KR20010041642A

KR20010041642A - Ｔａｇｅ 분자를 코드화하는 분리된 핵산 분자 및 그것의사용

Info

Publication number: KR20010041642A
Application number: KR1020007009842A
Authority: KR
Inventors: 반데르브루겐피에르; 분-팔레어티에리
Original assignee: 에드워드 에이. 맥더모 2세, 로이드 제이. 오울드; 루드빅 인스티튜트 포 캔서 리서치
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2001-05-25
Also published as: US6194156B1; AU1622199A; US5952468A; US5905145A; CA2319312A1; ZA9811211B; WO1999045019A1; JP2002505096A; EP1060185A1; CN1284962A; EP1060185A4

Abstract

새로운 패밀리의 종양 거부 항원 전구체와, 그것을 코딩하는 핵산 분자가 개시된다. 이 종양 거부 항원 전구체는 TAGE 종양 거부 항원 전구체라고 불리고, 그것을 코드하는 핵산 분자는 TAGE 코딩 분자라고 불린다. 그 코딩 서열와 종양 거부 항원, 및 그것의 전구체 분자의 다양한 진단상 및 치료상의 사용이 설명된다.

Description

ＴＡＧＥ 분자를 코드화하는 분리된 핵산 분자 및 그것의 사용{ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH ENCODE TAGE MOLECULES, AND USES THEREOF}

포유동물의 면역체계가 이물질이나 외래물질을 인식하고 그에 반응하는 과정은 복잡하다. 이 체계의 중요한 면은 T 림프구 즉, "T 세포"반응이다. 이 반응은 T 세포가 인간의 백혈구 항원("HLA") 또는 주조직적합체(major histocompatibility complexes("MHC")) 및 펩티드라고 불리는 세포 표면 분자의 복합체를 인식하고 그와 상호작용하는 것을 필요로 한다. 펩티드는, HLA/MHC 분자를 또한 제공하는 세포에 의하여 프로세싱되는 보다 큰 분자로부터 유도된다. 이에 관해서는 Male 등, Advanced Immunology(J.P. Lipincott Company, 1987), 특히 6 내지 10장을 참고하라. T 세포와 HLA/펩티드 복합체의 상호작용은, HLA 분자와 펩티드의 특정한 조합에 특이적인 T 세포를 필요로 하기 때문에 제한된다. 만약 특이적인 T 세포가 존재하지 않는다면, 그것의 상대 복합체가 존재한다 하더라도 T 세포 반응은 없다. 비슷하게, 특정한 복합체가 없으나 T 세포가 있다면 반응은 없다. 이러한 기전은 이물질에 대한 면역체계의 반응, 자가면역성 질환 및 세포의 이상성에 대한 반응에 관련된다. 단백질이 HLA 결합 펩티드로 프로세싱되는 기전에 많은 연구의 초점이 맞추어져 왔다. 이에 관해서는 Barinaga, Science 257:880(1992); Fremont 등, Science 257:919(1992); Matsumura 등, Science 257:927(1992); Latron 등, Science 257:964(1992)를 참고하라.

T 세포가 세포의 이상성을 인식하는 기전은 또한 암에 관련되어 왔다. 예를 들어, 1992년 5월 22일에 제출되고 1992년 11월 26일에 공개되고, 참고에 의하여 연합된 PCT 출원 PCT/US92/04354에서, 한 패밀리의 유전자가 개시되는데, 이 유전자는 펩티드로 프로세싱되고, 다시 펩티드는 세포표면에 발현되고 특이적인 세포용해성(cytolytic) T 림프구, 즉 이후로는 "CTLs"에 의한 종양 세포의 용해를 이끌어 낼 수 있다. 이 유전자는 "종양 거부 항원 전구체" 또는 "TRAP" 분자를 코드한다고 말해지며, 그로부터 유도되는 펩티드는 "종양 거부 항원" 또는 "TRAs"라고 불린다. 이 패밀리의 유전자에 대한 추가적인 정보를 위하여 Traversari 등, Immunogenetics 35:145(1992); van der Bruggen 등, Science 254:1643(1991)를 참고하라. 또한, 참고에 의하여 완전히 연합된, 1991년 12월 12일에 제출되어 지금은 미국특허 제5,342,774호인 미국특허출원 일련번호 807,043를 참고하라. "MAGE" 패밀리의 종양거부 항원 전구체는 이 특허에서 개시된다.

