ES2549913T3

ES2549913T3 - Métodos de tratamiento de trastornos oculares externos usando agua ácida de alto ORP y composiciones de la misma

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Publication number: ES2549913T3
Application number: ES10743222.1T
Authority: ES
Inventors: Yongge Chen; Roberto Denoni
Original assignee: APR Nanotechnologies SA
Current assignee: APR Nanotechnologies SA
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2010-06-16
Publication date: 2015-11-03
Anticipated expiration: 2030-06-16
Also published as: EP2442818A1; EP2954901A1; US8691289B2; US20100330204A1; EP2442818B1; ZA201200259B; WO2010146460A1; US20140178500A1

Abstract

Composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de agua ácida que tiene un potencial de oxidación reducción (ORP) mayor de 1100 mV para su uso en el tratamiento de una catarata en un paciente animal, en donde la composición es para administración tópica a un ojo de dicho paciente.

Description

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contaminantes tales como especies iónicas en el agua. La expresión "agregado molecular" indica el número de moléculas de agua que están coordinadas en una estructura ordenada.

[0047] En la mayoría de las realizaciones preferentes, la anchura de línea media de RMN 17O para el agua ácida es

5 mayor o igual que 42, 45, 46, o 47, y menor que 100, 75, 60, 56, 53, 51, 50 o 49 Hz, en la que el intervalo se puede seleccionar para cualquiera de los extremos anteriores. De ese modo, por ejemplo, en realizaciones preferentes, el agua ácida de la presente invención tiene una anchura de línea media de RMN que varía de 45 a menos de 51 Hz, o de 45 a menos de 50 Hz, ode 46 a menos de 50Hz.

[0048] El agua ácida también se puede caracterizar por la presencia y la cantidad de especies de cloro en el agua. Se puede usar uno de los siguientes ensayos o cualquier combinación de los siguientes ensayos para caracterizar el agua. De acuerdo con el ensayo de cloro libre (método espectrofotométrico), o el ensayo de cloro total (método espectrofotométrico), el agua se puede definir por contener menos de 85, 70, 60, 55, 52 o incluso 50 mg/l de especies de cloro, opcionalmente limitada por un límite inferior de 20, 30 o 40 mg/l. De acuerdo con el ensayo de

15 cloro total (método yodométrico), el agua se puede definir por contener menos de 80, 70, 65, o incluso 62 mg/l de especies de cloro, opcionalmente limitada por un límite inferior de 20, 30 o 40 mg/l. De acuerdo con el ensayo de cloro de la norma UNI 24012 (método mercurimétrico), el agua puede contener más de 50, 100, 130, 150 o incluso 170 mg/l de cloro, y/o menos de 250 o 200 mg/l. Los cloritos (como ClO2-), cuando se miden mediante EPA 300.1 (1997) (límite de detección de 100 ug/l), son preferentemente no detectables. Los cloratos (ClO3-), cuando se miden mediante EPA 300.1 (1997) (límite de detección de 0,1 mg/l), están presentes preferentemente en una cantidad menor de 10, 5, 2, o incluso 1 mg/l.

[0049] Aunque en ciertas realizaciones el agua ácida puede contener especies de cloro oxidantes en cantidades de hasta 60 o incluso 100 mg/l, en una realización preferente el agua ácida de acuerdo con la invención está

25 básicamente exenta de especies de cloro oxidantes, u otros residuos aniónicos de sales que se generan durante el proceso de electrólisis, es decir, menos de 10 o incluso 5 mg/l, y preferentemente indetectables.

[0050] En una realización particularmente deseable, el agua se puede caracterizar mediante la conductividad, la presencia de cloro gaseoso disuelto (Cl2), ácido hipocloroso (HOCl) e iones cloruro (Cl-), y mediante la presencia de cantidades despreciables de ion hipoclorito (OCl-). En el agua, las cantidades relativas de cloro y ácido hipocloroso se ven fuertemente afectadas por la cantidad de cloruros. Específicamente, un aumento en los cloruros da como resultado un aumento en la cantidad de cloro gaseoso con respecto al ácido hipocloroso según el siguiente equilibrio:

35 Cl-+ H++ HOCl ↔ Cl2+ H2O

[0051] Debido a la relación entre la cantidad de cloruros y las cantidades de cloro gaseoso y ácido hipocloroso, la cantidad de cloruros en el agua es preferentemente muy baja (menos de 200 ppm) para asegurar que el cloro libre en el agua está casi exclusivamente en la forma de ácido hipocloroso.

[0052] La relación entre las cuatro especies Cl2, HOCl, Cl-, y OCl-se puede entender usando los equilibrios de disociación del cloro gaseoso en agua que se describen a continuación, en los que Cl2, HOCl, y OCl-son las tres formas posibles del cloro total libre:

45 Cl2+ H2O = Cl-+ H++ HOCl Ka1≈ 3 x 10-4

HOCl = H+ + OCl-Ka2≈ 2,9 x 10-8

[0053] Como se puede observar en las ecuaciones anteriores, se produce generación de cloro en presencia de un exceso de Cl-. Además, la cantidad de las tres formas de cloro total libre es una función del pH y se puede determinar algebraicamente Cl-mediante el uso de los equilibrios descritos anteriormente como sigue a continuación:

α Cl2 = [H+]2 [Cl-] / ([H+]2 [Cl-] + [H+] Ka1 + Ka1 Ka2)

