WO2009056965A2 - Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra ia enfermedad de chagas, composiciones farmacéuticas que las contienen, procedimiento para ia obtención del inmunógeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento - Google Patents

Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra ia enfermedad de chagas, composiciones farmacéuticas que las contienen, procedimiento para ia obtención del inmunógeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento Download PDF

Info

Publication number
WO2009056965A2
WO2009056965A2 PCT/IB2008/002923 IB2008002923W WO2009056965A2 WO 2009056965 A2 WO2009056965 A2 WO 2009056965A2 IB 2008002923 W IB2008002923 W IB 2008002923W WO 2009056965 A2 WO2009056965 A2 WO 2009056965A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
clause
vaccine
cruzi
immunogen
immunogenic
Prior art date
Application number
PCT/IB2008/002923
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2009056965A3 (es
Inventor
Carlos De Baeremaecker Barros
Original Assignee
Terramark Markencreation Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Terramark Markencreation Gmbh filed Critical Terramark Markencreation Gmbh
Priority to MX2010004626A priority Critical patent/MX2010004626A/es
Priority to EP08844056.5A priority patent/EP2206513B1/en
Priority to CA2702534A priority patent/CA2702534C/en
Priority to ES08844056.5T priority patent/ES2569943T3/es
Priority to US12/740,393 priority patent/US8900598B2/en
Publication of WO2009056965A2 publication Critical patent/WO2009056965A2/es
Publication of WO2009056965A3 publication Critical patent/WO2009056965A3/es
Priority to US14/529,454 priority patent/US9662378B2/en
Priority to US15/492,365 priority patent/US10213500B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/005—Trypanosoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the technical objective of the present invention is to favor the increase in the immune response against protozoal or bacterial antigens, especially to increase the induction of essential cytotoxic T response against these antigens.
  • the present invention will lead to the development of therapeutic or prophylactic vaccine formulations for Chagas disease.
  • Trypanosoma cruzi is a protozoan of the order kinetoplastidia, family Tryponosomatidae, characterized by the presence of a single scourge and a single mitochondrion, within which its genome is arranged in a complex and compact network called kinetoplast. It is an intracellular parasite with a life cycle that involves vertebrates and invertebrates.
  • Amastigote spherical or oval
  • Epimastigote elongated and with the kinetoplast located before the nucleus
  • trypomastigote also elongated, but with the kinetoplast located subsequently to the nucleus It is found in the blood of mammals and is the infective form of them. This form is not divided.
  • T. cruzi is divided into two large groups: T. cruzi ⁇ and T. cruzi W. The latter in turn is divided into five smaller groups: T. cruz / ' Ua, Hb, Mc, Md and He.
  • Chagas disease also called American trypanosomiasis
  • Triatoma infestans which transmits the parasite when it defecates on the bite that it has made to feed itself.
  • T. cruzi cycles are between a stage of trypomastigote that circulates in the blood and the stage of amastigote that replicates in the cytoplasm of infected host cells (especially in muscles).
  • Chagas disease is predominant in almost all Latin American countries that also include Mexico and Central America, where approximately 18 million people are infected with T. cruzi and at least 50,000 children and adults die each year from Chagas disease chronic due to the absence of effective treatments.
  • Reduvid triatomines known as vinchuca (from Ecuador to Patagonia), chipo (in Venezuela), pito (in Colombia) and barbeiro (in Brazil), are hematophagous insects, i.e. blood suckers, living in slits, holes and unwanted spaces of homes or warehouses in the regions of South America and Central America. These become infected after
  • More than 90 million are at risk of infection in endemic areas.
  • 2-5% of fetuses can be infected by maternal route in these endemic areas that can cause abortions or future births with congenital Chagas disease.
  • Chemotherapeutic treatments have been partially satisfactory in the control of T. cruzi infection and Chagas disease.
  • the high toxicity of the drugs and the limited therapeutic efficacy available have ended up limiting the usefulness of chemotherapy for the treatment of acute and chronic patients.
  • drug therapy reduces the severity of the disease in chronically infected individuals, but does not reverse the damage caused by parasites.
  • Vaccines for the prevention or treatment of T. cruzi infection practically do not exist.
  • Traditional vaccines consisting of heat-inactivated parasites, or subcellular fractions of T. cruzi provide a degree of protection for infections with T. cruzi (M. Basombrio, Exp. Parasitol. 71: 1-8 (1990); A. Ruiz and others., Mol. Biochem. Parasitol, 39: 117-125. (1990)).
  • a DNA vaccine containing the gene encoding trans-sialiadasa has been shown to provide prophylactic protection against T. cruzi infections in mice (F. Costa et al, Vaccine 16: 768-774 (1998)), but not has demonstrated prevention or that causes a reversal of the disease or stimulates a response of the animal cytotoxic T cell.
  • the specific cellular and humoral immune response in the BALB / c mice immunized with a genomic expression library of T. cruzi has been observed (E. Alberti et al., Vaccine 16: 608-612 (1998)).
  • Trans-sialidase is an enzyme of Trvpanosoma cruzi (causative agent of Chagas disease) that is required by this parasite to invade human host cells. Since if the parasite does not invade cells, it does not survive in the human, trans-sialidase seems to be an ideal target for the immune attack, that is, development of a vaccine. Therefore, what is sought is a vaccine that when used to immunize, produces in response antibodies that specifically inhibit trans-sialidase.
  • trans-sialidases produced in the trypanosome. Some have only one region that is the one required for the enzymatic activity (trans-sialidation which is the transfer of a sugar called sialic acid). Others have, in addition to this region, a second domain that has nothing to do with trans-sialidation, but is very immunogenic (generates antibodies in the host). This second region Ia we call SAPA (shed-acute-phase antigen that means antigen released from acute phase) and is formed by repetitive units of amino acids.
  • SAPA shed-acute-phase antigen that means antigen released from acute phase
  • Genes have been identified (nucleic acids, DNA, formed by units called nucleotides or bases, a region of DNA that encodes a protein such as in this case the trans-sialidase, is called a gene) that encode the region with enzymatic activity and the region SAPA
  • T. cruzi molecules One of the T. cruzi molecules described as essential for the invasion of host cells is sialic acid (Schenkman S. et al. CeII 65,1117-1126,1991; Schenkman, S. et al. Ann.Rev.Microbiol. 48, 499-523, 1994; Schenkman, S. and Eichinger, D. Parasitology Today 9, 218-222, 1993). Since the trypanosome is unable to synthesize sialic acid (Schauer, R. et al. Z. Physiol. Chem. 364: 1053-1057, 1983), it must be acquired from molecules containing sialic acid present in the medium.
  • trans-sialidase This process is done using a single enzyme called trans-sialidase (Previato, JO et. Al., Mol. Biochem. Parasitol. 16: 8596, 1985 and Zingales, B., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 26, 135-144, 1987).
  • the trans-sialidase is capable of transferring sialic acid from sialidated molecules present in the medium, such as some of those circulating in the blood of the infected host, to molecules present on the surface of the trypanosome.
  • the trypanosome molecules that can be sialidated are mainly those called mucins (Ruiz, R. C, et al. Parasite Immunoi. 15,121-12, 1993; MB Reyes, et al. Gene 140, 139-140, 1994; JM Di noisya et al. J. Biol. Chem. 270, 24146-24149, 1995; JM Di noisya, et al. J. Biol. Chem. 271, 32078-32083, 1996).
  • the mucins are those that interact with the surface of the human cell to be invaded, thus enabling the infection process (Ruiz, R. C, et al. Parasite Immunoi. 15, 121-12, 1993) .
  • trans-sialidases Trypanosoma cruzi has two types of trans-sialidases. One of them contains only the amino acids required for trans-sialidase activity (Briones, MRS et al. Mol. Biochem. Parasitol. 70: 9-17, 1995) and was used in the application WO 9318787 for the purpose of synthesizing carbohydrates given its enzymatic activity and secondarily proposed as an immunogen in the same patent application.
  • a second group of trans-sialidases contains, in addition to these sequences, a series of amino acid repeats in the carboxyl terminal region called SAPA (C. Ibá ⁇ ez, et al. Mol. Biochem. Parasitol.
  • the main object of the present invention is a vaccine against Chagas disease, capable of stimulating the immune response against the trans-sialidase virulence factor of the Trypanosoma cruzi parasite, characterized in that said vaccine because it comprises a multicomponent vaccine for Chagas disease ⁇ trypanosomiasis americana) characterized in that it comprises: (a) an immunogenic portion consisting of one or more recombinant or synthetic polypeptides, or fractions thereof, and (b) one or more polynucleotides comprising the regions encoding one or more immunogenic polypeptides, both portions for derivatives of the Trypanosoma cruzi (that is to say of a T. Cruzi and / or a conserved region common to several of them) where the administration of said vaccine protects against the infection of the parasite, eliminates or attenuates the clinical consequences of said infection.
  • Another object of the present invention is a monocomponent vaccine for Chagas disease comprising at least one component selected from an immunogenic portion consisting of one or more recombinant or synthetic polypeptides, or fractions thereof and a group of polynucleotides that comprise the regions that encode one or more immunogenic polypeptides derived from Trypanosoma cruzi (that is, from a T. Cruzi and / or a conserved region common to several of them), where the immunogenic portion or the polynucleotide group stimulates an antibody response, of Th1 or skewed CD4 + T cells or CD8 + T against Trypanosoma cruzi.
  • compositions containing said multicomponent and monocomponent vaccines are also included in the present invention.
  • procedures for obtaining the immunogenic portion of said vaccines and the nucleic acid used in said process are also included in the present invention.
  • Figure 1 Nucleotide sequence of the region of the gene that encodes the protein of Trypanosoma cruzi that has transsial idasa activity.
  • the letters represent the four bases (molecules) that make up the DNA (deoxyribonic acid).
  • A adenine
  • T thymine
  • C cytosine
  • G guanine. Every three bases (three hundred bases) an amino acid (molecular unit that forms the protein) is encoded, which in this case is the Idasa transsial.
  • the lowercase ATG indicated is the first amino acid of the trans-sialidase (the amino acid methionine).
  • the last TGA triplet is the one used by the cell to indicate where the protein is terminated (termination triplet).
  • Figure 2 Amino acid sequence of the region encoded in the gene shown in Figure 1 and corresponding to the part of the protein that possesses trans-sialidase activity. Each letter indicates an amino acid according to the universally accepted code. Corresponds to region 1 of Figure 6.
  • Figure 3 Base sequence encoding the region of repetitive amino acid units called SAPA. Other indications equal to Figure 1. Corresponds to region 2 of Figure 6.
  • Figure 4 Amino acid sequence encoded according to the sequence of bases indicated in Figure 3 and corresponding to the SAPA protein. Corresponds to region 2 of Figure 6.
  • Figure 5 Sequence of nudeotides (upper line) and amino acids (lower line) corresponding to the gene and protein, respectively, resulting from the union of trans-sialidase and SAPA.
  • the present invention provides a vaccine that is effective for treating or preventing the infection of a mammal by derivatives of the Trypanosoma cruzi (that is, of a T. Cruzi and / or a conserved region common to several of them).
  • the vaccine is effective against infection and / or disease caused by T. cruzi.
  • the multicomponent vaccine of the present invention is for Chagas disease ⁇ American trypanosomiasis) comprising: (a) a portion Immunogenic conformed by one or more recombinant or synthetic polypeptides, or fractions thereof, and (b) one or more polynucleotides comprising regions encoding one or more immunogenic polypeptides, both portions for derivatives of Trypanosoma cruzi (en say of a T. Cruzi and / or a conserved region common to several of them), and where the administration of said vaccine protects against infection of the parasite, eliminates or attenuates the clinical consequences of said infection.
  • a polynucleotide vaccine contains one or more polynucleotides that comprise the regions encoding one or more immunogenic polypeptides derived from T. Cruzi. Similarly, a polypeptide vaccine contains one or more immunogenic polypeptides derived from T. cruzi.
  • Another object of the present invention is a monocomponent vaccine for Chagas disease comprising at least one component selected from an immunogenic portion consisting of one or more recombinant or synthetic polypeptides, or fractions thereof and a group of polynucleotides that comprise the regions encoding one or more immunogenic polypeptides derived from Trypanosoma cruzi (that is, from a T. Cruzi and / or a conserved region common to several of them), where the immunogenic portion or the polynucleotide group stimulates an antibody response, of Threaded CD4 + T cells or CD8 + T against the Trypanosoma cruzi.
  • the "immunogenic portion" of the vaccine may comprise one or more polypeptides whose structure includes a C-terminal region consisting of at least two repetitive units of amino acids, each of said repetitive units possessing at least 60% homology. with the following amino acid sequence: AHSTPSTPVDSS and fused to said C-terminal region a polypeptide with trans-sialidase activity. It can also comprise an adjuvant that does not destroy the trans-sialidase enzymatic activity of the immunogenic portion, preferably aluminum oxide. Said portion may comprise between 10 and 16 repetitive units in the C-terminal region, preferably 13 units.
  • Said immunogenic portion may be obtained from trypomastigotes of the Trypanosoma cruzi parasites (i.e. from a T. Cruzi and / or a conserved region common to several of them) or from amastigotes of the Trypanosoma cruzi parasites (i.e. from a T. Cruzi and / or a conserved region common to several of them).
  • the vaccine of the present invention can be a recombinant biomoiecuia formed by the fusion of said region consisting of repetitive units of amino acids and said polypeptide with trans-sialidase activity and / or polypeptide with cysteine proteinase activity, and / or parafraglar protein Rod (PFR).
  • PFR parafraglar protein Rod
  • the multicomponent vaccine of the present invention preferably stimulates an antibody response or an immune response transmitted by cells, or both responses, in the mammal to which it will be administered.
  • the vaccine stimulates a response of the biased CD1 + T1 cells or a response of the CD8 + T cells; preferably, in the case of a vaccine of the single component, the vaccine stimulates an antibody response, a response of the T1 skewed CD4 + T cells or a response of the CD8 + T cells.
  • a particularly preferred embodiment of the vaccine of the present invention includes a nucleotide comprising the regions encoding a cytokine, to provide additional stimulation to the mammalian immune system.
  • a particularly preferred embodiment of the polypeptide vaccine of the invention includes an immunogenic polypeptide containing a sequence of membrane displacement, to facilitate the introduction of the polypeptide into the mammalian cell and the subsequent stimulation of the immune response transmitted by cells. .
  • the immunogen of the present invention can be selected from the following proteins TSA-1, ASP-1, ASP-2, hemolysin and Lyt1.
  • the multicomponent vaccine of the present invention can comprise a plurality of polynucleotides that comprise the regions encoding one or more immunogenic polynucleotides derived from T. Cruzi (from a T. Cruzi and / or from a conserved region common to several of them.
  • cytokines which can be selected from interleukin 12 (IL-12), granulocytic macrophage colony stimulation factor (GM-CSF), interleukin 6 (IL-6) , interleukinium (IL-18), ⁇ -, ⁇ , ⁇ -interferon, and chemokines, cytokines IL-12 and GM-CSF are especially preferred.
  • IL-12 interleukin 12
  • GM-CSF granulocytic macrophage colony stimulation factor
  • IL-6 interleukin 6
  • IL-18 interleukinium
  • chemokines cytokines IL-12 and GM-CSF are especially preferred.
  • compositions containing the recombinant or synthetic polypeptides or fractions thereof of the immunogenic portion and polynucleotides comprising the regions encoding one or more immunogenic polypeptides derived from T. Cruzi, together with a pharmaceutical vehicle are also subject to The present invention.
  • the present invention provides a vaccine of several polynucleotide components is prepared by inserting two or more nucleotides that comprise the regions that encode one or more immunogenic polypeptides derived from T. Cruzi in two or more polynucleotide vectors, then combining the polynucleotide vectors to render a polynucleotide vaccine.
  • a vaccine of the present invention can be administered prophylactically to a mammal before infection by T. Cruzi.
  • the administration of the vaccine must be effective in preventing subsequent infection of the mammal by T. Cruzi.
