ES2432644T3 - Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC - Google Patents

Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC Download PDF

Info

Publication number
ES2432644T3
ES2432644T3 ES10163500T ES10163500T ES2432644T3 ES 2432644 T3 ES2432644 T3 ES 2432644T3 ES 10163500 T ES10163500 T ES 10163500T ES 10163500 T ES10163500 T ES 10163500T ES 2432644 T3 ES2432644 T3 ES 2432644T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
rnai agent
seq
enac
alpha
antisense strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10163500T
Other languages
English (en)
Inventor
Gino Van Heeke
Emma Hickman
Henry Luke Danahay
Pamela Tan
Anke Geick
Hans-Peter Vornlocher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2432644T3 publication Critical patent/ES2432644T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Composición que comprende un agente de ARNi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en laque: a. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8356 (SEQ ID NO: 143)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8356 (SEQ IDNO: 144); o b. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8379 (SEQ ID NO: 189)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8379 (SEQ IDNO: 190); o c. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8572 (SEQ ID NO: 447)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8572 (SEQ IDNO: 448); o d. la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8595 (SEQ ID NO: 493)y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND 8595 (SEQ IDNO: 494).

Description

Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC
Campo técnico
La invención se refiere al campo del transporte de iones en las vías respiratorias mediado por ENaC y a composiciones y a métodos para modular la expresión de alfa-ENaC, y más particularmente a la regulación por disminución de alfa-ENaC por oligonucleótidos a través de interferencia por ARN que se administran localmente a los pulmones y el conducto nasal a través de inhalación/administración intranasal, o se administran sistémicamente, por ejemplo mediante inyección intravenosa.
Antecedentes
La interferencia por ARN o “iARN” es un término acuñado inicialmente por Fire y colaboradores para describir la observación de que ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al., Nature 391: 806-811, 1998). El ARNbc corto dirige el silenciamiento postranscripcional, específico de genes en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función génica. Esta tecnología se ha revisado numerosas veces recientemente, véanse, por ejemplo Novina, C.D:, y Sharp, P., Nature 2004, 430:161, y Sandy, P., et al., Biotechniques 2005, 39:215.
Las superficies mucosas en la superficie de contacto entre el entorno y el cuerpo han hecho evolucionar varios mecanismos protectores. Una forma principal de tal defensa innata es limpiar estas superficies con líquido. Normalmente, la cantidad de la capa de líquido en una superficie mucosa refleja el equilibrio entre la secreción líquida epitelial, que a menudo refleja la secreción de aniones (Cl- y/o HCO3-) acoplada con agua (y un contraión catiónico) y la absorción de líquido epitelial, que a menudo refleja la absorción de Na+, acoplada con agua y contraanión (Cl- y/o HCO3-). Muchas enfermedades de las superficies mucosas están provocadas por demasiado poco líquido protector en esas superficies mucosas creado por un desequilibrio entre la secreción (demasiado poca) y la absorción (relativamente demasiada). Los procesos de transporte salino defectuosos que caracterizan estas disfunciones mucosas residen en la capa epitelial de la superficie mucosa. Un enfoque para reponer la capa de líquido protector en las superficies mucosas es “reequilibrar” el sistema bloqueando la absorción de líquido mediada por el canal de Na+. La proteína epitelial que media la etapa limitante de la velocidad de la absorción de Na+ y líquido es el canal de Na+ epitelial (ENaC). Alfa-ENaC está situado en la superficie apical del epitelio, es decir, la superficie de contacto entre superficie mucosa-entorno. La inhibición de la absorción de líquido mediada por Na+ mediada por alfa-ENaC puede obtener utilidad terapéutica. Por tanto, existe la necesidad del desarrollo de terapias eficaces para el tratamiento y la prevención de enfermedades o trastornos en los que está implicado alfa-ENaC, por ejemplo fibrosis quística en seres humanos y animales, y particularmente para terapias con alta eficacia. Un requisito previo para la alta eficacia es que el principio activo no se degrade demasiado rápido en un entorno fisiológico.
Li Tianbo et al. describen cómo la interferencia por ARN de alfa-ENaC inhibe la absorción de fluidos de pulmón de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649-L660, 2006.
Sumario
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en la que:
a.
la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8356 (SEQ ID NO: 143) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8356 (SEQ ID NO: 144); o
b.
la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8379 (SEQ ID NO: 189) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8379 (SEQ ID NO: 190); o
c.
la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8572 (SEQ ID NO: 447) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8572 (SEQ ID NO: 448); o
d.
la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8595 (SEQ ID NO: 493) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND 8595 (SEQ ID NO: 494).
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi
para alfa-ENaC, en la que el agente de ARNi comprende una hebra sentido y una hebra antisentido,
en la que la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 143), ND8379 (SEQ ID NO: 189) y ND8572 (SEQ ID NO: 447) y ND8595 (SEQ ID NO: 493), y
en la que la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 144), ND8379 (SEQ ID NO: 190) y ND8572 (SEQ ID NO: 448) y ND8595 (SEQ ID NO: 494),
comprendiendo además la composición un ligando de receptor epitelial.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi, tal como se describió anteriormente en el presente documento, para su uso en terapia.
Las composiciones de la invención, por ejemplo, las composiciones de agente de ARNi pueden usarse con cualquier dosificación y/o formulación descritas en el presente documento, así como con cualquier vía de administración descrita en el presente documento.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de esta descripción, los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
En las figuras:
Figura 1: Mapa de digestos de restricción del constructo pXoon para α-EnaC de macaco clonado.
Figura 2: Secuencia de proteína y de ADN de alfa-EnaC de macaco.
Figura 3: Clonación de los sitios de reconocimiento inespecíficos y específicos predichos en el constructo indicador de luciferasa doble AY535007. Los fragmentos consisten en 19 nt del sitio diana predicho y 10 nt de secuencia flanqueante en ambos extremos 5’ y 3’.
Descripción detallada
Para facilidad de exposición, el término “nucleótido” o “ribonucleótido” se usa a veces en el presente documento en referencia a una o más subunidades monoméricas de un agente de ARN. Se entenderá que la utilización del término “ribonucleótido” o “nucleótido” en el presente documento también puede referirse, en el caso de un ARN modificado
o sustituto de nucleótido, a un nucleótido modificado, o resto de reemplazo sustituto, tal como se describe adicionalmente a continuación, en una o más posiciones.
Un “agente de ARN” tal como se usa en el presente documento, es un ARN no modificado, ARN modificado, o sustituto de nucleósido, cada uno de los cuales se describen en el presente documento o se conocen bien en la técnica de síntesis de ARN. Aunque se describen numerosos ARN modificados y sustitutos de nucleósido, los ejemplos preferidos incluyen los que tienen mayor resistencia a la degradación por nucleasas que la que tienen los ARN no modificados. Los ejemplos preferidos incluyen los que tienen una modificación con azúcar en 2’, una modificación en una proyección monocatenaria, preferiblemente una proyección monocatenaria en 3’, o, particularmente si es monocatenario, una modificación en 5’ que incluye uno o más grupos fosfato o uno o más análogos de un grupo fosfato.
Un “agente de ARNi” (abreviatura para “agente de ARN interferente”) tal como se usa en el presente documento, es un agente de ARN, que puede regular por disminución la expresión de un gen diana, por ejemplo el gen de ENaC SCNN1A. Aunque no se desea limitarse por la teoría, un agente de ARNi puede actuar mediante uno o más de varios mecanismos, incluyendo la escisión postranscripcional de un ARNm diana denominado a veces en la técnica iARN, o mecanismos pretranscripcionales o pretraduccionales.
Un “agente de ARNi bc” (abreviatura para “agente de ARNi bicatenario”), tal como se usa en el presente documento, es un agente de ARNi que incluye más de una, y preferiblemente dos, hebras en las que la hibridación intercatenaria puede formar una región de estructura de dúplex. Una “hebra” se refiere en el presente documento a una secuencia de nucleótidos contiguos (incluyendo nucleótidos que no se producen de manera natural o modificados). Las dos o más hebras pueden ser, o cada una formar parte de, moléculas separadas, o pueden estar interconectadas covalentemente, por ejemplo, mediante un ligador, por ejemplo, un ligador de polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una hebra puede incluir una región que es suficientemente complementaria a un ARN diana. Tal
hebra se denomina “hebra antisentido.” Una segunda hebra del agente de ARNbc, que comprende una región complementaria a la hebra antisentido, se denomina “hebra sentido.” Sin embargo, un agente de ARNi bc también puede formarse a partir de una única molécula de ARN que es al menos parcialmente autocomplementaria, formando, por ejemplo, una estructura de horquilla o mango de sartén, incluyendo una región de dúplex. Estas últimas se denominan en el presente documento ARN de horquilla cortos o ARNhc. En tal caso, el término “hebra” se refiere a una de las regiones de la molécula de ARN que es complementaria a otra región de la misma molécula de ARN.
Aunque, en células de mamífero, los agentes de ARNi bc largos pueden inducir la respuesta de interferón que es frecuentemente perjudicial, los agentes de ARNi bc cortos no desencadenan la respuesta de interferón, al menos no en un grado que sea perjudicial para la célula y/o el huésped (Manche et al., Mol. Cell. Biol. 12:5238, 1992; Lee et al., Virology 199:491, 1994; Castelli et al., J. Exp. Med. 186:967, 1997; Zheng et al., ARN 10:1934, 2004; Heidel et al., Nature Biotechnol. 22 1579). Los agentes de ARNi incluyen moléculas que son suficientemente cortas que no desencadenan una respuesta de interferón no específica perjudicial en células de mamífero normales. Por tanto, puede usarse la administración de una composición que incluye un agente de ARNi (por ejemplo, formulado tal como se describe en el presente documento) a un sujeto para disminuir la expresión de alfa-ENaC en el sujeto, a la vez que se sortea una respuesta de interferón. Las moléculas que son lo suficientemente cortas que no desencadenan una respuesta de interferón perjudicial se denominan agentes de ARNic o ARNic en el presente documento. “Agente de ARNic” o “ARNic” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un agente de ARNi, por ejemplo, un agente de ARNi bc, que es suficientemente corto que no induce una respuesta de interferón perjudicial en un mamífero, y particularmente una célula humana, por ejemplo, tiene una región de dúplex de menos de 60 pero preferiblemente menos de 50, 40 ó 30 pares de nucleótidos.
Los agentes de ARNi aislados descritos en el presente documento, incluyendo agentes de ARNi bc y agentes de ARNic, pueden mediar la expresión disminuida de alfa-ENaC, por ejemplo, mediante degradación de ARN. Por conveniencia, tal ARN también se denomina en el presente documento ARN que va a silenciarse. Un ácido nucleico de este tipo también se denomina “ARN diana”, a veces “molécula de ARN diana” o a veces “gen diana”.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “media iARN” se refiere a la capacidad de un agente para silenciar, de manera específica de la secuencia, un gen diana. “Silenciamiento de un gen diana” significa el proceso mediante el cual una célula que contiene y/o que expresa un determinado producto del gen diana cuando no está en contacto con el agente, contendrá y/o expresará al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o el 90% menos de tal producto génico cuando está en contacto con el agente, en comparación con una célula similar que no ha estado en contacto con el agente. Tal producto del gen diana puede ser, por ejemplo, un ARN mensajero (ARNm), una proteína o un elemento regulador.
Tal como se usa en el presente documento, el término “complementario” se usa para indicar un grado de complementariedad suficiente de manera que se produce la unión estable y específica entre un compuesto y una molécula de ARN diana, por ejemplo, ARNm de alfa-ENaC. La unión específica requiere un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico a secuencias que no son diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos. Las secuencias que no son diana difieren normalmente de las secuencias diana en al menos 2, 3 ó 4 nucleótidos.
Tal como se usa en el presente documento, un agente de ARNi es “suficientemente complementario” a un ARN diana, por ejemplo, un ARNm diana (por ejemplo, ARNm de alfa-ENaC) si el agente de ARNi reduce la producción de una proteína codificada por el ARN diana en una célula. El agente de ARNi también puede ser “exactamente complementario” al ARN diana, por ejemplo, el ARN diana y el agente de ARNi se aparean, preferiblemente para formar un híbrido compuesto exclusivamente por pares de bases de Watson-Crick en la región de complementariedad exacta. Un agente de ARNi “suficientemente complementario” puede incluir una región interna (por ejemplo, de al menos 10 nucleótidos) que es exactamente complementaria a un ARN de alfa-ENaC diana. Además, en algunas realizaciones, el agente de ARNi distingue específicamente una diferencia de un solo nucleótido. En este caso, el agente de ARNi sólo media la iARN si se encuentra complementariedad exacta en la región (por ejemplo, dentro de 7 nucleótidos de) la diferencia de un solo nucleótido. Agentes de ARNi preferidos se basarán en o consistirán en o comprenderán las secuencias sentido y antisentido proporcionadas en las tablas 1A1D.
Tal como se usa en el presente documento, “esencialmente idéntico” cuando se usa en referencia a una primera secuencia de nucleótidos en comparación con una segunda secuencia de nucleótidos significa que la primera secuencia de nucleótidos es idéntica a la segunda secuencia de nucleótidos excepto por hasta una, dos o tres sustituciones de nucleótido (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo). “Que conserva esencialmente la capacidad para inhibir la expresión de alfa-ENaC en células humanas cultivadas,” tal como se usa en el presente documento en referencia a un agente de ARNi no idéntico a pero derivado de uno de los agentes de ARNi de las tablas 1A-1D mediante deleción, adición o sustitución de nucleótidos, significa que el agente de ARNi derivado
presenta una actividad inhibidora de no menos del 20% de la actividad inhibidora del agente de ARNi de las tablas 1A-1D a partir del que se derivó. Por ejemplo, un agente de ARNi derivado de un agente de ARNi de las tablas 1A1D que disminuye la cantidad de ARNm de alfa-ENaC presente en células humanas cultivadas en el 70% puede disminuir por sí mismo la cantidad de ARNm presente en células humanas cultivadas en al menos el 50% con el fin de que se considere que conserva esencialmente la capacidad para inhibir la replicación de alfa-ENaC en células humanas cultivadas. Opcionalmente, un agente de ARNi puede disminuir la cantidad de ARNm de alfa-ENaC presente en células humanas cultivadas en al menos el 50%.
Tal como se usa en el presente documento, un “sujeto” se refiere a un organismo mamífero que se somete a tratamiento para un trastorno mediado por alfa-ENaC. El sujeto puede ser cualquier mamífero, tal como una vaca, un caballo, un ratón, una rata, un perro, un cerdo, una cabra o un primate. En la realización preferida, el sujeto es un ser humano.
Diseño y selección de agentes de ARNi
Tal como se usa en el presente documento, “trastornos asociados con la expresión de alfa-ENaC” se refiere a cualquier estado biológico o patológico que (1) está mediado al menos en parte por la presencia de alfa-ENaC y (2) cuyo desenlace puede verse afectado al reducirse el nivel del alfa-ENaC presente. Se indican a continuación trastornos específicos asociados con la expresión de alfa-ENaC.
La presente descripción se basa en el diseño, la síntesis y la generación de agentes de ARNi que seleccionan como diana alfa-ENaC y la demostración del silenciamiento del gen de alfa-ENaC in vitro en células cultivadas tras la incubación con un agente de ARNi, y el efecto protector resultante hacia los trastornos mediados por alfa-ENaC.
Un agente de ARNi puede diseñarse de manera racional basándose en información de secuencia y características deseadas. Por ejemplo, un agente de ARNi puede diseñase según la temperatura de fusión relativa del dúplex candidato. Generalmente, el dúplex debe tener una menor temperatura de fusión en el extremo 5’ de la hebra antisentido que en el extremo 3’ de la hebra antisentido.
La presente descripción proporciona composiciones que contienen ARNic y/o ARNhc dirigidos a uno o más transcritos de alfa-ENaC.
Para cualquier diana génica particular que se seleccione, el diseño de ARNic o ARNhc para su uso según la presente descripción seguirá preferiblemente determinadas directrices. Además, en muchos casos, el agente que se suministra a una célula según la presente descripción puede someterse a una o más etapas de procesamiento antes de convertirse en un agente supresor activo (véase a continuación para un análisis adicional); en tal casos, los expertos habituales en la técnica apreciarán que el agente relevante estará diseñado preferiblemente para incluir secuencias que pueden ser necesarias para su procesamiento.
Las enfermedades mediadas por disfunción del canal de sodio epitelial, incluyen enfermedades asociadas con la regulación de volúmenes de fluido a través de membranas epiteliales. Por ejemplo, el volumen de líquido de superficie de las vías respiratorias es un regulador clave del aclaramiento mucociliar y el mantenimiento de la salud de los pulmones. El bloqueo del canal de sodio epitelial promoverá la acumulación de fluido en el lado mucoso del epitelio de las vías respiratorias, promoviendo de ese modo el aclaramiento de mucosidad e impidiendo la acumulación de mucosidad y esputo en tejidos respiratorios (incluyendo las vías respiratorias pulmonares). Tales enfermedades incluyen enfermedades respiratorias, tales como fibrosis quística, discinesia ciliar primaria, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, infecciones de las vías respiratorias (agudas y crónicas; víricas y bacterianas) y carcinoma de pulmón. Las enfermedades mediadas por el bloqueo del canal de sodio epitelial también incluyen enfermedades distintas a las enfermedades respiratorias que se asocian con la regulación anómala de fluidos a través de un epitelio, que implica quizá una fisiología anómala de los líquidos de superficie protectores en su superficie, por ejemplo, xerostomía (sequedad de boca) o queratoconjuntivitis seca (sequedad de ojos). Además, podría usarse el bloqueo del canal de sodio epitelial en el riñón para promover la diuresis e inducir de ese modo un efecto hipotensivo.
El tratamiento puede ser sintomático o profiláctico.
El asma incluye tanto asma intrínseca (no alérgica) como asma extrínseca (alérgica), asma leve, asma moderada, asma grave, asma bronquítica, asma inducida por el ejercicio, asma ocupacional y asma inducida tras infección bacteriana. Ha de entenderse también que tratamiento del asma abarca el tratamiento de sujetos, por ejemplo, de menos de 4 ó 5 años de edad, que presentan síntomas de sibilancia y están diagnosticados o pueden diagnosticarse como “lactantes sibilantes”, una categoría de pacientes establecida de importante preocupación médica y ahora identificado a menudo como asmáticos incipientes o de fase temprana. (Por conveniencia este estado asmático particular se denomina “síndrome del lactante sibilante”.)
La eficacia profiláctica en el tratamiento de asma se evidenciará por la frecuencia o gravedad reducida del ataque sintomático, por ejemplo, de ataque broncoconstrictor o asmático agudo, la mejora en la función pulmonar o la mejora de la hiperreactividad de las vías respiratorias. Puede evidenciarse además por el requisito reducido de otra terapia sintomática, es decir, terapia para o destinada a restringir o suprimir el ataque sintomático cuando se produce, por ejemplo, antiinflamatoria (por ejemplo, con corticosteroides) o broncodilatadora. El beneficio profiláctico en el asma puede ser evidente, en particular, en sujetos propensos a “baja matutina”. “La baja matutina” es un síndrome asmático reconocido, común en un porcentaje sustancial de asmáticos y caracterizado por un ataque de asma, por ejemplo, entre las horas de aproximadamente 4-6 a.m., es decir, normalmente a una hora sustancialmente distante de cualquier terapia para asma sintomática administrada previamente.
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica incluye bronquitis crónica o disnea asociadas con la misma, enfisema, así como agravamiento de la hiperreactividad de las vías respiratorias como resultado de otra terapia farmacológica, en particular, otra terapia farmacológica inhalada. La descripción también puede aplicarse al tratamiento de bronquitis de cualquier tipo o génesis incluyendo, por ejemplo, bronquitis aguda, araquídica, catarral, pseudomembranosa, crónica o ftinoide.
Basándose en los resultados mostrados en el presente documento, la presente descripción proporciona agentes de ARNi que reducen la expresión de alfa-ENaC en células cultivadas y en un sujeto, por ejemplo un mamífero, por ejemplo un ser humano. Las tablas 1A-1D proporcionan agentes de ARNi que seleccionan como diana alfa-ENaC a modo de ejemplo, basándose en las abreviaturas de nomenclaturas convencionales facilitadas en la tabla A.
La tabla 1A, Seq. Id No. 305-608, la tabla 1B y la tabla 1D, Seq. Id No. 1519-1644 enumeran ARNic que no comprenden modificaciones de nucleótido excepto por una unión fosforotioato entre las timidinas 3’-terminales y las penúltimas. Las Seq Id restantes en las tablas 1A-1D enumeran ARNic en los que todos los nucleótidos que comprenden bases piridimínicas son 2’-O-metil-nucleótidos modificados en la hebra sentido, y todas las uridinas en un contexto de secuencia de 5’-ua-3’ así como todas las citidinas en un contexto de secuencia de o 5’-ca-3’ son 2’O-metil-nucleótidos modificados en la hebra antisentido.
Basándose en estos resultados, la descripción proporciona específicamente un agente de ARNi que incluye una hebra sentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de las secuencias de hebra sentido de los agentes proporcionados en las tablas 1A-1D, y una hebra antisentido que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de las secuencias antisentido de los agentes proporcionados en las tablas 1A-1D.
Los agentes de ARNi mostrados en las tablas 1A-1D se componen de dos hebras de 19 nucleótidos de longitud que son complementarias o idénticas a la secuencia diana, más una proyección 3’-TT. La presente descripción proporciona agentes que comprenden al menos 15, o al menos 16, 17 ó 18 ó 19 nucleótidos contiguos de estas secuencias. Sin embargo, aunque estas longitudes pueden ser potencialmente óptimas, los agentes de ARNi no pretenden limitarse a estas longitudes. El experto es muy consciente de que agentes de ARNi más cortos o más largos pueden ser eficaces de manera similar, puesto que, dentro de determinados intervalos de longitud, la eficacia es más bien una función de la secuencia de nucleótidos que de la longitud de hebra. Por ejemplo, Yang, et al., PNAS 99:9942-9947 (2002), demostraron eficacias similares para agentes de ARNi de longitudes de entre 21 y 30 pares de bases. Otros han mostrado el silenciamiento eficaz de genes por agentes de ARNi hasta una longitud de aproximadamente 15 pares de bases (Byrom, et al., “Inducing RNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase III” Tech Notes 10(1), Ambion, Inc., Austin, TX).
Por tanto, es posible y se contempla seleccionar de las secuencias proporcionadas en las tablas 1A-1D, una secuencia parcial de entre 15 y 19 nucleótidos para la generación de un agente de ARNi derivado de una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1A-1D. Alternativamente, pueden añadirse uno o varios nucleótidos a una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1A-1D, o un agente que comprende 15 nucleótidos contiguos de uno de estos agentes, preferiblemente, pero no necesariamente, de tal modo que los nucleótidos añadidos son complementarios a la secuencia respectiva del gen diana, por ejemplo, alfa-ENaC. Por ejemplo, los primeros 15 nucleótidos de uno de los agentes pueden combinarse con los 8 nucleótidos que se encuentran en 5’ con respecto a esta secuencia en ARNm de alfa-ENaC para obtener un agente con 23 nucleótidos en las hebras sentido y antisentido. Todos de tales agentes de ARNi derivados están incluidos en los agentes de ARNi, siempre que conserven esencialmente la capacidad para inhibir la replicación de alfa-ENaC en células humanas cultivadas.
La hebra antisentido de un agente de ARNi debe ser igual a o al menos de, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 ó 50 nucleótidos de longitud. Debe ser igual a o de menos de 60, 50, 40 ó 30, nucleótidos de longitud. Intervalos preferidos son 15-30, 17 a 25, 19 a 23 y 19 a 21 nucleótidos de longitud.
La hebra sentido de un agente de ARNi debe ser igual a o al menos de 14, 15, 16 17, 18, 19, 25, 29, 40 ó 50 nucleótidos de longitud. Debe ser igual a o de menos de 60, 50, 40 ó 30 nucleótidos de longitud. Intervalos preferidos son 15-30, 17 a 25, 19 a 23 y 19 a 21 nucleótidos de longitud.
La parte bicatenaria de un agente de ARNi debe ser igual a o al menos de, 15, 16 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40 ó 50 pares de nucleótidos de longitud. Debe ser igual a o de menos de 60, 50, 40 ó 30 pares de nucleótidos de longitud. Intervalos preferidos son 15-30, 17 a 25, 19 a 23 y 19 a 21 pares de nucleótidos de longitud.
Generalmente, los agentes de ARNi incluyen una región de suficiente complementariedad con el ARNm de alfa-ENaC, y son de suficiente longitud en cuanto a nucleótidos, que el agente de ARNi, o un fragmento del mismo, pueda mediar la regulación por disminución del gen de alfa-ENaC. No es necesario que exista una complementariedad perfecta entre el agente de ARNi y el gen diana, pero la correspondencia debe ser suficiente como para permitir que el agente de ARNi, o un producto de escisión del mismo, dirija el silenciamiento específico de la secuencia, por ejemplo, mediante escisión por iARN de un ARNm de alfa-ENaC.
Por tanto, los agentes de ARNi incluyen agentes que comprenden una hebra sentido y hebra antisentido, que comprenden, cada una, una secuencia de al menos 16, 17 ó 18 nucleótidos que es esencialmente idéntica, tal como se define a continuación, a una de las secuencias de las tablas 1A-1D, excepto porque no más de 1, 2 ó 3 nucleótidos por hebra, respectivamente, se han sustituido por otros nucleótidos (por ejemplo, adenosina reemplazada por uracilo), a la vez que conservan esencialmente la capacidad para inhibir la expresión de alfa-ENaC en células humanas cultivadas. Estos agentes presentarán, por tanto, al menos 15 nucleótidos idénticos a una de las secuencias de las tablas 1A-1D, pero se introducen 1, 2 ó 3 apareamientos erróneos de bases con respecto o bien la secuencia de alfa-ENaC diana o bien entre las hebras sentido y antisentido. Los apareamientos erróneos con respecto a la secuencia de ARN de alfa-ENaC diana, particularmente en la hebra antisentido, se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, están preferiblemente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4 ó 3 nucleótidos de un extremo 5’ y/o 3’-terminal, lo más preferiblemente dentro de 6, 5, 4 ó 3 nucleótidos del extremo 5’-terminal de la hebra sentido o el extremo 3’-terminal de la hebra antisentido. La hebra sentido sólo es necesario que sea lo suficientemente complementaria con la hebra antisentido como para mantener el carácter bicatenario global de la molécula.
Se prefiere que las hebras sentido y antisentido se elijan de manera que el agente de ARNi incluya una única hebra
o región desapareada en uno o ambos extremos de la molécula. Por tanto, un agente de ARNi contiene hebras sentido y antisentido, preferiblemente apareadas para contener una proyección, por ejemplo, una o dos proyecciones en 5’ o 3’ pero preferiblemente una proyección en 3’ de 2-3 nucleótidos. La mayor parte de las realizaciones tendrán una proyección en 3’. Los agentes de ARNic preferidos tendrán proyecciones monocatenarias, preferiblemente proyecciones en 3’, de 1 a 4, o preferiblemente 2 ó 3 nucleótidos, de longitud, en uno o ambos extremos del agente de ARNi. Las proyecciones pueden ser el resultado de que una hebra sea más larga que la otra, o el resultado de dos hebras de la misma longitud que están escalonadas. Los nucleótidos desapareados que forman la proyección pueden ser ribonucleótidos, o pueden ser desoxirribonucleótidos, preferiblemente timidina. Los extremos 5’ se fosforilan preferiblemente, o pueden estar sin fosforilar.
Longitudes preferidas para la región de dúplex tienen entre 15 y 30, lo más preferiblemente 18, 19, 20, 21, 22 y 23 nucleótidos de longitud, por ejemplo, en el intervalo de agente de ARNic analizado anteriormente. Los agentes de ARNic pueden asemejarse en longitud y estructura a los productos procesados por Dicer naturales de ARNbc largos. También están incluidas realizaciones en las que las dos hebras del agente de ARNic se unen, por ejemplo, se unen covalentemente. Las estructuras de horquilla, u otras monocatenarias que proporcionan la región bicatenaria requerida, y preferiblemente una proyección en 3’ también están dentro de la descripción.
Evaluación de agentes de ARNi candidatos
Tal como se indicó anteriormente, la presente descripción proporciona un sistema para identificar ARNic que son útiles como inhibidores de alfa-ENaC. Puesto que, tal como se indicó anteriormente, los ARNhc se procesan de manera intracelular para producir ARNic que tienen partes de dúplex con la misma secuencia que la estructura de tallo de los ARNhc, el sistema es igualmente útil para identificar ARNhc que son útiles como inhibidores de alfa-ENaC. Para los fines de descripción, esta sección se referirá a ARNic, pero el sistema también engloba los correspondientes ARNhc. Específicamente, la presente descripción demuestra la preparación satisfactoria de ARNic dirigidos para inhibir la actividad de alfa-ENaC. Las técnicas y los reactivos descritos en el presente documento pueden aplicarse fácilmente para diseñar posibles nuevos ARNic, dirigidos a otros genes o regiones de genes, y sometidos a prueba para determinar su actividad en la inhibición de alfa-ENaC tal como se analiza en el presente documento.
En diversas realizaciones de la descripción, pueden someterse a prueba posibles inhibidores de alfa-ENaC para determinar la supresión de la expresión endógena de alfa-ENaC introduciendo ARNic candidato(s) en células (por ejemplo, mediante la administración exógena o mediante la introducción de un vector o constructo que dirige la síntesis endógena de ARNic en la célula), o en animales de laboratorio mediante administración pulmonar o nasal. Alternativamente, pueden someterse a prueba posibles inhibidores de alfa-ENaC in vitro mediante la cotransfección transitoria de ARNic candidato(s) junto con un plásmido de expresión de alfa-ENaC. Se evalúa entonces la capacidad del/de los ARNic candidato(s) para reducir niveles de transcritos diana y/o para inhibir o suprimir uno o más aspectos o características de la actividad de alfa-ENaC tales como diferencia de potencial epitelial o absorción
de fluido de superficie de las vías respiratorias.
