BRPI0805753A2 - vacina multicomponente ou monocomponente para a doença de chagas, composições farmacêuticas que as contêm, procedimento para a obtenção do imunógeno de ditas vacinas e ácido nucléico utilizado em dito procedimento - Google Patents
vacina multicomponente ou monocomponente para a doença de chagas, composições farmacêuticas que as contêm, procedimento para a obtenção do imunógeno de ditas vacinas e ácido nucléico utilizado em dito procedimento Download PDFInfo
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Abstract
VACINA MULTICOMPONENTE OU MONOCOMPONENTE PARA A DOENçA DE CHAGAS, COMPOSIçõES FARMACêUTICAS QUE AS CONTêM, PROCEDIMENTO PARA A OBTENçãO DO IMUNóGENO DE DITAS VACINAS E áCIDO NUCLéICO UTILIZADO EM DITO PROCEDIMENTO. O objeto principal da presente invenção é uma vacina contra a doença de Chagas, capaz de estimular a resposta imune contra o fator de virulência trans-sialidase do parasita <UM>Trypanosoma cruzi<MV>, caracterizada dita vacina por compreender uma vacina multicomponente para a doença de Chagas (tripanossomíase americana) caracterizada por compreender: (a) uma porção imunogênica conformada por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações destes, e (b) um ou mais polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênicos, ambas porções para os derivados dos Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), onde a administração de dita vacina protege da infecção do parasita, o elimina ou atenua as conseqúências clínicas de dita infecção. Outro objeto da presente invenção é uma vacina monocomponente para a doença de Chagas que compreende ao menos um componente selecionado entre uma porção imunogênica conformada por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações deles e um grupo de polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênico derivados dos Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), onde a porção imunogênica ou o grupo de polinucleotídeos estimula uma resposta de anticorpos, de células T CD4+ oblíquas Th1 ou T CD8+ contra o Tripanosoma cruzi. Também se incluem na presente invenção as composições farmacêuticas contendo ditas vacinas multicomponentes e monocomponentes, procedimentos para obtenção da porção imunogênica destas vacinas e o ácido nucléico utilizado nesse processo.
Description
VACINA MULTICOMPONENTE OU MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM, PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNÓGENO DE DITAS VACINAS E ÁCIDO NUCLÉICO UTILIZADO EM DITO PROCEDIMENTO.
O objetivo técnico da presente invenção é favorecer o incremento na resposta imune frente a antígenos protozoários ou bacterianos, especialmente aumentar a indução de resposta T citotóxica essencial contra estes antígenos. A presente invenção conduzirá ao desenvolvimento de formulações de vacinas terapêuticas ou profiláticas para a Doença de Chagas.
Estado da técnica
O Trypanosoma cruzi é um protozoário da ordem kinetoplastidia, familia Tryponosomatidae, caracterizado pela presença de um só flagelo e uma só mitocôndria, dentro da qual seu genoma se encontra ordenado em uma complexa e compacta rede denominada kinetoplasto. É um parasita intracelular com um ciclo de vida que envolve vertebrados e invertebrados.
Apresenta três formas distintas: Amastigote: esférico ou ovalado, é a forma reprodutiva no interior das células mamíferas, Epimastigote: alongado e com o kinetoplasto localizado anteriormente ao núcleo, é a forma reprodutiva no trato digestivo dos invertebrados e em meios de cultivo e Tripomastigote: também alongado, mas com o kinetoplasto localizado posteriormente ao núcleo. Encontra-se no sangue dos mamíferos e é a forma infectante deles. Esta forma não se divide. O Τ. cruzi se divide em dois grandes grupos: T. cruzi I e T. cruzi II. Este último por sua vez se divide em cinco grupos menores: T. cruzi lia, Ilb1 lio, Ild y lie.
O agente etiológico da doença de Chagas também denominada tripanosomiasis americana, é um parasita intracelular protozoário, Tripanosoma cruzi. Se transmite por meio de um inseto hematófago, Triatoma infestans, o qual transmite o parasita quando defeca sobre a picada que ele mesmo realiza para alimentar-se. Nos mamíferos, os ciclos do T. cruzi se encontram entre um estágio do trypomastigote que circula no sangue e o estágio do amastigote que replica no citoplasma das células hóspedes infectadas (especialmente nos músculos). A doença de Chagas é encontrada predominante em quase todos os países latino-americanos que incluem também México e América Central, onde aproximadamente 18 milhões de pessoas são infectadas com o T. cruzi e ao menos 50.000 crianças e adultos morrem a cada ano pela doença de Chagas crônica devido a ausência de tratamentos eficazes.
Os triatominos redúvidos, conhecidos como vinchuca (do Equador a Patagônia), chipo (na Venezuela), pito (na Colômbia) e barbeiro (no Brasil), são insetos hematófagos, isto é, chupadores de sangue, que vivem nas frestas, buracos e espaços sujos de moradias ou habitações nas regiões da América do Sul e América Central. Estes se infectam depois de picar um animal ou pessoa que já padece da doença. Em geral, a infecção se propaga aos seres humanos quando um inseto infectado deposita fezes na pele enquanto a pessoa está dormindo à noite. A pessoa com freqüência coça as picadas, introduzindo acidentalmente as fezes na ferida da picada, um corte aberto, os olhos ou a boca. Os animais podem se infectar da mesma forma e também contraem a doença comendo um inseto infectado. As pessoas infectadas podem não apresentar sintomas da doença até 10 ou 15 anos após ser infectado, pelo que sua detecção se faz mais difícil.
Mais de 90 milhões encontram-se em risco de infecção nas áreas endêmicas. Além disso, 2-5% dos fetos podem ser infectados por via materna em ditas áreas endêmicas que podem provocar abortos ou futuros nascimentos com a doença de Chagas congênita.
O resultado em termos de perda de produtividade devido a doença e custos médicos têm um efeito retardador no crescimento econômico destes países. O risco de transmissão do T. cruzi para indivíduos não infectados através de transplantes de órgãos e transfusões de sangue de doadores imigrantes infectados é muito elevado.