  • the administration of the vaccine is effective to prevent the development of the chronic debilitating disease in a mammal after the subsequent infection by T. cruzi.
  • administration of the vaccine is effective in preventing the death of the mammal after the subsequent infection by T. cruzi.
  • the invention includes a method for identifying T. Cruzi immunogenic polypeptides from a T. cruzi library, for use in a polynucleotide vaccine.
  • the method uses the immunization of the expression library (ELI) in mice to identify T. Cruzi polypeptides that cause an immune response in an mammal effective to avoid, stop or delay the progression of the disease in the mammal that has been infected by T. Cruzi
  • the method is used to identify immunogenic polypeptides derived from T. cruzi, and from BALB / co B6 mice that have been immunized.
  • the procedure involves:
  • (d) co-hybridize the first and second microarray specimens to identify at least one gene that expresses T. cruzi during the intracellular stage of the amastigote infectious cycle, where said gene encodes the immunogenic candidate.
  • a form of preparation of the immunogen used in the multicomponent or monocomponent vaccines of the present invention comprises the steps: a) linking the nucleotide sequence (s) coding for the immunogenic peptide (s) to a vector capable of expressing said sequence, b) linking the sequence coding obtained in the previous stage to a vector capable of expressing said sequence, c) transforming a host capable of expressing said coding sequence of said immunogen, d) growing the transformed bacteria obtained in the previous stage in a suitable culture medium, e) isolate and purify the immunogen obtained in the previous stage.
  • the vector of step b) can be pET22b +.
  • the hosts are eukaryotic cells, bacteria, especially Escherichia coli BL26DE3, yeasts.
  • the culture medium of step d) can be an L-Broth medium.
  • Another form of preparation of the immunogen used in the multicomponent or monocomponent vaccines of the present invention comprises the steps of: a) growing the trypomastigote form of Trypanosoma cruzi in a suitable culture medium, b) obtaining the supernatant where the tripomastigotes form has grown by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, c) filtration of the obtained supernatant and passage through an affinity column containing immunoglobulins that recognize the repetitions of the carboxymethyl terminal sequence of the immunogen, d) elution increasing the pH to detach the protein.
  • the peptides used in the methods of the present invention can be obtained by chemical synthesis.
  • Another object of the present invention comprises a nucleic acid used in the procedures disclosed above because it essentially comprises a sequence encoding said immunogen.
  • T. cruzi More than 100 natural mammalian hosts are known for T. cruzi, and T. cruzi can be human beings from other animal hosts. Any mammalian host is immunized according to the present invention.
  • the application of the vaccine of this application includes men, domestic animals such as dogs and cats, rodents and wildlife animals.
  • the mammal object to be immunized is a dog, a cat, or a man.
  • the polynucleotide vaccine of the invention includes at least one, preferably at least two, nucleotides comprising the regions encoding one or more immunogenic polypeptides derived from T. cruzi. When it contains two or more regions that encode immunogenic polypeptides, the polynucleotide vaccine is a multicomponent vaccine. It is desirable to minimize the number of different immunogenic polypeptides comprising regions encoding nucleotide; however, despite the fact that a polynucleotide vaccine that generates the highest level of protection should encode 10 or more immunogenic polypeptides.
  • the polynucleotide vaccine contains DNA, RNA, a modified nucleic acid, or any combination thereof.
  • the vaccine comprises one or more expression or cloning vectors; preferably, the vaccine comprises a plurality of expression vectors capable of autonomous expression of a nucleotide comprising the region that encodes one or more immunogenic polypeptides or cytosine in the cell of a mammal.
  • An expression vector preferably includes a eukaryotic promoter sequence, preferably the nucleotide sequence of a strong eukaryotic promoter, operably linked to one or more coding regions.
  • a promoter is a DNA fragment that acts as a regulatory signal and binds to RNA polymerase in a cell to initiate the transcription of a descending coding sequence (3 ' direction); The transcription is the formation of an RNA chain according to the genetic information contained in DNA.
  • a promoter is operably linked to a nucleic acid sequence, or it can be used to control or regulate the transcription of that nucleic acid sequence.
  • the present invention is not limited to a specific eukaryotic promoter but extends to the wide known variety; preferably, the expression vector contains a CMV or RSV promoter.
  • the promoter used is preferably a constitutive promoter.
  • a vector useful in the present invention can be circular or linear, single or double braided and can be a plasmid, cosmid, or an epitome, but plasmids are preferred.
  • each nucleotide comprising the region if it encodes an immunogenic polypeptide or a cytokine
  • each nucleotide comprising the region in a separate vector; however, it is understood that one or more regions may be present in a single vector, and these regions are under the control of single or multiple promoters.
  • Nucleotide sequences encoding cytokines can be added to the polynucleotide vaccine, such as macrophage granulocytic colony stimulation factor (GM-CSF), interleukin 12 (IL-12) and co-stimulating molecules such as B7-1, B7-2, CD40.
  • GM-CSF macrophage granulocytic colony stimulation factor
  • IL-12 interleukin 12
  • co-stimulating molecules such as B7-1, B7-2, CD40.
  • the cytokines can be used in various combinations to fine tune the response of the animal's immune system, including the antibody and cytotoxic T lymphocyte responses, achieving a specific level response that allows to control or eliminate the infection of T. cruzi.
  • the polynucleotide vaccine may contain a fusion product containing an antigenic polypeptide and a molecule, such as CTLA-4, which directs the product of the fusion to cells with the presence of antigens within the host.
  • Plasmids and other delivery systems are prepared using techniques well known in the art of molecular biology.
  • the present invention may include methods for preparing and using the polynucleotide vaccine.
  • the polypeptide vaccine of the present invention includes at least one, preferably at least two, immunogenic polypeptides (recombinant or synthetic, or fractions thereof) of T. cruzi. As with the polynucleotide vaccine, it is desirable to minimize the number of different immunogenic polypeptides provided in the vaccine; however, it is nevertheless understood that a polypeptide vaccine that generates the highest level of protection contains IQ or more numerous immunogenic polypeptides. Because a response of the CD8 + T cells is not normally directed to the administration of a conventional vaccine of the protein subunit, the immunogenic polypeptides contained in the polypeptide vaccine preferably include one or more fused membrane transport sequences (MTS). to your N-terminal or C-terminal or both. A sequence of the membrane transport allows the transport of the immunogenic polypeptide through a lipid bilayer, allowing delivery to the inside of a mammalian cell.
  • MTS fused membrane transport sequences
  • Cytokines are proteins that regulate the function of the cells that produce them or other cell types. They are the agents responsible for intercellular communication, they induce the activation of specific membrane receptors, cell proliferation and differentiation functions, chemotaxis, growth and modulation of immunoglobulin secretion. They are produced mainly by lymphocytes and activated macrophages, although they can also be produced by polynuclear leukocytes, endothelial, epithelial and connective tissue cells. According to the cell that produces them, they are called lymphokines (lymphocytes), monochines (monocytes) or interleukins (hematopoietic cells). Its fundamental action is in the regulation of the mechanism of inflammation. There are pro-inflammatory and other anti-inflammatory cytokines
  • the polynucleotide vaccine includes at least one nucleotide comprising the region encoding a cytokine.
  • cytokines include nterleukin 12 (IL-12), granulocytic macrophage colony stimulation factor (GM-CSF), interleukin 6 (IL-6), interleukini ⁇ (IL-18), ⁇ -, ⁇ , ⁇ -interferon, , and chemokines.
  • cytokines include IL-12 and GM-CSF.
  • the polynucleotide and polypeptide vaccines of the present invention are easily formulated as pharmaceutical compositions for veterinary or human use.
  • the pharmaceutical composition optionally includes pharmaceutically acceptable excipients or diluents as those that were compatible with the genetic material.
  • pharmaceutically acceptable vehicle refers to a carrier that is acceptable in the sense of being compatible with the various components of a composition and that does not impair its therapeutic behavior. They are acceptable excipients, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, or the like and combinations of these.
  • the vaccine may contain small amounts of auxiliary substances such as wetting agents or emulsifying agents, buffering agents, salts, and / or adjuvants that improve the effectiveness of the stimulating composition of an immune response. Also included in the present invention are methods for preparing and using such pharmaceutical compositions.
  • the present invention comprises the administration of a polynucleotide vaccine and a polypeptide vaccine to a mammal in a serial protocol.
  • a plasmid-based DNA vaccine can be administered to a mammal to the primary immune system, followed by one or more administrations of a polypeptide vaccine or a viral vaccine (for example vector of the polypeptide of the vaccine that carries the genes that encode immunogenic polypeptides and, optionally, cytokines) to stimulate the mammalian immune system.
  • any dosage form for example polypeptide vaccine, plasmid vaccine, viral vector vaccine
  • any dosage form for example polypeptide vaccine, plasmid vaccine, viral vector vaccine
  • T lymphocyte is understood as the cells (white blood cells) responsible for coordinating the cell-mediated immune response, as well as cooperative functions to develop all forms of immune responses, including the antibody response by B lymphocytes.
  • T lymphocytes can be differentiated from B lymphocytes and killer cells by the presence of a special receptor on the surface of the membrane called T Cell Receptor (TCR) .
  • TCR T Cell Receptor
  • the T of the denomination comes from the thymus, which is the most important organ of the differentiation of these cells from stem cells of the lymphatic system.
  • CD4 + T cell means the T lymphocytes responsible for coordinating the cell-mediated immune response, as well as cooperative functions to develop all forms of immune responses, including the antibody response by B lymphocytes.
  • CD8 + T cell means cytotoxic T lymphocytes (CTL, for its acronym in English Citolytic T Lymphocyte) belong to the line of T lymphocytes responsible for the effector functions of cellular immunity. They neutralize cells infected by intracellular microorganisms, by means of a direct attack on the infected cells, injecting toxic enzymes causing their destruction. They are commonly called CD8 +, due to the presence of the CD8 membrane receptor.
  • CTLs are par excellence lysis cells when properly stimulated, especially by antigens expressed on MHC class I. They are so specific in their lethal functions that they are capable of destroying the target cell without affecting the uninfected neighboring cells.
  • the process of cell destruction mediated by CTL consists of:
  • apoptosis of the target cell including the mediation of cell death inducing molecules such as Fas and its ligand.
  • lymphocytes Due to the great toxicity of these lymphocytes, and to prevent the unnecessary risk of a continuous presence of circulation, inactive or virgin cytotoxic cells require two types of signals for activation:
  • CTLs that recognize the antigen in question are activated and retained in the area of infection and perform their effector functions. Those CTL that do not recognize the antigen involved, return to the circulation.
  • immunogenic polypeptide used in the vaccine against T. cruzi according to the present invention that which can be expressed by the extracellular stage of T. cruzi (trypomastigote), in the intracellular stage (amastigote), or during both stages of the life cycle.
  • the immunogenic polypeptide is expressed by a T. cruzi amastigote, preferably, it is expressed by the amastigote in the early stage of the infection, in approximately 24 hours of the initial infection.
  • a class of polypeptides that exemplify the immunogenic polypeptides according to the invention is from the family of trans-sialidase proteins, such as TSA-1 (T. cruzi Peru; D. Fouts et. Al. Mol. Biochem. Parasitol. 46: 189 - 200 (1991); GenBank.Acc. Number M58466), ASP-1 (T. cruzi Brazil; M. Santos et al. Mol. Biochem. Parasitol. 86: 1-11 (1997): GenBank.Acc. Number U74494)) and ASP-2 (T. cruzi Brazil; H. Low et al. Mol. Biochem. Parasitol. 88: 137-149 (1997); GenBank. Acc. Number U77951).
  • TSA-1 T. cruzi Peru; D. Fouts et. Al. Mol. Biochem. Parasitol. 46: 189 - 200 (1991); GenBank.Acc. Number M58466), ASP-1 (T.
  • the present invention constitutes a more complete multicomponent or monocomponent vaccine, which may constitute varieties of the same component of different T. Cruzi, especially those conserved portions and / or with the addition of different targets, for example, taking as a target a one or more trans-sialidases, fragelar proteins or cysteines proteases of one or more varieties of T. cruzi.
  • the vaccines known so far could not be developed without leaving a considerable portion of the affected population unprotected therefore the invention includes the combination of maximum immunogenicity against the variety of clinical expressions, (ie a "monoshot-continental" vaccine ").
  • Vaccines containing the genetic material are preferred over traditional vaccines due to the ease of construction and manufacture of the vectors, the potential for the modification of the sequences by mutagenesis directed to improve the antigenic potency of the isolated epitopes or to suppress epitopes that can trigger unwanted response, in the case of DNA vaccines, DNA stability, the absence of the dangers associated with active and attenuated vaccines, their ability to induce humoral and cell-transmitted immunity and, in particular, responses of CD8 + T cells, and the persistence of immune responses.
  • results similar to those mentioned can be obtained when instead of using the intravenous route for immunization, other immunization routes are used such as intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or any other that generates an antibody response in the immunized host. It is also possible to obtain similar results when some of the known adjuvants are used to immunize, such as aluminum oxide or others that do not destroy the enzyme, as detailed below.
  • An adjuvant is an oily, aqueous or other structure substance that injected together with the immunogen, in this case a recombinant protein such as trans-sialidase / SAPA, contributes to increase its immunogenicity, that is, increases the immune system response as to the production of antibodies or the cellular response.
  • Cellular response is a type of immune system response) in which the proliferation is essentially of cells that contribute to controlling an infectious agent. Another result that was obtained as a result of these experiments is that only one response is obtained against the trans-sialidase that inhibits its activity when this enzyme is used as an immunogen in its active form, that is, with a conformation that maintains its enzymatic activity .
  • Another result that was obtained as a result of these experiments is that only one response is obtained against the trans-sialidase that inhibits its activity when this enzyme is used as an immunogen in its active form, that is, with a conformation that maintains its enzymatic activity .
  • Table 2 shows that when the adjuvant used to immunize mice is aluminum oxide, which does not alter the enzymatic activity of the transialidase, antibodies are generated that inhibit it. However, if Freund is used as an adjuvant, which destroys the enzymatic activity of the transialidase, antibodies that inhibit the trans-sialidase are not generated in the mouse.
  • the inactivation of the trans-sialidase with heat at 80-C for 3 minutes so that the protein does not maintain its enzymatic activity preventing it from stimulating the formation of neutralizing antibodies results similar to those mentioned can be obtained when instead of using the intravenous route for immunization, other immunization routes are used such as intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or any other that generates an antibody response in the immunized host. It is also possible to obtain similar results when some of the known adjuvants are used to immunize, such as aluminum oxide or others that do not destroy the enzyme, as detailed.
  • An adjuvant is an oily, aqueous or other structure substance that injected together with the immunogen, in this case a recombinant protein such as transialidase / SAPA, contributes to increase its immunogenicity, that is, increases the immune system response as to the production of antibodies or the cellular response.
  • a recombinant protein such as transialidase / SAPA
  • Cellular response is a type of immune system response in which the proliferation is essentially of cells that contribute to controlling an infectious agent.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