Pueden compararse células o animales de laboratorio a los que se han suministrado composiciones de ARNic de la invención (células/animales de prueba) con células o animales de laboratorio similares o comparables que no han recibido la composición de la invención (células/animales control, por ejemplo, células/animales que no han recibido ni ARNic ni un ARNic control tal como un ARNic dirigido a un transcrito no endógeno tal como proteína fluorescente verde (GFP)). El fenotipo de transporte de iones de las células/animales de prueba puede compararse con el fenotipo de células/animales control, siempre que el ARNic de la invención comparta reactividad cruzada de secuencia con la especie/tipo de célula de prueba. La producción de proteína alfa-ENaC y corriente de cortocircuito (in vitro o ex vivo) puede compararse en las células/animales de prueba con relación a las células/animales control. De manera similar, pueden compararse otros indicios de la actividad de alfa-ENaC, incluyendo diferencia de potencial epitelial ex vivo o aclaramiento mucociliar in vivo o obtención de imágenes mediante resonancia magnética (IRM) de cuerpo entero. Generalmente, las células/animales de prueba y células/animales control procederán de la misma especie y, para células, de tipo de célula similar o idéntico. Por ejemplo, podrían compararse células de la misma línea celular. Cuando la célula de prueba sea una célula primaria, normalmente la célula control también sería una célula primaria.
Por ejemplo, la capacidad de un ARNic candidato para inhibir la actividad de alfa-ENaC puede determinarse convenientemente (i) suministrando el ARNic candidato a células (ii) evaluando los niveles de expresión de ARNm de alfa-ENaC con relación a un gen de control expresado de manera endógena (iii) comparando la corriente sensible a amilorida en un modelo celular in vitro producido en presencia del ARNic con la cantidad producid en ausencia del ARNic. Este último ensayo puede usarse para someter a prueba ARNic que seleccionan como diana cualquier transcrito diana que puede influir en la actividad de alfa-ENaC indirectamente y no se limita a ARNic que seleccionan como diana los transcritos que codifican para las subunidades del canal ENaC.
La capacidad de un ARNic candidato para reducir el nivel del transcrito diana puede evaluarse midiendo la cantidad del transcrito diana usando, por ejemplo, transferencias de tipo Northern, ensayos de protección de nucleasas, hibridación con sondas, transcripción inversa (RT)-PCR, RT-PCR en tiempo real, análisis de microalineamientos, etc. La capacidad de un ARNic candidato para inhibir la producción de un polipéptido codificado por el transcrito diana (o bien a nivel transcripcional o bien postranscripcional) puede medirse usando una variedad de enfoques basados en anticuerpos incluyendo, pero sin limitarse a, inmunotransferencias de tipo Western, inmunoensayos, ELISA, citometría de flujo, microalineamientos de proteínas, etc. En general, puede usarse cualquier método de medición de la cantidad de o bien el transcrito diana o bien un polipéptido codificado por el transcrito diana.
En general, determinados inhibidores de ARNi de alfa-ENaC preferidos reducen el nivel de transcrito diana al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 16 veces, al menos aproximadamente 64 veces o en un grado incluso mayor con relación al nivel que estaría presente en ausencia del inhibidor (por ejemplo, en una célula control comparable que carece del inhibidor). En general, determinados inhibidores de ARNi de alfa-ENaC preferidos inhiben la actividad del canal ENaC, de modo que la actividad es menor en una célula que contiene el inhibidor que en una célula control que no contiene el inhibidor en al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 16 veces, al menos aproximadamente 64 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, o en un grado incluso mayor.
Determinados inhibidores de ARNi de alfa-ENaC preferidos inhiben la actividad del canal ENaC durante al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 120 horas, al menos 144 horas o al menos 168 horas tras la administración del ARNic y la infección de las células. Determinados inhibidores de alfa-ENaC preferidos impiden (es decir, reducen hasta niveles indetectables) o reducen significativamente la actividad de alfa-ENaC durante al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas o al menos 60 horas tras la administración del ARNic. Según diversas realizaciones de la descripción, una reducción significativa en la actividad de alfa-ENaC es una reducción hasta menos de aproximadamente el 90% del nivel que se produciría en ausencia del ARNic, una reducción hasta menos de aproximadamente el 75% del nivel que se produciría en ausencia del ARNic, una reducción hasta menos de aproximadamente el 50% del nivel que se produciría en ausencia del ARNic, una reducción hasta menos de aproximadamente el 25% del nivel que se produciría en ausencia del ARNic o una reducción hasta menos de aproximadamente el 10% del nivel que se produciría en ausencia del ARNic. La reducción en la actividad de alfa-ENaC puede medirse usando cualquier método adecuado incluyendo, pero sin limitarse a, medición de la corriente de cortocircuito de la sensibilidad a amilorida in vitro, diferencia de potencial epitelial ex vivo o aclaramiento mucociliar in vivo o IRM de cuerpo entero/pulmonar.
Pruebas de estabilidad, modificación y nuevas pruebas de agentes de ARNi
Un agente de ARNi candidato puede evaluarse con respecto a la estabilidad, por ejemplo, su susceptibilidad a la escisión por una endonucleasa o exonucleasa, tal como cuando el agente de ARNi se introduce en el cuerpo de un
sujeto. Pueden emplearse métodos para identificar sitios que son susceptibles de modificación, particularmente escisión, por ejemplo, escisión por un componente que se encuentra en el cuerpo de un sujeto. Tales métodos pueden incluir el aislamiento y la identificación de los fragmentos más abundantes formados por la degradación del agente de ARNi candidato tras su incubación con medios biológicos aislados in vitro, por ejemplo suero, plasma, esputo, líquido cefalorraquídeo o homogeneizados celulares o tisulares, o tras poner en contacto un sujeto con el agente de ARNi candidato in vivo, identificando de ese modo sitios propensos a la escisión. Tales métodos están, por ejemplo, sin limitación, en la publicación de solicitud de patente internacional n.º WO2005115481, presentada el 27 de mayo de 2005.
Cuando se identifican sitios susceptibles a la escisión, puede diseñarse y/o sintetizarse un agente de ARNi adicional en el que el posible sitio de escisión se hace resistente a la escisión, por ejemplo mediante la introducción de una modificación en 2’ en el sitio de escisión, por ejemplo un grupo 2’-O-metilo. Este agente de ARNi adicional puede volverse a someter a prueba para determinar la estabilidad, y puede iterarse este proceso hasta que se encuentre un agente de ARNi que presente la estabilidad deseada.
Pruebas in vivo
Puede someterse a prueba un agente de ARNi identificado como que puede inhibir la expresión génica de alfa-ENaC para determinar la funcionalidad in vivo en un modelo animal (por ejemplo, en un mamífero, tal como en ratón, rata, cobaya o primate). Por ejemplo, el agente de ARNi puede administrarse a un animal, y el agente de ARNi evaluarse con respecto a su biodistribución, estabilidad y su capacidad para inhibir la expresión de alfa-ENaC o modular un proceso biológico o patológico mediado al menos en parte por alfa-ENaC.
El agente de ARNi puede administrarse directamente al tejido diana, tal como mediante inyección, o el agente de ARNi puede administrarse al modelo animal de la misma manera que se administraría a un ser humano. Preferiblemente, el agente de ARNi se suministra a las vías respiratorias del sujeto, tal como mediante administración intranasal, inhalada o intratraqueal.
El agente de ARNi también puede evaluarse por su distribución intracelular. La evaluación puede incluir determinar si el agente de ARNi se captó en la célula. La evaluación también puede incluir determinar la estabilidad (por ejemplo, la semivida) del agente de ARNi. La evaluación de un agente de ARNi in vivo puede facilitarse mediante el uso de un agente de ARNi conjugado con un marcador rastreable (por ejemplo, un marcador fluorescente tal como fluoresceína; un marcador radiactivo, tal como 35S, 32P, 33P o 3H; partículas de oro; o partículas de antígeno para inmunohistoquímica).
El agente de ARNi puede evaluarse con respecto a su capacidad para regular por disminución la expresión de alfa-alfa-ENaC. Pueden medirse los niveles de expresión génica de alfa-ENaC in vivo, por ejemplo, mediante hibridación in situ, o mediante el aislamiento de ARN de tejido antes de y tras la exposición al agente de ARNi. Cuando es necesario sacrificar al animal para recoger el tejido, un animal control no tratado servirá para la comparación. Puede detectarse ARN de alfa-ENaC mediante cualquier método deseado, incluyendo pero sin limitarse a RT-PCR, transferencia de tipo Northern, ensayo de ADN ramificado o ensayo de protección de ARNasa. Alternativa o adicionalmente, puede monitorizarse la expresión génica de alfa-ENaC mediante la realización de análisis de in inmunotransferencia de tipo Western o inmunotinción con extractos de tejido tratados con el agente de ARNi.
Pueden someterse a prueba posibles inhibidores de alfa-ENaC usando cualquier variedad de modelos animales que se han desarrollado. Pueden administrarse composiciones que comprenden ARNic candidato(s), constructos o vectores que pueden dirigir la síntesis de tales ARNic dentro de una célula huésped, o células modificadas mediante ingeniería o manipuladas para contener ARNic candidatos, a un animal. Se evalúa la capacidad de la composición para suprimir la expresión de alfa-ENaC y/o para modificar fenotipos dependientes de ENaC y/o reducir su intensidad con relación a animales que no han recibido el posible inhibidor de alfa-ENaC. Tales modelos incluyen, pero no se limitan a, modelos murinos, de ratas, cobayas y primates no humanos para fenotipos dependientes de ENaC, todos los cuales se conocen en la técnica y se usan para someter a prueba la eficacia de posibles agentes terapéuticos de alfa-ENaC.
Utilizando los sistemas inventados para identificar agentes de ARNic terapéuticos candidatos, se seleccionan agentes terapéuticos adecuados de los identificadores de dúplex ND-8302, ND-8332, ND-8348, ND-8356, ND-8357, ND-8373, ND-8381, ND-8396, ND-8450 y ND-8453, seleccionados de manera más adecuada de ND-8356, ND-8357 y ND-8396.
Química de ARNi
Se describen en el presente documento agentes de ARNi aislados, por ejemplo, agentes de ARN bc que median iARN para inhibir la expresión del gen de alfa-ENaC.
Los agentes de ARN analizados en el presente documento incluyen ARN no modificado de otro modo así como ARN que se ha modificado, por ejemplo, para mejorar la eficacia, y polímeros de sustitutos de nucleósido. ARN no modificado se refiere a una molécula en la que los componentes del ácido nucleico, concretamente azúcares, bases, y restos fosfato, son los mismos o esencialmente los mismos tal como se producen en la naturaleza, preferiblemente tal como se producen de manera natural en el cuerpo humano. La técnica se ha referido a ARN raros o poco comunes, pero que se producen de manera natural, como ARN modificados, véase, por ejemplo, Limbach et al. Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196, 1994. Tales ARN raros o poco comunes, a menudo denominados ARN modificados (aparentemente porque son normalmente el resultado de una modificación postranscripcional) están dentro de la expresión ARN no modificado, tal como se usa en el presente documento. ARN modificado tal como se usa se refiere en el presente documento a una molécula en la que uno o más de los componentes del ácido nucleico, concretamente azúcares, bases y restos fosfato, son diferentes de los que se producen en la naturaleza, preferiblemente diferentes de los que se producen en el cuerpo humano. Aunque se denominan “ARN” modificados”, naturalmente incluirán de hecho, debido a la modificación, moléculas que no son ARN. Los sustitutos de nucleósido son moléculas en las que la estructura principal de ribofosfato se reemplaza por un constructo distinto a ribofosfato que permite que se presenten las bases en la relación espacial correcta de manera que la hibridación es sustancialmente similar a la que se observa con una estructura principal de ribofosfato, por ejemplo, miméticos no cargados de la estructura principal de ribofosfato. Se analizan ejemplos de los anteriores en el presente documento.
Pueden incorporarse las modificaciones descritas en el presente documento en cualquier ARN bicatenario y molécula de tipo ARN descritos en el presente documento, por ejemplo, un agente de ARNi. Puede ser deseable modificar una o ambas de las hebras antisentido y sentido de un agente de ARNi. Como los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades o monómeros, muchas de las modificaciones descritas a continuación se producen en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, por ejemplo, una modificación de una base o un resto fosfato, o el oxígeno que no se une de un resto fosfato. En algunos casos, la modificación se producirá en todas las posiciones objeto en el ácido nucleico pero en muchos, casos y de hecho en la mayoría, no lo hará. A modo de ejemplo, puede producirse una modificación sólo en una posición 3’ o 5’ terminal, puede producirse sólo en una región terminal, por ejemplo en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 ó 10 nucleótidos de a hebra. Puede producirse una modificación en una región bicatenaria, una región monocatenaria, o en ambas. Por ejemplo, puede producirse una modificación de fosforotioato en una posición de O que no se une, sólo en uno o ambos extremos terminales, puede producirse sólo en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 ó 10 nucleótidos de una hebra, o puede producirse en regiones bicatenarias y monocatenarias, particularmente en los extremos terminales. De manera similar, puede producirse una modificación en la hebra sentido, la hebra antisentido, o ambas. En algunos casos, la hebra sentido y antisentido tendrán las mismas modificaciones o la misma clase de modificaciones, pero en otros casos la hebra sentido y antisentido tendrán diferentes modificaciones, por ejemplo, en algunos casos puede ser deseable modificar sólo una hebra, por ejemplo la hebra sentido.
Dos objetivos principales para la introducción de modificaciones en agentes de ARNi es su estabilización frente a la degradación en entornos biológicos y la mejora de propiedades farmacológicas, por ejemplo propiedades farmacodinámicas, que se analizan adicionalmente a continuación. Se describen otras modificaciones adecuadas a un azúcar, una base o estructura principal de un agente de ARNi en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/01193, presentada el 16 de enero de 2004. Un agente de ARNi puede incluir una base que no se produce de manera natural, tal como las bases descritas en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/011822, presentada el 16 de abril de 2004. Un agente de ARNi puede incluir un azúcar que no se produce de manera natural, tal como una molécula portadora cíclica distinta a hidrato de carbono. Se describen características a modo de ejemplo de azúcares que no se producen de manera natural para su uso en agentes de ARNi en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/11829, presentada el 16 de abril de 2003.
Un agente de ARNi puede incluir una unión internucleotídica (por ejemplo, la unión fosforotioato quiral) útil para aumentar la resistencia a nucleasas. Además, o como alternativa, un agente de ARNi puede incluir un mimético de ribosa para una resistencia a nucleasas aumentada. Se describen uniones internucleotídicas y miméticos de ribosa para una resistencia a nucleasas aumentada a modo de ejemplo en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede incluir monómeros y subunidades monoméricas conjugados con ligandos para la síntesis de oligonucleótidos. Se describen monómeros a modo de ejemplo en la solicitud estadounidense n.º 10/916.185, presentada el 10 de agosto de 2004.
Un agente de ARNi puede tener una estructura ZXY, tal como se describe en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede complejarse con un resto anfipático. Se describen restos anfipáticos a modo de ejemplo para su uso con agentes de ARNi en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
En otra realización, el agente de ARNi puede complejarse con un agente de administración que presenta un
complejo modular. El complejo puede incluir un agente portador unido a uno o más de (preferiblemente dos o más, más preferiblemente los tres de): (a) un agente de condensación (por ejemplo, un agente que puede atraer, por ejemplo, unir, un ácido nucleico, por ejemplo, a través de interacciones iónicas o electrostáticas); (b) un agente fusogénico (por ejemplo, un agente que puede fusionarse y/o transportarse a través de una membrana celular); y (c) un grupo de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento celular o tisular, por ejemplo, una lectina, una glicoproteína, un lípido o una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico. Se describen agentes de ARNi complejados con un agente de administración en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Un agente de ARNi puede tener apareamientos no canónicos, tales como entre las secuencias sentido y antisentido del dúplex de ARNi. Se describen características a modo de ejemplo de agentes de ARNi no canónicos en la solicitud PCT n.º PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Resistencia a nucleasas potenciada
Un agente de ARNi, por ejemplo, un agente de ARNi que selecciona como diana alfa-ENaC, puede tener resistencia a nucleasas potenciada.
Una manera de aumentar la resistencia es identificar sitios de escisión y modificar tales sitios para inhibir la escisión, tal como se describe en la solicitud estadounidense n.º 60/559.917, presentada el 4 de mayo de 2004. Por ejemplo, los dinucleótidos de 5’-ua-3’, 5’-ca-3’, 5’-ug-3’, 5’-uu-3’ ó 5’-cc-3’ pueden servir como sitios de escisión. En determinadas realizaciones, todas las pirimidinas de un agente de ARNi portan una modificación en 2’ en o bien la hebra sentido, la hebra antisentido, o bien ambas hebras, y el agente de ARNi tiene por tanto resistencia a endonucleasas potenciada. También puede lograrse una resistencia a nucleasas potenciada mediante la modificación del nucleótido en 5’, lo que da como resultado, por ejemplo, al menos un dinucleótido de 5’-uridinaadenina-3’ (5’-ua-3’) en el que la uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’-citidinaadenina-3’ (5’-ca-3’), en el que la 5’-citidina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’uridina-guanina-3’ (5’-ug-3’), en el que la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’uridina-uridina-3’ (5’-uu-3’), en el que la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’; o al menos un dinucleótido de 5’-citidina-citidina-3’ (5’-cc-3’), en el que la 5’-citidina es un nucleótido modificado en 2’, tal como se describe en la solicitud internacional n.º PCT/US2005/018931, presentada el 27 de mayo de 2005. El agente de ARNi puede incluir al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 de tales dinucleótidos. En una realización particularmente preferida, el nucleótido en 5’ en todas las apariciones de los motivos de secuencia 5’-ua-3’ y 5’-ca-3’ en o bien la hebra sentido, la hebra antisentido, o bien ambas hebras es un nucleótido modificado. Preferiblemente, el nucleótido en 5’ en todas las apariciones de los motivos de secuencia 5’-ua-3’, 5’-ca-3’ y 5’-ug-3’ en o bien la hebra sentido, la hebra antisentido, o bien ambas hebras es un nucleótido modificado. Más preferiblemente, todos los nucleótidos de pirimidina en la hebra sentido son nucleótidos modificados, y el nucleótido en 5’ en todas las apariciones de los motivos de secuencia 5’-ua-3’ y 5’-ca-3’ en la hebra antisentido son nucleótidos modificados, o cuando la hebra antisentido no comprende ninguno de un motivo 5’-ua-3’ y uno 5’-ca-3’, en todas las apariciones del motivo de secuencia 5’-ug-3’.
Preferiblemente, los nucleótidos modificados en 2’ incluyen, por ejemplo, una unidad de ribosa modificada en 2’, por ejemplo, el grupo 2’-hidroxilo (OH) pueden modificarse o reemplazarse por varios sustituyentes “oxi” o “desoxi” diferentes.
Los ejemplos de modificaciones “oxi” de grupo 2’-hidroxilo incluyen alcoxilo o ariloxilo (OR, por ejemplo, R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucleicos “bloqueados” (LNA) en los que el 2’ hidroxilo se conecta, por ejemplo, mediante un puente de metileno, al carbono en 4’ del mismo azúcar de ribosa; O-amina y aminoalcoxilo, O(CH2)n-amina, (por ejemplo, amina = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil-amino, arilamino, diaril-amino, heteroaril-amino, o diheteroaril-amino, etilendiamina, poliamino). Cabe destacar que los oligonucleótidos que contienen sólo el grupo metoxietilo (MOE), (OCH2CH2OCH3, un derivado de PEG), presentan estabilidades para nucleasas comparables a los modificados con la robusta modificación de fosforotioato.
Las modificaciones “desoxi” incluyen hidrógeno (es decir, azúcares de desoxirribosa, que son de particular relevancia para las partes de proyección de ARN parcialmente bc); halo (por ejemplo, fluoro); amino (por ejemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diaril-amino, heteroaril-amino, diheteroaril-amino, o aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclil-amino, arilamino, diaril-amino, heteroaril-amino o diheteroaril-amino), -NHC(O)R(R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquilo; tioalcoxilo; y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos con, por ejemplo, una funcionalidad amino.
Sustituyentes preferidos son 2’-metoxietilo, 2’-OCH3, 2’-O-alilo, 2’-C-alilo y 2’-fluoro.
La inclusión de azúcares de furanosa en la estructura principal de oligonucleótido también puede disminuir la escisión endonucleolítica. Un agente de ARNi puede modificarse adicionalmente incluyendo un grupo catiónico en 3’, o invirtiendo el nucleósido en el extremo 3’-terminal por una unión 3’-3’. En otra alternativa, el extremo 3’-terminal puede bloquearse con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un 3’-C5-aminoalquil-dT. Otros conjugados en 3’ pueden presentar escisión endonucleolítica en 3’-5’. Aunque sin limitarse por la teoría, un conjugado en 3’, tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la escisión exonucleolítica bloqueando estéricamente que la exonucleasa se una al extremo 3’ del oligonucleótido. Incluso pequeñas cadenas de alquilo, grupos arilo o conjugados heterocíclicos
o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear 3’-5’-exonucleasas.
También puede inhibirse la escisión nucleolítica mediante la introducción de modificaciones de grupo de unión de fosfato, por ejemplo, uniones fosforotioato. Por tanto, los agentes de ARNi preferidos incluyen dímeros de nucleótidos enriquecidos o puros para una forma quiral particular de un grupo fosfato modificado que contiene un heteroátomo en la posición que no forma puentes ocupada normalmente por oxígeno. El heteroátomo puede ser S, Se, Nr2 o Br3. Cuando el heteroátomo es S, se prefiere la unión Sp enriquecida o quiralmente pura. Enriquecido significa al menos el 70, 80, 90, 95 o el 99% de la forma preferida. Las uniones fosfato modificadas son particularmente eficaces en la inhibición de la escisión exonucleolítica cuando se introducen cerca de las posiciones 5’ o 3’-terminales, y preferiblemente las posiciones 5’-terminales, de un agente de ARNi.
Los conjugados en 5’ también pueden inhibir la escisión exonucleolítica en 5’-3’. Aunque sin limitarse por la teoría, un conjugado en 5’, tal como naproxeno o ibuprofeno, puede inhibir la escisión exonucleolítica bloqueando estéricamente que la exonucleasa se una al extremo 5’ del oligonucleótido. Incluso pequeñas cadenas de alquilo, grupos arilo o conjugados heterocíclicos o azúcares modificados (D-ribosa, desoxirribosa, glucosa, etc.) pueden bloquear 3’-5’-exonucleasas.
Un agente de ARNi puede tener una resistencia a nucleasas aumentada cuando un agente de ARNi dúplex incluye una proyección monocatenaria de nucleótidos en al menos un extremo. En realizaciones preferidas, la proyección de nucleótidos incluye de 1 a 4, preferiblemente de 2 a 3, nucleótidos desapareados. En una realización preferida, el nucleótido desapareado de la proyección monocatenaria que está directamente adyacente al par de nucleótidos terminal contiene una base purínica, y el par de nucleótidos terminal es un par G-C, o al menos dos de los últimos cuatro pares de nucleótidos complementarios son pares G-C. En realizaciones adicionales, la proyección de nucleótidos puede tener 1 ó 2 nucleótidos desapareados, y en una realización a modo de ejemplo, la proyección de nucleótidos es 5’-gc-3’. En realizaciones preferidas, la proyección de nucleótidos está en el extremo 3’ de la hebra antisentido. En una realización, el agente de ARNi incluye el motivo 5’-cgc-3’ en el extremo 3’ de la hebra antisentido, de manera que se forma una proyección de 2 nt 5’-gc-3’.
Por tanto, un agente de ARNi puede incluir modificaciones de modo que se inhiba la degradación, por ejemplo, mediante nucleasas, por ejemplo, endonucleasas o exonucleasas, que se encuentran en el cuerpo de un sujeto. Estos monómeros se denominan en el presente documento NRM, o monómeros que promueven la resistencia a nucleasas, las modificaciones correspondientes, modificaciones de NRM. En muchos casos, estas modificaciones modularán también otras propiedades del agente de ARNi, por ejemplo, la capacidad para interaccionar con una proteína, por ejemplo, una proteína de transporte, por ejemplo, albúmina sérica, o un miembro del RISC, o la capacidad de las secuencias primera y segunda para formar un dúplex entre sí o para formar a dúplex con otra secuencia, por ejemplo, una molécula diana.
Pueden introducirse una o más modificaciones de NRM diferentes en un agente de ARNi o en una secuencia de un agente de ARNi. Puede usarse una modificación de NRM más de una vez en una secuencia o en un agente de ARNi.
Las modificaciones de NRM incluyen algunas que pueden situarse sólo en el extremo terminal y otras que pueden ir en cualquier posición. Algunas modificaciones de NRM pueden inhibir la hibridación de modo que es preferible usarlas sólo en regiones terminales, y es preferible no usarlas en el sitio de escisión o en la región de escisión de una secuencia que selecciona como diana una secuencia o gen objeto, particularmente en la hebra antisentido. Pueden usarse en cualquier lugar en una hebra sentido, siempre que se mantenga una suficiente hibridación entre las dos hebras del agente de ARNi bc. En algunas realizaciones, es deseable poner el NRM en el sitio de escisión o en la región de escisión de una hebra sentido, ya que puede minimizar el silenciamiento inespecífico.
En la mayoría de los casos, las modificaciones de NRM se distribuirán de diferente manera dependiendo de si se componen de una hebra sentido o antisentido. Si son en una hebra antisentido, no deben insertarse modificaciones que interfieran en o inhiban la escisión por endonucleasas, en la región que está sometida a escisión mediada por RISC, por ejemplo, el sitio de escisión o la región de escisión (tal como se describe en Elbashir et al., 2001, Genes and Dev. 15: 188, incorporado al presente documento como referencia). La escisión de la diana se produce aproximadamente en la mitad de una hebra antisentido de 20 ó 21 nt, o aproximadamente a 10 u 11 nucleótidos en el sentido de 5’ con respecto al primer nucleótido en el ARNm diana que es complementario a la hebra antisentido. Tal como se usa en el presente documento, sitio de escisión se refiere a los nucleótidos en cualquier lado del sitio de escisión, en la diana o en la hebra del agente de ARNi que se hibrida como el mismo. Región de escisión significa
los nucleótidos dentro de 1, 2 ó 3 nucleótidos del sitio de escisión, en cualquier sentido.
Pueden introducirse tales modificaciones en las regiones terminales, por ejemplo, en la posición terminal o con 2, 3, 4 ó 5 posiciones del extremo terminal, de una hebra sentido o antisentido.
Ligandos fijados
Las propiedades de un agente de ARNi, incluyendo sus propiedades farmacológicas, pueden influenciarse y adaptarse a medida, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos, por ejemplo ligandos fijados. Además, las propiedades farmacológicas de un agente de ARNi pueden mejorarse incorporando un ligando en una formulación del agente de ARNi cuando el agente de ARNi o bien tiene o bien no tiene un ligando fijado.
Una amplia variedad de entidades, por ejemplo, ligandos, pueden fijarse a un agente de ARNi o usarse como aditivo
o conjugado de formulación, por ejemplo, al portador de una subunidad monomérica conjugada con ligando. Se describen ejemplos a continuación en el contexto de una subunidad monomérica conjugada con ligando pero que sólo se prefiere, de entidades que pueden acoplarse en otros puntos a un agente de ARNi.
Restos preferidos son ligandos, que se acoplan, preferiblemente de manera covalente, o bien directa o bien indirectamente, a través de una fijación intermedia al portador. En realizaciones preferidas, el ligando se une al portador a través de una fijación intermedia. El ligando o ligando fijado puede estar presente en el monómero conjugado con ligando cuando el monómero conjugado con ligando se incorpora en la hebra en crecimiento. En algunas realizaciones, el ligando puede incorporarse en una subunidad monomérica conjugada con ligando “precursora” tras haberse incorporado una subunidad monomérica conjugada con ligando “precursora” en la hebra en crecimiento. Por ejemplo, puede incorporarse un monómero que tiene, por ejemplo, una fijación terminada en amino, por ejemplo, TAP-(CH2)nNH2 en una hebra sentido o antisentido en crecimiento. En una operación posterior, es decir, tras la incorporación de la subunidad monomérica precursora en la hebra, puede unirse posteriormente un ligando que tiene un grupo electrófilo, por ejemplo, un éster pentafluorofenílico o grupo aldehído, al monómero conjugado con ligando precursor mediante acoplamiento del grupo electrófilo del ligando con el grupo nucleófilo terminal de la fijación de subunidad monomérica conjugada con ligando precursora.
En realizaciones preferidas, un ligando altera la distribución, el direccionamiento o la vida de un agente de ARNi en el que se incorpora. En realizaciones preferidas, un ligando proporciona una afinidad potenciada por una diana seleccionada, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimento, por ejemplo, un compartimento celular u orgánico, tejido, órgano o región del cuerpo, en comparación, por ejemplo, con una especie en que está ausente tal ligando.
Los ligandos preferidos pueden mejorar propiedades de transporte, hibridación y especificidad y también pueden mejorar la resistencia a nucleasas del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descritos en el presente documento y/o ribonucleótidos naturales o modificados.
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo, para potenciar la captación; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores por ejemplo, para monitorizar la distribución; agentes de reticulación; restos que confieren resistencia a nucleasas; y bases nitrogenadas naturales o poco comunes. Los ejemplos generales incluyen moléculas lipófilas, lípidos, lectinas, esteroides (por ejemplo, uvaol, hecogenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado con epifriedelanol), vitaminas, hidratos de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polímeros sintéticos (por ejemplo, pentadecámero de oligo-lactato) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio), inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico), proteínas, agentes de unión a proteína, moléculas de selección como diana de integrina, moléculas policatiónicas, péptidos, poliaminas y peptidomiméticos. Otros ejemplos incluyen ácido fólico o ligandos de receptores de células epiteliales, tales como transferina.
El ligando puede ser una molécula que se produce de manera natural o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen polilisina (PLL), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, restos catiónicos, por ejemplo, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido α-helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento celular
