .412.431.LE LE acagtactccacgttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1653
hENAC010 .455.477.LE LE ggagcttatagtagcagtaccccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1654
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 102/176
98/161
hENAC011 .522.538.LE LE acgctgcatggcttccgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1655
hENAC012 .561.580.LE LE gagggccatcgtgagtaaccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1656
hENAC013 .214.234.BL BL Tcatgctgatggaggtctcca 1657
hENAC014 .294.318.BL BL Ggtaaaggttctcaacaggaacatc 1658
hENAC015 .319.343.BL BL Cacacctgctgtgtgtactttgaag 1659
hENAC016 .432.454.BL BL Caggaactgtgctttctgtagtc 1660
hENAC017 .478.500.BL BL Gtggtctgaggagaagtcaacct 1661
hENAC018 .581.599.BL BL Ccattcctgggatgtcacc 1662
GAPDH humano:
FPL No- Membros Função Sequência SEQ. I.D.
me N°:
hGAP001 AF261085.252.271.CE CE gaatttgccatgggtggaatTTTTTctcttgga- aagaaagt 1663
hGAP002 AF261085.333.352.CE CE ggagggatctcgctcctggaTTTTTctcttgga- aagaaagt 1664
hGAP003 AF261085.413.431.CE CE ccccagccttctccatggtTTTTTctcttgga- aagaaagt 1665
hGAP004 AF261085.432.450.CE CE gctcccccctgcaaatgagTTTTTctcttgga- aagaaagt 1666
hGAP005 AF261085.272.289.LE LE agccttgacggtgccatgTTTTTaggcataggac- ccgtgtct 1667
hGAP006 AF261085.290.310.LE LE gatgacaagcttcccgttctcTTTTTaggcataggac- ccgtgtct 1668
hGAP007 AF261085.311.332.LE LE agatggtgatgggatttccattTTTTTaggcatagga- cccgtgtct 1669
hGAP008 AF261085.353.372.LE LE gcatcgccccacttgattttTTTTTaggcataggac- ccgtgtct 1670
hGAP009 AF261085.373.391.LE LE cacgacgtactcagcgccaTTTTTaggcataggac- ccgtgtct 1671
hGAP010 AF261085.451.472.LE LE ggcagagatgatgacccttttgTTTTTaggcatag- gacccgtgtct 1672
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 103/176
99/161
hGAP011 AF261085.392.412.BL BL Ggtgaagacgccagtggactc 1673
[00258] Os IC50s para exemplos de siRNA exemplos são mostrados na tabela 2A e 2B.
Exemplo 3.2: Redução de Alfa-ENaC transitório em um modelo epitelial bronquial humano primário:
[00259] Células epiteliais bronquiais humanas (referência de doador 4F1499) foram colocadas em placas de 24 poços a 1x105 células por poço em 0,5 mL de meio de crescimento um dia antes de transfecção. As células estavam 70% confluentes no dia de transfecção de siRNA. [00260] Cada siRNA foi colocado novamente em suspensão em 100nM em 1mL de Optimem I (Invitrogen) e em um tubo separado, Lipofectamina 2000 (Invitrogen) foi diluída para 6 pL/mL em Optimem, concedendo uma quantidade suficiente para transfecção de quatro réplicas em uma placa de 24 poços. Após 5 minutos em temperatura ambiente, as misturas foram combinadas para dar a concentração final desejada de 50nM de siRNA e 3 pL/mL de Lipofectamina 2000. A mistura de transfecção foi incubada por outros 20 minutos em temperatura ambiente e 420 pL do complexo siRNA/reagente foram adicionados a cada poço como declarado pelo projeto experimental. Placas foram suavemente agitadas para assegurar mistura completa e então incubadas a 37°C em uma incubadora a 5% de CO2/95% de ar por 4 horas. Subsequentemente, a mistura de transfecção foi aspirada e as células foram retornadas as condições de cultura normais para outras 20 horas.
[00261] Lisados celulares foram preparados para análise de DNA ramificado. Um mistura meio:tampão de lise (Panomics) de 2:1 foi preparada e células foram lisadas em 200 pL a 53oC por 30 minutos.
Após uma verificação visual para lise completa, os lisados celulares foram armazenados a -80oC para análise subsequente. Análise de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 104/176
100/161
DNA ramificado foi realizada como descrito acima, com expressão de alfa-ENaC normalizada contra GAPDH. O protocolo de análise de DNA ramificado usado difere daquele acima somente em que 20 pL de amostra foi aplicada a cada poço nesse caso.
Tabela 2C mostra a expressão de alfa-ENaC em HBEC primário para exemplos de siRNA.
Exemplo 3.3: inibição in vitro de expressão de cinomolgos clonados expressada exogeneamente de gene de alfa-ENaC para agentes RNAi selecionados em células Cos-1
Clonagem da sequência alfa-ENaC de cinomolgos [00262] Sequências de iniciador para uma amplificação de 5'- UTR e CDS (nucleotídeos mostrados em suportes correspondem à sequência α-ENaC de Macaca mulatta (Macaco reso) de cDNA):
P745: 5'- CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3' (nt 1427) (SEQ. I.D. N°:1674)
P733: 5'- CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3' (nt 1) (SEQ. I.D. N°:1675) P734: 5- CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3' (nt 17) (SEQ. I.D. N°:1676) P735: 5'- GGCCGCTGCACCTGTAGGG-3' (nt 28) (SEQ. I.D. N°:1677)
Sequências de iniciador para amplificação de CDS e 3'- UTR:
P737: 5'- ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3' (nt 1422) (SEQ. I.D. N°:1678)
P740: 5'- TTGAGCATCTGCCTACTTG-3' (nt 3113) (SEQ. I.D. N°:1679)
Sequências de iniciador para amplificação de parte interna de CDS: P713: 5'- 5'-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3' (nt 1182) (SEQ. I.D. N°:1709)
P715: 5'- 5'-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3' (nt 2108) (SEQ. I.D. N°:1680)
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 105/176
101/161 [00263] RNA total de pulmão de cinomolgos (Macaca fascicularis) (#R1534152-Cy-BC) foi adquirido de BioCat (Alemanha). Síntese de cDNA foi realizada usando Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen) (Invitrogen). Síntese de cDNA foi realizada usando ou hexâmeros aleatórios ou iniciadores oligo dT. Além disso, a primeira fita de cDNA de pulmão de cinomolgos foi também adquirida de BioCat /#C1534160-Cy-BC). Para amplificação por PCR, o kit de PCR Advantage 2 (# K1910-1, Clontech) foi usado. Amplificação da 5'-UTR e partes do CDS foi realizada usando P745 e uma mistura equimolar de P733, P734 e P735. Para amplificação por PCR dos CDS e 3'-UTR, iniciadores P737 e P740 foram usados. Os iniciadores P713 e P715 foram usados para amplificação de partes do CDS.
[00264] Todos os produtos de PCR foram analisados por eletroforese de gel de agarose e então clonados no vetor pCR2.1 usando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen) em bactérias TOP10. Clones foram então reunidos e DNA foi isolado usando o kit Qiagen Miniprep. Após digestão com enzima de restrição EcoRI e análise por eletroforese de gel de agarose, DNA de clones corretos foram submetidos ao sequenciamento.
[00265] As sequências foram então alinhadas com a sequência de cDNA de a-ENaC de macaco reso, e sequências dos clones individuais foram alinhadas umas com as outras. O cDNA de alfa-ENaC de cinomolgos de comprimento completo foi então clonado por digestão da parte de 5' (5'-UTR e CDS, clone 55) com EcoR I e Not I, digestão da parte do meio dos CDS por Not I e BstE II (clone 15), e a parte de 3' (CDS e 3'-UTR) por BstE II e EcoR V (clone 80). Os fragmentos de DNA digeridos foram então subclonados em pcDNA3.1, digeridos com EcoR I e EcoR V. O cDNA de alfa-ENaC de cinomolgos de comprimento completo em pcDNA3.1 foi então submetido a sequenciamento de comprimento completo (Ingenetix, Viena, Áustria). A sequência de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 106/176
102/161 cDNA de alfa-ENaC de cinomolgos corresponde a nt 28 - 3113 da sequência de cDNA de alfa-ENaC de resos. Finalmente o cDNA de alfaENaC de cinomolgos foi então excisado do pcDNA3.1 alfa-ENaC de cinomolgos por digestão com BamH I e EcoR V e subclonado no vetor pXOON. O mapa do plasmídeo é ilustrado na Figura 1. Figura 2 descreve a proteína (SEQ ID NO:1681) e a sequência de DNA (SEQ ID NO:1682) de alfa-ENaC de cinomolgos.
Transfecções:
[00266] Células Cos-1 foram semeadas a 6x104 células/poço em placas de 24 poços cada em 0,5 mL de meio de crescimento. Um dia após semear as células foram cotransfectadas com o plasmídeo de expressão de alfa-ENaC de cinomolgos pXOON e o siRNA indicado. Para cada poço, 4ng de plasmídeo de expressão de alfa-ENaC e 600ng de plasmídeo de veículo (pNFAT-luc) foram cotransfectadas com siRNA relevante (concentração final de 45nM) usando reagente de transfecção de gene X-treme (Roche) a 3,75 pL/poço em um volume total de 720 pL/poço Opti-MEM (Invitrogen) como descrito abaixo. [00267] Transfecções foram realizadas em triplicata para cada amostra. Misturas principais de plasmídeo/siRNA (cada para 3,5 poços) foram preparadas como segue: 14 ng de plasmídeo de expressão de alfa-ENaC, 2,1 pg de plasmídeo de veículo e 112 pmoles de siRNA relevante em um volume total de 210 pL (Opti-MEM). Uma mistura principal de lipídios foi preparada para toda a transfecção (105 pL de lipídio mais 1575 pL de Opti-MEM para oito amostras de transfecção de triplicata). Plasmídeo/siRNA e lipídio foram misturados em volume igual para dar um volume total de 420 pL de mistura de transfecção por amostra de triplicata (3,5x). Seguindo uma incubação de 20 minutos em temperatura ambiente, 120 pL da mistura de transfecção relevante foi adicionada a cada poço de células no volume de transfecção de 720 pL (Opti-MEM). Células foram transfectadas por 24 horas a
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 107/176
103/161
37°C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada (Heraeus GmbH, Hanau, Alemanha) e coletadas para análise de DNA ramificado.
[00268] Lisados celulares foram preparados para análise de DNA ramificado. Uma mistura de meio:tampão de lise (Panomics) de 2:1 foi preparada e células foram lisadas em 200 pL a 53oC por 30 minutos. Após uma verificação visual para lise completa, os lisados celulares foram armazenados a -80 oC para análise subsequente. Análise de DNA ramificado foi realizada como descrito acima, com expressão de cino alfa-ENaC normalizada contra eGFP do plasmídeo de expressão. O protocolo de análise de DNA ramificado usado difere daquele acima somente em que 20 pL de amostra foram aplicados a cada poço neste caso.
Conjuntos de sondas: Alfa-EnaC de cinomolgos:
Nome FPL Função Sequência SEQ. I.D. N°:
cyENa001 CE cgccgtgggctgctgggTTTTTctcttggaaagaaagt 1683
cyENa002 CE ggtaggagcggtggaactcTTTTTctcttggaaagaaagt 1684
cyENa003 CE cagaagaactcgaagagctctcTTTTTctcttggaaagaaagt 1685
cyENa004 CE cccagaaggccgtcttcatTTTTTctcttggaaagaaagt 1686
cyENa005 LE ggtgcagagccagagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt 1687
cyENa006 LE gtgccgcaggttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1688
cyENa007 LE gatcagggcctcctcctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1689
cyENa008 LE ccgtggatggtggtattgttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1690
cyENa009 LE gcggttgtgctgggagcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1691
cyENa0010 LE ttgccagtacatcatgccaaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1692
cyENa0011 BL acaccaggcggatggcg 1693
eGFP:
Nome FPL Função Sequência SEQ. I.D. N°:
EGFP001 CE ggcacgggcagcttgcTTTTTctcttggaaagaaagt 1694
EGFP002 CE ggtagcggctgaagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt 1695
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 108/176
104/161
EGFP003 CE cctggacgtagccttcgggTTTTTctcttggaaagaaagt 1696
EGFP004 CE ccttgaagaagatggtgcgctTTTTTctcttggaaagaaagt 1697
EGFP005 LE cgaacttcacctcggcgcTTTTTctcttggaaagaaagt 1698
EGFP006 LE ccttcagctcgatgcggtTTTTTctcttggaaagaaagt 1699
EGFP007 LE gtcacgagggtgggccagTTTTTaggcataggacccgtgtct 1700
EGFP008 LE cacgccgtaggtcagggtgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1701
EGFP009 LE gtgctgcttcatgtggtcggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1702
EGFP0010 LE tcaccagggtgtcgccctTTTTTaggcataggacccgtgtct 1703
EGFP0011 BL cggtggtgcagatgaacttca 1704
EGFP0012 BL catggcggacttgaagaagtc 1705
EGFP0013 BL cgtcctccttgaagtcgatgc 1706
[00269] Tabela 2C mostra uma expressão de alfa-ENaC em espécies de cinomolgos para os exemplos de siRNA.
Exemplo 3.4 Triagem para indução de interferon-α [00270] Para avaliar a capacidade de siRNA estimular liberação de interferon-α (IFN α ), siRNA foi incubado com células mononucleares de sangue periféricos recentemente purificados (PBMCs) in vitro por 24 horas. O siRNA foi adicionado ou diretamente a PBMCs, ou primeiro complexado com um agente de transfecção de lipídio (GenePorter 2 ou Lipofectamine 2000 ou agente de transfecção DOTAP) e subsequentemente incubados com PBMCs. Os controles positivos para indução de IFN α, sequências controle não-modificadas DI_A_2216 e DI_A_5167 foram incluídas.
DI_A_2216: é molécula de DNA antissenso de fita simples
5'-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG 3' (SEQ. I.D. N°:1707)
DI_A_5167 é um siRNA conjugado a colesterol
5'- GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-chol - 3'
3'- CsAsCAGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5' (SEQ. I.D. N°:1708)
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 109/176
105/161 [00271] Após 24 horas, o IFN α foi medido por ELISA. O nível de IFN α basal foi determinado para células não tratadas e foi sempre muito próximo a um controle de apenas água. A adição de agente de transfecção sozinho não deu ou deu somente um pequeno aumento de níveis de IFN α. Oligonucleotídeos estimulatórios conhecidos foram adicionados a células, quer diretamente ou na presença de transfectante, e os aumentos esperados de IFN α foram observados. Essa configuração permite determinar a estimulação de IFN α em PBMC humano por siRNA (ou outros oligonucleotídeos).
[00272] Isolamento de PBMCs Humanos: uma fração concentrada de leucócitos (creme leucocitário) foi obtida de banco de Sangue Suhl, Institute for Transfusion Medicine, Alemanha. Estas células foram negativas para uma variedade de patógenos, incluindo HIV, HCV, e outros. O creme leucocitário foi diluído de 1:1 com PBS, adicionado a um tubo contendo Ficoll, e centrifugado por 20 minutos a 2200 rpm para permitir fracionamento. Isto foi seguido por remoção da camada turva de células brancas do sangue e transferidos a um tubo com PBS fresco e Ficoll, que foi centrifugado por 15 minutos a 2200 rpm. A camada turva de células do sangue brancas foi novamente removida, transferida para meio de cultura RPMI 1640 e centrifugada por 5 minutos a 1.200 rpm para peletar as células brancas do sangue. As células foram novamente colocadas em suspensão em RPMI, peletadas como acima, e colocadas novamente em suspensão em meios com 10% de FCS a 1 x 106/mL.
[00273] Medição de interferon-α: células em cultura foram combinadas com ou 500 nM (ou 1μΜ) de oligonucleotídeo em Optimem, ou 133 nM de oligonucleotídeo em GP2 ou Lipofectamina2000, ou agente de transfecção de DOTAP, por 24 horas a 37°C. Interferon-α foi medido com kit ELISA imediato de Bender Méd Systems (Vienna, Áustria) de acordo com as instruções do fabricante.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 110/176
106/161 [00274] Seleção de sequências terapêuticas de veículo foi baseada em um nível de indução de IFN α de menos do que 15% do controle positivo.
Exemplo 3.5 Determinação de estabilidade de siRNA em esputo de pacientes CF [00275] Amostras de esputo foram coletadas por Dr. Ahmet Uluer, Children's Hospital Boston. Após coleta, amostras de esputo foram tratadas com antibiótico e foram irradiadas por UV para reduzir teor bacteriano. Para determinar estabilidade de siRNA na amostra de esputo, siRNAs foram incubados em 30 pL de esputo em uma concentração de 5 μΜ a 37°C para os tempos indicados. A reação foi terminada pela adição de proteinase K e amostras foram incubadas a 42°C por outros 20 minutos. Uma molécula de 40 mers de RNA feita de L-nucleotídeos (Spiegelmer) resistente a degradação de nuclease foi adicionada e servida como calibração-padrão. Amostras foram filtradas através de uma membrana de 0,2 μm para remover detritos restantes. Amostras foram analisadas por HPLC de troca iônica de desnaturanção em uma coluna de DNAPac PA 200 (Dionex) a pH 11,0 usando um gradiente de perclorato de sódio para eluição. Produtos de siRNAs e de degradação foram quantificados por determinação da área sob o pico para cada amostra. Concentração foi normalizada para a concentração nas amostras não-incubadas.
[00276] A seleção das sequências terapêuticas principais (ND8356, ND8357 e ND8396) foi baseada em uma estabilidade in vitro observada em esputo de CF com uma meia vida maior que 60 minutos. Exemplo 3.6 Verificação cruzada de sequências terapêuticas principais contra polimorfismos conhecidos em gene de SCNN1A humano [00277] Para excluir conhecidos polimorfismos dos sítios-alvos de candidatos principais, sequências de siRNA de veículo foram verificadas contra o polimorfismo de banco de dados de nucleotídeo simples
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 111/176
107/161 de NCBI (SNP) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp). Dos 10 polimorfismos de éxon conhecidos no gene SCNN1A humano, nenhum foi mostrado para estarem presentes nos sítios-alvo de qualquer dos 10 candidatos terapêuticos principais mais potentes.
Exemplo 3.7 Perfil in vitro de 5 melhores sequências fora do alvo previstas [00278] Uma lista de alinhamentos para cada sequência foi classificada por homologia sobre a região de 19 mers. Fora dos alvos foram contados baseado no número e posição do desalinhamento de acordo com os critérios descritos no exemplo 1. As 5 melhores sequências fora do alvo foram identificadas para cada sequência terapêutica principal (ND8356, ND8357 e ND8396). Sequências dentro e fora do alvo foram individualmente clonadas em um sistema dual reporter de luciferase. Cada fragmento clonado englobou 19 nucleotídeos-alvo em adição a 10 nucleotídeos de regiões de flanqueamento, ambos 5' e 3' da sequência-alvo. Os fragmentos foram clonados em um sítio de clonagem múltiplo 3' para sequência de Renilla luciferase, sob o controle de um promotor de SV40. A atividade de cada siRNA contra ambas sequências dentro e fora do alvo foi determinada pela fluorescência relativa da Renilla luciferase alvo à Firefly luciferase, a última sendo independentemente controlada pelo promotor de HSV-TK. Inicialmente, transfecções foram realizadas em células Cos-7 em uma concentração de siRNA de 50nM. Etapas de leitura de luciferase foram tomadas 24h pós-transfecção. Nesta concentração elevada de siRNA, nenhuma queda de mais do que 30% foi observada contra qualquer sequência fora do alvo para qualquer um dos três siRNAs principais. Atividade contra a sequência-alvo foi demonstrada com uma redução relativa em atividade de Renilla luciferase de aproximadamente 80%. Curvas de IC50 foram também geradas para cada siRNA contra a sequência denPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 112/176
108/161 tro do alvo e controladas com as sequências fora do alvo identificadas acima. Para cada siRNA principal, IC50's desejados nesse teste de repórter foram de ordem similar de magnitude (10-50 pM) para os IC50's obtidos contra o alvo endógeno em H441 (Exemplo 3.3) indicando que para ND8356, ND8357 e ND8396, potência contra a sequência-alvo foi pelo menos 1000-5000 vezes maior que para qualquer das sequências fora do alvo previstas.
Exemplo 3.8 Perfil de genotoxicidade [00279] Determinação da citotoxicidade : citotoxicidade foi determinada por uso de um contador de células para a avaliação do número de células de cultura.
[00280] Sabe-se bem que o teste das concentrações citotóxicas in vitro pode induzir efeitos genotóxicos como a formação de micronúcleo. Portanto, os requerentes consideraram números aumentados de células contendo micronúcleos aparecendo em contagem de células em torno de 50% ou menos (comparado com o controle negativo concorrente) para estar relacionado com a citotoxicidade se nenhum aumento dose-dependente em células micronucleadas já puder ser observado em concentrações mostrando toxicidade moderada no máximo. A análise da concentração mostrando pelo menos 50% de redução em contagem de células é requerida pelas diretrizes regulando os testes de células de mamíferos in vitro (diretrizes OECD e ICH para conduzir os testes de aberração de cromossomos). Além disso, protocolos OECD requerem o teste de compostos não tóxicos para incluir pelo menos uma concentração precipitante (desde que não exceda 10 mM ou 5 mg/ml, o que for menor.). Já que o teste com micronúcleos in vitro visa prever o surgimento de testes regulatórios, isto é, teste de aberração de cromossomos in vitro, o protocolo para o teste de micronúcleo in vitro foi projetado para atender às exigências para estes testes.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 113/176
109/161 [00281] Sistema de teste: células TK6 são células transfectadas pelo Ebstein-Barr-Virus e imortalizadas (origem linfoblastoide humana derivada do baço). Determinação de potencial clastogênico e/ou aneugênico no teste de micronúcleo in vitro com células TK6 com e sem homogenado de fígado S9 (2%) de ratos machos (pré-tratados com Aroclor 1254). Tempo de tratamento: 20 horas (-S9), 3 horas (+S9). Tempo de amostragem: 24 horas após o início do tratamento de 3 horas, 48 horas após o início do tratamento de 20 horas. Para cada substância pelo menos três concentrações (2 culturas por concentração) e 2000 células por concentração foram analisados.
[00282] O efeito indutor de micronúcleo para uma concentração testada foi considerado positivo se a frequência de células micronucleadas foi >= 2% e mostrou pelo menos uma duplicação do valor de controle de solvente concorrente, OU < 2% e mostrou pelo menos um aumento de três vezes sobre o valor de controle de solvente concorrente.
Para concluir um experimento como sendo positivo, a relação dose-efeito e citotoxicidade foi levada em consideração.
[00283] Sumário: as sequências terapêuticas principais ND8396, ND8356, ND8357 nem induziram números aumentados de células contendo micronúcleos após o tratamento de 20 horas sem ativação metabólica, nem após o tratamento de 3 horas com ou sem S9. Não pode ser analisada a concentração citotóxica até o limite de teste de 5 mg/mL.
Exemplo 3.9 eficácia funcional in vitro em H441: ND8396 [00284] A fim de demonstrar a eficácia funcional in vitro de siRNA principal contra alfa ENaC, células H441 foram transfectadas com siRNA e preparadas para análise de transporte de íons por câmara
Ussings. Para a transfecção, células H441 foram plaqueadas em frasPetição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 114/176
110/161 cos T25 a 2 x 106 células por frasco em meio de cultura suplementado com 200nM de dexametasona. Células em cada frasco foram transfectadas ou com ND8396 ou um siRNA de controle de não-alvo a 30nM de siRNA e 4mL/mL de Lipofectamina 2000 em um volume total de 5mL (meio sem soro). Um dia após a transfecção, células foram plaqueadas sobre insertos de Snapwell de 1 cm2 em confluência (2 x 105 células por inserto) para minimizar o tempo requerido para diferenciação e formação de junções tight e fornecido com meio para tanto as câmaras apical como basolateral. Após um dia adicional de cultura, o meio apical foi removido e o meio basolateral substituído, deste modo tomando as células na cultura de interface ar - líquido (ALI). Células foram mantidas a ALI durante mais de seis dias antes da análise do transporte de íons.
[00285] Para análise funcional em câmaras Ussings, os insertos de Snapwell foram montados em câmaras de difusão vertical (Costar) e foram banhados com solução de Ringer continuamente gaseificada (5% de CO2 em O2; pH 7,4) mantidas a 37°C, contendo: 120mM de NaCl, 25mM de NaHCO3, 3,3mM de KH2PO4, 0,8mM de K2HPO4, 1,2mM de CaCl2, 1,2mM de MgCl2, e 10mM de glicose. A osmolaridade da solução foi determinada dentro da faixa de 280 e 300 mosmol/kgH2O. Células foram submetidas a voltagem a 0 mV (modelo EVC4000; WPI). A resistência transepitelial (RT) foi medida por aplicação de um pulso de 1 ou 2 mV em intervalos de 30 s, ou usando a diferença de potencial inicial através das células e a corrente inicial medida, e então calculando RT pela lei de Ohm. Dados foram gravados usando PowerLab (ADInstruments). Após o tratamento com siRNA, as características basais das células e a corrente de curto-circuito sensível a amilorida (ISC seguindo aplicação de 10 pM amilorida; lado apical apenas) foram gravadas. A atividade de canal de ENaC em cada cultura foi determinada por ISC sensível a amilorida em cada caso.
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 115/176
111/161 [00286] Após o teste, as células em insertos individuais foram lisadas para análise de RNA. Um nocaute de 75% ao nível de RNA no momento do teste (ND8396 como comparado a um controle sem definir a meta) estava correlacionado com um nocaute funcional da corrente sensível de amilorida de aproximadamente 30% (ND8396 como comparado a um controle sem definir a meta).
[00287] As sequências de acido nucleico são representadas abaixo usando a nomenclatura-padrão, e especificamente as abreviaturas de tabela A.
Tabela A: abreviaturas de monômeros de nucleotídeos usadas em representação de sequências de ácido nucleico. Será entendido que estes monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, são mutuamente ligados por ligações 5'-3'-fosfodiéster.
Abreviatura3 Nucleotídeo(s)
A adenosina-5'-fosfato
C citidina-5'-fosfato
G guanosina-5'-fosfato
T 2'-desóxi-timidina-5'-fosfato
U uridina-5'-fosfato
c 2-O-metilcitidina-5'-fosfato
u 2-O-metiluridina-5'-fosfato
Ts 2'-desóxi-timidina -5'-fosforotioato
Tabela 1A: siRNAs selecionados em conjunto de triagem inicial (siRNAs com reatividade cruzada à ENaC alfa humano-resos). Um total de 152 sequências de iRNA foram identificadas como um conjunto inicial de triagem, ambos com modificação de estrutura dorsal (fitas de sequência 1-304) e sem (fitas de sequência 305-608). Sequências de iRNA foram projetadas para serem totalmente complementares a ambas sequências alfa-ENaC de ser humano e macaco reso, de acordo com os critérios de projeto descritos na seção de
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 116/176
112/161 exemplos. A expressão de porcentagem residual de alfa-ENaC em duas experiências de transfecção de dose única independentes é mostrada (fazer referência a seção de exemplos para métodos usados). Legenda da tabela abaixo:
duplex ID
SEQ. ID Senso
SEQ. ID Antissenso
a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
2a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 117/176
113/161
Q σι
C C $H «I a X
Σ Λ
N S>
4* 4» 4» * 4»:4? *:*»*:* «fr: 4»: «*=<*? 4>\ <: «*· 4P:
ι/i t**> 9 ein o © 9 in «4 et* Φίριι ι/i *4 ; - : -·· : ! ; - :^;h; i 5 5 ? · 5 5 í ί ’ í í ! í I I ! í i i
I i N I Η Η I i i I t : 4...Í ' 4 17 .·..! j ( j. ! · | i 1 i w -r in n oiitfi □.:·»· wlin Q. ·/»! »Í r~ i <7·! ιζι σι’ ιηί <ci »«! «d! *i CD <·> M *1:N Ol= w: Ο; O>: «i: U>:*O£ ti: »· Oj O·:
Q σι
4* ·» 44 * H N H ój:N N;*4 N:H ιΛ· ♦ ti
PI · «Μ ; *«: w: W; P»: 01:
-4~
:..-4-4-4 ,.L4._1
,.4. i... 1..4444..
à 0 ·, Cl Ο Γ' Μ i-ΐΡΊ *' O rlio. O» N: »: rl Ό 1 O 2 <, *1 i· 9ι Ό N ΓΜ 'O·® irt: i· W:ffi:r«:U>:W:iA
S£*'5’ : 5 = : : í : : S í 1 I !
Ol Oki oi t·! «Ί: ~& : <h; f*»;
Figure BRPI0813680B1_D0001
- - : | i i φ: ββ: oi OI: CVMj <n,
... ,.t. ----1-: ., r -t.
□ CJ O bb 0:01 »Ό Β;θ ti: V: 10: o:o: c« -lj-1 -I, i >ijN « Μ; íi; OljPlj «
¢..-4.
κ e»: n r-41« . rti o·! t·! f«Í r«Í n ·: D a: α Bi β: β: ai — “ i I I Í I
... j : : » ui »·! o»l o·! h!
Bi B: C: <B; B·
Figure BRPI0813680B1_D0002
O»I Ifti p»i OvI I PI: PI· PI· PI:
--4-4 i σ> w σ»: ii»; ο·!σ<ί w ri Oli M: ti: PI: PI: <i ' ♦··+· m io r» os «ijo «í; ci n j v in io· o-i <nj e>j o' «-C p«i pij »· mi
B 8 ^3 · Φι σι · σι Oi j 6h! σι j «Λ J ^3- ^3; í ^3Í Oi
S g g 3 g;2 g g 2{ΰ g ggigiSiS S SiS:SiSi η o o o o; o a; ο η η ο: ο; ο; η· η· o er o; oi o; o;
ζζζζζζζ;ζζζ ζ·ζ·ζ·ζ;ζ;ζ z z; z; z: Z:
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 118/176
114/161
CD cA° CD cóP OS dP co os <#> ui rd dP OS dP CM «v> uu •rt1 CM oM> 31 -cr CD «v> rd <N> eu rd <#> eu oV> eu <A» rd <N> CM 1 τη oV> CM CM cA5 eu oV> rd
<N> c/P dP dP dP <N> <#> <#> dP <& <A» tffi «V» <*> dP <#> dP <#> tffi «A*»
eu eu O o τη Γ- Γ- CD co CD n CD OS CD CM CM τη uu Os rd τη eu
os r- OS r· 00 O os rd n CM CM CD n rd 00 ’Φ uu OO Γ- τη os CM UU OO rd
rd
<#> dP «M> «V» <N> dP <#> <& <A» <#> tffi <A» <A» <fP <#> oV· <A» dP <#> tffi «V>
Γ- eu rd uU CM CM CM CM συ rd UU CD rd UU r· OS CD τη uu rd rd Os CM
4fi «¥> <ffi <Λ» 4P «v> <N> <ή» <ffi «IP «v>
rd rd rd O UU τη n ο Έί1 ΓΜ TJ1 n UU CD o eu Γ- rd rd CD CM CD uu
OS r- CO r- CO OS τη rd n CM CM CD n rd CO τη CD oo Γ- τη O eu UU CO rd
rd
EH EH H EH EH EH EH H EH Eh EH EH Eh H EH EH EH EH Eh EH EH EH EH Eh EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
H H H fcH H H H fcH H H H H H fcH fcH H H H H fcH H H fcH H H H
< 0 0 35 tu 0 0 D 0 tu 3> 3> 0 Q < 0 0 0 0 0
3 □ □ tf □ «í tf 0 tf 0 0 □ tf 0 3 tf 3> 0 ü 0 0 ii 0 0 0
2 □ < 3 □ tf 0 tf □ 3 0 t ) □ (J 0 0 t) 0 □ < 0 0 0 0 □
0 u 3 0 tu 3 O 0 tu tu ii 0 3> 3> 3i 0 0 tf 0 0 0 0 < 0
tf tu 0 •tf (J □ 3 t > □ □ 0 0 3> 0 ( J 0 t) 0 tf ? tf 3 < )
tn 0 t) 0 0 3) 0 o «s 3) tf 0 0 □ < tf 3» 3 0 □ i) <* 3 0 0
□ 0 i! () tf < tu o () 3 D 0 0 3> 3> tf 0 t ) tf 3> 3· t t ( ) 0 0
o □ 0 < tu 3 0 0 o <* □ 33 tu (U tu < < t) 0 (U 0 tu 0 0 3)
0 < 0 υ η o «í tf tf 0 0 0 3 t) 0 tu 0 0 0 3>
□ 3 rJ tf ii tu tf 0 3 0 3 tu υ 0 () 3· 0 t) □ 0 3> tf 0 tf ii tf
0 •tf 0 i t > o < o □ Q 0 Q (U < < 0 () t) □ o 0 tf
tl tf tu 0 tu t) t) 3 tf 3 tf □ □ 0 □ 0 o 3 u tf ( ) 0 0 () 0
0 0 0 o 0 <3 0 0 tf 0 0 0 0 0 0 3j 3 0 □ D 0
0 0 3> 0 tu 0 0 (J 3 tf 0 3> tf (J 0 3» 0 tf tu 0 0 0 0 tf tf
tu < () f) < < (U tf □ tu 0 < 0 tu □ < 0 () O 0 □ 3· < < tu tu
0 0 0 0 t) 0 < o 0 0 3· 0 3» 0 3» 0 0 q 0 3 0 0 «<
tf tf tu 0 □ 0 3 & 0 0 t1) tf 0 ii 0 0 tf tf 0 3 0 tu 0 □ 3
tu 0 tu 0 < 0 0 <) < t) < tu (') 0 □ < 3 tf O < í < < O 0 □
0 0 0 □ o 0 0 o 0 0 < o 0 0 0 3 0 0 0 3 0 3 0 0 0
τη CO co O CM τη co co o ΓΜ CD CO o CM CD oo o CM τη CD OO O CM τη
τη τη τη LQ UU uu n n CD CD CD CD CD Γ- r- r-- r· Γ- oo CO oo CO OO os OS os
EH EH EH H EH EH EH EH H EH EH EH EH EH H EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH H
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Fh H H H H H H H H Fh fcH H H H H H H H H fcH H H fcH H H H
0 0 tu tu tu 0 ü tu 0 3 t) 0 0 ü 0 t) 0 3 < 0 3 0 (J ü
(J 0 0 3 3 o tu 0 3 0 3 U o 0 tf 3 < 3 0 3 3 3 tf 0 tf
3 3 l) 0 < 0 <J O t) i) 3 0 0 0 t) 3 3 3 D 3 t) 0 t) ü
t) 0 0 Q tu 0 3 t) y o <É t) 0 3 < t) y tu y < 0 t) 3
t) 3 tu tu 3 3 O 3 tf ÍJ tj 3 O (J < 3 o 0 0 (J < tf 3 3 (J U
ü 0 0 t) t) t) 3 !*) t) 3 0 3 0 U tf t) 3 u tu 0 0 3 3
tu 0 ii tf U O O 0 3 3 0 0 3 3 3 0 3 (J tf tf (J tf tf 0 U 0
0 3 u o u tu tu < 3 < 3 < 0 < O < < (U 3 tu tu tu (U 0 <
3 U 3 0 3 0 tu 3 3 3 ü t) tf u 0 u O 3 3 Q 0 0 Q 3
tf tf (J 3 o 0 3 0 0 0 tf 0 0 0 0 tf 0 0 tf 0 tf 3 3 3 0 3
tu 3 3 t) 3 tu < < 3 3 3 < 3 tu t) () < tu tu 3 t) tu tu (U 3 <
O < tu 3 <J 3 3 3 O 3 3 < 0 0 u 3 3 0 0 0 O (J 0 0 tf
tu (1 0 3 3 Q tu t) t) Q 3 O 0 3 0 3 (J tu
u 0 3 0 0 O •tf 3 O 3 tf 3 0 3 < 3 3 tf tf 3 < 0 3 tf 0 o
3 0 O 3 0 ·£ 0 0 < < tu 3 O <* o 0 3 tu 3 0 0 3 3 3 < !')