El objeto principal de la presente invención es una vacuna contra la enfermedad de Chagas, capaz de estimular la respuesta inmune contra el factor de virulencia trans-sialidasa del parásito Trvpanosoma cruzi, caracterizada dicha vacuna porque comprende una vacuna multicomponente para la enfermedad del Chagas {tripanosomiasis americana) caracterizada porque comprende: (a) una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos, y (b) uno o mas polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénicos, ambas porciones para los derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos) donde la administración de dicha vacuna protege de la infección del parásito, lo elimina o atenúa las consecuencias clínicas de dicha infección. Otro objeto de la presente invención es una vacuna monocom ponente para la enfermedad del Chagas que comprende al menos un componente seleccionado entre una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos y un grupo de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénico derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos), donde la porción inmunógenica o el grupo de polinucleótido estimula una respuesta de anticuerpos, de células T CD4+ sesgadas Th 1 o T CD8+ contra el Tripanosoma cruzi. También se incluyen en la presente invención las composiciones farmacéuticas que contienen dichas vacunas multicomponentes y monocomponentes, procedimientos para la obtención de la porción inmunogena de dichas vacunas y el acido nucleico utilizado en dicho procedimiento.

Description

SOLICITUD DE PATENTE DE INVENCIÓN
"Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra Ia enfermedad de Chagas, composiciones farmacéuticas que las contienen, procedimiento para Ia obtención del inmunógeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento"
El objetivo técnico de Ia presente invención es favorecer el incremento en Ia respuesta inmune frente a antígenos protozoarios o bacterianos, especialmente aumentar Ia inducción de respuesta T citotóxica esencial contra estos antígenos. La presente invención conducirá al desarrollo de formulaciones de vacunas terapéuticas o profilácticas para Ia enfermedad de Chagas.
ESTADO DEL ARTE
El Trypanosoma cruzi es un protozoario del orden kinetoplastidia, familia Tryponosomatidae, caracterizado por Ia presencia de un solo flagelo y una sola mitocondria, dentro de Ia cuál su genoma se encuentra ordenado en una compleja y compacta red denominada kinetoplasto. Es un parásito intracelular con un ciclo de vida que involucra vertebrados e invertebrados.
Presenta tres formas distintas: Amastigote: esférico u ovalado, es Ia forma reproductiva en el interior de las células mamíferas, Epimastigote: alargado y con el kinetoplasto localizado anteriormente al núcleo, es Ia forma reproductiva en el tracto digestivo de los invertebrados y en medios de cultivo y Tripomastigote: también alargado, pero con el kinetoplasto localizado posteriormente al núcleo. Se encuentra en Ia sangre de los mamíferos y es Ia forma infectante de ellos. Esta forma no se divide.
El T. cruzi se divide en dos grandes grupos: T. cruzi \ y T. cruzi W. Este último a su vez se divide en cinco grupos menores: T. cruz/'Ua, Hb, Mc, Md y He.
El agente etiológico de Ia enfermedad de Chagas también denominada tripanosomiasis americana, es un parásito intracelular protozoario , Tripanosoma cruzi. Se transmite por medio de un insecto hematófago, Tríatoma infestans, el cual transmite el parásito cuando defeca sobre Ia picadura que él mismo ha realizado para alimentarse. En los mamíferos los ciclos del T. cruzi se encuentra entre un estadio del trypomastigote que circula en Ia sangre y el estadio del amastigote que replica en el citoplasma de las células huésped infectadas (especialmente en los músculos). La enfermedad de Chagas se encuentra predominante en casi todos los países latinoamericanos que incluyen también México y América Central, en donde aproximadamente 18 millones de personas son infectadas con el T. cruzi y al menos 50.000 niños y adultos mueren cada año por Ia enfermedad de Chagas crónica debido a Ia ausencia de tratamientos eficaces.
Los triatominos redúvidos, conocidos como vinchuca (desde Ecuador hasta Ia Patagonia), chipo (en Venezuela), pito (en Colombia) y barbeiro (en Brasil), son insectos hematófagos, es decir chupadores de sangre, que viven en las rendijas, agujeros y espacios desaseados de viviendas o bodegas en las regiones de América del Sur y América Central. Éstos se infectan después de
i picar a un animal o persona que ya padece Ia enfermedad. En general, Ia infección se propaga a los seres humanos cuando un insecto infectado deposita heces en Ia piel mientras que Ia persona está durmiendo en Ia noche.
La persona a menudo se frota las picaduras, introduciendo accidentalmente las heces en Ia herida de Ia picadura, un corte abierto, los ojos o Ia boca. Los animales pueden infectarse de Ia misma forma y también contraen Ia enfermedad comiendo un insecto infectado. Las personas infectadas pueden no presentar síntomas de Ia enfermedad hasta 10 o 15 años luego de haberse infectado, por Io que su detección se hace más difícil.
Más de 90 millones se encuentran en riesgo de infección en las áreas endémicas. Además, 2-5% de los fetos pueden ser infectados por vía materna en dichas áreas endémicas que pueden provocar abortos o futuros nacimientos con Ia enfermedad de Chagas congénita.
El rédito en términos de perdida de productividad debido a Ia enfermedad y los costos médicos tienen un efecto abrumador en el crecimiento económico de estos países. El riesgo de transmisión del T. cruzi para individuos no infectados a través de trasplantes de órganos y transfusiones de Ia sangre de donantes inmigrantes infectados es muy elevado.
Los tratamientos quimioterapéuticos han resultado parcialmente satisfactorios en el control de Ia infección de T. cruzi y enfermedad de Chagas. Sin embargo, Ia elevada toxicidad de los fármacos y Ia escasa eficacia terapéutica disponible han terminado por limitar Ia utilidad de Ia quimioterapia para el tratamiento de enfermos agudos y crónicos. Además, Ia terapia del fármaco reduce Ia severidad de Ia enfermedad en individuos crónico infectados, pero no revierte el daño provocado por los parásitos.
Las vacunas para Ia prevención o tratamiento de Ia infección del T. cruzi prácticamente no existen. Las vacunas tradicionales constituidas de parásitos inactivados por calor, o fracciones subcelulares del T. cruzi proporciona un grado de protección para infecciones con T. cruzi (M. Basombrio, Exp. Parasitol. 71:1 - 8 (1990); A. Ruiz y otros., Mol. Biochem. Parasitol, 39:117 - 125. (1990)). Sin embargo, estas vacunas fallan al proporcionar un nivel protector de inmunidad, probablemente debida a Ia pérdida de epitopes importantes durante Ia inactivación y/o al fallo de los antígenos para ingresar en Ia ruta de MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) clase I de Ia elaboración y Ia presentación del antígeno y de provocar las respuestas ¡nmunitarias transmitidas por células (J. Monaco. Immunol. Today 13:173 - 179 (1992)). Las vacunas atenuadas activas son capaces de ingresar en Ia ruta de MHC clase I, y pudieron provocar respuestas inmunes protectoras. Sin embargo, el peligro de Ia reversión de parásitos atenuados a las cepas virulentas si Ia atenuación no ha sido completada hace de estas vacunas que resulten impracticables. Una vacuna de Ia DNA que contenía el gen que codificaba Ia trans-sialiadasa ha demostrado proporcionar una protección profiláctica contra infecciones del T. cruzi en los ratones (F. Costa et al, Vaccine 16:768 - 774 (1998)), pero no ha demostrado Ia prevención o que provoque una reversión de Ia enfermedad o estimular un respuesta de Ia célula T citotóxicas animales. Además, Ia respuesta inmune celular y humoral específica en los ratones BALB/c inmunizados con una biblioteca de expresión genomica del T. el cruzi ha sido observada (E. Alberti et al., Vaccine 16:608 - 612 (1998)).
La trans-sialidasa es una enzima del Trvpanosoma cruzi (agente causal de Ia enfermedad de Chagas) que es requerida por este parásito para invadir células del huésped humano. Dado que si el parásito no invade células, no sobrevive en el humano, Ia trans-sialidasa parece ser un blanco ideal para el ataque inmunológico, esto es, desarrollo de una vacuna. Por Io tanto, Io que se busca es una vacuna que cuando se Ia utilice para inmunizar, produzca como respuesta anticuerpos que específicamente inhiban a Ia trans-sialidasa.
Hay varias trans-sialidasas producidas en el tripanosoma. Algunas tienen solamente una región que es Ia requerida para Ia actividad enzimática (de trans-sialidación que es Ia transferencia de un azúcar denominado ácido siálico). Otras tienen además de esta región, un segundo dominio que no tiene nada que ver con Ia trans-sialidación, pero que es muy ¡nmunógenica (genera anticuerpos en el huésped). Esta segunda región Ia denominamos SAPA (shed-acute-phase antigen que significa antígeno liberado de fase aguda) y está formada por u- nidades repetitivas de aminoácidos.
Han sido identificados los genes (ácidos nucleicos, ADN, formados por unidades denominadas nucleótidos o bases, una región del ADN que codifica una proteína como en este caso Ia trans-sialidasa, se denomina gen) que codifican Ia región con actividad enzimática y Ia región SAPA.
Una de las moléculas del T. cruzi descriptas como esencial para Ia invasión de células huésped es el ácido siálico (Schenkman S. Et al. CeII 65,1117- 1126,1991; Schenkman, S. et al. Ann.Rev.Microbiol. 48, 499-523, 1994; Schenkman, S. and Eichinger, D. Parasitology Today 9, 218-222, 1993). Dado que el tripanosoma es incapaz de sintetizar ácido siálico (Schauer, R. y et al. Z. Physiol. Chem. 364: 1053-1057, 1983), Io debe adquirir de moléculas que contengan ácido siálico presentes en el medio. Este proceso Io realiza utilizando una enzima única denominada trans-sialidasa (Previato, J. O. et. al., Mol. Biochem. Parasitol. 16:8596, 1985 Y Zingales, B., et al., Mol. Biochem.Parasitol. 26, 135-144, 1987). La trans-sialidasa es capaz de transferir ácido siálico de moléculas sialidadas presentes en el medio, tal como algunas de las que circulan en Ia sangre del huésped infectado, a moléculas presentes en Ia superficie del tripanosoma.
Las moléculas del tripanosoma pasibles de ser sialidadas, son principalmente aquellas denominadas mucinas (Ruiz, R. C, et al. Parasite Immunoi. 15,121-12, 1993; M. B. Reyes, et al. Gene 140, 139-140, 1994; J. M. Di Noia et al. J. Biol. Chem. 270, 24146-24149, 1995; J. M. Di Noia, et al. J. Biol. Chem. 271, 32078- 32083, 1996). Una vez sialidadas, las mucinas son las que interaccionan con Ia superficie de Ia célula humana a ser invadida, posibilitándose de esta manera el proceso de infección (Ruiz, R. C, et al. Parasite Immunoi. 15, 121-12, 1993). Otros grupos han demostrado que si el parásito no expresa trans-sialidasa, no puede infectar células como Io hacen los parásitos que sí poseen trans- sialidasa (Pereira et al., Infect. Immum. 64, 38843892, 1996). Por Io tanto, Ia inmunización con trans-sialidasa de forma tal que genere anticuerpos que inhiban la enzima, constituye una herramienta utilizable en Ia obtención de una vacuna contra este parásito. Recientemente se ha demostrado que Ia respuesta inmune contra Ia tran- sialidasa es un factor que contribuye a prevenir Ia muerte del huésped causada por el parásito ((Chuenkova, M. y Pereira M.E.A., J. Exp. Med. 181, 1693-1703, 1995).
El Trypanosoma cruzi tiene dos tipos de trans-sialidasas. Una de ellas contiene solamente los aminoácidos requeridos para Ia actividad de trans-sialidasa (Briones, M.R.S. et al. Mol.Biochem. Parasitol. 70: 9-17, 1995) y fue utilizada en Ia solicitud WO 9318787 con Ia finalidad de sintetizar carbohidratos dada su actividad enzimática y propuesta secundariamente como inmunógeno en Ia misma solicitud patente. Un segundo grupo de trans-sialidasas contiene, a- demás de estas secuencias, una serie de repeticiones de aminoácidos en Ia región carboxilo terminal denominada SAPA (C. Ibáñez, et al. Mol. Biochem. Parasitol. 30: 27-34, 1988; J. L. Affranchino, et al. Mol. Biochem. Parasitol 34: 221228, 1989; Cazzulo, JJ. and Frasch.A.C.C. FASEB J. 6, 3259326, 1992). Esta segunda región es altamente antigénica durante una infección natural en humanos (M. B. Reyes, et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:2846-2850, 1990).