o tisular, por ejemplo, una tirotropina, melanotropina, proteína de surfactante A, hidrato de carbono de mucina, un
poliaminoácido glicosilado, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato o un péptido Arg-Gly-Asp (RGD) o peptidomimético de RGD.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo lipoproteínas de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo albúmina sérica humana (HSA), o péptidos, por ejemplo, moléculas que tengan una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un tipo de célula especificado tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente o fucosa multivalente.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, perturbando el citoesqueleto celular, por ejemplo, perturbando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxol, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, jasplaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, mioservina, tetraciclina.
En un aspecto, el ligando es un lípido o una molécula basada en lípido. Una molécula lipídica o basada en lípido de este tipo se une preferiblemente a una proteína del suero, por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido diana, por ejemplo, tejido hepático, incluyendo las células parenquimatosas del hígado. Otras moléculas que pueden unirse a HSA también pueden utilizarse como ligandos. Por ejemplo, pueden usarse naproxeno o aspirina. Un ligando lipídico o basado en lípido puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte a una célula o membrana celular diana, y/o (c) puede usarse para ajustar la unión a una proteína del suero, por ejemplo, HSA.
Puede utilizarse un ligando basado en lípido para modular, por ejemplo controlar la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un ligando lipídico o basado en lípido que se une a HSA más fuertemente tendrá menor probabilidad de direccionarse al riñón y por consiguiente tendrá menor probabilidad de aclararse del cuerpo.
En una realización preferida, el ligando de base lipídica puede unirse a HSA. Preferiblemente, se une a HSA con afinidad suficiente de manera que el conjugado se distribuirá preferiblemente en un tejido distinto del riñón. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión HSA-ligando no pueda revertirse.
En otro aspecto, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina o nutriente, que se capta por una célula diana, porejemplo, una célula en proliferación. Éstos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación indeseable de células, por ejemplo, del tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Las vitaminas a modo de ejemplo incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas a modo de ejemplo incluyen las vitaminas B, por ejemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por las células cancerosas.
En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente a modo de ejemplo es un péptido tal como tat o antenapedia. Si el agente es un péptido, puede modificarse, incluyendo un mimético peptídico, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que tiene preferiblemente una fase lipófila y una fase lipófoba. El agente de permeación celular puede unirse covalentemente al agente de ARNi o ser parte de un complejo de ARNi-péptido.
Modificaciones de 5’-fosfato
En realizaciones preferidas, los agentes de ARNi están fosforilados en 5’ o incluyen un análogo de fosforilo en el extremo terminal 5’ principal. Las modificaciones de 5’-fosfato de la hebra antisentido incluyen aquéllas que son compatibles con el silenciamiento génico mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5’monofosfato ((HO)2(O)P-O-5’); 5’-difosfato ((HO)2(O)P-OP(HO)(O)-O-5’); 5’-trifosfato ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-OP(HO)(O)-O-5’); caperuza de 5’-guanosina (metilada en 7 o no metilada) (7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-OP(HO)(O)-O-5’); caperuza de 5’-adenosina (Appp), y cualquier estructura de caperuza de nucleótidos modificada o no modificada (N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’); 5’-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5’); 5’-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5’), 5’-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5’); cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato y trifosfatos con oxígeno/azufre reemplazados (por ejemplo, 5’-alfa-tiotrifosfato, 5’-gamma-tiotrifosfato, etc.), 5’-fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5’, (HO)(NH2)(O)P-O-5’), 5’-alquilfosfonatos (R = alquilo = metilo, etilo, isopropilo, propilo, etc., por ejemplo RP(OH)(O)-O-5’-, (OH)2(O)P-5’-CH2-), 5’alquileterfosfonatos (R = alquil éter = metoximetilo (MeOCH2-), etoximetilo, etc., por ejemplo RP(OH)(O)-O-5’-).
La hebra sentido puede modificarse con el fin de desactivar la hebra sentido e impedir la formación de un RISC
activo, reduciendo potencialmente de este modo los efectos inespecíficos. Esto puede lograrse mediante una modificación que impide la fosforilación en 5’ de la cadena sentido, por ejemplo mediante la modificación con un 5’O-metil-ribonucleótido (véase Nykanen et al., (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway, Cell 107, 309-321). Pueden usarse también otras modificaciones que impiden la fosforilación, por ejemplo sustituyendo simplemente el 5’-OH por H en lugar de O-Me. Alternativamente, puede añadirse un grupo voluminoso grande al 5’-fosfato convirtiéndolo en un enlace fosfodiéster.
Bases nitrogenadas no naturales
Nitropirrolilo y nitroindolilo son bases nitrogenadas no naturales que son miembros de una clase de compuestos conocidos como bases universales. Las bases universales son aquellos compuestos que pueden reemplazar cualquiera de las cuatro bases que se producen de manera natural sin afectar sustancialmente al comportamiento de fusión o la actividad del dúplex de oligonucleótido. A diferencia de las interacciones de enlaces de hidrógeno de estabilización asociadas con las bases nitrogenadas que se producen de manera natural, se postula que los dúplex de oligonucleótido que contienen bases nitrogenadas de 3-nitropirrolilo se estabilizan únicamente mediante el apilado de interacciones. La ausencia de interacciones de enlaces de hidrógeno significativas con bases nitrogenadas de nitropirrolilo obvia la especificidad por una base complementaria específica. Además, diversos informes confirman que 4, 5 y 6-nitroindolilo presentan muy poca especificidad por las cuatro bases naturales. De manera interesante, un dúplex de oligonucleótido que contiene 5-nitroindolilo era más estable que los correspondientes oligonucleótidos que contienen 4-nitroindolilo y 6-nitroindolilo. Se describen procedimientos para la preparación de 1-(2’-O-metil-β-D-ribofuranosil)-5-nitroindol en Gaubert, G.; Wengel, J. Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629. Otras bases universales incluyen hipoxantinilo, isoinosinilo, 2-aza-inosinilo, 7-desaza-inosinilo, nitroimidazolilo, nitropirazolilo, nitrobencimidazolilo, nitroindazolilo, aminoindolilo, pirrolopirimidinilo, y derivados estructurales de los mismos. Para un análisis más detallado, que incluye procedimientos de síntesis, de nitropirrolilo, nitroindolilo, y otras bases universales mencionadas anteriormente véanse Vallone et al., Nucleic Acids Research, 27(17):3589-3596 (1999); Loakes et al., J. Mol. Bio., 270:426-436 (1997); Loakes et al., Nucleic Acids Research, 22(20):4039-4043 (1994); Oliver et al., Organic Letters, Vol. 3(13):1977-1980 (2001); Amosova et al., Nucleic Acids Research, 25(10):1930-1934 (1997); Loakes et al., Nucleic Acids Research, 29(12):2437-2447 (2001); Bergstrom et al., J. Am. Chem. Soc., 117:1201-1209 (1995); Franchetti et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 11:67-69 (2001); y Nair et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 20(4-7):735-738 (2001).
El difluorotolilo es una base nitrogenada no natural que funciona como base universal. El difluorotolilo es un isóstero de la base nitrogenada natural timina. Pero a diferencia de timina, el difluorotolilo no muestra selectividad apreciable por ninguna de las bases naturales. Otros compuestos aromáticos que funcionan como bases universales y que son aptos para la presente descripción son 4-fluoro-6-metilbencimidazol y 4-metilbencimidazol. Además, los derivados de isocarbostirililo relativamente hidrófobos 3-metil-isocarbostirililo, 5-metil-isocarbostirililo y 3-metil-7-propinilisocarbostirililo son bases universales que producen sólo una ligera desestabilización de dúplex de oligonucleótido en comparación con la secuencia de oligonucleótido que contiene sólo bases naturales. Otras bases nitrogenadas no naturales incluyen 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidazopiridinilo, 9-metil-imidazopiridinilo, pirrolopirazinilo, isocarbostirililo, 7-propinil-isocarbostirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbenilo, tetracenilo, pentacenilo, y derivados estructurales de los mismos. Para un análisis más detallado, que incluye procedimientos de síntesis, de difluorotolilo, 4-fluoro-6metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol, y otras bases no naturales mencionadas anteriormente, véanse: Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122(32):7621-7632 (2000); O’Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434-10442 (1995); y la patente estadounidense n.º 6.218.108.
Transporte de agentes de ARNi a células
Sin desear limitarse mediante ninguna teoría, la similitud química entre agentes de ARNi conjugados con colesterol y determinados constituyentes de las lipoproteínas (por ejemplo, colesterol, ésteres de colesterilo, fosfolípidos) puede conducir a la asociación de agentes de ARNi con lipoproteínas (por ejemplo, LDL, HDL) en sangre y/o la interacción del agente de ARNi con componentes celulares que tienen una afinidad por colesterol, por ejemplo componentes de la ruta de transporte de colesterol. Las lipoproteínas así como sus constituyentes se captan y procesan por células mediante diversos mecanismos de transporte activos y pasivos, por ejemplo, sin limitación, endocitosis de LDL unida al receptor de LDL, endocitosis de LDL oxidadas o modificadas de otro modo a través de la interacción con el receptor depurador A, la captación mediada por el receptor depurador B1 de HDL-colesterol en el hígado, pinocitosis, o transporte de colesterol a través de membranas mediante proteínas transportadoras de tipo ABC (casete de unión a ATP), por ejemplo ABC-A1, ABC-G1 o ABC-G4. Así, los agentes de ARNi conjugados con colesterol podrían disfrutar de una captación facilitada mediante células que presentan tales mecanismos de
transporte, por ejemplo células del hígado. Como tal, la presente descripción proporciona evidencias y métodos generales para agentes de ARNi de direccionamiento a células que expresan determinados componentes de superficie celular, por ejemplo receptores, mediante conjugación de un ligando natural para tal componente (por ejemplo, colesterol) con el agente de ARNi, o mediante conjugación de un resto químico (por ejemplo, colesterol) con el agente de ARNi que se asocia con o se une a un ligando natural para el componente (por ejemplo, LDL, HDL).
Otras realizaciones
Un agente de ARNi, puede producirse en una célula in vivo, por ejemplo, a partir de moldes de ADN exógeno que se suministran a la célula. Por ejemplo, los moldes de ADN pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden suministrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (patente estadounidense n.º 5.328.470), o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057, 1994). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incluye el vehículo de inserción génica. Los moldes de ADN, por ejemplo, pueden incluir dos unidades de transcripción, una que produce un transcrito que incluye la hebra superior de un agente de ARNi y una que produce un transcrito que incluye la hebra inferior de un agente de ARNi. Cuando se transcriben los moldes, se produce el agente de ARNi, y se procesa en fragmentos de agente de ARNic que median el silenciamiento génico.
Formulación
La presente descripción también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen compuestos de ARNbc. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de varias maneras dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistémico y de la zona que vaya a tratarse. La administración puede ser tópica, pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles condones recubiertos, guantes y similares. Las formulaciones tópicas preferidas incluyen aquéllas en las que los ARNbc están en mezcla con un agente de administración tópica tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidil-etanolamina = DOPE, dimiristoilfosfatidil-colina = DMPC, diestearoilfosfatidil-colina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidil-glicerol = DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo = DOTAP y dioleoilfosfatidil-etanolamina = DOTMA), por ejemplo bromuro de (+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodeciloxi)-1-propanaminio = GAP-DLRIE). Pueden encapsularse ARNbc dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular a liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNbc pueden complejarse con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres incluyen pero no se limitan a ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un éster alquílico C1-10 (por ejemplo, isopropilmiristato IPM), monoglicérido, diglicérido o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se describen formulaciones tópicas en detalle en la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 09/315.298 publicada el 20 de mayo de 1999 .
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosas, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes. Formulaciones orales preferidas son aquéllas en las que se administran ARNbc junto con uno o más potenciadores de la penetración, tensioactivos y agentes de quelación. Los tensioactivos preferidos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares preferidos incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos preferidos incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, de sodio). También se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetración, por
ejemplo, ácidos/sales grasos en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación particularmente preferida es la sal de sodio de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Potenciadores de la penetración adicionales incluyen lauril éter de polioxietileno-9, cetil éter de polioxietileno-20. Los ARNbc pueden suministrarse por vía oral, en forma granular incluyendo partículas secadas por pulverización, o complejarse para formar micro o nanopartículas. Los agentes de complejación de ARNbc incluyen poli-aminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, poli(cianoacrilatos de alquilo); gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; poli(cianoacrilatos de alquilo); poliiminas derivatizadas con DEAE, pululanos, celulosas y almidones. Los agentes de complejación particularmente preferidos incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-Llisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino), poli(cianoacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(cianoacrilato de isohexilo), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, poli(acrilato de hexilo), poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico (PLGA), alginato y polietilenglicol (PEG). Se describen formulaciones orales para ARNbc y su preparación en detalle en la solicitud estadounidense con n.º de serie 08/886.829 (presentada el 1 de julio de 1997), n.º de serie 09/108.673 (presentada el 1 de julio de 1998), n.º de serie 09/256.515 (presentada el 23 de febrero de 1999), n.º de serie 09/082.624 (presentada el 21 de mayo de 1998) y n.º de serie 09/315.298 (presentada el 20 de mayo de 1999).
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.
Las formulaciones farmacéuticas, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los principios activos con el/los portador(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, se preparan las formulaciones poniendo en asociación de manera uniforme e íntima los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, conformando el producto.
Las composiciones pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitarse a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.
En una realización, las composiciones farmacéuticas pueden formularse y usarse como espumas. Las espumas farmacéuticas incluyen formulaciones tales como, pero sin limitarse a, emulsiones, microemulsiones, cremas, gelatinas y liposomas. Aunque son de naturaleza básicamente similar, estas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final. La preparación de tales composiciones y formulaciones la conocen generalmente los expertos en las técnicas farmacéuticas y de formulación y puede aplicarse a la formulación de las composiciones.
Emulsiones
Las composiciones pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas que superan habitualmente 0,1 μm de diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi et al., en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas íntimamente y dispersas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de la variedad de o bien agua en aceite (w/o) o bien aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa se divide finamente en y se dispersa como gotitas minúsculas en una fase oleosa en masa, la composición resultante se denomina emulsión de agua en aceite (w/o). Alternativamente, cuando una fase oleosa se divide finamente en y se dispersa como gotitas minúsculas en una fase acuosa en masa, la composición resultante se denomina emulsión de aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como una disolución en o bien la fase acuosa, fase acuosa, la fase oleosa o bien por sí mismo como una fase separada. También pueden
estar presentes excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizadores, tintes y antioxidantes en emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que se componen de más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones aceite en agua en aceite (o/w/o) y de agua en aceite en agua (w/o/w). Tales formulaciones complejas proporcionan a menudo determinadas ventajas que no proporcionan las emulsiones binarias simples. Las emulsiones múltiples en las que gotitas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran pequeñas gotitas de agua constituyen una emulsión w/o/w. Asimismo, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa proporciona una emulsión o/w/o.
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión se dispersa bien en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma por medio de emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de cremas y bases de pomada de tipo emulsión. Otros medios de estabilización de emulsiones conllevan el uso de emulsionantes que pueden incorporarse en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se clasifican ampliamente en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes que se producen de manera natural, bases de absorción y sólidos finamente divididos (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes surfactantes, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199). Los tensioactivos son normalmente anfífilos y comprenden una parte hidrófila y una hidrófoba. La razón de la naturaleza hidrófila con respecto a la hidrófoba del tensioactivo se ha denominado equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa en la clasificación y selección de tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos pueden clasificarse en diferentes clases basándose en la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfóteros (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285).
Los emulsionantes que se producen de manera natural usados en formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción presentan propiedades hidrófilas de manera que pueden empaparse con agua para formar emulsiones w/o mientras que conservan sus consistencias semisólidas, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrófila. Los sólidos finamente divididos también se han usado como buenos emulsionantes especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Éstos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas sin hinchamiento tales como bentonita, attapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos apolares tales como carbono o triestearato de glicerilo.
Una gran variedad de materiales no emulsionantes también se incluyen en formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Éstos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los coloides hidrófilos o hidrocoloides incluyen gomas que se producen de manera natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenanos, goma guar, goma karaya y goma tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímerossintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Éstos se dispersan o se hinchan en agua para formar disoluciones coloidales que estabilizan las emulsiones mediante la formación de fuertes películas interfaciales alrededor de las gotitas de la fase dispersa y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Puesto que las emulsiones contienen a menudo varios componentes tales como hidratos de carbono, proteínas, esteroles y fosfátidos que pueden soportar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones incorporan a menudo conservantes. Los conservantes usados comúnmente incluidos en formulaciones de emulsión incluyen metil-parabeno, propil-parabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido phidroxibenzoico, y ácido bórico. También se añaden comúnmente antioxidantes a formulaciones de emulsión para impedir el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser eliminadores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y agentes sinérgicos antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
La aplicación de formulaciones de emulsión a través de vías dermatológicas, orales y parenterales y métodos para su fabricación se ha revisado en la bibliografía (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y
Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Las formulaciones de emulsión para administración oral se han usado ampliamente debido a su facilidad de formulación, así como la eficacia desde un punto de vista de la absorción y biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Los laxantes con base de aceite mineral, las vitaminas solubles en lípidos y preparaciones nutritivas ricas en grasas están entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral como emulsiones o/w.
En una realización, las composiciones de ARNbc y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión puede definirse como un sistema de agua, aceite y anfífilo que es una disolución líquida termodinámicamente estable y ópticamente isotrópica individual (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando en primer lugar un aceite en una disolución acuosa de tensioactivo y añadiendo luego una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por tanto, también se han descrito las microemulsiones como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas surfactantes (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan comúnmente a través de una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es un tipo de agua en aceite (w/o) o de aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y tensioactivo usados y de la estructura y empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y colas hidrocarbonadas de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 271).
El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fases se ha estudiado extensamente y ha producido un conocimiento exhaustivo, para un experto en la técnica, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335). En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, oleil éteres de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (M0310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (M0750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DA0750), solos o en combinación con cotensioactivos. El cotensioactivo, habitualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial mediante la penetración en la película de tensioactivo y por consiguiente la creación de una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensioactivo. Pueden prepararse microemulsiones, sin embargo, sin el uso de cotensioactivos y se conocen en la técnica sistemas de microemulsiones autoemulsionantes libres de alcohol. La fase acuosa puede ser normalmente, pero no se limita a, agua, una disolución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase de aceite puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y tri-glicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son de interés particularmente desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la absorción potenciada de fármacos. Se ha propuesto que las microemulsiones de base lipídica (tanto o/w como w/o) potencian la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Met. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan las ventajas de una solubilización de fármacos mejorada, protección del fármaco frente a hidrólisis enzimática, posible potenciación de la absorción de fármacos debido a alteraciones inducidas por tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral con respecto a formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada y toxicidad reducida (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). A menudo, pueden formarse espontáneamente microemulsiones cuando sus componentes se ponen juntos a la temperatura ambiental. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos, péptidos o ARNbc termolábiles. Las microemulsiones también han sido eficaces en la administración transdérmica de componentes activos en aplicaciones tanto cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsión de la presente invención faciliten la absorción sistémica aumentada de ARNbc y ácidos nucleicos desde el tracto gastrointestinal, así como que mejoren la captación celular local de ARNbc y ácidos nucleicos dentro del tracto gastrointestinal, la vagina, la cavidad bucal y otras zonas de administración.
Las microemulsiones también pueden contener aditivos y componentes adicionales tales como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para potenciar la absorción de los ARNbc y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de la penetración usados en las microemulsiones pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y compuestos no quelantes y no tensioactivos (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de estas clases se ha analizado anteriormente.
Liposomas
Existen muchas estructuras de tensioactivos organizadas además de las microemulsiones que se han estudiado yusado para la formulación de fármacos. Éstas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como liposomas, han atraído un gran interés debido a su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista de la administración de fármacos. El término “liposoma” significa una vesícula que se compone de lípidos anfífilos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas.
Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipófilo y un interior acuoso. La parte acuosa contiene la composición que va a administrarse. Los liposomas catiónicos presentan la ventaja de poder fusionarse a la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse de manera tan eficaz con la membrana celular, se captan por macrófagos in vivo.
Con el fin de atravesar la piel intacta de mamíferos, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro de menos de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por tanto, es deseable usar un liposoma que sea sumamente deformable y que pueda pasar a través de tales poros finos.
Las ventajas adicionales de los liposomas incluyen; los liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y solubles en lípidos; los liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimentos internos frente al metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga superficial de lípidos, el tamaño de vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Los liposomas son útiles para la transferencia y la administración de principios activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican liposomas a un tejido, los liposomas comienzan a fusionarse con las membranas celulares y a medida que avanza la fusión de los liposomas y la célula, se vacía el contenido liposomal en la célula donde puede actuar el principio activo.
Las formulaciones liposomales han sido el centro de atención de una extensa investigación como el modo de administración para muchos fármacos. Cada vez hay más evidencias de que para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Tales ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, acumulación aumentada del fármaco administrado en la diana deseada y la capacidad para administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrófilos como hidrófobos, en la piel.
Varios informes han detallado la capacidad de los liposomas para suministrar agentes incluyendo ADN de alto peso molecular en la piel. Se han administrado compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADN de alto peso molecular a la piel. La mayoría de aplicaciones dio como resultado la selección como diana de la parte superior de la epidermis.
Los liposomas se clasifican en dos clases amplias. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que interaccionan con moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. El complejo de liposomas/ADN cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, se rompen los liposomas, liberando su contenido en el citoplasma de la célula (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente, atrapan el ADN más que complejarse con el mismo. Puesto que tanto el ADN como el lípido están cargados de manera similar, se produce repulsión más que formación de complejo. No obstante, cierta cantidad de ADN queda atrapada dentro del interior acuoso de estos liposomas. Se han usado liposomas sensibles al pH para suministrar ADN que codifica para el gen de la timidina cinasa a monocapas celulares en cultivo. Se detectó la expresión del gen exógeno en las células diana (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo importante de composición liposomal incluye fosfolípidos distintos a la fosfatidilcolina derivada de manera natural. Pueden formarse composiciones de liposomas neutros, por ejemplo, a partir de dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos se forman generalmente a partir de dimiristoil-fosfatidilglicerol, mientras que se forman liposomas aniónicos fusogénicos principalmente a partir de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE). Se forma otro tipo de composición liposomal a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Se forma otro tipo a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado la administración tópica de formulaciones farmacológicas liposomales a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a piel de cobayas dio como resultado una reducción de úlceras herpéticas cutáneas mientras que la administración de interferón a través de otros medios (por ejemplo, como disolución o como emulsión) fueron ineficaces (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional sometió a prueba la eficacia de interferón administrado como parte de una formulación liposomal con respecto a la administración de interferón usando un sistema acuoso, y concluyó que la formulación liposomal era superior a la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
Los sistemas liposomales no iónicos también se han examinado para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposomales no iónicas que comprende Novasome.TM. I (dilaurato de glicerilo/colesterol/estearil éter de polioxietileno-10) y Novasome.TM. II (diestearato de glicerilo/colesterol/estearil éter de polioxietileno-10) para administrar ciclosporina-A a la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposomales no iónicos eran eficaces para facilitar la deposición de ciclosporina-A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estéricamente”, una expresión que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, dan como resultados vidas de circulación potenciadas con relación a liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquéllos en los que parte de la parte lipídica de formación de vesículas de los liposomas (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como monosialogangliósido Gm1, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Aunque no desea limitarse por ninguna teoría particular, se cree en la técnica que, al menos para liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivatizados con PEG, la semivida de circulación potenciada de estos liposomas estabilizados estéricamente se deriva de una captación reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Diversos liposomas que comprenden uno o más glicolípidos se conocen en la técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann.