U 0 < Q u tf 3 O 0 u Q u Q tf < ü Q 3 0 tu O 3 tu 3
tf tf < 3 O 3 tf tf tu 0 < 0 ii 3 0 0 3 tf 3 O U O 0 tf
3 tf < 3 3 3 < 3 O 3 (') 0 < 3 i'i u 3 < O 0 O 0 0 0 0 0
3 0 0 < υ 3 3 3 ü U < u 0 < < 3 ü 0 u 3 u 0 3 ü υ ü
eu uu P* os rd eu uu r· Os rd eu uu Γ- os rd eu uu Γ* Os rd eu uu Os rd eu
τη τη τη τη UU n uu n n CD CD CD CD CD r· Γ- Γ- Γ- 00 oo CO OO OO OS os
CO r- co os O rd CM CO n CD r- CO OS O rd CM eu τη uu CD r- oo os O rd
O o o o rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM eu eu
eu eu eu eu Π eu eu CO n eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu eu
co co oo co 00 CO CO oo co oo co OO CO OO co 00 00 oo oo 00 oo 00 oo oo oo co
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 119/176
115/161
r-1 <& CO r-1 <N> CO <N> <A* CO r·1 <Λ> CO UD <Λ> CO oV> LO <AP CM oV> CO <AP 'tf’ oV> LO <AP CO «v> CO oV> 'tf* oV> kO oV> CM «v> CO oV> 'tf* <N> 'tf’ oV> MD <N> A oV> CM
<H> <#> <H> «V> «v> <M> <N> <N> oV> «V» oV> «V» oV> «V» <x> <#> <H> <#> <#> «V> <H>
O CM A A r-1 MD OS CM CM Γ' CO rd r- Γ' MD lo O 'tf’ CM os CM O CO CO MD
r-1 CO r· Os r· r· Os r· CO Έ ϊ-d cr 'tf* LO CM A LO cr OO LO O Έ A A
A
<#> oV> <*> <*> <#> <#> <H> «AP «A® <#> tH> <H> tH> tffi oV> tffi oV> tffi tffi tH>
r-i kO CO LQ CO LO kO 'Φ CM rd CO CM CO A A CM oo A Γ- *tf* A CO CO
A
<A° <*> <*> <*> <*> <K> <*> <ffi <AP <AP
O co MD CM 10 kO 'tf* 10 lO r· O m OS m OS OO OS MD OS OO A Os ÍO
r-1 00 lO 'tf’ MJ 'tf’ r- CO CO CO MJ rd 'tf’ m MD CM A MJ LO OO MJ LO O 'tf* A A
A
A EH A EH A EH A EH H EH EH EH EH EH A A A A A A A A A A A A
rn tf) rn rn rn rn rn rn rn ω m ω m ω m rn m (fl tf) rn rn rn rn rn rn rn
H H H H H A H H H fcH fcH H fcH H H H A A H H H A H A H A
0 0 0 0 0 < 0 0 < 3 0 Q < r) Q < □ 0
□ (9 0 (J 0 3 < < 0 0 0 < 0 < < 0 ii < ii u 0 tJ 3 □
□ (9 (9 () ( ) 3 o 3 < (9 (9 0 (9 < 0 (9 0 0 19 □ < () (9 tf 0 0
□ (9 0 C) < <ΐ 0 3 0 «í C) 0 (9 ü Q 0 3 Q 3 0 << tf 0 r)
0 ( ) () < 3 ii 0 3 0 3 0 0 (> 0 ( 1 0 0 0 0 0 □ 3 0 u
0 y 3 p y tf «í 0 0 3 3 p < y < (9 0 y p < y 0 tf D
0 0 < 3» < < 3 0 u 0 (J 3 < 3 < 3 3 (J < 0 υ 0 (J tf 0
(9 < 3 < O 0 (9 3 3 3 0 0 3 0 3 0 tf tf 3 (9 3· ÍD 0 tf 3·
3 p 0 y 0 < (9 3 < Q 0 y 0 3 tf tf 0 «í < p Q 0 y
ÍD < 0 < 3 0 0 0 0 < 0 < 0 0 3 0 <2 3 D 0 IJ < (/ <
o 9 (9 3 p () () () O Q 3 (9 tf 3 Q 1^ 9 ( ) 3
3 ii () 0 0 0 0 < < 0 3 0 0 0 3 tf < ii 0 3 0 0 O 0
0 Γ ) 0 3 0 0 o 0 tf r) < 3 0 tf ü < 0 0 Γ ) tf 0
0 3 0 (J 3 (/ 3 0 3 3 0 0 0 0 < 0 D < (/ tf □
tf 0 0 (9 0 0 < (9 0 (9 3 (9 < < < 3 tf 3 < < 0 0 0 tf 0 0
tf 0 p 0 0 3 0 0 Q 0 y 0 U 3 < tf 9 9 Q y 0 tf D
c5 3» 0 (, ( > ( 1 (> 0 0 3 0 o 0 3 < 3 0 li 0 0 0 0 0 3 ( )
3» 0 0 0 0 U 0 < < 3 (9 0 3 3 3 3 0 D 0 D D 0 0 0
o 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 < 0 0 3 0 3 0 O D □ 0 0
MD CO o CM 'tf* MD CO o CM 'tf’ MD CO O CM 'tf’ MD OO O CM tf* MD OO o CM 'tf’ MD
OS os CO CO CO CO CO r-) í-1 r-i rd rd CM CM CM CM CM CO CO CO ÍO CO Έ Έ
rd A rd r-1 r-1 r-1 r-1 r-1 rd rd rd rd A A A A A A A A A A A A
A Eh Eh Eh A EH A EH EH EH EH EH EH A A A A A A A A A A A A A
rn rn rn W rn rn rn W tn ω rn ω rn ω rn tn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn
A A Fh Fh Fh Eh Fh Fh Fh Fh FH EH A A A A A A A A A A A A A A
< 0 0 0 «i O O O 0 0 3 0 Q Q < 3 O 0 < 9 0 3 3
3 O 0 0 ii 0 O 3 3 u 0 < < < 3 U 3 < ti 3 0 0 O O
u < O 0 0 0 0 O O <i 0 0 0 3 3 < 0 ü O 0 o 0 3 υ 0
3 9 < 0 0 < 0 O O 0 0 3 0 0 < 3 3 3 0 0 9 0 O 3 3 <
3 0 o O 0 o 3 O o O tf O 3 3 3 3 < 3 3 0 0 O 3 0 u
3 3 (9 < o 0 í 0 O < 0 O O 3 O 3 0 3 Q 3 < 3
O (9 3 ii < 0 0 0 ü 3 0 3 3 3 < (1 3 0 3 3 7) O 0 3 0 3
< 0 0 0 o (9 O 3 3 3 l) (9 O υ 3 3 0 D 0 ü l) < υ
3 3 19 3 19 Ü < «í 0 0 0 0 (9 0 < o 3 3 9 3 3 3 0 0 <
< tf 3 0 3 < υ 0 0 0 3 O 3 0 ii < 0 3 < U 0 3 3 0 3
3 tf < 0 0 0 3 0 3 3 0 u 3 0 < 3 3 0 3 3 O O 0
0 3 3 3 0 0 O < < 0 0 O < 0 3 3 3 < O < 3 O 3 <
0 0 3 < 3 3 o 19 0 < 3 3 0 3 3 9 0 9 Q 3 0
3 0 0 3 < 0 3 3 O U s. < < 3 0 3 i) U 0 O < 3 0 0 3 <
O 0 (9 3 3 0 3 O < u 0 0 (9 o (9 0 O o O 0 < 0 L) 3 0
tf O 0 0 3 3 <3 < o 3 0 D O 0 o O < υ l) 9 < 9 3 3 9 0
tf O O 0 0 < 0 3 3 O O O O 3 (J O 0 0 o < 3 0 O 3 0 U
tf ü r> (9 0 3 3 3 0 0 υ 3 0 3 3 υ 0 3 0 0 l) 0 3 3
0 0 υ υ 0 3 ü 0 3 3 3 3 ü υ 3 3 3 3 0 υ 3 3 3 υ 3
A CO 10 (*- OS vI CO ui r· os rd ÍO ιΟ Os A CO LO Γ- OS A ÍO LO
lO r- OS o O o O O í—1 r-1 rd rd rd CM CM CM CM CM CO CO CO CO CO 'tf* 'tf*
OS OS OS A r-1 A r-1 A r-1 rd rd rd rd rd A A A A A A A A A A A A
CM CO 'tf’ LO MD r- CO OS O rd CM CO 'tf’ UD MD r- CO Os O A CM CO 'tf* LO MD Γ-
co CO CO CO CO CO CO CO 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf* 'tf’ 'tf* 'tf’ 'tf* LO LO LO LO LO LO LO LO
co CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO OO OO CO OO CO oo CO OO CO OO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 120/176
116/161
1 <ό® Γ- o rd <ó® oo M0 <N> CM r- rd d© os <A© MO 10% | rd os rd MO rd <N> τρ uo <N> CO 1 %2 <N> MJ oo rd rd 1%ε 1%z 1 1%ε co MJ
<Λ» <Ν> «V» <H> ςΛ© <Λ© <Λ© <N> <H> <N> <Λ» «V» <H> <Ν> <Λ» <#> <Λ» <N> <N> <N>
rd MJ CM U0 CO r- O O CO CO Cf* rd rd MO CM UO Μ0 OS O MJ O MJ Os CO
Γ- μο o CO rd rd rd o r- CM rd rd Γ- CM CM CM Γ- CM MO CM CO UO CM rd CO CM
rd rd rd rd rd rd rd
<ό® <ó® <ffi <N> <λ© <N> <N> <Η> <N> <tP
os os CM lQ CM CO OS CO CM M0 CM r- CO rd CM rd CM rd *5* MO UO m CM rd CM rd
rd rd
οΆ <Λ» «V» <Λ» <A© <Λ© <A© <Λ© <A© <H> oV> <N> οΆ <Λ» «V» <Λ» <Ν> <Λ» <N> <N> <H> oV> <N>
CO Γ' CM CO os Γ- cfi O M0 UO CM CO MO r- M0 CM rd Γ- UO O r- CO MJ CM CO CO
r- uo O CO rd rd O Cf* •cf* CO rd MJ CO rd rd rd 3* rd ^f* MJ UO 3* rd rd co rd
rd rd rd rd
EH ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH
to ω ω ω CO to CO CO CO to CO CO CO CO CO CO CO C0 to CO CO CO to CO CO CO
fcH Η H H H fcH H H fcH fcH H fcH H fcH H H H Η fcH H fcH H H H H H
□ 0 u < Ω () 0 Ω Ω Q □ ω □ .3* Q 0 U Q U 0 0
í 1 < <! 0 0 0 Ω 0 0 < () í 1 tf u 0 Ω < <2 0 0 Ω <
0 5! f) tf □ 0 «4* 0 □ u to t) < 0 <2 □ 0 0 t) 3 0 < tf □ 3
□ υ O tf o tf tf C) < 0 U 3 t) to u < 0 0 Γ) y tf tf 0 0
u 0 <2 tf 3 Ω 0 < O (0 tf □ □ < < < o to tf tf 0 0
Ω Ω tf 3 tf tf 0 < 0 o 3» tf tf 0 Ω 3 y ί) Q «a* tf 0 Ω
to ί) <2 Ω tj 3 < i! < o 3> t3 ίί 0 Ω t J t ) 3 () 0 tf 0 () 0 (J
0 0 3 0 0 0 0 0 3 0 0 0 Ω O 0 0 Ω < 0 < tf 0 0 Ω Ω
0 U □ < f) 0 □ 0 0 y í) 0 () □ D 0 y Ω y tf t) Ω □ 0
0 0 < (1 0 0 0 0 Ω Ω < Ω υ □ 0 Ω 0 Ω 0 0 Ω <J 0 Ω
0 ο < y 0 < C) 0 u tf Ω 0 □ O 0 O «< Ω < (3* O t) Ω <
< < to <0 □ < to to 0 í J < í J Ω 0 0 0 < tf u Ω () 0 3
tf 0 y Γ) < 0 < 0 () to t) t) to tf < < ί1) to tf Ω y < t)
ο 10 () ί) □ (1 () □ < υ to o □ tf tf 3 ί! Ω () tf (J < 3 <
u Γ) t) 0 t) Ω () u o to 3> u Ω □ tf to < to < Γ) to Ω 3 to □ 0
ω Γ) y 0 0 Ω 0 ω Ω η 0 ii tf 3 3 Q 0 y 0 Ω
o () 0 < ( > 0 0 υ 0 () < 3» 0 < 3» ίί 0 0 0 < <2 Ω
0 < 0 1) < < 0 Ω Ω υ 0 3 0 tf 0 3 0 CJ < Ω 3 <2 0 Ω 0
< 0 < u u 3 < 0 □ < 0 0 < < □ O Ω υ U 0 0 Ω U Ω
CO Ο CM 'Cf* MO CO O ΓΜ M0 CO O CM 3* MO CO o CM MJ co O CM cf* MJ co
uo uo U0 U0 U0 MJ MJ MO MJ MJ r- Γ- Γ- Γ- r- co CO co CO co os O> os OS os
rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd
Eh ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH
Í0 rn ífl ΪΙΊ ífl to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to
Eh ΕΗ EH Fh FH EH EH EH EH EH EH EH Eh EH Eh EH Eh ΕΗ EH FH FH EH EH Eh FH Eh
3 1) 3 0 0 3 y < 3 t) y 3 3 3 <ί 3 0 y ί)
(J 3 <J o 3 3 (J < < 0 0 < O 3 0 < υ 0 3 3 < < 3 ü ü
υ 0 0 3 0 0 0 0 0 3 0 3 < 3 υ 3 0 υ 0 ί1) 3 3 3 3! 3
>< 0 0 t) y y 3 < t) < < υ y 3 <) tf 3 < y 0 y 3 y <
3 0 0 o 0 tf 0 0 U υ 0 3 (J 3 Ο 3 to u < ÍJ < υ
3 <: y 0 0 tf 0 0 «ΐ 3 to t) tf tf 3 3 < (0 < 0 3 3 < 3
3 0 0 to 3 Q 3 O 0 O υ o 0 0 O 3 3 3 is υ 3 < 0 3 to O
3 3 3 o () 3 < 3 t) O υ 0 3 to 3 υ υ O 3 3 to < (0 u <
0 1) 3 0 y 3 0 o 0 y 3 t> tf y 3 3 3 0 3 3
3 υ 0 3 0 i> 0 O (J < 3 < 3 0 ίί < ί! tf Íl υ < 0 0 <
y 0 3 0 o y 3 o Q ii 1) y 0 tf y 0 tf 0 3 y
0 0 < 0 0 υ υ 0 3 0 (1 0 0 ίί 3 0 3 3 0 0
y 0 3 0 3 0 3 Q < t) 0 ii tf tf 3 Q o 3 t) 0 t) 0
< 3 < 3 3 U 3 (J 0 < 3 3 3 0 3 0 0 () 3 3 υ 3
0 0 3 3 3 3 < < 0 3 to 3 t) 3 < 5! 3 < 3 3 0 t) 3 3 t) t)
to y 3 y 3 3 0 3 t) < 3 to y ί1) 3 y y ί1) to 3 3 y y
ίί 3 (0 3 O 3 O < 0 υ 0 3 tJ 3 < ο Ο 0 < O 3 3 3 <
0 3 0 υ υ 0 0 !) 3 < 0 0 3 0 ί) < 3 3 3 ί) ί) 3 3
υ 3 0 3 < 0 υ < < υ 0 < 3 3 υ υ 3 0 3 υ 0 υ (J υ
Γ- OS rd CO U0 r- OS rd CO UO Γ- os rd CO UO r· os rd CO uo r- OS rd CO UO Γ-
3* 'Cf* U0 U0 u0 UO U0 MO MJ M0 M0 MO r- r- Γ r- r· CO CO OO co co OS os os os
rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd
00 OS O rd CM CO cf* UO M0 Γ- CO OS O rd CM CO ^ί* LO MO r- oo OS CO rd CM CO
uo LQ MJ M0 M0 M0 M0 MO M0 M0 M0 M0 r- r· r- r· Γ- Γ- r- Γ- r- Γ- OO CO OO oo
co C0 co CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO co co co co co co CO co CO co CO co CO
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO co co co co co CO co CO co CO co CO
Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 121/176
117/161
<Λ° 07 <a° rd rd «v> CO «v> τη r-1 U7 dfi os <Λ° rd rd <a° τη «v> «v> □7 rd oV> 07 rd rd <A° rd rd oV> OS <N> OS 1%f,T r- rd <N> rd <*» o rd 07 rd <N> CD oM> rd CM CM
«v> «v> <H>
CO τη o r-1 o CO CM CM U7 rd CM U7 OS CM U7 Os 07 O CM os OO
rd kO Γ- CO τη 93 τη rd CM OS CO 93 rd CM OO OS OO rd O os OO OO 07 CM
rd
<*> <N> <N> «V» cV> <#> <N> o¥> <H> <H> oV> o¥> «Λ> <#> <H> <H> <#> <#>
rd CO r* r-1 07 CM CM rd rd 07 LO rd rd 0- CM OS CM CO OO rd 07 LO CM 07 rd rd
ç-1
<Λ> <A> dfi o¥> <#> «V» o*> o*> <#> o*> dfi <#>
τ—1 CO lO O lO 07 07 93 O* o* T U7 rd O CM 07 LO LO rd 07 rd CO LO CD
ç—I τη Lf) τη τη τη 07 rd rd MJ OS U7 rd Os CM Os 07 Os CO rd r- CO 9J CM rd
EH EH EH Eh EH Eh Eh EH EH Eh EH EH EH EH Eh EH Eh EH EH EH EH Eh Eh Eh Eh EH
tn tn tn tn tn tn tn tn OT ω tn tn ω (f) (f) Cfl tf) tf) tíl tf) tn tn tn tn tn tn
H fcH H H fcH fcH H H H fcH fcH H fcH fcH H H fcH fcH H fcH H H fcH fcH fcH fcH
0 P t) 0 □ P 0 0 0 P Q P 0 f) P 0 •^ 0 0 P P tf
tf p í) < J (9 tf tf 0 (S <) 0 3 P P <) P 0 ( I «tf P P ti P 0
ü □ 0 «tf 0 u 0 3 P < u P 0 0 P «5* 0 < 0 «tf 0 tn < 0 <
<£ <3 «tf tf < P 2 Q P Q 0 P •tf Q 3 0 tf P 0 y P t) tn
0 tf «tf 3 0 tf P 3 0 tf 0 0 u tf 0 0 0 f ) 0 0 u 0 tf P P P
() y tf p < 0 0 P P 3 u P «rf (9 0 Q 0 < <í 3 0 P 0
□ 0 □ 0 0 ( J P 0 tf ( ) 0 0 u 0 «J U P 0 0 u 3 0 tf P () P
0 < P «tf < 0 0 P 3 (9 < < P < «I^J P < 0 P P 0 tf < P 0 0
y 0 «tf 3 0 ·=£ «s 0 0 3 0 y 0 3 P 3 P () «tf 0 u P 0
<9 < o 0 0 0 0 U 0 0 < 0 0 0 < 0 P tf tf P P < 0
3 «tf 0 tf < tf P P < 0 0 < 0 0 u tn t) 0 0 υ y
0 0 □ t I 0 0 0 0 tf < 0 3 0 u 0 0 0 P () < P P < P < 0
0 tf 0 Q □ 0 y 0 0 (9 < P 0 y «< 3 y P y 0
o tf ( ) 0 0 (J tf P tf 0 tf () tf P tf 0 0 0 0 0 0 P 0 0
P tf u 0 tf «tf α < 0 u 0 o 0 < 0 0 tf < < < < P P
0 0 0 < 0 o tf o 0 0 < P í) P 3 «< < o tf 3 y y (1 0 P
P □ 0 ti 0 2 0 P tf 0 t) u P tf P 0 0 t) (1 0 0 tf 0 0 () P
u P < 0 0 0 t) 3 < 0 P 0 0 P < 0 0 P 0 3 < P t) 0
P < υ 0 ü 2 0 < 0 υ P u < 0 0 υ P < υ 0 0 0 0 0 <
o CM τη LO CO o CM τη LD CO o CM kD CO o CM 93 OO O CM kO OO O
o O ο O o rd rd rd rd rd CM CM CM CM CM 07 07 07 07 07 LO
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
Eh Eh Eh Eh EH Eh Eh Eh EH EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH
rn ?n ffl tn ífl ífl tn m ffl ffl ffl ífl ífl ífl ífl ffl ffl ífl ífl ífl ffl ífl ífl tn ίΠ ín
Eh EH H H Fh Eh FH EH Fh Fh Eh Fh Eh H H FH Eh EH Fh Fh H Fh Eh FH Fh EH
«< 3 0 ü 0 < U 3 ü (9 < 0 3 y 0 (9 3 0 0 t) U 3 0 y 3
0 < 3 0 3 ti U (0 < 3 0 < 0 0 3 0 0 3 < U < 3 < 0 D
< < 0 0 0 < 0 < 3 0 0 0 < 3 «tf 0 0 0 0 0 0 3 t) 0 0 tf
0 y 3 0 0 3 0 (9 0 3 0 y «tf < 3 3 0 3 (9 tn tn tf
< 3 0 U 3 3 3 0 3 3 U 0 u 0 (J 3 U U 3 3 3 3 3 3 < tf
0 3 0 0 U 0 3 3 3 < 3 O 3 3 «< 3 0 O y y 0 t) tf y O
O 3 0 0 tf 0 0 U U υ 0 t) 3 tf 3 0 0 3 o tf 0 <1 <J «tf 0 o
0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 0 υ 0 0 0 0 0 3 < tf 3 tf 3 t)
3 < 3 y 3 3 3 3 3 < 3 3 0 0 y 3 t) t) 0 tn y 0 tn tn
0 3 0 3 0 U U 3 0 0 O 0 3 ii 0 0 3 υ tf 3 3 tf tf 3 0
0 y 3 0 3 3 ü 0 < 0 0 < < 3 3 3 ti tn <£ y
0 3 3 3 (I 0 tf tf 0 3 3 tf 3 3 tf 3 ti tf tf 0 3 3 0 0
<£ y tf y 0 0 0 3 0 y 0 3 0 <í t> t) Q 0 3 «tf tf
0 0 3 < 3 0 0 tf tf 0 0 tf 0 3 D 0 0 u 0 3 3 tf tj 0
0 3 3 3 0 3 «tf < 0 3 0 u 0 3 0 υ 0 0 (9 υ 0 0 3 tf <!
3 O 3 3 3 tf tf 3 y t) «í y o y 3 y y 3 tn tn «tf tn t)
0 «tf 0 3 0 0 0 tf tf 3 0 tf 0 0 3 0 3 0 3 0 (J 3 3 3
3 «tf 0 3 0 u 3 3 υ 0 0 0 < 0 < υ (9 3 < < 0 < 3 υ
υ 0 υ < < υ υ 0 3 < υ 3 0 0 < 3 υ 3 0 0 3 < < 3
os rd 07 U7 Γ- Os rd 07 U7 os rd 07 LO os rd 07 U7 Γ- os rd 07 LO Γ- Os
os o O O o O rd rd rd rd rd CM CM CM CM CM 07 07 07 07 07 ’φ τη
rd CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
τη U7 <43 CO OS O rd CM 07 U7 93 Γ- CO Os O rd CM 07 U7 93 r- CO OS
CO CO CO CO CO CO Os OS OS Os os os OS Os Os Os O O O O O O O o o O
07 07 07 07 07 07 07 07 07 07 07 07 07 07 07 07 ^r -'Φ ^r T τη
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO OO CO CO CO CO OO OO OO CO CO CO CO OO OO CO CO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 122/176
118/161
CM <N> A <N> OS <#> lp <#> <#> CM <N> A A oV> OS A <*> A eV> Γ- A <#> MD <N> <#> r- <N> CM A <N> A eV> A <N> CO <N> OS A 1 %^τ <N> MJ CM <#> r· CM Γ- oV> r- oV> OS
tffi cffi <H> <H> <N> oV> <tfi «A» <Λ> tffi oV> cffi <H> <ffi <#>
ip Γ- rd o Γ- iP CO ΓΜ MD CO MD A CO OS MJ Γ- O τρ MD MD CM cn iP iP CM
CO MD ''tf1 Os MJ Οϊ CM MJ CO O CM Oh CO r- MJ O CO CO LP CO Οϊ iP O CTS O
A A A A
<N> «tfi «s¥> <Λ® <A® «V* φ\° <ffi «V> dfi <A® «tfi <ffi dfi «V* dfi 4P
A CM CM A CM MD A A CM iP A O CO A CO MD CM MD r· A OS (Ό A CM CP OO
A A A A A CM CM CM A
tffi <H> dfi «v> <A> oV» «íP <*> oV> dfi dfi <H> dfi
A r- O CO lP MJ CO A OS iP MD CM O LP O CM LP iP A OO A os MJ OS
CM lP CO Γ- MJ OS CM ip os O CM OS CO OO OS CO =r MJ OS A OS A O o O
A A A A A A
A EH EH A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
tn tn rn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
A EH A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
□ < < 0 (0 3) 0 3> 0 □ < 2 (0 to (0 □ to 0 0 0 0 0 □ < o
□ 3 3 ( J O 0 0 < 0 3» 3 ( ) tf D 0 Π D to to □ t J < O □ 3 t)
□ 0 () < < < □ 3 3« to 0 0 tf < □ □ < < 0 0 0 2 tf (0 <
(0 0 0 y O to 0 0 0 < «< tf 0 0 D 0 3 < < 3 0 < tf 0
□ 0 3) < 3) 3» 0 0 < 3 0 0 < < 0 < 0 3 3 0 < < □ 0 o
(0 u 0 y < to tf ('( t) 0 0 «í 0 y y □ y η (0 0 0 3 3 0 «£ <
< 3> < 3 U tf 0 0 3> 31 0 0 0 0 0 to < □ < 0 0 0 < 0
□ 0 0 3 O □ tf (') □ 0 0 □ □ □ □ < 0 < 3 to to < (0 □ 0
0 0 < 3> < O y 11 3» 0 0 u t) to 0 0 0 to 0
0 0 3 <! t J 3 □ to 3· □ 3 3 3 0 0 to 0 < to <! 0 < 0 t)
D 0 < to 0 0 0 0 3> Q to 3J 3> to □ 0 tf 0 0 0 D tf 0
□ < 3 □ O 0 □ 0 □ 0 < □ < < □ □ 0 < 0 to 0 O 0 0
t) 0 □ 0 O 0 3> 0 3> y 3> y to 0 □ 3 < < □ 0 < 0 tf
0 □ 0 < < 0 0 3 < 3> 0 to < 3> □ 0 3 < 3 < to 0 < 3 □ 0
t J 0 3) to O < 0 O 0 ef < 0 3 ÍD □ t J (tf 0 < 0 < □ 3 to 0 0
< □ 0 to □ to □ tf t) □ 0 <c 0 tf 0 0 0 3 0 0 0 0 2
0 0 < 0 t J □ 2 2 0 < 0 < 0 3 < 0 0 0 □ 0 < 0 □ □ 0
0 □ < {) 0 0 to 0 0 < t) 0 0 t) 3 0 to 0 to □ 3 O to to <
□ U u 0 0 < < O ÍD υ u 0 0 0 0 0 < 0 0 < < 0 0 0 0 3
CM md CO o ΓΜ MD CO o CM MD oo O CM MD oo o CM MD oo O CM
ip iP m iP MD <0 MD MD LO r· Γ- r- r· CO OO OO CO oo os OS os OS os o O
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CP CP
Eh Eh A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
tn rn rn tn rn tn rn tn tn rn tn tn rn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn rn tn
EH A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
< 0 (0 y y 3 3 <£ < to (0 y Q t) y t) 3 (0 y 3 3 0 t) t) O
< 3 0 0 to O 3 3 3 3 to 0 t) to < O O to O < < < 0 O 3
< 0 υ 3 o to tf < ü 3 0 3 υ 0 3 to 0 0 < t) 3 t) < < ü
3 3 t) 3 O tf y tf 3 0 y 3 3 0 3 0 o 0 < y 0 0 0
0 IJ < U o 3 0 < 0 3 3 3 < tf tf 0 3 0 3 0 3 < 3 (J 0 0
0 < Ü 3 3 O 0 o 3 < y y 3 tf tf 0 0 3 < 3 y 0 3 3 < 0
0 ü •í (J o O í 3 to 3; 0 < 0 0 0 < 3 < 3 3 < o O 3 0 3
tf □ < < < t) < 0 O 3 3 3 «tf 3! 0 3 0 O t) 3 < U u 3
tf 0 3 {) 0 0 y O tf y 3 y «< 0 «tf t) O 3 to o 3 0 3 y
<J < 3 0 0 < t) 0 0 0 tJ 0 (J 0 3 3 (J 3 U 3 ü 3 to
y Q 3 3 < 3 0 o t) 1? 3 3 3 y y < 0 3 t) y 3 to O 3 y o
0 0 < < < 3 3 O tf 0 O < < < 3 O 3 < U 0 3 (J < Ü
tf 3 < 3 0 to 3 (0 Q tf O y y y y y 3 3 (0 y y 3 0 <
0 to 3 0 3 (J 3 O 0 0 0 3 to 0 0 < 0 < 3 to t) < < (J 3 3
< O < 3 < < O O 3 < 0 (J 0 3 3 t) 3 υ < 0 t) 3 < U 0
υ O 0 (0 to t) 0 0 0 3 3 3 3 t) y «tf t) < 3 3 0 3 3 3 0
0 0 3 3 3 < < < t) O to 3 3 < tf 3 U 0 3 0 < 3 O 3
«2 < < (0 < υ 0 3 to < 0 to 3 < to tf < O ÍJ < to 3 3 < < 0
3 3 0 0 < 0 < 0 < 3 < O (J u “· (J u 0 0 0 0 0 < 3 <
ç—I CO lp r· os A CO LP Γ- os A CO LP Γ- os A CO iP r· OS A cn LP os A
lP iP lp lp lp MD MD MD MD MD Γ- r- r· Γ- OO 00 CO OO 00 OS os OS os os O
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CP
O A CM CO ’φ iP MD Γ- OO OS O A CM CO iP MD r- OO os O A CM CP LP
A A A A A A A A A A CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM cn cn CP CP CP CP
çf
CO CO CO CO CO CO CO oo CO OO OO CO OO OO CO OO OO CO OO 00 OO OO OO OO oo OO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 123/176
119/161
r-1 JP 00 JP CM JP CM JP o JP r-1 JP r-1 JP <-1 JP rH JP <-1 JP cH JP rd JP lO JP JP JP CM JP rd JP CM JP O JP CO JP CO rd JP Γ- JP rd CM JP CM JP 00 JP CM
«k© JP JP JP JP JP «k© JP JP οΆ JP JP JP JP JP «Λ© JP οΆ JP JP JP JP JP ©Ά ςΛ© JP
r- Os O o o MD CM CO CO CO CO Os CM o r* CM CO Qs CM r- -Cp 00 CO U0 rd
o MD 00 r-1 rd c1 CM CM rH cd r- rd rd CO U0 l> oo rd rd CM rd
r-1 rd
ok© JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP <*> JP JP JP JP JP JP <A© JP
CO τ MD CM CM CO 00 ^r CM τ—1 CM CM rd rd CM rd uo rd 0- U0 rd CM U0 rd
rd rd rd rd CM CM
ok© JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP JP
os τρ τ—1 rd m 00 CM Lü OS CM rd CM OS rd CO ^p CM O O CM KD UO •^p CO CM
o CO cp rd r-1 CM CO 00 ϊ—i τ—1 CM rd os MD OS rd rd ττ rd MD CO 00 o CM 00 rd
rd rd
ÉH Eh Eh EH EH ÉH Eh EH EH EH EH EH EH ÉH EH EH EH EH EH Eh EH EH ÉH ÉH EH
(0 to to to 10 to to to to W to to 10 to (0 (0 to to to to to to to (0 to to
H fcH H fcH H H H H H H H H fcH H H H H H fcH fcH fcH H H H H fcH
( ) S 0 p < y y Q Q y 0 y D 0 <2 y y y ίο y < 0 0 p
t1 () 0 < ti 0 0 0 0 0 () 0 íd () < 0 0 0 ri Π 3 0 3 Í0 Í0 <
0 0 0 0 0 0 0 0 0 □ 0 0 0 < 0 < 0 0 0 0 □ < O Í0 < □
0 0 ti 0 < 0 0 D □ 0 □ 0 ίο p ^2 r> p < t) p 0 y y p y
□ 0 0 < O t J <J D D ii □ D O O 0 0 D < 0 0 0 {) <« 0 0 <
p y < p d li < :=> r) i p < 0 r) r) < p < < 0 0 r >
o < D < 0 •i □ :=> () 0 •í () ri ΰ ίο 0 0 3 3 ÍO 0 ri ()
li □ 0 t) •i () < 0 0 t) □ 0 tl < t) ÍO 0 Í0 0 <
i y •d y 0 p 0 < i y p 0 < 0 0 < 0 0 y 0 y 0 < «d y
0 0 ti 0 u < 0 o 0 0 0 < □ ri 0 u ri <J O < 0 < □ □ 0 <
□ 0 0 t ) o 0 < D 0 0 <£ 0 o 0 <2 «c u «í o y y tl 0 •d 0
< -d d O 0 < ri □ 0 < 0 < < □ 0 < 0 0 0 0 o ri < 0 0
0 f i y 0 ío p y 0 ίζ> y «í 0 < 0 <2 y p y y 0 y r) 0 ÍO
3 () 0 O u < 0 D D 0 0 □ ίο ( ) < 0 < 0 < 0 0 r j □ ()
-3 o ío u ÍO t) 0 t) t) i 0 0 0 0 0 0 0 o 0 t) ί=» 0 3 Γ) t)
0 0 0 o o 0 «d 0 0 i 0 < y 0 O (0 □ 0 p y < 0 0 y 0
(J < 0 o 0 < 0 o 0 i < «! 0 0 <J □ o 0 < 0 ri < < 0 0
0 to 0 0 Í0 0 0 () 0 i < 0 < o < () 0 () i t) 0 () to to 0 0
o 0 u ίο ío 0 □ 0 ίζ> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 3 0 0 0 0 ÍO
•ςρ MD oo o CM TJ1 kO OO o CM CO o CM tp KO CO o CM TT M0 OO O CM τρ
o o o rd r-1 r-1 rd r-1 CM CM CM CM CM 00 OO 00 CO 00 -CP •^p •^p ^P •^p UO U0 UO
00 00 oo D CO 00 CO CO CO 00 00 00 CO CO 00 CO CO CO 00 00 00 OO oo 00 00 00
E-i Eh Eh Eh EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH
Í0 to to to ÍO to in to tn tn to to to ÍO to to to to Í0 to to ÍO to ÍO ÍO to
H Fh Fh EH Eh H Eh H EH FH H Fh FH Fh Fh FH Fh Eh Eh Fh Fh H Fh EH
!> ti 0 < < t) y 0 0 0 0 ^2 0 y y y O y p y to t) 0 -d
0 0 0 ti 3 0 ri 0 0 □ □ 0 O < □ 0 0 0 D 0 0 0 0 0 0 0
o ÍO 0 »i 0 Í0 0 < 0 o :=> □ 0 0 0 ii < 0 O 0 0 ίο Í0 0 0
0 0 y i < y £ y □ y S o 0 i t) 3 y y p 0 0 y y
2 () < 0 < 0 (> 0 0 < () () 0 0 0 u ti 0 0 < () □ o 0
α 0 y < 0 p u «< < y 0 < < 0 □ 0 □ 0 p Ξ> □ 0 y y «d y
o o 0 ri < < 0 0 < 0 □ u o () t J u □ < t) t J (t 0 0 ri <
α D □ < 0 □ 0 <* to □ 0 □ o < 0 □ D 0 0 0 0 < 0 □ 0 0
d 0 0 0 d 0 p Γ ) t) r) < y y p y p y t 1 y t) p y Í0 Γ )
υ ( ) 0 ( ) 0 ÍO 0 0 (> (i ΰ <1 0 0 0 0 0 0 o < 0 ÍO
0 p ri y •d y D <2 < y 0 p 0 0 ίο 0 Q 0 y y 0 p o r)
□ < < υ 0 o 0 0 D < ( ) 0 □ () O 0 ίο 0 ( ) 0 Í0
y p p 0 ío < 0 p D 0 i < y o 0 D < 0 0 y
3 0 □ < o □ □ li 0 o < D 0 O 0 0 o < o □ □ O 0 < J □ 0
3 0 0 o < 0 0 li □ < li < < 0 0 < □ 0 0 0 0 Í0 0 0 □
y 0 y ío t) t) i 0 i 0 ti 0 ίο 0 0 y y y
0 () 0 0 () ( > (> 0 0 ( 1 0 () ίο 0 □ ( ) 0 (1 ( 1 3 O < 3 Í0 <
o 0 () ío 0 t) Γ) t) t) t) 0 o < 0 Π Γ) t) t) 0 D t) Í0 3 Í0
o < o < O 0 0 0 0 0 0 0 < 0 u 0 0 0 □ 3 □ 0 ÍO 0 0 «d
00 uo Os rd 00 u0 os <-1 00 U0 r- Os rd CO u0 r- Os rd 00 U0 r- Os rd 00
O O o O rd rd rd r-1 ϊ—1 CM CM CM CM CM 00 03 00 CO OO ’ζρ U0 tn
oo 00 CO 00 00 00 CO 00 00 CO CO 00 00 00 00 CO 00 00 00 OO 00 00 00 00 00 00
rd ΓΜ CO -çp U0 MD CO Os O rd CM CO •^P U0 MD r- CO os o rd ΓΜ 00 •^p uo
M0 O O o O o o o o O í—1 rd rd rd rd rd rd rd rd rd CM CM CM CM CM CM
n Ü0 LD uo UO U0 U0 m uo uo LD U0 uo LO U0 U0 m UO UO U0 U0 UO LQ U0 UO m
