ES2569943T3 - Una vacuna multicomponente o monocomponente para usar contra la enfermedad de Chagas - Google Patents
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Abstract
El objeto principal de la presente invención es una vacuna contrala enfermedad de Chagas, capaz de estimular la respuesta inmunecontra el factor de virulencia trans-sialidasa del parásito Trvpanosoma cruzi, caracterizada dicha vacuna porque comprende una vacuna multicomponente para la enfermedad del Chagas {tripanosomiasis americana) caracterizada porque comprende: (a) una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos, y (b) uno o mas polinucleótidosque comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénicos, ambas porciones para los derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservadacomún a varios de ellos) donde la administración de dicha vacunaprotege de la infección del parásito, lo elimina o atenúa las consecuencias clínicas de dicha infección. Otro objeto de la presente invención es una vacuna monocom ponente para la enfermedad delChagas que comprende al menos un componente seleccionado entre una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos y un grupo de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénico derivados de los Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a variosde ellos), donde la porción inmunógenica o el grupo de polinucleótido estimula una respuesta de anticuerpos, de células T CD4+ sesgadas Th 1 o T CD8+ contra el Tripanosoma cruzi. También se incluyen en la presente invención las composiciones farmacéuticas quecontienen dichas vacunas multicomponentes y monocomponentes, procedimientos para la obtención de la porción inmunogena de dichasvacunas y el acido nucleico utilizado en dicho procedimiento.
Description
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DESCRIPCION
Una vacuna multicomponente o monocomponente para usar contra la enfermedad de Chagas
El objetivo tecnico de esta invencion es reforzar la respuesta inmunitaria contra antigenos protozoarios y bacterianos, especialmente para aumentar la induccion de la respuesta T citotoxica, esencial contra estos antfgenos. Esta invencion conducira al desarrollo de formulaciones vacunales terapeuticas o profilacticas para la enfermedad de Chagas.
Estado de la tecnica
Trypanosoma cruzi es un protozoo del orden Kinetoplastida, familia Trypanosomatidae, que se distingue por la presencia de un unico flagelo y una unica mitocondria, dentro de la cual, se ordena su genoma en una red compleja y compacta denominada cinetoplasto. Es un parasito intracelular con un ciclo vital que implica a vertebrados e invertebrados.
Existen tres formas diferentes: Amastigoto: Esferica u oval, es la forma reproductiva en el interior de las celulas de mairnfero, Epimastigoto: Alargada, con el cinetoplasto localizado anterior al nucleo, es la forma reproductiva en el tracto digestivo de los invertebrados y en los medios de cultivo, y Tripomastigoto: Tambien alargada, pero con el cinetoplasto localizado posterior al nucleo. Se encuentra en la sangre de los marnfferos y es su forma infectiva. Esta forma no esta dividida.
T. cruzi se divide en dos grandes grupos: T. cruzi I y T. cruzi II. El ultimo se divide en cinco grupos mas pequenos: T. cruzi Ila, Ilb, Ilc, Ild y lie.
El agente etiologico de la enfermedad de Chagas, tambien conocida como tripanosomiasis americana, es un parasito intracelular protozoario, Trypanosoma cruzi. Se transmite mediante un insecto hematofago, Triatoma infestans, el cual transmite el parasito cuando el insecto defeca sobre la picadura al alimentarse. En los marnfferos, el ciclo de T. cruzitranscurre entre el estadio de tripomastigoto, que circula en la sangre y el estadio de amastigoto, que se replica en el citoplasma de las celulas infectadas del anfitrion (especialmente en los musculos). La enfermedad de Chagas prevalece en la mayor parte de los pafses latinoamericanos, incluyendo Mexico y Centroamerica, donde al menos 18 millones de personas estan infectadas por T. cruzi y al menos 50.000 ninos y adultos mueren cada ano de enfermedad de Chagas cronica debido a la falta de tratamientos eficaces.
Los triatomas de la familia de los reduvidos, conocido como vinchuca (desde Ecuador hasta la Patagonia), chipo (en Venezuela), pito (en Colombia), y barbeiro (en Brasil) son insectos hematofagos, es decir, succionadores de sangre, que viven en grietas, agujeros y zonas de suciedad en las casas o sotanos de las regiones de Sudamerica y Centroamerica. Se infectan al picar a un animal o una persona que ya padece la enfermedad. En general, esta infeccion se propaga a los seres humanos cuando un insecto infectado deposita heces sobre la piel de una persona mientras la persona duerme por la noche.
La persona suele frotarse la picadura accidentalmente, introduciendo las heces en la picadura, un corte abierto, los ojos o la boca. Los animales tambien pueden infectarse de la misma forma y tambien contraen la enfermedad al ingerir el insecto infectado. La persona infectada puede no presentar smtomas de la enfermedad hasta 10 o 15 anos despues de haberse infectado; esto hace la deteccion de la enfermedad aun mas diffcil. Mas de 90 millones de personas estan en riesgo de infeccion en las zonas endemicas. Ademas, en las zonas endemicas, el 2-5 % de los fetos que portan las madres infectadas se abortan o nacen con la enfermedad de Chagas congenita.
La falta de ingresos publicos en funcion de la perdida de productividad debida a la enfermedad y a los altos costes medicos tiene un efecto insostenible sobre el crecimiento economico de estos pafses. El riesgo de transmision de T. cruzi a individuos no infectados a traves de trasplantes de organos y transfusiones de sangre de donantes inmigrantes infectados es muy alto.
Los tratamientos quimioterapicos han tenido un exito parcial a la hora de controlar la infeccion por T. cruzi y la enfermedad de Chagas. Sin embargo, la alta toxicidad de los farmacos y la escasa eficacia de las terapias disponibles han limitado el uso de la quimioterapia para el tratamiento, tanto de los pacientes cronicos como de los agudos. Ademas, la terapia farmacologica reduce la gravedad de la enfermedad en los individuos infectados de forma cronica, pero no puede revertir el dano ya causado por los parasitos.