N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) notificaron la capacidad del monosialogangliósido Gm1, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar las semividas en sangre de los liposomas. Estos hallazgos se expusieron por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La patente estadounidense n.º 4.837.028 y el documento WO 88/04924, ambos concedidos a Allen et al., dan a conocer liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gm1 o un éster de sulfato de galactocerebrósido. La patente estadounidense n.º
5.543.152 (Webb et al.) da a conocer liposomas que comprenden esfingomielina. Se dan a conocer liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina en el documento WO 97/13499 (Lim et al).
Muchos liposomas que comprenden lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos, y métodos de preparación de los mismos, se conocen en la técnica. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C1215G, que contiene un resto de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) indicaron que el recubrimiento hidrófilo de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos da como resultado semividas en sangre potenciadas significativamente. Se describen fosfolípidos sintéticos modificados mediante la unión de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (por ejemplo, PEG) por Sears (patentes estadounidenses n.os 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describieron experimentos que demuestran que liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivatizados con PEG o estearato de PEG tienen aumentos significativos en las semividas de circulación en sangre. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron tales observaciones a otros fosfolípidos derivatizados con PEG, por ejemplo, DSPE-PEG, formado a partir de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Se describen liposomas que tienen restos de PEG unidos covalentemente en su superficie externa en la patente europea n.º EP 0 445 131 B1 y el documento WO 90/04384 concedido a Fisher. Se describen composiciones de liposomas que contienen el 1-20 por ciento molar de PE derivatizado con PEG, y métodos de uso de las mismas, por Woodle et al. (patentes estadounidenses n.os 5.013.556 y 5.356.633) y Martin et al. (patente estadounidense n.º
5.213.804 y patente europea n.º EP 0 496 813 B1). Se dan a conocer liposomas que comprenden varios de otros conjugados de lípido-polímero en el documento WO 91/05545 y la patente estadounidense n.º 5.225.212 (ambos concedidos a Martin et al.) y en el documento WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Se describen liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados con PEG en el documento WO 96/10391 (Choi et al). La patente estadounidense n.º 5.540.935 (Miyazaki et al.) y la patente estadounidense n.º 5.556.948 (Tagawa et al.) describen
liposomas que contienen PEG que pueden derivatizarse adicionalmente con restos funcionales en sus superficies.
Un número limitado de liposomas que comprenden ácidos nucleicos se conocen en la técnica. El documento WO 96/40062 concedido a Thierry et al. da a conocer métodos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La patente estadounidense n.º 5.264.221 concedida a Tagawa et al. da a conocer liposomas unidos a proteína y afirma que el contenido de tales liposomas puede incluir ARNbc. La patente estadounidense n.º 5.665.710 concedida a Rahman et al. describen determinados métodos de encapsulación de oligodesoxinucleótidos en liposomas. El documento WO 97/04787 concedido a Love et al. da a conocer liposomas que comprenden ARNbc que seleccionan como diana el gen raf.
Los transfersomas son aún otro tipo de liposomas, y son agregados lipídicos sumamente deformables que son candidatos atractivos para vehículos de administración de fármacos. Los transfersomas pueden describirse como gotitas de lípido que son tan sumamente deformables que pueden penetrar fácilmente a través de poros que son más pequeños que la gotita. Los transfersomas son adaptables al entorno en el que se usan, por ejemplo presentan autooptimización (adaptativos a la forma de los poros en la piel), presentan autorreparación, frecuentemente alcanzan sus dianas sin fragmentarse, y a menudo presentan autocarga. Para preparar transfersomas es posible añadir activadores de bordes superficiales, habitualmente tensioactivos, a una composición liposomal convencional. Los transfersomas se han usado para administrar albúmina sérica a la piel. La administración mediada por transfersomas de albúmina sérica ha mostrado ser tan eficaz como inyección subcutánea de una disolución que contiene albúmina sérica.
Los tensioactivos encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La manera más común de clasificar y categorizar las propiedades de los muchos tipos de tensioactivos diferentes, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrófilo (también conocido como “cabeza”) proporciona el medio más útil para categorizar los diferentes tensioactivos usados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, pág. 285).
Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y pueden usarse a lo largo de un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB oscilan entre 2 y aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. También están incluidos en esta clase las alcanolamidas y los éteres no iónicos tales como etoxilatos de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados y polímeros de bloque etoxilados/propoxilados. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula de tensioactivo porta una carga negativa cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, acil-lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tal como alquilsulfatos y alquilsulfatos etoxilados, sulfonatos tales como alquil-bencenosulfonatos, acil-isetionatos, acil-tauratos y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los alquilsulfatos y los jabones.
Si la molécula de tensioactivo porta una carga positiva cuando se disuelve o se dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.
Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de portar una carga o bien positiva o bien negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados del ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
Se ha revisado el uso de tensioactivos en productos farmacológicos, formulaciones y en emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, pág. 285).
Potenciadores de la penetración
En una realización, la presente descripción emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar la administración eficaz de ácidos nucleicos, particularmente ARNbc, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en disolución en formas tanto ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, habitualmente sólo los fármacos solubles en lípidos o fármacos lipófilos atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden atravesar membranas celulares si la membrana que va a atravesarse se trata con un potenciador de la penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipófilos a través de membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos.
Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y compuestos no quelantes y no tensioactivos (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de las clases mencionadas anteriormente de potenciadores de la penetración se describen a continuación en mayor detalle.
Tensioactivos: en relación con la presente descripción, los tensioactivos (o “agentes surfactantes”) son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfacial entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de ARNbc a través de la mucosa. Además de sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, lauril éter de polioxietileno-9 y cetil éter de polioxietileno-20) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres alquílicos C1- C10 de los mismos (por ejemplo, metílico, isopropílico y t-butílico), y mono y diglicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sales biliares: el papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de la dispersión y la absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasas (Brunton, capítulo 38 en: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ª Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, págs. 934-935). Diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de la penetración. Por tanto la expresión “sales biliares” incluye cualquiera de los componentes de la bilis que se producen de manera natural así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicocolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y lauril éter de polioxietileno-9 (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, capítulo 39 en: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes quelantes: los agentes quelantes, pueden definirse como compuestos que retiran iones metálicos de una disolución mediante la formación de complejos con los mismos, con el resultado de que se potencia la absorción de ARNbc a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de la penetración, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de ADNasa, como las nucleasas de ADN más caracterizadas requieren un ion metálico divalente para catálisis y por tanto se inhiben por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes incluyen pero no se limitan a etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato, 5-metoxisalicilato y homovanilato de sodio), derivados de N-acilo de colágeno, lauril éter-9 y derivados de N-amino-acilo de betadicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Compuestos no quelantes y no tensioactivos: tal como se usa en el presente documento, los compuestos potenciadores de la penetración no quelantes y no tensioactivos pueden definirse como compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que, no obstante, potencian la absorción de ARNbc a través de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
También pueden añadirse agentes que potencian la captación de ARNbc a nivel celular a las composiciones farmacéuticas y otras. Por ejemplo, lípidos catiónicos, tales como Lipofectin (Junichi et al, patente estadounidense n.º 5.705.188), derivados catiónicos de glicerol y moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731) y otros péptidos, también se conocen para potenciar la captación celular de ARNbc.
Pueden utilizarse otros agentes para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tales como 2-pirrol, azonas y terpenos tales como limoneno y
mentona.
Portadores
Determinadas composiciones también incorporan compuestos portadores en la formulación. Tal como se usa en el presente documento, “compuesto portador” o “portador” puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no presenta actividad biológica per se) pero se reconoce como ácido nucleico mediante procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica mediante, por ejemplo, la degradación del ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su retirada de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, normalmente con un exceso de esta última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperada en el hígado, riñón u otros depósitos extracirculatorios, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente fosforotioado en tejido hepático puede reducirse cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4’-isotiocianoestilbeno-2,2’-disulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
Excipientes
En contraposición a un compuesto portador, un “portador farmacéutico” o “excipiente” es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona teniendo en cuenta la manera planificada de administración con el fin de proporcionar el volumen, consistencia, etc., deseados cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil-metilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico; estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).
También pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de manera perjudicial con ácidos nucleicos para formular las composiciones. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones de sal, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para la administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir disoluciones acuosas estériles y no estériles, disoluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes, o disoluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las disoluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de manera perjudicial con ácidos nucleicos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones de sal, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Composiciones farmacéuticas para la administración al aparato respiratorio
Otro aspecto prevé la administración de agentes de ARNi al aparato respiratorio, particularmente para el tratamiento de fibrosis quística. El aparato respiratorio incluye las vías respiratorias altas, incluyendo la orofaringe y la laringe, seguido por las vías respiratorias bajas, que incluyen la tráquea seguido por bifurcaciones en los bronquios y bronquiolos. Las vías respiratorias altas y bajas se denominan vías respiratorias conductoras. Los bronquiolos terminales se dividen entonces en bronquiolos respiratorios que conducen luego a la zona respiratoria final, los alveolos, o pulmón profundo. El epitelio de las vías respiratorias conductoras en la diana principal de los aerosoles terapéuticos inhalados para la administración de agentes de ARNi tales como agentes de ARNi de alfa-ENaC.
Las composiciones de administración pulmonar pueden administrarse mediante inhalación por el paciente de una dispersión de modo que la composición, preferiblemente el agente de ARNi, dentro de la dispersión pueda alcanzar el pulmón en el que puede, por ejemplo, absorberse fácilmente a través de la región alveolar directamente a la circulación sanguínea. La administración pulmonar puede ser eficaz tanto para la administración sistémica como para la administración localizada para tratar enfermedades de los pulmones.
La administración pulmonar puede lograrse mediante diferentes enfoques, incluyendo el uso de formulaciones nebulizadas, aerosolizadas, micelulares y a base de polvos secos; la administración mediante inhalación puede ser oral y/o nasal. La administración puede lograrse con nebulizadores de líquido, inhaladores basados en aerosoles y dispositivos de dispersión de polvos secos. Se prefieren los dispositivos de dosis medida. Uno de los beneficios de usar un atomizador o inhalador es que se minimiza el potencial de contaminación porque los dispositivos son autocontenidos. Los dispositivos de dispersión de polvos secos, por ejemplo, suministran fármacos que pueden formularse fácilmente como polvos secos. Una composición de ARNi puede almacenarse de manera estable como polvos liofilizados o secados por pulverización por sí mismos o en combinación con portadores en polvo adecuados. La administración de una composición para inhalación puede estar mediada por un elemento de sincronización de la dosificación que puede incluir un temporizador, un contador de dosis, un dispositivo de medida del tiempo o un indicador temporal que cuando se incorpora en el dispositivo permite el seguimiento de las dosis, la monitorización del cumplimiento y/o la activación de dosis a un paciente durante la administración del medicamento en aerosol.
Los ejemplos de dispositivos farmacéuticos para la administración de aerosoles incluyen inhaladores de dosis medida (MDI), inhaladores de polvo seco (DPI) y nebulizadores por chorro de aire. Se describen sistemas de administración mediante inhalación a modo de ejemplo que pueden adaptarse fácilmente para la administración de los agentes de ARNi objeto en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.756.353; 5.858.784; y las solicitudes PCT WO98/31346; WO98/10796; WO00/27359; WO01/54664; WO02/060412. Otras formulaciones de aerosol que pueden usarse para administrar los agentes de ARNi se describen en las patentes estadounidenses n.os 6.294.153; 6.344.194; 6.071.497, y las solicitudes PCT WO02/066078; WO02/053190; WO01/60420; WO00/66206. Además, pueden adaptarse métodos para administrar agentes de ARNi a partir de los usados en la administración de otros oligonucleótidos (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) mediante inhalación, tal como se describe en Templin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000, 10:359-68; Sandrasagra et al., Expert Opin Biol Ther, 2001, 1:979-83; Sandrasagra et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12:177-81.
La administración de los agentes también puede implicar la administración de los denominados “profármacos”, es decir, formulaciones o modificaciones químicas de una sustancia terapéutica que requieren alguna forma de procesamiento o transporte por sistemas innatos en el organismo del sujeto para liberar la sustancia terapéutica, preferiblemente en el sitio en el que se desea su acción; esta última realización puede usarse junto con la administración del aparato respiratorio, pero también junto con otras realizaciones de la presente descripción. Por ejemplo, los pulmones humanos pueden eliminar o degradar rápidamente aerosoles depositados escindibles hidrolíticamente a lo largo de periodos que oscilan entre minutos y horas. En las vías respiratorias altas, los epitelios ciliados contribuyen al “escalador mucociliar” mediante el cual se barren partículas de las vías respiratorias hacia la boca. Pavia, D., “Lung Mucociliary Clearance,” en Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke,
S. W. y Pavia, D., Eds., Butterworths, Londres, 1984. En los pulmones profundos, los macrófagos alveolares pueden fagocitar partículas poco después de su deposición. Warheit et al. Microscopy Res. Tech., 26: 412-422 (1993); y Brain, J. D., “Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages,” en The Reticuloendothelial System, S.
M. Reichard y J. Filkins, Eds., Plenum, Nueva York., págs. 315-327, 1985.
En realizaciones preferidas, particularmente cuando se desea la dosificación sistémica con el agente de ARNi, se formulan los agentes de ARNi aerosolizados como micropartículas. Las micropartículas que tienen un diámetro de entre 0,5 y diez micrómetros pueden penetrar en los pulmones, pasando a través de la mayoría de las barreras naturales. Se requiere un diámetro de menos de diez micrómetros para sortear la garganta; se requiere un diámetro de 0,5 micrómetros o mayor para evitar exhalarse.
Otros componentes
Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes adyuvantes que se encuentran de manera convencional en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de utilización establecidos en la técnica. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos, compatibles adicionales tales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tal como tintes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizadores. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente en las actividades biológicas de los componentes de las composiciones. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interaccionen de manera perjudicial con el/los ácido(s) nucleico(s) de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.
Determinadas realizaciones proporcionan combinaciones y composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o
más agentes de ARNbc y (b) uno o más de otros agentes terapéuticos que funcionan mediante un mecanismo sin interferencia por ARN.
Por consiguiente, la descripción incluye una combinación de un ARNi con una sustancia farmacológica antiinflamatoria, broncodilatadora, antihistamínica, antitusiva, antibiótica o de ADNasa, estando dicho bloqueante del canal de sodio epitelial y dicha sustancia farmacológica en la misma composición farmacéutica o una diferente.
Los antibióticos adecuados incluyen antibióticos macrólidos, por ejemplo, tobramicina (TOBI™).
Las sustancias farmacológicas de ADNasa adecuadas incluyen dornasa alfa (Pulmozyme™), una disolución altamente purificada de desoxirribonucleasa I humana recombinante (rhADNasa), que escinde selectivamente el ADN. La dornasa alfa se usa para tratar la fibrosis quística.
Otras combinaciones útiles de bloqueantes del canal de sodio epitelial con fármacos antiinflamatorios son aquéllas con antagonistas de receptores de quimiocinas, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR7, CCR-8, CCR-9 y CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5, tales como los antagonistas de Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 y SCH-D; antagonistas de Takeda, tales como cloruro de N-[[4-[[[6,7-dihidro-2-(4-metil-fenil)-5H-benzo-ciclohepten-8-il]carbonil]amino]fenil]-metil]tetrahidroN,N-dimetil-2H-piran-4-aminio (TAK-770); y antagonistas de CCR-5 descritos en los documentos USP 6.166.037 (particularmente las reivindicaciones 18 y 19), WO 00/66558 (particularmente la reivindicación 8), WO 00/66559 (particularmente la reivindicación 9), WO 04/018425 y WO 04/026873.
Los fármacos antiinflamatorios adecuados incluyen esteroides, en particular, glucocorticosteroides, tales como budesonida, dipropionato de beclametasona, propionato de fluticasona, ciclesonida o furoato de mometasona, o esteroides descritos en los documentos WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (especialmente los de los ejemplos 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 y 101), WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 y WO 04/66920; agonistas de receptores de glucocorticoides no esteroideos, tales como los descritos en los documentos DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280, WO 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 y WO 04/26248; antagonistas de LTD4, tales como montelukast y zafirlukast; inhibidores de PDE4, tales como cilomilast (Ariflo® GlaxoSmithKline), roflumilast (Byk Gulden), V-11294A (Napp), BAY19-8004 (Bayer), SCH-351591 (Schering-Plough), arofilina (Almirall Prodesfarma), PD189659 / PD168787 (Parke-Davis), AWD-12-281 (Asta Medica), CDC-801 (Celgene), SelCID(TM) CC-10004 (Celgene), VM554/LTM565 (Vernalis), T440 (Tanabe), KW-4490 (Kyowa Hakko Kogyo), y los dados a conocer en los documentos WO 92/19594, WO 93/19749, WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945, WO 04/045607 y WO 04/037805; antagonistas del receptor de adenosina A2B tales como los descritos en el documento WO 02/42298; y agonistas de receptores adrenérgicos beta-2, tales como albuterol (salbutamol), metaproterenol, terbutalina, salmeterol fenoterol, procaterol, y especialmente, formoterol, carmoterol y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y compuestos (en forma libre o de sal o de solvato) de fórmula (I) del documento WO 0075114, preferiblemente compuestos de los ejemplos del mismo, especialmente indacaterol y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, así como compuestos (en forma libre o de sal o de solvato) de fórmula (I) del documento WO 04/16601, y también compuestos de los documentos EP 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, USP 2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618, WO 04/46083, WO 04/80964, WO 04/108765 y WO 04/108676.
Los fármacos broncodilatadores adecuados incluyen agentes anticolinérgicos o antimuscarínicos, en particular, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, sales de tiotropio y CHF 4226 (Chiesi) y glicopirrolato, pero también los descritos en los documentos EP 424021, USP 3.714.357, USP 5.171.744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 y WO 04/05285.
Los fármacos antiinflamatorios y broncodilatadores dobles adecuados incluyen antagonistas muscarínicos/agonistas del receptor adrenérgico beta-2 dobles tales como los dados a conocer en los documentos USP 2004/0167167, WO 04/74246 y WO 04/74812.
Las sustancias farmacológicas antihistamínicas adecuadas incluyen clorhidrato de cetirizina, paracetamol, fumarato de clemastina, prometazina, loratidina, desloratidina, difenhidramina y clorhidrato de fexofenadina, activastina, astemizol, azelastina, ebastina, epinastina, mizolastina y tefenadina, así como las dadas a conocer en los documentos JP 2004107299, WO 03/099807 y WO 04/026841.
Otras combinaciones útiles de agentes con fármacos antiinflamatorios son aquéllas con antagonistas de receptores de quimiocinas, por ejemplo, CCR-1, CCR-2, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 y CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, particularmente antagonistas de CCR-5, tales como los antagonistas de Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 y SCH-D; antagonistas de Takeda, tales como cloruro de N-[[4-[[[6,7dihidro-2-(4-metilfenil)-5H-benzo-ciclohepten-8-il]carbonil]amino]fenil]-metil]tetrahidro-N,N-dimetil-2H-piran-4-aminio (TAK-770) y antagonistas de CCR-5 descritos en los documentos USP 6.166.037 (particularmente las reivindicaciones 18 y 19), WO 00/66558 (particularmente la reivindicación 8), WO 00/66559 (particularmente la reivindicación 9), WO 04/018425 y WO 04/026873.
También pueden seleccionarse otros agentes terapéuticos adicionales útiles del grupo que consiste en moléculas de unión a citocinas, particularmente anticuerpos de otras citocinas, en particular una combinación con un anticuerpo anti-IL4, tal como se describe en el documento PCT/EP2005/00836, un anticuerpo anti-IgE, tal como Xolair®, un anticuerpo anti-IL31, un anticuerpo anti-IL31R, un anticuerpo anti-TSLP, un anticuerpo anti-receptor de TSLP, un anticuerpo anti-endoglina, un anticuerpo anti-IL1b o un anticuerpo anti-IL13, tal como se describe en el documento WO05/007699.
Pueden usarse juntos dos o más compuestos combinados en una única formulación, por separado, de manera concomitante o de manera secuencial.
Puede determinarse la toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que muestran altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de composiciones se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la descripción, puede estimarse la dosis terapéuticamente eficaz inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto de polipéptido de una secuencia diana (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición que es la mitad de la máxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Puede usarse tal información para determinar más exactamente dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.
Además de su administración individualmente o como una pluralidad, tal como se analizó anteriormente, los ARNbc pueden administrarse en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de trastornos relacionados con ENaC. En cualquier caso, el médico que lo administra puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de ARNbc basándose en los resultados observados usando medidas de eficacia convencionales conocidas en la técnica o descritas en el presente documento.
Métodos de tratamiento y vías de administración
Una composición que incluye un agente de ARNi, por ejemplo, un agente de ARNi que selecciona como diana alfa-ENaC, puede administrarse a un sujeto por una variedad de vías para lograr o bien la administración local en el sitio de acción o bien la administración sistémica al sujeto. Las vías a modo de ejemplo incluyen la administración local directa al sitio de tratamiento, tal como los pulmones y el conducto nasal así como la administración intravenosa, nasal, oral y ocular. El medio preferido de administración de los agentes de ARNi es a través de administración directa a los pulmones y el conducto nasal como líquido, aerosol o disolución nebulizada.
Las formulaciones para inhalación o administración parenteral se conocen bien en la técnica. Tal formulación puede incluir disoluciones acuosas estériles que pueden contener también tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Para uso intravenoso, la concentración total de solutos debe controlarse para hacer la preparación isotónica.
Los compuestos activos dados a conocer en el presente documento se administran preferiblemente al/a los pulmón/pulmones o al conducto nasal de un sujeto mediante cualquier medio adecuado. Los compuestos activos pueden administrarse mediante la administración de una suspensión en aerosol de partículas respirables constituidas por el compuesto activo o los compuestos activos, que inhala el sujeto. El compuesto activo puede aerosolizarse en una variedad de formas, tales como, pero sin limitarse a, inhaladores de polvo seco, inhaladores de dosis medida o suspensiones líquido/líquido. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Las partículas
pueden contener opcionalmente otros componentes terapéuticos tales como amilorida, benzamil o fenamil, estando incluido el compuesto seleccionado en una cantidad eficaz para inhibir la reabsorción de agua de las secreciones mucosas de las vías respiratorias, tal como se describe en la patente estadounidense n.º 4.501.729.
La composición farmacéutica particulada puede combinarse opcionalmente con un portador con el fin de ayudar en la dispersión o el transporte. Un portador adecuado tal como un azúcar (es decir lactosa, sacarosa, trehalosa, manitol) puede mezclarse con el compuesto o compuestos activos en cualquier razón adecuada (por ejemplo, una razón 1 a 1 en peso).
Las partículas constituidas por el compuesto activo deben incluir partículas de tamaño respirable, es decir, partículas de un tamaño lo suficientemente pequeño como para pasar a través de la boca o nariz y la laringe por inhalación y a los bronquios y alveolos de los pulmones. En general, las partículas que oscilan entre aproximadamente 1 y 10 micrómetros de tamaño (más particularmente, de menos de aproximadamente 5 micrómetros de tamaño) son respirables. Las partículas de tamaño no respirable que están incluidas en el aerosol tienden a depositarse en la garganta y a ser tragadas, y la cantidad de partículas no respirables en el aerosol se minimiza preferiblemente. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partícula en el intervalo de 10-500 uM con el fin de garantizar la retención en la cavidad nasal.
Pueden prepararse composiciones farmacéuticas líquidas de compuesto activo para producir un aerosol mediante combinación del compuesto activo con un vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de pirógenos. Las disoluciones de sal hipertónicas usadas son preferiblemente disoluciones estériles libres de pirógenos, que comprenden desde el uno hasta el quince por ciento (en peso) de la sal fisiológicamente aceptable, y más preferiblemente desde el tres hasta el siete por ciento en peso de la sal fisiológicamente aceptable.
Pueden producirse aerosoles de partículas líquidas que comprenden el compuesto activo mediante cualquier medio adecuado, tal como con un nebulizador de chorro impulsado a presión o un nebulizador ultrasónico. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.501.729. Los nebulizadores son dispositivos disponibles comercialmente que transforman las disoluciones o suspensiones del principio activo en una nebulización de aerosol terapéutico por medio de aceleración con un gas comprimido, normalmente aire u oxígeno, a través de un orificio Venturi estrecho o por medio de agitación ultrasónica.
Las formulaciones adecuadas para uso en nebulizadores consisten en el principio activo en un portador líquido, comprendiendo el principio activo hasta el 40% p/p de la formulación, pero preferiblemente menos del 20% p/p. El portador es normalmente agua (y lo más preferiblemente agua estéril libre de pirógenos) o una disolución acuosaalcohólica diluida, que se hace preferiblemente isotónica, pero puede ser hipertónica con líquidos corporales mediante la adición de, por ejemplo, cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen conservantes si la formulación no se ha hecho estéril, por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, antioxidantes, agentes aromatizantes, aceites volátiles, agentes tamponantes y tensioactivos.