그 개시가 참고에 의하여 연합된, 미국 특허 제5,405,940호에서, MAGE-1 유전자가 HLA-A1 분자에 의하여 제공되는 노나펩티드로 프로세싱되는 종양 거부 항원 전구체를 코드한다는 것이 명백하게 된다. HLA-A1에 결합하는 노나펩티드는, 모티프가 충족되는 결합을 위한 "법칙"을 따른다. 이 점에서, 예를 들어, PCT/US93/07421; Falk 등, Nature 351:290-296(1991);Engelhard, Ann Rev. Immunol. 12:181-207(1994); Ruppert 등, Cell 74:929-937 (1993); Rotzschke 등, Nature 348:252-254(1990); Bjorkman 등, Nature 329:512-518(1987);Traversari 등, J. Exp. Med. 176:1453-1457(1992)를 참고하라. 참고에 의하여, 특정한 HLA 분자에 대한 특정한 펩티드의 기지의 특이성이 있다면, 특정한 펩티드가 하나의 HLA 분자에만 결합하고 다른 분자에는 결합하지 않을 것이 예상된다는 것을 알 수 있다. 다른 개인이 다른 HLA 표현형을 가지기 때문에 이것은 중요하다. 결과적으로, 특정한 펩티드를 특이적인 HLA 분자의 상대로서 확인하는 것은 진단상의 및 치료상의 분자를 가지지만, 이것들은 그 특정한 HLA 표현형을 가지는 개인을 위해서만 적당하다. 세포의 이상성은 하나의 특정한 HLA 표현형에 제한되는 것이 아니며 표적화된 치료법은 문제가 되는 비정상 세포의 표현형에 대한 지식을 필요로 하기 때문에 이 분야에서의 추가적인 연구가 필요하다.

1993년 1월 22일에 제출되고 참고에 의하여 연합된 미국특허출원 일련번호 008,446에서, MAGE-1 발현산물이 두번째 TRA로 프로세싱된다는 사실이 개시된다. 이 두번째 TRA는 HLA-Cw^*1601 분자에 의하여 제공된다. 이 개시는 일정한 TRAP가 다수의 TRAs를 산출하고, 그 각각은 MHC 분자로의 결합을 위한 모티프 법칙을 만족시킬 것이다.

1992년 12월 22일에 제출되고 참고에 의하여 본원에 연합된 미국특허출원 일련번호 994,928는, 몇몇 정상 세포(예를 들어, 멜라닌세포)에 의하여 생산되는 분자인 티로시나제가 종양세포내에서 프로세싱되어 HLA-A2 분자에 의하여 제공되는 펩티드를 산출한다는 것을 가르쳐준다.

미국 특허 제5,683,886호에, 그리고 참고에 의하여 완전히 연합된 바와 같이, 티로시나제로부터 유도되지 않는 두번째 TRA는 HLA-A2 분자에 의하여 제공되는 것으로 가르쳐진다. 이 TRA는 TRAP로부터 유도되지만, 비-MAGE 유전자에 의하여 코드된다. 이 개시는 특정한 HLA 분자가 다른 공급원으로부터 유도된 TRAs를 제공할런지도 모른다는 것을 보여준다.

1993년 6월 17일에 제출되고 참고에 의하여 본원에 연합된 미국특허 제5,571,711에서, 관련되지 않은 종양 거부 항원 전구체, 이른바 "BAGE" 전구체가 기술된다. BAGE 전구체는 MAGE 패밀리와 관련되어 있지 않다.