Os tratamentos quimioterapêuticos têm resultados parcialmente satisfatórios no controle da infecção de T. cruzi e doença de Chagas. Porém, a elevada toxicidade dos fármacos e a escassa eficácia terapêutica disponível acabam por limitar a utilidade da quimioterapia para o tratamento de enfermos agudos ou crônicos. Além disso, a terapia com fármacos reduz a severidade da doença em indivíduos crônico infectados, porém não reverte o dano provocado pelos parasitas. As vacinas para a prevenção ou tratamento da infecção do T. cruzi praticamente não existem. As vacinas tradicionais constituídas de parasitas inativados por calor, ou frações subcelulares do T. cruzi proporciona em grau de proteção para infecções com T. cruzi (M. Basombrio, Exp. Parasitol. 71:1 - 8 (1990); A. Ruiz e outros., Mol. Biochem. Parasitol, 39:117 - 125. (1990)). Porém, estas vacinas falham ao proporcionar um nível protetor de imunidade, provavelmente devido à perda de epítopes importantes durante a inativação e/ou a falha dos antígenos para ingressar na rota de MHC (complexo maior de histocompatibilidade) classe I da elaboração e a apresentação do antígeno e de provocar as respostas imunitárias transmitidas por células (J. Mônaco. Immunol. Today 13:173 - 179 (1992)). As vacinas atenuadas ativas são capazes de ingressar na rota de MHC classe I, e puderam provocar respostas imunes protetoras. Porém, o perigo da reversão de parasitas atenuados as cepas virulentas sem a atenuação não tem sido completada faz com que estas vacinas resultem impraticáveis. Uma vacina do DNA que continha o gene que codificava a transsialiadasa tem demonstrado proporcionar uma proteção profilática contra infecções do T. cruzi nos ratos (F. Costa et al, Vaccine 16:768 - 774 (1998)), mas não tem demonstrado a prevenção ou que provoque uma reversão da doença ou estimular uma resposta da célula T citotóxicas animais. Além disso, a resposta imune celular e humoral específica nos ratos BALB/c imunizados com uma biblioteca de expressão genômica do T. el cruzi tem sido observada (E. Alberti et al., Vaccine 16:608 - 612 (1998)).
A transsialidasa é uma enzima do Trypanosoma cruzi (agente causai da doença de Chagas) que é requerida por este parasita para invadir células do hóspede humano. Dado que se o parasita não invade células, não sobrevive no humano, a trans- sialidase parece ser um alvo ideal para o ataque imunológico, isto é, desenvolvimento de uma vacina. Por tanto, o que se busca é uma vacina que quando seja utilizada para imunizar, produza como resposta anticorpos que especificamente inibam a trans-sialidase.
Existem várias trans-sialidases produzidas no tri- panosoma. Algumas têm somente uma região que é requerida para a atividade enzimática (de trans-sialidação que é a transferência de um açúcar denominado ácido siálico). Outras têm além desta região, um segundo domínio que não tem nada que ver com a trans- sialidação, mas que é muito imunogênica (gera anticorpos no hóspede). Esta segunda região é denominada de SAPA (shed-acute- phase antigen que significa antígeno liberado de fase aguda) e está formada por unidades repetitivas de aminoácidos.
Foram identificados os genes (ácidos nucléicos, ADN, formados por unidades denominadas nucleotídeos ou bases, uma região do ADN que codifica uma proteína como neste caso a trans- sialidase, se denomina gene) que codificam a região com atividade enzimática e a região SAPA.
Uma das moléculas do T. cruzi descritas como essencial para a invasão de células hóspede é o ácido siálico (Schenkman S. Et al. Cell 65,1117-1126,1991; Schenkman, S. et al. Ann.Rev.Microbiol. 48, 499-523, 1994; Schenkman, S. and Eichinger, D. Parasitology Today 9, 218-222, 1993). Dado que o tripanosoma é incapaz de sintetizar ácido siálico (Schauer, R. y et al. Z. Physiol. Chem. 364: 1053-1057, 1983), deve adquiri-lo de moléculas que contenham ácido siálico presentes no meio. Este processo é realizado utilizando uma enzima única denominada trans- sialidase (Previato, J.O. et. al., Mol. Biochem. Parasitol. 16:8596, 1985 Y Zingales1 B., et al., Mol. Biochem.Parasitol. 26, 135-144, 1987). A trans-sialidase é capaz de transferir ácido siálico de moléculas sialidadas presentes no meio, tal como algumas das que circulam no sangue do hóspede infectado, a moléculas presentes na superfície do tripanosoma.
As moléculas do tripanosoma passíveis de ser sialidadas, são principalmente aquelas denominadas mucinas (Ruiz, R.C., et al. Parasite Immunol. 15,121-12, 1993; Μ. B. Reyes, et al. Gene 140, 139-140, 1994; J. M. Di Noia et al. J. Biol. Chem. 270, 24146-24149, 1995; J.M. Di Noia, et al. J. Biol. Chem. 271, 32078- 32083, 1996). Uma vez sialidadas, as mucinas são as que interagem com a superfície da célula humana a ser invadida, possibilitando-se desta maneira o processo de infecção (Ruiz, R.C., et al. Parasite Immunol. 15, 121-12, 1993). Outros grupos tem demostrado que se o parasita não expressa trans-sialidase, não pode infectar células como fazem os parasitas que possuem trans-sialidase (Pereira et al., Infect. Immum. 64, 38843892, 1996). Por tanto, a imunização com trans-sialidase de forma tal que gere anticorpos que inibam a enzima, constitui uma ferramenta utilizável na obtenção de uma vacina contra este parasita. Recentemente tem-se demonstrado que a resposta imune contra a tran-sialidasa é um fator que contribui a prevenir a morte do hóspede causada pelo parasita (Chuenkova, M. y Pereira M.E.A., J. Exp. Med. 181, 1693-1703, 1995).
O Trypanosoma cruzi tem dois tipos de trans- sialidases. Uma delas contém somente os aminoácidos requeridos para a atividade de trans-sialidase (Briones, M.R.S. et al. Mol.Biochem. Parasitol. 70: 9-17, 1995) e foi utilizada no pedido de patente WO 9318787 com a finalidade de sintetizar carboidratos dada sua atividade enzimática e proposta secundariamente como imunógeno no mesmo pedido patente. Um segundo grupo de trans- sialidases contém, além destas seqüencias, uma série de repetições de aminoácidos na região carboxilo terminal denominada SAPA (C. Ibánez, et al. Mol. Biochem. Parasitol. 30: 27-34, 1988; J.L. Affranchino, et al. Mol. Biochem. Parasitol 34: 221228, 1989; Cazzulo, J.J. and Frasch,A.C.C. FASEB J. 6, 3259326, 1992). Esta segunda região é altamente antigênica durante uma infecção natural em humanos (M.B. Reyes, et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 87:2846- 2850, 1990).
A investigação mais abundante para as vacinas foi centrada em intentos de desenvolver vacinas profiláticas da proteína contra a infecção do T. cruzi, mas foram cumpridas com pouco êxito. O desenvolvimento das vacinas das subunidades integradas pelos antígenos definidos que são capazes de induzir fortes respostas humorais e de células T de tipo 1 e de reduzir a carga do parasita, tem ficado impedido pelo desconhecimento da biologia dos três estágios de desenvolvimento do T. cruzi, a ausência de informação suficiente da seqüência nos genes expressados nos estágios de contagio e intracelulares, e o ponto de vista científico que a doença crônica não está associado com a infecção parasita persistente porém é o resultado de uma resposta auto-imune parasita-induzida.
O objeto principal da presente invenção é uma vacina contra a doença de Chagas, capaz de estimular a resposta imune contra o fator de virulência trans-sialidase do parasita Trypanosoma cruzi, caracterizada dita vacina por compreender uma vacina multicomponente para a doença de Chagas (tripanossomíase americana) caracterizada por compreender: (a) uma porção imunogênica conformada por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações destes, e (b) um ou mais polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênicos, ambas porções para os derivados dos Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), onde a administração de dita vacina protege da infecção do parasita, o elimina ou atenua as conseqüências clínicas de dita infecção.