Asimismo pueden producirse aerosoles de partículas sólidas que comprenden el compuesto activo con cualquier generador de aerosol terapéutico particulado sólido. Los generadores de aerosol para administrar agentes terapéuticos particulados sólidos a un sujeto producen partículas que son respirables y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de un agente terapéutico a una tasa adecuada para la administración a seres humanos. Un tipo ilustrativo de generador de aerosol particulado sólido es un insuflador. Las formulaciones adecuadas para administración por insuflación incluyen polvos finamente triturados que pueden administrarse por medio de un insuflador o absorberse en la cavidad nasal a modo de una aspiración nasal. En el insuflador, el polvo (por ejemplo, una dosis medida del mismo eficaz para llevar a cabo los tratamientos descritos en el presente documento) está contenido en cápsulas o cartuchos, compuestos normalmente por gelatina o plástico, que o bien se perforan o bien se abren in situ y el polvo se administra por el aire aspirado a través del dispositivo por inhalación o por medio de una bomba accionada manualmente. El polvo empleado en el insuflador consiste únicamente en el principio activo o en una mezcla de polvo que comprende el principio activo, un diluyente de polvo adecuado, tal como lactosa, y un tensioactivo opcional. El principio activo comprende normalmente desde el 0,1 hasta el 100 p/p de la formulación.
Un segundo tipo de generador de aerosol ilustrativo comprende un inhalador de dosis medida. Los inhaladores de dosis medida son dispensadores de aerosol presurizados, que contienen normalmente una formulación de suspensión o disolución del principio activo en un propelente licuado. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para administrar un volumen medido, normalmente de desde 10 hasta 200 ul, a fin de producir una pulverización de partículas finas que contiene el principio activo. Los propelentes adecuados incluyen determinados compuestos de clorofluorocarbonos, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismos. La formulación puede contener adicionalmente uno o más codisolventes, por ejemplo, etanol, tensioactivos, tales como ácido oleico o trioleato de sorbitano, antioxidante y agentes aromatizantes adecuados.
Puede incorporarse un agente de ARNi en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Por
ejemplo, las composiciones pueden incluir una o más especies de un agente de ARNi y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retardo de la absorción e isotónicos, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en lo que respecta a cualquier medio o agente convencional que sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. Pueden incorporarse también en las composiciones compuestos activos suplementarios.
La administración puede proporcionarla el sujeto u otra persona, por ejemplo, un cuidador. Un cuidador puede ser cualquier entidad implicada en proporcionar atención al ser humano: por ejemplo, un hospital, hospicio, consultorio médico, clínica de pacientes ambulatorios; un trabajador sanitario tal como un médico, enfermero u otro especialista;
o un cónyuge o tutor, tal como un progenitor. La medicación puede proporcionarse en dosis medidas o en un dispensador que administra una dosis medida.
La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” es la cantidad presente en la composición que es necesaria para proporcionar el nivel deseado de fármaco al sujeto que va a tratarse para proporcionar la respuesta fisiológica prevista.
La expresión “cantidad fisiológicamente eficaz” es aquella cantidad administrada a un sujeto para proporcionar el efecto paliativo o curativo deseado.
La expresión “portador farmacéuticamente aceptable” significa que el portador puede captarse en los pulmones sin efectos toxicológicos adversos significativos en los pulmones.
El término “coadministración” hace referencia a la administración a un sujeto de dos o más agentes, y en particular dos o más agentes de ARNi. Los agentes pueden estar contenidos en una única composición farmacéutica y administrarse al mismo tiempo, o los agentes pueden estar contenidos en formulaciones separadas y administrarse en serie a un sujeto. Siempre que los dos agentes puedan detectarse en el sujeto al mismo tiempo, se dice que los dos agentes se coadministran.
Los tipos de excipientes farmacéuticos que son útiles como portador incluyen estabilizadores tales como albúmina sérica humana (HSA) , agentes de carga tales como hidratos de carbono, aminoácidos y polipéptidos; agentes de ajuste del pH o tampones; sales tales como cloruro de sodio, y similares. Estos portadores pueden estar en forma cristalina o amorfa, o pueden ser una mezcla de ambos.
Los agentes de carga que son particularmente valiosos incluyen hidratos de carbono, polipéptidos, aminoácidos o combinaciones compatibles de los mismos. Los hidratos de carbono adecuados incluyen monosacáridos tales como galactosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, trehalosa y similares; ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina; y polisacáridos, tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos y similares; alditoles, tales como manitol, xilitol y similares. Un grupo preferido de hidratos de carbono incluye lactosa, trehalosa, rafinosa, maltodextrinas y manitol. Los polipéptidos adecuados incluyen aspartamo. Los aminoácidos incluyen alanina y glicina, prefiriéndose glicina.
Los agentes de ajuste del pH o tampones adecuados incluyen sales orgánicas preparadas a partir de ácidos y bases orgánicas, tales como citrato de sodio, ascorbato de sodio, y similares; se prefiere citrato de sodio.
Dosificación
Puede administrarse un agente de ARNi a una dosis de menos de aproximadamente 75 mg por kg de peso corporal,
o menos de aproximadamente 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 ó 0,0005 mg por kg de peso corporal, y menos de 200 nmol de agente de ARNi (por ejemplo, aproximadamente 4,4 x 1016 copias) por kg de peso corporal, o menos de 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075, 0,00015 nmol de agente de ARNi por kg de peso corporal. La dosis unitaria, por ejemplo, puede administrarse mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o intramuscular, por vía intratecal o directamente en un órgano), una dosis inhalada o una aplicación tópica.
La dosificación puede ser una cantidad eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno. Puede administrarse de manera profiláctica o como la parte principal o una parte de un protocolo de tratamiento.
En una realización, la dosis unitaria se administra de manera menos frecuente que una vez al día, por ejemplo menor de cada 2, 4, 8 ó 30 días. En otra realización, la dosis unitaria no se administra con una frecuencia (por ejemplo, no con una frecuencia regular). Por ejemplo, la dosis unitaria puede administrarse una sola vez. Dado que el silenciamiento mediado por el agente de ARNi puede persistir durante varios días después de la administración de
la composición del agente de ARNi, en muchos casos, es posible administrar la composición con una frecuencia de menos de una vez al día o, en algunos casos, sólo una vez durante todo el régimen terapéutico.
En una realización, se administra a un sujeto una dosis inicial, y una o más dosis de mantenimiento de un agente de ARNi, por ejemplo, un agente de ARNi bicatenario, o agente de ARNic, (por ejemplo, un precursor, por ejemplo un agente de ARNi mayor que puede procesarse en un agente de ARNic, o un ADN que codifica para un agente de ARNi, por ejemplo un agente de ARNi bicatenario, o agente de ARNic, o precursor del mismo). La o las dosis de mantenimiento son generalmente menores que la dosis inicial, por ejemplo, la mitad de la dosis inicial. Un régimen de mantenimiento puede incluir el tratamiento del sujeto con una dosis o dosis que oscilan entre 0,01 y 75 mg/kg de peso corporal al día, por ejemplo, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 ó 0,0005 mg por kg de peso corporal al día. Las dosis de mantenimiento se administran preferiblemente no más de una vez cada 5, 10 ó 30 días. Además, el régimen de tratamiento puede durar un periodo de tiempo que variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad particular, su gravedad y el estado global del paciente. En realizaciones preferidas, la dosificación puede administrarse no más de una vez al día, por ejemplo no más de una vez cada 24, 36, 48 o más horas, por ejemplo no más de una vez cada 5 u 8 días. Tras el tratamiento, puede monitorizarse el paciente para determinar cambios en su estado y para determinar el alivio de los síntomas del estado patológico. La dosificación del compuesto puede o bien aumentarse en el caso de que el paciente no responda significativamente a los niveles de dosificación actuales, o bien puede disminuirse la dosis si se observa un alivio de los síntomas del estado patológico, si el estado patológico ha desaparecido, o si se observan efectos secundarios indeseables.
La dosis eficaz puede administrarse en una única dosis o en dos o más dosis, según se desee o considere apropiado en las circunstancias específicas. Si se desea facilitar infusiones repetidas o frecuentes, puede ser recomendable la implantación de un dispositivo de administración, por ejemplo, una bomba, endoprótesis semipermanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o un depósito.
Tras el tratamiento satisfactorio, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado patológico, en la que se administra el compuesto en dosis de mantenimiento, que oscilan entre 0,001 g y 100 g por kg de peso corporal (véase el documento US 6.107.094).
La concentración de la composición del agente de ARNi es una cantidad suficiente para ser eficaz en el tratamiento
o la prevención de un trastorno o para regular un estado fisiológico en seres humanos. La concentración o cantidad de agente de ARNi administrada dependerá de los parámetros determinados para el agente y el método de administración, por ejemplo, nasal, bucal o pulmonar. Por ejemplo, las formulaciones nasales tienden a requerir concentraciones mucho menores de algunos componentes con el fin de evitar irritación o ardor en los conductos nasales. A veces es deseable diluir una formulación oral hasta 10-100 veces con el fin de proporcionar una formulación nasal adecuada.
Determinados factores pueden influir en la dosificación requerida para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a la gravedad de la enfermedad o el trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Se apreciará también que la dosificación eficaz de un agente de ARNi tal como un agente de ARNic usado para el tratamiento puede aumentar o disminuir a lo largo del transcurso de un tratamiento particular. Pueden resultar cambios en la dosificación y hacerse evidentes a partir de los resultados de ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, puede monitorizarse el sujeto después de la administración de una composición de agente de ARNi. Basándose en la información de la monitorización, puede administrarse una cantidad adicional de la composición del agente de ARNi.
La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta del estado patológico que va a tratarse, durando el transcurso del tratamiento desde varios días hasta varios meses, o hasta que se obtenga una curación o se logra una disminución del estado patológico. Pueden calcularse programas de dosificación óptimos a partir de las mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos habituales en la técnica pueden determinar fácilmente dosificaciones, metodologías de dosificación y tasas de repetición óptimas. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los compuestos individuales, y generalmente pueden estimarse basándose en las CE50 que se ha encontrado que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo tal como se describió anteriormente.
Los agentes de ARNi tal como se describen en el presente documento pueden ser útiles en el tratamiento y (cuando sea apropiado) en la prevención de una cualquiera de los siguientes enfermedades/trastornos;
Fibrosis quística, síndrome de Liddle, insuficiencia renal, hipertensión, desequilibrios hidroelectrolíticos.
En particular, en algunas realizaciones, los agentes de ARNi de la invención pueden usarse para tratar y/o prevenir manifestaciones clínicas adversas de estas enfermedades/trastornos.
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretase como limitativos
adicionalmente.
Ejemplos
Fuente de reactivos
Cuando la fuente de un reactivo no se facilita específicamente en el presente documento, tal reactivo puede obtenerse de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular a una calidad/pureza convencional para su aplicación en biología molecular.
Ejemplo 1: Selección de secuencias
Con el fin de identificar ARNic para modular por disminución la expresión de la subunidad alfa del canal de sodio epitelial ENaC (α-ENaC), se definieron conjuntos de selección basándose en un análisis bioinformático. Los controladores clave para el diseño del conjunto de selección fueron la especificidad pronosticada de los ARNic contra el transcriptoma de la especie relevante. Para la identificación de ARNic para alfa-ENaC y un sistema de administración eficaz, se usó un enfoque de tres pasos: Se seleccionó la rata como especie de prueba para abordar la eficacia del silenciamiento in vivo tras la administración intratraqueal, se seleccionó la cobaya como organismo modelo de enfermedad para demostrar que la reducción de ARNm de alfa-ENaC da como resultado un efecto funcional medible. La molécula de ARNic terapéutica tiene que seleccionar como diana alfa-ENaC humano así como la secuencia de alfa-ENaC de al menos una especie relevante para la toxicología, en este caso, mono rhesus.
El análisis inicial de la secuencia de ARNm de alfa-ENaC relevante reveló que pueden identificarse pocas secuencias que satisfacen los requisitos de especificidad y al mismo tiempo seleccionan como diana ARNm de alfa-ENaC en todas las especies relevantes. Por tanto, se decidió diseñar conjuntos de selección independientes para el ARNic terapéutico y para las moléculas sustitutas que van a someterse a prueba en el modelo de enfermedad relevante (tablas 1A, 1B, 1C y 1D).
Todos los ARNic reconocen la secuencia de alfa-ENaC humana, ya que se seleccionó un sistema de cultivo de células humanas para la determinación de la actividad in vitro (H441, véase a continuación). Por tanto, pueden usarse todos los ARNic para seleccionar como diana ARNm de alfa-ENaC humano en un entorno terapéutico.
Se diseñaron los conjuntos de selección terapéuticos para que contuviesen sólo secuencias de ARNic que son completamente complementarias a las secuencia de alfa-ENaC de mono rhesus y ser humano.
Diseño y selección in silico de ARNic que seleccionan como diana alfa-ENaC (SCNN1A)
Se llevó a cabo el diseño de ARNic para identificar ARNic para los cuatro conjuntos definidos previamente (véase anteriormente)
a) “Conjunto de selección inicial”
b) “Conjunto de selección extendido”
c) “Conjunto sustituto in vivo para rata”
d) “Conjunto sustituto in vivo para cobaya”
Conjunto de selección inicial
El objetivo de la selección in silico de un conjunto de selección inicial era identificar ARNic que seleccionan como diana específicamente alfa-ENaC humano, así como su ortólogo de mono rhesus. Se descargó el ARNm diana humano (NM_001038.4) de un recurso del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide) durante el procedimiento de selección de ARNic completo. Con el fin de identificar el ortólogo de rhesus de alfa-ENaC (Macaca mulatta), se usó la secuencia humana en una búsqueda en BLASTN en el Bailor College of Medicine (http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast/?organism=Mmulatta) frente a cóntigos de Mmulatta a partir del . Se extrajeron todas las regiones de aciertos y se ensamblaron mediante la herramienta de ensamblaje CAP para generar una primera secuencia de ensamblaje. Además, se realizó una búsqueda en BLAST con la secuencia humana en UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgBlat?command=start&org=Rhesus&db=rheMac2&hgsid=84859356) frente a Rhesus congelado el 12 de marzo de 2005. Se descargó el acierto de entramado 84554 y se usó junto con la primera secuencia de ensamblaje mediante CAP para generar la secuencia consenso final para alfa-ENaC de rhesus.
Tras la extracción de todas las secuencias de 19 meros solapantes del ARNm humano, se identificaron 19 meros conservados que tenían secuencias idénticas en la secuencia consenso de rhesus ensamblada. Se definieron las secuencias de 19 meros como el grupo de secuencias de ARNic (sentido) que presentan reacción cruzada entre ser humano-rhesus, representadas por 19 meros de 1185.
Se generaron las secuencias antisentido correspondientes y se sometieron a prueba para determinar su especificidad en ser humano. Para esto, se tomó como parámetro su potencial pronosticado para interaccionar con ARNm diana irrelevantes (potencial inespecífico). Se definieron secuencias con bajo potencial inespecífico como preferibles y se pronostica que son más específicas.
Para la selección adicional, se clasificaron los ARNic candidatos según su potencial pronosticado para interaccionar con otras secuencias del huésped (en este caso, sin limitación, ser humano). Se supone que ARNic con bajo potencial inespecífico son más específicos in vivo. Para pronosticar el potencial inespecífico específico de ARNic, se hicieron las siguientes suposiciones:
1) Puede deducirse el potencial inespecífico de una hebra a partir del número y la distribución de apareamientos erróneos con una diana inespecífica.
2) La diana inespecífica más relevante, que es el que se pronostica que tiene la probabilidad más alta de silenciarse debido a la tolerancia de apareamientos erróneos, determina el potencial inespecífico de la hebra.
3) Las posiciones 2 a 9 (contando de 5’ a 3’) de una hebra (región simiente) pueden contribuir más al potencial inespecífico que el resto de la secuencia (que es la región no simiente y de sitios de escisión) (Haley, B., y Zamore, P.D., Nat Struct Mol Biol. 2004, 11:599).
4) Las posiciones 10 y 11 (contando de 5’ a 3’) de una hebra (región de sitios de escisión) pueden contribuir más al potencial inespecífico que la región no simiente (que son las posiciones 12 a 18, contando de 5’ a 3’).
5) Las posiciones 1 y 19 de cada hebra no son relevantes para las interacciones inespecíficas.
6) El potencial inespecífico puede expresarse mediante la puntuación inespecífica de la diana inespecífica más relevante, calculada basándose en el número y la posición de apareamientos erróneos de la hebra con la región más homóloga en el gen inespecífico considerando las suposiciones 3 a 5.
7) Suponiendo una posible supresión de la actividad de la hebra sentido por las modificaciones internas introducidas, sólo será relevante el potencial inespecífico de la hebra antisentido.
Para identificar posibles genes inespecíficos, se sometieron secuencias antisentido de 19 meros a una búsqueda de homología frente a secuencias de ARNm humanas disponibles públicamente, que se supone que representan el transcriptoma completo humano.
Para este fin, se realizaron búsquedas en fastA (versión 3.4) con todas las secuencias de 19 meros frente a la base de datos RefSeq humana (versión disponible de ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/ el 18 de noviembre de 2005). Se ejecutó la búsqueda en FastA con parámetros-valores-pares -f 30 -g 30 con el fin de tener en cuenta la homología a lo largo de la longitud completa del 19 mero sin ningún hueco. Además, con el fin de garantizar el listado de todos los aciertos inespecíficos relevantes en el archivo de salida de fastA, se usó el parámetro -E 15000.
La búsqueda dio como resultado una lista de posibles dianas inespecíficas para cada secuencia de entrada enumerada descendiendo la homología de secuencia a lo largo del 19 mero completo.
Para clasificar todas las posibles dianas inespecíficas según las suposiciones 3 a 5, y mediante esto identificar el gen inespecífico más relevante y su puntuación inespecífica, se analizaron los archivos de salida de fastA mediante una secuencia de comandos PERL.
La secuencia de comandos extrajo las siguientes propiedades inespecíficas para cada secuencia de entrada de 19 meros y cada gen inespecífico para calcular la puntuación inespecífica:
Número de apareamientos erróneos en la región no simiente
Número de apareamientos erróneos en la región simiente
Número de apareamientos erróneos en la región de sitios de escisión
Se calculó la puntuación inespecífica considerando las suposiciones 3 a 5 tal como sigue:
Puntuación inespecífica = número de apareamientos erróneos simiente * 10
+
número de apareamientos erróneos de sitios de escisión * 1,2
+
número de apareamientos erróneos no simiente * 1
Se definió el gen inespecífico más relevante para cada secuencia de 19 meros como el gen con la puntuación inespecífica más baja. Por consiguiente, se definió que la puntuación inespecífica más baja era representativa del potencial inespecífico de cada ARNic, representado por la secuencia antisentido de 19 meros analizada.
Se usó el potencial inespecífico calculado como parámetro de clasificación (en sentido descendente de la puntuación inespecífica) con el fin de generar una clasificación para todas las secuencias de ARNic con reactividad cruzada entre ser humano-rhesus.
Se definió una puntuación inespecífica de 3 o más como un requisito previo para la selección de ARNic, mientras que se excluyeron todas las secuencias que contenían 4 o más G en una fila (secuencias de poli-G), conduciendo a la selección de un total de 152 ARNic que seleccionan como diana ENaC alfa de ser humano y rhesus (véase la tabla 1a).
Conjunto de selección extendido
El objetivo de la selección in silico del conjunto de selección extendida era identificar todos los ARNic adicionales que seleccionan como diana alfa-ENaC humano con suficiente especificidad, que se excluyeron del conjunto inicial debido a la falta de reactividad cruzada con rhesus. Se tomaron las secuencias restantes del grupo de 19 meros derivados de alfa-ENaC humano que no se habían analizado antes y se generaron las secuencias antisentido correspondientes. Se calcularon el gen inespecífico más relevante y sus puntuaciones inespecíficas correspondientes tal como se describe en la sección “conjunto de selección inicial”.
Para determinarla reactividad cruzada con ratón y cobaya (Cavia porcellus/cobya), se descargaron secuencias de alfa-ENaC de estas especies de la base de datos 1 de nucleótidos del NCBI (números de registro NM_011324.1 y AF071230 (longitud completa)/DQ109811 (cds parcial), respectivamente). Se usaron las dos secuencias de cobaya para generar una secuencia consenso de alfa-ENaC de cobaya. Se sometió a prueba cada secuencia de 19 meros humana para detectar su presencia en las secuencias de ratón y cobaya. Se asignaron secuencias positivas al grupo de secuencias de ARNic (sentido) que presentan reactividad cruzada entre ser humano-ratón, o secuencias de ARNic (sentido) que presentan reactividad cruzada entre ser humano-cobaya. Tras la exclusión de todas las secuencias de poli-G, se seleccionaron secuencias con puntuaciones inespecíficas de 3 o más así como aquellas con puntuaciones inespecíficas de 2,2 ó 2,4 y reactividad cruzada con ratón, rhesus o cobaya. El número total de ARNic en el grupo de selección extendido era de 344 (véase la tabla 1b).
Conjunto sustituto de rata in vivo
El objetivo de la selección in silico del conjunto sustituto de rata in vivo era identificar todos los ARNic que seleccionan como diana alfa-ENaC de ser humano y rata con suficiente especificidad en rata. Para la identificación de ARNic que presentan reactividad cruzada entre ser humano-rata, se descargó la secuencia de ARNm de alfa-ENaC de rata de la base de datos de nucleótidos del NCBI (número de registro, NM_031548.2), y se sometieron a prueba todas las secuencias del grupo de 19 meros humanos para detectar su presencia en la secuencia de rata, que representa el conjunto de secuencias de ARNic (sentido) que presentan reactividad cruzada entre ser humanorata.
Se generaron las secuencias antisentido correspondientes y se sometieron a prueba para determinar su especificidad en rata. Para esto, se calcularon el gen inespecífico más relevante en rata y sus puntuaciones inespecíficas correspondientes tal como se describe en la sección “conjunto de selección inicial” usando el conjunto de ARNm de rata (base de datos RefSeq) en lugar de los transcritos humanos. Tras la exclusión de todas las secuencias de poli-G, se generó una clasificación considerando la puntuación inespecífica de rata en primera prioridad y la puntuación inespecífica humana con segunda prioridad. Se seleccionaron finalmente las 48 secuencias de la parte superior de la lista que representan el conjunto sustituto de rata in vivo (véase la tabla 1c).
Conjunto sustituto de cobaya in vivo
El objetivo de la selección in silico del conjunto sustituto de cobaya in vivo era identificar todos los ARNic que seleccionan como diana alfa-ENaC de ser humano y cobaya que no se han seleccionado en los conjuntos previos. Se clasificaron los ARNic restantes del conjunto determinado anteriormente de secuencias de ARNic (sentido) que
presentan reacción cruzada entre ser humano-cobaya según las puntuaciones inespecíficas humanas. Se seleccionaron las 63 secuencias superiores (excluyendo secuencias de poli-G), que representan el conjunto sustituto de cobaya in vivo (véase la tabla 1d).
Ejemplo 2: Síntesis de ARNic
Síntesis de nucleótidos que comprenden bases naturales
Puesto que los ARNic de los conjuntos de selección están destinados todos potencialmente para su administración in vivo, se sintetizaron ARNic con una estrategia de modificación que protege los ARNic de la degradación por endo y exonucleasas en un entorno biológico. En esta estrategia, se protegen los extremos 3’ de ambas hebras de una actividad 3’->5’-exonucleolítica mediante una unión fosforotioato entre las dos últimas bases nitrogenadas en el extremo 3’. Con el fin de inhibir la degradación endo-nucleolítica del ARNic, se reemplazaron todas las pirimidinas en la hebra sentido del ARNic por el ribonucleótido modificado con 2’-O-metilo correspondiente. Para reducir el número de modificaciones en la hebra antisentido, que es la hebra más activa y por tanto más sensible a las modificaciones, sólo se modificaron las pirimidinas en el contexto de sitios de escisión de nucleasas principales identificados previamente con grupos 2’-O-metilo. Los sitios de escisión principales son los siguientes dos motivos de secuencia: 5’-UA-3’ y 5’-CA-3’.
Puesto que también se ha considerado el uso de ARNic en formulaciones que protegen potencialmente los ARN del entorno biológico nucleolítico en el pulmón, también se sintetizó el mismo conjunto de ARNic sin ninguna protección de la degradación endonucleolítica.
Cuando la fuente de un reactivo no se facilita específicamente en el presente documento, tal reactivo puede obtenerse de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular a una calidad/pureza convencional para su aplicación en biología molecular.
Se produjeron ARN monocatenarios mediante síntesis en fase sólida en una escala de 1 μmol usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio de porocontrolado (CPG, 500Å, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. Se generaron ARN y ARN que contiene nucleótidos de 2’-O-metilo mediante síntesis en fase sólida empleando las correspondientes fosforamiditas y fosforamiditas de 2’-O-metilo, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Se incorporaron estos bloques de construcción en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena oligorribonucleotídica usando química de fosforamiditas de nucleósidos convencional tal como se describe en Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU. Se introdujeron uniones fosforotioato mediante reemplazo de la disolución de oxidante de yodo con una disolución del reactivo Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, RU) en acetonitrilo (1%). Se obtuvieron reactivos auxiliares adicionales de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).
Se llevó a cabo la desprotección y purificación de los oligorribonucleótidos brutos mediante HPLC de intercambio aniónico según procedimientos establecidos. Se determinaron los rendimientos y las concentraciones mediante absorción UV de una disolución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm usando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleißheim, Alemania). Se generó ARN bicatenario mezclando una disolución equimolar de hebras complementarias en tampón de apareamiento (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8; cloruro de sodio 100 mM), se calentó en un baño de agua a 85 - 90ºC durante 3 minutos y se enfrió hasta temperatura ambiente a lo largo de un periodo de 3 - 4 horas. Se diluyó la disolución de ARN apareado hasta una concentración de 50 μmol de ARN bicatenario/l y se almacenó a -20ºC hasta su uso.
Ejemplo 3: Pruebas de ARNic in vitro
Se sometió a prueba la capacidad de los agentes de ARNi para inhibir expresión de alfa-ENaC en líneas celulares humanas in vitro, o en ratas in vivo. Se transfecta el agente de ARNi en las células, por ejemplo, mediante transfección, se deja actuar sobre las células durante un determinado tiempo, por ejemplo, 24 horas, y se determinaron los niveles de ARNm de alfa-ENaC mediante análisis de ADN ramificado. Alternativamente, se administra el agente de ARNi in vivo a través de vía intratraqueal y se determina la inhibición de la expresión de ARNm de alfa-ENaC mediante análisis de ADN ramificado en el órgano diana. Complementando estos ensayos directos, se sometió a prueba la inhibición de la expresión génica diana mediante agentes de iARN para ARNm de alfa-ENaC expresado de manera recombinante en células huésped de mamífero.
Líneas celulares
Se obtuvieron células H441 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (número de la ATCC: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania) y se hicieron crecer en RPMI 1640, suero de ternero fetal al 10%, 100 u de penicilina/estreptomicina 100 μg/ml, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 nM y piruvato de sodio 1 mM (todos de Biochrom
AG, Berlín, Alemania) a 37ºC bajo una atmósfera del 5% de CO2/95% de aire.
Se obtuvieron células epiteliales bronquiales humanas primaras de Cambrex (n.º de cat. CC-2540) y se hicieron crecer rutinariamente en medio BEGM con SingleQuots (n.º de cat. de Cambrex CC-3170 menos tri-yodotreonina). Para la polarización y el crecimiento en la superficie de contacto aire-líquido, se hicieron crecer las células en una mezcla 1:1 de BEGM:DMEM complementada con D-glucosa 4,5 g/l (n.º de cat. de Gibco BRL 41965-039) y complementada con SingleQuots (n.º de cat. de Cambrex CC-4175), como anteriormente pero menos la triyodotreonina y alícuotas de GA1000 y en presencia de gentamicina 50 μg/ml (n.º de cat. de Gibco Brl 10131-015). Como las células se mantuvieron en medio libre de suero, se usó disolución de neutralización de tripsina durante las etapas de pase (n.º de cat. de Cambrex CC-5002). Para la polarización y el cultivo en la superficie de contacto airelíquido, se hicieron crecer las células sobre soportes de policarbonato semipermeables (0,4 micrómetros) (n.º de cat. de Corning Costar 3407 n.º 3460) y se cultivaron todo el tiempo a 37ºC bajo una atmósfera del 5% de CO2/95% de aire.
Se hicieron crecer células de riñón de mono verde africano Cos-1 (n.º de la ATCC CRL-1650) en MEM de Dulbecco, glucosa 4,5 g/L, suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, bicarbonato de sodio 1,5 g/l (Gibco BRL), 100 u de penicilina/estreptomicina 100 μg/ml.
Ejemplo 3.1: Selección in vitro de ARNic de alfa-ENaC activos y determinación de CI50 en H441