55 α HClO = [H+] Ka1 / ([H+]2 [Cl-] + [H+] Ka1 + Ka1 Ka2)

α ClO-= Ka1 Ka2 / ([H+]2 [Cl-] + [H+] Ka1 + Ka1 Ka2)

[0054] Estas ecuaciones se pueden usar para simular la concentración de cloro a diferentes valores de pH. Por ejemplo, la Figura 3 es una simulación gráfica de la concentración de diversas especies de cloro en función del pH. Como se puede observar en la Figura 3, para un pH habitual del agua de 2,8-3,0 (indicado por la línea de puntos y guiones de color verde), el cloro libre está presente principalmente en forma de Cl2 y HClO, y la cantidad relativa de las dos especies se ve fuertemente afectada por la cantidad de cloruros, y el aumento de estos da como resultado

65 un aumento de la cantidad de cloro gaseoso con respecto al HClO.

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[0055] Se reconoce generalmente que las soluciones diluidas de ácido hipocloroso son inestables debido a la descomposición. Esta descomposición se puede producir de acuerdo con una primera ruta:

5 2 HOCl → 2 HCl + O2

2 HCl + 2 HOCl → 2 Cl2 +2 H2O

[0056] O de acuerdo con una segunda ruta, en la que el ácido cloroso (HClO2) es un compuesto intermedio en la formación de ácido clórico (HClO3):

2 HOCl → [HClO2] + HCl

2 HOCl + [HClO2] → HClO3 + HCl

15 HClO3 + HCl + HOCl → HClO3 + Cl2 + H2O

[0057] Los estudios cinéticos han indicado que ambas rutas de descomposición dependen del pH y aumentan con la concentración, temperatura, y exposición a luz. Además, el primer proceso se puede acelerar mediante catálisis, y el segundo proceso se puede acelerar en presencia de otros electrolitos, en particular iones cloruro. Debido a la descomposición, las soluciones de hipoclorito pueden ser más estables que las soluciones de ácido hipocloroso. Por esta razón, las soluciones comerciales a menudo tienen un pH neutro o alcalino, lo que hace que el cloro libre exista como hipoclorito y no como ácido hipocloroso.

25 [0058] Aunque no se pretende quedar unidos a ninguna teoría en particular, se cree que el bajo contenido de ion cloruro es una de las razones principales para la estabilidad inusual y ventajosa a lo largo del tiempo del agua ácida electrolítica, tanto por evaporación como por autodescomposición. Preferentemente, la cantidad de cloruros tanto al principio como al final del proceso electrolítico es baja (200 ppm o inferior), de modo que el agua comprende cloro en la forma de HClO. Por ejemplo, en una realización particular, el agua puede comprender ~50 ppm de cloro libre, y ~200 ppm de iones cloruro. A pH 2,80, esto corresponde a un 99,3 % de HClO, y un 0,7 % de cloro gaseoso disuelto.

[0059] La conductividad del agua varía preferentemente de 900 a 1800 uS/cm, y más preferentemente varía de 1000, 1100, 1200, o 1300 a 1400, 1500, 1600, o 1700 uS/cm. El contenido de cloro libre del agua varía

35 preferentemente de 20 a 80 ppm, más preferentemente varía de 30 o 40 a 60 o 70 ppm, y lo más preferentemente es aproximadamente 50 ppm. El contenido de ion cloruro del agua varía preferentemente de 150 a 250 ppm, más preferentemente varía de 160, 170, 180 o 190 a 210, 220, 230, o 240 ppm, y lo más preferentemente es aproximadamente 200 ppm. El contenido de clorito del agua varía preferentemente de 50 a 150 ppb, más preferentemente varía de 60, 70, 80 o 90 a 110, 120, 130, o 140 ppb, y lo más preferentemente es aproximadamente 100 ppb. El contenido de clorato del agua varía preferentemente de 0,5 a 1,5 ppm, más preferentemente varía de 0,6, 0,7, 0,8, o 0,9 a 1,1, 1,2, 1,3, o 1,4 ppb, y lo más preferentemente es aproximadamente 1 ppm.

[0060] Debido a su composición química y acidez, el cloro libre en el agua puede estar presente en la forma de ácido hipocloroso (HOCl) y cloro gaseoso (Cl2). La cantidad relativa de HOCl y Cl2 en el agua varía preferentemente

45 de un 99,9 % de HOCl y un 0,1 % de Cl2 a un 95 % de HOCl y un 5 % de Cl2, más preferentemente varía de un 99,5 % de HOCl y un 0,5 % de Cl2 a un 98,5 % de HOCl y un 1,5 % de Cl2, y lo más preferentemente es aproximadamente un 99,3 % de HOCl y un 0,7 % de Cl2.