둘다 참고에 의하여 연합된 U.S. 특허출원 일련번호 08/096,039와 일련번호 08/250,162에서, 비-관련된 TRAP 전구체 GAGE가 또한 개시된다.

상기에서 인용된 논문, 특허, 및 특허출원에 의하여 나타나는 연구는, 큰 부분에 있어서 MAGE 패밀리의 유전자 및 관련되지 않은 BAGE 유전자와 GAGE 유전자를 다룬다. 그러나, 추가적인 종양 거부 항원 전구체가 세포에 의하여 발현된다는 것이 현재 밝혀져 왔다. 이러한 종양 거부 항원 전구체는 "TAGE" 종양 거부 항원 전구체라고 불린다. 그것은 MAGE 패밀리의 유전자, BAGE 패밀리의 유전자, 또는 GAGE 패밀리의 유전자에 대해 상동성을 보이지 않는다. 그러므로, 본 발명은 그러한 TAGE TRAPs를 코드화하는 유전자, 그 코드화된 종양 거부 항원 전구체, 그것으로부터 유도되는 종양 거부 항원, 그 유전자의 단편, 및 그것들의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 다음에 오는 개시에서 더욱 상세히 설명된다.

본 발명은 종양 거부 항원 전구체를 코드하는 핵산 분자의 패밀리에 관한 것이다. 종양 거부 항원 전구체, 또는 "TRAP"는 인간의 백혈구 항원 분자에 의하여 제공되는 펩티드로 프로세싱될 수 있을 것이다. 문제의 유전자는 다른 기지의 종양 거부 항원 전구체 코딩 서열에 관련되어 보이지 않는다.

실시예 1

이 실시예는, 이 발명에 따른 핵산 분자의 분리이다.

cDNA 라이브러리를 표준적인 방법론을 따르면서 고환 조직으로부터 조제하였다. 명확하게 말하면, 상업적으로 이용가능한 올리고-dT mRNA 추출 키트를 이용하여 폴리 A RNA를 분리하였다. RNA를 일단 분리하면, 그것을 올리고-dT 프라이머와 표준적인 방법을 이용하여 cDNA로 전환시켰다.

그리고나서, cDNA를 NotI/BstX 어댑터에 결찰시켜, 기지의 발현벡터 pcDNA I/Amp로 삽입하였고, 결과적인 재조합체 플라스미드를 E.coli DH5αF'IQ안으로 일렉트로포레이션하였다. 그후, 참고에 의하여 연합된 Sambrook 등, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), p. 1.94에 따라, 트랜스펙션된 박테리아를 암피실린(50ug/ml)을 이용하여 선택하였고 나일론-기초한 막위로 플레이팅하여 복사하였다. 간단히 말해서, 박테리아를 막위로 플레이팅한 후, 막을 고체배지위에 배치하였고, 콜로니가 보일 때, 두번째의 막을 첫번째의 막위에 놓았다. 어느정도의 박테리아가 두번째의 막에 붙어서 복제품을 창조하였다.

전처리에 이어서, 막을 혼성화 실험에서 사용하였다. 명확히 말하면, 막을, 10% 덱스트란 설페이트, 1% SDS 및 1M NaCl의 용액과, 65℃에서,³²P 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 접촉시켰다. 프로브는, 참고에 의하여 연합된 미국 특허 제5,571,711호의 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 100-385로 구성되었고, 이어서 두번의 5분간의 실온 세척, (2xSSC)을 하였고, 이어서 2xSSC, 1% SDS에서 60℃로 두번의 30분간의 세척을 하였다.

양성의 클론들 중의 하나는 부분적으로 서열분석되었다. 482 염기쌍 부분적인 서열은 SEQ ID NO:1로서 보여진다. 그것은 기지의 서열들과 상동성을 보이지 않았고, 혼성화 프로브가 유도된 cDNA의 서열과도 상동성을 보이지 않았다. 혼성화는 낮은 스트린전시 조건에 기인하여 일어났다.