Practicamente no existen vacunas para la prevencion o el tratamiento de la infeccion por T. cruzi. Las vacunas tradicionales constituidas por parasitos inactivados por calor, o fracciones subcelulares de T. cruzi proporcionan un grado de proteccion para las infecciones por T. cruzi (M. Basombrio, Exp. Parasitol. 71:1-8 (1990); A. Ruiz y col., Mol. Biochem. Parasitol, 39:117 - 125. (1990)). Sin embargo, estas vacunas fracasan a la hora de obtener el nivel protector de la inmunidad, probablemente debido a la perdida de epttopos importantes durante la inactivacion y/o a la incapacidad de los antfgenos para entrar en la via de procesamiento y presentacion antigenica del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, de Major Histocompatibility Complex) de clase I, y a la hora de obtener respuestas inmunitarias mediadas por celulas (J. Monaco. Immunol. Today 13:173 - 179 (1992)). Las vacunas vivas atenuadas son capaces de entrar en la via del MHC de clase I y podnan obtener respuestas inmunitarias
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protectoras. Sin embargo, el peligro de reversion de los parasitos atenuados hacia cepas virulentas si la atenuacion no se ha completado hace a estas vacunas impracticables. Se ha demostrado que una vacuna de ADN que contiene el gen que codifica una transialidasa proporciona proteccion profilactica frente a las infecciones por T. cruzi en ratones (F. Costa y col, Vaccine 16:768 -774 (1998)), pero no se ha demostrado que evite o revierta la enfermedad, o que estimule una respuesta de linfocitos T CD8+ en animales. Ademas, se observo respuesta inmunitaria celular y humoral espedfica en ratones BALB/c inmunizados con una biblioteca de expresion genomica de T. cruzi (E. Alberti y col., Vaccine 16:608 - 612 (1998)).
La transialidasa es una enzima de Trypanosoma cruzi (el agente que causa la enfermedad de Chagas) necesaria para que este parasito invada las celulas del anfitrion humano. Dado el hecho de que si el parasito no invade las celulas, no sobrevivira en los seres humanos, la transialidasa parece la diana ideal para un ataque inmunologico, es decir, para desarrollar una vacuna. Por lo tanto, el objetivo es una vacuna que, como respuesta cuando se use para inmunizar, pueda producir anticuerpos que inhiban la transialidasa de forma espedfica.
Existen varias transialidasas producidas en el tripanosoma. Algunas solo tienen una region necesaria para la actividad enzimatica (la transialidacion, que es la transferencia de un azucar denominado acido sialico). Otras, ademas de esta region, tienen una segunda region no relacionada con la transialidacion, pero que es muy inmunogenica (genera anticuerpos en el anfitrion). Esta segunda region se denomina SAPA (de Shed-acute-phase- antigen antfgeno segregado de fase aguda) y esta formada por unidades repetitivas de aminoacidos.
Los genes (acidos nucleicos, ADN, formados por unidades denominadas nucleotidos o bases, una region del ADN que codifica una protema como, en este caso, la transialidasa, se denomina gen) que codifican la region con actividad enzimatica y la region SAPA se han identificado.
Una de las moleculas de T. cruzi descrita como esencial para la invasion de la celula anfitriona es el acido sialico (Schenkman S. y col. Cell 65, 1117-1126,1991; Schenkman, S. y col. Ann. Rev. Microbiol. 48, 499-523, 1994; Schenkman, S. y Eichinger, D. Parasitology Today 9, 218-222, 1993).
Dado que el tripanosoma es incapaz de sintetizar acido sialico (Schauer, R. y col. Z. Physiol. Chem. 364: 1053-1057, 1983), ha de obtenerlo a partir de moleculas que contienen acido sialico presentes en el entorno. Este proceso se consigue usando enzima exclusiva denominada transialidasa (Pre-viato, J.O. et. al., Mol. Biochem. Parasitol. 16:8596, 1985 Y Zingales, B., y col., Mol. Biochem. Parasitol. 26, 135-144, 1987). La transialidasa es capaz de transferir acido sialico desde las moleculas sialidadas presentes en el entorno, tales como algunas moleculas que se encuentran en la sangre del anfitrion infectado, hasta moleculas presentes en la superficie del tripanosoma.
Las moleculas del tripanosoma que pueden sialidarse son las denominadas mucinas (Ruiz, R.C., y col. Parasite Immunol. 15,121-12, 1993; M. B. Reyes, y col. Gene 140, 139-140, 1994; J. M. Di Noia y col. J. Biol. Chem. 270, 24146-24149, 1995; J.M. Di Noia, y col. J. Biol. Chem. 271, 32078-32083, 1996). Una vez sialidadas, las mucinas son las moleculas que interaccionan con la superficie de la celula humana que va a ser invadida, facilitando el proceso de infeccion (Ruiz, R.C., y col. Parasite Immunol. 15, 121-12, 1993). Otros grupos han demostrado que si el parasito no expresa transialidasa, no puede infectar celulas de la misma forma que lo hacen los parasitos que contienen transialidasa (Pereira y col., Infect. Immun. 64, 38843892, 1996). Por lo tanto, la inmunizacion con transialidasa, efectuada de modo que genere anticuerpos para inhibir la enzima, constituye una util herramienta para obtener una vacuna contra el parasito. Recientemente se ha demostrado que la respuesta inmunitaria contra la transialidasa es un factor que ayuda a evitar la muerte del anfitrion causada por el parasito ((Chuenkova, M. y Pereira M.E.A., J. Exp. Med. 181, 1693-1703, 1995).
Trypanosoma cruzi tiene dos tipos de transialidasas. Un tipo contiene unicamente los aminoacidos necesarios para la actividad de la transialidasa (Briones, M.R.S. y col. Mol. Biochem. Parasitol. 70: 9-17, 1995) y se uso en la solicitud WO 9318787 con el fin de sintetizar carbohidratos, debido a su actividad enzimatica, y se propuso en segundo lugar como un inmunogeno en la misma solicitud de patente. Un segundo grupo de transialidasas contiene, ademas de estas secuencias, una serie de repeticiones de aminoacidos en la region carboxilo terminal, denominada SAPA (C. Ibanez, y col. Mol. Biochem. Parasitol. 30: 27-34, 1988; J.L. Affranchino, y col. Mol. Biochem. Parasitol 34: 221228, 1989; Cazzulo, J.J. y Frasch, A.C.C. FASEB J. 6, 3259326, 1992). Esta segunda region es altamente antigenica durante una infeccion natural en seres humanos (M.B. Reyes, y col., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:28462850, 1990).