Outro objeto da presente invenção é uma vacina monocomponente para a doença de Chagas que compreende ao menos um componente selecionado entre uma porção imunogênica conformada por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações deles e um grupo de polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênico derivados dos Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), onde a porção imunogênica ou o grupo de polinucleotídeos estimula uma resposta de anticorpos, de células T CD4+ oblíquas Th 1 ou T CD8+ contra o Tripanosoma cruzi.
Também se incluem na presente invenção as composições farmacêuticas contendo ditas vacinas multicomponentes e monocomponentes, procedimentos para obtenção da porção imunogênica destas vacinas e o ácido nucléico utilizado nesse processo.
Descrição das figuras
Figura 1: Seqüência de nucleotídeos da região do gene que codifica a proteína do Tripanosoma cruzi que possui atividade de trans-sialidasa. As letras representam as quatro bases (moléculas) que constituem o ADN (ácido desoxirribonucléico). A: adenina, T: timina, C: citosina, G: guanina. Cada três bases (triplete de bases) se codifica um aminoácido (unidade molecular que forma a proteína) que neste caso é a trans-sialidase. O ATG indicado em minúscula é o primeiro aminoácido da trans-sialidase (o aminoácido metionina). O triplete TGA último é o utilizado pela célula para indicar onde termina a proteína (triplete de terminação). Corresponde à região 1 da figura 6.
Figura 2: Seqüência de aminoácidos da região - codificada no gene que se mostra na Figura 1 e que corresponde à parte da proteína que possui atividade de trans-sialidase. Cada letra indica um aminoácido de acordo com o código universalmente aceito. Corresponde à região 1 da figura 6.
Figura 3: Seqüência de bases que codifica a região de unidades repetitivas de aminoácidos denominada SAPA. Resto das indicações igual à Figura 1. Corresponde à região 2 da figura 6.
Figura 4: Seqüência de aminoácidos codificada de acordo com a seqüência de bases indicada na Figura 3 e que corresponde à proteína SAPA. Corresponde a região 2 da figura 6.
Figura 5: Seqüência de nucleotídeos (linha superior) e de aminoácidos (linha inferior) correspondente ao gene e à proteína, respectivamente, resultante da união da trans-sialidase e SAPA.
Descrição detalhada da invenção Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma vacina que seja eficaz para tratar ou para evitar a infecção de um mamífero por derivados dos Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles). Em uma forma de realização particularmente preferida, a vacina é eficaz contra a infecção e/ou doença provocadas pelo T. cruzi.
A vacina multicomponente da presente invenção é para a doença de Chagas (tripanossomíase americana) compreendendo: (a) uma porção imunogênica conformada por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações destes, e (b) um ou mais polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênicos, ambas porções para os derivados dos Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), e onde a administração de dita vacina protege da infecção do parasita, o elimina ou atenua as conseqüências clínicas de dita infecção. Uma vacina do polinucleotídeo contem um ou mais polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênicos derivados do T. Cruzi. Em forma análoga, uma vacina do polipeptídio contem um ou mais polipeptídios imunogênicos derivados do T. cruzi.
Outro objeto da presente invenção é uma vacina monocomponente para a doença dei Chagas que compreende ao menos um componente selecionado entre uma porção imunogênica conformada por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações deles e um grupo de polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênico derivados dos Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), onde a porção imunogênica ou o grupo de polinucleotídeo estimula uma resposta de anticorpos, de células T CD4+ oblíquas Th 1 o T CD8+ contra o Tripanosoma cruzi.
A "porção imunogênica" da vacina pode compreender um ou mais polipeptídios cuja estrutura inclui uma região C-terminal que consta de pelo menos duas unidades repetitivas de aminoácidos, possuindo cada uma de ditas unidades repetitivas pelo menos 60% de homologia com a seqüência seguinte de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS e fusionada a dita região C-terminal um polipeptídio com atividade trans-sialidase. Pode compreender ainda um adjuvante que não destrói a atividade enzimática trans- sialidase da porção imunógena, preferentemente oxido de alumínio. Dita porção pode compreender entre 10 e 16 unidades repetitivas na região C-terminal, preferentemente 13 unidades.
Dita porção imunogênica pode ser obtida de tripomastigotas dos parasitas Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles) ou de amastigotas dos parasitas Trypanosoma cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles).
A vacina da presente invenção pode ser uma biomolécula recombinante formada pela fusão de dita região que consta de unidades repetitivas de aminoácidos e dito polipeptídio com atividade trans-sialidase e/ou de polipeptídio com atividade cisteíno proteinase, e/ou da proteína parafragelar Rod (PFR).
A vacina multicomponente da presente invenção estimula preferivelmente uma resposta de anticorpos ou uma resposta imune transmitida por células, ou ambas respostas, no mamífero aos quais será administrado. Preferivelmente a vacina estimula uma resposta das células T CD4 + oblíquas Th1 ou uma resposta das células T CD8+; preferencialmente, no caso de uma vacina do componente único, a vacina estimula uma resposta de anticorpos, uma resposta das células T CD4 + oblíquas Th1 ou uma resposta das células T CD8+. Uma forma de realização particularmente preferida da vacina da presente invenção inclui um nucleotídeo que compreende às regiões que codificam uma citosina, para proporcionar a estimulação adicional ao sistema imune do mamífero. Uma forma de realização particularmente preferida da vacina do polipeptídio da invenção inclui um polipeptídio imunogênico que contenha uma seqüência de deslocamento da membrana, para facilitar a introdução do polipeptídio na célula de mamífero e a estimulação subseguinte da resposta imune transmitida pelas células.
O imunógeno da presente invenção pode ser selecionado entre as seguintes proteínas TSA-1, ASP-1, ASP-2, hemolisina e Lyt1.
A vacina multicomponente da presente invenção pode compreender uma pluralidade de polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polinucleotídeos imunogênicos derivados dos T. Cruzi (isto é de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles) e ao menos um ou mais polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a citoquinas, que pode selecionar-se entre interleucina 12 (IL-12), fator de estimulação de colônias macrófago granulocíticas (GM-CSF), interleucina 6 (IL-6), interleucina 18 (IL-18), α-,β,γ- interferon, , e quimosinas, são especialmente preferidas as citocinas IL-12 y GM-CSF.
As composições farmacêuticas que continham os polipeptídios recombinantes ou sintéticos ou frações deles da porção imunogênica e os polinucleotídeos que compreendem às regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênicos derivados dos T. Cruzi, junto com um veículo farmacêutico também são objeto da presente invenção.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma vacina de vários componentes de polinucleotídeo se prepara insertando dois ou mais nucleotídeos que compreendem as regiões que codificam a um ou mais polipeptídios imunogênico derivado do T. Cruzi em dois ou mais vetores de polinucleotídeo, depois combinando aos vetores do polinucleotídeo para render uma vacina do polinucleotídeo.
