ES2546610T3

ES2546610T3 - Nueva inmunoterapia contra tumores neuronales y cerebrales

Info

Publication number: ES2546610T3
Application number: ES13175457.4T
Authority: ES
Inventors: Niels Emmerich; Oliver Schoor; Norbert Hilf; Toni Weinschenk; Claudia Trautwein; Steffen Walter; Harpreet Singh
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2007-07-27
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2015-09-25
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: JP2010534464A; WO2009015843A1; KR20120025014A; HK1191022A1; RS54147B1; KR101290892B1; JP5738348B2; KR101317989B1; BRPI0813621A2; CA2694808C; CN101809148A; SI2660248T1; CN103911358A; JP2013226145A; PT2183361E; EA029831B1; EP2183361A1; CN103911358B; US10434120B2; US20190321405A1

Abstract

Péptido seleccionado del grupo siguiente a) Péptido consistente en la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID N. º 5, y b) Péptido acorde con a), en el que uno o dos de los residuos de aminoácidos están alterados de modo que el aminoácido K de la posición 1 es sustituido por I, L, F, M o Y, el aminoácido V de la posición 2 es sustituido por M, o L, el aminoácido F de la posición 3 es sustituido por A, Y, P, M o S, el aminoácido A de la posición 4 es sustituido por E, G, P o T, el aminoácido G de la posición 5 es sustituido por I, K, Y, N, F o V, el aminoácido I de la posición 6 es sustituido por L o T, el aminoácido P de la posición 7 es sustituido por A, Y o H, el aminoácido T de la posición 8 es sustituido por K o E, y el aminoácido V de la posición 9 es sustituido por L, en que dicho péptido mantiene la capacidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I, y en que dicho péptido es capaz de estimular los linfocitos T CD8.

Description

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Los linfocitos T cooperadores CD4-positivos desempeñan un papel importante en la inducción y en el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). Por esta razón, la identificación de epítopos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) que sean reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos reviste suma importancia para el

5 desarrollo de medicamentos que estimulen una respuesta inmunitaria antitumoral (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003).

En ausencia de inflamación, la expresión de las moléculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las células del sistema inmunitario, en concreto a las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, como, por ejemplo, monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En pacientes con cáncer 10 se ha descubierto con sorpresa que las células tumorales expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel et al., 2006).

En modelos de mamífero como el ratón se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestación de los tumores sin el concurso de las células efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a través de la inhibición de la angiogénesis mediante la secreción de interferón gamma (IFN-γ) (Qin and Blankenstein, 2000). Además se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresión tumoral mediante la

15 inducción de respuestas de anticuerpos al reconocer péptidos de antígenos asociados a tumor presentados por moléculas HLA de clase II (Kennedy et al., 2003). A diferencia de lo que sucede con los péptidos asociados a tumor reconocidos por moléculas HLA de clase I, hasta la fecha el número descrito de ligandos de clase II derivados de antígenos asociados a tumor (AAT) es pequeño (www. cancerimmunity. org, www. syfpeithi. de).

Dado que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II suele ser exclusiva de las células del sistema

20 inmunitario (Mach et al., 1996), la posibilidad de aislar péptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba factible. Pero Dengjel et al. descubrieron hace poco varios epítopos de MHC de clase II en tumores (WO 2007/028574, EP 1760088 B1; (Dengjel et al., 2006).

Para que un péptido desencadene una respuesta inmunitaria celular, debe unirse a una molécula de MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de los polimorfismos específicos de la secuencia de aminoácidos

25 del péptido. Los péptidos que se unen a las MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 10 residuos de aminoácidos y suelen contener dos residuos conservados («anclaje») en su secuencia que interactúan con la hendidura de unión correspondiente de la molécula de MHC. De este modo cada alelo MHC posee un «motivo de unión» que determina qué péptidos se pueden unir específicamente a la hendidura de unión (Rammensee et al., 1997).

30 En la reacción inmunitaria dependiente de las MHC de clase I, los péptidos no solo tienen que ser capaces de unirse a ciertas moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales, también tienen que ser reconocidos por linfocitos T portadores de receptores TCR específicos.

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, esto es, los epítopos, pueden ser moléculas derivadas de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de

35 transcripción, etc. que son expresados y, en comparación con células inalteradas del mismo origen, están regulados al alza en las células del tumor correspondiente.