Las investigaciones mas amplias para vacunas se han centrado sobre los intentos de desarrollar vacunas profilacticas de protemas contra la infeccion por T. cruzi, pero se han llevado a cabo con escaso exito. El desarrollo de vacunas de subunidades compuestas por antfgenos definidos capaces de inducir fuertes respuestas humorales y de linfocitos T de clase 1, y de reducir la carga de parasito, se ha visto obstaculizada debido a la falta de conocimiento de la biologfa de los tres estadios del desarrollo de T. cruzi, la ausencia de informacion suficiente sobre la secuencia de los genes que se expresan en los estadios contagioso e intracelular, y el punto de vista cientffico de que la enfermedad cronica no esta relacionada con la infeccion parasitaria persistente, sino que es el resultado de una respuesta autoinmunitaria inducida por el parasito. Buscaglia y col. (J. Infect. Dis. 1998;177(2):431-436.) desvelan una vacuna contra la enfermedad de Chagas que comprende una protema quimerica transialidasa/SAPA (TS-SAPA) y alumin (marca registrada para el aluminato de sodio).
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Sumario de la invencion
Los objetivos de las presentes invenciones se resuelven como se reivindica en las reivindicaciones.
El primer objetivo de la presente invencion es una vacuna contra la enfermedad de Chagas, capaz de estimular la respuesta inmunitaria contra el factor de virulencia transialidasa del parasite Trypanosoma cruzi, la vacuna se distingue por el hecho de que comprende una vacuna multicomponente para la enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) que comprende lo siguiente: (a) una porcion inmunogenica formada por un polipeptido recombinante o sintetico y (b) uno o mas polinucleotidos que comprenden regiones que codifican uno o mas polipeptidos inmunogenicos, en la que ambos componentes (a) y (b) son de Trypanosoma cruzi; en la que la administracion de dicha vacuna protege contra la infeccion por Trypanosoma cruzi, la elimina y modera las consecuencias clmicas de dicha infeccion; en la que la porcion inmunogenica es el polipeptido de fusion de transialidasa y SAPA (TS-SAPA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 6 (tal como se muestra en la figura 5), caracterizado porque la vacuna multicomponente comprende un adyuvante que no destruye la actividad enzimatica transialidasa de la porcion inmunogenica, en la que el adyuvante es oxido de aluminio.
Otro objetivo de la presente invencion es una vacuna monocomponente contra la enfermedad de Chagas que comprende una porcion inmunogenica constituida por un polipeptido sintetico o recombinante, en la que la porcion inmunogenica estimula una respuesta de anticuerpos de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o de linfocitos T CD8+ contra Trypanosoma cruzi, en la que la porcion inmunogenica es el polipeptido de fusion de transialidasa de y SAPA (TS-SAPA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 6 (tal como se muestra en la figura 5) caracterizado porque la vacuna monocomponente comprende un adyuvante que no destruye la actividad enzimatica transialidasa de la porcion inmunogenica, en la que el adyuvante es oxido de aluminio.
Esta invencion tambien incluye las composiciones farmaceuticas que contienen las vacunas multicomponente y monocomponente. Esta invencion describe ademas los procedimientos para la obtencion de la porcion inmunogenica de dichas vacunas y el acido nucleico usado en dicho procedimiento.
Descripcion de las figuras
Figura 1: Secuencia de los nucleotidos de la region del gen que codifica la protema de Tripanosoma cruzi que tiene actividad transialidasa. Las letras representan cuatro bases (moleculas) que constituyen el ADN (acido desoxirribonucleico). A: Adenina, T: Timina, C: Citosina, G: Guanina. Cada tres bases (triplete de bases) codifica un aminoacido (unidad molecular que forma la protema) que en este caso es transialidasa. El ATG indicado en minusculas es el primer aminoacido de la transialidasa (aminoacido metionina). El ultimo triplete TGA es el que usa la celula para indicar donde termina la protema (triplete de terminacion). Corresponde a la region 1 de la figura 6.
Figura 2: Secuencias de aminoacidos de la region codificada por el gen mostrado en la figura 1 y que corresponde a la parte de la protema que tiene actividad transialidasa. Cada letra indica un aminoacido de acuerdo con el codigo aceptado de forma universal. Corresponde a la region 1 de la figura.
Figura 3: Secuencia de bases que codifica la region de unidades repetitivas de aminoacidos denominada SAPA. Resto de instrucciones similares a las de la figura 1. Corresponde a la region 2 de la figura 6.
Figura 4: Secuencia de aminoacidos codificada de acuerdo con la secuencia de bases indicada en la figura 3 y que corresponde a la protema SAPA. Corresponde a la region 2 de la figura 6.
Figura 5: Secuencias de nucleotidos (lmea superior) (SEQ ID NO. 5) y de aminoacidos (lmea inferior) (SEQ ID NO. 6) correspondientes al gen y la protema respectivamente, resultantes de la union de transialidasa y SAPA.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona una vacuna eficaz para tratar o evitar la infeccion de un mairnfero por derivados de Trypanosoma cruzi (es decir, T. cruzi y/o una region conservada comun a muchos de ellos). En una realizacion preferida, la vacuna es eficaz contra la infeccion y/o la enfermedad causada por T. cruzi. La vacuna multicomponente de esta invencion es para la enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) que comprende lo siguiente: (a) una porcion inmunogenica formada por un polipeptido recombinante o sintetico y (b) uno o mas polinucleotidos que comprenden regiones que codifican uno o mas polipeptidos inmunogenicos, en la que ambos componentes (a) y (b) son de Trypanosoma cruzi; en la que la administracion de dicha vacuna protege contra la infeccion por Trypanosoma cruzi, la elimina y modera las consecuencias clmicas de dicha infeccion; en la que la porcion inmunogenica es el polipeptido de fusion de transialidasa y SAPA (TS-SAPA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 6 (tal como se muestra en la figura 5), caracterizado porque la vacuna multicomponente comprende un adyuvante que no destruye la actividad enzimatica transialidasa de la porcion inmunogenica, en la que el adyuvante es oxido de aluminio.
Una vacuna de polinucleotido contiene uno o mas polinucleotidos que comprenden las regiones que codifican uno o mas polipeptidos inmunogenicos procedentes de T. cruzi. De forma similar, una vacuna de polipeptido contiene uno
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o mas polipeptidos inmunogenicos procedentes de T. cruzi.