Alternativamente, uma vacina da presente invenção pode ser administrada em forma profilaticamente a um mamífero antes da infecção pelo T. Cruzi. Em uma forma de realização preferida, a administração da vacina deve ser eficaz para evitar a infecção subseqüente do mamífero pelo T. Cruzi. Em outra forma de realização, a administração da vacina é eficaz para evitar o desenvolvimento da doença debilitante crônica em um mamífero depois da infecção subseqüente pelo T. cruzi. Em outra forma de realização, administração da vacina é eficaz para evitar a morte do mamífero depois da infecção subseqüente pelo T. cruzi.
Em outro aspecto, o invento inclui um procedimento para identificar os polipeptídios imunogênicos do T. Cruzi de uma genética do T. cruzi, para ser utilizados em uma vacina do polinucleotídeos. Em uma forma de realização, o procedimento utiliza a imunização da biblioteca de expressão (ELI) em ratos para identificar os polipeptídios do T. Cruzi que provocam uma resposta imunitária em um mamífero eficaz para evitar, deter ou desacelerar a progressão da doença no mamífero que foi infectado pelo T. Cruzi. Preferivelmente, o procedimento é utilizado para identificar os polipeptídios imunogênicos derivados do T. cruzi, e dos ratos BALB/c o B6 que foram imunizados.
Em outra forma de realização, o procedimento implica:
(a) preparar o micro arranjo de um DNA que compreende um marco de leitura aberto dos genes d T. cruzi;
(b) preparar uma primeira proveta que compreende um trimastigota marcado Cy3 -derivado do cDNA do T. cruzi;
(c) preparar uma segunda proveta que compreende um amastigota marcado Cy5-derivado do cDNA;
(d) co-hibridizar as primeiras e segundas provetas no microarray para identificar pelo menos um gene que expresse o T. cruzi durante o estágio intracelular do ciclo infeccioso de amastigota, onde dito gene codifica ao candidato imunogênico polipeptídio do T. cruzi; e
(e) imunizar ratos com o gene para determinar se o gene codifica um polipeptídio do cruzi que provoca uma resposta imunitária que compreende em um mamífero eficaz para evitar, deter ou retardar a progressão da doença no mamífero que foi infectado pelo T. cruzi.
Uma forma de preparação do imunógeno utilizado nas vacinas multicomponente ou monocomponente da presente invenção compreende as etapas: a) ligar a ou as seqüências nucleotídicas codificantes para o ou os peptídeos imunogênicos a um vetor capaz de expressar dita seqüência, b) ligar a seqüência codificante obtida na etapa anterior a um vetor capaz de expressar dita seqüência, c) transformar um hóspede capaz de expressar dita seqüência codificante de dito imunógeno, d) crescer as bactérias transformadas obtidas na etapa anterior em um meio de cultivo adequado, e) isolar e purificar o imunógeno obtido na etapa anterior. O vetor do passo (b) pode ser pET22b+. Os hóspedes são células eucariontes, bactérias, especialmente Escherichia coli BL26DE3, leveduras. O meio de cultivo do passo (d) pode ser um meio L-Broth. Outra forma de preparação do imunógeno utilizado nas vacinas multicomponente ou monocomponente da presente invenção compreende as etapas de: a) crescer a forma tripomastigote de Trypanosoma cruzi em um meio de cultivo adequado, b) obtenção do sobrenadante onde cresceram as formas tripomastigotes por centrifugação a 5000 rpm durante 10 minutos, c) filtração do sobrenadante obtido e passagem por uma coluna de afinidade que contem imunoglobulinas que reconhecem as repetições da seqüência carboximetil terminal do imunógeno, d) eluição aumentando o pH para descolar a proteína.
Os peptídeos utilizados nos procedimentos da presente invenção podem ser obtidos por síntese química. Outro objeto da presente invenção compreende um ácido nucléico utilizado nos procedimentos antes revelados porque compreende essencialmente uma seqüência que codifica dito imunógeno.
São conhecidos mais de 100 hóspedes de mamíferos naturais para o T. cruzi, e o T. cruzi pode chegar aos seres humanos proveniente de outros hóspedes animais. Qualquer hóspede mamífero fica imunizado de acordo com a presente invenção. A aplicação da vacina desta patente inclui homens, animais domésticos tais como cães e gatos, roedores e animais da fauna. Preferivelmente, o mamífero objeto para ser imunizado é um cão, um gato, ou um homem.
Vacina do polinucleotídeo
A vacina do polinucleotídeo da invenção inclui pelo menos um, preferivelmente ao menos dois, nucleotídeos que compreendem às regiões que codificam um ou mais polipeptídios imunogênico derivado dos T. cruzi. Quando contem duas ou mais regiões que codificam polipeptídios imunogênicos, a vacina do polinucleotídeo é uma vacina multicomponente. É desejável para minimizar o número de diferentes polipeptídios imunogênicos que compreendem regiões que codificam nucleotídeo; porém, não obstante considerado que uma vacina do polinucleotídeo que gera o mais alto nível de proteção deveria codificar 10 ou mais polipeptídios imunogênicos. A vacina de polinucleotídeo contem DNA, RNA, um ácido nucléico modificado, ou qualquer combinação destes. Preferivelmente, a vacina compreende um ou mais vetores de expressão ou clonação; preferivelmente, a vacina compreende uma pluralidade de vetores de expressão capazes da expressão autônoma de um nucleotídeo que compreende a região que codifica a um ou mais polipeptídios ou citosina imunogênicos na célula de um mamífero. Um vetor de expressão inclui preferivelmente uma seqüência de promotor eucariótica, preferivelmente a seqüência de nucleotídeos de um forte promotor eucariótica, operativamente unido a uma ou mais regiões que codificam. Um promotor é um fragmento de ADN que atua como sinal regulador e se une a RNA polimerase em uma célula para iniciar a transcrição de uma seqüência de codificação descendente (direção 3'); a transcrição é a formação de uma cadeia de RNA de acordo com a informação genética contida no DNA. Um promotor está operavelmente unido a uma seqüência de ácido nucléico, ou pode ser utilizado para controlar ou regular a transcrição desta seqüência de ácido nucléico. A presente invenção não está limitada a um promotor eucariótica concreto e sim, se estende a ampla variedade conhecida; preferivelmente, o vetor de expressão contem o promotor de CMV ou de RSV. O promotor utilizado é preferivelmente um promotor constitutivo.
Um vetor útil na presente invenção pode ser circular ou linear, trançado simples ou duplo e pode ser um plásmico, cósmico, ou um epítome, porém são preferidos os plásmicos. Em uma forma de realização preferida, cada nucleotídeo que compreende a região (se codifica um polipeptídio imunogênico ou uma citosina) em um vetor separado; porém, fica entendido que uma ou mais regiões podem estar presentes em um só vetor, e estas regiões ficam sob controle de promotores simples ou múltiplos.