CO CO OO OO CO OO CO CO CO CO CO OO CO CO CO CO CO CO CO CO OO OO CO CO CO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
s Ξ Ξ £ £ £ s S Ξ Ξ Ξ Ξ s s s S S Ξ Ξ Ξ Ξ Ξ S S Ξ
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 124/176
120/161
4f> CM <N> os 1%í 17% | o CO c-1 CM 4f> cd 15% | CO 1%ε dA CM 1%{,τ CO 1 %S cd CM cd CM 4f> OS CM o •Φ cd cd CO
oV> <Λ> oM> oV> o¥> <A» oV> oV> <*> o¥> oV> oV> oV> oV> <fp
’Φ r· ’Φ o CO 00 CO CM CO ’Φ LO LO CO o LO MD O r- CM C- LD CO CM ’Φ CO
CM o CO CO c-1 c-1 c-1 CM CM OO rd CM rd ’Φ MD CO cd CM cd CM LO cd os cd Γ-
cd
<A° tffi <ffi tffi <ffi
r- LD MD oo CM •Φ ιθ c-1 ’Φ CM v1 O rd vd lO UD CM Γ- U0 CO LO cd CO Os CM cd
c-1 cd rH cd cd cd
<Λ° <Λ*
’Φ CM OO r- •Φ O m O CO •’Φ 00 LO CM CO rd MD OS OO CM m ΓΜ CO os Γ- Os CO
CM CM Γ- CO cd CM CM CO CO r-1 rd CM rd ’Φ LO CO cd CM CM CM LO CM CO cd LD
cd rd
E-» Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh EH EH EH EH EH EH EH EH
ω ω m ífl m m ω rn ω ω ω ÍJ1 ω m M rn m m ω rn ω ω M ΪΠ m m
Fh Fh Eh Eh Fh Fh EH Fh Fh EH EH Eh FH Fh Fh Eh Fh Fh Eh Fh Fh Fh Fh Fh Fh Fh
d «4* < •4* y d ED d d ED ED d Q Q d Q Q Q d y Q ti
D lí □ lí d < í) d D < í) d □ d u d t) d d ti d □ ti d ()
D í d tf □ ED d d D d d u d t) «4* © < d d d u O ED <1 d d
o O d 0 d d ti d o ED ED (1 d tf 0 y y 0 □ (1 0 y
u □ d 0 □ ED 0 tf 0 □ d 0 tf 0 •í 0 0 tf < O 0 d 0 ()
y d p () d ED tf y t) ED tf ED ED 11 ED t) tf ED y (1 t) y ED
< d ed t) d ED 0 o ED ED •3 0 () ED ED 11 tf () d o ti <J < □
o 3! u u d •4* < D O ti d 0 < < 0 d d (1 d d 0 ED <1 ED
y □ ED tf 3 ED < f > ti (1 o t) t) ti y 11 y ED ED ED t)
o 0 < <J d 0 ED d o () t) □ d <J □ d □ < u < d < □ □ < 0
< d d < < d d o Q ti d y d d □ d y < d <
d () (> ED tf ED ED ED d ED d ED ED u < () u (J () d ED ED d () d
d d d 0 tf ·=£ d 0 0 < 0 0 0 □ ED d □ ED Q d d d 0 < 0
0 0 0 < 0 d < (J D u 0 D 0 0 0 0 () 0 < < < d ED
< d •3 ED d d < d d o d t) t) d ED □ < < d d tf d d d
d f > d y ED d t) < o n <4! y y D ED d tf (1 ED d
D () d ED d d d t) d <J d ti < d d d ED d 0 ED ti t >
d 0 0 < 0 < ti (1 0 ED < o 0 < < □ 0 ED □ (1 0 0
o o u d u u 3 d d o d ED d d u < ED d < u d d ED u u d
LD CO o CM ’Φ LD CO O CM •Φ LO oo O CM ’Φ LO CO O CM ’Φ LD CO o CM ’Φ LD
lO LO LO MD MD MD MD r- r· r- r- Γ- CO CO CO CO CO os OS Os os os o O o O
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO ’Φ ’Φ ’Φ ’Φ
Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH EH Eh EH EH Eh Eh Eh Eh EH Eh Eh EH EH Eh EH Eh Eh Eh Eh
ω (fl m rn m m rn m (fl (fl ω rn (fl m rn m m m (rt m (fl (fl m (Π m rn
H H H H H H fcH H H H H fcH H H H H H H H H fcH H H H
o d d y d d □ d d Q y < y d © < d □ y y < (1 y
ed t < d d ED d ED u () d ED ED d ED ED ED ED < o < 2! <J d ti
< d 0 < 0 0 0 □ d d ti 0 o □ □ 0 ED 0 0 0 < 0 0 < 0 (1
ti d ED d y ti d d ED < d y ti < y < d t) ED ED y ti
D O (> □ < () u □ o o < □ u ti d () < < ED □ u o ED d d 11
o d d □ d d D d o ti y o ED y d <4! <4! d ED o □ ED (1 <
() () (> (> □ □ <J d d ED ED <1 d t > t > () () t) (> <1 □ d
u <1 d < □ < ED < <* 0 < 0 < d □ (1 0 d ti 0 < < d 0 d
ED d d ED ED ED y t 1 tf y y y t) ED ED (1 ti Q ED ED ED (1 ED
o t < ED d u u < t) 0 d ti tj d o < ED d ED o O 3 ED ti
D d «í «£ □ □ □ < D ti 0 0 < 0 ED 0 0 ti d ED < □ 3 < 0
O O d 0 (> ED □ 3 < () () u ED ED 0 d 0 (> 0 t) 0 <« (> □ ED
O o y d t) < 0 y < < ED f) ED < ED y d (1 Q ED
d ( 1 < d () □ < ED 0 d < □ o < < d < 0 O < 0 () □ 0 d <
ti < u d < d © d d d ED d ED d d □ ED ED ti t) (1 d ©
0 □ 0 d 0 0 0 0 tf < «ΐ 0 □ d d 0 □ d D d «4* 0 ti 0
< o u □ < < 0 0 < 0 d d 0 0 □ < ED (J (I () ti < tf 0 () 0
< ED < d □ d d ED d u ED t) d t) ti d d t) tf t) t) ti
0 o □ □ d u < u 0 < < □ u d u D u d O u u u d d u u
lO r- os cd CO LO Γ- os t-1 CO LO Γ- σ% rd CO lO Γ- OS cd CO LO r- Os cd CO LO
LO LO ιθ MD MD MD LO LO r- r- r- r· r- OO CO CO CO CO OS Os OS Os OS O o O
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO ’Φ ’Φ ’Φ
LD r- CO Os O cd CM CO •φ tn MD CO Ch o cd CM CO ’Φ LO LD r- CO OS o cd
CM CM CM CM CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO ’Φ ’Φ ’Φ ’Φ ’Φ ’Φ ’Φ •φ ’Φ ’Φ LO LO
lO lO lO LO lO LO lO LO LO lO LO LO UO LO LO lO lO LO LO LO lO lO lO LO LO LO
OO OO OO CO OO oo OO oo oo OO oo CO oo oo oo OO OO oo OO oo OO OO OO CO oo OO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 125/176
121/161
CM <#> τ—1 co 10% | tfrí CM rd 18% 1 0^ Cd rd v£) <N> rd <#> Cd 0^ rd <#> ΈΡ Cd CM rd 1 %S rd <#> id 1 %9T <#> 1 %Z ld <N> CO <#> ld
<H> 0^ tffi «ffi <H> 0^
cd rd CO vo σν r- Cd O CM O VO Cd Cd Cd Cd σν o Cd CM O σν O Cd Ld
cd Cd CO ld Cd rd rd rd Cd rd o σν Cd rd CM co CM rd -çr rd ’Φ ld CM
rd
<#> tfP dP <N> 0^ 0^ <#> 0^ <#> tfP <N> <#>
VO Cd id rd •^p CM rd o VO Cd VO rd VO CM ld co CM Cd ld Cd CM Cd O rd Cd CM
r-1 CM rd CM rd CM rd
«ffi «ffi <tfi «ffi «tfi oV> dfi «ffi «ffi <tfi «ffi (tfi oV>
O σ\ ¢-1 CM rd σν VO ld VO Cd •^r Ch σν CO σν VO σν CO ld td O
td CM r- σν r- ld o •^p rd rd rd rd co VO CM rd rd co rd CM rd Cd 3* CM
rd
EH £-· EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn σι σι tn tn ω ω ω σι tn tn tn ω tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
H fcH H fcH fcn fcn fcH fcH fcH fcH fcH fcH fcH H H fcH fcH fcH fcH fcH fcH bH H fcH fcH
t) < 0 y < <£ < P Q Q <; < 0 Q < P ^2 P <2 < y
() P < < 0 0 0 3 () < 0 0 3 0 0 0 0 P P < 3 () < 0 to
0 P 0 3 < (0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 P < 0 0 0 0 0 3 t) <*
< < y P 0 0 0 0 0 Q 0 P Q P 0 < í 0 0 P y to lí
P ri < 10 P 0 P 0 0 <. 0 U 0 0 0 0 u P 0 0 0 0 0 •í
p y «£ 0 0 P P P < y < (0 to y P y 0 í P P P lí P
< < p 0 0 0 () P < P < P P () < 0 o 0 0 í 0 0 () •í P
() o O P P P 0 o P 0 P 0 í P 0 P P 0 li P () 0 P to
0 0 0 P < 0 0 u 0 P í í 0 <£ P 0 0 0 0 y P
< P 0 0 0 0 •3 0 < 0 0 P 0 í P P 0 0 < ( ) < < 0 to 3
y 0 P P y 0 0 0 0 Q P 0 4* P < Q < < <£ y 0 P 0 *2 < y
o O 0 < 0 P 0 0 0 P lí < 0 0 0 P o 0 P 0 < 3 to
P 0 t) () 0 í 0 < <£ P <2 í 0 < 0 (> 0 li 0 y t)
o () P () P 0 P P 0 0 0 0 < P 0 P < () lí P •3 í P to t)
0 0 < 0 0 0 P 0 < < < P P < < u u 0 Ȓ 0 0 u 0 0 0
t) P t) 0 0 ( ) y 3 (> P < í 3 y y Q y <2 í < P P () y <2
<) () () 0 0 P 0 0 0 P < P ζ_} 0 0 0 0 0 < 0 P (> 0 () to <
o u 0 < < P 0 0 P P P P < 0 < P 0 P 0 0 0 0 0 < to f)
P P 0 0 0 0 0 < 0 0 P 0 P < 0 o P P 0 0 < < < 0 < 0
co o CM vo co O CM -Çp VO co O CM •^r vo co o CM -'Φ vo CO O CM •^p vo co
o rd rd rd rd rd CM CM CM CM CM Cd cd Cd Cd Cd •^r -'φ ld ld ld ld Ld
•^p ’Φ -^p ΈΡ ^P •^p •^p ^p ’φ -^r •^r •^r
Η EH Eh EH Eh Eh EH EH EH EH EH Eh Eh EH EH Eh Eh Eh Eh EH EH Eh EH EH EH
tn tn rn rn rn rn rn tn ω ω ω rn tn tn rn tn tn tn tn rn rn rn tn rn tn tn
Fh Fh FH FH Fh FH FH EH FH FH FH FH EH Eh Η FH Fh FH FH FH EH EH EH FH EH FH
< < 0 0 0 0 0 P y < y < P 0 < < y Q P P P 0 P Q
íi 0 () P P 3 ( ) 0 < 3 P () P < 0 3 0 0 0 ( 1 () P () 0
0 0 0 0 0 •3 0 0 0 5 P 3 0 0 0 0 0 0 P 0 < 0 0 0 t) P
0 0 0 0 0 0 P 0 0 < P P P 0 0 y Q 0 P P ·=£ <2 Q t)
o 0 P 0 0 0 0 P P P < P < P P 0 0 0 P 0 0 0 0 0 0
y 0 < 0 < ( ) í < 0 0 y P 0 P < 0 < P <2 P «fi P P «c y <2
< 0 0 0 0 P 0 P P P < 0 P 0 P P 0 () 0 P 0 P P 0 0 (0
t) 0 0 P P P 0 < 0 0 0 < P P 0 0 0 < u 0 < 0 P P P D
0 0 < <£ 0 0 0 0 0 y < 0 P < P y P P P 0 0 < 0 0 P to
P < 0 (9 0 0 P (I P O 0 () P < < u 0 P P 0 P P () () P
0 y P y P P y y P y < P P P P < Γ) 0 ^2 y to < P
0 0 () < < -3 0 0 < () < 0 P P P < <) < 3 () P 0 () 3 ()
P P < 0 0 0 < P < P < < 0 P P y 0 y P ^2 y *2 P <
<0 P P 0 ( 1 3 < P 0 P 0 ( ) 0 () < P 0 0 P < < P 3
0 P 0 < 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 0 0 P 0 0 0 P P
P P 0 < 0 P 0 0 (> 0 0 (> < y 0 y < y P P y 0 to y P
0 < 0 P P (> () 0 () P 0 (> 0 0 ( > < P 0 () P 0 0 0 P to P
0 3 P P 0 0 0 P 0 P P 0 0 P 0 0 0 0 < < P P 0 P 0 t)
0 P 0 0 P P P P < u u P P P P 0 u P P 3 0 P < 0 P 0
r- σν rd cd ld Γ- σν rd Cd ld r- σν rd Cd id σν rd Cd ld Γ- σν rd Cd ld
o o rd rd rd rd rd CM CM CM CM CM Cd Cd Cd Cd Cd 'd’ Z1 id id ld ld
'Cp Ζ1 ^p •^p Z1 ^P zp ^p τρ ^p z1 Z1 'd1 Z1 Z* z1 τρ
CM cd çp Ld VO Γ- CO σν O rd Cd ld vo Γ- co σν o rd ΓΜ Cd id VO Γ-
Ld ud id Ld Ud ud Ud ud vo VO Μ3 vo VO M3 vo vo vo r- r· Γ- r· r- r- Γ- r·
ud ud lO ud ld ld ud td Ld ud ud ld ld ld ud ud ud ud ld ud ld ld ud id Ld ud
CO CO CO CO CO CO co co co CO CO CD CO CO co co co co co co CO oo co co co co
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 126/176
122/161
-Cf* co A A iO A VO <& LO rd CA® rd CN CN rd CN 1%z co CA® cr «A» CO «A» CO 1%z «A» CN 1%z oA> CN oV> A oV> A «A* A «A® VO
<N> <A» <N> «AP oV> <N> <A» <A» oV> «v> cA<> «A» <A° oA» «A» oA® «A» oM> «A» oA»
CN r^- O O oo CN O 00 CN OO CO VO rd O in ΓΝ VO cr •cf* VO OO VO VO CO OS
00 A Γ- LO A lO CN CN rd rd Γ- rd rd CN CN VO oo A A A A A A CN A VO
«V» <#> <H> <N> «V» <N> <H> o¥> <H> «V» <N> <H> oV> <H> <#> «V» o¥> «A» «A» oA» oAO oA»
r· CN 10 CN A co CN CN rd CN iO rd rd CN CN co Γ- CN A A CN A O A CN CN
& <N> & «w> <N> CA® «A» «A» «A» «A» «A» «A» «A* eA»
10 •cf* co vo CO co CO VO CN r- CO 'Cf* Os CO CO vo Γ- A CN A LO Γ- CO A A
r- A vo Ui rd •cr rd CN rd rd r- rd rd CN vo Ch A A A A A A CN CN CO
A EH EH EH EH Eh EH EH EH EH EH EH Eh EH Eh EH A A A A A A A A A A
ΪΠ ÍO rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn
Eh EH Fh FH Eh Eh H Eh FH Eh Eh Fh FH FH EH FH A A A A A A A A A A
< P 0 0 P □ 0 P 0 P <* < 0 < y < y '1 0 /3 <3 P 0 0
□ (') ( j □ 0 0 3 P C J (J tf o 0 P 3 < 3 0 0 3 P 3 3 P <) 3
□ o 0 P 0 0 0 < 0 P 0 0 0 P 0 < tf tf P P 0 P 0 tf
t1) 3 0 P 0 y P 0 0 y < 0 0 y tf 3 Q tf tf
tf Ξι □ ti 3 0 0 tf P P < P < < 0 0 3 tf 0 0 0 3 tf P
tf tf 0 < 0 ( ) o tf < tf 0 P P < y 0 Q tf tf 0 < P 0 y tf P
Q □ 3 ti 3 U P 0 0 y P () r j P < ) 0 tf 0 ( J 0 0 P 0 P 0
0 o 0 0 P < 0 0 0 P P u 0 P 3 0 < tf 0 0 P P 0 < P tf
0 0 □ 0 3 ti y 0 0 0 P P (0 y P y tf 0 P P 0 y P 0 tf
o 0 0 0 0 □ P < P u P 0 P 0 P 0 0 P 0 0 P 0 3 0
0 t) 0 y 0 tf P yi P P 0 P <c P < <* t) t) P < P tf 0
0 3 □ 3 0 0 0 (J < í) P 0 0 0 3 tf 0 P 0 (1 P t) 0 y <)
< 0 < 0 0 0 0 0 0 0 0 tf < < ti 0 tf P y < 0 /3 <3 tf 0 y
ti o ti <) P 3 0 0 P P tf 3 P ti P () tf 0 < P 0 3 0 tf <) 0
0 o 0 0 0 0 P U P P tf o < 0 < 0 0 P P 0 P 0 P tf 0 (0
0) o 0 < P 0 P P 0 0 tf 0 P < P Q 0 y 0 (1 P 0 0 ^3 <
u o 0 u 0 3 () 3 P 0 < P ti 0 0 0 < < 3 P 3 P P 0 ti
< 0 □ P u 0 P 0 tf 0 P 0 O < P P 3 0 P 0 0 P 0
0 o < 0 P < 0 0 < < P P P 3 0 0 0 0 P 0 P P < 0 0
o ΓΝ VO oo o CN vo oo O CN cr* vo CO o CN Cf* VD 00 o CN •cr* vo co O
VO VO VO VO VO r- Γ- r- r- Γ- 00 OO 00 oo co os OS OS os os o O O o o A
•cr ^f* *3* cf* cf* cf* cr *3* cf* CT* •Cf* LO iO LO LO LO LO
Eh Eh EH En Eh Eh Eh Eh EH Eh Eh Eh Eh EH EH EH A A A A A A A A A A
rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn
Fh EH EH FH Eh Eh Fh Fh EH Eh Eh Eh Eh Eh EH A A A A A A A A A A A
0 < □ y < P 0 y P P P < < < P 0 y 0 < < P 0 y
□ □ í J 3 •3 0 ( ) 3 C ) P (J tJ 0 P P < < P 0 < 0 0 < P 0
o 0 0 0 0 □ 0 P < P 0 P 0 0 0 0 P P P 3 P < 3 0 0
y tf y P 0 < «s y y P 0 < P < y 0 y P y ^3 0 y P
0 tf 0 f) ti u 3 0 P 0 □ () P 0 0 3 3 0 3 0 3 P 0 ()
0 tf o 0 3 □ ti t) tf tf P P < 0 < 0 P P <3 P t) P 0 y
□ 0 □ 0 0 (J () (J 0 0 (J P P P ri 0 P < 0 P 0 0 () P ( 1 0
0 □ < □ 0 0 u 0 P 0 ef P u O 0 P P 0 < 0 0 < 0 0 0 0
y P 0 0 0 y P < 0 < tf 0 < P < P P 0 yi P P P < P y
0 <) (J <) 0 3 P 3 P 0 tf ti < ti tf () 0 3 0 (J 3 (> P P 0
o o y p 0 0 0 0 y 0 tf < y 0 tf 0 P 0 <s < y ^3 < y P
< J 0 u 0 3 2 0 (J () < 0 ti < P y P P 0 0 3 3 0 P P
0 < P 0 P 0 < 0 0 0 tf P 0 P 0 0 0 y 3 y
□ p ( J □ ( ) 0 P P P y < < p 0 0 () P P 0 P 3 0 0 p <
□ □ < < 0 □ 0 P 0 P < P < P P 0 0 P P 0 0 0 P P 3
y p □ 0 P 0 0 < P 0 y 0 P y y 0 0 P P y y P 0 P P
() □ ( ) 3 0 0 0 P () P < 0 () 0 < 0 P P P < 3 0 () P
3 (> o 0 t) P < 0 0 P 0 t) < P P P t) t) P 3 P P tf 0 P
□ < 0 0 < 0 < 0 P P 0 0 P 0 P 0 0 0 0 0 0 ”· 0 u
os t—1 co LO Γ- os rd (O LO Γ- ov rd CO lD r- OS A co LO r- OS A co LO r· os
lO vo VO VO VO VO Γ- Γ' r- Γ- r- OO 00 oo co oo OS os OS os os O o o o o
•cf* ^f* •cr •cf* cf* •d* cf* cf* •cf* cf* •cf* •cf* •cf* iO LO LO LO LO
CO os o A ΓΝ CO cr in vo Γ- co OS O rd ΓΝ CO 'Cf* in VO Γ- CO OS o A ΓΝ CO
r· u- 00 oo OO 00 OO 00 OO co oo OO US OS crs os OS os os os os os o O O o
lO lO 10 LO iO lO LO tO LO iO LO m LO LO m LO m LO LÜ ui LO LO vo VO vo vo
00 co 00 oo OO oo OO 00 OO OO oo OO 00 oo oo oo oo 00 oo 00 OO OO oo OO co OO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 127/176
123/161
0^ ç—) CM <#> ^f* 1%ε <& co CM rd O rd iO CO CM <#· CM CM 1%ε ^f* 1%ε ^f* CO rd rd cfi «v> CM rd kü 1%s 0^ CO 1%ST CM
cV> 4fi «N> d® <N> «Α® 4P cV> «N> <N> 4P 4P cV>
O iO lO 10 lO CO Os CM O kü -=J* m rd Os O Os CO O Γ- rd co LO •*3* CO
CO Γ- CM rd r- r· CM CM r- rd CM CM O OS CO rd lO r- co LO rd LO kü CM
rd
©v> & 4fi> <Y> & cY>
kü CM rd rd CM LO CM rd CM CO rd rd CO *3* CM rd CM CO r- kü CO CM CO CO CO
oV> <N> «*> o¥> <N> <N> «v> <N> <H> «*> o¥> <H> ttí> oV> <N> <H> <N> <H> «v> oV> «*>
r- o O Γ- O CM rd rd CO Γ- CO CO OS CO LO CO kü Γ- OS Cf* iO CO r· OO çf* LO
kü rd rd kü kü CM rd lO rd rd rd os CO kü CM rd cf* r- 00 LO rd LO kü CM
Eh Eh Eh EH EH Eh EH Eh EH Eh EH EH EH EH Eh Eh EH EH EH Eh EH EH EH EH Eh
rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn cn rn rn rn cn cn cn cn cn cn rn
Eh Eh Fh Fh Fh Eh Eh Fh Fh EH Fh FH Eh FH Fh Fh Fh Fh Fh EH EH EH EH Eh FH Fh
P P 0 0 y < P 0 < P 0 0 P «ΐ (0 tf 0 0 < P P < P < < 0
C ) CO tf tf tf 0 c) tf P P P C J P 0 C ) tf P P 0 P co P P P C )
n 0 o P P < 0 P 0 0 P tf 0 < 0 tf 0 0 0 3 P (0 0 <
P P < 0 0 P 0 0 P y tf y P 0 tf P y y P 0 to co y to y
o tf P P tf tf 0 tf 0 < tf 0 0 C J C ) tf 0 tf tf P P P P tf P tf
< 0 0 P P P 0 y P y tf 0 0 y y 0 P 0 P f) (0 y (0 y
ti () P 0 tf (J tf tf 0 tf tf 0 P 0 tf 0 P 0 3 P (J P P tf P tf
< o (9 P P 0 < < P < tf P < to P P (0 tf tf P 0 0 P 0 to P
o 0 < 0 0 P 0 0 0 P P P «tf <) < tf ti 0 P y y y < <
•4* tf 0 0 tf 0 tf tf < co C J to 0 P <! tf P P tf tf 0 tf P tf
«í < < «? ρ p < «í 0 y y < 0 ro y co 0 y 0 y y P y < (0
0 0 ti ti tf tf 0 P 0 0 tf tf t) P C ) < P P tf P tf tf P tf P P
p 0 o tf 0 0 0 0 < P < 0 0 <c y P 0 y 0 P 0 y 0 to P y
10 0 < < P tf 0 < < J < P < 0 tf 0 tf tf tf P 0 0 C J P 0 tf
< 3 tf 0 3 0 u 0 0 0 < co to < tf < < < < P P 0 to P to
0 c) tf (J y < P ( J y P P < < C ) tf P 0 0 0 í) P < P «ΐ y
tf P 0 P tf tf ti u P P co 0 ti C) 0 10 < tf 0 (J P P 0 0 tf
< o 0 0 P < 0 P 0 C ) P 0 0 < P co P P 0 (0 0 P 0
0 P 0 3 0 0 P 0 < 0 0 0 P < 0 0 0 0 3 0 0 < P 0 0 0
CM kü co O CM 'Cf* kd co O CM -=J* kü CO o CM 'Cf* kü CO O CM kü co o CM
r-1 rd r-1 rd CM CM CM CM CM co CO co CO co 'φ ^f* Cf* cfi cf* lO IO LO IO LO kü kü
lo 10 lO LO lO iO lO iO m iO lO iO LO LO LO LO LO LO lO LO iO LO iO LO iO LO
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh EH H EH EH EH EH EH Eh EH H EH EH
rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn cn rn rn rn cn rn rn rn cn cn cn cn cn cn rn
H fcH H fcH H H H H fcH H H H H fcH H H H H fcH H H fcH H H H H
tO < 0 P O 11 < y P y 0 0 < P to y f) 0 P y y P y (0 0
p u 0 0 tf P ti < 0 tf P (i 0 P < 0 < P tf tf 0 ti tf P 0
o < 0 < P í) 0 0 < P tf 0 0 0 (0 0 0 P () 0 0 tf < to 0 P
0 CO P 0 0 P 0 y tf < P P co P < 0 co 0 y tf < p 0
o P P tf P P 0 0 0 0 (J P 0 C ) P P P P P P tf tf CO 0 tf 0
o 0 P P P < P r) P 0 P P 0 0 0 0 C ) 0 tf 0 0 y 0 P
< tf 0 cJ 0 o c) 0 P < P 0 0 P C ) < tf 0 0 tf 0 < ) tf o < C J
0 0 0 0 P P 0 < 0 (*) 0 0 0 0 P P tf P 0 tf P 3 <
o P P P P <£ P P t) 0 y P () t) y 0 0 y y 0 (0 tf f > P f 1
P () 0 u P ti 0 (J () P C ) tf C ) P 0 < P P tf tf P C ) Q C ) tf P
< 0 P P y 0 < 0 0 0 < < < P y P P 0 to < 0 y y P P
o o c) tf tf 0 P P P P < P ti < •tf 0 P P 0 0 tf 0 <
0 tf 0 P 0 0 0 0 <) P co < 0 0 y C ) P tf 0 ·=£ tf P < P
P tf t) < < < c) tf < 0 P 0 0 0 C ) tf P P < (J < 0 0 (0 ti 0
0 P tf 3 0 P 0 0 0 P 0 0 0 0 co 0 0 0 P tf tf < < 0 < P
P tf tf P y t) <£ y t) 0 P 0 0 P •tf 0 0 tf to 0 0 0 y (0
0 0 0 < tf P 0 < () u < P tf P tf P 0 < J P Cj P P C í co P
0 0 P P 0 0 0 0 < 3 0 < 0 (0 P < < 0 P 0 tf < < (0
< < o 0 0 P < 0 P < 0 0 < P 0 P 0 0 P < < P P P 0
ç—i CO LO Γ- OS rd co lO Γ- Os rd CO LO Os rd CO iO Γ- Os rd co lO Os rd
ç—i rd r-1 rd rd CM CM CM CM CM CO co CO co co ^f* cf* cfi cfi cj* IO LO IO LO «O kü
lo lQ LO iO LO iO lO iO m iO LO lO LO LO LO LO LO iO iO LO iO LO iO LO iO LO
έ lO kü Γ- CO OS O rd CM CO ^f* U0 kü co os O rd ΓΜ co cfi LO kü CO Os
o O o o O o rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd CM Í\1 ΓΜ Psi ΓΜ ΓΜ í\l ÍM ÍM ΓΜ
kü kü kü kü kü kü kü kD kD k£) kO k£l kü kü kü kü kD kü kü kü kü kü kü kü kü kü
co CO co CO CO co CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO co CO CO CO CO co CO CO CO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 128/176
124/161
dP CM dP T cffi CM dP r-1 dP ç—1 dP CO 1%z dP -φ <1P oo <Λ> dP LO dP cH «P rd oP O eP rd oP rd «P rd dP CO dP CO dP CO dP CO oP CM rd 1
dP 4P <#> tffi <#> dA dP oP dP dP dP dP dP dP dP oP dP dP dP
CO OO Φ LO LO r- rd rd CM O ^r -31 CO CO rd O -'Φ rd CM OS LO
CM oo ç—I r-1 r-i co CM LO iO LO t—1 τ—i t—1 ϊ—1 CM rd rd O LO LO CO
rd
dP dP <N> <K> dA dP dP dP dP oP dP dP <N> dP dP dP dP
CM rd rd CM CO lQ CO CO LO r· LO CM CM CO O O rd O M3 LO CM
rd rd
dP <#> 4P <#> tffi <#> dA dP oP dP dP dP dP dP dP dfi oP dP dP dP
CM LO rd rd oo ΓΜ LO O -31 CO LO -'Φ LO CM CM O LO lO r-
CO os ç—I CM CM ’φ CM LO LO LO LO t—1 τ—i t—1 vd rd rd rd O LO LO φ
rd
Eh EH EH Eh EH Eh EH Eh Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
rn rn tn rn rn ω tn ω rn ω CO <0 CO m rn rn rn rn rn rn rn rn rn
H EH FH EH FH Eh EH EH FH H FH EH FH FH FH FH FH FH Eh EH EH FH
o P 0 P 0 P < P to 0 0 P 0 Q y 0 0 y 0 P < P f)
p 0 0 < 0 P 0 () P 0 P P 0 0 P () P P P (> (t
< < P P P 0 0 0 tf < P P < < 0 0 < 0 P to 0
0 0 y 0 y < < tf P ^3 P < P y < 0 to
p P 0 0 < P 0 0 0 < 0 < 0 P 0 0 < □ 0 (> P
0 «4* 0 0 0 0 y y y P y P 0 y 0 P P 0 < P
0 0 i? í) (J P P 0 0 0 0 0 0 < P < () 0 t1) < 0 P 0
p P < 0 P 0 0 P P P P < 0 < P 0 0 < to P to
P 0 y 0 P < Q Q P t) 0 Q < y to 10 tf
() 0 P 19 P P 0 0 u 0 0 0 0 0 < o < 0 (J 0
0 y 0 0 P 0 < 0 P P (9 P tf y < to P tf (0 P
□ (9 P (9 P 0 P < <« P P (I < 0 0 0 P o r3 tf <
y 0 P ·< y P y P y 0 t) P P < P Lí to tf <3
0 () 0 < P 0 to < P P (> 0 P 0 o P 0
0 < 0 P 0 cf < 0 P P P 0 «q* 0 < 0 < P 3 (9 to 0 <
tn P 0 P tf y P y tf 0 Q 0 P Q to to P to
(1 () P P P 0 <) < 0 0 Q ( ) 0 P 0 o P P 0 11
0 0 e> 0 0 < < 0 0 0 0 P 0 0 0 0 P P P (9 to < to
0 < < P P 0 0 0 0 0 0 0 < 0 0 < 0 0 0 0 P 0
•Φ LO co o CM -Φ LO CO o CM LO CO O CM LO CO O CM ’φ LO co
LO LO LO Γ- Γ- Γ- r- r- oo OO oo OO oo os OS os OS os o O o O o
lO iO lO iO iO iD iO iO LO LO LO LO LO LO LO LO iO LO LO LO LO LO LO
Eh Eh EH EH EH Eh EH EH EH EH Eh EH EH EH EH Eh EH EH EH Eh EH Eh EH
ω rn rn tn ω ω tn ω ω w OT ω OT CO tn rn rn rn rn ω ω rn ω
H H H H H H H H f-H H H H H H H H H H H H f-H
y P P «£ 0 (9 y 0 y y P 0 y P P y y 0 0 < 0
(9 0 0 0 u P P 0 0 <) (9 < í J < J (9 0 < < < ( ) P < /
0 0 < 0 P 0 P 0 0 P 0 0 0 < o P o < 0 0
P íJ tf y tf P 0 y P P P () () () < y í) () í) ()
0 P 0 < o P P 0 < tf tf (9 P 0 P 0 P < P u 0 0 P
P t > 0 t1 P < y y P tf tf <3 0 P < P y (> P P t) P
0 0 P 0 < o < 0 0 0 P P P < 0 0 P 0 P 0
< () 5! 0 o P < P P «ΐ 0 P 0 0 0 P < u (J P P
0 y 0 tf 0 P y < () tf t) () P 0 0 P 0 P y
0 0 < () qj 0 o 0 (> 0 0 0 P P ( > P () P 0 P 0 0
< P (9 0 0 tf P P P 0 0 0 P 0 0 P 0 0 P 0 0 P
< P P () tf 0 0 < < < P 0 P < 0 0 P u < 0 P
t) 0 P 0 0 tf (> y y y y y P < P 0 y y P t) y
P í ) P ( ) o Q 0 P 0 o 0 o 0 0 ( ) < (> P P
< < 0 0 P < 0 0 0 P P 0 P 0 < 0 0 P P 0 (0 <
0 0 0 y 0 P P P P 0 y •q* 0 < P P < Q P P P (0 y
P P < < < () í) 0 P P < tf P P t) 0 P o P () P 0
0 0 P 0 < 0 0 P < 0 tf < 0 0 < 0 P 5 < < 0 (0
0 < 0 < 0 3 P < 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P < O
co LT) Γ- os rd CO LO Γ- os <-1 CO iO u- os rd CO LO r- OS rd co iO r-
MJ LO LO LO Γ Γ- [*- Γ- co co CO co oo OS os OS OS os O o O o
10 10 LO iO lO lO LO LO LO LO LO LO LO lO LO LO LO iO LO LO LO LO LO
o r-1 ΓΜ CO Φ lO LO Γ- OO Οϊ o r-1 CM CO -'φ LO LO r- CO Οϊ O rd ΓΜ
co CO CO CO CO CO CO co CO co ^r -'φ -'φ -çp -31 LO LO LO
LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO
co CO OO CO OO CO CO CO oo CO OO CO OO CO CO OO OO CO CO CO CO CO CO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 s 2 S 2 2 £ 2 s 2 2 2 2 2 s 2 S 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 129/176
125/161
Tabela 1B: siRNAs selecionados em conjunto de triagem estendido (siRNAs de seres humanos apenas). Outras 344 sequências de iRNA foram identificadas e foram projetadas para serem totalmente complementares à sequência de alfa-ENaC humano, de acordo com os critérios de projeto descritos na seção de exemplos. Todos os siRNAs listados neste conjunto de triagem foram modificados somente com uma ligação de fosforotioato na extremidade 3' entre nucleotídeos 20 e 21 de cada fita. A expressão de porcentagem residual de alfaENaC em teste de transfecção de dose única é mostrada (fazer referência à seção de exemplos para métodos usados).
