ES2557931T3

ES2557931T3 - (7H-Pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazinas como inhibidores de cinasas para el tratamiento de cáncer e inflamación

Info

Publication number: ES2557931T3
Application number: ES08782684.8T
Authority: ES
Inventors: Bryce Alden Harrison; Spencer David Kimball; Ross Mabon; David Brent Rawlins; Dennis S. Rice; Michael Victor Voronkov; Yulian Zhang
Original assignee: Lexicon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Lexicon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-08-08
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2016-01-29
Anticipated expiration: 2028-08-08
Also published as: CA2695857A1; WO2009021169A3; US20090042893A1; JP2010535813A; AU2008285388B2; DK2188289T3; EP2188289A2; EP2188289B1; HUE025788T2; PL2188289T3; JP5406838B2; PT2188289E; AU2008285388A1; WO2009021169A2; CN101772502A; US8507672B2; JP2014040432A; EP2597098A1; CA2695857C

Abstract

Compuesto de fórmula:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: X es O o NRA; A es cicloalquilo, arilo o heterociclilo; R1 es hidrógeno, ORB, N(RB)2, SRB, o alquilo, arilo o heterociclilo; R2 es hidrógeno, halógeno, ciano, ORB, N(RB)2, SRB, alquilo, arilo o heterociclilo; cada R3 es independientemente halógeno, alquilo, o dos R3 pueden tomarse junto con el anillo al que están unidos para proporcionar cicloalquilo o heterociclilo; cada R4 es ciano, halógeno, hidroxilo, nitro, RC, ORC, N(RC)2, NHC(O)RC, C(O)RC, C(O)N(RC)2 o SO2RC; RA es hidrógeno, ciano, nitro, RA1, SO2RA1 o SO2N(RA1)2; cada RA1 es independientemente hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo o heterociclilo, cada R8 es independientemente hidrógeno o alquilo; cada RC es independientemente hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo o heterociclilo; n es 0-8; y m es 0-4; en los que el término "alquilo" significa un hidrocarburo de cadena lineal, ramificado o cíclico que tiene desde 1 hasta 20 átomos de carbono; el término "alquilo" incluye hidrocarburos saturados así como restos alquenilo y alquinilo; el término "alquenilo" significa un hidrocarburo de cadena lineal, ramificado y/o cíclico que tiene desde 2 hasta 20 átomos de carbono y que incluye al menos un doble enlace carbono-carbono; el término "alquinilo" significa un hidrocarburo de cadena lineal, ramificado o cíclico que tiene desde 2 hasta 20 átomos de carbono, y que incluye al menos un triple enlace carbono-carbono.

Description

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El compuesto de 4-hidroxipirrolo[2,3-d]pirimidina resultante se convierte entonces en el compuesto de 4-cloro correspondiente (compuesto 1(a) en el esquema 2, a continuación) usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, West, J. Org. Chem. 26:4959 (1961). Ese compuesto se usa entonces para preparar compuestos de la invención, tal como se muestra a continuación en el esquema 2:

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Esquema 2

Tal como se muestra en el esquema 2, la pirrolopirimidina 1(a) se condensa con una piperazina en condiciones

10 adecuadas (por ejemplo, calentamiento en i-PrOH) para formar la pirrolopirimidina sustituida 1(b). El tratamiento de esta nueva piperazina con un agente de acoplamiento sustituido adecuado (por ejemplo, un isocianato) 1(c) produce el compuesto final. Si se desea, pueden usarse métodos conocidos para transformar ese compuesto en otros diversos englobados por esta invención.

15 5.4. Métodos de uso

Esta invención se refiere a un método de inhibición de LIMK2, que comprende poner en contacto LIMK2 con un potente inhibidor de LIMK2. Potentes inhibidores de LIMK2 preferidos son compuestos de la invención (es decir, compuestos dados a conocer en el presente documento).

20 Una realización particular se refiere a un método de tratamiento, gestión o prevención de una enfermedad o un trastorno inflamatorio en un paciente, que comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la invención.

25 Otra realización se refiere a un método de tratamiento, gestión o prevención de cáncer en un paciente, que comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la invención.

Otra realización se refiere a un método de reducción de la presión intraocular en un paciente, que comprende inhibir

30 la actividad o expresión de LIMK2 en un paciente que lo necesita. En un método, se inhibe la actividad de LIMK2 poniendo en contacto el ojo del paciente con un potente inhibidor de LIMK2. Potentes inhibidores de LIMK2 particulares son de fórmulas I o II. En otro método, se inhibe la expresión de LIMK2 administrando al ojo del paciente un compuesto (por ejemplo, un ARNip) que inhibe la expresión de LIMK2.

35 Otra realización se refiere a un método de tratamiento, gestión o prevención de enfermedades o trastornos que afectan a la visión en un paciente, que comprende inhibir la actividad o expresión de LIMK2 en un paciente que lo necesita. En un método, se inhibe la actividad de LIMK2 poniendo en contacto el ojo del paciente con un potente inhibidor de LIMK2. Potentes inhibidores de LIMK2 particulares son de fórmulas I o II. En otro método, se inhibe la expresión de LIMK2 administrando al ojo del paciente un compuesto (por ejemplo, un ARNip) que inhibe la expresión

40 de LIMK2. Las enfermedades y los trastornos que afectan a la visión incluyen glaucoma, enfermedades

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formaciones susceptibles a la oxidación. Los antioxidantes adecuados incluyen ácido etilendiaminotetraacético, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y tiourea.

6. Ejemplos

5 Pueden entenderse aspectos de esta invención a partir de los siguientes ejemplos, que no limitan su alcance. En la medida en que los ejemplos se refieran a compuestos fuera del alcance de las reivindicaciones, se incluirán como ejemplos de referencia. Por tanto, todos los compuestos en el presente documento tras los “ejemplos” nombrados no son ejemplos de la invención reivindicada excepto el ejemplo 13.

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6.1. Ejemplo 1: (S)-N-(3-Bromo-4-fluorofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboxamida

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15 Se preparó el compuesto del título en varias etapas.