La investigación más abundante para las vacunas se ha centrado en intentos de desarrollar vacunas profilácticas de Ia proteína contra Ia infección del T. cruzi, pero se han cumplido con poco éxito. El desarrollo de las vacunas de Ia subunidades integradas por los antígenos definidos que son capaces de inducir fuertes respuestas humorales y de células T de tipo 1 y de reducir Ia carga del parásito, ha quedado impedido por el desconocimiento de Ia biología de los tres estadios desarrollos del T. cruzi, Ia ausencia de información suficiente de Ia secuencia en los genes expresados en los estadios de contagio e intracelulares, y el punto de vista científico que Ia enfermedad crónica no esta asociado con Ia infección parásita persistente pero es el resultado de una respuesta autoinmune parásito-inducida.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
El objeto principal de Ia presente invención es una vacuna contra Ia enfermedad de Chagas, capaz de estimular Ia respuesta inmune contra el factor de virulencia trans-sialidasa del parásito Trypanosoma cruzi, caracterizada dicha vacuna porque comprende una vacuna multicomponente para Ia enfermedad del Chagas {tripanosomiasis americana) caracterizada porque comprende: (a) una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos, y (b) uno o mas polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénicos, ambas porciones para los derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos) donde Ia administración de dicha vacuna protege de Ia infección del parásito, Io elimina o atenúa las consecuencias clínicas de dicha infección.
Otro objeto de Ia presente invención es una vacuna monocomponente para Ia enfermedad del Chagas que comprende al menos un componente seleccionado entre una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos y un grupo de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénico derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos), donde Ia porción inmunógenica o el grupo de polinucleótido estimula una respuesta de anticuerpos, de células T CD4+ sesgadas Th1 o T CD8+ contra el Tripanosoma cruzi.
También se incluyen en Ia presente invención las composiciones farmacéuticas que contienen dichas vacunas multicomponentes y monocomponentes, procedimientos para Ia obtención de Ia porción ¡nmunogena de dichas vacunas y el acido nucleico utilizado en dicho procedimiento.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Secuencia de nudeótidos de Ia región del gen que codifica Ia proteína del Tripanosoma cruzi que posee actividad de trans-sial idasa. Las letras representan las cuatro bases (moléculas) que constituyen el ADN (ácido desoxiribonudeico). A: adenina, T: timina, C: citosina, G: guanina. Cada tres bases (tripiete de bases) se codifica un aminoácido (unidad molecular que forma Ia proteína) que en este caso es Ia trans-sial idasa. El ATG indicado en minúscula es el primer aminoácido de Ia trans-sialidasa (el aminoácido metionina). El tripiete TGA último es el utilizado por Ia célula para indicar donde se termina Ia proteína (tripiete de terminación). Corresponde a Ia región 1 de Ia figura 6.
Figura 2: Secuencia de aminoácidos de Ia región codificada en el gen que se muestra en Ia Figura 1 y que corresponde a Ia parte de Ia proteína que posee actividad de trans-sialidasa. Cada letra indica un aminoácido de acuerdo al código universalmente aceptado. Corresponde a Ia región 1 de Ia figura 6.
Figura 3: Secuencia de bases que codifica Ia región de unidades repetitivas de aminoácidos denominada SAPA. Resto de las indicaciones igual a Figura 1. Corresponde a Ia región 2 de Ia figura 6.
Figura 4: Secuencia de aminoácidos codificada de acuerdo a Ia secuencia de bases indicada en Ia Figura 3 y que corresponde a Ia proteína SAPA. Corresponde a Ia región 2 de Ia figura 6.
Figura 5: Secuencia de nudeótidos (línea superior) y de aminoácidos (línea inferior) correspondiente al gen y a Ia proteína, respectivamente, resultante de Ia unión de Ia trans-sialidasa y SAPA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, Ia presente invención proporciona una vacuna que sea eficaz para tratar o para evitar Ia infección de un mamífero por derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos). En una forma de realización particularmente preferida, Ia vacuna es eficaz contra Ia infección y/o enfermedad provocadas por el T. cruzi. La vacuna multicomponente de Ia presente invención es para Ia enfermedad del Chagas {tripanosomiasis americana) comprendiendo: (a) una porción ¡nmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos, y (b) uno o mas polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénicos, ambas porciones para los derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos),y donde Ia administración de dicha vacuna protege de Ia infección del parásito, Io elimina o atenúa las consecuencias clínicas de dicha infección. Una vacuna del polinucleótido contiene unos o más polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénicos derivados del T. Cruzi. En forma análoga, una vacuna del polipéptido contiene unos o más polipéptidos inmunogénicos derivados del T. cruzi.
Otro objeto de Ia presente invención es una vacuna monocomponente para Ia enfermedad del Chagas que comprende al menos un componente seleccionado entre una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos y un grupo de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénico derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos), donde Ia porción inmunógenica o el grupo de polinucleótido estimula una respuesta de anticuerpos, de células T CD4+ sesgadas Th1 o T CD8+ contra el Tripanosoma cruzi.
La "porción inmunógenica" de Ia vacuna puede comprender uno o mas polipéptidos cuya estructura incluye una región C-terminal que consta de por Io menos dos unidades repetitivas de amino ácidos, poseyendo cada una de dichas unidades repetitivas por Io menos un 60% de homología con Ia siguiente secuencia de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS y fusionada a dicha región C- terminal un polipéptido con actividad trans-sialidasa. Puede comprender además un adyuvante que no destruye Ia actividad enzimática trans-sialidasa de Ia porción inmunógeno, preferentemente oxido de aluminio. Dicha porción pueden comprender entre 10 y 16 unidades repetitivas en Ia región C-terminal, preferentemente 13 unidades.
Dicha porción inmunógenica puede ser obtenida de tripomastigotes de los parásitos Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos) o de amastigotes de los parásitos Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
La vacuna de Ia presente invención puede ser una biomoiécuia recombinante formada por Ia fusión de dicha región que consta de unidades repetitivas de aminoácidos y dicho polipéptido con actividad trans-sialidasa y/o de polipéptido con actividad cisteino proteinasa, y/o de Ia proteína parafragelar Rod (PFR).
La vacuna multicomponente de Ia presente invención estimula preferiblemente una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmune transmitida por células, o ambas respuestas, en el mamífero a las cuales será administrado. Preferiblemente Ia vacuna estimula una respuesta de las células T CD4 + sesgado Th1 o una respuesta de Ia células T CD8+; preferentemente, en el caso de una vacuna del componente único, Ia vacuna estimula una respuesta de anticuerpos, una respuesta de las células T CD4 + sesgado Th1 o una respuesta de Ia células T CD8+. Una forma de realización particularmente preferida de Ia vacuna de Ia presente invención incluye un nucleótido que comprende a las regiones que codifican una citocina, para proporcionar Ia estimulación adicional al sistema inmune del mamífero. Una forma de realización particularmente preferido de Ia vacuna del polipéptido de Ia invención incluye un polipéptido inmunogénico que contenga una secuencia de desplazamiento de Ia membrana, para facilitar Ia introducción del polipéptido en Ia célula de mamífero y Ia estimulación subsiguiente de Ia respuesta inmune transmitida por células.
El inmunógeno de Ia presente invención puede ser seleccionado entre las siguientes proteínas TSA-1 , ASP-1 , ASP-2, hemolisina y Lyt1. La vacuna multicomponente de Ia presente invención puede comprender una pluralidad de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polinucleótidos inmunogénicos derivados de los T. Cruzi (de un T. Cruzi y/o de una región conservada común a varios de ellos) y al menos uno o mas polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a citoquinas, que puede seleccionarse entre interleuquina 12 (IL-12), factor de estimulación de colonias macrófago granulocíticas (GM-CSF), interleuquina 6 (IL-6), interleuquinaiδ (IL-18), α-,β,γ- interferón, , y quimocinas, son especialmente preferidas las citoquinas IL-12 y GM-CSF.
Las composiciones farmacéuticas que contenían los polipéptidos recombinantes o sintéticos o fracciones de ellos de Ia porción inmunógenica y los polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénicos derivados de los T. Cruzi, junto con un vehículo farmacéutico también son objeto de Ia presente invención.
En otro aspecto, Ia presente invención proporciona una vacuna de varios componentes de polinucleótido se prepara insertando dos o mas nucleótidos que comprenden las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénico derivado del T. Cruzi en dos o mas vectores de polinucleótido, después combinando a los vectores del polinucleótido para rendir una vacuna del polinucleótido.
Alternativamente, una vacuna de Ia presente invención puede ser administrada en forma profilácticamente a un mamífero antes de Ia infección por el T. Cruzi. En una forma de realización preferida, Ia administración de Ia vacuna debe ser eficaz para evitar Ia infección subsiguiente del mamífero por el T. Cruzi. En otra forma de realización, Ia administración de Ia vacuna es eficaz para evitar el desarrollo de Ia enfermedad debilitante crónica en un mamífero después de Ia infección subsiguiente por el T. cruzi. En otra forma de realización, administración de Ia vacuna es eficaz para evitar Ia muerte del mamífero después de Ia infección subsiguiente por el T. cruzi.
En otro aspecto, el invento incluye un procedimiento para identificar los polipéptidos inmunogénicos del T. Cruzi de una genoteca del T. cruzi, para ser utilizados en una vacuna del polinucleótido. En una forma de realización, el procedimiento utiliza Ia inmunización de Ia biblioteca de expresión (ELI) en ratones para identificar los polipéptidos del T. Cruzi que provocan una respuesta inmunitaria en un mamífero eficaz para evitar, detener o demorar Ia progresión de Ia enfermedad en el mamífero que ha sido infectado por el T. Cruzi. Preferiblemente, el procedimiento es utilizado para identificar los polipéptidos inmunogénicos derivados del T. cruzi, y de los ratones BALB/c o B6 que han sido inmunizados.
En otra forma de realización, el procedimiento implica:
(a) preparar el microarray de un DNA que comprende un marco de lectura abierto de los genes del T. cruzi;
(b) preparar una primera probeta que comprende un trimastigote marcado Cy3 - derivado del cDNA del T. cruzi;
(c) preparar una segunda probeta que comprende un amastigote marcado Cy5- derivado del cDNA;
(d) cohibridizar las primeras y segundas probetas al microarray para identificar por Io menos un gen que exprese el T. cruzi durante el estadio intracelular del ciclo infeccioso de amastigote, donde dicho gen codifica al candidato inmunogénico. polipéptido del T. cruzi; y
(e) inmunizar ratones con el gen para determinar si el gen codifica un polipéptido del cruzi que provoca una respuesta inmunitaria que comprende en un mamífero eficaz para evitar, detener o retar Ia progresión de Ia enfermedad en el mamífero que ha sido infectado por el T. cruzi.