Legenda da Tabela abaixo duplex ID
SEQ. ID Senso
SEQ. ID Antissenso
a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 130/176
126/161
Φ ω
ο
Ό •Η ω
'-Ρ ο*· '-P ^P ^P --P o*· xO -p o*· &- -p o*·
Λ 00 04 04 04 0O O
£ '-P '-Ρ '-P '-P '-P xP xP -P c> -P cO >P
ΤΓ 00 OO T— 00 04 CO
Ξ σ> 04 C4
rH
ο
5C
<Ξ>
Eh Εη EH EH Eh Eh EH Eh Eh
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
Eh Εη EH EH EH EH EH EH EH Eh
Ρ 0 0 y < 0
< 0 0 0 0 0 P 0 0
u 0 0 0 0 < < < 0 0
o y 0 0 0 P P 0 0 0
o 0 0 0 0 < 0 0 P
y 0 P «4J y 0 0 0 0 <
0 Ρ 0 0 0 0 <
0 P P P 0 0 P P P
P Ρ 0 P 0 0 0 P
o 0 P 0 0 P P P 0 0
y Ρ □ < < P 0 0 <í y
Φ Ρ 0 P P P P P 0 0
ω 0 P P < 0 P <: 0
C Ρ P 0 P P 0 0 P
φ 0 Ρ < 0 0 P P P 0
«3* < í y P 0 5 tf <
«i < p 0 0 P P < 0
C Ρ 0 0 P 0 P < 0
< **· 0 P P 0 P < P P
o 04 co 00 o 04 co 00
τ— T— τ— 04 04 04 04 04
CT co CO co co co CO CO co CO CO
Se ID
Ê-t Εη Eh Eh Eh Eh EH Eh Eh
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
ε-« Εη EH Eh Eh Eh EH EH Eh Eh
Ρ y < < <£ P < P <
Ρ < 0 0 < 0 P P 0
Ρ Ρ < 0 0 í P P 0
Ρ Ρ P P 0 0 < P P
0 P 0 0 3: P 0
Ρ cr < 0 P y 0 <£
υ (J P «J P 0 < P 0
Ρ »3« 0 < <* < < 0 0
0 P P 0 0 P 0
< Ο 0 0 «5 < < 0 0
ί 0 P 0 0 y < P
ρ 0 < < 0 0 < -í <
y y P P 0 0 0 P P
0 0 < P 0 0 0 0 0 P
0 0 0 P 0 0 P 0 0 <
C0 y 0 y 0 0 < < 0 0 0
c 0 0 0 0 0 P P P 0 0
φ Ρ Ρ 0 0 0 0 0 < 0 0
ω 0 < P 0 0 0 0 P P 0
σ> 00 LO co 0O LO r-
cr ο Έ— — ς— — — 04 04 04 04
Se ID co CO co co co CO CO CO CO co
X ιο CO r^- 00 o> O 04 OO
’Τ LO LO LO LO LO
Q_ , Λ ’Τ Ο ο D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04
Ω Q ζ. V- Z. v- z. v- z. v- z. v- z. v- Z. τ-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 131/176
127/161
xP ©* '-P --P >P >P '-P xP '-P xP ©- >P >P --P o*- ^P ©* '-P '-P ©^
CM CM CO r- CO CO CO CM CM CM co o
'-P ©^ xP '-P ©^ xP &* '-P -P ©^ '-p ©^ xP x? ©^ xP ©* '-P ©*· <o ©^ xP ©- >-P '-P '-P ©^
CM 00 r- o> O LO CO OO T— CO sr CM CO
CM CM CO CO <J> <?> CM CM
Eh Eh EH EH Eh Eh EH EH Eh EH EH EH EH Eh Eh Eh
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh EH EH
p 0 0 0 to 0 D to 0 to 0 0 0 D to o
< 0 0 0 □ 0 0 □ 0 □ < 0 to □ o
o to 0 0 0 < 0 < < 0 < 0 0 < 0 0
0 < 0 < 0 < 0 0 0 0 3 < < <
0 to 0 to to 0 < 0 0 0 to 0 < to 0 0
< 0 0 0 0 p 0 0 0 p < 0 Q 0
to 0 to to 0 0 0 0 0 0 0 to to 0 0
o < 0 0 0 0 0 0 < 0 to < 0 0 0
0 to 0 □ 0 0 0 < □ □ 0 to 0 0 <
O 0 0 to 0 0 0 to 0 to 0 0 0 0
o 0 0 0 O 3 to □ 0 3 0 0 < 0 O
to O 0 to to tf 0 0 to < 0 < 0 0 to to
0 < P 3 tf O < 0 □ 0 3 to < 0
0 0 to 0 to 0 0 to 0 0 0 to 0
o to 0 0 0 < 0 □ 0 < < 0 < 0
< □ 0 3 to < D 0 0 3 0 0 □ 0
0 to 0 0 □ 0 O tf 0 0 0 < 0 to < 0
0 < < □ O 0 0 tf 0 0 0 □ 0 0 <
< < 0 0 0 0 0 < to to 0 0 to 0
O CM co 00 O CM CO oo o CM co oo O
ÇQ <?Q CO CO CO sr 'T IO IO IO IO IO co
CO CO co <£> co co CO co co co co CO co co co co
Eh Η EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω (0 ω ω ω
Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
to to 0 0 0 0 0 to to < 0 0 < Q to
0 to to < 0 0 to 0 0 0 to < 0 0 to
0 0 0 tf 0 |ή* to 0 0 0 to 0 □ 0
3 tf 0 < tf □ tf 0 □ 0 0 0 tf 0 o
< tf 0 to to 0 (J to 0 tf 0 to □ (J □ 0
0 < 3 O 0 < 0 0 tf 0 0 0 < 0 3
to 0 to 3 tf to to 0 to 0 < □ 0
< 0 0 tf □ 0 0 □ 0 □ 0 0 <
0 0 0 0 tf p < tf 0 «e 0 0 3 0
0 0 0 0 0 0 < 0 < 0 0 0 0 □ to
0 < 0 tf 0 0 to < < 0 < 0 0 3 0
0 to 0 0 0 0 O 0 to □ 0 < □ 0 0 0
< 0 < O 0 0 0 to 0 0 0 < < 0 0
o 0 0 0 0 < 0 0 0 0 to < □ 0 0 0
0 < 0 < < 0 to 0 0 0 < 0 □ < 0 0
p 0 p 0 p 0 to 0 0 0 to 0 to to to
0 < 0 0 0 0 to to 0 to 0 0 to 0 0
to to 0 0 0 < 0 0 < 0 < to 0 < < <
0 0 0 < 0 < 0 < 0 0 0
O) CO LO r- o> co LO r- σ> CQ LO r- o>
CM CO CO CO co co sr YT IO LO IO LO LO
CO co CO CO co co co co co co co co CO CO co co
10 co r- OO σ> o CM co 'T IO co r- OO σ> o
io vo io 10 IO co co co co co co co co CO co r-
Λ LJ o D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04
z v- Ζ τ- Ζ τ- Ζ τ- Z v- Ζ τ- z v- Ζ τ- Ζ τ- Ζ τ- Z v- Ζ τ- Ζ τ- Ζ τ- Ζ τ- Ζ τ-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 132/176
128/161
>-9 θ'· •-9 >.o θ'· v_o •-9 v_o •-9 ^-9 θ'· •-9 ^-9 ^-9 --9 ^-9 --9 *-9
CM CM CO r- CO CO r- CO CM O LO CO
^9 >-9 θ'- ^-9 >-9 θ'· ^9 ^-9 ^9 θ'- ^-9 θ'- >-9 θ'- ^-9 θ'- >-9 θ'- ^9 o^· -9 θ'- ^-9 σ- ^9 θ'- >-9 θ'-
CM CO r- cd O LO CO O σ> LO LO CO CO
CM CM cO cO CD cO CO 1—
Eh Eh EH Eh EH Eh EH EH EH EH EH EH EH Eh EH Eh
to tO to tO 10 to to to tt to to to to to to to
Eh Eh EH Eh EH EH EH EH Eh EH Eh EH EH Eh EH Eh
0 O 0 0 p p 0 0 □ 0 0 0 0 O 0
0 O 0 0 < < < to to to 0 0 0 0 to 0
0 0 0 0 < 0 □ 0 < 0 □ 0 0 O 0
0 0 0 p p 0 0 0 p 0 0 tf < 0 0 □
0 0 < < □ 0 < 0 0 < D < < □
0 p 0 0 0 p □ 0 0 p 0 0 0 p
to to tO 0 0 0 0 0 0 tf to < < < 0 0
0 □ 0 0 0 < 0 0 tf □ 0 0 0 «3«
□ p 0 O 0 0 0 0 tf ·<£ < L5 0 0 tf
D 0 < 0 O 0 0 0 0 0 □ < < Cj
0 0 □ 0 0 tf p 0 0 0 < p 0 tf 0
0 0 D < < tf 0 to tf < 0 0 < Cj to
□ O □ 0 0 0 O □ tf 0 0 0 < 0 p 0
0 0 0 < 0 0 0 to 0 0 0 < to < < 0
0 0 0 0 O < < to 0 0 0 < 0 0 »<«
p 0 0 p 0 0 0 •í 0 0 0 0 o 0 tf
0 to < 0 0 0 to 0 to 0 Ξ) to < 0 tf
□ 0 0 O 0 □ □ □ 0 < < 0 0 < 0
□ 0 □ 0 o 0 0 O 0 0 0 0 0 0 □
CM CO co o CM CO OO O CM CO CO o CM
CO CO CO CO r- r- r- r- r- CO CO CO CO 00 σ> CT)
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO
Eh Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh EH EH
to to to to 10 to 10 to to to to to to to to to
EH Eh EH Eh EH EH EH EH EH EH EH Eh EH Eh EH EH
< 0 <£ 0 < 0 0 tf 0 0 □ 0 0 0 0 <£
□ 0 0 0 < <í 0 to □ 0 0 □ 0
0 O 0 0 0 tf 0 0 < < □ 0 □
·=£ 0 0 0 0 0 o 0 0 0 0 < Q p □
0 0 0 0 < □ □ □ 0 0 0 o 0 0 □
0 0 0 o 0 0 0 0 0 0 □ < to p 0
< < 0 0 0 < tf to 0 0 0 D 0 < 0
0 0 tf o o o 0 tf □ O □ 0 0 □ 0
0 0 tf 0 0 □ 0 0 □ to 0 O 0
0 □ 0 □ 0 0 0 0 0 < o □ o 0
0 0 0 0 u □ o □ to 0 0 0 □
D 0 0 0 0 to 0 0 to tf 0 0 □ 0 to
·<£ 0 0 0 0 0 0 p tf p o p 0 0
0 to to < 0 0 0 < < 0 0 < 0 0 0 tf
□ 0 0 □ O 0 □ 0 0 □ □ < □ O tf
0 0 0 < 0 0 0 0 0 □ p 0 0 tf
0 0 0 0 o 0 < 0 to 0 < □ 0 0 t_5
0 < 0 0 o O D 0 0 0 0 tf o
0 0 0 < 0 0 3 0 0 0 0 □ * 0
cO LO r- σ> cO LO r- CD cO LO r- CD
CO CO CO CO CO r^- r- r- r- 1^- CO CO CO CO CO o>
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO
CM CO sr LO CO r- CO σ> o CM CO LO CO
r^- r- r^- r- Γ-- r^- r- r^- r- CO OO CO CO 00 CO CO
D- 04 X-\ L-J o D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04
Z T- Z -r- Z T- Z -r- Z v- Z T- Z v- Z v- Z T- Z v- Z T- Z T- Z v- Z T- Z v- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 133/176
129/161
o- <· >9 9 o^· *9 o^· >_p o-* V_O o- v-9 o- V_O o- >9 ^9 9 o^· *9 'P o· *9
CO CM r- MT CO <o CO CM CM CM
xP σ'· χΟ *9 o^· xP o^· o^· -9 ^9 σ'· ^9 o^· xP χθ σ'· xP o^· χΡ o^· ^9 o^· ^9 o^· ^9 o^-
<£> O O MT o CD CO LíO CO co O MT CO CD OO
CM UO r- OO CO CM •q· CM CD Τ’
Η Eh Eh EH Eh Eh Eh EH Eh Eh EH Eh
10 10 to to to to to to to to to to to to to
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
U y y U < y Ç) y P t$ y y y U
U y y P 3 y < P y y P u y P
O u u y U < 2 y P y y y < »3* P
Q & y P P 2 P y y u y y 2 <
G> y y y < u 0 P u u P u 0 y
y P u u y y P y u P P y P
u u u □ y y < y P P < u o P
o □ y u y y y y y P P y y u y
y P <í P o P P <£ u P
p y 3 y y P o y 3 3 y y P P
y & y y y 3 y y y y
y & P u u P < y P P < P u
y < y y y D y P P u P P y
o 3 y P y P y P y P y u u y <
o □ y P u y υ u P y y P y
< y P P 2 o y y P u y y P <
t=> p u u 0 y o < y u u u < y u
y y y u < y P y u P u u y <
y y y y y P O y y P y y u y y
•q- <o 00 O CM MT tO OO o CM •<t <D co O CM
06 OO oo O o O O o T— T— CM CM
(O <o <D Γ- r- Γ— r- r- r- r- r— Γ- r- r- r-
Eh EH EH Eh Eh Eh EH EH EH EH EH EH Eh EH
to 10 to to to to to to to to to to to to to
EH EH EH EH Eh EH EH EH EH Eh Eh EH EH EH EH
y u U y O < < y y =C y U U
o u u y P y 3 y P y y y u P
< y y U u y P y y y y P u y
y (4* P P y y y u y < P
y < u »2 P y o y P y u u 3: u
y P y »2 U y < y »3* y Q y P
y P y P U o y 3 y 2 y < y
o y y < P u 2 2 □ P 3 y
y 2 3 < u u y < 2 P 2 y y y u
< Q :=> 3 u u y 0 P P u u < <
y P P P 2 y á p P u y 2
y 3 U y u u Q u y 2 u u y 0
p y y y y y P y 2 2 P y <
y y y o u < y y 0 2 u < y <
y u u u P y o P y y < y y u
y <c «ΐ u < P 2 y u y u u P P
y y y u y P P 0 u u u P P <
y u u P u P P 5! u u < y u 2
y y y y P P y y y u u υ y y
CO tO Γ- oo co LÍ0 r- OO CO 1X0 r- σ>
OO O) O) oo o o o o o CM
to <O <D <O r- r- r- r- r- r- r·— r- r- r- r-
r- 00 CD O CM co uo co r- 00 CD o
00 00 OO CD CD CD CD CD o CD CD CD CD o o
D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 04 D- 05 D- 05
Z T- Z T- Z T- Z <r- Z T- Z V- Z V- Z v- Z T- Z_ T- Z T- Z T- Z v- Z v- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 134/176
130/161
>_o o^· ο^- ^ρ ο-· *-Ρ ο^· >-Ρ ο-· *-Ρ ο^· *-P o-· '-P o^- '-P '-P o^· --P *-P o^· '-P o^· '-P
sr LO CM 'TT o o
o*· ο“· “-p θ'* <5- *-Ρ ο*· *-Ρ ο*· νθ ο*· “-P o*· *-P o- *-P o*· *-P o-· *-P o*· *-P o*· >-P o*·
oo Γ- CO σ> τ— σ> οο co CO O) CM ΤΓ LO co <o
CO 00 CM
E-* Επ Επ ΕΗ Επ Επ ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH
to 01 to ω to ω to to to to to to to to to
E-* ΕΗ Επ ΕΗ ΕΗ Επ ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH
u Ο 0 Ο 3 0 0 0 Ç! 3 3 y
0 υ 0 < 3 Ο < 0 0 < 0 0 0 0 0
0 3 < 3 3 0 0 3 3 0 0 3 3 0 <
o < y * < y 0 0 0 0 < 3 y 3
0 < 0 0 3 < < 0 3 0 0 0 0 0 3
3 3 υ 3 ο 0 < 0 y 0 3 < 0
< < 0 ο Ο 3 0 3 0 < 0 0 3 3
< 0 0 υ 3 3 0 0 •3 0 < < 3 3
3 U < 3 0 0 < 0 tf 0 3 3 3 y 3
< 0 < Ο ο 3 0 0 tf 3 < 3 0 < 0
υ υ 3 3 y 3 < < y 0 0
υ 3 Ο 0 < 0 3 0 < 0 < 0 < < 0
ο Μ! -ΐ 3 ο 3 y 0 0 < y y 0 0
υ < 0 3 3 3 < 3 3 0 < 0 3 tf <
3 υ 3 Ο 3 0 0 0 0 < 0 < < tf 0
0 ο Ο 3 Ο 3 < 0 3 0 0 0 0 tf 3
< 3 0 3 3 0 0 0 0 0 3 3 3 tf <
υ ο 3 < 3 3 < < 0 3 0 0 3 tf 3
ο ο < -3 Ο 3 0 0 3 0 0 0 0 0 3
(Ο CO Ο CM <Ο CO O CM 'sT <D CO O CM
CM CM CM CO CO CO CO co ΤΓ 'T •«T LO LO
r- γ- r- r- C- r- c~ r- r~~ r~ r-
Ε-* ΕΗ ΕΗ ΕΗ ΕΗ ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH EH
to to to 10 to ω to to to to to to to to to
Ε-* ΕΗ ΕΗ ΕΗ ΕΗ ΕΗ EH EH EH EH EH EH EH EH EH
U υ 3 3 U 0 0 < Ç! 0 <
0 0 < 3 < 3 3 3 0 < 0 0 3 <
3 < Ο «3* Ο 0 0 0 0 < < 3 3
y y y tf y 3 0 < 0 0 0 3
< 0 < υ 0 0 0 0 3 0 3 3 3 0
ο 3 υ < tf < 3 < 0 3 y 3 3
υ 0 3 < 0 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0
ο < υ ο 3 υ 3 0 3 0 3 0 3 3 0
ο Ο < < Ο 3 3 0 3 0 y 0 0
3 υ 3 υ 0 3 0 0 3 < 3 0 3 0
< 0 3 ·=£ y y 3 y 3 0 •=C < < Ç!
3 ο Ο 0 < 0 0 3 3 0 3 Ϊ tf
3 3 Ο U y ΛΓ 0 < Q 3 3 < tf
< < 3 0 < 0 0 3 0 0 3 0 < o
Ο 3 0 0 3 3 3 0 < 0 0 0 0 0 <
y 3 Ο 3 3 0 0 Ó! y 0 3 < Q •3
ο < 3 < < 0 0 < < 0 0 < < 0
ο Ο 0 3 •3 0 3 0 0 3 0 0 0 0 0
ο 0 3 0 0 < 0 0 0 0 3 < < 0 0
CO ιο r- σ> CO lo r- σ> CO LO r- CT>
CM CM CM CM CO CO CO co CO vr sr vr to
h- r- r-- r- r-- r- r-- r- r- >- r- r- r-- r- >-
CM CO •«τ ΙΟ <ο r- 00 σ> o CM co •HT LO (£>
Ο ο ο ο ο ο o o τ— τ—
Α 10 LJ ο A LJ ο D- 05 Λ LJ ο D- 05 D- 05 Λ LJ o D- 05 Λ LJ o Λ LJ o D- 05 Λ LJ o D- 05 Λ LJ o D- 05
Ζ τ- Ζ V- Ζ τ- Ζ V- Ζ τ- Ζ τ- Z V- Ζ τ- z Z V- Z -r- Z v- Ζ τ- Ζ τ- Z v-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 135/176
131/161
v_o v_o o^· v_o o*· v_o o^· o^· v_o o^· o^· o^· o^· o^· o^· o^· o^·
o CN o o CO CN CN CO m
v_o v_o o*· v_o o*· v_o v_o >-P v_o >-P >-P >-P >-P
co CN T— σ> CN co r- co o σ> CN CO
•Ν’ CN CN co CN CN CO CO
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
0 3 3 0 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0
3 3 0 0 3 0 < 0 0 0 3 0 0 0 <
3 0 0 3 3 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 3 < L9 3
O 0 0 0 0 < 3 3 < 0 3 0 3 3
O 0 0 0 3 0 0 •í 0 3 3 0 0
0 < 0 0 < 0 0 0 0 í 3 0 0 3 0
O 0 3 < 3 3 0 0 3 lí 0 0 < < 0
3 < 3 0 0 3 3 0 0 0 3 3
0 < 3 0 3 0 0 0 0 0 0 0 3 0 í
3 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0 3 L2 L5
< 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 <
3 0 0 0 0 0 3 0 0 0 < 0 0 0
3 0 3 0 3 0 < lí 0 < 3 0 0
O 3 0 3 0 0 0 lí lí 0 3 3 3 0 0
O 0 0 0 0 3 0 í 3 3 0 0 Q 3
3 0 3 0 0 < 3 0 0 0 0 < 3 0 0
0 3 0 0 3 0 0 0 < 0 < 3 0 0 3
0 0 3 3 < 0 0 < 0 0 3 3 0 <
sr co CO O CN CO CO O CN CO CO o CN
to LO LO co CO co co co p- p— p— r- P- co 00
r-- r- r- r- r- r- r- r- r- r- r- r- 1^ P- r-~
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω tn ω
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
0 0 3 0 0 3 0 0 < 0 3 3
0 < 0 0 < 0 0 0 3 0 3 0 0
< 0 < 0 0 3 < 0 0 0 0 3 0 0
0 0 0 0 < 0 3 0 < L5 L5 0
0 < 0 < 0 0 0 3 3 0 < < 0 0
5 0 5 0 5 0 3 3 3 0 3 0 3 0
0 0 0 0 0 < 0 3 0 0 p 0 0 0
3 < 0 0 0 < 0 0 0 0 0 0 0 0 3
< 0 0 0 0 3 0 1^ 0 0
0 < 0 < 0 0 0 0 0 0 0 lí 0 3
3 3 < 0 0 0 0 0 0 í 3
0 0 < 3 < < 0 0 < 3 0 0 3 3 0
0 3 0 0 3 0 0 0 0 3 ·=£ 0 L5 0
U 0 3 0 0 < 0 3 0 3 0 < 0 0
0 0 0 0 0 3 < < 3 0 < 0 5 3
0 0 < 0 0 0 0 < 0 3 0 í
lí 0 0 < < 0 < 0 0 0 0 0 0 0 0
í < 0 0 0 3 0 0 0 < 0 0 0 3
0 < < 0 0 < 0 < 0 < 0 < 0 0
CO m p- O) CO m p- O) CO to P- O)
ir> ir> ir> ir> CO co co co CO p- p- r- P- P- 00
r- Γ- l~ Γ- Γ- l~ r-~ l~ l~ r~ l~ P' P- P- P-
p— co CT> o CN CO IO co r- co O) o
T— T— T— CN CN CN CN CN CN CN CN CN CN co co
D- 05 X m y ° D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 Λ y o Λ y ° Λ y °
Z v- z v- z v- z v- z v- z v- Z T- z v- Z T- z v- Z T- Z T- z z z
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 136/176
132/161
o*· <> o^· >-P *-2 o*· --2 o*· -2 *-2 o^· >-2 *-2 o*· *-2 o^· >-2 o^· *-2 o^·
04 o o o 04 sr CD co co r- 04 04
o*· -2 o^· ^2 o*· ^2 o^- ^2 ^2 ^2 o*· ^2 o^- ^2
oo σ> 04 t— 04 D> r- •sr t— ST oo o co t—
T— T— T— T— N— 04 T— 04 ST r- OO o ST T— CO
H EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
Co co 0 < p co 0 0 0 0 0 CO Q
Co co 0 < < 0 CO co 0 0 0 CO 0 0
D 3* 0 0 0 0 0 0 0 < < CO o
tf < 0 0 < co 0 0 0 co 0 0 0 tf
Ϊ (J 0 0 co co 0 0 0 0 co < 0 tf
0 p 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Co 0
Co < 0 0 0 Co 0 0 0 0 < Co
< 0 0 < 0 0 co < 0 < < 0 Co 0 0
O p 0 0 CO 0 p 0 0 0 CO 0 p 0
3 0 < CO 0 0 0 0 0 0 0 0 CO 0 CO
0 0 0 0 0 0 0 0 Co 0 0 Co
0 Co 0 0 Co Co Co co 0 0 0 Co í 0
0 0 0 0 Co 0 0 0 0 < 0 0
o 0 0 Co 0 0 0 0 0 0 0 < 0 0
0 0 0 0 < < Co < < 0 0 co CO 0 0
0 0 p 0 0 0 0 0 0 CO 0 0 0
o 0 0 CO < 0 < 0 < 0 0 0 < 0
< Co Co Co < 0 0 Co 0 0 < 0 0
< 0 0 Co 0 0 Co 0 0 0 0 co Co
st CD 00 O 04 st CD 00 o 04 ST CD 00 o 04
co 00 co co σ> o D) σ> o O o o o T— T—
r- r- r- r- r- r- r- r- oo 00 00 co 00 oo 00
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
co 0 0 p 0 0 0 0 Co 0 0 <
Co Co Co í < CO 0 0 0 0 Co 0 0
0 C0 0 0 í Co 0 co 0 Co 0 0 0 Co 0
0 0 < Co 0 0 0 0 0 0 0 Q 0 0
0 0 0 0 CO CO < CO CO 0 0 < < 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 p 0 CO 0
0 0 0 0 < Co 0 0 0 0 Co 0 0 0 Co
co 0 < 0 0 < < 0 0 0 < Co 0
0 Co 0 0 0 0 0 0 0 0 co 0 Co
0 Co 0 0 0 0 0 0 0 0 < 0
0 0 0 < Co 0 < 0 0 0 rf 0 0
□ 0 0 D 0 0 < CO 0 CO CO 0 < 0 0
< Co 0 0 co 0 Co co 0 0 Q 0 Co
0 < 0 0 0 Co 0 0 0 0 0 0 < Co 0
co 0 Co 0 0 0 0 0 0 Co 0 Co
co Co Co 0 0 p tf 0 0 0 0 0 Co
tf Co 0 Co 0 0 (J 0 0 0 Co co < Co
tf < 0 CO CO CO 0 < < 0 0 0 tf 0 0
* < 0 0 CO < < 0 0 0 0 0 0 CO
co ID r- D) co LD r- D) CO LD r- D)
co OO OO OO o o σ> O> σ> O o O o O T—
r- r- r- r- r- r- r- r- r- CO co 00 00 OO co
04 CO st LD CD r- oo O) o 04 co st LD <D
00 OO CO OO 00 00 00 OO , •sr sr ST ST sT ST ST
D- 05 D- 05 D- 05 ID- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 X LJ o D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05
Z v- z v- z v- Z v- Z v- Z v- z v- z v- Z v- Z v- Z T- z z Z v-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 137/176
133/161
10% 14% 15% 4% 1% 2% 1% 2% -P o5· CM 8% 7% 9% 4% -P o*· C\| 2%
cF- --P cF- xP o*· -p cF- xP cF- xP cF- xP cF- χθ cF- -p cF- xP cF- xP cF- xP cF- χθ cF- χθ cF-
co -7Γ co CM co co σ> OO O r- co CM LO LO
'T o r- CM CM T— T— T— CM o T— CM LO T— T—
Eh EH EH Eh EH EH EH EH Eh EH EH EH EH Eh EH
ω tn UI ω U) U) U) U) ω U) U) ü) ui tn tn
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
3 y 0 0 0 0 p
0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 < 0 <
0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 < 0 < 3
=£ < 0 0 3 3 < p < 3 p p tf
0 0 3 tf 0 3 0 3 0 < 0 0 < 0 tf
ÇJ 0 y tf y 0 0 0 < 0 p p tf
< 0 0 (J < < 0 3 0 < 3 0 0 < 0
< 0 3 3 0 3 0 0 3 0 < 0 0 0
p 0 -ΐ 3 0 3 y tf y 0 0
0 0 0 0 0 3 0 tf 0 0 3 0 0 0
tf 0 0 y 0 3 tf < < 3
0 Q 3 0 0 0 tf 0 0 < 0 3 3 0 0
p < < tf y 0 p 7 0
0 0 0 0 < 3 (J o < 3 < O 3 < 0
0 < 0 0 0 3 0 3 0 < 3 0 < <
p y < 3 3 y 3 < 0 p 0 y y 0 0
< < 0 0 0 < 0 0 0 0 0 < < 3 3
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3
0 0 0 0 3 < < 3 3 0 0 0 < 3 3
-7Γ co 00 O CM CO 00 O CM co 00 O CM
— T— CM CM CM CM CM co CO CO CO co •'T
CO co OO OO CO co CO CO OO co co co co OO oo
Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
ω UI UI ω ω ω UI UI ω ω ω UI UI tn tn
Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
7 7 y =£ 3 3 < < 0 0 y 3 tf
0 0 o 0 0 0 0 0 0 0 0 o 0 0 tf
3 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 3 3 < tf
0 3 «£ p y < y 0 0 0 0
0 3 0 0 0 < 0 < 0 3 < 0 3 3 3
y 0 0 0 3 < 0 y 3 p 0 3 0
3 0 3 0 3 0 0 0 0 0 0 0
u 0 < 0 0 0 3 0 0 3 0 < < 0 0
3 3 0 p 0 3 0 3 p 3 3 <
0 3 0 0 0 0 tf u 3 0 0 < 0 0 0
< 0 3 p y tf 0 p y 0 3 p 3
3 3 0 < < 0 tf 0 0 < 0 3 0 0 0
ρ 0 y 0 3 3 0 0 3 0 y p 0
0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 0 < < 3
0 0 < 3 0 »4* 0 < 0 3 0 0 3 0 3
3 3 p 0 0 tf < p 0 3 < < p
0 0 0 0 3 o 0 0 0 0 3 0 3 <
0 0 0 0 < 0 0 0 0 3 0 0 3 0 3
3 3 < 0 0 0 0 0 3 0 3 3 3 3 <
CO LO r- O) CO LO r- O) CO LO r- O)
τ— T— T— T— CM CM CM CM CM CO CO CO CO CO •«T
co co 00 00 CO CO CO 00 00 co co co 00 co CO
r- co σ> o CM CO •«T LO co r- co σ> o
, -TT , -sT LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO co co
Q lo o Λ 10 y o Λ y o y ° D- 05 Λ 10 y ° D- 05 D- 05 Λ 10 y ° D- 05 D- 05 Λ 10 y ° A 10 y ° D- 05 D- 05
~z. Z V- Z v- Z τ- Z -r- Z τ- Z v- Z V- Z τ- Z -r- z v- Z V- Z v- Z τ- Z τ-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 138/176
134/161
-9 o^· ^9 ^9 o^· ^9 9 -9 o^· 9 ^9 o^· ^9 ^9 o*· -9 o^· 9 ^9 o^· ^9 ^9 o*·
CM CM tn CO MT CO tn
-9 o^· 9 *9 o^· ^9 ^9 o^· ^9 o^· 9 ^9 o^· ^9 *9 o^· ^9 o^· 9 -9 o^· ^9 *9 o^·
MT o IX- Γ—- MT CO <J> CO τ— CM CO o r- τ—
CM (O oo co CM CM co r-
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
P y y P y < y P y y y < ^2
P y u d y P y u P u y y y 3 <
y P P < 2 < u < < < < y y P P
P y 2 P y P P y y <
y y y P 0 2 < < u y < < d P
y y P y y 2 2 y y y P y u y P
< y y y 0 P y < y u u P y u
P < u y y < < P P y P y y y
3 y y < y y u < y y P <
d y o d y < y o y P o y y d
y u y P y P P y o y y P y
P P o 3 y < < y u y y y d P
P y y y 2 y y P y y y y u
y y 3 o y 2 o < < y < u P u
y y 3 u P P < y y y u P y y 2
y y y y y y < P P P y < y 2
< < < < d y P < P P o P P 0
3 y y y y < P u y < P y y P P
P y y P P P < y y P < < y u y
MT <£> co o CM MT tn co o CM MT tn oo o CM
MT MT MT tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn r- r-
00 CO co co co co co co co co co co oo co co
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
< y u < P y u < P P y y
P o u d y P < y y P 2 y y <
P P P P P y u < P 2 2 u < 3 y
u y u y y P y P 2 2 P y P
u u P y < < P u d 0 0 < y u P
u y P y y P y P P P y P y Q
P < u y y P o y < u u y P d o
< 3 u P y P P P y y u y y y <
y y y P < y < u y u P u
y < u u d u P d u y < u y u u
P P u y P u y u y y P Q P
< P P y y u P P < < y < o y u
P y y P y y < y P y y y
y u < y y P P o y y u y y <
y y y y P P P P y y P P y 3
P P P 3 P u P < y < < y Q P P
y < < ÍO P P y P P P P y y <
< u y y u < u y y u u y P P
3 y P P y 3 y P y < y y y P y
CO o Γ—- σ> co tn Γ—- CT> CO tn Γ- σ>
MT q- MT MT tn tn tn tn tn tn tn tn tn <r> r-
00 co CO CO co 00 co co co co co co oo co co
CM co MT tn o r- co σ> o CM CO 'T m tn
tn tn tn tn (O <D tn tn r- r- r- r- r- r- r-
X tn LJ o X tn LJ o x 10 LJ O X tn LJ o X 10 LJ o X tn LJ o X 1/71 LJ o X 10 LJ o Λ LJ o X tn LJ o Λ LJ O Λ LJ o D- 05 X tn LJ o X tn LJ o
z Z V- Z v- Z v- Z v- Z v- Z Z τ- Z v- Z v- Z v- Z Z H- Z v- Z v-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 139/176
135/161
--2 o^· 00 3% ^-2 σ- <O 1% 3% 3% 10% 5% --2 o^· CM 1% 2% 2% 8% 10% 10%
*-2 o^· ^-2 o^· *-2 *-2 o^· *-2 o^· V_O o*· v_o θ'*· v_o θ'*· *-2 o^· *-2 o^· *-2 o^· *-2 o^· >-P o*· V_O o*· V-P o*·