Otro objetivo de esta invencion es una vacuna monocomponente contra la enfermedad de Chagas que comprende una porcion inmunogenica constituida por un polipeptido sintetico o recombinante, en la que la porcion inmunogenica estimula una respuesta de anticuerpos de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o de linfocitos T CD8+ contra Trypanosoma cruzi, en la que la porcion inmunogenica es el polipeptido de fusion de transialidasa y SAPA (TS- sApA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. caracterizado porque la vacuna monocomponente comprende un adyuvante que no destruye la actividad enzimatica transialidasa de la porcion inmunogenica, en la que el adyuvante es oxido de aluminio.
La "porcion inmunogenica" de la vacuna es el polipeptido de fusion de transialidasa y SAPA (TS-SAPA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 6 (tal como se muestra en la figura 5), Las vacunas de la invencion comprenden un adyuvante que no destruye la actividad enzimatica transialidasa de la porcion inmunogenica, el cual es oxido de aluminio. La porcion comprende 13 unidades repetitivas en la region C-terminal.
La porcion inmunogenica se obtiene a partir de tripomastigotos de Trypanosoma cruzi (es decir, a partir de un T. cruzi).
Esta invencion se relaciona con una vacuna que es una biomolecula recombinante formada mediante la fusion de esa region que consiste en unidades repetitivas de aminoacidos y el polipeptido con actividad transialidasa.
La vacuna multicomponente de esta invencion estimula preferentemente una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmunitaria transmitida a traves de celulas, o ambas respuestas, en el mairnfero al cual se administrara la vacuna. La vacuna estimulo preferentemente una respuesta de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o de linfocitos T CD8+. En el caso de una vacuna monocomponente, la vacuna estimula la respuesta de anticuerpos, una respuesta de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o una respuesta de los linfocitos T CD8+. La vacuna puede prepararse incluyendo un polinucleotido que comprenda las regiones que codifican una citocina, para proporcionar la estimulacion adicional al sistema inmunitario del mamffero. En un aspecto preferido, la preparacion de la vacuna de esta invencion incluye un polipeptido inmunogenico que contiene una secuencia de desplazamiento de membrana, para facilitar la introduccion del polipeptido en la celula del mamffero y la posterior estimulacion de la respuesta inmunitaria transmitida a traves de celulas.
Las composiciones farmaceuticas que comprenden la vacuna multicomponente de la presente invencion o la vacuna monocomponente de la presente invencion junto con un vehnculo farmaceutico tambien son el objeto de esta invencion.
En particular, una composicion farmaceutica de la presente invencion es una composicion farmaceutica que comprende una vacuna multicomponente de la presente invencion, en la que la porcion inmunogenica o el grupo de polinucleotido estimulan una respuesta de anticuerpos de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o de linfocitos T CD8+ contra Trypanosoma cruzi, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
En particular, una composicion farmaceutica de la presente invencion es una composicion farmaceutica que comprende una vacuna monocomponente de la presente invencion, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
Tambien se desvela una vacuna de multiples componentes de polinucleotido. Se prepara insertando dos o mas polinucleotidos que comprenden las regiones que codifican uno o mas polipeptidos inmunogenicos procedentes de T. cruzi en dos o mas vectores de polinucleotido, combinando mas tarde los vectores de polinucleotido para dar una vacuna de polinucleotido.
De forma alternativa, esta vacuna relacionada con la invencion puede administrarse a un marnffero de forma profilactica antes de la infeccion por T. cruzi. En una realizacion preferida, la aplicacion de la vacuna ha de ser eficaz para evitar la posterior infeccion del marnffero por T. cruzi. En otra realizacion, la administracion de la vacuna es eficaz para evitar el desarrollo de la enfermedad debilitante cronica en un marnffero tras la posterior infeccion por T. cruzi. En otra realizacion, la aplicacion de la vacuna es eficaz para evitar la muerte del marnffero tras la posterior infeccion por T. cruzi.
La invencion describe un procedimiento para identificar los polipeptidos inmunogenicos de T. cruzi de una biblioteca de T. cruzi, para usarlos en una vacuna de polinucleotido. El procedimiento utiliza la inmunizacion con biblioteca de expresion (ELI, de expression library immunization) en ratones para identificar los polipeptidos de T. cruzi que obtienen una respuesta inmunitaria en un marnffero, eficaz para evitar la muerte, detener o retrasar el avance de la enfermedad en el mamffero que ha sido infectado por T. cruzi. El procedimiento puede usarse para identificar los polipeptidos procedentes de T. cruzi y de los ratones the BALB/c o B6 que han sido inmunizados.
El procedimiento puede implicar lo siguiente:
(a) preparacion de una micromatriz de ADN que comprenda una fase de lectura abierta de genes de T. cruzi;
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(b) preparacion de una primera sonda que comprenda ADNc de T. cruzi procedente de tripomastigoto marcado con Cy3;
(b) preparacion de una segunda sonda que comprenda ADNc procedente de amastigoto marcado con Cy5;
(d) cohibridacion de la primera y segunda sondas a la micromatriz para identificar al menos un gen cuya expresion sea T. cruzi durante el estadio de amastigoto intracelular del ciclo infeccioso, en el que el gen codifica un polipeptido inmunogenico candidato de T. cruzi; y
(e) inmunizacion de ratones con el gen para determinar si el gen codifica un polipeptido de T. cruzi que obtiene una respuesta inmunitaria en un mairnfero, eficaz para evitar la muerte del marnffero, o para detener o retrasar el avance de la enfermedad en el mamnfero asociados con la infeccion del mamffero por T. cruzi.
Una forma de preparar el inmunogeno usado en las vacunas multicomponente o monocomponente de esta invencion comprende las siguientes etapas: a) union a las secuencias de nucleotido codificadoras del peptido/s inmunogenico/s a un vector capaz de expresar dicha secuencia, b) ligamiento de la secuencia codificadora obtenida en la etapa anterior a un vector capaz de expresar dicha secuencia, c) transformacion de un anfitrion capaz de expresar la secuencia codificadora del inmunogeno, d) crecimiento de las bacterias transformadas en la etapa anterior en el medio de cultivo adecuado, e) aislamiento y purificacion del inmunogeno obtenido en la etapa anterior. Etapa b) el vector puede ser pET22b+. Los anfitriones son celulas eucariotas, bacterias, especialmente Escherichia coli BL26DE3, y levaduras. El medio de cultivo de la etapa d) puede ser un medio L-Broth.