Podem-se adicionar a vacina de polinucleotídeo, seqüências de nucleotídeos que codificam citosinas, tais como fator de estimulação de colônias granulocíticas do macrófago (GM-CSF), interleucina 12 (IL-12) e as moléculas co-estimulantes tais como B7- 1, B7-2, CD40. As citosinas podem ser utilizadas em várias combinações para sintonizar finamente a resposta do sistema imune do animal, incluindo o anticorpo e respostas citotóxicas do linfócito de T, logrando uma resposta de nível especifico que permita controlar ou eliminar a infecção do T. cruzi. A vacina de polinucleotídeo pode conter um produto de fusionado contendo um polipeptídio antigênico e uma molécula, tal como CTLA-4, que dirige o produto da fusão às células com presença de antígenos dentro do hóspede.
Os plásmicos e outros sistemas de entrega se preparam utilizando as técnicas bem conhecidas na técnica da biologia molecular. A presente invenção pode incluir procedimentos para preparar e utilizar a vacina de polinucleotídeo.
Vacina de polipeptídio
A vacina de polipeptídio da presente invenção inclui pelo menos um, preferível mente pelo menos dois, polipeptídios imunogênicos (recombinantes ou sintéticos, ou frações deles) do T. cruzi. Como com a vacina de polinucleotídeo, é desejável minimizar o número de diferentes polipeptídios imunogênicos providos na vacina; porém, fica não obstante compreendido que uma vacina de polipeptídio que gera o mais alto nível de proteção contenha IO ou polipeptídios imunogênicos mais numerosos. Porque uma resposta das células T CD8+ não está normalmente dirigida a administração de uma vacina convencional da subunidade da proteína, os polipeptídios imunogênicos contidos na vacina de polipeptídio incluem preferível mente uma ou mais seqüências de transporte da membrana (MTS) fusionadas a seus N-terminal ou C- terminal ou ambos. Uma seqüência de transporte da membrana permite o transporte do polipeptídio imunogênico através de uma bi- capa lipídica, permitindo a entrega a parte interior de uma célula de mamífero.
Citocinas
As citocinas são proteínas que regulam a função das células que as produzem ou outros tipos celulares. São os agentes responsáveis da comunicação intercelular, induzem a ativação de receptores específicos de membrana, funções de proliferação e diferenciação celular, quimiotaxias, crescimento e modulação da secreção de imunoglobulinas. São produzidas, fundamentalmente, pelos linfócitos e os macrófagos ativados, ainda que também podem ser produzidas por leucócitos polinucleares, células endoteliais, epiteliais e do tecido conjuntivo. Segundo a célula que as produza, se denominam Iinfocinas (linfócito), monocinas (monócitos) o interleucinas (células hematopoiéticas). Sua ação fundamental é na regulação do mecanismo da inflamação. Existem citosinas pró- inflamatórias e outras antiinflamatórias
Preferivelmente, a vacina de polinucleotídeo inclui pelo menos um nucleotídeo que compreende a região que codifica uma citosina. As citosinas preferidas incluem interleucina 12 (IL-12), fator de estimulação de colônias macrófago granulocíticas (GM-CSF), interleucina 6 (IL-6), interleucina 18 (IL-18), α-,β,γ- interferón, , e quimosinas. Especialmente as citosinas preferidas incluem IL-12 y GM-CSF.
Composições farmacêuticas
As vacinas de polinucleotídeo e de polipeptídio da presente invenção são formuladas facilmente como composições farmacêuticas para o uso veterinário ou humano. A composição farmacêutica inclui opcionalmente os excipientes ou os diluentes farmacêuticos aceitáveis como aqueles que forem compatíveis com o material genético. A denominação "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um carregador que seja aceitável no sentido de ser compatível com os distintos componentes de uma composição e que não prejudique seu comportamento terapêutico. São excipientes aceitáveis, por exemplo, água, solução salina, dextrosa, glicerol, etanol, ou similares e combinações destes. Além disso, se for desejado, a vacina pode conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou agentes emulsionantes, os agentes buffer, as sales, e/ou os coadjuvantes que melhoram a efetividade da composição estimulante de uma resposta imune. Também se incluem na presente invenção procedimentos para preparar e utilizar tais composições farmacêuticas.
Administração de uma combinação de vacina de polinucleotídeo e de vacina de polipeptídio
A presente invenção compreende a administração de uma vacina de polinucleotídeo e de uma vacina de polipeptídio a um mamífero em um protocolo serial. Por exemplo, uma vacina plásmico - baseada DNA pode ser administrada a um mamífero ao sistema imune primário, seguido por uma ou mais administrações de uma vacina polipeptídica ou de uma vacina viral (por exemplo vetor de polipeptídio da vacina que leva aos genes que codificam os polipeptídios imunogênicos e, opcionalmente, as citosinas) para estimular o sistema imune do mamífero. A ordem da administração dos diferentes tipos de vacinas, e a natureza das vacinas administradas em qualquer forma de dosificação (por exemplo vacina de polipeptídio, vacina de plásmico, vacina de vetor viral) podem ser facilmente determinadas por um técnico na área para provocar a resposta imunitária mais eficaz no mamífero.
DEFINIÇÃO DE ALGUNS TERMOS
Se entende como "doença de Chagas" diferentes expressões clínicas em pacientes parasitados por variedades de T. Cruzi, por sua vez relacionada com o impacto imunológico crônico em diversos tecidos brancos. Por conseguinte, as vacinas até agora conhecidas, sejam elas de mono ou multicomponentes de substâncias freqüentes de algum tipo de T. Cruzi, são fórmulas parciais como para encarar um tratamento que seja efetivo em todas as zonas geográficas, onde se desenvolve a doença, e contra todas as formas intra ou extracelulares do parasita. Além disso, a imunogenicidade de tais componentes comuns podem variar no tempo e/ou com a mudança do estado de saúde do hóspede, devido a que não garantem uma proteção universal e duradoura.
Entende-se por "linfócito T" as células (glóbulos brancos) responsáveis de coordenar a resposta imune mediada por células, assim como de funções de cooperação para que se desenvolvam todas as formas de respostas imunes, incluindo a resposta de anticorpos pelos linfócitos B. Os linfócitos T podem ser diferenciados dos linfócitos B e das células asesinas pela presença de um receptor especial na superfície da membrana chamado Receptor das Células T (TCR). O T da denominação provém do timo, que é um órgão mais importante da diferenciação destas células a partir de células mãe do sistema linfático.
Entende-se por "célula T CD4+" os linfócitos T responsáveis de coordenar a resposta imune mediada por células, assim como de funções de cooperação para que se desenvolvam todas as formas de respostas imunes, incluindo a resposta de anticorpos pelos linfócitos B.
Se entende por "célula T CD8+" os linfócitos T citotóxicos (CTL, por suas siglas em inglês Citolytic T Lymphocyte) pertencem a linha dos linfócitos T encarregados das funções efetoras da imunidade celular. Neutralizam células infectadas por microorganismos intracelulares, mediante um ataque direto as células infectadas, injetando enzimas tóxicas provocando sua destruição. São chamadas comumente CD8+, pela presença do receptor de membrana CD8.