C4 CO CT CO o 04 04 04 LD r- T— sr oo CO
sr 04 04 04 04 04 sr LD
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Fh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
< CO 0 CO 0 0 p 0 y y
Co 0 < co 0 0 Co 0 0 3 0 0 0 0 <
< u 0 0 0 0 0 0 Co 3 0 0 Co < Co
Co < 0 Co 0 < 0 0 p 0 Co 3 0
Co < 0 Co < Co 0 Co 0 0 Co Co 0 D 0
y 0 0 CO CO CO p < p y CO 0 0 y
0 co < co 0 Co 0 0 < 0 0 Co 0
< 0 0 Co 0 0 0 < 0 0 0 Co 0 3 <
< tf 0 0 y y 0 co Co Co 0 Co Co
0 < tf Co 0 0 0 0 0 0 CO CO 0 0 0
C0 0 tf 0 0 0 0 0 p 0 0 y CO
u < 0 0 < 0 0 0 < 0 0 0 tf 0 0
y 0 Co y 0 Co y Co Co < y tf Co 0
0 0 < Co 0 0 < Co co 3 0 tf co Co
< < 0 0 0 0 < Co 0 0 0 < 0 tf 0
() 0 Co CO 0 Co CO CO 0 0 0 0 tf p
Co Co Co Co Co Co Co 0 0 0 Co Co 0 0
tn 0 0 0 CO 0 0 < < CO 0 0 0 0
< Co Co 0 < < 0 0 co 0 Co 0 0 0
sr <£> OO O 04 sr CD OO O C4 sr CD CO O 04
r- r- r— oo CO co OO oo CT CT CT CT CT O O
00 00 00 00 CO oo CO co 00 00 co 00 oo CT CT
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
Co < Co 0 Co p 0 0 < y y 0 0
11 0 0 0 3 0 0 CO CO 3 0 CO 0 0 0
< < tf tf tf < 0 0 0 < Co 0 0
tn 0 tf tf tf 3 p y 0 0 Co
co Co 0 0 0 0 p 3 0 0 0 Co 0 Co 0
Co 0 y Co 0 y Co < < Co y Co <
0 0 < 0 0 < 0 0 3 3 CO 0 CO 3 0
0 Co 0 0 Co 0 0 0 Co 0 0 0 Co 0 0
< 0 Co y y Co y 0 y y tf y 0 0
0 Co Co < o 0 0 0 0 0 tf 0 0 0
t) Co Co y 0 0 Co 0 0 tf tf 0 < <
CO 0 0 < 0 0 0 CO 0 o (3 tf 0 CO CO
y < Co Co < y 0 p y 0 CO y
0 0 0 Co 3 3 Co < 0 3 0 0 0
< Co 0 tf Co 0 0 0 tf 3 0 < 0
•3 Co 0 tf 0 p 0 0 0 tf Co p Co 0
D 0 0 0 0 0 0 0 3 CO (J 0 < CO <
< 0 Co 0 0 < 0 0 Co 0 0 0 0 Co
CO < 0 3 CO 0 0 < 0 0 0 CO 0 CO 0
co ID r- ct CO ID r- CT CO ID r-- CT
r- r- r- r- oo co OO oo OO CT CT CT CT CT O
oo oo oo oo co oo OO oo OO OO OO OO CO OO CT
r- oo ct o 04 CO LD CD r- OO CT O
r- r- r- oo co OO oo co OO OO oo 0O OO CT CT
Q LO o D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05
Z T- z v- Z T- Z T- Z V- Z v- Z V- Z V- Z T- Z T- Z T- Z T- Z V- Z v-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 140/176
136/161
o^· o^· o^· o^· -_o o-· o^· -_o o-· *-9 o^· -_o >-9 o-· *-9 o^· *-9 σ’·
10 o IO o co 'sT CO CN
v_o o*· *-9 o*· o-· v_o o*· *-P o*· o-· n? o*· *-P o*· s_o o-· *-P o*· *-P s_p o-· *-9 o*· -9 o*· ^P o-·
'TT ΥΓ IO co o t— co OO CN r- co T— co IO
co vr σ> CN OO CN CN
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
q < •cg 3 0 0 0 q 0 0 •Cg 0 0 3
< 0 0 0 0 < 0 3 0 0 3 3 <
0 3 < < 3 0 < 3 3 < 3 3 0 3
< 0 0 0 q 0 0 •=g < 0 q q q q 3
3 3 3 3 < < 3 0 0 0 0 0
0 3 3 =g 0 0 0 0 < 3 0 3 í í 0
0 0 0 0 0 3 0 < 0 0 < 0 o CD <
0 0 0 3 0 0 0 0 < 3 < 0 < 0
0 0 q q 0 3 0 3 í 0 0 0 3 0
0 < < 0 0 0 3 0 0 0 < 0 3
3 0 í < 3 q 0 q 0 0 q 0
< 0 0 0 < 0 0 0 0 3 0 0 3 0 0
3 0 0 3 =g 0 q <g 0 0 <
0 0 0 0 < 0 3 0 3 0 0 0 3 0 <
0 3 0 0 0 3 < 0 0 0 3 0 0
0 0 0 q 3 q 3 0 q 3 q 0 0 3
0 3 3 < < < 0 3 < 0 0 3 0 0
< 0 0 0 0 0 0 < 0 3 0 3 0 <
0 3 3 < 0 < 0 0 0 0 0 0 0 0
NT <O OO O CN CO OO O CN co OO O CN
O o O T— T— CN CN CN CN CN CO CO
σ> σ> o> σ> σ> σ> σ> σ> o> O σ> o> O) O) o>
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
0 < < 3 0 3 0 0 0 0 q q 0 0 3
3 0 0 0 0 0 3 0 3 0 < 0 0 3
0 < < 3 3 3 3 0 < 3 0 0 3 0 0
0 q 0 3 0 < 0 0 0 0 0 q Cg
0 < 0 0 0 < 3 3 3 0 0 0 »4* 0 0
0 0 0 0 3 0 < 0 < 0 0 0 í 0 3
< 3 3 0 0 3 3 3 0 0 3 3 Çj 0 3
3 0 0 0 3 0 0 0 0 < 0 0 < 0 0
0 3 0 3 <£ 3 3 0 0 0 0 0 q
0 3 3 3 0 0 0 < 0 0 0 3 0 3 <
3 0 0 0 0 q «í 0 < 3 q 0 0 0
0 0 0 < 0 0 0 0 3 3 < 3 0 3 0
0 0 0 0 0 < q 3 0 q 3 0 0 0 3
0 < 3 0 0 0 0 3 < 0 < 3 3 0
< < 3 3 < 0 0 0 3 0 3 3 0
3 q 0 0 0 <5 0 3 3 0 0 0 0 0 <
0 < 3 3 < 0 3 < 3 < < 0 3 <
3 3 0 3 0 0 0 3 0 < 0 0 < 3
0 3 3 < 3 0 0 0 0 0 0 3 0 0 <
CO LO r- o> CO in Γ- CD CO IO r- O)
o O o o t— T— t— T— CN CN CN CN CN CO
σ> CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD
CN CO sr m CO r- OO σ> O CN CO xr IO <O
o> CT> o> o> σ> O) σ> σ> O O O o o O O
D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 05 D- 06 90 -a D- 06 D- 06 90 -a D- 06 90 -a
Z T- Z v- Z v- Z T- z Z v- Z T- Z T- Z v- z ·=- Z T- Z v- z ·=- Z T- Z V-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 141/176
137/161
θ'- -o o- V-P θ'- v_o θ'- '-P θ'- *-P θ'· V-P θ'- V-P θ'- '-P θ'- '-P θ'- v-P o- V-P θ'- '-P θ'- '-P θ'- v-P o-
oo o CM co o o co 00 co
v_o θ'- -_o σ'- -o o· '-P θ'· v_o θ'- -_o σ'- -o o-· V-P θ'- v_o θ'- v-P σ'- V-P θ'- v·? θ'- *-P θ'- v-P σ'- V-P σ'-
LO CO CM CO -3- CM CM r- CM CD LO CM CO co CO
CO lo CN LO r- co CM CM
Eh Eh Eh EH Eh EH Eh EH Eh EH EH EH EH EH
to to 10 ω to to m ω to ω to ω to ω to
Eh Eh EH EH Eh EH EH Eh EH Eh EH EH Eh
0 0 p 0 0 0 £3 0 0 0 £3 p 0 £3
£3 < < £3 £3 0 u £3 0 £3 0 < £3 £3
0 £3 3 0 £3 < £3 £3 0 < 0 £3 0 0 0
0 0 £3 0 0 £3 0 0 £3 0 □ <
< £3 0 u < £3 £3 £3 0 < 0 0 0 0 £3
0 £3 £3 0 0 0 0 £3 £3 0 0 0 0
0 < 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 £3
< 0 3 0 0 0 0 0 £3 0 0 0 0 0
D U 0 D 0 £3 0 0 0 0 0 0
to 0 < 0 3 £3 < 0 £3 < 0 < 0 0
0 £3 0 0 o 0 0 0 D < £3 tf <
< 0 £3 0 o 0 £3 £3 0 0 £3 £3 tf t_5 £3
0 0 £3 0 0 0 0 0 £3 0 tf £3
£3 0 0 0 < £3 £3 £3 £3 £3 0 < 0 0 0
0 < £3 0 0 £3 £3 £3 0 0 < £3 0 <
0 0 O << 0 £3 0 £3 0 D £3 £3 0
£3 £3 0 0 £3 0 0 £3 0 0 £3 £3 o 0 0
< £3 £3 0 0 < £3 0 0 D o 0 0 0
0 0 O 0 0 3 0 £3 < < 0 0 o 0 <
'T CO 00 O CM vr CD co O CM 3- CD OO O CM
co co co 3- 3- 3- 3- LD LD LD D D CO co
σ> CD CD CD σ> CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD
Eh EH EH EH Eh EH EH EH Eh EH EH EH H EH EH
to to 10 to to to to to to to to to to to to
EH Eh EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
0 o < 0 0 £3 0 p p 0 <2 0 ^2 £3
£3 < 3 0 0 £3 < u 0 < tf o £3 o 0
< 3 0 0 < 0 0 tf 0 0 tf tf 0 0 0
0 0 £3 0 tf 0 tf 0 tf tf 0 £3 0
0 £3 3 0 0 tf 3 tf 0 0 £3 tf £3 0 £3
0 y 0 £3 tf 3 tf 0 p 0 0
U 0 £3 0 o tO 0 U 0 < 0 £3 £3
£3 0 3 0 0 0 < 0 0 3 < £3 0 3
0 o 0 0 0 0 0 p < to 3 0 D to
< 0 £3 0 £3 £3 o < £3 0 to 0 £3 0
< 0 0 £3 tf 0 0 0 0 ^2 0 0 to
£3 £3 0 £3 0 0 0 u 0 < o o 0 0 0
0 £3 0 p 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ><
0 < < 0 0 0 0 3 < 0 0 0 £3 0 0
£3 3 0 0 £3 < «a* 3 0 £3 0 0 0 0 <
y O £3 0 0 tf p 0 0 «£ 0 D o
0 3 £3 0 3 £3 tf 0 £3 0 0 0 0
£3 3 £3 £3 3 < 0 0 0 < 0 £3 < <
0 0 0 0 0 £3 0 0 0 0 3
co LD r- CD CO lo r- CD CO LO r-- CD
CO CO co CO sr 3- 3 3 3- LO LO LO LO LO co
CD cd σ> σ> σ> σ> CD CD CD CD CD CD CD CD CD
r- oo σ> o CM co LO CO r- 00 CD O
o o ο T— •τ— 3— 3— 3— 3— T— CM CM
90 -a 90 -a D- 06 90 -a 90 -a D- 06 D- 06 90 -a 90 -a D- 06 D- 06 D- 06 90 -a D- 06 90 -a
Z T- Z T- Z T- Z T- Z r- Z T- Z T- z v- Z r- Z T- Z T- z Z r- Z T- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 142/176
138/161
nP no o^· Np nP no o^· nP o^· nP no o^· nP o^· nP no nP o^· -9 o^· -9 -9 o^·
CM CM o LD CM Ν’ o
n$ o^· nP o^· -9 c> nP o^· nP o^· -9 o^· nP o^· nP o^· >-P θ' o^· -9 o^· Np θ' -9 o^· -9 o^· Np O*“
oo ’ζ— CD CD oo CD CM Ν’ o oo o LD Ν’ τ— r-
σ> Ν’ r- CM co Ν’ CM CO
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω 01 01
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
0 y a 3 3 a 0 y 0 0 a 0 3
0 0 0 a < < 0 a 0 a 0
< 0 0 a 0 0 0 0 0 •í 0 a < a
y 0 y 3 0 a 3 0 a 0 0 3 a 3
0 3 < < 0 0 a a a 0 0 a 0
y 0 < 0 < a 0 a a Q 0
0 0 0 a 0 a 0 0 0 a 0 a 0 a
0 < < 0 0 < 0 0 0 a 0 a < a a
3 a a 0 a 0 0 a 0 < 0 0 0
< 0 a 0 < 0 0 a a 0 JZ> 0 0
y 0 < y 0 0 0 a a 3 0 a 0 3 y
0 a 0 0 0 a 0 a 0 a 0 a 0 <
0 3 < < ·=£ «: 0 0 a 0 0 Q a 3
< 3 a a 0 0 0 0 a a a < 0 a 0
3 a 0 a 0 a 0 a a 0 a 0 a a
y 0 y 0 3 0 a < 3 =£ a 0 3 0
0 < 0 a 0 a 0 a < 0 0 0 0 0 0
0 0 < 0 a 0 0 0 0 0 0 a a a 0
0 0 0 0 a 0 < 0 0 0 a 0 a 0 a
Ν’ CD CO O CM Ν’ CD oo O CM CD co o CM
CD CD CD r- r- r- h- r- 00 OO oo OO oo o CD
σ> CD σ> cd CD CD cd σ> CD σ> CD CD CD CD CD
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω 01 01 01 01
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
o y 0 y a 0 0 0 0 y
u 0 a 0 < 0 0 0 0 0 0 < < < 0
u 3 0 < 0 < 0 < a 0 0 0 0 0 0
0 y 0 0 0 ·< a a y 3 y
< 0 < 0 < 0 tf tf 0 < 0 tf <
3 tf •3 < 0 0 0 0 tf tf a 0 tf y
0 tf a a a a 0 0 0 0 0 <
3 0 < 0 0 0 < 0 0 < 0 < 0 a
0 0 a 0 0 0 0 tf < y < y =£ Q
3 3 0 < 0 a a 0 0 Ϊ < 0 0 0
< < 0 0 y 0 0 3 y a 0
0 3 a 0 0 a 0 0 0 < 0 < a < tf
0 0 y < 0 0 y 0 0 < 0 tf
3 3 0 0 a 0 a a 0 tf a < 0 0
0 < a a a a 0 0 < »4* 0 0 < 0
0 0 y 0 < y y tf 0 y < <
3 0 0 0 0 0 0 0 a 0 < D <
< 0 a 0 0 a < a a 0 a < 0 < 0
0 0 < < < 0 0 a 0 0 0 <
CO LD r- σ> CO LD r~ CO CO LD r- D)
CD CD CD CD Γ- |x- r·— r- Γ- co oo CO co OO CD
D) CD CD D) CD σ> D) CD σ> D) CD CD CD CD CD
CM CO Ν’ LD CD co σ> o CM CO Ν’ LD CD
CM CM CM CM CM CM CM CM CO CO CO CO CO CO CO
LJ o x ° LJ o X CD LJ O X CD LJ o Λ ° LJ o 90 -a X CD LJ o D- 06 90 -a X CD LJ o D- 06 X CD LJ O X CD LJ o Λ ° LJ o X CD LJ O
Z V- Z v- Z v- Ζ τ- Z v- Z v- Ζ τ- z v- Z v- Ζ τ- z v- Z v- Ζ τ- Z Z v-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 143/176
139/161
'-P σ' sO ©*- '-P σ'· '-P σ'· '-P o^· '-P o^- '-P σ'- '-P σ'- '-P σ' '-P σ'- '-P σ'· *-P σ' '-P o^· '-P σ'· '-P σ'·
CM CM co CO CO CM CO r- to LO LO
•-P •-P '-P '-P '-P '-P o^- '-P o^· '-P o^· '-P o^· '-P σ- '-P σ- •-P σ- •-P '-P '-P
co LO •«r tO Γ—- r- CO 00 o o o o tO co
CM CM co CO 00 LO 7Γ LO to
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH Eh EH EH EH EH EH EH EH
0 0 3 0 3 3 0 0 0 3 0 0 0
0 3 3 0 0 3 0 3 tf 0 3 0 0 3 3
0 0 0 3 3 0 0 3 tf 3 0 0 3 0 3
3 0 3 0 3 3 3 0 0 3 3 3 0 <5 0
u 0 3 0 0 3 3 0 3 0 0 3 0 3 0
0 0 0 3 3 0 3 3 0 0 0 0 0 0
0 3 0 0 0 0 0 0 3 3 0 3 3 3 0
3 0 0 3 0 0 0 3 0 3 3 3 0 0 3
0 0 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 3 3
0 0 0 tf 3 0 3 3 3 3 3 3 0 0 0
0 0 tf 3 3 0 3 0 0 0 3 0 <5 3
0 3 3 tf 0 0 3 0 3 0 3 0 3 3 0
< 3 0 0 0 3 0 3 3 0 3 0 0 0 0
3 0 3 3 0 3 0 0 0 3 3 3 0 0 0
3 0 0 0 3 3 0 3 3 0 0 0 3 3 3
3 0 3 0 3 3 3 0 3 3 3 3 3 3 0
0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 3 0 0 ίζι 3
0 3 3 3 0 0 0 3 3 3 0 3 0 0 3
0 3 0 0 3 3 0 0 0 3 0 0 3 3 0
to OO O CM tO co o CM sr to OO o CM
σ> CT> CT> o O o O o T— τ— T— T— CM CM
σ> σ> σ> o O o o o o o o o o O O
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
0 3 0 <5 3 3 0 0 0 3 0 0 3 3 0
0 3 3 3 0 0 0 3 3 3 0 3 0 0 3
0 0 0 3 «4* 0 0 0 0 0 3 0 0 3 3
3 0 3 0 tf 3 3 0 3 3 3 3 3 3 0
3 0 0 0 tf 3 0 3 3 0 0 0 3 3 3
3 0 3 < 0 3 0 0 0 3 3 3 0
3 3 0 d 0 3 0 3 3 0 3 0 0 0 0
0 3 3 3 0 0 3 0 3 0 3 0 3 3 0
0 0 0 3 3 3 0 3 0 0 0 3 0 0 3
0 0 0 3 3 0 3 3 3 3 3 3 0 0 0
0 0 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 3 3 0
3 0 0 3 0 0 0 3 0 3 3 3 0 0 3
0 3 0 0 <5 0 0 0 3 3 0 3 3 3 0
0 0 0 0 3 tf 0 3 3 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 tf 0 3 0 0 3 0 3 0
3 0 tf 0 3 tf tf 0 0 3 3 3 0 0 0
0 0 0 3 3 0 0 3 3 3 0 0 3 0 3
0 3 3 0 0 3 0 3 3 0 3 0 0 3 3
0 0 3 0 0 3 3 0 3 0 0 3 0 0 0
co LO 1- σ> CO LO Γ- σ>
o o o O o T- τ— CM
CD Q> CD CD o o o o o o o o o o O
r- 00 CT> o CM co LO o r- 00 σ> o
co co CO , sr . sr . 7Γ . zr LO LO
X <£> LJ O X <£> y o 90 a 90 a x LJ O X tO LJ O X to y ° D- 06 D- 06 90 -a ID- 06 90 -a 90 -ai 90 -a 90 -a
Z v- z v- Ζ τ- Ζ τ- z v- Z v- Z V- Z v- Z v- Z V- Z V- z v- Ζ τ- Ζ τ-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 144/176
140/161
s_o o*· >p o^· '-P θ'- c> o^· '-P c> •-P σ' xP o^· '-P '-P vO o- '-P o^· ·-? c> '-P c>
lo CM CM CO CO CM CM CM CM
>P <· <· >P >P >P >P '-P '-P >P '-P '-P '-P
CO 00 OO r- r- O 'T CO CO O 140 vr 140 140 LO
CM CM CO co CM CM ST CM
E-» EH Eh Eh EH Eh EH Eh EH Eh EH Eh Eh EH EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
Eh EH Eh Eh EH EH EH EH EH Eh EH EH EH EH
0 P a 0 P 0 0 0 ·=£ 0 0 Q 0 <
0 o a a a 0 0 < 0 < 0 a o 0 3
P 0 0 0 0 P P P 0 P 0 0 0 0
0 a 0 0 a 0 tf 0 a a < a
P a 0 < 0 0 a 0 tf a a 0 3 0 0
0 < 0 a 0 0 tf 0 a 0 9 a
0 3 3 0 0 0 0 tf < a o o 0
0 5! 0 0 0 0 a 0 a 3 0 0 0 P
0 9 0 a < 9 0 0 P =£ 9
0 0 0 < a 0 0 0 0 0 a < P 0 0
ΐ 0 0 0 0 a a < 0 0 a
< 0 0 tf 0 0 a a 3 0 0 0 < 0 a
0 a tf 0 0 0 0 0 a a 0 a 0 0
< a 0 tf < a o 0 0 0 0 0 a 0
0 a P 0 0 P 0 P P < P 0 0
0 u a a 0 a 0 0 0 0 0 a
< a 0 0 0 a 0 0 0 0 0 < < 0
0 P 0 0 0 < 0 a < 0 0 0 P
0 0 3 a a 0 3 0 0 0 0 < 0 <
sr <O oo o CM <O CO o CM sr <£> 00 O CM
CM CM CM CO CO CO CO co 140 LO
O O O o O o o o O o O O O O O
Eh Eh Eh Eh Eh EH EH EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
EH EH Eh Eh EH EH EH EH EH Eh EH EH Eh EH EH
0 0 a 0 a 0 0 0 P a 0 a
0 3 a 0 0 0 a 0 a 0 a 0 0 <
P 3 0 0 0 0 0 0 0 0 P P P 0
9 0 a < 0 a a 0 0 0 0 <
0 tf < 0 0 < 0 a < < a a < 0 0
a tf 0 a a a < 0 0 0 ΐ
0 o < a 0 0 0 0 0 < < 0 < 0 0
a 0 0 a 0 0 < P 0 0 0 P 0
0 a 0 0 9 9 tf a < a 0 0 0 tf
0 0 0 a < 0 0 0 0 0 < a tf 0 Q
a 0 a 0 0 a a 0 0 0 tf a 0
0 a 0 0 0 a 0 < 0 < a 0 0 0 <
0 a a 0 a 0 0 0 a a a 0 0 0
a 0 a 0 O 0 a a 0 tf 0 0 0
< 0 a 0 0 <0* 0 P < tf 0 P 0 0
tf 0 0 0 9 tf a 0 tf a a
< 0 0 0 0 < tf < a 0 itf 0 0 0 0
0 0 < < < 0 0 a 0 a 0 0 0 P
0 < 0 3 0 0 0 a 0 0 0 0 0 a
CO LO r- CO CO 140 r- σ> co 140 r- σ>
CM CM CM CM co co CO co co sr LO
o o o o o o o o o o o o o o o
CM CO LO <o r- 00 σ> o CM CO •«r LO co
LO 140 LO 140 140 140 140 140 co co CO CO CO CO co
D- 06 D- 06 D- 06 90 -Q D- 06 D- 06 D- 06 90 -Q D- 06 90 -Q 90 -Q D- 06 D- 06 D- 06 Λ ° L_J o
Z v- Z T- Z v- Z V- Z T- Z v- Z v- Z T- Z v- Z V- Z v- Z T- Z v- Z T- Z -r-
Legenda da Tabela abaixo:
2a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 145/176
141/161 õ*· m
co
Eh ω
EH
P
P o
eí o
sr
LD
O
Eh ω
Eh o
<
o §
o o
<
o o
<
o co uo o
r~ <o <£>
o
SD --P CM 1% 2% ST '-P CO 1% --P zr 1%
2nd screen single dose @ 50 nM in H441; MV 16% 17% 24% 27% 61% 18% 60% 18%
θ'* zr '-p ΖΓ 3% CO '-p CM %9 -P CM -P CM 5% 3%
19% 23% 18% 33% 29% 63% 94% 20% 66% 15%
GCGUUCACAAAAGUAAUGGTs T CAUCAGCUACUGUUCUUGGTsT GGUGUGAGAAACCUCUCCUTsT UUGCUCCAAGCAGGAUGAUTsT AGCGUCUGCUCUGUGAUGCTsT AGGGUGGAGGCUACCUCCUTsT GCCGUCUUCAUGCGGUUGUTsT CAGAAGGCCGUCUUCAUGCTsT GGAGGGUGACCAUCGUGACTs T UAAUGGUGUCUGAGCAGGGTs T
1056 1058 1060 1062 1064 1066 1068 1070 1072 1074
CCAUUACUUUUGUGAACGCTsT CCAAGAACAGUAGCUGAUGTs T AGGAGAGGUUUCUCACACCTs T AUCAUCCUGCUUGGAGCAATsT GCAUCACAGAGCAGACGCUTs T AGGAGGUAGCCUCCACCCUTs T ACAACCGCAUGAAGACGGCTs T GCAU GAAGACGGCC UU C UGT S T GUCACGAUGGUCACCCUCCTsT CCCUGCUCAGACACCAUUATsT
1055 1057 1059 1061 1063 1065 1067 1069 1071 1073
ND- 10668 ND- 10669 ND- 10670 ND- 10671 ND- 10672 ND- 10673 ND- 10674 ND- 10675 ND- 10676 ND- 10677
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 146/176
142/161
.O θ'- '-P θ'- ,ο -P θ'- -P ©- θ'-
IO CN CM OO CM
θ'- -P •-P vo --P θ' '-P θ'- •-P
O T— r- O r- co O
r·- CN r- CO CN oo LO
•^P --P θ'- -P θ'- --P θ'- vo o- --P θ'- '-P θ'- o- •-P θ'- '-P θ'- o-
co CO CN OO r- LO OO CM τ— xr O0 CM
CM
'-P v_o '-P θ' ^P θ' *-P θ'· θ'- v_o θ'- '-P σ' 0^ '-P '-P σ' 0^ '-P
o O 00 00 σ> Γ-- CM 00 Γ-- — LO 00 CO
00 CN 00 oo CM σ> ÍT> CN CM Lf>
A A A A A A A Ai A A A A A
tn tn tn tn tn tn tn tn i tn tn tn tn tn
A A A A A A A Ai A A A A A
ΐ < 0 y 0 < 0 0 2 0 y <
0 0 0 2 o 0 0 2' 2 0 2 <
□ □ □ < tf □ < 0' 0 0 U 0 u
0 5 y 0 tf < 0 0 0 y y < y
0 0 0 0 tf 2 0 2' 0 < 0 3 0
2 0 □ y u y 2 0 < 2 0 0 2
< 0 0 □ < < 0 2 0 2 0 <
u 0 0 0 0 u u 0 U 2 0 2 U
y 2 < < 2 y < < 2 y 0 y 2
2 2 0 2 < 0 2' 0 0 0 <
0 0 0 u < 0' 0 0 tf y
□ < 0 0 0 < 3 2 < 0 0 0 <
y 0 2 < □ y y 0 y 0 < 2
0 u U 0 □ 0 0 0 < 0 2 < 0
0 0 0 2 0 2 2 < 0 0 0 0 <
«£ 2 0 tf U < 01 0 2 u < u
0 0 0 2 tf 0 0 <1 3 0 2 0 0
0 □ < < tf 0 0 0' 0 0 0 0 0
< □ 0 0 0 0 0 0: 0 0 0 2 2
CO 00 O CN sr CO 00 O CM CO 00 O
r- r- oo OO oo oo 00 co CO CO CO CO O
o o o O o o o o 0 0 0 0 T—
A A A A A A A Al A A A A A
tn tn tn tn tn tn tn tni tn tn tn tn tn
A A A A A A A Ai A A A A A
□ < u u U U u y y u y < <
U < □ □ □ U o 0 0 u 0 0
0 0 0 < 2 0 0 3' < 0 < 0 0
□ < 2 y □ y 2 0' 0 < y 2 0
0 0 0 < 0 < < 2 0 0 0 0 2
u 0 y 0 < u u U· 2 0 2 y
u u < □ 3 u u u· u 2 0 2 <
2 0 0 0 2 2 2 0 0 0 2
u u y 0 0 u 2 0' 0 2 y 2 0
□ tf < 0 tf 2 0 <1 0 0 0 2 2
y tf 2 □ tf y o 2! < u 0 y ><
0 0 U u (J 0 0 0 0 < u < 0
2 2 y 0 2 2 0 y 0 2
0 < 0 0 0 < 01 3 < 0 0 <
0 0 0 0 □ < 0 < 0 2 0 2 0
0 < y 0 □ □ 0 y 0 0 y 2 y
< < < □ □ < □ 0 u u 0 U 0
0 0 0 < 0 0 0 <1 < 0 < 2 2
□ □ □ 0 0 u 2 0; 0 < 0 U 2
LO r- co cO LO r·- σ> QO LO r-- CO
r- r- CO 00 oo 00 oo CO CO CO CO CO
o o o o o o o 0 0 0 O 0 0
00 σ> o CN OO LO CO r^- CO σ> 0
r- r^- oo oo 00 oo oo OO 00 00 00 00 CO
LJ o 90 -a D- 06 D- 06 90 -a D- 06 90 -a D- 06 D- 06 D- 06 D- 06 D- 06 D- 06
z v- Z -r- z v- z v- z v- z -r- z -- z z z — z z z —
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 147/176
143/161
-9 .Ο •-9 .Ο ο-- ^-9 ^-9 -9 •-9 νΛ θ'- *-9 -9
CN C0 r- CO CO CN r- CN O CN r- CO
o^- %_o θ'- ^-9 θ'- --Ρ θ'- >-Ρ θ'- --Ρ θ'- ^-9 ^-9 ^-9 θ'- --9 θ'- --P θ'- -9 -9
co Lf> 00 Ο ΟΝ CN lo CO 00 Γ-- OO CO r-- σ> r-- I--
v~ C0 CO ΟΝ ΟΝ CN co •^· rn r- ΤΓ
EH EH EH Εη Εη Εη Εη Εη ΕΗ Eh Eh EH EH EH Eh EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
Eh Eh EH ΕΗ Εη Εη ΕΗ Εη EH EH EH Eh EH EH EH
o 3 p 0 0 3 0 0 3 0 p 0 0 0 0 0
o 0 0 0 Ρ 0 Ρ Í3 0 0 0 0 0 P Í3 0
o 3 3 0 Ρ 0 Ρ 3 0 P 0 3 0 0 3 3
p 0 Ρ 3 0 0 0 3 P 0 0 0 0 0 0
3 0 0 π 3 D Ρ 0 0 P 3 3 0 P D 0
0 3 0 3 0 0 3 3 0 0 0 0 0 3 p 0
P 0 Ρ 3 0 Ρ 0 0 Ρ 3 3 3 0 0 0
3 0 Ρ 0 0 0 0 3 Ρ 0 0 0 0 P 0 tf
0 0 3 0 0 3 3 0 0 0 3 0 3 p 3 tf
3 P 3 0 0 Ρ 0 0 0 3 0 0 P 0 0 P
P P 0 0 3 0 3 Ρ Ρ P 0 3 P 0 Q P
0 0 0 0 0 0 ο 3 0 0 3 3 0 0
3 tf 0 3 0 tf 0 0 0 p 3 p 0 0 tf 3
0 0 0 0 c5 Ρ 0 0 0 0 3 0 0 tf 3
0 0 0 0 tf D 0 3 0 tf O 0 3 0 (tf 0
0 0 3 tf tf 0 0 0 Ρ tf 3 0 0 tf p 0
P 0 0 tf tf 0 0 0 Ρ tf 0 3 0 tf 3 0
P 0 0 tf 0 3 3 0 3 0 0 0 D (tf 0 0
3 3 3 0 Ρ 0 Ρ 3 P 3 0 0 P 0 0
CN CO ¢0 Ο CN <0 οο o CN <o 00 O CN
O o Ο Ο τ— τ— τ— τ— CN CN CN CN CM CO CO
T- T- τ- τ~ τ- τ~ τ- τ~ τ- T- T~ T- T~ T- T~ T-
EH Eh ΕΗ ΕΗ ΕΗ Εη ΕΗ Εη ΕΗ EH EH EH Eh EH Eh EH
ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
Eh EH Εη ΕΗ ΕΗ Εη ΕΗ Εη Εη Eh EH Eh Eh EH EH Eh
ρ P Ρ Ρ 0 3 0 3 Ρ 3 P 0 0 3 0 0
3 0 0 Ρ 0 Ρ Ρ 0 Ρ 0 0 0 3 P 0 0
3 0 0 Π Ρ 0 0 0 tf P 0 n 0 Π Í3 0
0 0 Ρ Ρ Ρ 0 0 0 «tf P p 0 0 P 3 0
0 0 0 0 Ρ 3 0 Ρ c5 P o P 0 P 0
0 0 0 0 Ρ 0 3 0 0 0 0 p 0 0 P P
P D 0 Π 0 π 0 0 0 3 Π 0 0 n D
0 P 0 0 0 Ρ 0 0 0 P 0 0 P P o 0
3 3 0 0 Ρ 0 Ρ 3 3 3 0 P 3 0 0 3
P 3 Ρ 0 0 3 0 0 0 P 0 0 3 0 0 3
0 0 Ρ 0 0 Ρ Ρ 0 0 0 p 0 P 3 P P
P 0 tf 0 0 0 0 Ρ tf 0 0 0 0 3 0 P
3 0 tf Ρ 0 3 0 0 tf P P P y 0 0 P
0 D 0 π 0 0 π 0 0 0 0 o Π 3 0
P 0 0 tf Ρ 3 3 0 0 tf P P 0 3 3 0
3 3 0 tf ρ y 0 0 P tf 0 0 0 0 0 0
0 Π Ρ 0 3 ο 3 0 tf 0 n 0 0 n P
0 0 0 0 3 0 3 3 0 0 0 0 0 3 3 0
0 D 3 0 0 Í3 0 0 P 0 3 0 0 0 0 0
CO LO r- σ> CO LO r- σ> CO LT> r- σ>
o o ο ο ο Τ— τ— τ— T— T— CN CN CM CM CM co
τ— τ— τ— Τ— Τ— τ— τ— T— T— τ— τ— τ—
CN C0 lo co Γ^- ΟΟ σ> o CN CO Lf> CO
σ> σ> σ> σ> σ> σ> σ> σ> σ> o O O o o O o
Λ co LJ o 90 -α D- 06 D- 06 D- 06 90 -α D- 06 D- 06 D- 06 Qo Qo Qo Qo Qo Qo D- 07
Ζ T- Ζ τ- Ζ τ- Ζ τ- Ζ ν- Ζ ν- Ζ ν- Z T- Z T- Z T- z <- Z v- Z T- Z T- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 148/176
144/161
< ^-9 ^-9 ^-9 •-9 •-9 ^-9 ^-9 '-P
CM co 'FT 'FT CM CO CM CM CO CO CM CM CM
v_o σ'- v_o •-9 &*· •-9 &*· •-9 &*· •-9 ^-9 ô*· ^-9 ô*· σ'· v_o ^-9 ^-9 o^· ^-9 o^· -9 õ*· ^-9 o^· ^-9 σ'
r- CM t— r^- O O σ> UO O <O <O UO
UO CO UO CM CM sr CM CO CM CM
Eh EH EH EH EH EH EH EH EH Eh Eh EH EH EH EH
tn tn W tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Eh EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH Eh EH EH Eh EH EH
y < < y 0 y 0 0 o 0 y y P y 0 P
< 3 0 0 2» < 0 P 0 P < < 0 3 0 P
0 u 0 0 0 0 0 < < P 0 0 0 tf P 0
y 0 0 y y < y y P < y < y P P
0 u 0 0 □ 0 0 0 3 o 3 0 0
tf y 0 0 y < <í P 0 «£ y 0 0 y tf
tf 0 0 < < tf 0 P P < 0 0 0 P 0 tJ
tf 0 < 0 0 0 0 < P 0 P 0 0 P 0 P
□ < 0 y < 3 y 0 o P 0 P P y P P
P d 0 0 P 0 < 0 0 0 0 P P 0 < 0
0 y 0 y < tf 0 0 0 <£ P 0 y 0 P 0
tf 0 0 3 0 □ 0 P 0 < 0 0 0 0 P
tf 0 << o 0 0 0 P P <£ 0 0 P <£
tJ < 0 0 P < P 0 < 0 0 tf 0 < 0 0
0 0 0 P 0 0 < P tf 0 < 0 P P 0 <
U 0 P 0 =£ y y 0 0 y 0 0 < y ·=£ y
U □ 0 □ 0 3 0 P < < P 0 P < 0 0
0 0 o 0 0 tf 0 P 0 0 0 P 0 0 < P
0 P 0 0 < 0 P 0 P < 0 P < 0 0 0
rtT <o 00 O CM <o 00 o CM rtT <o OO O CM
co co co FT sr sr UO UO UO UO UO <o <O <o
T- T- T- T“ r~ r~ T- τ~ τ~ τ- ç- ς- ς-
EH EH Eh EH EH EH EH EH EH Eh Eh EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh Eh EH EH EH EH