Otra forma de preparar el inmunogeno usado en las vacunas multicomponente o monocomponente de esta invencion comprende las siguientes etapas: a) crecimiento de la forma de tripomastigoto de Trypanosoma cruzi en un medio de cultivo adecuado, b) obtencion del sobrenadante en el que han crecido las formas de tripomastigoto mediante centrifugacion a 5000 rpm durante 10 minutos, c) filtracion del sobrenadante obtenido y paso a traves de una columna de afinidad que contenga inmunoglobulinas que reconozcan las repeticiones de la secuencia carboximetilo terminal del inmunogeno, d) elucion aumentando el pH para despegar la protema.
Los peptidos usados en el procedimiento de esta invencion pueden obtenerse mediante smtesis qmmica.
La invencion describe ademas un acido nucleico usado en los procedimientos explicados anteriormente porque comprende esencialmente una secuencia codificadora de dicho inmunogeno.
Se conocen mas de 100 anfitriones naturales mamnferos para los anfitriones de T. cruzi, y T. cruzi puede transmitirse a un ser humano desde otro anfitrion animal. Puede inmunizarse a cualquier anfitrion marnffero de acuerdo con esta invencion. La administracion de la vacuna en esta solicitud incluye a seres humanos, animales domesticos tales como perros y gatos, roedores y animales salvajes. Preferentemente, el mamffero que se inmuniza es un perro, un gato o un ser humano.
Vacuna de polinucleotido
La vacuna de polinucleotido incluye al menos una, preferentemente al menos dos, regiones de nucleotidos codificadoras, codificando cada region codificadora un componente de polipeptido inmunogenico para T. cruzi. Cuando contiene dos o mas regiones de nucleotidos codificadoras, la vacuna de polinucleotido se denomina en el presente documento como vacuna multicomponente. Es conveniente reducir al mmimo el numero de los diferentes polipeptidos inmunogenicos codificados por las regiones de nucleotidos codificadoras; sin embargo, considerando que una vacuna de polinucleotido genera el mayor nivel de proteccion, codificara 10 o mas polipeptidos inmunogenicos. La vacuna de polinucleotido vacuna contiene ADN, ARN, un acido nucleico modificado, o cualquier combinacion de los mismos. Preferentemente, la vacuna comprende uno o mas vectores de expresion o de clonacion; mas preferentemente, la vacuna comprende una pluralidad de vectores de expresion capaces de la expresion autonoma de una region de nucleotidos codificadora en una celula de marnffero para producir al menos uno o mas polipeptidos inmunogenicos o citocinas. Un vector de expresion incluye preferentemente una secuencia de promotor eucariota, mas preferentemente, la secuencia de nucleotidos de un promotor eucariota fuerte, ligada de forma operativa a una o mas regiones codificadoras. Un promotor es un fragmento de ADN que actua como una senal reguladora y se una a la ARN polimerasa en una celula para iniciar la transcripcion de una secuencia codificadora cadena abajo (en direccion 3'); la transcripcion es la formacion de una cadena de ARN de acuerdo con la informacion genetica contenida en el ADN. Un promotor esta ligado de forma operativa a una secuencia de acido nucleico, o puede usarse para controlar o regular la transcripcion de esa secuencia de acido nucleico.
Esta divulgacion no esta limitada a un promotor eucariota espedfico sino que se hace extensiva a la amplia variedad conocida; preferentemente, el vector de expresion incluye un promotor de CMV o VRS. El promotor usado permanece preferentemente como un promotor constitutivo.
Un vector util en la presente invencion puede ser circular o lineal, de cadena simple o de cadena doble y puede ser un plasmido, un cosmido o un eposoma pero preferentemente es un plasmido. En una realizacion preferida, cada region de nucleotidos codificadora (que codifica un polipeptido inmunogenico) esta en un vector separado; sin embargo, debe entenderse que pueden estar presentes una o mas regiones en un unico vector, y estas regiones pueden estar bajo el control de promotores individuales o multiples. A la vacuna de polinucleotido, Pueden anadirse secuencias de nucleotido codificadoras de citocinas, tales como un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF, de granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleucina 12 (IL-12) y las moleculas coestimuladoras, tales como B7-1, B7-2, CD40. Las citocinas pueden usarse en varias combinaciones para ajustar la respuesta del sistema inmunitario del animal, incluyendo tanto respuestas de anticuerpos como de linfocitos T
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citotoxicos, alcanzando un nivel de respuesta especifico necesario para controlar o eliminar la infeccion por T. cruzi. La vacuna de polinucleotido puede incluir un producto de fusion que contenga un polipeptido antigenico y una molecula, tal como CTLA-4, que dirigen el producto de fusion hacia las celulas con presencia de antfgeno dentro del anfitrion.
Los plasmidos y otros sistemas de dispensacion se preparan usando tecnicas bien conocidas en biologfa molecular. Esta invencion puede incluir procedimientos para preparar y usar la vacuna de polinucleotido.
Vacuna de polipeptido
La vacuna de polipeptido de esta invencion incluye un polipeptido inmunogenico de T. cruzi (recombinante o sintetico), a saber, una porcion inmunogenica constituida por un polipeptido recombinante o sintetico, en la que la porcion inmunogenica es el polipeptido de fusion de transialidasa y SAPA (TS-SAPA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 6 (tal como se muestra en la figura 5),
Como la respuesta de los linfocitos T CD8+ no puede desencadenarse normalmente de forma directa por la administracion de una vacuna convencional de subunidades de protema, los polipeptidos inmunogenicos contenidos en la vacuna de polipeptido pueden incluir una o mas secuencias transportadoras de membrana (STM) fusionadas con el N-terminal o el C-terminal o ambos. Una secuencia transportadora de membrana permite el transporte del polipeptido inmunogenico a traves de la bicapa de lfpidos, permitiendo que se dispense en el interior de una celula de mairnfero.