Una forma de preparación del inmunógeno utilizado en las vacunas multicomponente o monocomponente de Ia presente invención comprende las etapas: a) ligar Ia o las secuencias nucleotídicas codificantes para el ó los péptidos inmunogénicos a un vector capaz de expresar dicha secuencia, b) ligar Ia secuencia codificante obtenida en Ia etapa anterior a un vector capaz de expresar dicha secuencia, c) transformar un huésped capaz de expresar dicha secuencia codificante de dicho inmunógeno, d) crecer las bacterias transformadas obtenidas en Ia etapa anterior en un medio de cultivo adecuado, e) aislar y purificar el inmunógeno obtenido en Ia etapa anterior. El vector del paso b) puede ser pET22b+. Los huéspedes son células eucariontes, bacterias, especialmente Escherichia coli BL26DE3, levaduras. El medio de cultivo del paso d) puede ser un medio L-Broth. Otra forma de preparación del inmunógeno utilizado en las vacunas multicomponente o monocomponente de Ia presente invención comprende las etapas de: a) crecer Ia forma tripomastigote de Trypanosoma cruzi en un medio de cultivo adecuado, b) obtención del sobrenadante donde se han crecido Ia forma tripomastigotes por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos, c) filtración del sobrenadante obtenido y pasaje por una columna de afinidad que contiene inmunoglobulinas que reconocen las repeticiones de Ia secuencia carboximetil terminal del inmunógeno, d) elución aumentando el pH para despegar Ia pro teína.
Los péptidos utilizados en los procedimientos de Ia presente invención pueden ser obtenidos por síntesis química.
Otro objeto de Ia presente invención comprende un acido nucleico utilizado en los procedimientos antes revelados porque comprende esencialmente un secuencia que codifica dicho inmunógeno.
Se conocen mas de 100 huéspedes de mamíferos naturales para el T. cruzi, y el T. cruzi puede ser a los seres humanos proviniendo de otros huésped animal. Cualquier huésped mamífero queda inmunizado de acuerdo con a Ia presente invención. La aplicación de Ia vacuna de esta solicitud incluyen hombres, animales domésticos tales como perros y gatos, roedores y animales de Ia fauna. Preferiblemente, el mamífero objeto para ser inmunizado es un perro, un gato, o un hombre.
Vacuna del polinucleótido
La vacuna del polinucleótido de Ia invención incluye por Io menos uno, preferiblemente al menos dos, nucleótidos que comprenden a las regiones que codifican uno o mas polipéptidos inmunogénico derivado de los T. cruzi. Cuando contiene dos o mas regiones que codifican polipéptidos inmunogénicos, Ia vacuna del polinucleótido es una vacuna multicomponente. Es deseable para minimizar el número de diferentes polipéptidos inmunogénicos que comprenden regiones que codifican nucleótido; sin embargo, no obstante considerado que una vacuna del polinucleótido que genera el más alto nivel de protección debería codificar 10 o mas polipéptidos inmunogénicos. La vacuna del polinucleótido contiene DNA, RNA, un ácido nucleico modificado, o cualquier combinación de estos. Preferiblemente, Ia vacuna comprende uno o más vectores de expresión o clonación; preferiblemente, Ia vacuna comprende una pluralidad de vectores de expresión capaces de Ia expresión autónoma de un nucleótido que comprende Ia región que codifica a uno o mas polipéptidos o citosina inmunogénicos en Ia célula de un mamífero. Un vector de expresión incluye preferiblemente una secuencia de promotor eucariota, preferiblemente Ia secuencia de nucleótidos de un fuerte promotor eucariota, operativamente unido a una o más regiones que codifican. Un promotor es un fragmento de ADN que actúa como señal reguladora y se une a Ia RNA polimerasa en una célula para iniciar Ia transcripción de una secuencia de codificación descendente (dirección 3'); Ia transcripción es Ia formación de una cadena del RNA de acuerdo con Ia información genética contenida en DNA. Un promotor esta operablemente unido a una secuencia de ácido nucleico, o puede ser utilizado para controlar o regular Ia transcripción de esa secuencia de ácido nucleico. La presente invención no esta limitada a un promotor eucariota concreto sino que se extiende a Ia amplia variedad conocida; preferiblemente, el vector de expresión contiene a promotor de CMV o de RSV. El promotor utilizado queda preferiblemente a promotor constitutivo. Un vector útil en el Ia presente invención puede ser circular o lineal, trenzado simple o doble y puede ser un plásmido, cosmido, o un epitoma, pero son preferidos los plásmidos. En una forma de realización preferida, cada nucleótido que comprende Ia región (si codifica un polipéptido inmunogénico o una citocina) en un vector separado; sin embargo, queda entendido que uno o más regiones pueden estar presentes en un solo vector, y éstas regiones quedan bajo control de promotores simples o múltiples.
Se pueden adicionar a Ia vacuna del polinucleótido secuencias de nucleótidos que codifican citocinas, tales como factor de estimulación de colonias granulocíticas del macrófago (GM-CSF), interleuquina 12 (IL-12) y las moléculas co-estimulantes tales como B7-1 , B7-2, CD40. Las citocinas pueden ser utilizadas en varias combinaciones para sintonizar finamente Ia respuesta del sistema inmune del animal, incluyendo el anticuerpo y respuestas citotóxicas del linfocito de T, logrando una respuesta de nivel especifico que permita controlar o eliminar Ia infección del T. cruzi. La vacuna de polinucleótido puede contener un producto de fusionado conteniendo un polipéptido antigénico y una molécula, tal como CTLA-4, que dirige el producto de Ia fusión a las células con presencia de antígenos dentro del huésped. Los plásmidos y otros sistemas de entrega se preparan utilizando las técnicas bien conocidas en el arte de Ia biología molecular. La presente invención puede incluir procedimientos para preparar y utilizar Ia vacuna del polinucleótido.
Vacuna de polipéptido
La vacuna del polipéptido de Ia presente invención incluye por Io menos uno, preferiblemente por Io menos dos, polipéptidos inmunogénicos (recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos) del T. cruzi. Como con Ia vacuna del polinucleótido, es deseable minimizar el número de diferentes polipéptidos inmunogénicos proveídos en Ia vacuna; sin embargo, queda no obstante comprendido que una vacuna del polipéptido que genera el más alto nivel de protección contenga IQ o polipéptidos inmunogénicos más numerosos. Porque una respuesta de Ia células T CD8+ no esta normalmente dirigida a Ia administración de una vacuna convencional de Ia subunidad de Ia proteína, los polipéptidos inmunogénicos contenidos en Ia vacuna del polipéptido incluyen preferiblemente unas o más secuencias del transporte de Ia membrana (MTS) fusionadas a sus N-terminal o C-terminal o ambos. Una secuencia del transporte de Ia membrana permite el transporte del polipéptido inmunogénico a través de una bicapa lipídica, permitiendo Ia entrega a Ia parte interior de una célula de mamífero.
Citoquinas
Las citoquinas son proteínas que regulan Ia función de las células que las producen u otros tipos celulares. Son los agentes responsables de Ia comunicación intercelular, inducen Ia activación de receptores específicos de membrana, funciones de proliferación y diferenciación celular, quimiotaxis, crecimiento y modulación de Ia secreción de inmunoglobulinas. Son producidas, fundamentalmente, por los linfocitos y los macrófagos activados, aunque también pueden ser producidas por leucocitos polinucleares, células endoteliales, epiteliales y del tejido conjuntivo. Según Ia célula que las produzca se denominan linfocinas (linfocito), monocinas (monocitos) o interleucinas (células hematopoyéticas). Su acción fundamental es en Ia regulación del mecanismo de Ia inflamación. Hay citocinas pro-inflamatorias y otras antiinflamatorias
Preferiblemente, Ia vacuna de polinucleótido incluye por Io menos un nucleótido que comprende Ia región que codifica una citocina. Las citocinas preferidas incluyen ¡nterleuquina 12 (IL-12), factor de estimulación de colonias macrófago granulocíticas (GM-CSF), interleuquina 6 (IL-6), interleuquinaiδ (IL-18), α-,β,γ- interferón, , y quimocinas. Especialmente las citocinas preferidas incluyen IL-12 y GM-CSF.
Composiciones farmacéuticas
Las vacunas de polinucleótido y de polipéptido de Ia presente invención son formuladas fácilmente como composiciones farmacéuticas para el uso veterinario o humano. La composición farmacéutica incluye opcionalmente los excipientes o los diluentes farmacéutico aceptables como aquellos que fueran compatibles con el material genético. La denominación "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un carrier que es aceptable en el sentido de ser compatible con los distintos componentes de una composición y que no perjudique su comportamiento terapéutico. Son excipientes aceptables, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de estos. Además, si es deseado, Ia vacuna puede contener cantidades pequeñas de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o agentes emulsionantes, los agentes buffer, las sales, y/o los coadyuvantes que mejoran Ia efectividad de Ia composición estimulante de una respuesta inmune. También se incluyen en Ia presente invención procedimientos para preparar y de utilizar tales composiciones farmacéuticas.
Administración de una combinación de vacuna del polinucleótido y de vacuna del polipéptido
La presente invención comprende Ia administración de una vacuna del polinucleótido y de una vacuna del polipéptido a un mamífero en un protocolo serial. Por ejemplo, una vacuna plásmido-basada DNA puede ser administrada a un mamífero al sistema inmune primario, seguido por unas o más administraciones de una vacuna polipeptídica o de una vacuna viral (por ejemplo vector del polipéptido de Ia vacuna que lleva a los genes que codifican los polipéptidos inmunogénicos y, opcionalmente, las citocinas) para estimular el sistema inmune del mamífero. El orden de Ia administración de los diferentes tipos de vacunas, y Ia naturaleza de las vacunas administradas en cualquier forma de dosificación (por ejemplo vacuna del polipéptido, vacuna del plásmido, vacuna del vector viral) pueden ser fácilmente determinadas por un experto en el área para provocar Ia respuesta inmunitaria mas eficaz en el mamífero.
DEFINICIÓN DE ALGUNOS TÉRMINOS
Se entiende como "enfermedad de Chagag a diferentes expresiones clínicas en pacientes parasitados por variedades de T. Cruzi, a su vez relacionada con el impacto inmunológico crónico en diversos tejidos blancos. Por consiguiente, las vacunas hasta ahora conocidas, ya sean de mono o multicomponentes de sustancias frecuentes de algún tipo de T. Cruzi, son fórmulas parciales como para encarar un tratamiento que sea efectivo en todas las zonas geográficas donde se desarrolla Ia enfermedad, y contra todas las formas intra o extracelulares del parásito. Además Ia inmugenicidad de tales componentes comunes puede variar en el tiempo y/o con el cambio del estado de salud del huésped, por Io que no garantizan una protección universal y duradera.
Se entiende por "linfocito T a las células (glóbulos blancos) responsables de coordinar Ia respuesta inmune mediada por células, así como de funciones de cooperación para que se desarrollen todas las formas de respuestas inmunes, incluida Ia respuesta de anticuerpos por los linfocitos B. Los linfocitos T pueden ser diferenciados de los linfocitos B y de las células asesinas por Ia presencia de un receptor especial en Ia superficie de Ia membrana llamado Receptor de las Células T (TCR). La T de Ia denominación proviene del timo, que es el órgano más importante de Ia diferenciación de estas células a partir de células madre del sistema linfático.