u y 0 P 0 < y «c P 0 < P y 0 0
u 0 tf 0 0 □ 0 < 0 0 0 tf 0 0 P <
0 < 0 0 □ 0 3 P P < 0 < P 0 0
0 y tf 0 □ y 0 y 0 0 0 0 o y 3 0
U 0 0 < 0 0 P < P 0 P 0 < < 0 P
0 p 0 y 2 < y P 0 y P 0 P 0 0
□ 0 P 0 0 0 0 < 3 P 0 P 0 < P P
□ 0 0 □ □ 0 < 0 3 0 P 0 0 0 0 <
y 0 y 0 P 0 y 0 o ·=£ 0 0 0 < y
0 0 0 < 0 P 0 0 0 0 tf tf 0 P 0
3 □ 0 y 3 < y 0 tf < y tf tf 0 < <
p 0 p 0 0 0 0 P tf 0 < c5 c5 0 tf
P y 0 2» 2» 0 < tf P 0 0 0 tf 0 0
□ 0 0 0 0 □ P P tf 0 P 0 0 0 0 P
0 0 0 0 □ < 0 0 0 P 0 P P 0 0 P
0 y 0 y y □ 0 0 P P y o 0 < tf
0 0 0 0 0 0 0 P P 3 0 0 0 P tf 0
□ 2 0 0 < □ 0 < 0 3 P P 0 P 0 <
0 p P 0 0 0 0 0 < 0 0 0 < 0 0 3
CO UO r- σ> CO UO r- σ> co UO r- σ> CO
CO CO co co ’Τ UO UO UO UO UO <o <o
T- T- T- T- T- T- T- τ- T- T- T- T- T- T-
r-- CO σ> o CM cO rtT UO <o r- oo <J> o CM
o o o t— τ— T— T— T— CM CM CM
Λ rLJ o Λ LJ o Qo D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 Qo D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 Λ LJ o
z v- Z T- Z v- Z T- Z T- Z T- z v- Z T- Z v- Z T- Z T- Z T- Z T- Z T- Z T- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 149/176
145/161
1% 3% 2% 5% 13% 8% 4% 5% 20% 13% 6% 8% 2%
>_p >-P o-· >o o-· >o o-· v_o o-· o*· >_o >_o v_o o-· >o o-· >o o-· *-P θ'· *-9 o*· o*· >-9 <y-
CO lf> LO LO CN O CO oo a> r- σ> 00 O co CO
CN •ς— O CO co CN t— τ— t— t— LO CN CN CO
Eh Eh EH Eh EH Eh Eh EH EH EH EH EH H Eh Eh
to to (0 (0 to to to to 10 10 (0 to to to to
Eh E-< Eh Eh EH EH EH EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
0 0 0 0 3 < 3 3 3 LS 0 0 3
3 o 0 3 3 3 < 0 0 0 < < 0
3 0 < 0 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0
0 0 3 0 3 3 3 0 3 <2 0 < 3
(j < < 3 3 0 3 0 0 0 < 0 0 0
3 0 0 0 0 3 0 < < P LS 0 L2 0 0
3 < 3 0 3 3 0 3 0 0 3 3
0 u 3 3 3 0 3 0 0 0 0 3 3 < 0
0 3 0 3 □ 0 0 0 3 0 0 •=C 0 L2
3 3 3 0 3 3 0 0 0 < 3 < 0 < 0
< 0 0 »3* 0 3 0 < LS 0 0 3 0 <
0 3 tf 3 0 < 0 0 < < tf < tf 3
0 0 tf 0 0 0 0 P> 0 0 0 tf 0
0 < < 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3
O 0 0 0 3 < 0 3 D 3 0 < 0 0
3 0 < 0 3 3 3 0 0 0 0 3 L2
<J 0 tf 3 0 0 3 3 3 0 0 0 0 < <
0 0 tf 3 3 3 3 0 0 3 < < 0 0
0 < 0 3 0 0 0 0 0 0 3 3 0 <
co CO o CN ^r CO CO O CN •'T CO CO O CN q·
co co r- r- r- r- r- co CO CO co co σ> σ> σ>
T- T- T- T- T- T- T- T- T- T-
Eh Eh EH EH EH Eh eh Al EH EH EH Eh EH EH
to to (0 (0 to to ω ω 10 10 10 to to ω ω
Eh E-» Eh Eh EH EH EH EH Eh Eh Eh Eh Eh EH EH
0 3 3 LS < 0 0 0 0 LS 0 3 3 0 3
0 0 3 < 0 0 3 3 3 0 0
(0 0 3 •í 0 0 tf •ri* < 0 0 0 0 3 3
< 3 0 3 0 < tf tf 0 0 3 0 < 0
0 0 0 0 tf 3 0 tf < 3 3 0 3 0 0
0 D 3 0 tf 0 0 0 0 0 3 0 0 0 rf
3 0 0 3 o 0 0 0 < 0 0 3 0 3 0
0 < 3 3 < 0 3 0 0 3 3 3 3 3 <
3 0 0 3 0 < 0 3 3 0 LS 0 0 3
< tf < 0 tf < 0 0 0 3 < □ 0 3 0
tf 0 tf 0 0 0 0 <2 3 0 0
0 0 tf tf 0 3 0 0 0 0 < 3 0
D tf 0 3 3 0 5 3 Q 0
< 0 0 0 0 0 3 3 3 0 0 0 0 0
0 3 3 •3* < 0 <* 0 0 3 0 3 0 0 0
3 0 0 tf 0 < tf < 0 < 3 0 L2 3
3 0 3 (J 0 0 0 3 0 3 0 0 < 0 0
< 0 0 < < < 3 0 0 0 3 3 3 3 0
0 3 0 0 0 3 3 3 < 0 0 0 <
LO r- CO CO LO r- O) CO LO r- O) CO
LO LO LO Γ- r- r- r— r- co co CO co CO o> σ>
T- T- T- T- T- T- T- T“ T- T- T- T- T- T-
CO LO CO r- co σ> O CN CO LO CO r-
CN CN CN CN CN CN CN CO CO CO CO co CO CO co
Q r- o Qo D- 07 D- 07 D- 07 Qo D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 Qo
Z Z r- z v- z v- z v- Z T- Z T- Z T- Z r- Z T- Z r- Z T- Z T- Z r- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 150/176
146/161
1% θ'- CM 4% 3% 1% '-P co 1% 5% 7% 19% 18% 7% '-P co 3% *-9 θ'- LíO 3% --9 CM
o^- •-P o^· V-P ο- '-P o^- --P o^· '-S o^- --P V-P o- V-P ·-? o^- >-P o*· xp o^· V-P o- --S o^- ^9 o^·
CO CO CM CM LíO CM CM LíO τ— LíO co CD
CM ’Τ CO CO LíO CM
EH EH EH ΕΗ EH EH EH EH Eh EH EH EH EH EH EH EH EH
ro to to (0 to to to (0 to (0 to to (0 to (0 to to
Η EH EH ΕΗ EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH EH Eh EH EH Eh
d 0 0 0 y p < d p 0 p d P 0 y P 0
ÍO 0 Ρ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P
to 0 ÍO 0 li 0 d 0 0 0 0 0 P P d P 0
0 0 0 0 li y 0 ÍO d ÍO ÍO d P 0 y d 0
ο ÍO 0 ίο •i 0 ÍO 0 0 ÍO 3 P 0 3
y d y 0 0 y d y 0 d 0 P d d y 0 i
d 0 0 ίο 0 < 0 0 □ 0 ÍO 0 0 0 < P i
5 0 0 ίο 0 0 0 ío d 0 P d 0 P 0 P 0
to p y y P 0 P 0 0 □ d 0 P P P 0 P
0 0 0 < ÍO ío 0 ÍO 0 0 ío 0 0 0 0 0
u p y 0 0 y 0 y 0 y 0 d d 0 P P
t3 0 < 0 ío 0 0 0 0 ío 0 0 0 P P < P
d 0 y ρ d y ÍO ÍO p ío ío p 0 0 d 0 0
0 0 0 0 < 0 ÍO < 0 0 0 P 0 < 0
0 0 0 0 d 0 0 d 0 ÍO d 0 0 P 0 0 P
P 0 y ίο P y 0 3 P p 0 y P P d 0 P
ío ÍO 0 ίο 0 0 0 □ 0 ÍO 0 P P 0 P 0
0 d d 0 d ío ÍO 0 0 0 d 0 P 0 P 0 d
ÍO 0 0 ο 0 0 ÍO d ÍO 0 0 0 0 0 0 0 3
CD CO o CM ’Τ CD 00 O CM CD CO o CM CD CO
co co o Ο o o o CM CM CM CM CM
T— T— CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
T-
EH EH Eh Εη Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH Eh Eh Eh
to to to to to to to to to to to to to to to to to
fcH EH EH ΕΗ EH EH EH EH Eh EH Eh EH EH EH EH EH EH
< 0 0 d 0 y d Í0 d y 0 0 0 0 y y P
0 ÍO Í0 0 ÍO í 0 0 0 ÍO 0 li 0 < 0 P
ii d 0 ii 0 0 0 d 0 ÍO d 0 li i 0 d 0
u y i d y 0 ÍO d d 0 y i li P 0 d
0 0 0 0 □ 0 0 ÍO 0 ÍO 0 0 li 0 0 <
to 0 0 ρ 0 ÍO 0 d p 0 y p 0 i 0 P 0
P 0 0 ío 0 < < d < 0 0 P 0 0
0 0 ÍO 0 d 0 0 0 0 3 0 0 0 d d P i
□ 0 d 0 0 0 0 0 0 0 y 0 P P 0 d i
ÍO 0 ti 0 ío d 0 d 0 0 d 0 0 0 0 0
0 d 0 0 d 0 ç? y 0 d P 0 d d 0 d
ío 0 0 0 0 0 o 0 li ÍO 0 < 0 0
P 0 0 Ç? y ÍO 0 0 d 0 0 0 0 P P
to ÍO 0 0 0 0 ÍO 0 0 ÍO 0 d P P 0 0 P
< d 0 d ío ÍO 0 li 0 0 «i ÍO li 0 P P P
0 0 y 0 ío 0 0 i ÍO d p ii y o P y
O 0 < 0 P 0 □ Q 0 0 0 0 li < P < 0
□ d 0 d 0 ío 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 d
ÍO 0 0 0 0 d P P d 0 d P d 0 0 d 0
UO r- σ> CO LíO r- σ> 00 LíO r- σ> CO LíO r-
<_» σ> σ> o O o o o Ç— t;— τ— — — CM CM CM CM
t— T— Τ— CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
CO σ> ο CM CO LíO CD r- CO σ> O CM CO
σ> co ’Τ •'T ’Τ ’Τ LíO LíO LíO LíO LíO
Q r-- o D- 07 Qo O o D- 07 O o D- 07 O o Qo Qo D- 07 D- 07 D- 07 Qo Qo D- 07 Qo
z v- Ζ ν- Z T- Z T- Z T- Z v- z v- Z T- z v- Z T- Z v- z v- Z T- Z T- Z T- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 151/176
147/161
00 4% CM 3% 1% CM 21% 3% 29% 13% 5% xp 8% 8% ^9 >-9
-_o ©*· '-p θ'- xp d'- xP --9 θ'- xP xp xp xp θ'- >p θ'- >-9 ^9 θ'- >-9 θ'- *-9 θ'-
O CM CO OO O O> O LO CM
LO CO T- CO τ- T- LO O O T- CM 00 CM CM
Eh EH EH EH EH EH Eh EH EH EH EH EH Eh Eh Eh EH
to to to to to tn tn tn tn tn to to to to to to
H EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh Eh
0 P 0 o 0 P o < o 0 0 P p P 0
tf 0 0 0 0 P P 0 0 0 P n 0 < 0 0
tf P 0 P < P 0 P 0 P P 0 0 0 P tf
tf 0 P 0 0 0 P =£ P ·=£ 0 0 P P tf
P 0 P 0 P 0 0 P 0 0 o 0 0 tf
P 0 P P < 0 0 P 0 0 P 0 P 0 0 P
0 P 0 0 3 0 0 P 0 < 0 P P 0 0
P 0 0 0 0 0 0 P 0 0 P tf 0
P 0 0 < 0 0 0 0 =£ 0 < 0 0 tf 0
0 P 0 P 0 < 0 0 3 P 0 P
0 < P p 0 < tf 0 0 0 P P 0 0 0 tf
P 3 P < 0 3 0 P 0 P P 0 tf tf 0 c5
P P 0 0 P 0 P P 0 <£ tf tf 0 P
0 0 P P 0 < 0 0 P 0 3 0 0 tf < P
tf tf < P P 0 0 < 0 0 P < P P tf P
tf tf 0 0 0 0 0 0 P 0 0 < P 0 0
tf tf < P P 0 0 0 < 0 < P 0 P <
0 tf 0 0 < 0 P 0 0 0 0 0 0 < P P
0 0 0 0 P P 0 P 0 0 < < 0 3 P 0
O CM co 00 o CM CO OO O CM CO 00 O
CO CO cO cO cO LO LO LO LO LO co
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh EH Eh Eh
to to to to tn W tn tn Ifl to to tn to to to to
FH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH Eh EH Eh EH
0 0 0 0 < < 0 <: 0 0 P P 0 P tf 0
0 P 0 0 P 0 < 0 0 0 0 0 0 P tf
D Π P < < 0 0 0 P 0 P < P 0 tf P
P P 0 0 0 0 0 0 P 0 0 P < 0 0
P P P < 0 0 P 0 0 < P < 3 P
0 0 tf 0 P 0 0 < 0 P 0 0 P P tf
< 0 c5 < 0 P 3 0 P P P P 0 tf
3 P < P 0 P 0 3 0 < tf 0 P P 0 0
0 p 3 0 P P 0 0 0 tf < 0 0 0 P
0 < p 0 < 0 P P P 0 o P 0 < P
< 0 0 P 0 0 0 0 O 0 P 0 0 P 0
3 0 P 0 0 0 0 0 < 0 0 tf P E> P 0
O 0 0 P 0 0 0 P 0 tf Q P 0
0 3 P 0 0 3 0 0 < 0 O 0 <
0 < 0 3 0 < 0 0 tf 0 0 0 0 P 0 P
P 0 0 0 0 •ΐ P tf P 0 Q < P
P 0 P 3 0 0 3 0 0 0 3 P
P 0 0 0 0 tf < 0 0 0 3 < 0 P 0 0
0 P < 0 < 0 3 < P < 0 0 < < < 0
σ> CO LO r- o> co LO r- o> CO LO r- o
CM CO cO CO cO co sr sr sr LO LO LO LO LO
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
LO <£> r- 00 σ> o CM cO LO CO r- OO o O
LO LO LO LO LO co CO CO CO co CO co co co co r-
Q o D- 07 D- 07 Qo D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 Qo
Z v- Z T- Z V- Z v- Z T- Z v- Z v- Z T- Z v- Z v- Z T- Z -r- Z T- Z T- Z -r-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 152/176
148/161
•-9 >-P *-P o-'- *-P o-'- *-P o-'- *-P o-'- •-9 --9 --9 --9 >-P >-P >-P >-P •-P o-'- •-P o-'-
CM CO CM O C0 O CM CM
&- *-P '-P '-P *-P o-*- *-P o-*- *-P o*· *-P o-*- •^9 •^9 •^9 •^9 '-p '-p '-p >-P *-P o-'- *-P o-'-
00 00 LO LO 00 CO r- LO CO CM 00 LO CM
CM LO CM CM CM CM CM σ>
Eh Eh Eh Eh EH EH EH EH Eh Eh Eh Eh H H H H EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh H H H H Eh EH
0 d 0 0 0 0 0 0 d 3 < 0 «í 0 ED 0
□ 0 < 0 0 0 0 0 □ 0 < 0 3 0 0 0 0 □
0 0 d 0 < ED 0 0 O o d 0 < 0 < < ED
d < 3 < ED 0 d 0 0 0 < 3 0 Q 0 3 0
0 ED < ED 0 0 u 0 D 0 u d 0 0 d <
< 0 5 0 d 3 d d ED tf 0 d ED ED 0 12 3 0
u < 0 0 ED 0 0 d 0 ED 0 ED 0 ED 0 0 0
0 d O 0 d tf 0 o d 0 tf 0 0 o ED d
0 0 0 0 □ 0 tf 0 ED ED ED tf 0 0 O 0 0 0
0 0 0 □ 0 < tf < 0 0 0 «í □ < □ ED 0
< < < 0 < □ 0 □ □ 0 d 3 3 tf y o 0 □
3 0 0 < ED 0 0 ED 0 ED < < 0 0 0 0 □
0 < d □ < 3 0 < □ < d 0 tf 0 < ED 0
0 0 0 < ED 0 □ 0 D □ < 0 tf < O 0 0 0
0 o 0 O ED 0 0 0 O 0 3 o tf 0 0 d 0 0
0 5 «fi 3 d ED tf 0 0 < 0 3
d d d ED d 0 u d tf 0 u 0 3 O 3 u <
0 ED ED ED < « < d 0 tf ED ED < 0 ED 3 0
0 0 0 < 0 0 ED ED o 0 0 □ 0 < 0 0 0
CM +T CO 00 O CM CO oo O CM CO 00 o CM sr CO
CO CO CO CO r- r- r- r- r- 00 00 00 oo CO σ> σ> σ> <J>
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh H Eh Eh
0 0 0 3 0 0 < «í 0 0 3 < 0 3 0 0 0
0 < < < ED ED ED 0 0 O < o 0 3 O ED 0
ED 0 0 0 < 0 d d 0 ED 0 0 0 ED 3 ED 0 ED
0 < ED 0 ED «£ 3 3 S 0 3 0 ED 0 0 ED
0 3 0 3 3 0 d 0 0 ED < ED d o 0 d u
0 0 0 3 3 0 < 0 tf O 0 S ED 0 Q 0
0 Ü 0 < ED < d ED tf D 0 0 □ 0 u □ < 0
ED 0 0 □ < 0 0 < 0 < □ ED 0 0 0 0 0 tf
5 □ o 0 ED < 0 3 <£ 0 0 < < O 0 < 0 tf
0 0 0 < 0 ED □ ED 0 0 0 □ 3 O o 3 < 0
0 0 0 0 0 ED 0 < << <í o 0 0 0 0 0
ED 0 0 < o 0 □ 0 3 u d ED 0 □ u < < 0
d O 0 0 0 ED 0 0 0 «í 0 < «fi 0 0 0
□ 0 < 0 0 < 0 0 3 O 0 0 3 < 0 0 < 0
0 < ED < d 0 d 0 3 D 0 0 0 0 ED 0 0 ED
0 5 < 3 < d ED 0 0 0 0 S d 0 d < 0
o 0 u 0 ED 0 0 3 ED 0 d ED 0 ED ED 3
< d o 0 0 0 0 d 3 0 o 0 □ 0 0 0 0 3
0 □ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < □ 0 O 0 < 0
_ CO LO r- <J> CO LO r- σ> _ CO LO r- σ> 00 LO
CO CO CO CO CO r- r- h- r- r- 00 00 CO CO CO σ> σ>
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
CM CO LO CO N- 00 OD o CM CO LO CO r-- oo
r- r- r- r- r-- r-- r-- r-- r^- 00 00 00 00 00 00 00 oo oo
Qo D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 D- 07 Qo Qo Qo Qo Qo Qo Qo Qo ID- 07 Qo
Z T- z v- z v- z v- Z T- Z T- Z T- Z T- Z T- Z T- Z T- Z T- z z z z- Z.- Z T-
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 153/176
149/161
Tabela 1C: siRNAs selecionados em conjuntos de substituto de rato in vivo (siRNAs com reatividade cruzada humano-rato com maior especificidade em rato). Um conjunto de triagem de 48 sequências de ser humano e rato com reatividade cruzada para iRNA alfa-ENaCs foram identificadas. A expressão de porcentagem residual de alfa-ENaC em duas experiências de transfecção de dose única independentes é mostrada (fazer referência à seção de exemplos para métodos usados).
Legenda da tabela abaixo:
duplex ID
SEQ. ID Senso
SEQ. ID Antissenso
a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
2a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 154/176
150/161
<#> <A© <Λ© <Λ© (tfi <Λ©
co rd MJ CM CO CM CO UO CO CM rd CM MJ
c - <#> «V» «A© o¥> <#> <#> <A«· eM> <#> <A«·
•π Φ o *5 r-1 CO CM MJ r- r- MJ rH r- CM rd CO MJ CO
/2 Φ m H ’Τ CO r- uo co rd OO uo OS CO UO CM r- CO
N U © ξ tn c ac
<A© tfP <AP <A° oV> dfi <Λ©
rd os co co CO CO CO MJ CD m rd CO UO OS
rd rH
C Φ <Ξ> <#» <#> (tfi 4fi <A° <Λ© <A© oV» (ffi (tfi 4A 4A <Λ© oV»
<1> H Ç ··* CO o M) CO uo r- MJ CO m OS O MJ Γ-
φ tjl φ c c d > co r- Γ- co rd OS UO co r- UO CM Γ- Γ-
to t—1 C 1» · υ -η o ° ω ιη Ό u‘ h 5 s ac
EH EH Eh EH frH EH EH EH EH
tn tn to ffl tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
H H H H EH EH H H EH H H Fh H H
tf 0 0 3 3 tι t) 3 ti to G tf
ti tf 0 3 to t 1 3 0 (> 3 f 1 0 ti 0
< tf (0 0 to 0 3 3 tf 0 0 0 to (0
0 3 tf 3 0 3 í1 tf tf 3 3 to tf
0 < tf 3 0 to tI tf (3 ti tf f 1 ti
3 t) tf t!i 3 tf 3 f) to f 1 fl tf tf tf
3 0 □ 0 < ti to 0 3 3 3 ti tf 0
(0 3 < 0 u 0 < 3 to 3 3 0 3 0
tO tf 0 0 3 3 0 3 to 0 0 3 tf 3
3 ü o 3 3 3 0 0 0 3 3 t 1 ?5 3
tI 3 3 tf ( 1 í 1 3 3 0 tf to G f 1 G
φ 3 < < υ 3 3 3 < < 0 (1 to 3 0
ω 3 ti o 3 (0 tf t i to 0 G tf tf tf
c to 0 3 3 (l 0 3 t) 0 0 0 ti ü ti
Φ ω 3 < < (J (I t 1 < f) 0 to 3 f 1
3 fl (1 3 tO í 1 to to 3 tf tf (1 tf f 1
3 (1 0 10 0 0 t 1 < 0 tf tf 0 ti 0
c < (0 < 0 < < tI tf to to to < f I 3
< 0 <j 0 < < 0 0 0 0 < < < 0
co o ΓΜ MJ co o CM ’Φ MJ CO o ΓΜ
os o Ο o O o rH rd rd rd rd CM CM CM
cr CM co CO co co co CO CO CO CO CO CO CO CO
Φ y-Λ. ω Q rd rd rd rH rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd
EH EH EH EH EH EH EH EH Eh
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
H fcn H H fcH fcH H H H H fcH fcH fcH H
ti 3 (0 0 3 3 (I f) 0 fl 3 3 3 to
3 O 3 0 3 3 0 3 t> (J <J 3 (0 <
tf to (0 t) (I 0 to 3 υ 3 3 to 0 l)
tf (0 to tf y 0 0 V tf 3 3 to 3 G
tf 3 3 0 to 0 3 0 3 fl (1 3 tf 0
t) l? tf to o to t> Q 9 to to to
tf 0 0 3 <1 3 0 tj (J 0 0 3 3 3
3 3 3 to < < tf 3 3 ti to t) < <)
0 < 3 to to tf «s 9 3 ti 9 G tl
< 0 0 tf 0 0 0 tf tf to 0
(1 3 0 0 tf tf to tf t) to to tf 3 tf
U < 3 0 0 0 3 tf CJ 0 < (j
tf 0 tf 0 3 to tl Q tf tf tf (0 3 tl
< 0 3 (1 tf 3 tf 0 tí 0 0 3 3 3
0 3 3 tf (1 tl (0 3 o 0 3 to 3 0
tn to < 3 tf (0 0 tJ 3 3 < (1 3
c □ 3 O (3 <1 0 tf tf 3 f) ti ti t) tl
Φ to 3 tl < 0 to tf to to < to ti (0 (I
ω 3 3 0 u < < 0 0 < 0 0 0 3 3
1^· Os rd co uo r^· Os rd co ü0 Γ- os rd co
O OS OS O o o o O rd rd rd rd rd CM CM
CM CM CO co co co CO CO CO CO CO CO CO CO
Φ rd rH rd rd rd rH rd rd rd rd rd rd rd rd
ω
o rd ΓΜ CO TP uo MJ Γ- CO OS O rd CM CO
O O O O o O O O O rd rd rd rd rd
X CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
Φ OS OS Os OS Os Os OS OS OS OS OS OS OS OS
Ω 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω Ω
Q 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 155/176
151/161
«p 'tf’ A «P m «P oP 0 oP os 0 «P 'tf’ «SP 'tf’ 0 cA® 0 cA® O «P σ «SP o «P A «P 0 «P co «P o «P MD «P 0 oP 0 «P o A oP 'tf’ «P Os oP 0 oP 0 «P A «P p' «P A «P 0 «P A oP 0
«P «P <#> «ffi «ffi <#> <#> «P «SP «SP «IP «IP «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P
OS CO oo LO 0 p- MJ p- MJ os O r- o co O 0 MJ r- 'tf’ r- P- 0 0 0 A O A 'tf’ A 0 'tf’ co
CO A p- LO CO p- 0 0 P- MJ 0 A A 0 0 0 CO A Γ- A 0 P- 0 P- P- Os 0 MD 0 OO co
«P «P «P oP 4P «SP «SP <#> cA® cA® «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P oP oP «P «P «P «P oP oP
MJ A 'tf’ MD 0 OO 'tf’ o 0 0 A A 0 A 'tf’ 'tf’ A 'tf’ A 0 'tf’ kO 0 0 OS 0 MD A 0 0 'tf’
A A
«P </fi (ffi ctfi «P <K> «V» oV> «P «S» «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P «P oP oP «P «P «P «P oP oP
OS A 'tf’ O CO 0 os σ 0 0 A A 0 0 *5* 0 os A 0 0 'tf’ MD oo σ 0 0 0 'tf’ A 0 MD 0
Γ- A OO LO Γ- Γ- Γ- r- OS CO 'tf’ 0 A 0 0 'tf’ OO 0 00 0 0 OO MD co (D O A 0 Γ- 0 00 OO OS
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn m rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn m rn rn rn rn rn rn rn rn
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
3 0 lí 3 0 <4 3 < l í 3 l ) l ) 3 <£ 19 õ l) (9 < < < õ < 3 < r J
<í t í 3 0 0 0 3 ii 3 u < 0 0 0 li 3 3 «2 0 < < li ii 0 0 < < 3 ii t í
<í 0 3 < < < 0 0 3 3 u tf 3 tf 0 0 l J 0 0 3 O <í < l í (J 0 3 0 tí r í 0 (9
r í 3 υ tí O 0 tp 0 3 3 tf 3 tf 0 3 3 (9 ·< (9 (í 0 ( í 3 Q (í r í 0 t í
3 O o < 0 0 0 3 3 0 0 tf < 3 ri 0 < 0 0 < ri 3 0 < 19 ti 0 3 0 3 0 < <
() < tf 3 tp (9 0 3 3 3 l ) l ) 0 l) y < 0 0 3 Q () 0 Q 0 tf 0 3 tí tí
< ti 3 3 0 3 3 0 3 3 l) 3 3 li 0 li 0 3 0 0 3 0 < < 3 < 3 li tf 3 l í f J
tí 0 3 ( ) 3 tf 0 19 3 19 3 3 0 0 0 l ) 3 l J 19 3 3 lí lí 3 Cí lí 3 3 19 0 3
t í 0 3 3 3 tf tí 0 < 0 l J < 3 3 3 <4 3 < 9 Q 3 < l!J 19 3 l í <9 19 f í
< 0 < 0 P 3 (i 3 li < u 3 (i 0 0 3 li 0 0 0 li 0 0 0 li 3 < 3 3 3 3
3 3 3 0 0 «: 3 O ( 1 ( ) (J O 3 (J O (> 3 r j 0 3 3 Q < 0 (í 3 (í 3 r í 3
0 0 lí l f < ri 0 0 0 0 3 0 0 3 3 3 0 0 0 0 0 0 3 li 3 3 0 0 0 < 0 0
0 3» 0 f.) o 0 3 (,f 0 3 3 < 3 3 l > Q <c 3 tf Q 3 0 < 0 o 0 y 3 3 3 lí Q «i
( í < 3 0 tJ 3 0 0 3 0 l ) 3 3 0 li 3 < 0 0 0 0 3 3 3 3 l í 3 0 3 < 3 l í 0
0 0 0 tf fJ < l í 3 l í (9 3 0 l J 3 0 19 0 0 tf 0 3 (9 (9 19 < 19 lí 19 19 tí 19 3 tí (9
< 0 tf 0 u 0 t.) tp 0 3 3 19 < tf 3 l / 3 (9 3 Q 3 3 3 y lí 3
<2 < 0 3 3 0 0 0 ii 0 l J 3 0 li < 3 3 0 (J 0 3 3 < (J υ li 3 < 0 0 t í <
0 0 lí 0 (í < 0 0 3 u l J 0 0 < (> 0 < 0 3 0 3 3 < 0 0 3 < 0 (í 0 0 0 0
0 < U 3 0 υ < 3 0 3 o < 3 0 0 0 0 0 < 3 0 < 0 < 0 0 0 lí < 0 3 < 3 3
MD co O 0 tf1 0 OO o 0 'tf’ 0 co o 0 'tf’ kD co O 0 'tf’ MD co o 0 'tf’ MD (D o 0 tf1 MD 00 o 0
CM CM co 0 0 0 0 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf’ 0 0 0 0 0 MJ MJ MJ MJ MJ P- Γ- Γ- Γ- co co CO 00 00 os os
CO ÍO 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn rn
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
tí 3 0 υ 0 3 0 (P 3 0 o r> o 0 3 0 3 rí 3 o (í (í 0 3 (P 3
t) t) 0 ti 0 3 tí li < 0 0 O li 3 0 o 3 0 0 < 3 (J 3 0 < 3 (í 0 li tí ti ri
□ 3 3 0 < < tí 0 0 (9 l) (9 tf O 19 3 < < D 0 0 < 3 3 19 0 19 tf 3 lí tí 19 3
3 3 9 3 9 0 0 0 9 3 3 D tf 3 O 0 3 3 tf u U 3 3 tf «s 3 Q
tí 0 0 3 0 3 0 0 O < O 0 3 0 O u O 3 75 0 li li 3 ii (9 tí 0 0 0 < 0 li
0 3 υ tp O 0 0 0 < 0 0 3 O O (1 lí < f!’ lí 3 3 t)
tí < 0 0 0 0 < 0 ii < < 3 3 3 0 0 3 < 3 lí 5 ri 3 Ii 0 (i 0 < 0 (í 3
lí 0 0 0 3 0 0 0 0 0 3 (9 0 3 < < t) 0 0 3 3 0 rí (í < 0 < < 0 0 (í 3 0 0
< < tí tí 3 0 Q (P 0 < 0 0 lP < 0 q O 3 9 3 3 rí 0 t)
3 3 0 3 0 < < 3 0 < 0 3 0 3 0 0 O 0 lí ri (i 0 U lí tí 0 < 3 < <
0 0 tf 4 < 3 0 O 3 0 3 3 tf «í 3 l) tf 3 19 lí < 3 9 lí 3 3 (í < 0 tí tí ir!
0 tf tf 0 3 3 0 O U < tf 0 0 0 0 < 0 O 3 0 0 0 0 < 3 (J 0 <
3 0 tf t) 3 0 tf (P tf «s: 0 O 0 0 (1 (í tf t) 3 3 tf 3 0 3 tf 19 3
0 3 3 0 0 ii 3! 0 0 □ 0 3 0 3 u ii 3 lí 0 < (í 0 u rí li 3 3 □ < 0 0
< 0 3 0 3 0 0 t) 3 3 0 (9 3 3 < 0 0 3 0 O 3 0 0 3 l) 0 t) tf (J (J 3 3
0 3 tf 0 (9 0 0 t) O 3, < 3 3 3 t) 3 () 3 t) 0 (J 3 3 tf (J 0 tí 0
0 t) tf 3 3 3 tí 3 0 0 3 3 3 O 0 0 0 li 0 0 3 0 0 tí < 0 0 3 0 tí 0
0 0 tf O O D < 0 3 tf 0 3 O O 3 0 (9 < < 3 lí 3 3 (9 0 □ tí tí 3 3 < (9 3 (9
< 0 0 < 0 υ < 3 0 * 0 0 < 3 υ 0 3 0 u 3 3 lí l) 3 3 lí lí 0 3 0 < 3 0 0
0 P- Os A 0 0 P- Os A 0 0 Γ- OS A 0 0 P' Os A 0 0 P- os A 0 0 P- os A 0 LD P- Os A
0 0 0 0 (O to 0 0 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf’ 0 0 0 0 0 MJ MJ MJ MJ MJ l^· l^· P- l- CO OO 00 00 OO OS
CO ÍO CO 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A
in M) Γ- CO OS O A 0 0 'tf’ 0 0 Γ- OO OS O A 0 0 'tf’ 0 MD P- OO os σ A 0 0 'tf’ lti MD Γ- CO
A A A A A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 'tf* 'tf' 'tf' tf1 tf1 'tf’ 'tf’ 'tf’ 'tf’
CM CM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
OS Os OS OS OS Os Os os OS OS Os Os Os Os OS OS os Os os OS Os OS OS Os Os OS OS OS Os Os os Os Os OS
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q ά
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 156/176
152/161
Tabela 1D: siRNAs selecionados em conjunto substituto porquinho-daíndia in vivo (siRNAs com reatividade cruzada ser humano-porquinhoda-índia). Um conjunto de triagem de 63 sequências de ser humano e porquinho-da-índia com reatividade cruzada para sequências de iRNA alfa-ENaC foi identificado e sintetizado, tanto com modificação de estrutura dorsal (fitas de sequência 1393-1518) como sem (fitas de sequência 1519-1644). A expressão de porcentagem residual de alfaENaC em duas experiências de transfecção de dose única independentes é mostrada (fazer referência à seção de exemplos para métodos usados).