실시예 2

그리고나서, 이후로는 "TAGE"라고 불리는 분리된 핵산 분자가 유전자의 패밀리에 속하는지를 결정하기 위하여 실험을 수행하였다. 이것을 하기 위하여, 흑색종 셀라인 MZ2-MEL(참고에 의하여 연합된 미국 특허 제5,342,774호에서 설명된)으로부터의 게놈 DNA를 EcoRI로 분해하였다. SEQ ID NO:1에 근거한 뉴클레오티드 프로브를 조제하였는데, 이것은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 166-446으로 구성되었고, 게놈 분해의 서던 블로팅에서 사용하였다. 스트린전트 조건(0.2xSSC, 1% SDS, 60℃에서 20분)을 사용하였고, 3.5와 6.5 kb의 두개의 띠가 각각 관찰되었다. HindⅢ 분해를 이용하여 실험을 반복하였고 4개의 띠가 관찰되었다. 그 띠중 2개는 12 kb보다 더 컸으며, 다른 것들은 5와 7 kb 길이였다. 이 결과는 아마도 TAGE 유전자의 패밀리가 있다는 것을 가리킨다.

실시예 3

그리고나서, TAGE 유전자가 정상적인 세포와 조직 또는 암성의(cancerous) 세포와 조직에서 발현되는지를 결정하기 위하여 연구를 수행하였다. 이것을 하기 위하여, 표준적인 구아니딘 이소티오시아네이트 절차를 이용하여 표본로부터 총 RNA를 추출하였다. 역전사가, 올리고dT 프라이머를 이용하여 2ug의 RNA에 대하여 수행되어 cDNA를 확보하였다. 그리고나서, 100ng의 총 RNA(10⁴개의 세포)에 상응하는 cDNA 양을, 94℃로의 5분이 앞서는 30주기동안의 PCR 및 73℃로의 15분을 통하여 증폭하였다. 하나의 주기는 94℃로 1분, 59℃로 2분 및 73℃로 2분으로 정의되었다. 프라이머는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 166-187 및 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 425-446에 대한 보체로 각각 구성되었다. 예상되는 PCR 산물은 길이가 281 염기쌍이었다.

증폭에 이어서, 산물을 1.5% 아가로스 겔상에서 크기별로 분류하였다. 인간의 β-액틴의 PCR 증폭을 대조표준으로서 이용하였다.

시험된 20개의 정상적인 성숙한(adult) 조직 유형중에서, 정자와 고환만이 양성이었다. 시험된 6개의 태아 조직중 어느 것도 양성이 아니었다. 시험된 22개의 종양 유형중에서, 강한 발현은 정상피종에서 발견되었고(시험된 표본의 100%), 발현은, 흑색종, 육종, 머리 및 목 편평의 세포 암종 및 신경모세포종에서도 역시 발견되었다. 15개 유형의 종양 셀라인을 시험하였고, 육종, 신경모세포종, 흉막 중피종, 및 갑상선 암종 셀라인이 양성이었다.