As CTL são por excelência células lisislíticas quando estimuladas adequadamente, em especial por antígenos expressados sobre MHC clase I. São tão específicas em suas funções letais que são capazes de destruir a célula alvo sem afetar as células vizinhas não infectadas. O processo de destruição celular mediado por CTL consta de:
w> Reconhecimento do antígeno forasteiro e formação de um conjugado estável com receptores de membrana; MHC-I, TCR, CD8, ICAM-1, LFA-1, entre outros receptores e co-estimuladores ;
► Ativação da célula CTL por meio de inter-relações celulares mediadas por proteínas de membrana e a transdução de sinais intracelulares;
► Lise celular obrigando trocas na célula alvo e a exocitose de grânulos venenosos contendo principalmente perforina e granzina;
► Apoptose da célula alvo incluindo a mediação de moléculas indutoras de morte celular como a Fas e suas ligações.
Devido a grandiosa toxicidade destes linfócitos, e para prevenir o desnecessário risco de uma continua presença de circulação, as células citotóxicas inativas ou virgens requerem dois tipos de sinais para sua ativação: A união do receptor de células T na membrana da célula citotóxica com o Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC-I) tipo I sobre a superfície das células apresentadoras de antígeno (CPA),
A células infectadas por microorganismos de preferência intracelular (como os vírus), apresentam sobre sua superfície remanescentes do microorganismo no contexto de uma molécula de MHC-I. A célula infectada apresenta os antígenos forasteiros a uma CPA que processa a informação infectante as CTL,
A coestimulação em altas concentrações derivadas da união da molécula CD40 presente sobre as membranas de células dendríticas a suas ligações respectivas (CD40L) das células citotóxicas. É uma interação redundante, isto é, enquanto mais contatos de CD40 com suas ligações estimulam a produção de maior quantidade de ligações pela CTL, faz o sinal ativador mais potente e definitiva.
Nos tecidos infectados, as CTL que reconhecem o antígeno em questão são ativadas e retidas na zona da infecção e realizam suas funções efetoras. Aquelas CTL que não reconhecem o antígeno involucrado, regressam a circulação.
Entende-se por "polipeptídio imunogênico" utilizado na vacina contra o T. cruzi segundo a presente invenção aquele que pode ser expresso pelo estado extracelular do T. cruzi (trypomastigote), no estado intracelular (amastigota), ou durante ambos estados do ciclo de vida. Preferível mente, o polipeptídio imunogênico fica expressado por um amastigota do T. cruzi, preferivelmente, fica expressado pelo amastigota na etapa inicial da infecção, em aproximadamente 24 horas da infecção inicial.
Uma classe de polipeptídios que exemplifica os polipeptídios imunogênicos segundo a invenção é da família das proteínas trans- sialidase, tais como TSA-1 (T. cruzi Peru; D. Fouts et. al. Mol. Biochem. Parasitol. 46:189 - 200 (1991); GenBank.Acc. Número M58466), ASP-1 (T. cruzi de Brasil; M. Santos et al. Mol. Biochem. Parasitol. 86:1 - 11 (1997): GenBank.Acc. Número U74494)) e ASP- 2 (T. cruzi de Brasil; H. Low et al. Mol. Biochem. Parasitol. 88:137 - 149 (1997); GenBank. Acc. Número U77951).
Vantagens da presente invenção
A presente invenção constitui uma vacina multicomponente ou monocomponente mais completa, que pode constituir variedades de um mesmo componente de distintas T. Cruzi1 em especial daquelas porções conservadas e/ou com o agregado de targets (alvos) diferentes entre si, por exemplo, tomando como target (alvo) uma ou várias trans-sialidases, as proteínas fragelares ou as cisteinas proteases de uma ou mais variedades de T. cruzi.
Sendo a Chagas uma doença que requer estímulos e proteção para as inversões de desenvolvimento e distribuição, e que não dará lugar a um mercado competitivo e de múltiplas opções como seria se existissem a vacina Argentina, a vacina Brasileira, a vacina Peruana, etc., na prática não poderiam desenvolver-se as vacinas até agora conhecidas sem deixar desprotegida a uma porção considerável da população afetada, por conseguinte o invento inclui a combinação de máxima imunogenicidade ante a variedade de expressões clínicas, (isto é, uma vacina "monoshot- continental").
Propõe-se uma fórmula para ser utilizada ante todas as variedades e expressões clínicas. Não foram descritas, até o momento, fórmulas com multicomponentes tão amplas.
Vantagens de uma vacina genética
A eleição da administração do polinucleotídeo como técnica de imunização oferece uma excelente vantagem sobre os distintos sistemas de subministro de outras vacinas ou sistemas de entrega de antígeno. As vacinas que contêm o material genético são preferidas frente às vacinas tradicionais devido a facilidade da construção e fabricação dos vetores, o potencial para a modificação das seqüências por metagêneses dirigidas para melhorar a potência antigênica dos epitopes isolados ou para suprimir os epitopes que podem disparar resposta indesejada, no caso de vacinas de DNA, a estabilidade de DNA, a ausência dos perigos associados às vacinas ativas e atenuadas, sua habilidade de induzir imunidade humoral e transmitida por células e, particularmente, respostas das células T CD8+, e a persistência das respostas imunitárias. A habilidade de melhorar a resposta imunitária pela co-administração dos genes que codificam citosinas fica também estabelecida. TABELA 1: Atividade de TS em soro logo da injeção endovenosa da proteína trans-sialidase (TS) ou trans-sialidase unida a SAPA (TS- SAPA).
Os valores são a média obtidas de três animais independentes por grupo. A medida se realizou em amostras de soro tomadas de cada rato aos 30 min., 16 h., 26 h. e 110 horas posteriores a inoculação. A linhagem de ratos utilizada foi C3H. <table>table see original document page 27</column></row><table>
* Valores expressados em % da atividade de trans-sialidase remanescente considerando 100% aos valores obtidos às 0.5 hs. Logo da imunização com TS (para os valores TS) ou com TS- SAPA (para os valores TS-SAPA) respectivamente. Se no lugar de injetar a proteína com atividade de trans-sialidase, se injeta a um rato por via endovenosa uma proteína que contem a região com atividade trans-sialidase fusionada a proteína SAPA (TS- SAPA), os resultados são diferentes (Tabela 1). Ao tirar-se amostras a diferentes tempos da injeção endovenosa a atividade de trans- sialidase é detectável até 5 dias posteriormente a sua injeção. Estes resultados demonstram que a proteína SAPA, quando se fusiona a outra proteína como trans-sialidase, lhe confere uma propriedade nova tal como a de estabilizar-la em sangue mantendo por maior tempo esta atividade enzimática em circulação.