[0061] Debido a que el cloro libre en el agua está presente en la forma de HOCl y Cl2 en los intervalos descritos anteriormente, el agua puede ser altamente estable tanto frente a la evaporación como frente a la autodescomposición. En un estado expuesto no agitado a una temperatura de 25 ºC, el agua mantiene preferentemente el nivel de cloro durante un tiempo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 días. En un estado expuesto agitado a una temperatura de 25 ºC, el agua mantiene preferentemente el nivel de cloro durante un tiempo de 8, 12, 16, 20,

o 24 horas. En un estado cerrado a una temperatura de 25 ºC, el agua mantiene preferentemente aproximadamente

55 un 90 % de cloro libre después de un tiempo de 3 meses, y aproximadamente un 85 % del cloro libre después de un tiempo de 12 meses. En estado cerrado a una temperatura de 30 ºC, el agua mantiene preferentemente aproximadamente un 90 % del cloro libre después de un tiempo de 3 meses, y aproximadamente un 80 % del cloro libre después de un tiempo de 12 meses. En estado cerrado a una temperatura de 40 ºC, el agua mantiene preferentemente aproximadamente un 90 % del cloro libre después de un tiempo de 3 meses, y aproximadamente un 85 % del cloro libre después de un tiempo de 12 meses.

Preparación del agua ácida electrolítica

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negativos que, como se conoce, son atraídos por los respectivos polos opuestos. En el paso de una semicámara a la otra, la membrana nanoporosa actúa como un filtro para dichos iones y para cualquier partícula cargada, permitiendo solo el paso de las partículas de un tamaño lo suficientemente pequeño.

5 [0072] La entrada de agua a la unidad se puede caracterizar por su conductividad, medida preferentemente en µS/cm. De ese modo, por ejemplo, el agua se puede describir por la consistencia de la conductividad en la entrada de agua. Por ejemplo, la conductividad variaría en no más de 50, 20, 10, 5 o incluso 2 µS/cm, o un 100, 50, 20 o 10 %. El agua también se puede describir por la conductividad de la propia agua. La conductividad puede variar de 0,5, 1,0 o 1,5 µS/cm a 50, 25, 10, 5 o incluso 3 µS/cm, basándose en cualquier selección de extremos. La

10 conductividad varía preferentemente de 0,5 a 10 o de 0,5 a 3 µS/cm, y lo más preferentemente la conductividad es aproximadamente 2 µS/cm. Se ha descubierto que controlando la consistencia de la conductividad, y por disminución de la conductividad a los valores preferentes, se puede obtener un agua electrolizada de una calidad mucho más consistente, con la reducción consecuente en la anchura línea media de RMN. Los tipos de agua adecuados para introducirse en la unidad incluyen agua de ósmosis inversa, agua desionizada, y agua destilada. Un

15 tipo de agua preferente debido a su conductividad constante es agua osmótica preparada mediante ósmosis inversa.

[0073] El agua contiene preferentemente cloruro sódico, o alguna otra sal del metal alcalino, para facilitar la electrólisis. El cloruro sódico es preferentemente de calidad farmacéutica. La cantidad de cloruro sódico contenida en el agua es tal que el agua obtiene un nivel específico de conductividad. La conductividad de la solución de

20 entrada varía preferentemente de 50 µS/cm a 100 µS/cm, más preferentemente varía de 150 µS/cm a 200 µS/cm, y lo más preferentemente es aproximadamente 200 µS/cm.

[0074] También de importancia, el filtro evita la transmisión de metales pesados de una cámara a la otra. De ese modo, al introducir el agua en la cámara ácida o alcalina, se puede producir agua alcalina o ácida que no tiene

25 prácticamente ninguna contaminación de radicales metálicos (o al menos más allá de los límites de detección).

[0075] Un método de uso de tal unidad para preparar agua ácida electrolítica que tiene una anchura de línea media de RMN usando RMN 17O de aproximadamente 45 a menos de 51 Hz comprende:

30 (a) proporcionar una unidad de electrólisis que comprende: (i) una cámara catódica, una cámara anódica, y un filtro que separa dichas cámaras (caracterizado preferentemente por una porosidad que permite que pasen las fracciones ionizadas de H2O nanoagregada, tal como cuando la porosidad se caracteriza predominantemente por poros de aproximadamente 120 a aproximadamente 180 nm de diámetro (que tienen preferentemente un diámetro medio entre 120 y 180 nm)); y (ii) un cátodo situado en dicha cámara catódica y un ánodo situado en

35 dicha cámara anódica, en la que al menos uno de dichos ánodo y cátodo está revestido con un residuo de partículas en el que más de un 70 % en peso de dichas partículas tiene un diámetro de 40 a 100 nm;

(b): introducir una solución de agua y un metal alcalino en una o ambas de dichas cámaras; y

(c): aplicar un potencial eléctrico a dicho ánodo y dicho cátodo, durante un tiempo y en una extensión suficiente

para producir agua ácida electrolizada que tiene un ancho de línea media de RMN usando 17O de 40 aproximadamente 45 a menos de 51 Hz.

Construcción de un electrodo

[0076] De nuevo por referencia a la Figura 1, el dispositivo de electrólisis incluye los electrodos 1 y 2 que

45 comprenden un revestimiento superficial que comprende nanopartículas de uno o más metales. Preferentemente, los electrodos comprenden un núcleo está hecho de un material metálico, un material no metálico o las combinaciones de los mismos.

[0077] Si el núcleo está hecho de un material metálico, puede estar hecho, por ejemplo, de una aleación de titanio y

50 platino o una aleación de acero y grafito. Si el núcleo está hecho de un material no metálico, puede estar hecho, por ejemplo, de grafito. El núcleo también puede comprender diferentes capas, tales como, por ejemplo, un núcleo hecho de grafito que está revestido con una capa externa de metal, por ejemplo titanio. El término "mental" se refiere tanto a un metal como a composiciones químicas que comprenden dicho metal, tales como sus óxidos. Un núcleo preferente está hecho de TiO2.