Se entiende por "célula T CD4+" a los linfocitos T responsables de coordinar Ia respuesta inmune mediada por células, así como de funciones de cooperación para que se desarrollen todas las formas de respuestas inmunes, incluida Ia respuesta de anticuerpos por los linfocitos B. Se entiende por "célula T CD8+" a los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés Citolytic T Lymphocyte) pertenecen a Ia línea de los linfocitos T encargados de las funciones efectoras de Ia inmunidad celular. Neutralizan células infectadas por microorganismos intracelulares , mediante un ataque directo a las células infectadas, inyectando enzimas tóxicas provocando su destrucción. Se les llama comúnmente CD8+, por Ia presencia del receptor de membrana CD8.
Las CTL son por excelencia células lisislíticas cuando estimuladas adecuadamente, en especial por antígenos expresados sobre MHC clase I. Son tan específicas en sus letales funciones que son capaces de destruir a Ia célula diana sin afectar a las células vecinas no infectadas. El proceso de destrucción celular mediado por CTL consta de:
* reconocimiento del antígeno foráneo y formación de un conjugado estable con receptores de membrana; MHC-I, TCR, CD8, ICAM-1 , LFA-1 , entre otros receptores y co-estimuladores ;
* activación de Ia célula CTL por medio de interrelaciones celulares mediadas por proteínas de membrana y Ia transducción de señales intracelulares;
> lisis celular obligando cambios en Ia célula diana y Ia exocitosis de granulos ponzoñosos conteniendo principalmente perforina y granzina;
* apoptosis de Ia célula diana incluyendo Ia mediación de moléculas inductores de muerte celular como Ia Fas y su ligando.
Debido a Ia grandiosa toxicidad de estos linfocitos, y para prevenir el innecesario riesgo de una continua presencia de circulación, las células citotóxicas inactivas o vírgenes requieren dos tipos de señales para su activación:
+ La unión del receptor de células T en Ia membrana de Ia célula citotóxico con el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC-I) tipo I sobre Ia superficie de las células presentadoras de antígeno (CPA),
> Las células infectadas por microorganismos de preferencia intracelular (como los virus), presentan sobre su superficie remanentes del microorganismo en el contexto de una molécula de MHC-I. La célula infectada presenta los antígenos foráneos a una CPA quien procesa Ia información infectante a las CTL,
* La coestimulación en altas concentraciones derivadas de Ia unión de Ia molécula CD40 presente sobre las membranas de células dendríticas a su ligando respectivo (CD40L) de las células citotóxicas. Es una interacción redundante, es decir, mientras más contactos de CD40 con su ligando estimula Ia producción de mayor cantidad de ligandos por Ia CTL, haciendo Ia señal activadora mas potente y definitiva.
*• En los tejidos infectados, las CTL que reconocen el antígeno en cuestión son activados y retenidos en Ia zona de Ia infección y realizan sus funciones efectoras. Aquellas CTL que no reconocen el antígeno involucrado, regresan a Ia circulación.
Se entiende por "polipéptido inmunogénico" utilizada en Ia vacuna contra el T. cruzi según Ia presente invención aquel que puede ser expresado por el estadio extracelular del T. cruzi (trypomastigote), en el estadio intracelular (amastigote), o durante ambos estadios del ciclo de Ia vida. Preferiblemente, el polipéptido inmunogénico queda expresado por un amastigote del T. cruzi, preferiblemente, queda expresado por el amastigote en Ia etapa temprana de Ia infección, en aproximadamente 24 horas de Ia infección inicial.
Una clase de polipéptidos que ejemplifica los polipéptidos inmunogénicos según Ia invención es de Ia familia de las proteínas trans-sialidasa, tales como TSA-1 (T. cruzi Perú; D. Fouts et. al. Mol. Biochem. Parasitol. 46:189 - 200 (1991); GenBank.Acc. Número M58466), ASP-1 (T. cruzi el Brasil; M. Santos et al. Mol. Biochem. Parasitol. 86:1 - 11 (1997): GenBank.Acc. Número U74494)) y ASP-2 (T. cruzi el Brasil; H. Low et al. Mol. Biochem. Parasitol. 88:137 - 149 (1997); GenBank. Acc. Número U77951).
VENTAJAS DE LA PRESENTE INVENCIÓN
La presente invención constituye una vacuna multicomponente o monocomponente más completa, que puede constituir variedades de un mismo componente de distintas T. Cruzi, en especial de aquellas porciones conservadas y/o con el agregado de targets diferentes entre si, por ejemplo tomando como target a una o varias trans-sialidasas, las proteínas fragelares o las cisteinas proteasas de una o más variedades de T. cruzi.
Siendo el Chagas una enfermedad que requiere de estímulos y protección para las inversiones de desarrollo y distribución, y que no dará lugar a un mercado competitivo y de múltiples opciones como sería si existieran Ia vacuna Argentina, Ia vacuna Brasileña, Ia vacuna Peruana, etc., en Ia práctica no podrían desarrollarse las vacunas hasta ahora conocidas sin dejar desprotegida a una porción considerable de Ia población afectada, por consiguiente el invento incluye Ia combinación de máxima inmunogenicidad ante Ia variedad de expresiones clínicas, (es decir una vacuna "monoshot-continental").
Se propone una fórmula para ser utilizada ante todas las variedades y expresiones clínicas. No han sido descriptas hasta el momento, fórmulas con multicomponentes tan amplias.
Ventajas de una vacuna genética
La elección de Ia administración del polinucleótido como técnica de inmunización ofrece una excelente ventaja sobre los distintos sistemas de suministro de otras vacunas o sistemas de entrega de antígeno. Las vacunas que contienen el material genético son preferidas frente a las vacunas tradicionales debido a Ia facilidad de Ia construcción y fabricación de los vectores, el potencial para Ia modificación de las secuencias por mutagénesis dirigidas para mejorar Ia potencia antigénica de los epitopes aislados o para suprimir los epitopes que pueden disparar respuesta indeseada, en el caso de vacunas de DNA, Ia estabilidad de DNA, Ia ausencia de los peligros asociados a las vacunas activas y atenuadas, su habilidad de inducir inmunidad humoral y transmitida por células y, particularmente, respuestas de las células T CD8+, y Ia persistencia de las respuestas inmunitarias.
La habilidad de mejorar Ia respuesta inmunitaria por Ia co-administración de los genes que codifican citocinas queda también establecida. TABLA 1 : Actividad de TS en suero luego de Ia inyección endovenosa de Ia proteína trans-sialidasa (TS) o trans-sialida sa unida a SAPA (TS-SAPA). Los valores son promedios obtenidos de tres animales independientes por grupo. La medida se realizó en muestras de suero tomadas de cada ratón a los 30 min, 16, 26 y 110 horas posteriores a Ia inoculación. La cepa de ratón utilizada fue C3H. horas postinoculación 0.5 16 26 110
TS* 100% 3% 0% 0%
TS-SAPA* 100% 60% 50% 5%
* Valores expresados en % de Ia actividad de trans-sialidasa remanente considerando 100% a los valores obtenidos a las 0.5 hs. luego de Ia inmunización con TS (para los valores TS) o con TS-SAPA (para los valores TS-SAPA) respectivamente.
Si en lugar de inyectar Ia proteína con actividad de trans-sialidasa, se inyecta a un ratón por vía endovenosa una proteína que contiene Ia región con actividad trans-sialidasa fusionada a Ia proteína SAPA (TS-SAPA), los resultados son diferentes (Tabla 1). Al tomarse muestras a diferentes tiempos de Ia inyección endovenosa Ia actividad de trans-sialidasa es detectable hasta 5 días posteriormente a su inyección. Estos resultados demuestran que Ia proteína SAPA, cuando se fusiona a otra proteína como trans-sialidasa, Ie confiere una propiedad nueva tal es Ia de estabilizarla en sangre manteniendo por mayor tiempo esta actividad enzimática en circulación.
Resultados similares a los mencionados pueden obtenerse cuando en lugar de utilizar Ia vía endovenosa para Ia inmunización, se utiliza otras vías de inmunización tales como Ia intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o cualquier otra que genere una respuesta de anticuerpos en el huésped inmunizado. Asimismo es posible obtener resultados similares cuando se utilizan algunos de los adyuvantes conocidos para inmunizar, tales como óxido de aluminio u otros que no destruyan a Ia enzima, tal como se detalla mis adelante. Un adyuvante es una sustancia oleosa, acuosa o con otra estructura que inyectada conjuntamente con el inmunógeno, en este caso una proteína recombinante tal como trans-sialidasa/SAPA, contribuye a aumentar su inmunogenicidad, esto es, aumenta Ia respuesta del sistema inmune en cuanto a Ia producción de anticuerpos o Ia respuesta celular. Respuesta celular es un tipo de respuesta del sistema inmunología) en el cual Ia proliferación es esencialmente de células que contribuyen a controlar un agente infeccioso. Otro resultado que se obtuvo como consecuencia de estos experimentos es que sólo se obtiene una respuesta contra Ia trans-sialidasa que inhibe su actividad cuando esta enzima es utilizada como inmunógeno en su forma activa, esto es, con una conformación tal que mantenga su actividad enzimática.
TABLA 2: Actividad inhibidora de Ia trans-sialidasa en suero de animales inmunizados con trans-sialidasa con repeticiones (TS-SAPA) con adyuvante de Freund (AF), con óxido de aluminio (AI2O3) o con proteína desnaturalizada por calor a 80QC (80QC). La inmunización se realizó por vía intraperitioneal en todos los casos con 65 nanogramos para Ia primera dosis (día O) y con 13 nanogramos para Ia segunda dosis al día 38. La medida de inhibición de Ia trans-sialidasa se realizó como se describió para los experimentos previos al día 1 y al día 45 posterior a Ia primera inmunización (día O). La medida está expresada en % de Ia inhibición obtenida en presencia de suero de ratones no inmunizados cuyo valores de inhibición se considera O. Los valores son el promedio del obtenido de cuatro ratones inmunizados en forma independiente para cada condición.
Días post-inmunización 1 45 TS-SAPA en AF 0% 0% TS-SAPA en Al 0% 90% TS-SAPA a 80?C 0% 0%
Otro resultado que se obtuvo como consecuencia de estos experimentos es que sólo se obtiene una respuesta contra Ia trans-sialidasa que inhibe su actividad cuando esta enzima es utilizada como inmunógeno en su forma activa, esto es, con una conformación tal que mantenga su actividad enzimática. En Ia tabla 2 se muestra que cuando el adyuvante utilizado para inmunizar ratones es óxido de aluminio, que no altera Ia actividad enzimática de Ia trans- sialidasa, se generan anticuerpos que Ia inhiben. Sin embargo, si se utiliza como adyuvante Freund, que destruye Ia actividad enzimática de Ia trans- sialidasa, no se generan en el ratón anticuerpos que inhiban Ia trans-sialidasa. Asimismo, Ia inactivación de Ia trans-sialidasa con calor a 80-C durante 3 minutos de forma tal que Ia proteína no mantenga su actividad enzimática impidiendo que Ia misma estimule Ia formación de anticuerpos neutralizantes. Resultados similares a los mencionados pueden obtenerse cuando en lugar de utilizar Ia vía endovenosa para Ia inmunización, se utiliza otras vías de inmunización tales como Ia intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o cualquier otra que genere una respuesta de anticuerpos en el huésped inmunizado. Asimismo es posible obtener resultados similares cuando se utilizan algunos de los adyuvantes conocidos para inmunizar, tales como óxido de aluminio u otros que no destruyan a Ia enzima, tal como se ha detallado. Un adyuvante es una sustancia oleosa, acuosa o con otra estructura que inyectada conjuntamente con el inmunógeno, en este caso una proteína recombinante tal como trans- sialidasa/SAPA, contribuye a aumentar su inmunogenicidad, esto es, aumenta Ia respuesta del sistema inmune en cuanto a Ia producción de anticuerpos o Ia respuesta celular. Respuesta celular es un tipo de respuesta del sistema inmunológico en el cual Ia proliferación es esencialmente de células que contribuyen a controlar un agente infeccioso.
Es indudable que al ser el presente invento llevado a Ia practica, podrán ser introducidas modificaciones en Io que a ciertos detalles de construcción y forma se refiere, sin que ello implique apartarse de los principios fundamentales que se substancian claramente en las cláusulas reivindicatorías que siguen a continuación.