La clasificación actual de los antígenos asociados a tumores comprende los siguientes grupos principales (Novellino et al., 2005):

1. Antígenos cáncer-testículo: Los primeros TAA descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T

40 pertenecen a esta clase (van der Bruggen et al., 1991), que inicialmente se denominó antígenos cáncertestículo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histológicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testículo y ocasionalmente en la placenta. Como las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y por tanto se consideran como

45 específicos de tumor desde el punto de vista inmunológico. Ejemplos conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1.

2. Antígenos de diferenciación: Estos TAA están presentes tanto en los tumores como en el tejido normal del que deriva el tumor; la mayoría se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de esas proteínas relacionadas con el linaje melanocítico participan en la biosíntesis de la melanina y no son

50 específicas de tumor, lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-A/MART-1 en el melanoma y el PSA en el cáncer de próstata.

3. TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresión en tumores histológicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epítopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos

55 normales lo sean por debajo del límite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresión por parte de las células tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral. Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.

4. Antígenos específicos de tumor: Estos TAA únicos son fruto de mutaciones de genes normales (como β

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La detección de los TUMAP en una muestra de tejido enfermo puede ayudar a decidir si los tratamientos que implican al sistema inmunitario pueden ser beneficiosos, sobre todo si se sabe o se prevé que los linfocitos T estén implicados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo conocido con el que las células infectadas o cancerosas logran eludir la vigilancia del sistema inmunitario. Así pues, la presencia de TUMAP indica que dicho mecanismo no es utilizado por las células analizadas.

Los TUMAP pueden ser utilizados para analizar las respuestas de los linfocitos contra ellos, como son las respuestas de los linfocitos T o las respuestas de anticuerpos contra el TUMAP o el TUMAP unido a moléculas de MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden ser utilizadas como marcadores pronósticos para decidir los pasos posteriores del tratamiento. Dichas respuestas también pueden ser utilizadas como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a través de diferentes medios, como, por ejemplo, la vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, materiales autólogos, o la transferencia de linfocitos de donantes. En el ámbito de la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los TUMAP pueden tenerse en cuenta para la evaluación de efectos secundarios. El control regular de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo, con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.

Los TUMAP pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/TUMAP. Estos pueden ser utilizados como terapia, para dirigir toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.

Además se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.

La Tabla 1 muestra los péptidos dados a conocer, la SEQ ID N. º 5 corresponde a la presente invención, sus respectivas SEQ ID N. º, los alelos HLA a los que se unen cada uno de ellos y las proteínas originarias de las que pueden surgir dichos péptidos.

Tabla 1: Péptidos dados a conocer

SEQ ID N. º: Código del péptido Secuencia Alelos HLA Proteína(s) originaria(s)

1: PTP-001 ALTTLMHQL A*0205 PTPRZ1

2: PTP-002 FLYKVILSL A*02 PTPRZ1

3: PTP-003 AIIDGVESV A*02 PTPRZ1

4 5 6 7 8 9 10: PTP-004 PTP-005 PTP-006 PTP-007 PTP-008 PTP-009 PTP-010 FLLPDTDGL KVFAGIPTV QQSDYSAAL TQDDYVLEV QHEGTVNIF SVFGDDNKALSK EIGWSYTGALNQKN A*02 A*02 A*02# A*02# B*38 No determinado HLA-DR PTPRZ1 PTPRZ1 PTPRZ1 PTPRZ1, PTPRG PTPRZ1 PTPRZ1 PTPRZ1

11: CHI-001 SLWAGVVVL A*02 CHI3L2

# probablemente subtipo A*205

Sorprendentemente, la SEQ ID N. º 2 también se ha encontrado presente en el carcinoma adenoescamoso primario (un tipo de cáncer de pulmón) y por tanto también puede ser utilizada para tratar dicho tipo de cáncer de acuerdo con la susodicha descripción.

Proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, Zeta1 (PTPRZ1, PTP-ξ)

El PTPRZ1 es un miembro de la familia de las proteínas tirosina fosfatasa de tipo receptor y codifica una proteína de membrana de un solo paso de tipo 1 dotada de dos dominios citoplasmáticos de tirosina fosfatasa, un dominio alfaanhidrasa carbónica y un dominio de fibronectina de tipo III (Wu et al., 2006), en el cáncer de mama (Perez-Pinera et al., 2007), en los oligodendrocitos remielinizantes de las lesiones de la esclerosis múltiple (Harroch et al., 2002), y en células renales embrionarias humanas en condiciones hipóxicas (Wang et al., 2005).