55 [0078] El electrodo se puede caracterizar con respecto a electrodos conocidos básicamente debido a la presencia de una cubierta nanométrica (también denominada en lo sucesivo en el presente documento revestimiento) que es extremadamente lisa, es decir, una capa para cubrir el núcleo que incluye nanopartículas metálicas.

60 [0079] Los metales de los que se pueden hacer las nanopartículas del revestimiento se seleccionan preferentemente entre uno o más de titanio, iridio, itrio, rutenio, cinc, circonio, platino, selenio, tantalio y los compuestos de los mismos. Algunos compuestos metálicos preferentes son óxidos de los metales mencionados. Un revestimiento preferente comprende ZrO2, ZnO, Ru2O3, IrO2 e Y2O3, o TiO2, Pt/ZrO2, SnO2, Ta2O5, e IrO2. Preferentemente, los diversos metales se usan en forma de polvo.

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[0085] Se ha descubierto que recurrir a múltiples etapas de sinterización es particularmente útil con el fin de eliminar cualquier rugosidad de la superficie del electrodo y obtener una superficie extremadamente dura y lisa. Un electrodo como se ha definido anteriormente, usado como parte de un dispositivo para proporcionar la electrólisis de agua,

5 produce las siguientes ventajas:

-electrólisis más eficaz, en la que se produce un menor consumo de sales tales como NaCl, usada convencionalmente para acelerar la electrólisis de fluidos de baja conductividad tales como agua; y descripción

-si los dos electrodos son electrodos de acuerdo con la descripción, la posibilidad de producir un cambio continuo de polaridad de los electrodos ("intercambio de polaridad"). El cambio repentino de polaridad permite que las partículas cargadas que están presentes en el fluido sometidas a la electrólisis circulen en ambas direcciones en lugar de solamente en una (forzadas por la carga de las partículas y por el signo intercambiable de los electrodos), evitando de ese modo la formación de masas productoras de depósitos a nivel de los electrodos y manteniendo de ese modo su superficie limpia y su eficacia al máximo nivel. Además, si se proporciona una

15 membrana semipermeable en la celda electrolítica y divide las dos semicámaras anódica y catódica, el cambio de polaridad evita la obstrucción de los poros de dicha membrana, prolongando la vida del dispositivo; -la presencia de un revestimiento nanométrico determina una acumulación de carga en el electrodo superior de más de un 100 % con respecto a los electrodos convencionales. Esto permite proporcionar una electrólisis cualitativa y cuantitativamente diferente a potenciales considerablemente mayores, con el efecto de, por ejemplo, reducir el tamaño de los agregados moleculares; -la obtención de una consistencia, suavidad, lisura y densidad superficial muy elevadas, aspectos que evitan la solubilización del propio electrodo o la formación de sedimentos sobre su superficie, que se podrían producir a continuación en las fracciones de agua ácida y alcalina. Los mismos aspectos son también la base para la liberación básicamente nula de metales pesados y otros compuestos que constituyen la superficie y el núcleo del

25 electrodo en las fracciones de agua ácida y alcalina. Como también se mencionará posteriormente en el presente documento, la ausencia de metales pesados en el agua conduce a una estabilidad extraordinaria de la misma a lo largo del tiempo, con conservación de características tales como ORP, pH y tamaño de agregado molecular. Esta estabilidad es desconocida para los productos equivalentes conocidos. Los mismos aspectos también son la base para el mínimo mantenimiento requerido por el electrodo, que se pueden cambiar con una frecuencia considerablemente menor que los electrodos conocidos, reduciendo costes y aumentando la facilidad de producción; -la posibilidad de obtener efectos cuánticos (también conocidos en la bibliografía con el término "nanoefectos") por medio de las dimensiones nanométricas de las partículas del revestimiento. En resumen, cuando se alcanzan las dimensiones nanométricas, las propiedades ópticas, magnéticas y eléctricas de la materia cambian

35 radicalmente. Al reducir las dimensiones hasta que se alcanzan las dimensiones nanométricas habituales de los denominados agregados, debido al pequeño número de átomos que está presente en dicho agregado y a su reducido volumen, la discretización de los niveles de energía (cuantificación) se hace evidente en la estructura electrónica y depende del tamaño del agregado, conociéndose este fenómeno como "efecto de tamaño cuántico", y dependen del mismo características completamente nuevas, que contrastan con las que son habituales en los materiales a dimensiones ordinarias. En el presente caso, se ha obtenido el mejor rendimiento con polvos que tienen una distribución de tamaño centrada en un intervalo que varía de 60 a 80 nm como se ha indicado anteriormente. En su conjunto, los efectos descritos anteriormente producen la presencia simultánea de tres factores: estabilidad del agua resultante, facilidad de su producción (por ejemplo, gracias a los costes de mantenimiento inferiores y a la mayor durabilidad del dispositivo en su conjunto) y un aumento de su calidad

45 (especialmente en términos de pureza y constancia de propiedades a lo largo del tiempo). En particular, el aumento en la calidad del agua se puede medir tanto en términos de uniformidad de las dimensiones de los agregados moleculares (mayor porcentaje de micromoléculas con respecto al número de agregados macromoleculares) como en términos de aumento de estabilidad a lo largo del tiempo de las propiedades dadas para el agua mediante la propia electrólisis (por encima de todo, pH, ORP y tamaño de agregado). El aumento de estabilidad consigue presumiblemente la conservación a lo largo del tiempo de las características superficiales estructurales de los electrodos revestidos con un nanorrevestimiento como se describe en el presente documento.