Un día antes de la transfección, se indujo la expresión de proteína ENaC-alfa en células H441 (número de la ATCC: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Alemania) añadiendo 100 nM de dexametasona. Directamente antes de la transfección, se sembraron las células a 1,5 x 104 células / pocillo en placas de 96 pocillos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) en 75 μl de medio de crecimiento (RPMI 1640, suero de ternero fetal al 10%, 100 u de penicilina / estreptomicina 100 μg/ml, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 nM y piruvato de sodio 1 mM, todos de Biochrom AG, Berlín, Alemania). Se realizaron las transfecciones por cuadruplicado. Para cada pocillo, se mezclaron 0,5 μL de Lipofectamine2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) con 12 μL de Opti-MEM (Invitrogen) y se incubaron durante 15 min. a temperatura ambiente. Para que la concentración de ARNic sea de 50 nM en el volumen de transfección de 100 μl, se mezcló 1 μl de un ARNic 5 μM con 11,5 μl de Opti-MEM por pocillo, se combinaron con la mezcla de Lipofectamine2000-Opti-MEM y se incubaron de nuevo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se aplicaron completamente los complejos de ARNic-Lipofectamine2000 (25 μl cada uno por pocillo) a las células y se incubaron las células durante 24 h a 37ºC y un 5% de CO2 en un incubador humidificado (Heraeus GmbH, Hanau).
Se recogieron las células aplicando 50 μl de mezcla de lisis (contenido del kit de ADNb QuantiGene de Genospectra, Fremont, EE.UU.) a cada pocillo que contiene 100 μl de medio de crecimiento y se lisaron a 53ºC durante 30 min. Después de eso, se incubaron 50 μl de los lisados con conjuntos de sondas específicas para ENaC-alfa humana y GAPDH humana (véase la secuencia de los conjuntos de sondas a continuación) y se procedió según el protocolo del fabricante para QuantiGene. Al final, se midió la quimioluminiscencia en un instrumento Victor2-Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Alemania) como URL (unidades relativas de luz) y se normalizaron los valores obtenidos con el conjunto de sondas de hENaC con respecto a los valores de GAPDH respectivos para cada pocillo. Se relacionaron los valores obtenidos con ARNic dirigidos contra ENaC-alfa con el valor obtenido con un ARNic no específico (dirigido contra VHC) que se fijó al 100%. Se muestra en las tablas 1A-1D la expresión residual en porcentaje de alfa-ENaC para ejemplos de ARNic.
Se caracterizaron adicionalmente ARNic eficaces a partir de la selección mediante curvas de respuesta a la dosis. Se realizaron transfecciones de curvas de respuesta a la dosis a las siguientes concentraciones: 100 nM, 16,7 nM, 2,8 nM, 0,46 nM, 77 picoM, 12,8 picoM, 2,1 picoM, 0,35 picoM, 59,5 fM, 9,9 fM y simulado (sin ARNic) y se diluyeron con Opti-MEM hasta una concentración final de 12,5 μl según el protocolo anterior. Se realizó el análisis de datos usando el software incorporado en Microsoft Excel XL-fit 4.2 (IDBS, Guildford, Surrey, RU) y aplicando número de modelo sigmoideo 606.
Conjuntos de sondas:
Alfa-ENaC humano: Nombre de Miembros Función Secuencia SEQ.I.D. FPL NO: hENAC001 .235.255.CE CE gtctgtccagggtttccttccTTTTTctcttggaaagaaagt 1645 hENAC002 .274.293.CE CE actgccattcttggtgcagtTTTTTctcttggaaagaaagt 1646 hENAC003 .344.367.CE CE ctctcctggaagcaggagtgaataTTTTTctcttggaaagaaagt 1647 hENAC004 .391.411.CE CE gccgcggatagaagatgtaggTTTTTctcttggaaagaaagt 1648 hENAC005 .501.521.CE CE gcacttggtgaaacagcccagTTTTTctcttggaaagaaagt 1649 hENAC006 .539.560.CE CE agcagagagctggtagctggtcTTTTTctcttggaaagaaagt 1650 hENAC007 .256.273.LE LE cgccataatcgcccccaaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1651 hENAC008 .368.390.LE LE cacagccacactccttgatcatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1652 hENAC009 .412.431.LE LE acagtactccacgttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1653 hENAC010 .455.477.LE LE ggagcttatagtagcagtaccccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1654 hENAC011 .522.538.LE LE acgctgcatggcttccgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1655 hENAC012 .561.580.LE LE gagggccatcgtgagtaaccTTTTTaggcataggacccgtgtct 1656 hENAC013 .214.234.BL BL Tcatgctgatggaggtctcca 1657 hENAC014 .294.318.BL BL Ggtaaaggttctcaacaggaacatc 1658 hENAC015 .319.343.BL BL Cacacctgctgtgtgtactttgaag 1659 hENAC016 .432.454.BL BL Caggaactgtgctttctgtagtc 1660 hENAC017 .478.500.BL BL Gtggtctgaggagaagtcaacct 1661 hENAC018 .581.599.BL BL Ccattcctgggatgtcacc 1662 GAPDH humana Nombre de Miembros Función Secuencia SEQ.I.D. FPL NO: hGAP001 AF261085.252.271.CE CE gaatttgccatgggtggaatTTTTTctcttggaaagaaagt 1663 hGAP002 AF261085.333.352.CE CE ggagggatctcgctcctggaTTTTTctcttggaaagaaagt 1664 hGAP003 AF261085.413.431.CE CE ccccagccttctccatggtTTTTTctcttggaaagaaagt 1665 hGAP004 AF261085.432.450.CE CE gctcccccctgcaaatgagTTTTTctcttggaaagaaagt 1666 hGAP005 AF261085.272.289.LE LE agccttgacggtgccatgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1667 hGAP006 AF261085.290.310.LE LE gatgacaagcttcccgttctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1668
30 (continuación)
Nombre de Miembros Función Secuencia SEQ.I.D. FPL NO: hGAP007 AF261085.311.332.LE LE agatggtgatgggatttccattTTTTTaggcataggacccgtgtct 1669 hGAP008 AF261085.353.372.LE LE gcatcgccccacttgattttTTTTTaggcataggacccgtgtct 1670 hGAP009 AF261085.373.391.LE LE cacgacgtactcagcgccaTTTTTaggcataggacccgtgtct 1671 hGAP010 AF261085.451.472.LE LE ggcagagatgatgacccttttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1672 hGAP011 AF261085.392.412.BL BL Ggtgaagacgccagtggactc 1673 Se muestran las CI50 para ejemplos de ARNic en las tablas 2A y 2B.
Ejemplo 3.2: Inactivación de alfa-ENaC transitoria en un modelo epitelial bronquial humano primario:
Se sembraron en placa células epiteliales bronquiales humanas (referencia del donador 4F1499) en placas de 24 pocillos a 1x105 células por pocillo en 0,5 ml de medio de crecimiento un día antes de la transfección. Las células tenían una confluencia del 70% en el día de la transfección con ARNic.
Se resuspendió cada ARNic a 100 nM en 1 ml de Optimem I (Invitrogen) y en un tubo separado, se diluyó Lipofectamine 2000 (Invitrogen) hasta 6 μl/ml en Optimem, dando una cantidad suficiente para la transfección de cuatro duplicados en una placa de 24 pocillos. Tras 5 minutos a temperatura ambiente, se combinaron las mezclas dando la concentración final deseada de ARNic 50 nM y Lipofectamine 2000 3 μl/ml. Se incubó la mezcla de transfección durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente y se añadieron 420 μl del complejo de ARNic/reactivo a cada pocillo tal como dicta el diseño experimental. Se sacudieron las placas suavemente para garantizar un mezclado completo y entonces se incubaron a 37ºC en un incubador al 5% de CO2/95% de aire durante 4 horas. Posteriormente, se aspiró la mezcla de transfección y se devolvieron las células a condiciones de cultivo normales durante 20 horas adicionales.
Se prepararon lisados celulares para el análisis de ADN ramificado. Se preparó una mezcla de medio:tampón de lisis
2:1 (Panomics) y se lisaron las células en 200 μl a 53ºC durante 30 minutos. Tras una comprobación visual de que la lisis era completa, se almacenaron los lisados celulares a -80ºC para su análisis posterior. Se realizó el análisis de ADN ramificado tal como se describió anteriormente, con la expresión de alfa-ENaC normalizada frente a GAPDH. El protocolo de análisis de ADN ramificado difiere del anterior sólo en que se aplicaron 20 μl de muestra a cada pocillo en este caso.
La tabla 2C muestra la expresión de alfa-ENaC en HBEC primarias para ejemplos de ARNic.
Ejemplo 3.3: Inhibición in vitro de la expresión génica de alfa-ENaC de macaco clonada expresada de manera exógena para agentes de iARN seleccionados en células Cos-1
Clonación de la secuencia de alfa-ENaC de macaco
Secuencias de cebadores para la amplificación de UTR en 5’ y CDS (los nucleótidos mostrados entre paréntesis corresponden a la secuencia de ADNc de α-ENaC de Macaca mulatta (mono rhesus)): P745: 5’-CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3’ (nt 1427) (SEQ.I.D.NO:1674) P733: 5’-CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3’ (nt 1) (SEQ.I.D.NO:1675) P734: 5-CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3’ (nt 17) (SEQ.I.D.NO:1676) P735: 5’-GGCCGCTGCACCTGTAGGG-3’ (nt 28) (SEQ.I.D.NO:1677) Secuencias de cebadores para la amplificación de CDS y UTR en 3’: P737: 5’-ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3’ (nt 1422) (SEQ.I.D.NO:1678)
P740: 5’-TTGAGCATCTGCCTACTTG-3’ (nt 3113) (SEQ.I.D.NO:1679)
Secuencias de cebadores para la amplificación de la parte interna de CDS:
P713: 5’-5’-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3’ (nt 1182) (SEQ.I.D.NO:1679)
P715: 5’-5’-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3’ (nt 2108) (SEQ.I.D.NO:1680)
Se adquirió ARN total de pulmón de macaco (Macaca fascicularis) (n.º R1534152-Cy-BC) de BioCat (Alemania). Se realizó la síntesis de ADNc usando el sistema de síntesis de primera hebra SuperScript III (Invitrogen). Se realizó la síntesis del ADNc usando o bien hexámeros al azar o bien cebadores de oligo dT. Además, también se adquirió ADNc de primera hebra de pulmón de macaco de BioCat (n.º C1534160-Cy-BC). Para la amplificación por PCR, se usó el kit de PCR Advantage 2 (n.º K1910-1, Clontech). Se realizó la amplificación de la UTR en 5’ y las partes de la CDS usando P745 y una mezcla equimolar de P733, P734 y P735. Para la amplificación por PCR de la CDS y UTR en 3’, se usaron los cebadores P737 y P740. Se usaron los cebadores P713 y P715 para la amplificación de partes de la CDS.
Se analizaron todos los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y entonces se clonaron en el vector pCR2.1 usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen) en bacterias TOP10. Entonces se recogieron los clones y se aisló el ADN usando el kit Qiagen Miniprep. Tras la digestión con enzimas de restricción con EcoRI y el análisis mediante electroforesis en gel de agarosa, se sometió el ADN de los clones correctos a secuenciación.
Entonces se alinearon las secuencias con la secuencia de ADNc de α-ENaC de mono rhesus, y se alinearon las secuencias de los clones individuales entre sí. Entonces se clonó el ADNc de alfa-ENaC de macaco de longitud completa mediante digestión de la parte en 5’ (UTR en 5’ y CDS, clon 55) con EcoR I y Not I, digestión de la parte media de la CDS mediante Not I y BstE II (clon 15) y la parte en 3’ (CDS y UTR en 3’) mediante BstE II y EcoR V (clon 80). Entonces se subclonaron los fragmentos de ADN digeridos en pcDNA3.1, se digirió con EcoR I y EcoR V. Entonces se sometió el ADNc de alfa-ENaC de macaco de longitud completa en pcDNA3.1 a secuenciación de longitud completa (Ingenetix, Viena, Austria). La secuencia de ADNc de alfa-ENaC de macaco corresponde a los nt 28 - 3113 de la secuencia de ADNc de alfa-ENaC de mono rhesus. Finalmente, se cortó entonces el ADNc de alfa-ENaC de macaco de pcDNA3-1-alfa-ENaC de macaco mediante digestión con BamH I y EcoR V y se subclonó en el vector pXOON. Se ilustra el mapa del plásmido en la figura 1. La figura 2 representa la secuencia de proteína (SEQ.I.D.NO:1681) y ADN (SEQ.I.D.NO:1682) de alfa-ENaC de macaco.
Transfecciones:
Se sembraron células COS-1 a 6x104 células/pocillo en placas de 24 pocillos cada una en 0,5 ml de medio de crecimiento. Un día tras la siembra, se cotransfectaron las células con el plásmido de expresión de alfa-ENaC de macaco pXOON y el ARNic indicado. Para cada pocillo, se cotransfectaron 4 ng del plásmido de expresión de alfa-ENaC y 600 ng de plásmido portador (pNFAT-luc) con el ARNic relevante (concentración final de 45 nM) usando el reactivo de transfección génica X-treme (Roche) a 3,75 μl/pocillo en un volumen total de Opti-MEM 720 μl/pocillo (Invitrogen) tal como se describe a continuación.
Se realizaron las transfecciones por triplicado para cada muestra. Se prepararon mezclas madre de plásmido/ARNic (cada una para 3,5 pocillos) tal como sigue: 14 ng de plásmido de expresión de alfa-ENaC, 2,1 μg de plásmido portador y 112 pmol de ARNic relevante en un volumen total de 210 μl (Opti-MEM). Se preparó una mezcla madre de lípidos para la transfección completa (105 μl de lípido más 1575 μl de Opti-MEM para ocho muestras de transfección por triplicado). Se mezclaron el plásmido/ARNic y el lípido en un volumen igual para dar un volumen total de 420 μl de mezcla de transfección por muestra por triplicado (3,5x). Tras una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 120 μl de la mezcla de transfección relevante a cada pocillo de células en un volumen de transfección final de 720 μl (Opti-MEM). Se transfectaron las células durante 24 horas a 37ºC y un 5% de CO2 en un incubador humidificado (Heraeus GmbH, Hanau, Alemania) y se recogieron para el análisis de ADN ramificado.
Se prepararon lisados celulares para el análisis de ADN ramificado. Se preparó una mezcla de medio:tampón de lisis
2:1 (Panomics) y se lisaron las células en 200 μl a 53ºC durante 30 minutos. Tras una comprobación visual de que la lisis era completa, se almacenaron los lisados celulares a -80ºC para su análisis posterior. Se realizó el análisis de ADN ramificado tal como se describió anteriormente, con la expresión de alfa-ENaC de macaco normalizada frente a eGFP a partir del plásmido de expresión. El protocolo de análisis de ADN ramificado usado difiere del anterior sólo en que se aplicaron 20 μl de muestra a cada pocillo en este caso.
Conjuntos de sondas:
Alfa-ENaC de macaco: Nombre de FLP Función Secuencia SEQ.I.D.NO: cyENa001 CE cgccgtgggctgctgggTTTTTctcttggaaagaaagt 1683 cyENa002 CE ggtaggagcggtggaactcTTTTTctcttggaaagaaagt 1684 cyENa003 CE cagaagaactcgaagagctctcTTTTTctcttggaaagaaagt 1685 cyENa004 CE cccagaaggccgtcttcatTTTTTctcttggaaagaaagt 1686 cyENa005 LE ggtgcagagccagagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt 1687 cyENa006 LE gtgccgcaggttctgggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1688 cyENa007 LE gatcagggcctcctcctcTTTTTaggcataggacccgtgtct 1689 cyENa008 LE ccgtggatggtggtattgttgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1690 cyENa009 LE gcggttgtgctgggagcTTTTTqggcataggacccgtgtct 1691 cyENa0010 LE ttgccagtacatcatgccaaaTTTlTaggcataggacccgtgtct 1692 cyENa0011 BL acaccaggcggatggcg 1693
eGFP: Nombre de FPL Función Secuencia SEQ.ID.NO: EGFP001 CE ggcacgggcagcttgcTTTTTctcttggaaagaaagt 1694 EGFP002 CE ggtagcggctgaagcactgTTTTTctcttggaaagaaagt 1695 EGFP003 CE cctggacgtagccttcgggTTTTTctcttggaaagaaagt 1696 EGFP004 CE ccttgaagaagatggtgcgctTTTTTctcttggaaagaaat 1697 EGFP005 LE cgaacttcacctcggcgcTTTTTctcttggaaagaaagt 1698 EGFP006 LE ccttcagctcgatgcggtTTTTTctcttggaaagaaagt 1699 EGFP007 LE gtcacgagggtgggccagTTTTTaggeateggacccgtgtct 1700 EGFP008 LE cacgccgtaggtcagggtgTTTTTaggcataggacccgtgtct 1701 EGFP009 LE gtgctgcttcatgtggtcggTTTTTaggcataggacccgtgtct 1702 EGFP0010 LE tcaccagggtgtcgccctTTTTTaggcataggacccgtgtct 1703 EGFP0011 BL cggtggtgcagatgaacttca 1704 EGFP0012 BL catggcggacttgaagaagtc 1705 EGFP0013 BL cgtcctccttgaagtcgatgc 1706
La tabla 2C muestra la expresión de alfa-ENaC en la especie macaco para ejemplos de ARNic.
Ejemplo 3.4 Selección para la inducción de interferón-
Para evaluar la capacidad de ARNic para estimular la liberación de interferón-α (IFNα), se incubó ARNic con células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién purificadas in vitro durante 24 horas. Se añadió el ARNic o bien directamente a las PBMC, o bien tras complejarse con un agente de transfección lipídico (agente de transfección GenePorter 2 o Lipofectamine 2000 o DOTAP) y se incubó posteriormente con las PBMC. Como controles positivos para la inducción de IFNα, se incluyeron las secuencias control no modificadas D_I_A2216 y D_I_A5167.
DI_A_2216: es una molécula de ADN antisentido monocatenario
5’-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-3’
(SEQ.I.D.NO:1707)
DI_A_5167 es un ARNic conjugado con colesterol
5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-col-3’
3’-CsAsCAGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5’ (SEQ.I.D.NO:1708)
Tras 24 horas, se midió el IFNα mediante ELISA. Se determinó el nivel de IFNα basal para células no tratadas y era siempre muy próximo a un control de sólo agua. La adición del agente de transfección solo no dio ningún aumento o dio un pequeño aumento de los niveles de IFNα. Se añadieron oligonucleótidos estimuladores conocidos a las células, o bien directamente o bien en presencia de transfectante, y se observaron los aumentos esperados de IFNα. Este sistema permite determinar la estimulación de IFNα en PBMC humanas por ARNic (u otros oligonucleótidos).
Aislamiento de PBMC humanas: Se obtuvo una fracción concentrada de leucocitos (capa leucocítica) del Blood Bank Suhl, Institute for Transfusion Medicine, Alemania. Estas células eran negativas para una variedad de patógenos, incluyendo VIH, VHC y otros. Se diluyó la capa leucocítica 1:1 con PBS, se añadió a un tubo que contenía Ficoll y se centrifugó durante 20 minutos a 2200 rpm para permitir el fraccionamiento. A esto le siguió la eliminación de la capa turbia de los glóbulos blancos y se transfirió a un tubo con PBS nuevo y Ficoll, que se centrifugó durante 15 minutos a 2200 rpm. Se eliminó de nuevo la capa turbia de glóbulos blancos, se transfirió a medio de cultivo RPMI 1640 y se centrifugó durante 5 minutos a 1.200 rpm para sedimentar los glóbulos blancos. Se resuspendieron las células en RPMI, se sedimentaron como anteriormente y se resuspendieron en medio con FCS 10% hasta 1 x 106/ml.
Medición de interferón-α: Se combinaron las células en cultivo con o bien oligonucleótido 500 nM (o 1 μM) en Optimem o bien oligonucleótido 133 nM en agente de transfección GP2 o Lipofectamine2000 o DOTAP durante 24 horas a 37ºC. Se midió el interferón-α con el kit de ELISA instantáneo de Bender Med Systems (Viena, Austria) según las instrucciones del fabricante.
Se basó la selección de las secuencias terapéuticas líder en un nivel de inducción de IFNα de menos del 15% del control positivo.
Ejemplo 3.5 Determinación de la estabilidad del ARNic en esputo de pacientes con CF
Se recogieron muestras de esputos por el Dr. Ahmet Uluer, Children’s Hospital Boston. Tras la recogida, se trataron las muestras de esputos con antibiótico y se irradiaron con UV para reducir el contenido bacteriano. Para determinar la estabilidad del ARNic en muestras de esputos, se incubaron los ARNic en 30 μl de esputo a una concentración de 5 μM a 37ºC durante los tiempos indicados. Se terminó la reacción mediante la adición de proteinasa K y se incubaron las muestras a 42ºC durante otros 20 minutos. Se añadió una molécula de ARN de 40 meros compuesta por L-nucleótidos (“Spiegelmer”) resistente a la degradación por nucleasas y sirvió como patrón de calibración. Se filtraron las muestras a través de una membrana de 0,2 μm para eliminar los residuos restantes. Se analizaron las muestras mediante HPLC de intercambio iónico desnaturalizante sobre una columna DNAPac PA 200 (Dionex) a pH 11,0 usando un gradiente de perclorato de sodio para la elución. Se cuantificaron ARNic y productos de degradación mediante la determinación del área bajo el pico para cada muestra. Se normalizó la concentración con respecto a la concentración en las muestras no incubadas.
Se basó la selección de las secuencias terapéuticas líder (ND8356, ND8357 y ND8396) en una estabilidad in vitro observada en esputo de CF con una semivida mayor de 60 minutos.
Ejemplo 3.6 Comprobación cruzada de las secuencias terapéuticas líder frente a polimorfismos conocidos en el gen SCNN1A humano
Para excluir polimorfismos conocidos de los sitios diana de candidatos líder, se comprobaron las secuencias de ARNic líder frente a la base de datos de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp). De los 10 polimorfismos de exones
conocidos en el gen SCNN1A humano, ninguno mostró estar presente en los sitios diana de cualquiera de los 10 candidatos terapéuticos líder más potentes.
Ejemplo 3.7: Obtención del perfil in vitro de las 5 secuencias inespecíficas pronosticadas superiores
Se clasificó una lista de alineaciones para cada secuencia mediante su homología a lo largo de una región de 19 meros. Se puntuaron las dianas inespecíficas basándose en el número y la posición de los apareamientos erróneos según los criterios descritos en el ejemplo 1. Se identificaron las 5 secuencias inespecíficas superiores para cada secuencia terapéutica líder (ND8356, ND8357 y ND8396). Se clonaron individualmente secuencias específicas e inespecíficas en un sistema de indicador de luciferasa doble. Cada fragmento clonado abarcaba los 19 nucleótidos diana además de 10 nucleótidos que flanqueaban la región, tanto en 5’ como en 3’ de la secuencia diana. Se clonaron los fragmentos en un sitio de clonación múltiple en 3’ con respecto a la secuencia de luciferasa de Renilla, bajo el control de un promotor de SV40. Se determinó la actividad de cada ARNic frente a secuencias tanto específicas como inespecíficas mediante la fluorescencia relativa de la luciferasa de Renilla diana con respecto a la luciferasa de luciérnaga, estando esta última controlada independientemente por el promotor de TK de VHS. Inicialmente, se realizaron las transfecciones en células COS-7 a una concentración de ARNic de 50 nM. Se tomaron lecturas de luciferasas a las 24 h tras la transfección. A esta alta concentración de ARNic, no se observó inactivación de más del 30% frente a cualquier secuencia inespecífica para cualquiera de los tres ARNic líder. Se demostró actividad frente a la secuencia específica con una reducción relativa en la actividad de luciferasa de Renilla de aproximadamente el 80%. También se generaron curvas de CI50 para cada ARNic frente a la secuencia específica y se controlaron con las secuencias inespecíficas identificadas anteriormente. Para cada ARNic líder, las CI50 específicas en este ensayo de indicador eran de un orden de magnitud similar (10-50 pM) a las CI50 obtenidas frente a la diana endógena en H441 (ejemplo 3.3), lo que indica que para ND8356, ND8357 y ND8396, la potencia frente a la secuencia específica era al menos 1000-5000 veces superior que para cualquiera de las secuencias inespecíficas pronosticadas.
Ejemplo 3.8: Obtención del perfil de genotoxicidad
1.
Determinación de la citotoxicidad: Se determinó la citotoxicidad usando un contador de células para la evaluación de número de células en cultivo.
2.
Se sabe bien que las pruebas de las concentraciones citotóxicas in vitro pueden inducir efectos genotóxicos tales como formación de micronúcleos. Por tanto, se consideró que el aumento de los números de células que contenían micronúcleos que aparecen en los recuentos celulares de aproximadamente el 50% o menos (en comparación con el control negativo simultáneo) estaba relacionado con la citotoxicidad si no podía observarse todavía un aumento dependiente de la dosis en las células micronucleadas a concentraciones que muestran toxicidad moderada como máximo. Se requiere el análisis de una concentración que muestra al menos un 50% de reducción en el recuento celular por las directrices que regulan los ensayos de células de mamíferos in vitro (directrices de OECD e ICH para la realización de pruebas de aberraciones cromosómicas). Además, los protocolos de OECD requieren que las pruebas de compuestos no tóxicos incluyan al menos una concentración de precipitación (siempre que esta no exceda de 10 mM o 5 mg/ml, cualquiera que sea inferior). Puesto que la prueba de micronúcleos in vitro tiene como objetivo predecir el desenlace de los ensayos regulatorios, es decir, la prueba de aberraciones cromosómicas in vitro, se diseñó el protocolo para la prueba de micronúcleos in vitro para que cumpliese los requisitos de estas pruebas.
3.
Sistema de prueba: Las células TK6 son células inmortalizadas y transfectadas con virus de Ebstein-Barr (origen linfoblastoide humano derivadas del bazo). Determinación del potencial clastogénico y/o aneugénico en la prueba de micronúcleos in vitro con células TK6 con/sin homogeneizado de hígado S9 (2%) de ratas macho (tratadas previamente con Aroclor 1254). Tiempo de tratamiento: 20 h (-S9), 3 h (+S9). Tiempo de toma de muestras: 24 h tras el inicio del tratamiento de 3 horas, 48 h tras el inicio del tratamiento de 20 horas. Para cada sustancia, se analizaron al menos tres concentraciones (2 cultivos por concentración) y 2000 células por concentración.
4.
El efecto de inducción de micronúcleos para una concentración sometida a prueba se consideró positivo si la frecuencia de células micronucleadas era
•
>= 2% y mostró al menos una duplicación del valor del control de disolvente simultáneo, OR
•
< 2% y mostró al menos un aumento de 3 veces con respecto al valor del control de disolvente simultáneo.
5.
Para concluir que un experimento es positivo, tienen que tenerse en cuenta la relación dosis-efecto y la toxicidad.
6.
7.
Resumen: Las secuencias terapéuticas líder ND8396, ND8356, ND8357 no indujeron un aumento del número de
células que contenían micronúcleos tras el tratamiento de 20 horas sin activación metabólica, ni tras el tratamiento de 3 horas con o sin S9. No pudo analizarse la concentración citotóxica hasta el límite de prueba de 5 mg/ml.
Ejemplo 3.9 Eficacia funcional in vitro en H441: ND8396
Con el fin de demostrar la eficacia funcional in vitro de ARNic líder frente a alfaENaC, se transfectaron células H441 con ARNic y se prepararon para el análisis mediante la cámara de Ussing del transporte iónico. Para la transfección, se sembraron en placa células H441 en frascos T25 a 2 x 106 células por frasco en medio de cultivo complementado con dexametasona 200 nM. Se transfectaron las células en cada frasco con o bien ND8396 o bien un ARNic control que no seleccionaba como diana a ARNic 30 nM y Lipofectamine 2000 4 ml/ml en un volumen total de 5 ml (medio libre de suero). Un día tras la transfección, se sembraron en placa las células sobre insertos Snapwell de 1 cm2 a confluencia (2 x 105 células por inserto) para minimizar el tiempo requerido para la diferenciación y formación de uniones estancas y se suministró medio en las cámaras tanto apical como basolateral. Tras un día de cultivo adicional, se eliminó el medio apical y se reemplazó el medo basolateral, llevando así las células a cultivo en la superficie de contacto aire-líquido (ALI). Se mantuvieron las células en ALI durante seis días adicionales antes del análisis del transporte iónico.
8.
Para el análisis funcional en cámaras de Ussing, se montaron los insertos de Snapwell en cámaras de difusión vertical (Costar) y se bañaron con disolución de Ringer gasificada de manera continua (el 5% de CO2 en O2; pH 7,4) mantenida a 37ºC que contiene: NaCl 120 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 3,3 mM, K2HPO4 0,8 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 1,2 mM y glucosa 10 mM. Se determinó la osmolaridad de la disolución dentro del intervalo de 280 y 300 mosmol/kg de H2O. Se sometieron las células a pinzamiento de voltaje a 0 mV (modelo EVC4000; WPI). Se midió la resistencia transepitelial (RT) aplicando un pulso de 1 ó 2 mV a intervalos de 30 s, o usando la diferencia de potencial inicial a través de las células y la corriente inicial medida, y calculando entonces RT mediante la ley de Ohm. Se registraron los datos usando una estación de trabajo PowerLab (ADInstruments). Tras el tratamiento con ARNic, se registraron las características basales de las células y la corriente de cortocircuito sensible a amilorida (ISC tras la aplicación de amilorida 10 μM; lado apical sólo). Se determinó la actividad del canal ENaC en cada cultivo mediante la ISC sensible a amilorida en cada caso.
9.
Tras el ensayo, se lisaron las células en los insertos individuales para el análisis del ARN. Se correlacionó una inactivación del 75% al nivel del ARN en el tiempo de ensayo (ND8396 en comparación con control que no selecciona como diana) con una inactivación funcional de la corriente sensible a amilorida de aproximadamente el 30% (ND8396 en comparación con control que no selecciona como diana).
Se representan a continuación secuencias de ácido nucleico usando nomenclatura convencional, y específicamente las abreviaturas de la tabla A.
Tabla A: Abreviaturas de monómeros de nucleótido usados en la representación de secuencias de ácido nucleico. Se entenderá que estos monómeros, cuando están presente en un oligonucleótido, se unen mutuamente mediante enlacs 5’-3’-fosfodiéster.
Abreviaturaa
Nucleótido(s)
A
adenosina-5´-fosfato
C
citidina-5’-fosfato
G
guanosina-5’-fosfato
T
2’-desoxi-timidina-5’-fosfato
U
uridina-5’-fosfato
c
2’-O-metilcitidina-5’-fosfato
u
2’-O-metiluridina-5’-fosfato
Ts
2’-desoxi-timidina-5’-fosforotioato
Tabla 1A: ARNic seleccionados en el conjunto de selección inicial (ARNic que presentan reactividad cruzada entre ENaC alfa de ser humano-rhesus). Se identificaron un total de 152 secuencias de ARNi como conjunto de selección
inicial, tanto con (hebras de secuencia 1-304) como sin (hebras de secuencia 305-608) modificación de la estructura principal. Se diseñaron secuencias de ARNi para que fuesen completamente complementarias con secuencias de alfa-ENaC de tanto ser humano como mono rhesus, según los criterios de diseño descritos en la sección de ejemplos. Se muestra la expresión residual en porcentaje de alfa-ENaC en dos experimentos de transfección de una única dosis independientes (se hace referencia a la sección de ejemplos para los métodos usados).
Tabla 1B: ARNic seleccionados en un conjunto de selección extendido (ARNic “sólo humanos”): Se identificaron 344 secuencias de ARNi adicionales y se diseñaron para que fuesen completamente complementarias a las secuencias de alfa-ENaC humanas, según los criterios de diseño descritos en la sección de ejemplos. Se modificaron todos los ARNic enumerados en este conjunto de selección sólo con una unión fosforotioato en el extremo 3’ entre los nucleótidos 20 y 21 de cada hebra. Se muestra la expresión residual en porcentaje de alfa-ENaC en el ensayo de transfección de una única dosis (se hace referencia a la sección de ejemplos para los métodos usados).
Tabla 1C: ARNic seleccionados en el conjunto sustituto de rata in vivo (ARNic que presentan reactividad cruzada entre ser humano-rata con la especificidad más alta en rata). Se identificó un conjunto de selección de 48 secuencias de ARNi de alfa-ENaC que presentan reactividad cruzada entre ser humano y rata. Se muestra la
5 expresión residual en porcentaje de alfa-ENaC en dos experimentos de transfección de una única dosis independientes (se hace referencia a la sección de ejemplos para los métodos usados).
Tabla 1D: ARNic seleccionados en el conjunto sustituto de cobaya in vivo (ARNic que presentan reacción cruzada entre ser humana-cobaya): Se identificaron un conjunto de selección de 63 secuencias de ARNi de alfa-ENaC que presentan reacción cruzada entre ser humano y cobaya y se sintetizaron, tanto con (hebras de secuencias 13931518) como sin (hebras de secuencias 1519-1644) modificación de la estructura principal. Se muestra la expresión residual en porcentaje de alfa-ENaC en dos experimentos de transfección de una única dosis independientes (se hace referencia a la sección de ejemplos para los métodos usados).
Tabla 2A: Concentración al 50% de inhibición (CI50) para agentes de ARNi a modo de ejemplo de la tabla 1A (continuación)
ID de dúplex
CI50 [nM] 1º DRC en H441 CI50 [nM] 2º DRC en H441
ND8294
0,1949 0,0468
ND8295
0,1011 0,0458
ND8299
0,5986 0,5638
ND8302
0,0144 0,0134
ND8313
0,0315 0,0124
ND8320
0,0796 0,0078
ND8331
0,0213 0,0158
ND8332
0,0205 0,0089
ND8343
0,0523 0,0293
ND8348
0,0156 0,0182
ND8356
0,0241 0,0099
ND8357
0,0054 0,0032
ND8363
0,1186 0,0337
ND8368
0,0487 0,1209
ND8371
0,0811 0,0911
ND8372
0,0584 0,0425
ND8373
0,0066 0,0165
ND8375
0,1176 0,1187
ND8380
0,6817 0,5747
ND8381
0,0037 0,0041
ND8383
0,0275 0,1257
ND8384
0,0357 0,0082
ND8391
0,0260 0,0349
ND8392
0,3831 0,4775
CI50 [nM]
CI50 [nM]
1º DRC en
2º DRC en
ID de dúplex
H441 H441
ND8396
0,0023 0,0052
ND8403
0,0808 0,0759
Tabla 2B: Concentración al 50% de inhibición (CI50) y para agentes de ARNi a modo de ejemplo de la tabla 1D CI50 [nM] CI50 [nM] 1º DRC en 2º DRC en
H441 H441
ID de dúplex
ND8441 0,6738 0,8080
ND8443 0,0346 0,0263
ND8449 0,0120 0,0067
ND8450 0,0257 0,0106
ND8451 0,1320 0,0931
ND8453 0,0079 0,0033
ND8489 0,1640 0,1593
ND8496 0,0387 0,0185
Tabla 2C: % de actividad de la iARN a modo de ejemplo hacia la inhibición de la expresión génica de alfa-ENaC en los ensayos descritos en el ejemplo 3 Identificador de dúplex % de expresión de alfa-ENaC en expresión de alfa-ENaC en HBEC primarias (% del control) macaco (% del control) ARNic 50 nm ARNic 45 nm
No transfectado 77,2 n/a Control que no selecciona como 100 93,3 diana
Control negativo (alfa-ENaC no de n/a 100 macaco)ND8449 ND-8302 30,2 57
(continuación)
Identificador de dúplex
% de expresión de alfa-ENaC en expresión de alfa-ENaC en
HBEC primarias (% del control)
macaco (% del control)
ARNic 50 nm
ARNic 45 nm
ND-8332
24,7 54,3
ND-8348
40,1 56,2
ND-8356
36,6 55,8
ND-8357
29,6 50,4
ND-8373
30,4 53,8
ND-8381
32,5 40,4
ND-8396
34,1 46,3
ND-8450
45,9 78,9
ND-8453
30,1 55,3