Citocinas,
Las citocinas son protemas que regulan la funcion de las celulas que las producen o de otros tipos celulares. Son los agentes responsables de la comunicacion intercelular; inducen la activacion de receptores espedficos de membrana, funciones de proliferacion y diferenciacion celular, quimiotaxis, crecimiento y modulacion de la secrecion de inmunoglobulina. Las producen fundamentalmente los linfocitos y macrofagos activados, aunque tambien pueden producirlas los leucocitos polinucleares, las celulas endoteliales, las celulas epiteliales y las celulas del tejido conjuntivo. Dependiendo de la celula que las produzca, se denominan linfocinas (linfocito), monocinas (monocito) o interleucinas (celulas hematopoyeticas). Su accion principal es la regulacion del mecanismo de la inflamacion. Hay citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias.
La vacuna de polinucleotido puede incluir al menos una region de nucleotidos codificadora que codifica una citocina. Las citocinas de ejemplo incluyen interleucina 12 (IL-12), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), interleucina 6 (IL-6), interleucina 18 (IL-18), interferon y, interferones a, p, y quimiocinas.
Composiciones farmaceuticas
Las vacunas de polipeptido de la invencion se formulan facilmente como composiciones farmaceuticas para uso veterinario o humano. La composicion farmaceutica incluye opcionalmente excipientes o diluyentes que son farmaceuticamente aceptables, tales como los que fueron compatibles con el material genetico. La expresion "vetnculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un vetnculo que es aceptable en el sentido de que es compatible con los diversos componentes de una composicion y que no afecta de forma negativa a su comportamiento terapeutico. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Ademas, si se desea, la vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, sales, y/o coadyuvantes que mejoren la eficacia de la composicion estimuladora de una respuesta inmunitaria. En esta invencion tambien se incluyen algunos procedimientos para preparar y usar esas composiciones farmaceuticas.
Administracion de una combinacion de una vacuna de polinucleotido y de la vacuna de polipeptido
Esta invencion desvela la administracion de una vacuna de polinucleotido y de una vacuna de polipeptido a un mamffero en un protocolo en serie. Por ejemplo, puede administrarse una vacuna de ADN a base de plasmido al sistema inmunitario primario de un mamffero, seguida de una o mas administraciones de una vacuna de polipeptido o de una vacuna vmca (por ejemplo, el vector de la vacuna de polipeptido que porta los genes que codifican los peptidos inmunogenicos y, opcionalmente, las citocinas) para estimular el sistema inmunitario del mamffero. Un experto puede determinar facilmente el orden de administracion de los diversos tipos de vacunas y la naturaleza de las vacunas administradas, en cualquier dosificacion (por ejemplo, la vacuna de polipeptido, vacuna de plasmido, vacuna de vector viral) para provocar la respuesta inmunitaria mas eficaz en el mamnfero.
DEFINICIONES DE CIERTAS PALABRAS Y EXPRESIONES
La "enfermedad de Chagas" se refiere a diferentes expresiones clmicas en los pacientes infectados por diferentes variedades de T. cruzi, relacionadas al mismo tiempo con el impacto inmunologico cronico sobre diversos tejidos blancos. Por consiguiente, las vacunas conocidas actualmente, bien de monos o bien multicomponentes de
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sustancias frecuentemente disponibles de algun tipo de T. cruzi, son formulas parciales para emprender un tratamiento potencialmente eficaz en cada zona geografica en la que se desarrolla esta enfermedad, y contra cada forma intra o extracelular del parasito. Ademas, la inmunogenicidad de dichos componentes frecuentes puede variar a lo largo del tiempo y/o con los cambios en el estado de salud del anfitrion, y por lo tanto, no se garantiza una proteccion universal continua.
"Linfocito T" se refiere a las celulas (leucocitos) encargadas de coordinar la respuesta inmunitaria celular, asf como de las funciones de cooperacion para el desarrollo de cada tipo de respuestas inmunologicas, incluyendo la respuesta de anticuerpos por los linfocitos B. Los linfocitos T pueden diferenciarse de los linfocitos B y de las celulas citolfticas debido a la aparicion de un receptor especial en la superficie de la membrana, denominado receptor de celulas T (TCR, de T-cells Receptor). T viene de timo, el organo mas importante para la diferenciacion de estas celulas a partir de celulas madre del sistema linfatico.
"Linfocitos T CD4+" se refiere a los linfocitos T responsables de coordinar la respuesta inmunitaria celular, asf como de las funciones cooperadoras para el desarrollo de cada tipo de respuesta inmunitaria, incluyendo la respuesta de anticuerpos por los linfocitos B.
"Linfocitos T CD8+" se refiere a los linfocitos T citotoxicos (LTC); Estan incluidos en la lmea de linfocitos T responsable de la funcion efectora de la inmunidad celular. Neutralizan las celulas infectadas por microorganismos intracelulares, atacando directamente a las celulas infectadas, inyectando enzimas toxicas y destruyendolas. Actualmente se denominan CD8+, debido a la presencia del receptor de membrana CD8.
Los LTC son esencialmente capaces de lisar celulas cuando se estimulan adecuadamente, especialmente por antfgenos expresados en el MHC de clase I. Muy espedficos en sus funciones letales, tienen la capacidad de destruir una celula diana sin afectar a las celulas circundantes no infectadas. El proceso de destruccion mediado por celulas LTC comprende:
► Reconocimiento antfgeno extrano y formacion de un conjugado estable con receptores de membrana; MHC-I, TCR, CD8, ICAM-1, LFA-1, entre otros receptores y coestimuladores;
► Activacion de las celulas CTL por medio de interrelaciones celulares mediadas por protemas de membrana y transduccion de signos intracelulares;
► Lisis celular que fuerza cambios en la diana de la celula y exocitosis de granulos toxicos que contienen principalmente perforina y granzina;
► Apoptosis de la celula diana que incluye la mediacion de moleculas que inducen muerte celular, como Fas y su ligando.