Legenda da tabela abaixo:
duplex ID
SEQ. ID Senso
SEQ. ID Antissenso
a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
2a. dose única de triagem a 5 nM em H441; MV
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 157/176
153/161
SD dP □3 dp 03 r-1 dp LO dP Τ’ dP to dP OS dP rH dP Τ’ dP 03 rH dP 03 rH dP Γ- rH dP 03 rH dP 03
<A® «V» dP <Λ> dP dP dP dP dP <#> dP dP dP
φ o 5 MJ οη CM Ο Τ’ OS Τ’ OS 0- rH 1/3 O 0-
X φ U3 H Τ’ Τ’ os Τ’ tn 04 03 04 O Os 04 O Os rH
A ÍJ _ Τ’
N !j © 2 χ ω u
dP <ή> dP <*> eV> dP dP oP dP dP oP dP dP
ω m 03 03 03 LO 04 CO 0- 03 04 03 O
C Φ © Φ H 5 3 φ σι φ c B Ll c ω π υ -η o ° Z «*> dP «¥> «*> dP dP dP dP dP dP dP dP dP
OO m Li) tn 03 O 04 rH Τ’ O 04 OS rH
+J ω rH > ε Τ’ οο 03 Τ’ 04 tn 04 rH rH oo Os OS Γ- rH
ω ω O ul Α
Eh Εη Eh Εη Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Eh Εη Eh Η Eh H H H Eh H H Eh
3 3 3» tf 3 tf) tn tn tf 3 tf tn 3
3 < £3 tn m 0 3 < u < tf 3 0
< tn 3 < j <n 3 () tf t) tn tn tn 3
tn ο «f <) 3 t) 3 tn < Q 0 Π
<) υ tn 3 ω 3 3 t) 3 < tn tn 0
d 3 t) tn 3 3 tn <ί> tn tn tf 3
3 ιη u < 3 0 3 tn 0 t) < 0 3
tn < 3 0 tn 3 3 < t) tn t) 3 3
< ο 0 0 3 3 3 9 0 Q 3 «c
ti tn tf 3 3 tf tn tf tn tf tn
tn < 9 tf 3[ tf tn tn tf 9 Ψ Q 11
<1> tf 3 tn 0 tf tn t) t) 0 tn tn tn <j
tn tf tn < tn t) t) Q tn tn < Q 3
c3 tf < 3 t) υ 3 < 3 t) tf tn
tn < 3 tn tn ω 3 tn tf tn tn 0 3
3 tn tn 3 0 tn < 3 tn 9
tn tn 3 3 tn tf ti 3 3 tf 3 3 tn
c 0 3 tn U < t) tn 3 0 0 tn t) <
< £3 υ o 3 0 0 < 0 3 3 0 υ <
□ Τ’ LO 00 o IN Τ’ kO co o 04 Τ’ LO 00
os os Os o O o o o rH rH rH rH rH
ΓΤ ω 03 03 Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’
0> rH r-i rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH
ω
Εη Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Η H J-H H H H bH H H H H H fcH
t1) U < tn 9 3 q t) 0 3
π tf 0 tn 3 tn t) tí ti t) tn 3
υ O < < O 3 0 < < 3 tf < 0
tf t> 3 () tf O 3 t) 3 3 tf o tn
3 < <J 0 tn < t) 3 0 0 < 3
υ 3 3 < tn 0 <c 3 < tn 3 3 q
3 O 3 3 o tn tn O l) 0 3 t) tf
3 3 0 υ 3 υ tn tn υ o t) t) tn
V 3 tn 3 3 t) o 3 tn tn t) tn
υ (1 3 3 lí tf 3 o 3 3 o 3
3 tn t) 9 lí tf tf tn 9 t) 9 < 3
Ο 3 tf tn Q tf tf 3 tn 0 tn tf
q tn 3 < () tf t) o tn 3 () tf
tn tf tn t) < < 0 t) o u O 3 tf
tn m u < tn tf tf tn < 3 t) t) U
0 tn 3 3 < tn tf 0 3 3 tn O <
r 3 0 tf tn ti tf 0 3 tn U o t)
Φ < 3 tf υ t) () < 3 0 3 3 < tn
ü) < *· 3 < υ ü (J 3 < 3 υ
Q ΩΊ m 0- os rH 03 tn Γ- os rH 03 U3 0-
ΓΓ θ'. Os os Os O <_> o o O rH rH rH rH
Φ 03 ÍO 03 03 Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’
0) rH r-1 rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH rH
n
Γ- OO OS O rH IN 03 Τ’ U3 LO Γ- OO OS
X 03 03 03 Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’
Φ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ T* Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’ Τ’
Q. CO oo CO CO CO co CO OO OO CO CO co OO
3 Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
Q Ζ Z Z Z z Z Z Z Z Z Z Z Z
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 158/176
154/161
LD m τρ <Ν> (Π LO kO CO rd 11% <Ν> çn <Ν> Γ- <Ν> (Ό rd ^Ρ rd <Ν> OJ rd tn ’ζρ tD <Ν> ’ζΡ rd rd <Ν> tn <Ν> ’ζΡ os
CA* <Ν> <N> <N> <Ν> <Ν> <Ν> <Η* <Α® <Ν> <Ν> 0A9
CD CM 0 <Ώ ΟΟ 0 rd 0 os CD OO CM CO τρ CM to OS Cb to ιθ OS CD CM CM CO
07 cn ιθ CM CD OO tO rd os 00 •^p 00 07 00 Ο os ΈΡ 00 οο ιθ OS CD OO 0 0
rd rd
<Ν> oV> cAO cAO cAO <Ν> cAO cAO
rd CM ΩΊ rd m τρ CM CM OS CO co tn O ^Ρ rd ’ζρ tn ^Ρ CM ^Ρ ^P η CM
<Η> <H> <H> dfi μ
r-1 ΈΡ rd CO CM 0 ^p co rd ω co rd Ο rd CD rd tn rd co r- co CD rd CM
CM CM to rd CO 0 07 CM O οο CO θ' CM ΟΟ O CD ιθ σϊ OS to OS Οϊ OS CO 0
rd rd rd
Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Η Ei Η Ei Η Ei EH Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei
tn U) ιη Uí tn 0) tn 0) tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei
C) 0 & 0 0 tf (7 0 0 Q (7 < 0 (7 a a «£ ¢7 tf (7 0 a tf
a 0 0 0 tf 0 a 0 tf 0 0 υ 0 a a 0 0 a 0 0 0 tf 3
o 0 (.9 0 0 a 0 a 3 0 0 0 0 a a 0 tf < a < tf t.7 0 3 3
o a Μ! tf a 0 0 0 0 Q < ¢7 0 a ej < tf 0 tf ¢7 tf tf 3 y!
o 0 tf 0 0 0 0 0 0 a 0 0 3; (3 a 0 (3 < υ 0 tf
& tf 0 a 0 tf tf 0 tf Q a tf (7 a <í tf tf 0 υ Q tf
a Ü a a 0 tf 0 u 0 0 0 a 3; (3 a < 0 3 (3 0 0 0 0 tf
tf 0 a 0 tf 0 a 0 0 a 3 0 0 a < 0 tf (7 0 0 0 0 tf 0
í7 < 0 a 0 a a a tf a ¢7 < a < ¢7 < tf 0 Q •tf 0 0 !7 a
0 3 a tf a a 0 0 (3 0 < a < 0 3; (3 0 0 U 0 a 0
0 tf (7 a 0 a 0 (7 < 3 ΐ 0 (7 < tf ¢7 0 tf Q tf tf 0 tf
a < 0 a 0 a tf 0 a 3 0 0 a 3; (3 0 0 < ü 0 3 (3 3
0 3 a a a tf 0 0 0 ¢7 a a «£ tf (7 0 Q υ Q 0 t7 a tf Q
tf 0 a 0 tf 0 a a < a < a 0 (3 0 0 0 < 0 0 0 a a (3 0
0 0 0 (7 0 a a tf 3 < 0 0 (.1 0 0 < u 0 0 tf a 0 0 a
0 a 0 tf a a 0 0 (7 ¢7 a a tf Q υ Q 0 tf Q 0 a Q
tf 0 tf 0 a 0 0 a a a a < (3 0 < ü 0 0 0 3 (3 0 a 0 0
3 & 0 a 0 0 tf 0 tf a 0 0 0 < 0 0 ¢7 0 tf 3 a a 0 0 a
o 0 a a 0 tf 0 a 0 0 a 0 0 υ 0 0 0 0 3 0 a 0 0 a 0
o CM •^p CO CO O ΓΜ ΈΡ CO 00 O CM •çp CO OO O f\l ΈΡ co OO O CM •çp CO OO
CM CM CM CM CM 07 07 07 07 07 ^P ^P ^p ^P ^P to tO to to tO CO CO CO co CO
^p •^p ΈΡ •^p ^P ^P ^P ^P ΈΡ •τρ ΈΡ •τρ ΈΡ •^p ΈΡ •^p ΈΡ •^p ^P ^P ^P ^P ^P ^P ΈΡ
r-1 rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd
Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei Ei
0 υ tf < 0 3 0 tf <) υ < 0 Q (7 Q 0 0 υ 3 0 •tf tf υ
3 tf 0 3 υ α 3 υ 3 < υ υ 0 3 0 α υ 0 3 3 3 < 0 υ tf
3 0 3 υ »3* υ υ tf tf < »3* υ υ 3 0 υ υ υ 3 υ υ tf υ υ
υ tf t) 3 tf υ 0 υ o tf 3 υ 0 3 ¢7 υ (7 υ 3 υ t> tf υ
o υ υ υ 0 3 tf 3 tf 0 υ 3 0 υ υ 3 0 υ 0 3 tf υ u tf
3 υ tf υ 3 υ tf tf 3 3 < υ υ 0 υ t) 3 υ o υ tf tf υ o
υ tf tf tf 3 0 U υ υ < 3 3 υ 0 υ υ 0 υ 0 o 3 3 υ
tf 3 υ 3 υ tf 3 0 tf < υ υ < 3 3 υ 0 υ 3 0 υ 3 υ 3 3
0 3 ο tf Ο tf t) υ 3 < 3 υ t) 3 3 υ t7 Ο 3 υ 3 3 υ 3
ο 3 tf 3 tf 0 υ υ 0 3 < 3 υ 3 3 υ υ υ 0 υ 3 tf υ
0 3 υ tf o tf tf tf 3 υ υ 3 3 0 3 3 (7 υ 3 ¢7 υ 0 tf
3 0 υ 3 0 3 0 3 υ < < υ υ < 3 υ 3 υ 0 υ 0 0 3 υ
(7 <Γ 0 3 t) 0 υ ο 0 3 < 3 0 < 3 0 3 0 υ υ 0 0 3
3 0 3 (1 0 3 3 0 3 υ α < 3 3 υ < 3 3 3 0 0 (1 3 υ
υ 3 υ 0 υ υ υ υ □ 3 < υ υ 3 □ υ < υ 3 υ 3 0 υ 3
Q tf Ο 3 tf <5 υ υ υ 3 ο < υ 3 3 Ο 3 0 3 0 3 tf υ
tf 0 υ υ 0 tf 0 tf tf 0 υ υ 0 < < υ 3 3 tf 3 3 0 υ 3 tf
3 0 0 υ 3 υ tf 0 3 υ 0 3 0 υ < < υ 3 υ < υ 0 υ 3 3
0 υ < 0 0 3 υ 0 0 υ υ 3 3 0 υ < υ 3 υ 3 υ 0 tf 3
OS rd 07 ιθ 0 OS rd 07 U7 θ' OS rd 07 tO OS rd 07 ιΟ θ' OS rd ίΌ tn 0
r-i CM CM CM CM CM 07 07 07 07 07 •^ρ •^ρ •^ρ •^ρ •^ρ ιθ ιθ ιΟ ιθ ιΟ CO CO MJ CO
^p τρ ^Ρ ^P ^p ^P ^ρ ^ρ ^Ρ ^ρ τρ ’ζρ τρ ’ζρ τρ ΈΡ ^P ^ρ ^P ^p
rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd rd
O rd CM 07 ^P m CO 0 ΟΟ OS Ο rd CM 07 έρ ιθ CO Γ' ΟΟ OS Ο rd CM 07 ΈΡ
tn ιη tn ιη Ui m tn tn m tn co co CO Ό co co co co to co r- 0 0 0
^p ^Ρ *ρ ^Ρ *p ^P *p ^P ^ρ ’ζΡ ^ρ ’ζρ ^ρ ’ζρ ^ρ ’ζρ τρ ’ζρ ^ρ ’ζρ ^ρ ’ζΡ ^ρ ’ζρ ^p
CO οο οο οο OO OO OO OO ΟΟ 00 οο 00 οο 00 οο 00 co 00 οο οο οο OO οο OO OO
Q Ω Ω Ω Ω Ω Q Ω Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q ο Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 159/176
155/161
np cn <Λ> τ—1 <N> τ—1 <N> CO 4fi r-1 4fi cn O CM r-1 cn CM <N> «v> CO «v> CO X—1 CD m ϊ—1 <Λ> Ο τ—1 CO <N> cn <Ν> CM CD CM CM <—1 cn
<H> <H> dfi dfi <#> <#> Jfi <#> <#> <& <& <Η> dfi <#> <#>
Γ- CO CO UD 00 nP r~) CM LD co CO r- rH rH tn rH tn CD r* r·
OS <0 Γ- OO nP r-i cn tn oo CM 0Ί OS cn cn cH r- OS γ-- tn CM r- Γ- r-
0^ cffi dfi 4P <N> dfi dfi
CQ rH C9 Np tn r-1 CM CM m CM r- CM CM cH tn m m m cn tn O r-i NP m
<H> <Η> <N> <N> 4fi 4fi «v> <Η> <N> <N>
O ϊ—1 Np CO m O O Γ 04 O rH r-1 LD co θ' o 09 LD o 09 CD CO LD m LD
OS LD Γ O. m 04 NP tn O O. t—1 OS O CO LD 09 LD 5—1 θ' LD co
r-1 τ—1
Eh EH ΕΗ EH EH EH EH EH Eh Eh EH EH EH EH Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn σι tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH E-t Η FH EH FH FH EH EH EH FH FH FH FH EH EH EH FH FH FH FH FH FH FH EH
Co rf 0 Co 0 0 3 3 3 0 0 0 0 <c < 3 y 0 <c 0 0 Γ) <
0 0 < υ 0 0 0 3 3 0 3 0 0 < 0 3 0 0 < 0 0 < u 3 0
< < υ 0 0 0 < 0 0 3 3 3 < 0 3 0 0 tf 3 0 3 υ 0 0 0
0 υ 0 C0 tf 0 0 D 3 p Q 0 3 3 0 y tf 0 3 0 C) 3 p
< 0 3 0 0 3 3 3 3 < 0 3 3 0 0 0 0 0 0 u 3 < 0
0 CO 0 0 0 3 p 0 p «£ 0 Q p 0 p < 0 p 3 0
Co to 0 0 Co 3 tf O tf 0 () tf 0 3 tf < 3 3 0 0 3 3 0
0 0 0 < C0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 0 < 0 3 3 tf 0
< 0 0 < 0 to 0 0 p 3 ·=£ 0 3 0 < 3 p < 0 0 0 0
3 < 0 CO 0 o 0 3 0 3 0 3 0 □ 3 0 3 3 0 < 0 3 0 0
0 0 C0 p < 3 p < =£ □ p p ^3 0 p 0 LD tf < 4! 0
0 CO CO < 0 < 3 3 0 < ü 0 3 0 0 0 < 3 < LD 3 0 0 0 tf
Co Co =£ 0 < 3 0 ΐ < υ 0 0 0 0 <c 3 =£ 0 3 0 3 < tf
0 < 0 0 3 0 3 0 0 0 < 0 0 < 0 3 0 0 3 0 LD < 3 0 (3
0 0 0 0 0 3 0 0 0 tf 3 < < 0 3 0 3 3 3 3 < 0 0 0 3
Co 0 0 Co O 0 0 < tf 0 3 0 LD p rf 3 0 0 y 0 LD
0 0 < 3 0 U < 3 3 0 < 0 3 3 0 < 0 0 3 0 0 tf 0 () 0
t1) < 3 0 0 3 0 0 < 3 3 3 0 tf 0 3 3 < 0 < 0 0 0 0
0 3 0 C0 < 0 < < 3 0 0 0 0 3 3 < 0 < υ 0 < 3
o 04 NP LD CO o 04 NP LD CO O 04 LD CO O 04 LD CO O 04 LD CO
o~ θ' θ' 0- 0- co CO co co co os OS o. o. os o O o o o τ—1 r-) r-1 r-1 r-1
NP Np np NP NP np np NP •^r LD tn tn tn m m m LD m tn
ς—1 τ—1 cd cd τ—1 τ—1 Ϊ-{ ϊ—1 ϊ—1 rH rH τ—1 ϊ—1 rH rH t—1 rH cd cd 5—i ϊ—1 ϊ—1
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
tn ω ω tn tn W ω tn tn tn ω tn tn tn tn tn ω ω ω tn Ü1 ω tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
O < υ < 3 < υ 3 3 < υ (J 3 O < 3 0 α 0 0 3 3 <
υ 3 < 0 0 3 < υ υ 3 < < 3 υ 3 0 3 < 3 υ 3 υ υ υ υ
υ υ 3 < 0 0 3 < 3 υ 3 υ 3 tf υ 3 υ υ < υ υ 3 υ 0 υ
ο O 3 0 0 3 O t) tf < 3 < o 3 0 0 o
υ υ υ 0 υ < 0 0 0 3 3 3 (J 3 0 < 3 tf < 3 υ υ υ 3
υ 3 o ;> U o 0 υ 3 !) t) 3 O υ o tf υ 3 3 0 υ
< 3 3 υ < U 3 3 0 υ U υ υ 3 3 < 3 tJ 3 υ < 3 3 3
υ 3 tf □ υ 3 tf υ □ 0 υ tf υ υ υ □ < □ 3 tf υ υ υ 3
ο υ tf < ¢) t) 3 tf 3 υ 3 3 tf Q υ Q Ο tf 3 3 υ υ
3 3 0 3 υ U υ tf 0 3 υ tf □ 3 υ < < υ □ tj 0 0
3 υ 3 o 3 t) o Q 0 ·=£ tf 3 t> tf ο ¢) 3 < 3 q t) 0 0
υ υ υ 3 tf 3 υ υ 0 0 tj 3 0 3 υ υ 3 υ 3 3 υ
υ o t) tf 3 tf 3 ο 0 □ υ < 3 3 3 < υ < υ tf 3 3 0
υ < υ O □ 3 3 0 tf 3 0 0 3 Ü < υ 3 υ < 3 < 0 υ υ 3
3 ο < υ □ υ 3 < tf tf □ υ 3 tf O 0 υ υ 0 υ 3 0 tf 3 υ
υ 0 υ t) 3 o o tf tf tf υ t) tf < υ 0 3 ο υ tf < υ
3 3 0 υ 0 υ 3 υ tJ tf tf < 3 0 3 υ ο 3 3 υ < 0 0 υ 0
υ υ 3 0 υ υ υ < υ tf υ υ υ υ υ 3 υ υ 3 0 3 υ
< 3 υ 3 υ υ 3 3 < υ 0 υ υ 3 3 < 0 υ 3 υ υ 0 3 3
Ο. ι-1 η tn r- OS t-1 co tn r· OS ΐ-1 ΩΊ m Γ- OS ι-Ι cn tn Γ- OS cd cn m r·
MJ Γ- Γ- r^- r^- Γ- 00 co co co co os OS os os os Ο ο ο ο ο c-) r~i rH rH
^Ρ •^Ρ •^p np np NP NP np m m m tn tn tn tn m m
rH r-1 r~1 r~1 r~1 r-1 r-1 rH rH rH r-1 ς-1 τ-1 r~1 rH rH r~1 r~1 r~1 r~1 r~1 r-1 rH rH rH
m MD r- CO OS Ο τ—1 04 ω m MD o- CO OS Ο ΐ—1 04 09 m MJ r- CO OS
r~ θ' Γ 0- 0- CO CO CO CO CO CO CO co co CO os OS OS OS Ο. O. OS OS OS OS
Np Np Np NP NP NP nP •’φ ’ί* NP NP
co CO co co co co CO co co CO co CO co co CO co co co co CO co CO co CO CO
Q Ω Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 160/176
156/161
co <N> r-1 r-1 <N> CM ©¥> rH <N> r-1 CM CO <N> O r-1 <N> CO <N> O r-1 dfi CO CM CM <N> CM CO <N> CO dfi CO <Λ® CO τ—1 CO <N> CO oV> CO dfi τ-1 <Λ® Os
0^ <#> <#> cffi 4P <#> cffi οΆ 4P 0^ cA® cffi οΆ
o r- CO P- tn O CM tn o tn y tn CM CO to tH rH r- CO rH CO to Os Γ-
CM Ό CM rH co CO CM r- CM CM Os CM CM rH τ-i CM CM CM m rH r-1 rH rH r-1 Os
<N> <N> <N> <H> οΆ <N> <H> <N> <N> <A® <H> <N> <H> <N> <N> <H> <H>
CM CO •τΐ* CM 07 07 rH 0- CM CM CM rH CM τ-1 r-1 τ-1 Γ- 07 07 07 OS
r-1 τ—1 r-1 r-1
cA* ©¥> oV> <ffi <A° tffi oV> tffi oV5 tffi oV5
tO tn CM co y tn OS to Os O os CO τ—1 CO Γ' CO CO O r- tn τ—i tn to O
cH tn CM rH co CM cH to c-1 OS rH cH rH c-1 cH Os rH CM CM CM rH τ—í c-)
Eh EH EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH Eh EH Eh Eh EH EH EH Eh Eh EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Eh Eh Eh Eh Eh EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH EH Eh Eh Eh Eh EH
P p p ·=£ p y tn y P < tn P t) tn P y y ·=£ tn y y y tn
P < P y y y P 3 u 3 P u P u u y y P <j y u 3
< (7 □ y y P y 3 u y tn tn P P u tn tn y P y P P y tn tn
to y =£ y P t) P tn y y P tn P y P y y y y y tn
y u tn P u P P y P 3 y y y P t.n y y y y y tn 2 3 P
Γ) P t) y P P tn y y tn y 2 P P tn P y y y 2 y y
P y u < P y P y y u < y P P u P P y < y u y 0 y <
y P y y P P u y u P P < y P y y P u 2 y P P
y y tn P P P y tn y y P 2 tn tn P tn P P P 2 P y tn
ti y P P 2 tn tn 2 y t) 2 P 2 P P y tn 0 y P
to < y 2 P ·=£ tn tn 2 y y y y y y •ΐ tn P tn P tn tn < P ·=£
3 y 0 2 tn y y 0 tn tn tn u P y P y P 2 y P P y y
2 < < tn t) y y tn tn < y P y P P P P < tn tn y tn P P
0 < 3 P y u P 3 □ y 3 tn < tn P tn y P P P P
< P y y u P y 3 y y y < y y y y y P P < P < y y
P y < tn P y tn < < P tn y y P y «í P P y tn tn tn P P
tn y P P y < y P P 2 P P y u < y P tn tn P P P P <
y P y y < y y P y y tn y 3 P y P tn y < y 2 P y tn
P u y P u y y P P y u 3 y y P P y y P y y P y
O ΓΜ ^1 to CO O f\l to co O CM •'Φ tO CO O ΓΜ to CO O ΓΜ to CO
CM CM CM CM CM 07 07 07 07 07 •'φ tn m m m m to to to to to
LD ui tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
t-1 cH <-i cH cH cd cH cH <-i rH cH 1 cH rH <-i rH cH 1 rd rH 1 rH rH 1 rd
Eh Eh EH EH Eh EH EH Eh EH Eh H EH EH EH EH Eh H EH EH EH H Eh EH EH EH
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
Eh Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
y y tn y P y y y D y y < t) P y t) y t)
o u y P y y 3 u u u y P P u 3 <J u P u P < u u
u u < u P y 3 P 2 y P y P u 2 u u 3 2 P
< y P y ·=£ y P y P P 2 y tn y y P 2 y y y y 2
P < u y y u P u u 0 P y u u u 0 3 P P 0 u
t) P □ < tn y ΐ P < tn P □ y P y y P y 2 P P
P u P P u y y u y u P u < u 3 3 P 0 u o u 3
P u y P u tn y u y u u t.n < P u 3 u P y < y u
y P y P 2 P y y P tn tn y tn y y P y y < y y P P
y u P P 2 2 P u P P u P u y P < P 3 2 o u o y P <
P tn y y 2 2 2 tn y t> y p y P y y 2 P y y
u P y 0 2 2 P y y y 3 P u u P 0 3 y P y <
< y y P u 2 y y tn □ y 2 2 tn 2 < y P y tn y y y P
y < y y 3 3 0 u u y u P 2 2 P 0 3 <j u P P y P u u
y y u < y 3 2 y P u u y 2 u P u y u u u y P P
y tn D y y 2 y P P tn y y < y P < y y y y y □ y
P u 2 tn y 0 P tn u u u 3 3 tn y y u tn < tn y u
< 2 y u u < y P P tn 3 y y u P u < y P y y P
3 P u y u P P u y u y y P u y y y u P
os τ-1 co tn Γ- OS rH co tn Γ- os τ-1 CO tn Γ- Os í-1 CO tn r- Os CO tn Γ-
cH CM CM CM CM CM CO co co co co tn tn tn tn tn Ό MJ to to
lT) m m m m tn tn m tn tn m tn tn m tn tn m tn tn m tn tn m tn tn
r-1 ς-1 r~1 rH 1 τ—1 rH ς-1 1 rH 1 1 rH 1 1 rH 1 1 τ—1 1 ς-1 rH rH 1 τ—1
07 tn to y CO OS O τ—1 ΓΜ CO tn to Γ- CO Os O i—i ΓΜ 07 tn to y
U7 Ü7 tn tn tn tn tn to to to to to to to to to to r-~ r~ r~ y y y y y
to M3 to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to to
CO CO CO CO CO CO CO co co CO co co co co co co co CO co CO CO CO CO CO CO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 161/176
157/161
tn oV> CM <#> cm <#> o cd os MD 4P cn cn CM Γ- <#> CM 00 4P CM cd 4P CM cn oV> tn <#> cd CM CM cn cd 4P ^p o CM
<n> <N> <N> <H> <N> <N>
o 0 cn W cn CO ^p co c-1 OS OS m 0 0 cd cn tn cn cn O tn CN tn CD
^p cd CO 00 CD tn CD cd cn •^P CM cd 00 00 cd cn CM cd cd cn cd cd
<N> <N> <H> <N> <N>
co cn CN 0 00 co cn cd CN cd OS 0 cd CN m m CD CN τρ CN ^p cn CN ^p
CN CN cd cd CN CN CN
dfi <N> <N> <H> <H> <N> <N> dfi <N> 0^ dfi <N> <H> <H>
o os m τρ c-1 00 tD m os o cn r* os cn cd cd m m CO MD O MD 00 m cn
m c-1 CN O os CO 0 cd co os CN o Os cn 0 CD cd cd tn cd cd tn
c-1 c-1 í-)
Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn
EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
0 0 3 3 q tn tn 0 3 3 q < 3 q q 3 3 3 tn y
0 0 3 3 0 •Ϊ 0 ÍO tn 0 0 < 0 tn < 0 0 0 0 3 3 0 ÍO 0
t) 3 3 0 «cf 3 3 «4* tn tn 3 0 0 tn 0 tn 0 3 3 3
y 3 q < í tn ·* tn í q 3 q q y tn 3 q «tf tn tn 3 3 3 q
0 0 3; 0 3 0 0 < 0 0 0 3 0 < 0 3 3 3 3 0
3 < í tn 3 < < í 0 0 q ΐ q tn 3 q q tn 3 3 0 3 ·=£ tn q
3 0 3 0 0 tn tn 0 0 ÍO tn tn tn 3 3 3 tn 0 <
0 0 3 0 «cf 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 3 0 3 0 0 0 0
< 3 <g tn í 0 q o 0 0 ío q rf tn rf q q tn 0 0 ÍO ío
3 < 0 3 0 tn tn 0 0 3 tn < 0 3 tn tn 0 3 0 3 tn 3
0 tn k? tn 0 q q < í 0 q tn 3 3 q q 3 3 q
3 •3 0 0 0 < 0 0 3! 0 3; 0 3 3 < 0 O 3 0 < 0 0
í 0 0 q q 0 q o tn 3 í q 3 3 q < 3 tn < < y q q
0 0 0 0 0 tn tn tn 3 3 0 tn tn tn 3 0 3 tn 0 0 tn
0 0 0 < 0 0 0 «4* 3 0 0 3 0 0 0 0 0 3 0 0 0 «4* •3 <
í q q 0 q o q í q tn 3 q 3 q q 3 0 y 0 í q 3
C5 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 3 3; 0 0
0 < 0 tn tn 0 3 3 3 0 0 3 tn 3 0 0 3 0 tn 3 3
0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 3 0 0 ÍO 0 3 < 3 0 ÍO 0 0
O f\l MD 00 co r\i MD GO CO ΓΜ MD 00 CO ΓΜ MD GO CO CM MD OO
Γ- Γ- r- r- Γ- 00 00 00 OO GO os OS os OS OS co CO co CO O cd cd cd cd cd
m m m m m m m m tn m m m m m tn CD CD MD CD CD MD MD MD MD MD
cd <r~1 cd cd c-1 c-1 c-1 c-1 c-1 ϊ-1 ϊ-1 ξ—1 rd cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd
Eh Eh Eh EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH
ω ω ω (0 in in ω ω ω ω 0) 10 10 10 10 ω ω (0 (0 (0 in in ω ω ω
Eh Eh Eh EH EH EH EH EH EH EH EH Eh Eh EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH EH
<J 0 0 0 tn 0 3 0 < q q 0 0 y 3 y 3 3 < y q
0 3 0 0 0 0 3 3 < < 0 0 0 3 < 0 0 □ 0 0 3 < <
0 0 3 0 0 0 0 3 0 0 < 0 0 0 0 3 < 0 0 3 3 0 3 0
3 0 0 3 tn 0 tn 0 3 0 0 u < 0 0 3 < q q q 3 3 0 <
3 0 0 0 3 0 0 0 3 0 0 < 0 0 0 0 0 < 0 0 0 3 3 3
0 0 0 0 0 3 o 0 0 cr < 0 0 y 3 0 0 < y 0 tn y 3 0
3 3 0 0 u U 0 0 0 Çj 3 u < 3 0 3 < o 3 3 0 0 0
< 3 3 0 0 0 3 0 0 3 0 3 3 o 3 0 3 0 3 0 0
t) 0 3 3 0 tn 0 □ 0 3 3 0 3 0 () í < 0 0 3 «tf < y ÍO 3
3 3 0 3 3 0 0 0 0 0 3 0 D D Çj < 0 (.1 0 «tf tn < 0
3 < 3 0 3 3 tn 0 3 tn 0 0 3 0 3 0 3 0 0 0 tn q -< í
U 0 < 3 U 3 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 «3* 3 0 «c u 0 0 ü
< 3 0 3 0 3 0 0 o 0 0 3 y 0 0 çr < 3 í 3 0 tn 3
< 3 3 0 < 3 3 3 0 0 0 3 0 0 0 0 < O 3 0 0
0 0 3 3 0 0 3 0 3 0 0 3 ÍO 0 < 0 3 0 í •í 3 0
q < 0 3 3 () 3 0 3 0 3 y 0 tn y < 0 3 0 0 çf «í «3* y
0 < 0 3 3 < 3 3 0 0 3 3 3 0 0 0 0 3 u 0 «í «í <
0 0 0 3 0 0 0 0 3 3 0 0 3 0 0 0 0 0 «í 0
3 0 0 3 0 3 0 3 0 0 3 3 0 3 < 0 0 < 0 0
os c-1 cn tn 0 os c-1 cn tn Γ- OS rd cn tn 0 Os cd cn tn 0 Os cd cn tn 0
CD 0 0 0 0 0 CO CO CO CO co OS OS Os Os Os O O CO O O cd cd cd cd
ui LD LTJ tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn tn CD CD CD CD CD CD CD CD CD
cd cd cd cd c-1 c-1 c-1 c-1 cd rH rH cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd cd
CO os O c-1 ΓΝ cn ^P tn CD Γ CO OS O cd CN cn tn CD Γ- CO Os CO cd CN
0 r~ 00 OO CO CO CO CO CO co CO CO OS OS Os Os Os Os OS os Os OS O O O
tD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD r- r- Γ-
OO OO CO CO 00 00 00 00 OO co CO 00 00 00 00 OO OO OO CO CO 00 00 00 00 OO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 162/176
158/161
OS </A LD CM o r-1 o\° r- <#> o rd ©¥> CM r-1 27% rd 10% <#> m o\° CM ^p rd ^P
4P oV> <#> oV> ctfi <&> oV> 4f> oV>
ld 0 O rd 0 ^p rd 0 LO 0 lD O
CM 0 m 0 0 0 0 0 0 0 CO 0
<&> oV> oV> oV> d* cffi «íp oV> oV> oV>
LO CO r-1 0 0 ^p 0 CD ^P ^P 0 ^p 0
rd
dfi <#> dfi oV> 0^ 4f> oV>
lO O D 0 D 0 lD 0 ^P O O 0
CM 0 m 0 0 r-1 kO 0 0 0 OS 0
E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t
tn tn tn ω tn ω tn tn ω ω ω tn tn
F-t H E-t F-t E-< F-t F-t F-t H H H E-< H
0 < 3 y 0 =£ <2 y 0 <
0 < 0 3 0 0 0 0 0 0
< 0 3 0 0 tf 3 0 3 0 0 0 0
0 3 3 0 0 tf <2 3 y 0 3 3 y
3 3 0 0 0 0 o 0 < 0 3 < 0
3 0 3 0 < 0 3 < 3 0 y y
0 3 < 5 3 0 3 0 3 0
3 < 0 3 0 0 < 0 3 3 3 3 0
0 3 y 0 < 3 3 0 0 0 0
0 3 3 0 3 3 0 < 0 tf 3 0 0
3 3 0 3 0 0 3 0 3 tf ·=£ y 0
3 0 0 0 < 3 < 3 3 t3 0 0
4! 0 3 0 3 0 3 < tf
0 < 0 0 0 3 0 3 < 3 0 0
< 0 3 0 3 3 3 3 < 0 0 0 3
0 3 3 3 ·=£ 3 0 =£ y < y 0 3
3 3 0 < 0 0 3 0 0 3 0 () 0
3 0 < 0 3 3 0 < 0 0 0 0
0 < 0 3 3 < 0 < u 0 < < 3
O CM ^P LO CO O 0 ^P LD CO O 0 ^P
0 CM 0 0 0 m ΡΊ 0Ί ΩΊ m ^p ^P ^P
LD LD LD LD LD LD LD LD LD LO LO LD LO
rd 5—I rd r-1 r-1 rd rd rd 5—I 1 ν1 rd rd
E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-t
tn ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω ω
E-t E-t E-t E-t E-< E-t E-t E-t E-t E-t E-t E-< E-t
O 3 0 < 3 0 3 0 0 3 3 <
3 O 3 0 3 < 3 O 3 U O 0 0
3 tf 0 3 o 0 < 0 0 3 0 0 0
0 tf < 3 < 0 3 0 3 0 0 <
3 0 3 0 < 3 tf < 3 U 0 0 3
0 3 0 0 0 tf y 3 3 0 0
U O 3 3 < 3 (J 3 0 < 3 3 3
tf 0 0 0 3 < 3 3 tf 0 0 0 3
tf < 0 0 y 0 tf 3 3 y y
0 3 tf 0 < < 0 3 o 3 o o
3 0 tf 0 0 3 < < 3 y 0 0 0
< 3 0 3 U 0 3 0 < 3 3 0
O < 3 3 3 y < y tf 3 3 0
3 0 < 0 3 0 < 3 < 0 0 0 3
3 tf 0 0 0 0 u 0 3 0 tf 3 0
0 tf < 0 0 3 0 < y y tf < y
3 0 3 0 U 3 3 0 < 0 (J 0 0
0 3 u 0 0 3 0 0 3 0 3 0
0 0 3 3 < 0 0 3 o o 0 3 3
OS rd 0 0 0 OS r-1 0 0 0 OS rd 0
rd CM CM 0 0 0 0 0 0 0 0 ^P
LO LO LD LD LD LD LD LO LO LO LD LO LO
rd rd r-1 rd r-1 rd r-i rd rd r-1 rd rd rd
ΓΊ ^P LD LD Γ- CO OS O r-1 CM ÇO ^p m
O O O O O O O r-1 5—1 rd s“d rd rd
r~ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CO CO CO OO CO CO CO CO CO CO OO CO CO
Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 163/176
159/161
Tabela 2A: concentração em 50% de inibição (IC50) para agentes exemplares de iRNA de tabela 1A
Duplex ID IC50 [nM] H441
ND8294 0,1949
ND8295 0,1011
ND8299 0,5986
ND8302 0,0144
ND8313 0,0315
ND8320 0,0796
ND8331 0,0213
ND8332 0,0205
ND8343 0,0523
ND8348 0,0156
ND8356 0,0241
ND8357 0,0054
ND8363 0,1186
ND8368 0,0487
ND8371 0,0811
ND8372 0,0584
ND8373 0,0066
ND8375 0,1176
ND8380 0,6817
ND8381 0,0037
ND8383 0,0275
ND8384 0,0357
ND8391 0,0260
ND8392 0,3831
ND8396 0,0023
ND8403 0,0808
1° DRC em IC50 [nM] 2 em H441 0,0468 0,0458 0,5638 0,0134 0,0124 0,0078 0,0158 0,0089 0,0293 0,0182 0,0099 0,0032 0,0337 0,1209 0,0911 0,0425 0,0165 0,1187 0,5747 0,0041 0,1257 0,0082 0,0349 0,4775 0,0052 0,0759
DRC
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 164/176
160/161
Tabela 2B: concentração a 50% de inibição (IC50) e para agentes exemplares de iRNA da tabela 1D
Duplex ID IC50 [nM] 1° DRC em H441 IC50 [nM] 2°
DRC em H441
ND8441 0,6738 0,8080
ND8443 0,0346 0,0263
ND8449 0,0120 0,0067
ND8450 0,0257 0,0106
ND8451 0,1320 0,0931
ND8453 0,0079 0,0033
ND8489 0,1640 0,1593
ND8496 0,0387 0,0185
Tabela 2C: % de atividade exemplar de RNAi para inibição de expressão de gene alfa-ENaC nos testes descritos no Exemplo 3
Identificador de Duplex % de expressão de alfa-ENaC em HBEC primário (% de controle) 50nM de siRNA expressão em cinomólogo de alfa-ENaC (% de controle) 45nM de siRNA
Não-transfectado 77,2 n/a
Controle sem definir a 100 93,3
meta
Controle negativo (não- n/a 100
cino alfa-ENaC)ND8449
ND-8302 30, 2 57
ND-8332 24,7 54,3
ND-8348 40,1 56,2
ND-8356 36,6 55,8
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 165/176
161/161
Identificador de Duplex % de expressão expressão em
de alfa-ENaC em cinomólogo de
HBEC primário (% alfa-ENaC (% de
de controle) 50nM controle) 45nM
de siRNA de siRNA
ND-8357 29,6 50,4
ND-8373 30,4 53,8
ND-8381 32,5 40,4
ND-8396 34,1 46,3
ND-8450 45,9 78,9
ND-8453 30,1 55,3
Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 166/176
1/5

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um agente de iRNA para alfa-ENaC, constituído por uma fita senso e uma fita antissenso, sendo que:
    (a) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8396 (SEQ ID NO: 223), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8396 (SEQ ID NO: 224); ou (b) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8612 (SEQ ID NO: 527), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8612 (SEQ ID NO: 528); ou (c) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND10781 (SEQ ID NO: 1281), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND10781 (SEQ ID NO: 1282); ou (d) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8356 (SEQ ID NO: 143), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8356 (SEQ ID NO: 144); ou (e) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos de fita senso de ND8379 (SEQ ID NO: 189), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos de fita antissenso de ND8379 (SEQ ID NO: 190); ou (f) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8572 (SEQ ID NO: 447), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8572 (SEQ ID NO: 448); ou (g) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8595 (SEQ ID NO: 493), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8595 (SEQ ID NO: 494); ou
    Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 167/176
  2. 2/5 (h) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8357 (SEQ ID NO: 145), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8357 (SEQ ID NO: 146); ou (i) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8573 (SEQ ID NO: 449), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8573 (SEQ ID NO: 450); ou (j) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8313 (SEQ ID NO: 57), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8313 (SEQ ID NO: 58); ou (k) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8496 (SEQ ID NO: 1511), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8496 (SEQ ID NO: 1512); ou (l) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8712 (SEQ ID NO: 1637), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8712 (SEQ ID NO: 1638); ou (m) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8453 (SEQ ID NO: 1425), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8453 (SEQ ID NO: 1426); ou (n) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8489 (SEQ ID NO: 1497), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8489 (SEQ ID NO: 1498); ou (o) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND8456 (SEQ ID NO: 1431), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND8456 (SEQ ID NO: 1432); ou
    Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 168/176
  3. 3/5 (p) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND9201 (SEQ ID NO: 1297), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND9201 (SEQ ID NO: 1298); ou (q) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de ND10630 (SEQ ID NO: 979), e a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de ND10630 (SEQ ID NO: 980).