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Composición que comprende un agente de ARNi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en la que:
    a.
    la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8356 (SEQ ID NO: 143) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8356 (SEQ ID NO: 144); o
    b.
    la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8379 (SEQ ID NO: 189) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8379 (SEQ ID NO: 190); o
    c.
    la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8572 (SEQ ID NO: 447) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND8572 (SEQ ID NO: 448); o
    d.
    la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de ND8595 (SEQ ID NO: 493) y la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de ND 8595 (SEQ ID NO: 494).
  2. 2.Composición según la reivindicación 1, en la que la hebra antisentido tiene 30 nucleótidos o menos de longitud, y en la que la hebra sentido y la hebra antisentido forman una región de dúplex de 15 a 30 pares de nucleótidos de longitud.
  3. 3.Composición según la reivindicación 1, en la que la hebra antisentido y la hebra sentido tienen cada una de 19 a 23 nucleótidos de longitud.
  4. 4.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una modificación que hace que el agente de ARNi tenga una estabilidad aumentada en una muestra biológica.
  5. 5.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende un fosforotioato o un nucleótido modificado en 2’.
  6. 6.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende:
    al menos un dinucleótido de 5’-uridina-adenina-3’ (5’-ua-3’), en el que la uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’-uridina-guanina-3’ (5’-ug-3’), en el que la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’; al menos un dinucleótido de 5’-citidina-adenina-3’ (5’-ca-3’), en el que la 5’-citidina es un nucleótido modificado en 2’; o al menos un dinucleótido de 5’-uridina-uridina-3’ (5’-uu-3’), en el que la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’.
  7. 7.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una modificación en 2’ seleccionada del grupo que consiste en: 2’-desoxi, 2’-desoxi-2’-fluoro, 2’-O-metilo, 2’-O-metoxietilo (2’-O-MOE), 2’-Oaminopropilo (2’-O-AP), 2’-O-dimetilaminoetilo (2’-O-DMAOE), 2’-O-dimetilaminopropilo (2’-O-DMAP), 2’-Odimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) y 2’-O-N-metilacetamido (2’-O-NMA).
  8. 8.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende un extremo romo.
  9. 9.Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una proyección de nucleótidos que tiene de 1 a 4 nucleótidos desapareados.
  10. 10.
    Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi comprende una proyección de nucleótidos en el extremo 3’ de la hebra antisentido del agente de ARNi.
  11. 11.
    Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8356 (SEQ ID NO: 143 y 144).
  12. 12.
    Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8379 (SEQ ID NO: 189 y 190).
  13. 13.
    Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8572 (SEQ ID NO: 447 y 448).
  14. 14.
    Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi es ND8595 (SEQ ID NO: 493 y 494).
  15. 15.
    Composición según la reivindicación 1, en la que el agente de ARNi se liga a uno o más de compuesto de
    diagnóstico, grupo indicador, agente de reticulación, resto que confiere resistencia a nucleasas, base nitrogenada natural o poco común, molécula lipófila, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecogenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado con epifriedelanol, vitamina, hidrato de carbono, dextrano, pululano, quitina, quitosano, hidrato de carbono sintético, pentadecámero de oligo-lactato, polímero natural, polímero de peso molecular bajo o medio, inulina, ciclodextrina, ácido hialurónico, proteína, agente de unión a proteína, molécula de selección como diana de integrina, molécula policatiónica, péptido, poliamina, peptidomimético y/o transferrina.
  16. 16.
    Composición que comprende un agente de ARNi para alfa-ENaC, en la que el agente de ARNi comprende una hebra sentido y una hebra antisentido,
    en la que la hebra sentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra sentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 143), ND8379 (SEQ ID NO: 189) y ND8572 (SEQ ID NO: 447) y ND8595 (SEQ ID NO: 493) y
    en la que la hebra antisentido comprende al menos 19 nucleótidos contiguos de la hebra antisentido de un agente de ARNi seleccionado del grupo que consiste en ND8356 (SEQ ID NO: 144), ND8379 (SEQ ID NO: 190), ND8572 (SEQ ID NO: 448) y ND8595 (SEQ ID NO: 494) y,
    comprendiendo además la composición un ligando de receptor epitelial.
  17. 17.
    Composición según la reivindicación 16, en la que el ligando de receptor epitelial es (i) transferrina o (ii) ácido fólico.
  18. 18.
    Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 16, para su uso en terapia.
  19. 19.
    Composición según la reivindicación 1 o la reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por disfunción del canal de sodio epitelial seleccionada del grupo de: fibrosis quística, discinesia ciliar primaria, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma, infecciones de las vías respiratorias, carcinoma de pulmón, síndrome de Liddle, hipertensión, insuficiencia renal y desequilibrio hidroelectrolítico.
ES10163500T 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC Active ES2432644T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07110376 2007-06-15
EP07110376 2007-06-15
EP07114265 2007-08-13
EP07114265 2007-08-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2432644T3 true ES2432644T3 (es) 2013-12-04