Debido a la alta toxicidad de estos linfocitos, y con el fin de evitar el riesgo innecesario de la circulacion continua, las celulas citotoxicas inactivas o vmgenes requieren dos tipos de senales desencadenantes:
► Union del receptor de linfocitos T de la membrana de la celula citotoxica al complejo principal de histocompatibilidad (MHC-I) de tipo I de la superficie de las celulas que presentan el antfgeno (CPA),
► Las celulas infectadas por microorganismos, preferentemente los intracelulares (como los virus), muestran restos del microorganismo en su superficie en el contexto de una molecula de MHC-I. La celula infectada muestra antfgenos extranos para una CPA que procesa la informacion para los LTC,
► Coestimulacion a altas concentraciones procedentes de la union entre la molecula CD40 que aparece en las membranas de las celulas dendnticas y su ligando (CD40L) de las celulas citotoxicas. Es una interaccion redundante, es decir, cuantos mas contactos entre CD40 y su ligando, mayor es la produccion de ligandos por el LTC, haciendo a la senal desencadenante mas fuerte y mas definitiva.
► En los tejidos infectados, los LTC que reconocen el antfgeno implicado se activan y se retienen en la zona de infeccion, y llevan a cabo su actividad efectora. Los LTC que no reconocen el antfgeno implicado vuelven a la circulacion.
El "polipeptido inmunogenico" usado en la vacuna contra T. cruzi de acuerdo con esta invencion se refiera al que puede expresar T. cruzi en su estadio extracelular (tripomastigoto), en el estadio extracelular (amastigoto), o durante ambos estadios del ciclo vital. Preferentemente, el T. cruzi amastigoto expresa el polipeptido inmunogenico en la etapa precoz de la infeccion, aproximadamente 24 horas despues de la infeccion inicial.
Un tipo de polipeptidos que ejemplifican los polipeptidos inmunogenicos de acuerdo con la invencion son los de la familia de protemas de la transialidasa, tales como TSA-1 (T. cruzi Peru; D. Fouts y col. Mol. Biochem. Parasitol. 46:189 - 200 (1991); GenBank. N° de acceso M58466), ASP-1 (T. cruzi el Brasil; M. Santos y col. Mol. Biochem. Parasitol. 86:1-11 (1997): GenBank. N° de acceso H. Lo y col. Mol. Biochem. Parasitol. 88:137 - 149 (1997); GenBank. N° de acceso U77951).
Ventajas de esta invencion
Esta invencion es la vacuna multicomponente o monocomponente mas completa que puede constituir variedades del mismo componente de diferentes T. cruzi, especialmente de aquellas porciones conservadas y/o con la adicion de dianas diferentes entre ellas, por ejemplo, tomando como diana una o varias transialidasas, protemas flagelares o
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proteasas de cistema de una o mas variedades de T. cruzi.
El Chagas es una enfermedad que requiere incentivos y proteccion para las inversiones en desarrollo y distribucion; por tanto, no hay espacio para un mercado competitivo de opciones multiples, como si coexistieran una vacuna argentina, una vacuna brasilena, una vacuna peruana, etc.; en la practica, las vacunas conocidas en la actualidad no han podido desarrollarse sin dejar desprotegida a una parte importante de la poblacion afectada. Por consiguiente, la invencion implica la maxima combinacion de inmunogenicidad que afronte la variedad de expresiones clmicas (es decir, una vacuna "continental monodosis").
Se propone una formula para usar contra todas las variedades y expresiones clmicas. Hasta la fecha no se han descrito formulas con una gama tan amplia de multicomponentes.
Ventajas de una vacuna genetica
La eleccion de la administracion del polinucleotido como una tecnica de inmunizacion ofrece una ventaja excelente sobre los diferentes sistemas que suministran otras vacunas o sistemas de dispensacion de antigeno. Las vacunas que contienen material genetico se prefieren sobre las vacunas tradicionales porque los vectores son faciles de construir y producir, el potencial para la modificacion de secuencias de mutagenesis dirigidas a mejorar la potencia antigenica de epftopos individuales, o a suprimir epftopos que podnan desencadenar una respuesta indeseable. En el caso de vacunas de ADN, la estabilidad del ADN, la ausencia de los riesgos asociados a las vacunas vivas y atenuadas, su capacidad para inducir inmunidad humoral e inmunidad transmitida por celulas, y, en concreto, respuestas de linfocitos T CD8+, y la persistencia de las respuestas de la inmunidad.
Tambien se ha demostrado su capacidad para mejorar la respuesta inmunitaria mediante la coadministracion de genes que codifican citocinas.
TABLA 1: Actividad TS en suero despues de la inyeccion intravenosa de protema transialidasa (TS) o transialidasa unida a SAPA (TS-SAPA).
Los valores son promedios obtenidos a partir de tres animales independientes por grupo. La determinacion se llevo a cabo en muestras de suero recogidas de cada raton a los 30 minutos, y a las 16, 26 y 110 horas despues de la inoculacion. La cepa de raton fue C3H.
- Horas tras la inoculacion
- 0,5 16 26 110
- TS*
- 100 % 3 % 0 % 0 %
- TS-SAPA*
- 100 % 60 % 50 % 5 %
* Valores expresados en % de actividad de la transialidasa restante, considerando como 100% los valores obtenidos 0,5 h despues de la inmunizacion con TS (para los valores de TS) o con TS-SAPA (para los valores de TS-SAPA) respectivamente.
Si en lugar de inyectar una protema con actividad transialidasa, se inyecta por via intravenosa a un raton una protema que contiene la region con actividad transialidasa unida a la protema SAPA (TS-SAPA), los resultados obtenidos son diferentes (tabla 1). Cuando las muestras se recogen a diferentes tiempos despues de la inyeccion intravenosa, la actividad transialidasa es detectable hasta 5 dfas despues de la inyeccion. Estos resultados muestran que a la protema SAPA, cuando se une a otra protema como la transialidasa, se le confiere una propiedad nueva: la propiedad de estabilizarse en la sangre, manteniendo esta actividad enzimatica en la circulacion durante un periodo mas largo.
Pueden obtenerse resultados similares a los descritos anteriormente cuando se usan otras vfas de administracion, tales como la intramuscular, intraperitoneal, subcutanea o cualquier otra que desencadene una respuesta de anticuerpos en el anfitrion inmunizado en lugar de la via de administracion intravenosa. Pueden obtenerse resultados similares igualmente cuando se usan algunos de los adyuvantes inmunizadores ya conocidos, tales como oxido de aluminio u otros que no destruyan la enzima, tal como se detalla a continuacion. Un adyuvante es una sustancia, bien oleosa o bien acuosa, o una sustancia con otra estructura, que inyectada conjuntamente con el inmunogeno -en este caso una protema recombinante como transialidasa/SAPA- contribuye a aumentar la inmunogenicidad, es decir, aumenta la respuesta del sistema inmunitario relacionada con la produccion de anticuerpos o la respuesta celular. Una respuesta celular es un tipo de respuesta por parte del sistema inmunitario en la que, basicamente, las celulas que contribuyen a controlar un agente infeccioso proliferan.