앞서 말한 실시예들은 종양 거부 항원 전구체를 코드하는 핵산 분자의 분리를 보여준다. 그러나, 이 "TRAP" 코딩 분자는, 상기에서 보여진 참고에서 설명된, 이전에 개시된 MAGE, BAGE 또는 GAGE 코딩 서열의 어떤 것과도, 또는 어떤 다른 기지의 유전자들과도 상동인 것으로 밝혀지지 않았다. 그러므로, 본 발명의 한 양태는 SEQ ID NO:1에서 보여지는 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자와, TRA를 코드하는 SEQ ID NO:1의 그 단편이나 부분, 즉 때때로 "소유전자(minigenes)"라고 불리는 것, 및 TAGE 단백질의 면역학적으로 활동적인 부분을 코드화하는 이 핵산 분자의 단편이나 부분이다. 이 서열은, 인용된 참고에서 설명된 대로의 이 유전자들중 어느 것의 서열에 그것을 비교함으로써 보여질 것과 같이, MAGE, BAGE 또는 GAGE 코딩 서열이 아니다. 또한, 본 발명의 일부는, 종양 거부 항원 전구체를 코드하고 스트린전트 조건하에서 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자에 혼성화하는 그 핵산 서열이다. 본원에서 사용될 때, "스트린전트 조건"은 당업계가 익숙한 매개변수들을 가리킨다. 보다 명확하게 말하면, 본원에서 사용될 때, 스트린전트 조건은 3.5xSSC, 1xDenhardt(0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% BDA), 25mM NaH₂PO₄, pH 7.0, 0.5% SDS, 2mM EDTA에서의 혼성화, 이어서 2xSSC, 0.5% SDS에서 65℃로 두번의, 15분 세척, 이어서 0.2xSSC, 0.1% SDS에서 65℃로 한번의 15분 세척을 가리킨다. 동일하거나 보다 높은 정도의 스트린전시를 생기게 하는, 사용될 수 있는 다른 조건, 시약등이 있다. 숙련된 장인은 그러한 조건에 익숙할 것이므로 그것은 본원에서 주어지지 않는다.

본 발명은 발현벡터안의 서열의 사용을 포함하고, 이 발현벡터는 원핵세포(예를 들어, E. coli) 또는 진핵세포(예를 들어, CHO나 COS 세포)인 숙주세포와 셀라인을 형질전환 또는 트랜스펙션시키기 위하여 사용될 수 있을 것이라는 것이 실시예들로부터 또한 보여질 것이다. 발현 벡터는 적절한 서열, 즉 상기에 설명된 서열이 프로모터에 실시가능하게 연결될 것을 필요로 한다. 인간의 백혈구 항원이 종양 거부 항원 전구체로부터 유도된 종양 거부 항원을 제공한다는 것이 밝혀져 왔기 때문에, 발현벡터는 HLA 분자를 코딩하는 핵산 서열도 또한 포함할 수 있을 것이다. 벡터가 두 코딩 서열 다를 포함하는 상황에서, 그 벡터는 그 중 어느하나도 정상적으로 발현하지 않는 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션시키기 위하여 이용될 수 있다. 종양 거부 항원 전구체 코딩 서열은 단독으로 사용될 수도 있을 것인데, 예를 들어 숙주세포가 HLA 분자를 이미 발현하고 있는 때이다. 물론, 사용될 수 있는 특정한 숙주세포에 대해서는 아무 제한이 없다. 벡터가 그 두개의 코딩서열을 포함할 때, 그 벡터는 HLA를 발현하지 않는 숙주세포안에서 사용될 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 이른바 발현 키트를 포함하는데, 발현 키트는 장인이 원하는 발현벡터나 벡터들을 조제하는 것을 허가한다. 그런 발현 키트에는, 적어도 앞서 논의된 코딩 서열 각각의 별개의 부분들이 포함된다. 필요한 앞서 언급된 서열이 포함되는 한, 원한다면 다른 성분들이 첨가될 수 있을 것이다.

본 발명의 핵산 분자와 TRAP를 앞서 설명된 MAGE, BAGE 및 GAGE 물질과 구별하기 위하여, 본 발명은 TAGE 패밀리의 유전자 및 TRAP라고 불릴 것이다. 그러므로, "TAGE"가 본원에서 사용될 때마다, 그것은 본원에서 설명된 서열에 의하여 코드되는 종양 거부 항원 전구체를 가리킨다. "TAGE 코딩 분자" 및 유사한 용어는 핵산 분자 그자체를 설명하기 위하여 사용된다.