A. Preparación de (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo. Se añadieron (S)-2-metilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo (3 g, 15 mmol), N,N-diisopropiletilamina (3 ml) y 4-cloro-5

20 metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (2 g, 12 mmol) a isopropanol (10 ml). Se calentó la disolución a 120ºC en un tubo de presión sellado durante 12 horas. Se concentró la reacción a vacío, y se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (80 g de SiO2, MeOH al 0-5%: CH2Cl2, 50 min) para dar (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin4-il)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo limpio (1,5 g, 4,5 mmol, 38%).

25 1H-RMN (400 MHz, cloroformo-d)  ppm 10,42 (s. a., 1H), 8,39 (s, 1H), 6,96 (s, 1H), 4,40 (d, J=6,06 Hz, 1H), 3,834,01 (m, 2H), 3,43 (td, J=12,57, 3,41 Hz, 1H), 3,32 (4d, J=12,76, 3,92 Hz, 1H), 3,07 (td, J=12,32, 3,41 Hz, 1H), 2,44 (s, 3H), 1,50 (s, 9H), 1,24 (d, J=6,82 Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 332.

B. Preparación de (S)-5-metil-4-(3-metilpiperazin-1-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina. Se añadió la piperazina protegida

30 con Boc de la etapa A (1,5 g, 4,5 mmol) a una mezcla 1:1 de ácido trifluoroacético y diclorometano (10 ml). Se agitó la reacción durante la noche, luego se concentró a vacío, se diluyó con diclorometano y se neutralizó con bicarbonato de sodio ac. sat. Se separaron las fases, y se sometió a retroextracción la fase acuosa con más diclorometano. Se secaron sobre MgSO4 las fracciones orgánicas combinadas y se concentraron a vacío para dar (S)-5-metil-4-(3-metilpiperazin-1-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (0,80 g, 3,5 mmol, 76%).

35 1H-RMN (400 MHz, MeOD)  ppm 8,24 (s, 1H), 7,05 (d, J=1,01 Hz, 1H), 3,97-4,04 (m, 2H), 3,00-3,14 (m, 4H), 2,74 (dd, J=12,88, 10,36 Hz, 1H), 2,45 (d, J=1,01 Hz, 3H), 1,19 (d, J=6,32 Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 232.

C. Preparación de (S)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1

40 carboxamida. A una disolución de trifosgeno (0,30 g, 1 mmol) en CH2Cl2 (70 ml) a -5ºC se le añadieron 3-bromo-4fluoroanilina (0,19 g, 1 mmol) en CH2Cl2 (20 ml) y trietilamina (0,60 ml, 4,3 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 20 min, luego se añadió (S)-5-metil-4-(3-metilpiperazin-1-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina de la etapa B (0,23 g, 1 mmol) en CH2Cl2 (30 ml). Se agitó la mezcla durante 1,5 horas, luego se concentró a vacío. Se purificó el residuo mediante HPLC prep. para proporcionar (S)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3

45 d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxamida (65 mg) como un sólido blanco.

1H-RMN (400 MHz, metanol-d4)  ppm 8,36 (s, 1H), 7,74 (dd, J=6,3, 2,5 Hz, 1H), 7,35 (dd, J=8,9, 4,2, 2,6 Hz, 1H), 7,24 (d, J=1,0 Hz, 1H), 7,13 (t, J=8,7 Hz, 1H), 4,55-4,62 (m, 1H), 4,33-4,41 (m, 1H), 4,18 (dd, J=13,0, 1,3 Hz, 1H), 4,04-4,12 (m, 1H), 3,85 (dd, J=13,0, 4,0 Hz, 1H), 3,57-3,68 (m, 2H), 2,49 (d, J=1,0 Hz, 3H), 1,28 (d, J=6,8 Hz, 3H);

50 EM (ES+) [M+H]+ = 447,3.

6.2. Ejemplo 2: (S)-Dimetilcarbamato de 3-(2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1

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6.7. Ejemplo 7: (S)-N’-Ciano-N-(3-fluorofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida

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5 Se añadieron N’-ciano-N-(3-fluorofenil)carbamimidato de fenilo, preparado de manera análoga a N-3-clorofenil-N’cianocarbamimidato de fenilo del ejemplo 6, etapa A, (0,55 g, 2,2 mmol), (S)-5-metil-4-(3-metilpiperazin-1-il)-7Hpirrolo[2,3-d]pirimidina, del ejemplo 1, etapa B, (0,50 g, 2,2 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1 ml) a acetonitrilo (10 ml). Se calentó la mezcla a 85ºC en un tubo de presión sellado durante 4 horas. Se evaporó el disolvente, y se

10 purificó el residuo mediante HPLC prep. (columna Sunfire C18 30x250 mm, MeCN al 10-100%: H2O (NH4OAc 10 mM), 18 min, 45 ml/min) para dar (S)-N’-ciano-N-(3-fluorofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4il)piperazin-1-carboximidamida (0,23 g, 0,58 mmol, 27%).

1H-RMN (400 MHz, MeOD)  ppm 8,28 (s, 1H), 7,31-7,49 (m, 1H), 7,08 (d, J=1,01 Hz, 1H), 6,89-7,02 (m, 2H), 4,63

15 4,74 (m, 1H), 4,20 (d, J=13,14 Hz, 1H), 4,06 (d, J=13,39 Hz, 1H), 3,97 (d, J=11,12 Hz, 1H), 3,67-3,86 (m, 1H), 3,54 (dd, J=13,14, 3,79 Hz, 1H), 3,38 (s. a., 2H), 3,18-3,29 (m, 1H), 2,50 (d, J=1,01 Hz, 2H), 1,39 (d, J=6,57 Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 393.

6.8. Ejemplo 8: (S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]-pirimidin-4-il)-N-(3-(trifluorometil)fenil) 20 piperazin-1-carboximidamida

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Se combinaron N’-ciano-N-(3-(trifluorometil)fenil)carbamimidato de fenilo, preparado de manera análoga a N’

25 cianocarbamimidato de N-3-bromofenilo del ejemplo 5, etapa A (36 mg, 0,12 mmol)), (S)-5-metil-4-(3-metilpiperazin1-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina, del ejemplo 1, etapa B, (35 mg, 0,15 mmol) y trietilamina (0,05 ml, 0,36 mmol) en isopropanol en un recipiente para microondas. Se calentó la reacción a 140ºC durante 30 min en condiciones de microondas. Se evaporó el disolvente, y se lavó el residuo con CH2Cl2 (3 x 10 ml). Se purificó el producto en bruto mediante HPLC prep. para proporcionar (S)-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3

30 (trifluorometil)fenil)-piperazin-1-carboximidamida como un sólido blanco.