Family

ID=40130244

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10163496T Active ES2432643T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi
ES10163502T Active ES2432532T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición de ARNi de la expresión alfa-ENaC
ES10163498.8T Active ES2439277T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi
ES10163500T Active ES2432644T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC
ES10163499T Active ES2432157T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC
ES10163501T Active ES2432158T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición por ARNi de la expresión de alfa-ENaC

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10163496T Active ES2432643T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi
ES10163502T Active ES2432532T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición de ARNi de la expresión alfa-ENaC
ES10163498.8T Active ES2439277T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición de la expresión de la alfa-ENaC por medio de ARNi

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10163499T Active ES2432157T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC
ES10163501T Active ES2432158T3 (es) 2007-06-15 2008-06-13 Inhibición por ARNi de la expresión de alfa-ENaC

Country Status (26)

Country Link
US (12) US7718632B2 (es)
EP (7) EP2223694B1 (es)
JP (6) JP5485146B2 (es)
KR (2) KR101653008B1 (es)
CN (1) CN101778941B (es)
AR (1) AR066984A1 (es)
AU (1) AU2008263876B2 (es)
BR (1) BRPI0813680A8 (es)
CA (1) CA2690674C (es)
CL (1) CL2008001756A1 (es)
CO (1) CO6251331A2 (es)
CR (1) CR11136A (es)
CU (1) CU23774A3 (es)
EA (1) EA200901653A1 (es)
EC (1) ECSP099794A (es)
ES (6) ES2432643T3 (es)
GT (1) GT200900315A (es)
IL (1) IL202366A0 (es)
MA (1) MA31564B1 (es)
MX (1) MX2009013609A (es)
PE (1) PE20090942A1 (es)
SG (3) SG10201601846VA (es)
SV (1) SV2009003434A (es)
TN (1) TN2009000521A1 (es)
TW (3) TWI444474B (es)
WO (1) WO2008152131A2 (es)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050058982A1 (en) * 2002-07-26 2005-03-17 Chiron Corporation Modified small interfering RNA molecules and methods of use
KR100473148B1 (ko) * 2002-11-27 2005-03-10 (주)텔리언 버스트모드 패킷 전달을 위한 정합장치 및 방법
EP1796732B1 (en) * 2004-10-01 2013-10-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Modified small interfering rna molecules and methods of use
US8765704B1 (en) 2008-02-28 2014-07-01 Novartis Ag Modified small interfering RNA molecules and methods of use
AR066984A1 (es) 2007-06-15 2009-09-23 Novartis Ag Inhibicion de la expresion de la subunidad alfa del canal epitelial de sodio (enac) por medio de arni (arn de interferencia)
JP2012509688A (ja) * 2008-11-26 2012-04-26 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介阻害
EP2756845B1 (en) * 2009-04-03 2017-03-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of KRAS by asymmetric double-stranded RNA
US8563710B2 (en) 2009-04-03 2013-10-22 Biomics Biotechnologies Co., Ltd. Modified oligonucleotide and its preparation and application
CN103275978B (zh) * 2009-04-03 2014-10-29 百奥迈科生物技术有限公司 修饰的小干扰核酸及其制备方法
US20120207818A1 (en) * 2009-07-14 2012-08-16 Shinohara Fumikazu Composition for suppressing expression of target gene
AU2010306940A1 (en) * 2009-10-12 2012-06-07 Smith, Larry Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
KR101605932B1 (ko) 2009-12-18 2016-03-24 노파르티스 아게 Ｈｓｆ1-관련 질환을 치료하기 위한 유기 조성물
KR20130051954A (ko) * 2010-04-23 2013-05-21 노파르티스 아게 베타-ＥＮａＣ-관련 질환을 치료하기 위한 유기 조성물
WO2012138416A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Pcr reaction mixtures with decreased non-specific activity
BR112013027070A2 (pt) 2011-04-20 2019-09-24 J Smith Larry métodos e composições para diminuir expressão de gene utilizando componentes que auto montam em células e produzem atividade de rnai
EP2751272A2 (en) 2011-09-02 2014-07-09 Novartis AG Organic compositions to treat hsf1-related diseases
EA201991102A1 (ru) 2016-11-01 2019-09-30 Эрроухед Фармасьютикалс, Инк. Альфа-v бета-6 лиганды интегрина и варианты их применения
US10590416B2 (en) * 2017-07-06 2020-03-17 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents for inhibiting expression of alpha-ENaC and methods of use
CN111372594A (zh) * 2017-10-31 2020-07-03 Ionis制药公司 ENaC表达的调节剂
JOP20200102A1 (ar) * 2017-11-01 2022-10-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc جزيئات ترابط إنتجرين واستخداماتها
CN109364248B (zh) * 2018-10-16 2021-05-18 哈尔滨医科大学 ENaC及其抑制剂在预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化中的应用
EP4021413A4 (en) * 2019-08-30 2023-07-05 United States Government as Represented by The Department of Veterans Affairs LIPOSOMAL TROPONOID COMBINATION FORMULATIONS
US11957178B2 (en) 2021-11-15 2024-04-16 Apackaging Group Llc Aerosol actuator

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4426330A (en) * 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) * 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4837026A (en) * 1985-10-03 1989-06-06 Rajakhyaksha Vithal J Transdermal and systemic preparation and method
DE3604625C2 (de) * 1986-02-14 1994-01-20 Bmw Rolls Royce Gmbh Gasturbine
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5451670A (en) * 1987-12-09 1995-09-19 City Of Hope Restriction fragment length polymorphism test for haplotyping domesticated fowl
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5013566A (en) * 1988-12-19 1991-05-07 Sampson Michael James Process for obtaining improved yields from plants used for hay making by using a coating agent
US5328470A (en) * 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5225212A (en) * 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5356633A (en) * 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5665710A (en) * 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
JP3220180B2 (ja) * 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
JP3351476B2 (ja) * 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
DE69424406T2 (de) * 1993-02-19 2000-10-26 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Arzneistoffzusammensetzung, die ein nukleinsäurecopolymer enthält
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
CA2137297C (en) * 1993-12-06 2000-04-18 Tsuyoshi Miyazaki Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
JP3543347B2 (ja) * 1994-01-24 2004-07-14 日本油脂株式会社 点火薬造粒物の製造方法
US5543152A (en) * 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
EP0843555B1 (en) 1995-08-01 2003-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Liposomal oligonucleotide compositions
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6218108B1 (en) * 1997-05-16 2001-04-17 Research Corporation Technologies, Inc. Nucleoside analogs with polycyclic aromatic groups attached, methods of synthesis and uses therefor
US5865710A (en) * 1996-08-01 1999-02-02 Wilson-Hyde; Cynthia Step aerobic platform
EP0975798A1 (en) 1997-03-11 2000-02-02 Yale University Method to diagnose and treat pathological conditions resulting from deficient ion transport such as pseudohypoaldosteronism type-1
JP2002510319A (ja) * 1997-07-01 2002-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法
US5976849A (en) * 1998-02-05 1999-11-02 Zeneca Limited Human E3 ubiquitin protein ligase
ATE408699T1 (de) 1999-03-10 2008-10-15 Phogen Ltd Verabreichung von nukleinsäuren und proteinen an zellen
WO2002044321A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules
EP1399593A2 (en) 2001-05-16 2004-03-24 Novartis AG Genes expressed in breast cancer as prognostic and therapeutic targets
WO2003057847A2 (en) 2001-12-31 2003-07-17 Algos Therapeutics , Inc. METHODS AND MATERIALS FOR MODULATING ENaC-BETA
US20050058982A1 (en) * 2002-07-26 2005-03-17 Chiron Corporation Modified small interfering RNA molecules and methods of use
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
GB0218970D0 (en) 2002-08-14 2002-09-25 Creative Peptides Sweden Ab Fragments of Insulin c-peptide
EP2305813A3 (en) * 2002-11-14 2012-03-28 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
JP2006517092A (ja) 2002-11-27 2006-07-20 アルテシアン セラピューティック，インコーポレイティド 心不全遺伝子の決定及び治療薬スクリーニング
BRPI0215958B1 (pt) 2002-11-29 2016-11-08 Basf Ag métodos para produção de metionina
DE10305213A1 (de) * 2003-02-07 2004-08-26 Florian Prof. Dr.med. Lang Verwendung eines neuen Polymorphismus im hsgk1-Gen zur Diagnose der Hypertonie und Verwendung der sgk-Genfamilie zur Diagnose und Therapie des Long-Q/T-Syndroms
AU2004227915A1 (en) * 2003-03-31 2004-10-21 John F. Engelhardt Pharmico-gene theraphy of epithelial sodium channel associated disoders
US7723509B2 (en) * 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
WO2004094636A1 (en) 2003-04-24 2004-11-04 Galapagos Genomics N.V. Effective sirna knock-down constructs
US20050256071A1 (en) * 2003-07-15 2005-11-17 California Institute Of Technology Inhibitor nucleic acids
JP4530335B2 (ja) * 2004-02-03 2010-08-25 独立行政法人科学技術振興機構 膀胱に発現する上皮型ナトリウムチャネルに対する阻害薬
EP1752536A4 (en) * 2004-05-11 2008-04-16 Alphagen Co Ltd POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME
SE0402832D0 (sv) * 2004-11-18 2004-11-18 Astrazeneca Ab Methods
US7923206B2 (en) * 2004-11-22 2011-04-12 Dharmacon, Inc. Method of determining a cellular response to a biological agent
CA2590768A1 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai modulation of mll-af4 and uses thereof
US8101741B2 (en) * 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
WO2007070509A2 (en) * 2005-12-13 2007-06-21 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Epithelial sodium channel inhibiting agents and uses therefor
MX2009001207A (es) 2006-08-18 2009-02-11 Hoffmann La Roche Policonjugados para el suministro in vivo de polinucleotidos.
US20110150897A1 (en) 2006-10-11 2011-06-23 Meyer Thomas F Influenza targets
AR066984A1 (es) 2007-06-15 2009-09-23 Novartis Ag Inhibicion de la expresion de la subunidad alfa del canal epitelial de sodio (enac) por medio de arni (arn de interferencia)

Also Published As

Publication number Publication date
PE20090942A1 (es) 2009-08-05
GT200900315A (es) 2011-10-05
EP2224005A1 (en) 2010-09-01
US20200157550A1 (en) 2020-05-21
WO2008152131A2 (en) 2008-12-18
JP2015145393A (ja) 2015-08-13
MX2009013609A (es) 2010-01-20
KR20100039335A (ko) 2010-04-15
ES2432532T3 (es) 2013-12-04
US9476052B2 (en) 2016-10-25
US9074212B2 (en) 2015-07-07
SG10201404955RA (en) 2014-10-30
BRPI0813680B1 (pt) 2018-02-06
US8168606B2 (en) 2012-05-01
ES2439277T3 (es) 2014-01-22
ECSP099794A (es) 2010-01-29
US9914927B2 (en) 2018-03-13
EP2171059A2 (en) 2010-04-07
US20100216971A1 (en) 2010-08-26
TN2009000521A1 (en) 2011-03-31
MA31564B1 (fr) 2010-08-02
KR101821081B1 (ko) 2018-01-23
JP2022188234A (ja) 2022-12-20
JP6680728B2 (ja) 2020-04-15
TWI629063B (zh) 2018-07-11
US20220235361A1 (en) 2022-07-28
JP5485146B2 (ja) 2014-05-07
JP2017222704A (ja) 2017-12-21
SV2009003434A (es) 2011-03-23
CR11136A (es) 2010-01-20
KR101653008B1 (ko) 2016-08-31
WO2008152131A3 (en) 2009-05-28
ES2432158T3 (es) 2013-12-02
SG169988A1 (en) 2011-04-29
JP7157775B2 (ja) 2022-10-20
CL2008001756A1 (es) 2009-02-20
CA2690674C (en) 2018-09-11
US20100216972A1 (en) 2010-08-26
EP2224004B1 (en) 2013-07-24
EP2223694A1 (en) 2010-09-01
EP2224005B1 (en) 2013-09-11
US20100210513A1 (en) 2010-08-19
CO6251331A2 (es) 2011-02-21
JP6193906B2 (ja) 2017-09-06
US20180148726A1 (en) 2018-05-31
ES2432643T3 (es) 2013-12-04
US7943592B2 (en) 2011-05-17
US11208662B2 (en) 2021-12-28
TWI444474B (zh) 2014-07-11
US20220112505A1 (en) 2022-04-14
CN101778941A (zh) 2010-07-14
CN101778941B (zh) 2013-05-22
JP2014129373A (ja) 2014-07-10
BRPI0813680A8 (pt) 2018-08-28
US20100210514A1 (en) 2010-08-19
EP2223693A1 (en) 2010-09-01
US10544418B2 (en) 2020-01-28
TW201524510A (zh) 2015-07-01
AU2008263876B2 (en) 2012-04-12
CA2690674A1 (en) 2008-12-18
JP5719047B2 (ja) 2015-05-13
IL202366A0 (en) 2011-08-01
EP2223695A1 (en) 2010-09-01
ES2432157T3 (es) 2013-12-02
SG10201601846VA (en) 2016-04-28
AU2008263876A1 (en) 2008-12-18
US20090156529A1 (en) 2009-06-18
EP2223694B1 (en) 2013-07-24
EP2223695B1 (en) 2013-07-24
US20160376599A1 (en) 2016-12-29
EP2223692A1 (en) 2010-09-01
US20100190714A1 (en) 2010-07-29
TW201636027A (zh) 2016-10-16
US7939508B2 (en) 2011-05-10
EA200901653A1 (ru) 2010-06-30
TWI552753B (zh) 2016-10-11
AR066984A1 (es) 2009-09-23
US20150284726A1 (en) 2015-10-08
US8119612B2 (en) 2012-02-21
CU23774A3 (es) 2012-02-15
EP2223693B1 (en) 2013-07-24
JP2020094063A (ja) 2020-06-18
TW200911989A (en) 2009-03-16
US7718632B2 (en) 2010-05-18
KR20160105530A (ko) 2016-09-06
EP2223692B1 (en) 2013-07-24
BRPI0813680A2 (pt) 2015-01-06
JP2010530369A (ja) 2010-09-09
EP2224004A1 (en) 2010-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2432644T3 (es) Inhibición mediante iARN de la expresión de alfa-ENaC
AU2023217592A1 (en) RNAi inhibition of alpha-ENaC expression