Claims

ReivindicacionesHabiendo así especialmente descrito y determinado Ia naturaleza de Ia presente invención, y como puede ser llevada a Ia práctica, se declara reivindicar, como de exclusivo derecho y propiedad:
1. Una vacuna multicomponente para Ia enfermedad del Chagas (tripanosomiasis americana) caracterizada porque comprende: (a) una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos, y (b) uno o mas polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos inmunogénicos, ambas porciones para los derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos), y donde Ia administración de dicha vacuna protege de Ia infección del parásito, Io elimina o atenúa las consecuencias clínicas de dicha infección.
2. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 caracterizada porque Ia porción inmunógenica comprende uno o mas polipéptidos cuya estructura incluye una región C-terminal que consta de por Io menos dos unidades repetitivas de amino ácidos, poseyendo cada una de dichas unidades repetitivas por Io menos un 60% de nomología con Ia siguiente secuencia de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS y fusionada a dicha región C-terminal un polipéptido con actividad trans-sialidasa.
3. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 2 caracterizada porque comprende además un adyuvante que no destruye Ia actividad enzimática trans-sialidasa de Ia porción inmunógeno.
4. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 3 caracterizada porque el adyuvante es oxido de aluminio.
5. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 2 caracterizada porque comprende entre 10 y 16 unidades repetitivas en Ia región C-terminal, preferentemente 13 unidades.
6. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 , caracterizada por ser una biomoiécuia recombinante formada por Ia fusión de dicha región que consta de unidades repetitivas de aminoácidos y dicho polipéptido con actividad trans-sialidasa y/o de polipéptido con actividad cisteino proteinasa, y/o de Ia proteína parafragelar Rod (PFR).
7. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenido de tripomastigotes de los parásitos Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
8. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenido de amastigotes de los parásitos Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
9. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 caracterizada porque estimula al menos una respuesta inmune en el huésped seleccionada del grupo que consiste en una respuesta de anticuerpo y/o una respuesta inmune por mediación celular.
10. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 9 caracterizada porque estimula al menos una respuesta de células T CD4+ sesgadas Th 1 o T CD8+.
11. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 10 caracterizada porque estimula al menos una respuesta de células T CD8+.
12. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 8 caracterizada porque el inmunógeno es seleccionado entre las proteínas TSA-1 , ASP-1 , ASP-2, hemolisina y Lyt1.
13. La vacuna multicomponente de acuerdo con Ia cláusula 1 que comprende una pluralidad de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polinucleótidos inmunogénicos derivados de los T. Cruzi (de un T. Cruzi y/o de una región conservada común a varios de ellos) y al menos uno o mas polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a citoquinas.
14. La vacuna multicomponente según Ia cláusula 13 donde Ia citoquina es seleccionada entre interleuquina 12 (IL-12), factor de estimulación de colonias macrófago granulocíticas (GM-CSF), interleuquina 6 (IL-6), interleuquinaiδ (IL- 18), α-,β,γ- interferón, , y quimocinas, son especialmente preferidas las citoquinas IL-12 y GM-CSF.
15. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 caracterizada porque es una vacuna terapéutica.
16. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 caracterizada porque es una vacuna profiláctica.
17. La vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 caracterizada porque es para administrar en animales, preferentemente gatos y perros, o seres humanos.
18. Una vacuna monocomponente para Ia enfermedad del Chagas que comprende al menos un componente seleccionado entre una porción inmunógenica conformada por uno o mas polipéptidos recombinantes o sintéticos, o fracciones de ellos y un grupo de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polipéptidos ¡nmunogénico derivados de los Trypanosoma cruzi ( es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos), donde Ia porción inmunógenica o el grupo de polinucleótido estimula una respuesta de anticuerpos, de células T CD4+ sesgadas Th1 o T CD8+ contra el Tripanosoma cruzi.
19. La vacuna monocomponente de Ia cláusula 18 caracterizada porque Ia porción inmunógenica comprende uno o mas polipéptidos cuya estructura incluye una región C-terminal que consta de por Io menos dos unidades repetitivas de amino ácidos, poseyendo cada una de dichas unidades repetitivas por Io menos un 60% de nomología con Ia siguiente secuencia de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS y fusionada a dicha región C-terminal un polipéptido con actividad trans-sialidasa.
20. La vacuna monocomponente de Ia cláusula 19 caracterizada porque comprende además un adyuvante que no destruye Ia actividad enzimática trans-sialidasa de Ia porción inmunógeno.
21. La vacuna monocomponente de Ia cláusula 20 caracterizada porque el adyuvante es oxido de aluminio.
22. La vacuna monocomponente de Ia cláusula 20 caracterizada porque comprende entre 10 y 16 unidades repetitivas en Ia región C-terminal, preferentemente 13 unidades.
23. La vacuna monocomponente de Ia cláusula 19 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenida de tripomastigotes de los parásitos de Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
24. La vacuna monocomponente de Ia cláusula 19 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenida de amastigotes de los parásitos de Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
25. La vacuna monocomponente de acuerdo con Ia cláusula 18 que comprende una pluralidad de polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a uno o mas polinucleótidos inmunogénicos derivados de los T. Cruzi (de un T. Cruzi y/o de una región conservada común a varios de ellos) y al menos uno o mas polinucleótidos que comprenden a las regiones que codifican a citoquinas.
26. Una vacuna monocomponente según Ia cláusula 25 donde Ia citoquina es seleccionada entre interleuquina 12 (IL-12), factor de estimulación de colonias macrófago granulocíticas (GM-CSF), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 18 (IL-18), α-,β,γ- interferón, , y quimocinas, son especialmente preferidas las citoquinas IL-12 y GM-CSF.
27. Una composición farmacéutica que comprende una vacuna multicomponente de Ia cláusula 1 donde Ia porción inmunógenica o el grupo de polinucleótido que estimula una respuesta de anticuerpos, de células T CD4+ sesgadas Th1 o T CD8+ contra el Tripanosoma cruzi; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
28. La composición farmacéutica según Ia cláusula 27 caracterizada porque Ia porción inmunógenica comprende uno o mas polipéptidos cuya estructura incluye una región C-terminal que consta de por Io menos dos unidades repetitivas de amino ácidos, poseyendo cada una de dichas unidades repetitivas por Io menos un 60% de nomología con Ia siguiente secuencia de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS y fusionada a dicha región C-terminal un polipéptido con actividad trans-sialidasa.
29. La composición farmacéutica de Ia cláusula 28 caracterizada porque comprende además un adyuvante que no destruye Ia actividad enzimática trans-sialidasa de Ia porción inmunógeno.
30. La composición farmacéutica de Ia cláusula 29 caracterizada porque el adyuvante es oxido de aluminio.
31. La composición farmacéutica de Ia cláusula 28 caracterizada porque comprende entre 10 y 16 unidades repetitivas en Ia región C-terminal, preferentemente 13 unidades.
32. La composición farmacéutica de Ia cláusula 31 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenido de tripomastigotes de los parásitos de Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
33. La composición farmacéutica de Ia cláusula 27 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenido de amastigotes de los parásitos Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
34. Una composición farmacéutica que comprende una vacuna de Ia cláusula 18 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
35. La composición farmacéutica de Ia cláusula 34 caracterizada porque Ia porción inmunógenica comprende uno o mas polipéptidos cuya estructura incluye una región C-terminal que consta de por Io menos dos unidades repetitivas de amino ácidos, poseyendo cada una de dichas unidades repetitivas por Io menos un 60% de nomología con Ia siguiente secuencia de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS y fusionada a dicha región C-terminal un polipéptido con actividad trans-sialidasa.
36. La composición farmacéutica de Ia cláusula 35 caracterizada porque comprende además un adyuvante que no destruye Ia actividad enzimática trans-sialidasa de Ia porción inmunógeno.
37. La composición farmacéutica de Ia cláusula 36 caracterizada porque el adyuvante es oxido de aluminio.
38. La composición farmacéutica de Ia cláusula 35 caracterizada porque comprende entre 10 y 16 unidades repetitivas en Ia región C-terminal, preferentemente 13 unidades.
39. La composición farmacéutica de Ia cláusula 35 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenido de tripomastigotes de los parásitos del Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
40. La composición farmacéutica de Ia cláusula 35 caracterizada porque el inmunógeno de Ia porción a) es obtenido de amastigotes de los parásitos del Trypanosoma cruzi (es decir de un T. Cruzi y/o una región conservada común a varios de ellos).
41. Procedimiento para Ia obtención del inmunógeno útil en las vacunas de acuerdo con las cláusulas 1 , 6 y 18, caracterizado porque comprende las etapas: a) ligar Ia o las secuencias nucleotídicas codificantes para el ó los péptidos inmunogénicos a un vector capaz de expresar dicha secuencia, b) ligar Ia secuencia codificante obtenida en Ia etapa anterior a un vector capaz de expresar dicha secuencia, c) transformar un huésped capaz de expresar dicha secuencia codificante de dicho inmunógeno, d) crecer las bacterias transformadas obtenidas en Ia etapa anterior en un medio de cultivo adecuado, e) aislar y purificar el inmunógeno obtenido en Ia etapa anterior.
42. Procedimiento de acuerdo con Ia cláusula 41 , caracterizado porque dicho vector es el vector pET22b+.
43. Procedimiento de acuerdo con Ia cláusula 41 , caracterizado porque dicho huésped son células eucariontes.
44. Procedimiento de acuerdo con Ia cláusula 41 , caracterizado porque dicho huésped son bacterias.
45. Procedimiento de acuerdo con Ia cláusula 41 , caracterizado porque dichas bacterias son Escherichia coli BL26DE3.
46. Procedimiento de acuerdo con Ia cláusula 41 , caracterizado porque dicho huésped son levaduras.
47. Procedimiento de acuerdo con Ia cláusula 41 , caracterizado porque dicho medio de cultivo es un medio L-Broth.
48. Procedimiento para Ia obtención del inmunógeno útil en Ia vacuna de acuerdo con las cláusulas 1 , 7 y 18, caracterizado porque comprende las etapas de: a) crecer Ia forma tripomastigote de Trypanosoma cruzi en un medio de cultivo adecuado, b) obtención del sobrenadante donde se han crecido Ia forma tripomastigotes por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos, c) filtración del sobrenadante obtenido y pasaje por una columna de afinidad que contiene inmunoglobulinas que reconocen las repeticiones de Ia secuencia carboximetil terminal del inmunógeno, d) elución aumentando el pH para despegar la pro teína.
49. Procedimiento de acuerdo con las cláusulas 41 y 48, caracterizado porque los péptidos pueden ser obtenidos por síntesis química.
50. Un ácido nucleico útil en el procedimiento de Ia cláusula 41 , caracterizado porque consiste esencialmente en una secuencia que codifica dicho inmunógeno.
PCT/IB2008/002923 2007-10-31 2008-10-30 Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra ia enfermedad de chagas, composiciones farmacéuticas que las contienen, procedimiento para ia obtención del inmunógeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento WO2009056965A2 (es)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2010004626A MX2010004626A (es) 2007-10-31 2008-10-30 Vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra la enfermedad de chagas.
EP08844056.5A EP2206513B1 (en) 2007-10-31 2008-10-30 A multicomponent or monocomponent vaccine to be used against chagas disease
CA2702534A CA2702534C (en) 2007-10-31 2008-10-30 A multicomponent or monocomponent vaccine to be used against chagas disease, pharmaceutical compositions containing them, procedure for the obtention of immunogen of said vaccines, and nucleic acid used in said procedure
ES08844056.5T ES2569943T3 (es) 2007-10-31 2008-10-30 Una vacuna multicomponente o monocomponente para usar contra la enfermedad de Chagas
US12/740,393 US8900598B2 (en) 2007-10-31 2008-10-30 Multicomponent or monocomponent vaccine to be used against Chagas disease, pharmaceutical compositions containing them, procedure for the obtention of immunogen of said vaccines, and nucleic acid used in said procedure
US14/529,454 US9662378B2 (en) 2007-10-31 2014-10-31 Multicomponent or monocomponent vaccine to be used against Chagas disease, pharmaceutical compositions containing them, procedure for the obtention of immunogen of said vaccines, and nucleic acid used in said procedure
US15/492,365 US10213500B2 (en) 2007-10-31 2017-04-20 Multicomponent or monocomponent vaccine to be used against chagas disease, pharmaceutical compositions containing them, procedure for the obtention of immunogen of said vaccines, and nucleic acid used in said procedure