1H (CD3OD):  1,349-1,6 (3H, J = 6,4 Hz, d), 2,028-2,054 (ancho, N-H); 3,515-3,547 (1H, m), 3,611-3,736 (2H, m), 4,059-4,092 (1H, J = 13,2 Hz, d), 4,561-4,595 (1H, J = 13,6 Hz, d), 4,643-4,706 (2H, m) 6,70 (1H, s), 7,19 (1H, s), 7,428-7,449 (2H, m),7,549-7,588 (2H, m), 8,203 (1H, s, ancho); EM (ES+) [M+H]+ = 429.

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6.9. Ejemplo 9: (S)-N-(3-Bromo-4-fluorofenil)-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4il)piperazin-1-carboximidamida

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Se preparó el compuesto del título de la misma manera que (S)-N-(3-clorofenil)-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H5 pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida del ejemplo 6.

1H-RMN (400 MHz, MeOD)  ppm 8,23 (s, 1H), 7,42 (dd, J=5,8, 2,5 Hz, 1H), 7,13-7,24 (m, 2H), 7,04 (s, 1H), 4,62 (s. a., 1H), 4,16 (d, J=13,1 Hz, 1H), 4,03 (d, J=13,4 Hz, 1H), 3,92 (d, J=13,1 Hz, 1H), 3,63-3,73 (m, 1H), 3,49 (dd, J=13,0, 3,7 Hz, 1H), 3,21 (td, J=12,4, 3,3 Hz, 1H), 2,45 (s, 3H), 1,33 (d, J=6,6 Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 471, 473.

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6.10. Ejemplo 10: N-(3-Bromofenil)-N’-ciano-2,5-dimetil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida

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A. Preparación de 4-(2,5-dimetilpiperazin-1-il)-5-metil-7H-pirrolo[2,3-dlpirimidina. Se añadieron trans-2,5-dimetilpiperazina (1 g, 8,8 mmol), N,N-diisopropiletilamina (1ml) y 4-cloro-5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (2 g, 11,9 mmol) a isopropanol (10 ml). Se calentó la disolución en un microondas a 150ºC durante 6 horas, luego se concentró a vacío. Se purificó el material mediante HPLC prep. (columna Sunfire C18 30x250 mm, MeCN al 10

20 100%: H2O (NH4OAc 10 mM), 18 min, 45 ml/min.) para dar 4-(trans-2,5-dimetilpiperazin-1-il)-5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidina (0,30 g, 14%).

1H-RMN (400 MHz, cloroformo-d)  ppm 8,49 (s, 1H), 6,95 (s, 1H), 3,62-3,70 (m, 1H), 3,46-3,57 (m, 1H), 3,20-3,27 (m, 1H), 2,95 (q, J=7,41 Hz, 1H), 2,81 (dd, J=12,63, 9,60 Hz, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,31 (d, J=6,82 Hz, 3H), 1,15 (t,

25 J=6,57 Hz, 4H); EM (ES+) [M+H]+ = 246.

B. Preparación de N-(3-bromofenil)-N’-ciano-2,5-dimetil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: Se añadieron la dimetilpiperazina de la etapa A (80 mg, 0,32 mmol), N-3-bromofenil-N’cianocarbamimidato de fenilo, del ejemplo 5, etapa A, (100 mg, 0,32 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (0,20 ml) a

30 isopropanol (10 ml). Se calentó la mezcla a 150ºC durante 20 min en un microondas, luego se concentró a vacío. Se purificó el material mediante HPLC prep. (columna Sunfire C18 30x250 mm, MeCN al 10-100%: H2O (NH4OAc 10 mM), 18 min, 45 ml/min) para dar (E)-N-(3-bromofenil)-N’-ciano-2,5-dimetil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4il)piperazin-1-carboximidamida (29 mg, 0,062 mmol), 19%).

35 1H-RMN (400 MHz, MeOD)  ppm 8,21 (s, 1H), 7,23-7,32 (m, 3H), 7,08-7,15 (m, 1H), 7,02 (s, 1H), 4,60 (s. a., 2H), 3,85 (d, J=2,53 Hz, 3H), 3,63 (d, J=12,38 Hz, 1H), 2,43 (s, 3H), 1,26 (d, J=6,82 Hz, 3H), 1,18 (d, J=6,57 Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 469.

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misma manera que (S)-dimetilcarbamato de 3-(2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboxamido)fenilo del ejemplo 2.

1H-RMN (CD3OD):  8,28 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,36-7,54 (m, 3H), 7,31 (s, 1H), 4,57-4,59 (m, 1H), 4,43-4,46 (d, J = 9 5 2Hz, 1H), 4,18-4,24 (m, 2H), 4,04-4,08 (d, J = 16Hz, 1H), 3,62-3,68 (m, 1H), 3,44-3,48 (m, 1H), 3,19-3,23 (m, 1H), 1,33-1,38 (d, J = 4Hz, 3H), 1,26-1,27 (d, J = 4Hz, 6H). EM (ES+) [M+H]+ = 456.

6.17. Ejemplo 17: N-(3-Bromofenil)-N’-ciano-2-metil-4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida

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Se preparó el compuesto del título a partir de 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina mediante el mismo procedimiento que (S)-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(trifluorometil)fenil)piperazin-115 carboximidamida del ejemplo 8.

1H-RMN (CD3OD):  8,18 (s, 1H), 7,05-7,35 (m, 5H), 6,66 (s, 1H), 4,51-4,74 (m, 3H), 3,98-4,09 (m, 1H), 3,35-3,74 (m, 3H), 1,32-1,33 (d, J = 4Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 441.