Ejemplos 55 EJEMPLO 1

Objetivo

[0086] Determinar la eficacia de agua nanoagregada ácida (ANW) frente a varias cepas de bacterias, virus y hongos.

Actividad bacteriana

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Tabla 6: efecto antifúngico de ANW

Especie: Solución Reducción de viabilidad

80 %: 50 % 25 %

Candida albicans (ATCC 10231): ANW > 4,37 < 3,09 < 3,09

Aspergillus niger (ATCC 16404): ANW < 3,12 < 3,12 < 3,12

[0094] Como se muestra en la Tabla 6, se puede clasificar que la ANW es un bactericida frente a Candida albicans (ATCC 10231) a una concentración de un 80 %. 5 Actividad viral

[0095] La actividad viral se evaluó frente al virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), el virus del Herpes Simple de tipo 1 (VHS-1), y el virus del Herpes Simple de tipo 2 (VHS-2) en presencia de un 5 % de suero

10 bovino fetal en el medio como interferencia de suciedad orgánica. Para el VIH-1, la reducción de viabilidad se evaluó después de 10 minutos de exposición de ANW pura a 21,5 ºC. Para VHS-1 y VHS-2, la reducción de viabilidad se evaluó después de 5 minutos de exposición a ANW pura a 35 ºC. La siguiente Tabla 7 muestra el efecto antiviral de la ANW pura en cada virus, con los valores de reducción de viabilidad expresados como la reducción log10.

15 Tabla 7: efecto antiviral de ANW

Especie: Solución Exposición Reducción de viabilidad

VIH-1 (cepa HTLV-IIIb): ANW 10 min a 21,5 ºC > 4,5

VHS-1 (ATCC VR733): ANW 5 min a 35 ºC < 5,5

VHS-2 (ATCC VR734): ANW 5 min a 35 ºC 4,25

[0096] Como se muestra en la Tabla 7, la ANW que puede inactivar los virus sometidos a ensayo.

EJEMPLO 2 20 Objetivo

[0097] Determinar la eficacia del agua nanoagregada ácida (ANW) en la estimulación de la curación corneal y la curación de cataratas. 25 Curación de ulceración corneal

[0098] La actividad de curación corneal se evaluó en un modelo de conejo in vivo. Se provocaron experimentalmente heridas oculares corneales en 8 conejos. A continuación se trataron los ojos izquierdo y derecho con ANW y solución

30 salina, respectivamente, por aplicación de 100 ml de las soluciones 4 veces por día durante 14 días consecutivos. En los días 4º, 9º, y 14º después de la cirugía, se tomaron imágenes de cada herida con un microscopio de lámpara de hendidura y se calculó el área de cada herida con el software Topcon IMAGENET 2000. A continuación se usó el área de herida para calcular la tasa de curación de herida (WHR) usando la siguiente ecuación:

35 WHR = 100(1 -(área de herida en el punto temporal) / (área de herida inicial))

[0099] La siguiente Tabla 8 muestra la Tasa de Curación de Herida de los ojos tratados con ANW y solución salina en los días 4, 9, y 14.

40 Tabla 8: efecto de curación de ulceración corneal de ANW y solución salina

Tasa de Curación de Herida (WHR)

Día 4: Día 9 Día 14

ANW: 77,78 ± 9,06 83,32 ± 12,23 87,20 ± 13,16

Solución salina: 71,84 ± 19,38 63,45 ± 23,02 64,23 ± 28,28

Valor T: 1,36 3,73 3,61

Valor P: > 0,05 < 0,05 < 0,05

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aplicaron 0,5 ml de ANW pura con un parche sobre la piel afeitada de tres conejos albinos macho. El parche se mantuvo sobre la piel por medio de una tirita adhesiva no irritante durante 4 horas. Se observó la reacción de la piel después de la retirada del parche y 24, 48, y 72 horas después de la retirada. No se observó ningún signo de eritema o edema. Basándose en estos resultados, se determinó que la ANW no es irritante para la piel, con un Índice

5 de Irritación de la Piel de 0,00.

[0111] También se evaluó la irritación dérmica después de exposición repetida con el método de la ISO 10993-10. Se trataron tres ratones macho de Nueva Zelanda 5 días a la semana durante 4 semanas con dos administraciones diarias consecutivas de 5 ml de ANW pura o solución salina como control aplicadas con un parche durante una hora.

10 Se observó la reacción de la piel antes y después de cada aplicación a lo largo del periodo de 4 semanas completo. No se observó ningún signo de eritema o edema. Además, después del sacrificio, no se detectaron signos de inflamación en las imágenes histológicas. Basándose en estos resultados, se determinó que la ANW no exhibe ninguna irritación significativa en la piel.