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ARP070104827A AR064593A1 (es) 2007-10-31 2007-10-31 Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra la enfermedad de chagas, composiciones farmaceuticas que las contienen, procedimiento para la obtencion del inmunogeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento.
ARP20070104827 2007-10-31

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/740,393 A-371-Of-International US8900598B2 (en) 2007-10-31 2008-10-30 Multicomponent or monocomponent vaccine to be used against Chagas disease, pharmaceutical compositions containing them, procedure for the obtention of immunogen of said vaccines, and nucleic acid used in said procedure
US14/529,454 Division US9662378B2 (en) 2007-10-31 2014-10-31 Multicomponent or monocomponent vaccine to be used against Chagas disease, pharmaceutical compositions containing them, procedure for the obtention of immunogen of said vaccines, and nucleic acid used in said procedure

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2009056965A2 true WO2009056965A2 (es) 2009-05-07
WO2009056965A3 WO2009056965A3 (es) 2009-07-23

Family

ID=40591558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/IB2008/002923 WO2009056965A2 (es) 2007-10-31 2008-10-30 Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra ia enfermedad de chagas, composiciones farmacéuticas que las contienen, procedimiento para ia obtención del inmunógeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento

Country Status (18)

Country Link
US (3) US8900598B2 (es)
EP (1) EP2206513B1 (es)
AR (1) AR064593A1 (es)
BR (1) BRPI0805753A2 (es)
CA (1) CA2702534C (es)
CO (1) CO6280407A2 (es)
CR (1) CR11334A (es)
DO (1) DOP2010000083A (es)
EC (1) ECSP10010055A (es)
ES (1) ES2569943T3 (es)
GT (1) GT201000066A (es)
HN (1) HN2010000750A (es)
MX (1) MX2010004626A (es)
NI (1) NI201000071A (es)
PA (1) PA8816401A1 (es)
PE (2) PE20140520A1 (es)
UY (1) UY31451A1 (es)
WO (1) WO2009056965A2 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011031317A2 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vaccine for control of trypanosoma cruzi infection and chagas disease

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR064593A1 (es) * 2007-10-31 2009-04-15 Baeremaecker Barros Carlos De Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra la enfermedad de chagas, composiciones farmaceuticas que las contienen, procedimiento para la obtencion del inmunogeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento.
BR112014001086A2 (pt) * 2011-07-21 2017-02-21 Consejo Superior De Investig Cientificas/Csic molécula quimérica útil na imunoterapia contra a leishmaniose, a qual compreende um fragmento da proteína pfr1 de leishmania infantum com epítopos específicos imunodominantes
US9566320B2 (en) 2013-09-24 2017-02-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Mucin-associated surface protein as vaccine against Chagas disease
US10279023B2 (en) 2013-09-24 2019-05-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Mucin-associated surface protein as a vaccine against chagas disease
WO2016209598A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Saint Louis University Peptides for inducing chagas disease responses
BR102021010469A2 (pt) * 2021-05-28 2022-12-13 Fundação Oswaldo Cruz Proteína quimérica recombinante, seu uso, e, composição

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993018787A1 (en) 1992-03-25 1993-09-30 New York University Trans-sialidase and methods of use and making thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6875584B1 (en) * 1999-03-02 2005-04-05 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prophylactic and therapeutic immunization against protozoan infection and disease
US7060676B2 (en) * 1999-12-20 2006-06-13 Trustees Of Tufts College T. cruzi-derived neurotrophic agents and methods of use therefor
US7780969B2 (en) 2005-07-15 2010-08-24 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Trypanosoma cruzi proteome compositions and methods
US9028844B2 (en) 2006-03-17 2015-05-12 Vib Vzw Vaccine against Trypanosoma cruzi infection
AR064593A1 (es) * 2007-10-31 2009-04-15 Baeremaecker Barros Carlos De Una vacuna multicomponente o monocomponente para ser utilizada contra la enfermedad de chagas, composiciones farmaceuticas que las contienen, procedimiento para la obtencion del inmunogeno de dichas vacunas y acido nucleico utilizado en dicho procedimiento.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993018787A1 (en) 1992-03-25 1993-09-30 New York University Trans-sialidase and methods of use and making thereof

Non-Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. RUIZ ET AL., MOL. BIOCHEM. PARASITOL, vol. 39, 1990, pages 117 - 125
BRIONES, M.R.S. ET AL., MOL.BIOCHEM. PARASITOL., vol. 70, 1995, pages 9 - 17
C. IBÁRÏEZ ET AL., MOL. BIOCHEM. PARASITOL., vol. 30, 1988, pages 27 - 34
CAZZULO, J.J.; FRASCH, A.C.C., FASEB J., vol. 6, 1992, pages 3259326
CHUENKOVA, M.; PEREIRA M.E.A., J. EXP. MED., vol. 181, 1995, pages 1693 - 1703
D. FOUTS, MOL. BIOCHEM. PARASITOL., vol. 46, 1991, pages 189 - 200
E. ALBERTI ET AL., VACCINE, vol. 16, 1998, pages 608 - 612
F. COSTA ET AL., VACCINE, vol. 16, 1998, pages 768 - 774
H. LOW ET AL., MOL. BIOCHEM. PARASITOL., vol. 88, 1997, pages 137 - 149
J. M. DI NOIA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 270, 1995, pages 24146 - 24149
J. MONACO, IMMUNOL. TODAY, vol. 13, 1992, pages 173 - 179
J.L. AFFRANCHINO ET AL., MOL. BIOCHEM. PARASITOL, vol. 34, 1989, pages 221 - 228
J.M. DI NOIA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 271, 1996, pages 32078 - 32083
M. B. REYES ET AL., GENE, vol. 140, 1994, pages 139 - 140
M. BA- SOMBRIO, EXP. PARASITOL., vol. 71, 1990, pages 1 - 8
M. SANTOS ET AL., BIOCHEM. PARASITOL., vol. 86, 1997, pages 1 - 11
M.B. REYES ET AL., PROC. NATL.ACAD SCI. USA, vol. 87, 1990, pages 2846 - 2850
PEREIRA ET AL., INFECT. IMMUM., vol. 64, 1996, pages 3884 - 3892
PREVIATO, J.O., MOL. BIOCHEM. PARASITOL., vol. 16, 1985, pages 8596
RUIZ, R.C. ET AL., PARASITE IMMUNOL., vol. 15, 1993, pages 121 - 12
SCHAUER, R. ET AL., Z. PHYSIOL. CHEM., vol. 364, 1983, pages 1053 - 1057
SCHENKMAN S. ET AL., CELL, vol. 65, 1991, pages 1117 - 1126
SCHENKMAN, S. ET AL., ANN.REV.MICROBIOL., vol. 48, 1994, pages 499 - 523
SCHENKMAN, S.; EICHINGER, D., PARASITOLOGY TODAY, vol. 9, 1993, pages 218 - 222
ZINGALES, B. ET AL., MOL. BIOCHEM. PARASITOL., vol. 26, 1987, pages 135 - 144

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011031317A2 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vaccine for control of trypanosoma cruzi infection and chagas disease
WO2011031317A3 (en) * 2009-09-10 2011-11-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Vaccine for control of trypanosoma cruzi infection and chagas disease
US8663649B2 (en) 2009-09-10 2014-03-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Diagnosis and treatment of Trypanosoma cruzi infection and Chagas disease
US9250239B2 (en) 2009-09-10 2016-02-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for detecting microbial infections

Also Published As

Publication number Publication date
PE20140520A1 (es) 2014-05-05
EP2206513B1 (en) 2016-02-17
EP2206513A2 (en) 2010-07-14
PA8816401A1 (es) 2009-09-17
PE20091161A1 (es) 2009-08-28
GT201000066A (es) 2012-04-03
NI201000071A (es) 2010-11-10
US20150056243A1 (en) 2015-02-26
WO2009056965A3 (es) 2009-07-23
CA2702534C (en) 2016-10-18
AR064593A1 (es) 2009-04-15
BRPI0805753A2 (pt) 2012-04-17
CR11334A (es) 2010-05-26
CO6280407A2 (es) 2011-05-20
US9662378B2 (en) 2017-05-30
US20100297186A1 (en) 2010-11-25
MX2010004626A (es) 2010-10-04
DOP2010000083A (es) 2010-07-15
ES2569943T3 (es) 2016-05-13
CA2702534A1 (en) 2009-05-07
HN2010000750A (es) 2013-08-19
US10213500B2 (en) 2019-02-26
ECSP10010055A (es) 2010-06-29
US8900598B2 (en) 2014-12-02
UY31451A1 (es) 2009-05-29
US20170290896A1 (en) 2017-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10213500B2 (en) Multicomponent or monocomponent vaccine to be used against chagas disease, pharmaceutical compositions containing them, procedure for the obtention of immunogen of said vaccines, and nucleic acid used in said procedure
Rodríguez-Morales et al. Experimental vaccines against Chagas disease: a journey through history
Garg et al. Genetic immunization elicits antigen-specific protective immune responses and decreases disease severity in Trypanosoma cruzi infection
Cazorla et al. Oral vaccination with Salmonella enterica as a cruzipain-DNA delivery system confers protective immunity against Trypanosoma cruzi
Handman Leishmaniasis: current status of vaccine development
US7892555B2 (en) Prophylactic and therapeutic immunization against protozoan infection and disease
Kim et al. DNA vaccines encoding viral glycoproteins induce nonspecific immunity and Mx protein synthesis in fish
JP3881014B2 (ja) ポリヌクレオチドツベクローシスワクチン
Ivory et al. DNA vaccines: designing strategies against parasitic infections
Da’dara et al. Immunization with plasmid DNA encoding the integral membrane protein, Sm23, elicits a protective immune response against schistosome infection in mice
Von Stebut Cutaneous Leishmania infection: progress in pathogenesis research and experimental therapy
Vázquez-Chagoyán et al. Vaccine development against Trypanosoma cruzi and Chagas disease
Siddiqui et al. Induction of protective immunity against Schistosoma mansoni via DNA priming and boosting with the large subunit of calpain (Sm-p80): adjuvant effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-4
da Costa et al. Trypanosoma cruzi trans-sialidase as a potential vaccine target against Chagas disease
Hota-Mitchell et al. Recombinant vaccinia viruses and gene gun vectors expressing the large subunit of Schistosoma mansoni calpain used in a murine immunization-challenge model
Spithill Control of tissue parasites. III. Trematodes
US20110008392A1 (en) Vaccine targets and delivery systems for cryptosporidium
Lee et al. A DNA Vaccine Encoding a Fatty Acid‐Binding Protein of Clonorchis sinensis Induces Protective Immune Response in Sprague–Dawley Rats
MXPA06004025A (es) Farmaco para el tratamiento de infecciones por leishmanias.
Pinge-Filho et al. Protective immunity against Trypanosoma cruzi provided by oral immunization with Phytomonas serpens: role of nitric oxide
ES2279599T3 (es) Vacuna contra la coccidiosis.
Ebrahimi et al. TIR-TLR7 as a molecular adjuvant: simultaneous enhancing humoral and cell-mediated immune responses against inactivated infectious bursal disease virus
Rodrigues et al. Swimming against the current: genetic vaccination against Trypanosoma cruzi infection in mice
WO2017190260A1 (es) Una vacuna contra la infección por trypanosoma cruzi
da Costa et al. as a Potential Vaccine Target Against Chagas Disease

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08844056

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008844056

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201011334

Country of ref document: CR

Ref document number: D2010052

Country of ref document: CU

Ref document number: CR2010-011334

Country of ref document: CR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2702534

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2010/004626

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12740393

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10058905

Country of ref document: CO