20 6.18. Ejemplo 18: (S)-4-(5-Ciano-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(isopropilcarbamoil)fenil)-2metilpiperazin-1-carboxamida

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25 A. Preparación de 5-bromo-4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina. A una disolución de 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (1,2 g, 7,8 mmol) en CH2Cl2 (25 ml) se le añadió N-bromoacetamida (1,186 g, 8,6 mmol) en CH2Cl2 (25 ml). Se calentó la mezcla a la temperatura de reflujo durante 40 min, luego se enfrió hasta temperatura ambiente y se concentró a vacío para dar un sólido blanquecino. Se añadió agua fría (40 ml) al sólido, que luego se recogió mediante filtración, se lavó con agua fría (5 ml) y se secó a vacío. Se recristalizó el producto en una cantidad mínima

30 de isopropanol para producir 5-bromo-4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina pura (1,475 g, 81,5%).

1H-RMN (CD3OD):  8,572 (s, 1H), 7,665 (s, 1H); EM (ES+) [M+H]+ = 232.

B. Preparación de 5-bromo-4-cloro-7-fenilsulfonil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina. A una suspensión de 5-bromo-4-cloro

35 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina de la etapa A (1,17 g, 5 mmol) en DMF (10 ml) a 0ºC, se le añadió NaH (al 60% en aceite mineral, 0,28 g, 7 mmol). Tras agitar 15 min, se añadió cloruro de bencenosulfonilo (0,64 ml, 5 mmol). Se calentó la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas, dando como resultado la precipitación de un sólido blanco. Se añadió más DMF (5 ml), y se extinguió la reacción con 10 ml de agua. Se recogió el sólido

mediante filtración y se secó a vacío para proporcionar 5-bromo-4-cloro-7-(fenilsulfonil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (1,62 g, 4,35 mmol, 87%) como un sólido blanco, con la que se continuó sin purificación adicional. EM (ES+) [M+H]+ = 373.

5 C. Preparación de (S)-5-bromo-4-(3-metilpiperazin-1-il)-7-(fenilsulfonil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina. A una mezcla de pirrolopirimidina de la etapa B (76 mg, 0,2 mmol) y (S)-2-metilpiperazina (21 mg, 0,2 mmol) en isopropanol (2 ml) se le añadió trietilamina (0,11 ml, 0,8 mmol). Se calentó la mezcla a 80ºC durante 5 min por medio de microondas y se concentró a vacío para dar (S)-5-bromo-4-(3-metilpiperazin-1-il)-7-(fenilsulfonil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina en bruto (65 mg, 0,15 mmol, 75%) que se usó directamente para la siguiente etapa. EM (ES+) [M+H]+ = 437.

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D. Preparación de (S)-4-(5-bromo-7-(fenilsulfonil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(isopropilcarbamoil)fenil)-2metilpiperazin-1-carboxamida. A una disolución de trifosgeno (15 mg, 0,05 mmol) en THF (1 ml) a 0ºC bajo N2 se le añadió gota a gota una disolución de 3-amino-N-isopropilbenzamida (25 mg, 0,14 mmol) y trietilamina (43 l, 0,3 mmol) en THF (1 ml). Se agitó la mezcla durante 15 min a 0ºC y otros 15 min a temperatura ambiente. Se añadió

15 la piperazina de la etapa C (65 mg, 0,14 mmol) en THF (1 ml), y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante la noche, luego se extinguió con MeOH y K2CO3 (97 mg, 0,70 mmol) y se filtró. Se concentró la disolución a vacío y se purificó mediante HPLC prep. para dar (S)-4-(5-bromo-7-(fenilsulfonil)-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-N-(3-(isopropilcarbamoil)fenil)-2-metilpiperazin-1-carboxamida (70 mg, 0,11 mmol, 77%). EM (ES+) [M+H]+ = 641.

20

E. Preparación de (S)-4-(5-ciano-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(isopropilcarbamoil)fenil)-2-metilpiperazin-1carboxamida. A una disolución de (S)-4-(5-bromo-7-(fenilsulfonil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3(isopropilcarbamoil)-fenil)-2-metilpiperazin-1-carboxamida de la etapa D (70 mg, 0,11 mmol) en DMF (2 ml) se le añadió Zn(CN)2 (26 mg, 0,22 mmol) y Pd(PPh3)4 (13 mg, 0,011 mmol). Se calentó la mezcla a 150ºC durante 3 min

25 por medio de microondas, se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró a través de un lecho de Celite. Se concentró la disolución a vacío, y se trató el residuo con NaOH y MeOH durante 2 h. Se purificó el producto mediante HPLC prep. para obtener (S)-4-(5-ciano-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(isopropilcarbamoil)fenil)-2metilpiperazin-1-carboxamida como un sólido blanco.

30 1H-RMN (CD3OD):  8,37 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,32-7,61 (m, 3H), 4,52-4,65 (m, 2H), 4,30-4,42 (m, 1H), 4,18-4,16 (m, 1H), 4,02-4,13 (m, 1H), 3,57-3,76 (m, 2H), 3,38-3,47 (m, 1H), 1,31-1,33 (d, J= 8Hz, 3H), 1,26-1,28 (d, J = 8Hz, 6H); EM (ES+) [M+H]+ = 447.

6.19. Ejemplo 19: (S)-N-(3-Bromofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N’35 (metilsulfonil)piperazin-1-carboximidamida

imagen22

A. Preparación de metilsulfonilcarbonimidato de difenilo.

40 Se disolvieron diclorodifenoximetano (2 g, 7,46 mmol) y metilsulfonamida (1,56 g, 16,41 mmol) en EtOAc (15 ml) y se calentaron a reflujo durante 12 horas. Se permitió que la mezcla se enfriase y se concentró a vacío. La purificación de la mezcla en bruto mediante cromatografía ultrarrápida (EtOAc al 20%/hexanos) proporcionó metilsulfonilcarbonimidato de difenilo (0,75 g, 2,59 mmol, 35%).

45 1H-RMN (400 MHz, cloroformo)  ppm 7,38-7,43 (m, 4H), 7,30 (m, 2H), 7,21 (m, 4H), 3,01 (s, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 292.

B. Preparación de N-3-bromofenil-N’-(metilsulfonil)carbamimidato de fenilo.

50 Se disolvieron metilsulfonilcarbonimidato de difenilo de la etapa A (0,75 g, 2,59 mmol) y 3-bromoanilina (0,28 ml,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2,59 mmol) en acetonitrilo (5 ml) y se calentaron hasta 70ºC durante 12 horas. Se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se concentró a vacío. La purificación mediante cromatografía ultrarrápida (EtOAc al 30%/hexanos) proporcionó N-3-bromofenil-N’-(metilsulfonil)carbamimidato de fenilo (0,50 g, 1,35 mmol, 52%).