15 Estudios de sensibilización de la piel

[0112] Se evaluó la hipersensibilidad de la piel de tipo retrasado con el método de la ISO 10993-10: Ensayo de Maximización en Cobaya. El ensayo usó 15 cobayas Hartley hembra albinas (10 tratadas y 5 controles). La fase de inyección (Día 0) se llevó a cabo por administración de tres inyecciones intradérmicas de 0,1 ml a cada animal: (a) 20 adyuvante de Freund completo, (b) ANW pura (ensayo) o solución salina (control), (c) ANW (ensayo) o solución salina (control) mezclados conjuntamente con adyuvante de Freund completo. A continuación se realizó un masaje de piel con 1 ml de SLS al 10 % en el Día 6. La fase de inducción (Día 7) se llevó a cabo por aplicación de 1 ml del ensayo o el control, dejado en su lugar durante 48 horas con un parche oclusivo. El desafío se llevó a cabo en el Día 21 mediante la aplicación a cada animal (tanto tratado como de control) de vendajes con 1 ml de ANW en el lado

25 derecho y 1 ml de solución salina en el lado izquierdo, dejado en su lugar durante 24 horas.

[0113] Las evaluaciones se llevaron a cabo en el día 23º (24 horas después del parche y la retirada) y en el día 24º (48 horas después del parche y la retirada). Se evaluó la intensidad de eritema y/o edema de acuerdo con la escala de Magnusson y Kligman de 0 a 3.

30 [0114] No se observó ninguna anomalía en los animales tratados o de control. Basándose en estos resultados, se determinó que ANW no exhibe potencial de dermatitis de contacto retrasada.

Estudios de irritación ocular

35 [0115] Se evaluó la irritación ocular con el método de la ISO 10993-10. En un primer experimento, se trataron tres conejos blancos de Nueva Zelanda por instilación de 0,1 ml de ANW pura en el ojo izquierdo, dejando el ojo derecho sin tratar como control. Los ojos se examinaron 1, 24, 48 y 72 horas después de la instilación mediante tinción de fluoresceína y observación en una lámpara de hendidura. No se observó ningún signo de irritación en ninguno de los

40 ojos. Basándose en estos resultados, se determinó que la ANW no es irritante para el tejido ocular de los conejos Blancos de Nueva Zelanda.

[0116] En un segundo experimento, se evaluó de nuevo la irritación ocular con el método de la ISO 10993-10. Se trataron tres conejos blancos de Nueva Zelanda por instilación de 0,1 ml de ANW pura en el ojo izquierdo como

45 ensayo, e instilación de 0,1 ml de agua que contenía NaCl (solución salina) en el ojo derecho como control. El tratamiento se repitió durante 30 días consecutivos. No se observó ningún signo de irritación en ninguno de los ojos de ensayo o control en ninguno de los puntos de observación. Basándose en estos resultados, se determinó que la ANW artículo de ensayo no es irritante para el tejido ocular de los conejos Blancos de Nueva Zelanda.

50 Resumen de los estudios de toxicología

[0117] La siguiente Tabla 9 muestra una sinopsis de los estudios de seguridad informados anteriormente en el Ejemplo 3.

55 Tabla 9: sinopsis de los estudios de seguridad de ANW

Efecto: Método Resultados

Citotoxicidad: Fibroblastos de ratón L-929 in vitro Ligeramente citotóxica (grado 1 de 4)

Irritación de piel aguda: Exposición aguda en conejos No irritante

Irritación de piel repetida: Exposición repetida en conejos No irritante

Hipersensibilidad retrasada: Ensayo de maximización en cobayas Sin sensibilización

Irritación ocular primaria: Administración aguda en conejos No irritante

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Efecto: Método Resultados

Irritación ocular repetida: Administración repetida en conejos No irritante

Genotoxicidad: Ensayo de Ames No mutagénica

Toxicidad sistémica aguda: Dosificación i.p. en ratones No tóxica hasta 50 ml/kg i.p.

EJEMPLO 4

Objetivo

5 [0118] Determinar la eficacia del agua nanoagregada ácida (ANW) para modular la actividad del sistema inmune. Estudio in vitro de proliferación de PBMC

[0119] La capacidad de la ANW para inhibir la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

10 se evaluó en un modelo celular in vitro usando 12 lotes de PCMC. En el experimento, 4 de los lotes se expusieron a betametasona (10 nM), un esteroide glucocorticoide con propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras, 4 de los lotes se expusieron a una dilución 1:10 de ANW, y los 4 lotes restantes se expusieron a una dilución 1:20 de ANW. La Tabla 10 muestra a continuación el efecto de inhibición que se midió para cada uno de los 12 lotes.

15 Tabla 10: inhibición de la proliferación de PBMC

Lote 1: Lote 2 Lote 3 Lote 4 Promedio

Betametasona (10 nM): 87,7 % 85,7 % 79,4 % 88,5 % 85,3 %

Agua nanoagregada ácida (1:10): 39,9 % 29,0 % 19,3 % 16,6 % 26,2 %

Agua nanoagregada ácida (1:20): 17,3 % 22,0 % 4,0 % 7,0 % 12,6 %

[0120] Como se muestra en la Tabla 10, la ANW inhibió la proliferación de PBMC para ambas diluciones. Se ha mostrado previamente que estas diluciones no son significativamente tóxicas en este tipo de células in vitro.