Tanto la proteína como el transcrito aparecen sobreexpresados en las células del glioblastoma, hecho que promueve su migración haptotáctica (Lu et al., 2005). Asimismo, el PTRPZ1 aparece con frecuencia amplificado a nivel del ADN genómico en el glioblastoma (Mulholland et al., 2006).

Kaplan y cols. clonaron 3 genes de la PTP de tipo receptor humana, entre ellos el PTP-γ (Kaplan et al., 1990). Se ha demostrado que un alelo PTPG se pierde en 3 de 5 estirpes celulares de carcinoma renal y en 5 de una decena de muestras de carcinoma pulmonar analizadas. El ARNm de la PTP-γ se ha hallado expresado en estirpes de células renales y pulmonares pero no en varias estirpes hematopoyéticas analizadas. Así pues, el gen PTP-γ parece tener características que hacen pensar en él como en un gen supresor de tumores en el carcinoma renal y el de pulmón. Gebbinket y cols. aislaron un ADNc de ratón de 5,7 kb, que codifica un 'nuevo' miembro de la familia de las

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Posición: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

PTP-002: Código del péptido F L Y K V I L S L

Variantes: M L

E: K

I: A G I I A E

L: Y P K L Y S

F
F: D Y T H

K: P T N

M
M: G

Y: S F

V: R
V

K: H

PTP-003: Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido: A I I D G V E S V

Variantes: M L

L
L

E: K

I: A G I I A E

L: Y P K L Y

F
F: T Y T H

K: P N

M
M: F

Y: S V

V: R

PTP-004: Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido: F L L P D T D G L

Variantes: M L

E: K

I: A G I I A E

L: Y D K L Y S

K: F T Y H

M: P N

Y: M G

V: S F

R: V

K: H

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PTP-005: Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido: K V F A G I P T V

Variantes: M L

L
L

E: K

I: A G I A E

L: Y P K L Y

F: P T Y T H

M
M: N

Y: S F

V

PTP-006: Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido: Q Q S D Y S A A L

Variantes: V P E V I H Y

Y: F K L V V

I: N I L

M: P A

PTP-007: Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido: T Q D D Y V L E V

Variantes: V P E V I H Y L

Y: F K L V V

I: N I L

M: P A

PTP-008: Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido: Q H E G T V N I F

Variantes: D

I: E M V Y K

P: V I V Y

L: A T N N

E: R K R

G: N

L: H

K

S

Es sabido que los péptidos que son presentados por MHC de clase II están compuestos por una «secuencia central» dotada de un secuencia de aminoácidos que se ajusta a cierto motivo específico del alelo de HLA y, opcionalmente, de extensiones N-y/o C-terminales que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, que se consideran irrelevantes para la interacción del péptido y todos o una parte de los clones de linfocitos T que

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también suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmídicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general proveídos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo, de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresión transitoria

o estable, expresión en el citoplasma o secreción, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la detección.

La potente región reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresión constitutiva de la proteína muy elevados, de hasta 1 mg/l en células COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de proteínas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicación del SV40 genera niveles elevados de replicación del ADN en células COS que toleran la replicación del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección por resistencia a la ampicilina, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secreción de las proteínas de fusión FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión aptos para el uso con una variedad de células hospedadoras.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector polinucleotídico de la presente invención. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacterianas pueden ser las células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como, por ejemplo, las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc. , Bethesda, MD, EE. UU. , y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE. UU. (N. º ATCC 31343). Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general están disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California 92037, EE. UU. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas, por ejemplo, en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols”, Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas en la materia.

La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invención se consuma con métodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse, por ejemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformación de células de levadura aparece descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. El método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo, el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc. , Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfeccion de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.

Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invención, se pueden identificar con técnicas bien conocidas, como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.

Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la invención son útiles para la preparación de péptidos de la invención, por ejemplo, las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos métodos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la invención de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.

En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) son en la actualidad objeto de investigación como tratamiento contra el cáncer de próstata (Sipuleucel–T) (Small EJ et al 2006; Rini et al 2006).

Se describe un método para la producción de un péptido o de su variante, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.

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