1H-RMN (400 MHz, cloroformo)  ppm 9,2 (s, 1H), 7,54 (m, 1H), 7,40 (m, 3H), 7,26 (m, 2H), 7,13 (m, 2H), 2,96 (s, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 369, 371.

C. Preparación de (S)-N-(3-bromofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N’-(metilsulfonil)piperazin-1carboximidamida. Se combinaron el carbamimidato de la etapa B (100 mg, 0,27 mmol), (S)-5-metil-4-(3metilpiperazin-1-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina, del ejemplo 1, etapa B (63 mg, 0,27 mmol) y trietilamina (77 l, 0,27 mmol) en MeCN (1,5 ml) y se calentaron a reflujo durante 2 horas. Se concentró la mezcla y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar (S)-N-(3-bromofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)N’-(metilsulfonil)piperazin-1-carboximidamida.

1H-RMN (400 MHz, metanol)  ppm 8,19 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,16 (m, 1H), 7,01 (s, 1H), 4,46 (m, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,78 (m, 2H), 3,52 (m, 1H), 3,40 (m, 1H), 3,08 (m, 1H), 2,98 (s, 3H), 2,39 (d, J= 1,0Hz, 3H), 1,26 (d, J = 6,8Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 506, 508.

6.20. Ejemplo 20: (S)-N-(3-Bromofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N’-sulfamoilpiperazin1-carboximidamida

imagen23

A. Preparación de sulfamoilcarbonimidato de difenilo. Se disolvieron diclorodifenoximetano (1 g, 3,72 mmol) y sulfamida (0,72 g, 7,44 mmol) en MeCN (10 ml) y se agitaron a temperatura ambiente durante 18 horas. Se concentró la mezcla a vacío y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (EtOAc al 20-40%/hexanos) para proporcionar sulfamoilcarbonimidato de difenilo (0,69 g, 2,34 mmol, 63%) como un aceite incoloro.

1H-RMN (400 MHz, metanol)  ppm 7,43-7,47 (m, 4H), 7,24-7,33 (m, 6H); EM (ES+) [M+H]+ = 293.

B. Preparación de N-3-bromofenil-N’-sulfamoilcarbamimidato de fenilo. Se disolvieron sulfamoilcarbonimidato de difenilo, de la etapa A, (0,05 g, 0,17 mmol) y 3-bromoanilina (18 l, 0,17 mmol) en acetonitrilo (0,5 ml) y se calentaron hasta 70ºC durante 12 horas. Se concentró la reacción a vacío para proporcionar N-3-bromofenil-N’sulfamoilcarbamimidato de fenilo, con el que se continuó en bruto en la siguiente reacción.

C. Preparación de (S)-N-(3-bromofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N’-sulfamoil-piperazin-1carboximidamida. Se combinaron carbamimidato en bruto de la etapa B (25 mg, 0,068 mmol), (S)-5-metil-4-(3metilpiperazin-1-il)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina, del ejemplo 1, etapa B (16 mg, 0,68 mmol) y trietilamina (10 l, 0,068 mmol) en MeCN (0,5 ml) y se calentaron hasta 70ºC durante 2 horas. Se concentró la mezcla y se purificó mediante HPLC preparativa para proporcionar (S)-N-(3-bromofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)N’-sulfamoil-piperazin-1-carboximidamida (4 mg, 0,0075 mmol, 11%) como un sólido blanco.

1H-RMN (400 MHz, metanol)  ppm 8,19 (s, 1H), 7,31 (m, 1H), 7,20 (m, 1H), 7,11-7,15 (m, 2H), 7,07 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,76 (m, 2H), 3,47 (m, 1H), 3,35 (m, 1H), 3,05 (m, 1H), 2,39 (d, J = 1,0 Hz, 3H), 1,25 (d, J = 6,8 Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 507, 509.

6.21. Ejemplo 21: (S)-N-(3-bromofenil)-N-(N-((dimetilamino)metilen)sulfamoil)-2-metil-4-(5-metil7Hpirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida

imagen24

Se disolvió (S)-N-(3-bromofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N’-sulfamoilpiperazin-1carboximidamida en bruto del ejemplo 20, etapa C, (25 mg, 0,068 mmol) en MeOH (0,5 ml) y se añadió

5 dimetilacetal de N,N-dimetilformamida (7 l). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se concentró. Se purificó la mezcla mediante HPLC preparativa para proporcionar el compuesto deseado (5 mg, 0,0088 mmol, 13%) como un sólido blanco.

1H-RMN (400 MHz, metanol)  ppm 8,19 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,28 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 7,01 (s, 1H), 4,48 (m, 1H),

10 4,03 (m, 1H), 3,79 (m, 2H), 3,49 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,05 (m, 1H), 2,97 (s, 3H), 2,86 (s, 3H), 2,39 (d, J= 1,0Hz, 3H), 1,25 (d, J = 6,8Hz, 3H); EM (ES+) [M+H]+ = 562, 564.

6.22. Ejemplo 22: 4-Fluoro-N-(3-(2-(4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-il)-2oxoetil)fenil)benzamida

15

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A. Preparación de 2-(3-nitrofenil)-1-(piperazin-1-il)etanona. Se añadió cloruro de 2-(3-nitrofenil)acetilo (0,20 ml, 1,0 mmol) a una mezcla con agitación vigorosa de piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (0,19 g, 1,0 mmol) en CH2Cl2

20 (2 ml) y NaHCO3 ac. sat. (1 ml). Se agitó la reacción durante 1 hora; luego se separó la fase orgánica, se filtró a través de una capa de MgSO4 y se concentró a vacío. Se trató el residuo con TFA en CH2Cl2 para eliminar el grupo Boc para dar 2-(3-nitrofenil)-1-(piperazin-1-il)etanona, con la que se continuó en bruto.