Resultados similares aos mencionados podem ser ob- tidos quando no lugar de utilizar a via endovenosa para a imunização, se utiliza outras vias de imunização tais como a intramuscular, intraperitoneal, subcutânea ou qualquer outra que gere uma resposta de anticorpos no hóspede imunizado. Além disso, é possível obter resultados similares quando se utilizam alguns dos adjuvantes conhecidos para imunizar, tais como óxido de alumínio ou outros que não destruam a enzima, tal como se detalha mais adiante. Um adjuvante é uma substância oleosa, aquosa ou com outra estrutura que injetada conjuntamente com o imunógeno, neste caso uma proteína recombinante tal como trans-sialidase/SAPA, contribui para aumentar sua imunogenicidade, isto é, aumenta a resposta do sistema imune em relação à produção de anticorpos ou a resposta celular. Resposta celular é um tipo de resposta do sistema imunológico no qual a proliferação é essencialmente de células que contribuem para controlar um agente infeccioso.
Outro resultado que se obteve como conseqüência destes experimentos é que só se obtém uma resposta contra a trans-sialidase que inibe sua atividade, quando esta enzima é utilizada como imunógeno na sua forma ativa, isto é, com uma conformação tal que mantenha sua atividade enzimática. TABELA 2: Atividade inibidora da trans-sialidase em soro de animais imunizados com trans-sialidase com repetições (TS-SAPA), com adjuvante de Freund (AF), com óxido de alumínio (AI2O3) ou com proteína desnaturada por calor a 80°C (80°C). A imunização se realizou por via intraperitoneal em todos os casos com 65 nanogramas para a primeira dose (dia O) e com 13 nanogramas para a segunda dose ao dia 38. A medida de inibição da trans- sialidase se realizou como se descreveu para os experimentos prévios ao dia 1 e ao dia 45, posterior a primeira imunização (dia 0). A medida está expressa em % da inibição obtida em presença de soro de ratos não imunizados cujo valor de inibição se considera 0. Os valores são a média do obtido de quatro ratos imunizados de forma Independente para cada condição.
<table>table see original document page 28</column></row><table> TS-SAPA a 80°C 0% 0%
Outro resultado que se obteve como conseqüência destes experimentos é que só se obtém uma resposta contra a trans-sialidase, que inibe sua atividade, quando esta enzima é utilizada como imunógeno na sua forma ativa, isto é, com uma conformação tal que mantenha sua atividade enzimática. Na tabela 2 se mostra que quando o adjuvante utilizado para imunizar ratos é óxido de alumínio, que não altera a atividade enzimática da trans- sialidase, geram-se anticorpos que a inibem. Entretanto, se é utilizado como adjuvante Freund, que destrói a atividade enzimática da trans-sialidase, não se geram no rato anticorpos que inibam a trans-sialidase. Além disso, a inativação da trans-sialidase com calor a 80°C durante 3 minutos de forma tal que a proteína não mantenha sua atividade enzimática impedindo que a mesma estimule a formação de anticorpos neutralizantes.
Resultados similares aos mencionados podem ser ob- tidos quando no lugar de utilizar a via endovenosa para a imunização, se utiliza outras vias de imunização tais como a intramuscular, intraperitoneal, subcutânea ou qualquer outra que gere uma resposta de anticorpos no hóspede imunizado. Além disso, é possível obter resultados similares quando se utilizam alguns dos adjuvantes conhecidos para imunizar, tais como óxido de alumínio ou outros que não destruam a enzima, tal como foi detalhado. Um adjuvante é uma substância oleosa, aquosa ou com outra estrutura que injetada conjuntamente com o imunógeno, neste caso uma proteína recombinante tal como trans-sialidase/SAPA, contribui para aumentar sua imunogenicidade, isto é, aumenta a resposta do sistema imune em relação à produção de anticorpos ou a resposta celular. Resposta celular é um tipo de resposta do sistema imunológico no qual a proliferação é essencialmente de células que contribuem para controlar um agente infeccioso.
É indubitável que ao ser o presente invento levado a prática, poderão ser introduzidas modificações a certos detalhes de construção e forma referidas, sem que implique num distanciamento dos princípios fundamentais que se substanciam claramente nas cláusulas reivindicatórias.
Claims (50)
1. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS (tripanossomíase americana) caracterizada por compreender: (a) uma porção imunogênica composta por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações deles, e (b) um ou mais polinucleotídeos que compreendem as regiões que codificam um ou mais polipeptídios imunogênicos, ambas porções para os derivados dos Trypanosoma cruzi (ou seja, de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), e onde a administração dessa vacina protege da infecção do parasita, elimina-o ou atenua as conseqüências clínicas dessa infecção.
2. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada pelo fato de que a porção imunogênica compreende um ou mais polipeptídios cuja estrutura inclui uma região C-terminal que consta de pelo menos duas unidades repetitivas de aminoácidos, possuindo cada uma dessas unidades repetitivas pelo menos 60% de homologia com a seguinte seqüência de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS e fundida a referida região C-terminal, um polipeptídio com atividade trans-sialidase.
3. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 2 e ainda caracterizada pelo fato de que compreende também um adjuvante que não destrói a atividade enzimática trans-sialidase da porção imunogênica.
4. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 3 e ainda caracterizada pelo fato de que o adjuvante é o óxido de alumínio.
5. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 2 e ainda caracterizada pelo fato de que compreende entre 10 e 16 unidades repetitivas na região C- terminal, preferível mente em 13 unidades.
6. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada pelo ser uma biomolécula recombinante formada pela fusão dessa região que consta de unidades repetitivas de aminoácidos e esse polipeptídio com atividade trans-sialidase e/ou de polipeptídio com atividade cisteíno proteinase, e/ou da proteína paraflagelar Rod (PFR).
7. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de tripomastigotas dos parasitas Trypanosoma cruzi.
8. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de amastigotas dos parasitas Trypanosoma cruzi.
9. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada pelo fato de que estimula ao menos uma resposta imune no hóspede selecionado do grupo que consiste em uma resposta de anticorpo e/ou uma resposta imune por mediação celular.
10. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 9 e ainda caracterizada pelo fato de que estimula ao menos uma resposta de células T CD4+ oblíquas Th 1 ou T CD8+.
11. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 10 e ainda caracterizada pelo fato de que estimula ao menos uma resposta de células T CD8+.
12. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 8 e ainda caracterizada por o imunogênico ser selecionado entre as proteínas TSA-1, ASP-1, ASP- -2, hemolisina e Lyt1.
13. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada por compreender uma pluralidade de polinucleotídeos que compreendem as regiões que codificam um ou mais polinucleotídeos imunogênicos derivados dos T. Cruzi (de um T. Cruzi e/ou de uma região conservada comum a vários deles) e ao menos um ou mais polinucleotídeos que compreendem as regiões que codificam citocinas.
14. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 13 e ainda caracterizada por a citocina é selecionada entre interleucina 12 (IL-12), fator de estimulação de colônias macrófago granulocíticas (GM-CSF)1 interleucina 6 (IL-6), interleucina 18 (IL-18), α-,β,γ- interferon, e quimosinas, são especialmente preferidas as citocinas IL-12 e GM- CSF.
15. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada pelo fato de ser uma vacina terapêutica.
16. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada pelo fato de ser uma vacina profilática.
17. VACINA MULTICOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 1 e ainda caracterizada por ser para administrar em animais, preferível mente em gatos e cachorros, ou seres humanos.
18. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS caracterizada por compreender ao menos um componente selecionado entre uma porção imunogênica conformada por um ou mais polipeptídios recombinantes ou sintéticos, ou frações deles e um grupo de polinucleotídeos que compreendem as regiões que codificam um ou mais polipeptídios imunogênicos derivados dos Trypanosoma cruzi (ou seja de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles), onde a porção imunogênica ou o grupo de polinucleotídeo estimula uma resposta de anticorpos, de células T CD4+ oblíquas Th 1 ou T CD8+ contra o Trypanosoma cruzi.
19. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 18 e ainda caracterizada por a porção imunogênica compreender um ou mais polipeptídios cuja estrutura inclui uma região C-terminal que consta de pelo menos duas unidades repetitivas de aminoácidos, possuindo cada uma dessas unidades repetitivas pelo menos 60% de homologia com a seguinte seqüência de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS e fundida a referida região C-terminal, um polipeptídio com atividade trans-sialidase.
20. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 18 e ainda caracterizada pelo fato de que compreende também um adjuvante que não destrói a atividade enzimática trans-sialidase da porção imunogênica.
21. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 20 e ainda caracterizada pelo fato de que o adjuvante é oxido de alumínio.
22. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 20 e ainda caracterizada pelo fato de que compreende entre 10 e 16 unidades repetitivas na região C- terminal, preferivelmente em 13 unidades.
23. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 19 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de tripomastigotas dos parasitas de Trypanosoma cruzi (ou seja de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles).
24. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 19 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de amastigotas dos parasitas de Trypanosoma cruzi (ou seja de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles).
25. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 18 e ainda caracterizada por compreender uma pluralidade de polinucleotídeos que compreendem as regiões que codificam um ou mais polinucleotídeos imunogênicos derivados dos T. Cruzi (de um T. Cruzi e/ou de uma região conservada comum a vários deles) e ao menos um ou mais polinucleotídeos que compreendem as regiões que codificam a citocinas.
26. VACINA MONOCOMPONENTE PARA A DOENÇA DE CHAGAS como reivindicado em 25 e ainda caracterizada por a citocina ser selecionada entre interleucina 12 (IL-12), fator de estimulação de colônias macrófago granulocíticas (GM-CSF), interleucina 6 (IL-6), interleucina 18 (IL-18), α-,β,γ- interferon, , e quimosinas, são especialmente preferidas as citocinas IL-12 e GM- CSF.
27. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender uma vacina multicomponente da cláusula 1 onde a porção imunogênica ou o grupo de polinucleotídeo que estimula uma resposta de anticorpos, de células T CD4+ oblíquas Th1 ou T CD8+ contra o Trypanosoma cruzi; e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
28. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 27 e ainda caracterizada pelo fato de que a porção imunogênica compreende um ou mais polipeptídios, cuja estrutura inclui uma região C-terminal que consta de pelo menos duas unidades repetitivas de aminoácidos, possuindo cada uma dessas unidades repetitivas pelo menos 60% de homologia com a seguinte seqüência de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS e fundida a referida região C- terminal, um polipeptídio com atividade trans-sialidase.
29. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 28 e ainda caracterizada pelo pelo fato de que compreende também um adjuvante que não destrói a atividade enzimática trans-sialidase da porção imunogênica.
30. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 29 e ainda caracterizada pelo fato de que o adjuvante é oxido de alumínio.
31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 28 e ainda caracterizada pelo fato de que compreende entre 10 e 16 unidades repetitivas na região C-terminal, preferível mente em 13 unidades.
32. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 31 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de tripomastigotas dos parasitas de Trypanosoma cruzi (ou seja de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles).
33. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 27 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de amastigotas dos parasitas Trypanosoma cruzi (ou seja de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles).
34. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 27 e ainda caracterizada por compreende uma vacina da cláusula 18 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
35. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 34 e ainda caracterizada pelo fato de que a porção imunogênica compreende um ou mais polipeptídios cuja estrutura inclui uma região C-terminal que consta de pelo menos duas unidades repetitivas de aminoácidos, possuindo cada uma dessas unidades repetitivas pelo menos 60% de homologia com a seguinte seqüência de aminoácidos: AHSTPSTPVDSS e fundida a referida região C-terminal, um polipeptídio com atividade trans-sialidase.
36. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 35 e ainda caracterizada pelo fato de que compreende também um adjuvante que não destrói a atividade enzimática trans-sialidase da porção imunogênica.
37. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 36 e ainda caracterizada pelo fato de que o adjuvante é óxido de alumínio.
38. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 35 e ainda caracterizada pelo fato de que compreende entre 10 e 16 unidades repetitivas na região C-terminal, preferível mente em 13 unidades.
39. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 35 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de tripomastigotas dos parasitas do Trypanosoma cruzi (ou seja de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles).
40. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA como reivindicado em 35 e ainda caracterizada pelo fato de que o imunogênico da porção a) é obtido de amastigotas dos parasitas do Trypanosoma cruzi (ou seja de um T. Cruzi e/ou uma região conservada comum a vários deles).
41. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 1, 6 e 18, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: a) conectar a ou as seqüências nucleotídicas codificadoras para o ou os peptídeos imunogênicos a um vetor capaz de expressar a referida seqüência, b) conectar a seqüência codificadora obtida na etapa anterior a um vetor capaz de expressar a referida seqüência, c) transformar um hóspede capaz de expressar a referida seqüência codificadora desse imunógeno, d) crescer as bactérias transformadas obtidas na etapa anterior em um meio de cultivo adequado, e) isolar e purificar o imunógeno obtido na etapa anterior.
42. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 41 e ainda caracterizado pelo fato de que esse vetor é o vetor pET22b+.
43. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 41 e ainda caracterizado pelo fato de que esse hóspede são células eucariontes.
44. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 41 e ainda caracterizado pelo fato de que esse hóspede são bactérias.
45. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 41 e ainda caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias são Escherichia coli BL26DE3.
46. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 41 e ainda caracterizado pelo fato de que esse hóspede são leveduras.
47. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 41 e ainda caracterizado pelo fato de que esse meio de cultivo é um meio L-Broth.
48. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 1, 7 e 18 e ainda caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) crescer a forma tripomastigota de Trypanosoma cruzi em um meio de cultivo adequado, b) obtenção do sobrenadante onde cresceram a forma tripomastigotas por centrifugação a 5000 rpm durante 10 minutos, c) filtração do sobrenadante obtido e passagem por uma coluna de afinidade que contém imunoglobulinas que reconhecem as repetições da seqüência carboximetil terminal do imunogênico, d) eluição aumentando o pH para separar a proteína.
49. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DO IMUNOGÊNICO ÚTIL NAS VACINAS como reivindicado em 41 e 48 e ainda caracterizado pelo fato de que os peptídeos podem ser obtidos por síntese química.
50. ÁCIDO NUCLÉICO útil no procedimento da cláusula 41, caracterizado pelo fato de que consiste essencialmente uma seqüência que codifica esse imunógeno.
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