    2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fita senso e a fita antissenso formam uma região duplex de pares de 15 a 30 nucleotídeos em comprimento.
    3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fita senso e a fita antissenso são, cada uma, de 19 a 23 nucleotídeos de comprimento.
  4. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA compreende um fosforotioato ou um nucleotídeo 2' modificado.
  5. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA compreende: dinucleotídeo de uma 5'-uridina-adenina-3' (5'-ua-'), no qual a uridina é um nucleotídeo 2' modificado; dinucleotídeo de uma 5'-uridina-guanina-3' (5'-ug-3'), no qual a uridina-5' é um nucleotídeo 2' modificado; dinucleotídeo de uma 5'-citidina-adenina-3' (5'-ca-3'), no qual a citidina-5' é um nucleotídeo 2' modificado; ou dinucleotídeo de uma 5-uridina-uridina-3' (5'-uu-3'), no qual a uridina-5' é um nucleotídeo 2' modificado.
  6. 6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA compreende uma modificação 2' selecionada a partir do grupo constituído por: 2-deóxi, deóxi-fluoro2'-2', 2'-O-metil, 2-O-metóxietil (2-O-MOE), 2'-O-aminopropil (2'-OAP), 2'-O-dimetilaminoetila (2-O-DMAOE), 2-O-dimetilaminopropila (2'-O-DMAP), 2-O-dimetilaminoetiloxietila (2-O-DMAEOE) e 2'-O-Nmethylacetamida (2-O-NMA).
    Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 169/176
    4/5
  7. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA compreende uma extremidade cega.
  8. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA compreende uma caudade nucleotídeo apresentando 1 a 4 nucleotídeos não pareados.
  9. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA compreende uma cauda de nucleotídeo na extremidade 3' da fita antissenso do agente iRNA.
  10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA é ND10630 (SEQ ID NOs: 979 e 980).
  11. 11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o agente de iRNA é ligado a um ou mais composto diagnóstico, grupo repórter, agente reticulante, porção que confere resistência a nuclease, nucleobase natural ou incomum, molécula lipofílica, colesterol, lipídios, lectina, esteróide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpenos, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelin, ácido litocólico derivatizado de epifriedelanol, vitamina, carboidratos, dextrano, pululano, quitina, quitosana, hidrato de carbono sintético, oligo lactato 15-mer, polímero natural, polímero de peso molecular baixo ou médio, inulina, ciclodextrina, ácido hialurônico, proteína, agente ligante de proteína, molécula alvo de integrina, policatiônico, peptídeo, poliamina, peptídeo mimético, e/ou transferrina.
  12. 12. Composição, caracterizada pelo fato de que inclui um agente de iRNA para alfa-ENaC, sendo que o agente iRNA é composto por uma fita senso e uma fita antissenso, na qual o agente iRNA é composto por uma fita senso e uma fita antissenso, sendo que:
    (a) a fita senso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita senso de um agente de iRNA selecionado a partir do grupo constituído por: ND8396 (SEQ ID NO: 223), ND8612 (SEQ ID NO: 527), ND10781 (SEQ ID NO: 1281), ND8356 (SEQ ID NO: 143), ND8379
    Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 170/176
    5/5 (SEQ ID NO: 189), ND8572 (SEQ ID NO: 447), ND8595 (SEQ ID NO: 493), ND8357 (SEQ ID NO: 145), ND8573 (SEQ ID NO: 449), ND8313 (SEQ ID NO: 57), ND8496 (SEQ ID NO: 1511), ND8712 (SEQ ID NO: 1637), ND8453 (SEQ ID NO: 1425), ND8489 (SEQ ID NO: 1497), ND8456 (SEQ ID NO: 1431), ND9201 (SEQ ID NO: 1297) e ND10630 (SEQ ID NO: 979);
    (b) a fita antissenso compreende 19 nucleotídeos contíguos da fita antissenso de um agente de iRNA selecionado a partir do grupo constituído por: ND8396 (SEQ ID NO: 224), ND8612 (SEQ ID NO: 528), ND10781 (SEQ ID NO: 1282), ND8356 (SEQ ID NO: 144), ND8379 (SEQ ID NO: 190), ND8572 (SEQ ID NO: 448), ND8595 (SEQ ID NO: 494), ND8357 (SEQ ID NO: 146), ND8573 (SEQ ID NO: 450), ND8313 (SEQ ID NO: 58), ND8496 (SEQ ID NO: 1512), ND8712 (SEQ ID NO: 1638), ND8453 (SEQ ID NO: 1426); ND8489 (SEQ ID NO: 1498), ND8456 (SEQ ID NO: 1432), ND9201 (SEQ ID NO: 1298) e ND10630 (SEQ ID NO: 980); e (c) a composição ainda compreende um ligante do receptor epitelial.
  13. 13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o ligante do receptor epitelial é (i) transferrina, ou (ii) ácido fólico.
  14. 14. Uso de um agente de iRNA para alfa-ENaC, constituído por uma fita senso e uma fita antissenso, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição para o tratamento de uma doença mediada por disfunção do canal de sódio epitelial selecionado a partir de: fibrose cística, discinesia ciliar primária, bronquite crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), asma, infecção do trato respiratório, carcinoma de pulmão, síndrome de Liddles, hipertensão, insuficiência renal e desequilíbrio eletrolítico.
    Petição 870170068438, de 14/09/2017, pág. 171/176
    1/5
    Eig 1:
    EcoRl (24) ' P.ttl (90} ' CDNA 5'-UTR de subunidade ! ENaC alfa de cinomolqo 5‘-ÜTR Hirtd III (476)
    ColE1
    ApaLI (6849) pA
    Ncol (5925)
    NeoPs?/ (5546, eGFP
    Smal (8218) T7 BamHI (1)
    Aval
    Xmal
    Ncol (7858)
    PstI (3416) Aval (3458)
    CDNA CDS de subunidade de ENaC alfa de cinomolgo
    CDS \XmaI (1152)
    Aval (1152)
    Smal (1154) ‘ ApaLI (1263)
    PstI (2377)
    CDNA 3'-UTF de subunidade de
    ENaC alfa de cinomolgo
    Ncol (4655)
    EM7 Smal (4551) Aval (4549) Xmal
    Aval (2653)
    Hindlll (2809) EcoRl (3128) PstI (3137) EcoRV (3140)
    - (3161)
    2/5
    Fig 2..
    SEQ.I.D.NO:1682
    GAATTCGCCCTTGGCCGCTGCACCTGTAGGGGAACAAGCTGGAGGAGCAGGA
    CCCTAGACCTCTGCAGCCCACCGCAGGGCTCATGGAGGGGAACAAGCTGGAGGAGCA
    GGACGCTAGCCCTCCACAGCCCACCCCAGGGCTCATGAAGGGGGACAAGCGTGAGGA
    GCAGGGGCTGGGCCCAGAACCTGCGGCACCCCAGCAGCCCACGGCGGAGGAGGAGGC
    CCTGATCGAGTTCCACCGCTCCTACCGAGAGCTCTTCGAGTTCTTCTGCAACAATAC
    CACCATCCACGGCGCCATCCGCCTGGTGTGCTCCCAGCACAACCGCATGAAGACGGC
    CTTCTGGGCAGTGCTCTGGCTCTGCACCTTTGGCATGATGTACTGGCAATTCGGCCT
    GCTTTTCGGAGAGTACTTCAGCTACCCCGTCAGCCTCAACATCAACCTCAACTCGGA
    CAAGCTTGTCTTCCCCGCAGTGACCATCTGCACCCTCAATCCCTACAGGTATCCGGA
    AATTAAAGAGGAGCTGGAGGAGCTGGACCGCATCACACAGCAGACGCTCTTTGACCT
    GTACAAATACGACTCCTCCCCCACCCTCGTGGCCGGCTCCCGCGGCCGTCGTGACCT
    GCGGGGCACTCTGCCGCACCTCTTGCAGCGCCTGAGGGTCCCGTCCCCGCTTCACGG
    GGCCCGTCAAGCCCGTAGCGTGGCCTCCAGCGTGCGGGACAACAACCCCCAAGTGGA
    C T GGAAGG AC T GG AAGATCGGT Τ T C GAGC TG T GC AAC C AGAAC AAAT C AGAC T GC Τ T
    CTACCAGACATACTCATCAGGGGTGGATGCAGTGAGGGAGTGGTACCGCTTCCACTA
    CATCAACATCCTGTCGAGGCTGCCAGAGACTCTGCCATCCCTGGAGGAGGACACACT
    GGGCAACTTCATCTTCGCCTGCCGCTTCAACCAGGTCTCCTGCAACCAGGCGAATTA
    CTCTCACTTCCACCACCCAATGTATGGAAACTGCTATACTTTCAATGACAAGAACAA
    CTCTAACCTCTGGATGTCTTCCATGCCTGGAGTCAACAACGGTCTGTCCCTGATGCT
    GCGCACAGAGCAGAATGACTTCATTCCCCTGCTGTCCACAGTGACTGGGGCCCGGGT
    AATGGTGCACGGGCAGGATGAACCTGCCTTTATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCG
    GCCTGGCGTGGAGACCTCCATCAGCATGAGGAAGGAAGCCCTGGACAGACTTGGGGG
    CGACTATGGCGACTGCACCAAGAATGGCAGTGATGTCCCTGTCAAGAACCTTTACCC
    TTCAAAGTACACGCAGCAGGTGTGTATTCACTCCTGCTTCCAGGAGAACATGATCAA
    GGAGTGTGGCTGTGCCTACATCTTCTATCCGCGGCCGCAGAACATGGAGTACTGTGA
    CTACAGGAAGCACAGTTCCTGGGGCTACTGCTACTATAAGCTCCAGGCTGACTTCTC
    CTCAGACCACCTGGGCTGTTTCACCAAGTGCCGGAAGCCATGCAGTGTGACCAGCTA
    CCAGCTCTCGGCTGGTTACTCACGATGGCCCTCGGTGACATCCCAGGAATGGGTCTT
    CGAGATGCTATCGCGACAGAACAACTACACCATCAACAACAAGAGAAATGGAGTGGC
    CAAAGTCAACATCTTCTTCAAGGAGCTGAACTACAAAACCAATTCTGAGTCTCCCTC
    3/5
    TGTCACGATGGTCACCCTCCTGTCCAACCTGGGCAGCCAGTGGAGCCTGTGGTTCGG
    CTCCTCAGTGCTGTCTGTGGTGGAGATGGCTGAGCTCATCTTTGACCTGCTGGTCAT
    CACATTCCTCCTGCTGCTCCGAAGGTTCCGAAGCCGATACTGGTCTCCAGGCCGAGG
    GGACAGGGGTGCTCAGGAGGTGGCCTCCACCCAGGCATCCTCCCCGCCTTCCCACTT
    CTGCCCCCACCCCACATCTCTGTACTTGTCCCAACTAGGCCCTGCTCCCTCCCCAGC
    CTTGACAGCCCCTCCCCCTGCCTATGCCACCCTGGGCCCCTGCCCATCTCCAGGGGG
    CTCCGCAGGGGCCAGCTCCACTGCCTATCCTCTGGGGGGGCCCTGAGAGAGGAGAGG
    TTCCTTGCACCAAGGCAGATGCTCCCCTGGTGGGAGGGTGCTGCCCTTGGCAAGATT
    GAAGGATGTGCAGGGCTTCCTCTCAGAGCCGCCCAAACTGCCCTTGATGTGTGGAGG
    GGAAGCGAGATGGGTAAGGGGCTCAGGAAGTTGTTCCAAGAACAGTGGCCAATGAAG
    CTGCCCAGAAGTGCCTTGGCTCTGGCTCTGTACCCCTTGGTACTGCCTCTGAACACT
    CTGGTTTCCCCACCCAACTGCAGCTAAGTCTCCTTTTCCCTTGGATCAGCCAAGCCA
    AACTTGGAGCTTTGACAAGGAACTTTCCTAAGAAATGGCTGATGACCAGGACAAAAC
    ACAACCAAGGGTACACACAGGCATGCACGCGTTTCCTGCCTGGCGACAGGTGAAGCC
    AGCCCCTGACTGACCTGGCCACACTGCTCTCCAGTAACACAGATGTCTGCCCCTCAT
    CTTGAACTTGGGTGGGAAACCCCACCCAAAAGCCCCCTTTATTACTTAGGCAATTCC
    CCTTCCCTGACTCCCGAGAGCCAGGGCCAGAGCAGACCCGTATAAGTAAAGGCAGCT
    CCAGGGCTCCTCTAGGCTCATACCCGTGCCCTCACAGAGCCATGCTCCAGCGCTTCT
    GTCCTGTGTCTTTCGTCCCTCTACATGTCTGCTCAAGACATTTTCTCAGCCTGAAAG
    CTTCCCCAGCCATCTGCCGGAGAACTCCTATGCATCCCTCAGAACCCTGCTCAGACA
    CCATTACTTTTGTGAAGGCTTCTGCCACATCTTGTCGTCCCAAAAATTGATCACTCC
    CCTTTCTGGTGGGCTCCCGTAGCACACTATAACATCTGCTGGAGTGTTGCTGTTGCA
    CCATACTTTCTTGTACGTTTGTGTCTGCCTCCCCAACTGGACTGTGAGGGCCTTGTG
    GCCAGGGACTGAGTCTTGCCCGTTTATGTATGCTCCGTGTCTAGCCCATCATCCTGC
    TTGAAGCAAGTAGGCAGATGCTCAAAAGGGCGAATTCTGCAGATATC
    Tradução:
    SEQ.I.D.NO:1681
    MEGNKLEEQDASPPQPTPGLMKGDKREEQGLGPEPAAPQQPTAEEEALIEFH RSYRELFEFFCNNTTIHGAIRLVCSQHNRMKTAFWAVLWLCTFGMMYWQFGLLFGEY FSYPVSLNINLNSDKLVFPAVTICTLNPYRYPEIKEELEELDRITQQTLFDLYKYDS S PTLVAGSRGRRDLRGTLPHLLQRLRVPS PLHGARQARSVAS SVRDNNPQVDWKDWK
    4/5
    IGFELCNQNKSDCFYQTYSSGVDAVREWYRFHYINILSRLPETLPSLEEDTLGNFIF
    ACRFNQVSCNQANYSHFHHPMYGNCYTFNDKNNSNLWMSSMPGVNNGLSLMLRTEQN
    DFIPLLSTVTGARVMVHGQDEPAFMDDGGFNLRPGVETSISMRKEALDRLGGDYGDC
    TKNGSDVPVKNLYPSKYTQQVCIHSCFQENMIKECGCAYIFYPRPQNMEYCDYRKHS
    SWGYCYYKLQADFSSDHLGCFTKCRKPCSVTSYQLSAGYSRWPSVTSQEWVFEMLSR
    QNNYTINNKRNGVAKVNIFFKELNYKTNSESPSVTMVTLLSNLGSQWSLWFGSSVLS
    VVEMAELIFDLLVITFLLLLRRFRSRYWSPGRGDRGAQEVASTQASSPPSHFCPHPT
    SLYLSQLGPAPSPALTAPPPAYATLGPCPSPGGSAGASSTAYPLGGP
    5/5
    Firefly Luciferase
BRPI0813680A 2007-06-15 2008-06-13 composição compreendendo um agente de irna para alfa-enac, constituído por um fita senso e uma fita antissenso, e seu uso BRPI0813680A8 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07110376 2007-06-15
EP07110376.6 2007-06-15
EP07114265.7 2007-08-13
EP07114265 2007-08-13
PCT/EP2008/057476 WO2008152131A2 (en) 2007-06-15 2008-06-13 Rnai inhibition of alpha-enac expression

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0813680A2 BRPI0813680A2 (pt) 2015-01-06
BRPI0813680B1 true BRPI0813680B1 (pt) 2018-02-06
BRPI0813680A8 BRPI0813680A8 (pt) 2018-08-28

Family

ID=40130244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0813680A BRPI0813680A8 (pt) 2007-06-15 2008-06-13 composição compreendendo um agente de irna para alfa-enac, constituído por um fita senso e uma fita antissenso, e seu uso

Country Status (26)

Country Link
US (12) US7718632B2 (pt)
EP (7) EP2224005B1 (pt)
JP (6) JP5485146B2 (pt)
KR (2) KR101653008B1 (pt)
CN (1) CN101778941B (pt)
AR (1) AR066984A1 (pt)
AU (1) AU2008263876B2 (pt)
BR (1) BRPI0813680A8 (pt)
CA (1) CA2690674C (pt)
CL (1) CL2008001756A1 (pt)
CO (1) CO6251331A2 (pt)
CR (1) CR11136A (pt)
CU (1) CU23774A3 (pt)
EA (1) EA200901653A1 (pt)
EC (1) ECSP099794A (pt)
ES (6) ES2432158T3 (pt)
GT (1) GT200900315A (pt)
IL (1) IL202366A0 (pt)
MA (1) MA31564B1 (pt)
MX (1) MX2009013609A (pt)
PE (1) PE20090942A1 (pt)
SG (3) SG169988A1 (pt)
SV (1) SV2009003434A (pt)
TN (1) TN2009000521A1 (pt)
TW (3) TWI444474B (pt)
WO (1) WO2008152131A2 (pt)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004011647A1 (en) 2002-07-26 2004-02-05 Chiron Corporation Modified small interfering rna molecules and methods of use
KR100473148B1 (ko) * 2002-11-27 2005-03-10 (주)텔리언 버스트모드 패킷 전달을 위한 정합장치 및 방법
JP2008514242A (ja) * 2004-10-01 2008-05-08 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 改変型の小さい干渉ｒｎａ分子および使用方法
US8765704B1 (en) 2008-02-28 2014-07-01 Novartis Ag Modified small interfering RNA molecules and methods of use
AR066984A1 (es) 2007-06-15 2009-09-23 Novartis Ag Inhibicion de la expresion de la subunidad alfa del canal epitelial de sodio (enac) por medio de arni (arn de interferencia)
US20110288154A1 (en) * 2008-11-26 2011-11-24 Merck & Co., Inc. RNA Interference Mediated Inhibition of Epithelial Sodium Channel (ENaC) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP2756845B1 (en) * 2009-04-03 2017-03-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA
EP2415869A4 (en) * 2009-04-03 2013-06-19 Biomics Biotechnologies Co Ltd MODIFIED OLIGO-NUCLEIC ACID MOLECULE, PROCESS FOR PREPARATION AND USES THEREOF
CN103275978B (zh) * 2009-04-03 2014-10-29 百奥迈科生物技术有限公司 修饰的小干扰核酸及其制备方法
US20120207818A1 (en) * 2009-07-14 2012-08-16 Shinohara Fumikazu Composition for suppressing expression of target gene
US20130079382A1 (en) * 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
CN105125572A (zh) 2009-12-18 2015-12-09 箭头研究公司 用于治疗hsf1相关疾病的有机组合物
EP3431604A1 (en) * 2010-04-23 2019-01-23 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat beta-enac-related diseases
CN103703141B (zh) * 2011-04-08 2016-08-17 伯乐实验室公司 具有降低的非特异性活性的pcr反应混合物
CA2871089A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Smith Holdings, Llc Methods and compositions for modulating gene expression using components that self assemble in cells and produce rnai activity
EP3521432A1 (en) 2011-09-02 2019-08-07 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat hsf1-related diseases
ES2906109T3 (es) 2016-11-01 2022-04-13 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Ligandos de la integrina alfa- v beta-6 y usos de los mismos
TN2019000308A1 (en) 2017-07-06 2021-05-07 Arrowhead Pharmaceuticals Inc RNAi AGENTS FOR INHIBITING EXPRESSION OF ALPHA-ENaC AND METHODS OF USE
WO2019089692A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODULATORS OF ENaC EXPRESSION
EP3703700A4 (en) * 2017-11-01 2021-08-04 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. INTEGRIN LIGANDS AND USES THEREOF
CN109364248B (zh) * 2018-10-16 2021-05-18 哈尔滨医科大学 ENaC及其抑制剂在预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化中的应用
US20220339136A1 (en) * 2019-08-30 2022-10-27 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Liposomal troponoid compound formulations
US11957178B2 (en) 2021-11-15 2024-04-16 Apackaging Group Llc Aerosol actuator

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4837026A (en) * 1985-10-03 1989-06-06 Rajakhyaksha Vithal J Transdermal and systemic preparation and method
DE3604625C2 (de) * 1986-02-14 1994-01-20 Bmw Rolls Royce Gmbh Gasturbine
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5451670A (en) * 1987-12-09 1995-09-19 City Of Hope Restriction fragment length polymorphism test for haplotyping domesticated fowl
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5013566A (en) * 1988-12-19 1991-05-07 Sampson Michael James Process for obtaining improved yields from plants used for hay making by using a coating agent
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
CA2156288C (en) 1993-02-19 2005-10-18 Junichi Yano Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
CA2137297C (en) 1993-12-06 2000-04-18 Tsuyoshi Miyazaki Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
JP3543347B2 (ja) * 1994-01-24 2004-07-14 日本油脂株式会社 点火薬造粒物の製造方法
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
ATE247971T1 (de) 1995-08-01 2003-09-15 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Liposomale oligonukleotidzusammensetzungen
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6218108B1 (en) 1997-05-16 2001-04-17 Research Corporation Technologies, Inc. Nucleoside analogs with polycyclic aromatic groups attached, methods of synthesis and uses therefor
US5865710A (en) * 1996-08-01 1999-02-02 Wilson-Hyde; Cynthia Step aerobic platform
CA2283293A1 (en) * 1997-03-11 1998-09-17 Yale University Method to diagnose and treat pathological conditions resulting from deficient ion transport such as pseudohypoaldosteronism type-1
DE69834038D1 (de) 1997-07-01 2006-05-18 Isis Pharmaceutical Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US5976849A (en) * 1998-02-05 1999-11-02 Zeneca Limited Human E3 ubiquitin protein ligase
MXPA01009073A (es) 1999-03-10 2002-05-06 Phogen Ltd Suministro de acidos nucleicos y proteinas a las celulas.
CZ302719B6 (cs) * 2000-12-01 2011-09-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití
US20030064385A1 (en) 2001-05-16 2003-04-03 Dressman Marlene Michelle Genes expressed in breast cancer as prognostic and therapeutic targets
AU2002364612A1 (en) 2001-12-31 2003-07-24 Algos Therapeutics, Inc. METHODS AND MATERIALS FOR MODULATING ENaC-BETA
WO2004011647A1 (en) 2002-07-26 2004-02-05 Chiron Corporation Modified small interfering rna molecules and methods of use
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
GB0218970D0 (en) 2002-08-14 2002-09-25 Creative Peptides Sweden Ab Fragments of Insulin c-peptide
EP1560931B1 (en) * 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
MXPA05005653A (es) 2002-11-27 2005-11-23 Artesian Therapeutics Inc Determinacion y seleccion terapeutica de genes de insuficiencia cardiaca.
AU2002368410A1 (en) 2002-11-29 2004-06-23 Basf Aktiengesellschaft Methods for the production of methionine
DE10305213A1 (de) * 2003-02-07 2004-08-26 Florian Prof. Dr.med. Lang Verwendung eines neuen Polymorphismus im hsgk1-Gen zur Diagnose der Hypertonie und Verwendung der sgk-Genfamilie zur Diagnose und Therapie des Long-Q/T-Syndroms
JP2006521825A (ja) * 2003-03-31 2006-09-28 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン ｒＡＡＶ導入を高めるための化合物および方法
US7723509B2 (en) * 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
WO2004094636A1 (en) 2003-04-24 2004-11-04 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
US20050256071A1 (en) * 2003-07-15 2005-11-17 California Institute Of Technology Inhibitor nucleic acids
JP4530335B2 (ja) * 2004-02-03 2010-08-25 独立行政法人科学技術振興機構 膀胱に発現する上皮型ナトリウムチャネルに対する阻害薬
WO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
SE0402832D0 (sv) * 2004-11-18 2004-11-18 Astrazeneca Ab Methods
US7923206B2 (en) * 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Method of determining a cellular response to a biological agent
JP2008523157A (ja) * 2004-12-14 2008-07-03 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ＭＬＬ−ＡＦ４のＲＮＡｉ調節およびその使用方法
WO2007051303A1 (en) * 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
WO2007070509A2 (en) * 2005-12-13 2007-06-21 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Epithelial sodium channel inhibiting agents and uses therefor
CN101500548A (zh) 2006-08-18 2009-08-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
WO2008043561A2 (en) 2006-10-11 2008-04-17 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Influenza targets
AR066984A1 (es) * 2007-06-15 2009-09-23 Novartis Ag Inhibicion de la expresion de la subunidad alfa del canal epitelial de sodio (enac) por medio de arni (arn de interferencia)

Also Published As

Publication number Publication date
US8168606B2 (en) 2012-05-01
ES2432644T3 (es) 2013-12-04
US9476052B2 (en) 2016-10-25
JP5485146B2 (ja) 2014-05-07
SG169988A1 (en) 2011-04-29
US20090156529A1 (en) 2009-06-18
SV2009003434A (es) 2011-03-23
KR101821081B1 (ko) 2018-01-23
EP2223692A1 (en) 2010-09-01
JP2022188234A (ja) 2022-12-20
MA31564B1 (fr) 2010-08-02
CN101778941A (zh) 2010-07-14
CN101778941B (zh) 2013-05-22
EP2171059A2 (en) 2010-04-07
AU2008263876A1 (en) 2008-12-18
US9914927B2 (en) 2018-03-13
AU2008263876B2 (en) 2012-04-12
SG10201404955RA (en) 2014-10-30
WO2008152131A2 (en) 2008-12-18
EP2223693B1 (en) 2013-07-24
GT200900315A (es) 2011-10-05
JP2017222704A (ja) 2017-12-21
EP2224005B1 (en) 2013-09-11
ES2432532T3 (es) 2013-12-04
TWI629063B (zh) 2018-07-11
EP2224005A1 (en) 2010-09-01
JP2015145393A (ja) 2015-08-13
CR11136A (es) 2010-01-20
EA200901653A1 (ru) 2010-06-30
JP5719047B2 (ja) 2015-05-13
EP2223693A1 (en) 2010-09-01
SG10201601846VA (en) 2016-04-28
US20220235361A1 (en) 2022-07-28
AR066984A1 (es) 2009-09-23
BRPI0813680A8 (pt) 2018-08-28
US20200157550A1 (en) 2020-05-21
US7718632B2 (en) 2010-05-18
US11208662B2 (en) 2021-12-28
US9074212B2 (en) 2015-07-07
US20150284726A1 (en) 2015-10-08
US8119612B2 (en) 2012-02-21
MX2009013609A (es) 2010-01-20
CA2690674A1 (en) 2008-12-18
US10544418B2 (en) 2020-01-28
PE20090942A1 (es) 2009-08-05
CO6251331A2 (es) 2011-02-21
JP2014129373A (ja) 2014-07-10
KR101653008B1 (ko) 2016-08-31
US20100216971A1 (en) 2010-08-26
EP2224004A1 (en) 2010-09-01
CL2008001756A1 (es) 2009-02-20
EP2223692B1 (en) 2013-07-24
JP2020094063A (ja) 2020-06-18
US20100216972A1 (en) 2010-08-26
EP2223694B1 (en) 2013-07-24
EP2223695A1 (en) 2010-09-01
JP6680728B2 (ja) 2020-04-15
US7939508B2 (en) 2011-05-10
CA2690674C (en) 2018-09-11
TWI552753B (zh) 2016-10-11
US7943592B2 (en) 2011-05-17
TWI444474B (zh) 2014-07-11
KR20100039335A (ko) 2010-04-15
TW201524510A (zh) 2015-07-01
ES2432158T3 (es) 2013-12-02
US20100210514A1 (en) 2010-08-19
ES2432643T3 (es) 2013-12-04
JP7157775B2 (ja) 2022-10-20
US20100190714A1 (en) 2010-07-29
CU23774A3 (es) 2012-02-15
BRPI0813680A2 (pt) 2015-01-06
US20220112505A1 (en) 2022-04-14
US20100210513A1 (en) 2010-08-19
US20180148726A1 (en) 2018-05-31
EP2224004B1 (en) 2013-07-24
ECSP099794A (es) 2010-01-29
ES2439277T3 (es) 2014-01-22
WO2008152131A3 (en) 2009-05-28
IL202366A0 (en) 2011-08-01
ES2432157T3 (es) 2013-12-02
TW200911989A (en) 2009-03-16
KR20160105530A (ko) 2016-09-06
EP2223694A1 (en) 2010-09-01
TW201636027A (zh) 2016-10-16
US20160376599A1 (en) 2016-12-29
TN2009000521A1 (en) 2011-03-31
JP2010530369A (ja) 2010-09-09
EP2223695B1 (en) 2013-07-24
JP6193906B2 (ja) 2017-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11208662B2 (en) RNAi inhibition of alpha-ENaC expression
AU2018256632B2 (en) RNAi inhibition of alpha-ENaC expression

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]