B. Preparación de 1-(4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-il)-2-(3-nitrofenil)etanona. Se combinaron 2

25 (3-nitrofenil)-1-(piperazin-1-il)etanona de la etapa A (0,32 g, 0,9 mmol), 4-cloro-5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (0,168 g, 1,0 mmol) y diisopropiletilamina (0,1 ml) en isopropanol y se calentaron a 80ºC durante 24 horas. Se aisló el producto mediante HPLC prep. para dar 1-(4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-il)-2-(3nitrofenil)etanona.

30 C. Preparación de 4-fluoro-N-(3-(2-(4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-il)-2-oxoetil)fenil)benzamida. A una disolución de 1-(4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-il)-2-(3-nitrofenil)etanona de la etapa B (0,13 g, 0,3 mmol) en isopropanol (2 ml) se le añadió SnCl2 (0,19 g, 1 mmol) y 1 gota de HCl ac. concentrado. Se calentó la reacción a reflujo durante 2 horas, y se aisló el producto de anilina mediante procedimientos convencionales. Se disolvió una parte de este material (35 mg, 0,1 mmol) en CH2Cl2 (2 ml) y NaHCO3 ac. sat. (2 ml).

Se añadió gota a gota cloruro de 4-fluorobenzoílo (16 mg, 0,1 mmol) en CH2Cl2 (1 ml) con agitación vigorosa. Se agitó la reacción durante 2 horas, luego se sometió a tratamiento final mediante procedimientos convencionales. Se aisló el producto mediante HPLC prep. seguida por CCF prep. para proporcionar 4-fluoro-N-(3-(2-(4-(5-metil-7Hpirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-il)-2-oxoetil)fenil)benzamida. EM (ES+) [M+H]+ = 473.

5

6.23. Compuestos adicionales

Se prepararon compuestos adicionales usando métodos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica. Algunos de esos compuestos se enumeran a continuación con sus masas observadas. Se incluyen

10 compuestos que se encuentran fuera del alcance de las presentes reivindicaciones como ejemplos de referencia únicamente. Por tanto ninguno de los compuestos enumerados a continuación en el presente documento es según la invención.

Tabla 1 15

Compuesto: (M+H)+

(2S)-N-(Biciclo[2.2.1]heptan-2-il)-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 393,2

Éster isobutílico del ácido (3-{[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carbonil]-amino}-fenil)-carbámico: 466

(3-Bromo-fenilamino)-[(R)-2-terc-butoximetil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]metil-cianamida: 528

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido (R)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 431

(R)-N-(3-Bromofenil)-N’-ciano-2-(hidroximetil)-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 470

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 429; 431

[3-(4-Fluoro-fenoxi)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 461

(3-Cloro-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 385

(3-Fluoro-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 369

(3-Ciano-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 376

(2-Bromo-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 429, 431

o-Tolilamida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 365

(4-Bromo-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 431

m-Tolilamida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 365

[3-(Morfolino-4-carbonil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 464,2

[3-(2-Dimetilamino-etilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 465

(3-Isopropilcarbamoil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 436

(3-Isopropilsulfamoil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 472

[3-(2-Hidroxi-etilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 438,1

[3-(1-Metil-piperidin-4-ilsulfamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 527,1

(3-Metoxi-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 381

[3-((S)-2-Hidroxi-1-metil-etilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 452,3

[3-((R)-2-Hidroxi-1-metil-etilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 452,2

(3-Ciclopropilsulfamoil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 470,1

[3-(2-Hidroxi-1-hidroximetil-etilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 468

(3-Ciclopropilcarbamoil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 434

(3-Dimetilcarbamoilmetoxi-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 452

[3-(1-Metil-piperidin-4-ilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 491,1

(3-Isopropoxi-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 409

[3-(2-Dimetilamino-etoxi)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 438

[3-(2-Hidroxi-1-hidroximetil-etilsulfamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 504,1

[3-(3-Dimetilamino-propionilamino)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 465

[3-(3-Metil-butirilamino)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 450

{3-[(Tetrahidro-furano-2-carbonil)-amino]-fenil}-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 464

[3-(4-Dimetilamino-butirilamino)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin4-il)-piperazin-1-carboxílico: 479

{3-[2-(3-Butil-ureido)-acetilamino]-fenil}-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 522

{3-[(Furano-2-carbonil)-amino]-fenil}-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4il)-piperazin-1-carboxílico: 460

{3-[2-(Piridin-4-ilsulfanil)-acetilamino]-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 517

[3-(2-Amino-acetilamino)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 423

(4-Metoxi-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 381

[4-(2-Dimetilamino-etilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 465

{3-[(4-Metil-piperazin-1-carbonil)-amino]-fenil}-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 492

(4-Etilcarbamoil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 422

[4-(2-Hidroxi-etilcarbamoil)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 438

{3-[3-(4-Cloro-butil)-3-metil-ureido]-fenil}-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 514

(4-Carbamoil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 394

[4-(3-Dimetilamino-propionilamino)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 465

(3-Aminometil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 380,1

(4-Aminometil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 380,2

(3-Dimetilaminometil-fenil)-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico ácido: 408,3

[4-(3,3-Dimetil-ureido)-fenil]-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 437

{3-[((S)-2-Oxo-tiazolidin-4-carbonil)-amino]-fenil-amida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 495

Piridin-3-ilamida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 352,1

Piridin-4-ilamida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 352,2

Tiazol-2-ilamida del ácido (S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 358,2

(S)-3-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)-Nisopropilbenzamida: 460,1

Ácido (S)-3-(N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamido)benzoico: 419,1

(S)-3-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)-Netilbenzamida: 446,1

(S)-3-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)-N-(2hidroxietil)benzamida: 462,1

(S)-3-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)-N-(2(dimetilamino)etil)benzamida: 489,2

(S)-3-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)-N-(2morfolinoetil)benzamida: 531,1

(S)-3-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)-N-(2(pirrolidin-1-il)etil)benzamida: 515,1

(S)-4-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamido)benzamida: 418

(S)-5-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)-2-fluoroN-(2-hidroxietil)benzamida: 480

(S)-3-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)benzoato de metilo: 433,1

(S)-N-((trans)-4-Aminociclohexil)-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 396,3

(S)-N-(3-terc-Butilfenil)-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 431,2