Otro resultado obtenido a partir de estos experimentos es que solo se obtiene una respuesta contra la transialidasa que inhibe su actividad cuando se usa esta enzima como un inmunogeno en su forma activa, es decir, con una conformacion que mantenga su actividad enzimatica.
TABLA 2: Actividad inhibidora de la transialidasa en suero de animales inmunizados con transialidasa, con repeticiones (TS-SAPA), con adyuvante de Freund (AF), con oxido de aluminio (A^03), con protema desnaturalizada por calor a 80 °C (80 °C). La inmunizacion se llevo a cabo por via intraperitoneal, en todos los casos con 65 nanogramos para la primera dosis (dfa 0) y con 13 nanogramos para la segunda dosis en el dfa 38. La determinacion de la inhibicion de la transialidasa se llevo a cabo como se describe para los experimented previos para el dfa 1 y en el dfa 45 despues de la primera inmunizacion (dfa 0).
La determinacion se expresa en % de la inhibicion obtenida en presencia de suero de ratones no inmunizados, cuyos valores de inhibicion se consideran como 0. Los valores son el promedio obtenido a partir de cuatro ratones inmunizados independientemente para cada afeccion.
- Dias tras la inmunizacion
- 1 45
- TS-SAPA en AF
- 0 % 0 %
- TS-SAPA en Ah03
- 0 % 90 %
- TS-SAPA a 80 °C
- 0 % 0 %
Otro resultado obtenido como consecuencia de estos experimentos es que solo se obtiene una respuesta contra la transialidasa que inhibe su actividad cuando se usa esta enzima como un inmunogeno en su formulacion activa, es decir, con una conformacion tal que conserve su actividad enzimatica. La tabla 2 muestra que cuando el adyuvante 5 usado para inmunizar a los ratones es oxido de aluminio -que no altera la actividad enzimatica de la transialidasa- se generan anticuerpos que la inhiben. Sin embargo, si se usa el adyuvante de Freund como adyuvante -el cual destruye la actividad enzimatica de la transialidasa, no se generaran en el raton anticuerpos que inhiban la transialidasa. Del mismo modo, la transialidasa inactivada por calor a 80°C durante 3 minutos de modo que se impide que la protema mantenga su actividad enzimatica, evitando que se estimule mediante la formacion de 10 anticuerpos neutralizantes.
Pueden obtenerse resultados similares a los descritos anteriormente cuando se usan otras vfas de administracion, tales como la intramuscular, intraperitoneal, subcutanea o cualquier otra que desencadene una respuesta de anticuerpos en el anfitrion inmunizado en lugar de la via de administracion intravenosa.
Ademas, pueden obtenerse resultados similares cuando alguno de los adyuvantes que se sabe que inmunizan, tales 15 como oxido de aluminio u otros que no destruyan la enzima, tal como se menciona anteriormente, Un adyuvante es oleoso, agua, o una sustancia de otra estructura, que inyectada junto con el inmunogeno, en este caso una protema recombinante, tal como transialidasa/SAPA, contribuye a aumentar su inmunogenicidad, es decir, aumenta la respuesta del sistema inmunitario con relacion a la produccion de anticuerpos o a la respuesta celular. La respuesta celular es un tipo de respuesta del sistema inmunitario en la que la proliferacion es basicamente de las celulas que 20 contribuyen a controlar un agente infeccioso.
Claims (5)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Una vacuna multicomponente contra la enfermedad de Chagas que comprende lo siguiente:(a) una porcion inmunogenica constituida por un polipeptido recombinante o sintetico; y(b) uno o mas polinucleotidos que comprenden las regiones codificadoras de uno o mas polipeptidos inmunogenicos;en la que ambos componentes (a) y (b) son de Trypanosoma cruzi;en la que la administracion de dicha vacuna protege contra la infeccion por Trypanosoma cruzi, la elimina y modera las consecuencias clmicas de dicha infeccion; en la que la porcion inmunogenica es el polipeptido de fusion de transialidasa y SAPA (TS-SAPA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 6 tal como se muestra en la figura 5; caracterizada porque la vacuna multicomponente comprende un adyuvante que no destruye la actividad enzimatica transialidasa de la porcion inmunogenica, en la que el adyuvante es oxido de aluminio.
- 2. La vacuna multicomponente definida en la reivindicacion 1, que estimula al menos una respuesta inmunitaria en el anfitrion seleccionada de entre el grupo que consiste en una respuesta de anticuerpos y/o una respuesta inmunitaria por mediacion de celulas, preferentemente al menos una respuesta de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o de linfocitos T CD8+, lo mas preferentemente al menos una respuesta de linfocitos T CD8+.
- 3. Una vacuna monocomponente contra la enfermedad de Chagas que comprende una porcion inmunogenica constituida por un polipeptido sintetico o recombinante,en la que la porcion inmunogenica estimula una respuesta de anticuerpos de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o de linfocitos T CD8+ contra Trypanosoma cruzi;en la que la porcion inmunogenica es el polipeptido de fusion de transialidasa y SAPA (TS-SAPA) de Trypanosoma cruzi codificado por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 5 o que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 6 tal como se muestra en la figura 5;caracterizada porque la vacuna monocomponente comprende un adyuvante que no destruye la actividad enzimatica transialidasa de la porcion inmunogenica, en la que el adyuvante es oxido de aluminio.
- 4. Una composicion farmaceutica que comprende una vacuna multicomponente definida en la reivindicacion 1, en la que la porcion inmunogenica o el grupo de polinucleotido estimulan una respuesta de anticuerpos de linfocitos T CD4+ polarizados hacia Th1 o de linfocitos T CD8+ contra Trypanosoma cruzi, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
- 5. Una composicion farmaceutica que comprende una vacuna multicomponente definida en la reivindicacion 3, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
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