20 Estudio in vitro de la activación de linfocitos T

[0121] La capacidad de la ANW para modular citoquinas inmunorreguladoras se evaluó en un modelo celular in vitro usando PBMC de 4 donantes de sangre estimulados con derivados de proteína purificada de Mycobucterium tuberculosis (PPD), un antígeno Th1 prototípico. En el experimento, los lotes de células PBMC se estimularon con

25 PPD solo, PPD más betametasona (10 nM), y PPD más Agua Nanoagregada Ácida (dilución 1:10). La activación de linfocitos T se midió al someter a ensayo los niveles de tres citoquinas: IL-10 (expresada en linfocitos T), IFN-gamma (expresada en células Th-1), e IL-4 (expresada en células Th-2). La Figura 3 muestra los niveles de cada citoquina en comparación con PBMC no estimuladas.

30 [0122] Como se muestra en la Figura 3, la ANW reguló positivamente la producción de IL-10 mediante PMBC estimulados de forma estadísticamente significativa (ensayo T: p < 0,05). La interleuquina IL-10 es una citoquina inmunorreguladora importante. Su función biológica principal es limitar y terminar las respuestas inflamatorias, y regular la diferenciación y la proliferación de varias células inmunes. La insuficiencia de IL-10 se considera como patofisiológicamente relevante en trastornos inflamatorios caracterizados por un patrón de citoquina de tipo 1 tal

35 como psoriasis. De ese modo, las propiedades inmunomoduladoras de ANW y, específicamente, las propiedades activadoras de IL-10 de la ANW, sugieren que la ANW se puede usar como agente terapéutico directo para varias enfermedades de la piel.

EJEMPLO 5

40 Objetivo

[0123] Comparar la estabilidad del agua nanoagregada ácida (ANW) con la estabilidad informada de otras aguas electrolizadas de pH, ORP, y composición similares.

45 Comparación de ANW con Agua Oxidante Electrolizada (EO) de Soo-Voo Len

[0124] La estabilidad de la ANW en condiciones de apertura y cierre a 25 ºC se comparó con la estabilidad del agua EO que se informa en el artículo "Effects of Storage Conditions and pH on Chlorine Loss in Electrolyzed Oxidizing

50 (EO) Water" -Journal of Agricultural and Food Chemistry -2002, 50, 209-212 de Soo-Voon Len, et al.

[0125] En Soo-Voo Len, el agua de electrolizada con un pH ácido (2,5-2,6), ORP > 1000 mV (1020-1120), y un

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contenido de cloro libre de ~50 ppm (53-56 ppm) se generó con un dispositivo ROX-20TA fabricado por Hoshizaki Electric Inc. (Aichi, Japón) usando una intensidad de corriente de 14 amperios y 7,4 voltios. El artículo informa que en condiciones de apertura a 25 ºC, el cloro en el agua de electrolizada se perdía completamente después de 30 horas cuando se agitaba, y después de 100 horas cuando no se agitaba. Además, como se observa en la Figura 1

5 del artículo, el cloro libre se perdió casi completamente después de 10 horas en condiciones de apertura, agitación, y luz difusa. El artículo también informa que en condiciones de oscuridad y cierre a 25 ºC, el cloro total en el agua electrolizada disminuyó en aproximadamente un 40 % después de 1400 horas (aproximadamente 2 meses).

[0126] En comparación, la ANW almacenada en condiciones de apertura a 25 ºC sin agitación perdió

10 completamente el cloro después de 240 horas (10 días), tiempo más que dos veces mayor que el agua EO en Soo-Voo Len (100 horas). Además, la ANW almacenada en condiciones de apertura a 25 ºC sin agitación y luz perdió completamente el cloro después de 24 horas, tiempo más de dos veces mayor que el agua EO en Soo-Voo Len (10 horas). Finalmente, en la ANW almacenada en condiciones de cierre a 25 ºC perdió un 8,44 % de cloro libre después de 3 meses, menos de una cuarta parte de la cantidad que perdió el agua EO en Soo-Voo Len después de

15 aproximadamente 2 meses (40 %).

Comparación de ANW con Agua Oxidante Electrolizada (EO) de Shun-Yao Hsu

[0127] La estabilidad de la ANW en condiciones de cierre a aproximadamente 30 ºC se comparó con la estabilidad

20 del agua EO que se informa en el artículo "Effects of storage conditions on chemical and physical properties of electrolyzed oxidizing water" -Journal of Food Engineering 65 (2004) 465-471 de Shun-Yao Hsu, et al.

[0128] En Shun-Yao Hsu, el agua electrolizada de la "formulación J" tenía un pH ácido (2,61), ORP = 1147 mV, y un contenido de cloro libre de 56 ppm. El artículo informa que en condiciones de cierre a 25-30 ºC, el cloro libre en el

25 agua electrolizada era de 43 ppm después de 21 días, una pérdida de un 23 %. En comparación, las muestras de ANW almacenadas en condiciones de cierre a 25 ºC, 30 ºC, y 40 ºC sin agitación perdieron un 8,44 %, un 8,64 %, y un 15,43 % de cloro libre después de 3 meses y un 12,14 %, un 19,13 %, y un 18,31 % de cloro libre después de 1 año, respectivamente.

30 EJEMPLO 6

[0129] Se sometieron a ensayo las propiedades y la composición del Agua Nanoagregada Ácida y se descubrió que tenían las especificaciones que se informa a continuación en la Tabla 11. También se analizaron las propiedades y la composición del Agua Nanoagregada Ácida que se informan posteriormente en la Tabla 12.