(S)-N-Adamantil-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida: 433,2

(S)-N-Bencil-N’-ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida: 389,1

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]-pirimidin-4-il)-N-(3-(trifluorometil)fenil)piperazin-1carboximidamida: 443

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(metiltio)fenil)piperazin-1carboximidamida: 421

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(piridin-3-il)piperazin-1carboximidamida: 376,2

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-p-tolilpiperazin-1-carboximidamida: 389,2

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(4-metilciclohexil)piperazin-1carboximidamida: 395,2

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2-,3-d]pirimidin-4-il)-N-(piperidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 382

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(piridin-2-ilmetil)piperazin-1carboximidamida: 390

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(1-metilpiperidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 396

(S)-N-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-fenilpiperazin-1-carboximidamida: 375

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(morfolin-4-carbonil)fenil)piperazin1-carboximidamida: 488,2

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(N-(2morfolinoetil)sulfamoil)fenil)piperazin-1-carboximidamida: 567,2

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-(N-(1-metilpiperidin-4il)sulfamoil)fenil)piperazin-1-carboximidamida: 551,1

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)piperazin-1carboximidamida: 383,1

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(3-oxo-1,3-dihidroisobenzofuran-5il)piperazin-1-carboximidamida: 431

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(piridin-4-ilmetil)piperazin-1carboximidamida: 390,1

(S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-(piridin-3-ilmetil)piperazin-1carboximidamida: 390,2

(S)-N’-Ciano-N-((trans)-4-hidroxiciclohexil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 397,1

(S)-N’-ciano-N-(3-((dimetilamino)metil)fenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin1-carboximidamida: 432,3

(S)-N’-Ciano-N-(3-(4-fluorofenoxi)fenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamina: 485,1

(S)-N’-Ciano-N-(3-(N-(2-(dimetilamino)etil)sulfamoil)fenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin4-il)piperazin-1-carboximidamida: 525,1

(S)-N’-Ciano-N-(3-(N-(2-hidroxietil)sulfamoil)fenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4il)piperazin-1-carboximidamida: 498,1

(S)-N’-Ciano-N-(3-(N-isopropilsulfamoil)fenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin1-carboximidamida: 496,1

(S)-N’-Ciano-N-(3-cianofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 400

(S)-N’-Ciano-N-(3-isopropilfenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 417,1

(S)-N’-Ciano-N-(4-((dimetilamino)metil)fenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin1-carboximidamida: 432,2

(S)-N’-Ciano-N-(4-fluoro-3-metilfenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 407,2

(S)-N’-Ciano-N-(4-fluorofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 393

(S)-N’-Ciano-N-(4-fluorofenil)-3-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 393

(S)-N’-ciano-N-(4-metoxifenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 405

(S)-N’-ciano-N,N-bis(2-hidroxietil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida

(S)-N’-ciano-N-ciclopropil-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida: 339

(S)-3-((S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamido)pirrolidin-1-carboxilato de terc-butilo: 468

(S)-4-(N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)piperidin1-carboxilato de terc-butilo: 382

Éster terc-butílico del ácido [(3-{[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carbonil]-amino}-fenilcarbamoil)-metil]-carbámico: 523

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido 2,5-dimetil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 445

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido 2,6-dimetil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 443; 445

[3-(4-Fluoro-fenoxi)-fenil]-amida del ácido 2,6-dimetil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboxílico: 475

2-[3-(4-Fluoro-fenoxi)-fenil]-1-[4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-etanona: 446,1

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido 2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 429

3-({[(E)-Etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-metil}amino)-N-isopropil-benzamida: 527

Éster metílico del ácido 3-({[(E)-etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4il)-piperazin-1-il]-metil}-amino)-benzoico: 500

3-({[(E)-Etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-metil}amino)-N-piridin-4-il-benzamida: 562

3-({[(E)-Etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-metil}amino)-N-etil-benzamida: 513

3-({[(E)-Etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-metil]amino)-benzamida: 485

3-({[(E)-Etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-metil}amino)-N-fenil-benzamida: 561

3-({[(E)-Etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-metil}amino)-N-(1-metil-piperidin-4-il)-benzamida: 582

3-({[(E)-Etanosulfonilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-metil}amino)-N-(2-morfolin-4-il-etil)-benzamida: 598

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido 3-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-3,8-diazabiciclo[3.2.1]octano-8-carboxílico: 442,9

(4-Fluoro-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carbotioico: 371,2

Piridin-3-ilamida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carbotioico: 354

[3-(4-Fluoro-fenoxi)-fenil]-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 447

(3-Bromo-4-fluoro-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 435

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 417

(3-Bromo-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 415, 417

(3,4-Difluoro-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 373,1

(4-Fluoro-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 355,2

[4-Fluoro-3-(4-fluoro-fenoxi)-fenil]-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin1-carboxílico: 465,1

(3-Cloro-2-metil-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 385,2

(3-Ciano-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 362,2

(2,3-Dicloro-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 407

(2,3-Dimetil-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 365,1

(3-Cloro-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 371,2

m-Tolilamida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 351,2

(3-Fluoro-4-metil-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1carboxílico: 369

Bifenil-2-ilamida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 413

(3-Metilsulfanil-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 383

[2-(1H-Indol-3-il)-etil]-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 404,2

3-Fluoro-bencilamida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 369

(3,5-Dimetoxi-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 397,05

(3-Metoxi-fenil)-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 367,1

(3-Bromo-fenil)-metil-amida del ácido 4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxílico: 431

4-[(S)-4-(6-Cloro-5-metil-pirimidin-4-il)-3-metil-piperazin-1-il]-5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina: 358,2

4-Fluoro-N-(3-{2-[4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-2-oxo-etil}-fenil)-benzamida: 473,2

Éster 2-(3-{[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carbonil]-amino}benzoilamino)-etílico del ácido acético: 480,1

Éster 3-({[(E)-etanosulfomilimino]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]metil}-amino)-fenílico del ácido dimetil-carbámico: 529

Éster 4-{[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidm-4-il)-piperazin-1-carbonil]-amino}-fenílico del ácido dimetil-carbámico: 438

1-(2-Metil-benzooxazol-5-ilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1il]-met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 497

1-(3-Bromo-fenilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met-(E)ilidenamida del ácido etanosulfónico: 520, 522

1-(3H-Benzoimidazol-5-ilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 482

1-(4-Fluoro-3’-metoxi-fenilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 490

1-(Benzo[1,3]dioxol-5-ilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 486

1-(Benzofuran-5-ilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 482

1-(Bifenil-4-ilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met-(E)ilidenamida del ácido etanosulfónico: 518

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-]-il]-1-(5-metil-tiazol-2-ilamino)-met(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 463

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-[3-(piridin-3-iloxi)-fenilamino]met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 535

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-[3-(morfolin-4-carbonil)fenilamino]-met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 555

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(piridin-3-ilamino)-met-(E)ilidenamida del ácido etanosulfónico: 443

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(tiazol-2-ilamino)-met-(E)ilidenamida del ácido etanosulfónico: 449

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-fenilamino-met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 442

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(3-oxazol-5-il-fenilamino)-met(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 509

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-[3-(2-metil-tiazol-4-il)fenilamino]-met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 539

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(quinolin-7-ilamino)-met-(E)ilidenamida del ácido etanosulfónico: 493

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(quinoxalin-6-ilamino)-met-(E)ilidenamida del ácido etanosulfónico: 494

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(3-trifluorometil-fenilamino)met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 510

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-[4-(3-trifluorometil-fenoxi)fenilamino]-met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 602

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(3,4,5-trimetoxi-fenilamino)met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 532

1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-[3-(morfolin-4-sulfonil)fenilamino]-met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 591

1-[2-(1H-Indol-3-il)-etilamino]-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 509

1-[3-(4-Fluoro-fenoxi)-fenilamino]-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]met-(E)-ilidenamida del ácido etanosulfónico: 552

N-(3-{2-[4-(5-Metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-2-oxoetil}-fenil)-isonicotinamida: 456,2

N-(3-Bromofenil)-2-butil-N’-ciano-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida: 496

N-(3-Bromo-fenil)-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-carboxamidina: 416

N-(3-Bromofenil)-N’-ciano-2-(4-fluorobencil)-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 548

N-(3-Bromofenil)-N’-ciano-2-etil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida: 468

N-(3-Bromofenil)-N’-ciano-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida: 441

N-(3-Bromofenil)-N’-ciano-5-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptano-2carboximidamida: 452,9

N-[1-(3-Bromo-fenilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met(E)-iliden]-bencenosulfonamida: 568, 570

N-[1-(3-Bromo-fenilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-2H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met(E)-iliden]-4-metoxi-bencenosulfonamida: 598, 600

N-[1-[(S)-2-Metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-1-(5-metil-tiazol-2-ilamino)met-(E)-iliden]-bencenosulfonamida: 511

N-[1-Etilamino-]-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met-(E)-iliden]bencenosulfonamida: 442

N-[1-Isopropilamino-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met-(E)iliden]-bencenosulfonamida: 456

1-(3-Bromo-fenilamino)-1-[(S)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-piperazin-1-il]-met-(E)ilidenamida del ácido naftaleno-2-sulfónico: 618, 620

N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)-N-m-tolilpiperazin-1-carboximidamida: 389

N’-Ciano-N-(3-(4-fluorofenoxi)fenil)-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 471

N’-Ciano-N-(3-cianofenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamida: 400

N’-Ciano-N-(3-metoxifenil)-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1carboximidamida: 404

3-((S)-N’-Ciano-2-metil-4-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)piperazin-1-carboximidamido)piperidin1-carboxilato de terc-butilo: 482

6.24. Expresión y purificación de LIMK2

Se expresó LIMK2 usando el sistema de expresión en baculovirus BAC-to-BAC® (Invitrogen). Se preparó

5 baculovirus recombinante según las indicaciones del fabricante expuestas en el manual de instrucciones. En resumen, se transformaron los plásmidos (pFactBac1 o pFastBacHT) que portaban los insertos de LIMK2 en E. coli componente DH10Bac de eficiencia máxima para generar un bácmido recombinante. La cepa huésped de E. coli DH10Bac contiene un vector lanzadera de baculovirus (bácmido) con un sitio diana mini-attTn7 y un plásmido auxiliar, y permite la generación de un bácmido recombinante tras la transposición entre el elemento mini-Tn7 en el

10 vector pFastBac y el sitio diana min-attTn7 en el bácmido. La reacción de transposición se produce en presencia de proteínas de transposición suministradas por el plásmido auxiliar. Se sembraron en placa las células y se escogieron las colonias blancas para el aislamiento de bácmidos tal como se describe en el manual de instrucciones.

Se transfirió el ADN de bácmido aislado a células SF9 para generar un baculovirus recombinante, y se recogió el

15 virus cinco días tras la transfección. Se amplificó el virus en frascos T75 a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,2. Se usó el virus amplificado para infectar células SF9 a una MOI de 5 para la expresión de proteínas.

Para la purificación a pequeña escala de los constructos de LIMK2, se usó un cultivo de 50 ml de células Sf9 infectadas con el baculovirus recombinante. Se recogieron las células mediante centrifugación durante 5 minutos a 20 500 x g. Entonces se resuspendieron las células en tampón de lisis (5 volúmenes por gramo de células). Un tampón de lisis típico contiene lo siguiente: HEPES 50 mM (pH 8,0), KCl 300 mM, glicerol al 10%, NP-40 al 1%, imidazol 15 mM, benzamidina 1 mM e inhibidores de proteasas completos de Roche (1 comprimido por 50 ml de lisado celular). Se lisó la suspensión celular mediante un pase a través de un microfluidizador M-110Y de Microfluidics a una presión de líquido de 14.000 a 20.000 psi seguido por centrifugación del lisado a 60.000 x g durante 15 minutos

25 a 4ºC.

Entonces se cargó directamente el sobrenadante sobre una matriz de cromatografía que contenía ion de cobalto unido covalentemente a ácido nitrilotriacético NTA. Se equilibró la matriz de cromatografía en el mismo tampón que la disolución de carga de proteína. La resina cargada iónicamente tiene normalmente una capacidad de unión 30 equivalente a de 5 a 10 mg de proteína con cola de histidina por ml de resina rellena. La cantidad de extracto que

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Claims

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