35

Tabla 11: especificaciones del agua ácida

Ensayo: Método Especificación

Apariencia: Simple vista Líquido

Olor: Olfato Característico

Color: Simple vista Incolora

pH: Como tal @ 25 ºC mediante pHmetro Mettler Toledo SevenMulti -Determinación Potenciométrica (Ph Eur. 2.2.3 -Ed. Actual) < 3,00

Potencial de oxidorreducción ORP (mV): Como tal @ 25 ºC mediante electrodo redox de combinación Mettler Toledo (P/N 51343200) Valoración Potenciométrica (Ph Eur. 2,2.20 -Ed. Actual) > 1100,0

Conductividad (uS cm-1): Como tal @ 25 ºC < 1300

Ensayo de cloro total (mg/l o ppm): Método internacional M37-07 Método Espectrofotométrico fuente APAT IRSA CNR HandBook Volumen 2 -Ref 4080 40,0-70,0

Ensayo de cloro total (mg/l o ppm): Método internacional M37-07 Método Espectrofotométrico fuente HandBook APAT IRSA CNR Volumen 2 -Ref 4080 40,0-70,0

Ensayo de cloro total (mg/l o ppm): Método Interno M37-07 Método Yodométrico fuente HandBook APAT IRSA CNR Volumen 2 -Ref 4080 40,0-70,0

Ensayo de cloro ((mg/l o ppm): Método Interno M05-08 Método Espectrofotométrico fuente HandBook APAT IRSA CNR Volumen 2 -Ref 4090 < 200,0

Cloritos (mg/l o ppb)): EPA 300.1, 1997 (en forma de ClO2) < 100

Cloratos (mg/l o ppm): EPA 300.1, 1997 <1

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Ensayo: Método Especificación

RMN 17O (Hz) ancho de línea @ 50 %: Espectrómetro de RMN 17O < 50

Metales pesados [Ag, As, Bi, Cd, Cu, Hg, Mo, Pb, Sb, Sn]: Método ICP < 10 ppm

Itrio (Método ICP): Mediante EPA 200,8 1994 (límite de detección de 0,1 mg/l) < 0,1 ppm

Cinc (Método ICP): Mediante EPA 200,8 1994 (límite de detección de 0,1 mg/l) < 0,1 ppm

Iridio (Método ICP): Mediante EPA 200,8 1994 (límite de detección de 0,1 mg/l) < 0,1 ppm

Titanio (Método ICP): Mediante EPA 200,8 1994 (límite de detección de 0,1 mg/l) < 0,1 ppm

Zirconio (Método ICP): Mediante EPA 200,8 1994 (límite de detección de 0,1 mg/l) < 0,1 ppm

Rutenio (Método ICP): Mediante EPA 200,8 1994 (límite de detección de 0,1 mg/l) < 0,1 ppm

Tabla 12: resultados del ensayo de agua ácida

ANW
ANW
ANW

LOT LCOVI/57: LOT LCOX/5 LOT LCOX/1

Apariencia: Líquido incoloro con ligero olor a cloro (como una piscina) Igual Igual

Ensayo de cloro libre (mg/l) Método Espectrofotométrico: 53,1 48,6 49,9

Ensayo de cloro total (mg/l) Método Espectrofotométrico: 52,1 48,6 49,0

Ensayo de cloro total (mg/l) Método Yodométrico: 60,6 54,9 56,7

Ensayo de cloro (mg/l) UNI 24012 (Método Mercurimétrico): 138 194,0 183,4

Cloritos mg/l (en forma de ClO2) mediante EPA 300.1 1997 (límite de detección de 100 mg/l): < 100 100 < 100

Cloratos mg/l mediante EPA 300.1 1997 (límite de detección de 0,1 mg/l): 1,20 1,5 0,9

pH (como tal mediante pHmetro Mettler Toledo Met Rohm 744): 2,59 2,71 2,81

ORP mediante electrodo redox de combinación Mettler Toledo PT4805-60-88TE-S7/120: 1151,8 1121,7 1110,5

RMN 17O (ancho de línea @ 50 % -Hz): 45,76 45,33 46,07

Metales pesados (Ag, As, Bi, Cd, Cu, Hg, Mo, Pb, Sb, Sn): < 10 ppm < 10 ppm < 10 ppm

EJEMPLO 6

5 [0130] La estabilidad de las composiciones de Agua Nanoagregada Ácida que contienen diferentes cantidades de ion cloruro se sometieron a ensayo tanto en almacenamiento como al aire libre. La composición de bajo contenido de cloruro contenía menos de 200 ppm de cloruro, y la composición de alto contenido de cloruro contenía 1100 ppm de cloruro.

10 [0131] Para someter a ensayo la estabilidad de almacenamiento, las composiciones se almacenaron en condiciones de cierre a 25 ºC y humedad relativa de un 60 %, y no se agitaron o expusieron a luz difusa. Después de 3 y 12 meses, la composición de bajo contenido de cloruro tuvo una pérdida de cloro libre de un 8,44 % y un 12,14 %, respectivamente. Por el contrario, las composiciones de alto contenido de cloruro tuvieron una pérdida de cloro libre

15 de un 27,4 % después de solo 3 meses.

[0132] Para evaluar la estabilidad al aire libre, las dos composiciones se mantuvieron abiertas, en agitación, y

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Claims

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