본원에서 설명된 대로의 발명은 많은 용도를 가지는데, 그 중 어느정도는 본원에서 설명된다. 첫번째로, 본 발명은, TRAP의 발현을 특징으로하는 질병(disorder)을 장인이 진단하도록 해준다. 이 방법은 TRAP 유전자의 발현, 및/또는 HLA에 의하여 표현되는 TRA와 같이 TRAP로부터 유도되는 TRA의 발현을 측정하는 것을 포함한다. 전자의 경우에, 그러한 측정은, 폴리머라제 연쇄반응, 또는 표지된 혼성화 프로브를 이용한 분석을 포함하는 표준적인 핵산 측정 분석을 통하여 수행될 수 있다. 후자의 경우에, 항원과 같은, TRA와 HLA의 복합체에 대한 결합 상대를 이용한 분석이 특히 바람직하다. 측정을 위한 양자택일적인 방법은 상기에 설명된 유형의, TNF 또는⁵¹Cr 방출 분석이다.

TRAP 유전자의 분리는 또한, TRAP 분자 그자체, 특히 SEQ ID NO:1에 의하여 코드되는 아미노산 서열을 포함하는 TRAP 분자를 분리하는 것을 가능하게 만든다. TRA로서, 또는 TRA와 HLA의 복합체로서 제공될 때의 이 분리된 분자들은 보조제(adjuvants)와 같은 물질과 조합되어, TRAP 분자의 발현을 특징으로 하는 질병을 치료하는데에 유용한 백신을 생산할 수 있을 것이다. 덧붙혀, 백신은, 비-증식성 암세포, 비-증식성 트랜스펙션체등과 같이 그 표면상에 TRA/HLA 복합체를 제공하는 세포로부터 조제될 수 있다. 세포가 백신으로서 이용되는 모든 경우에, 이것은 CTL 반응을 제공하기에 필수적인 성분중 하나 또는 둘다를 위한 코딩 서열로 트랜스펙션된 세포이거나, 트랜스펙션 없이 두 분자 모두를 발현하는 세포일 수 있다. 추가로, TRA와 HLA의 복합체는 물론 TRAP 분자, 그것의 연관된 TRA가, 당업계에 잘 알려진 표준적인 기술을 이용하여 항체 또는 CTL을 생산하기 위해 사용될 수 있을 것이다. 그러한 백신에는, GM-CSF와 같은 하나이상의 사이토카인이 포함될 수 있을 것이다.

"질병"이 본원에서 사용될 때, 그것은 종양 거부 항원 전구체가 발현되고 프로세싱되는 어떤 병리학적인 질환이라도 가리킨다. 그런 질병의 예는 암, 특히 흑색종이다. 흑색종은 색소 생산 세포의 암으로 잘 알려져 있다.

개시에 기초를 둔 치료상의 접근방법은, TRA 제공 세포의 용해를 이끌어내는, 피검자의 면역체계에 의한 반응에 전제를 둔다. 하나의 그런 접근방법은 문제의 표현형의 비정상 세포를 가진 피검자에게 그 복합체에 특이적인 CTL을 투여하는 것이다. 그러한 CTL을 실험실내에서 발생시키는 것은 장인의 기술에 속한다. 명확하게 말하면, 혈구와 같은 세포의 표본을, 복합체를 제공하고 특이적인 CTL이 증식하게끔 할 수 있는 세포에 접촉시킨다. 표적세포는 상기에서 설명된 유형의 COS 세포와 같은 트랜스펙션체일 수 있다. 이러한 트랜스펙션체는 그 표면상에 원하는 복합체를 제공하고, 관심있는 CTL와 조합될 때 그 증식을 자극한다. 본원에서 사용된 것과 같은 COS 세포는 다른 적당한 숙주세포와 마찬가지로 널리 이용가능하다.

인입면역전달(adoptive transfer) (Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917 (1986); Riddel 등, Science 257:238(7-10-92); Lynch 등, Eur. J. Immunol. 21:1403-1410(1991); Kast 등, Cell 59:603-614(11-17-89)이라 불리는 치료상의 방법론을 상술하기 위하여, 원하는 복합체를 제공하는 세포를 CTL와 조합하여 거기에 특이적인 CTL의 증식을 이끌어낸다. 그리고나서, 증식된 CTL을, 적절한 HLA 분자를 포함하는 특정한 복합체를 제공하는 어떤 비정상 세포를 특징으로 하는 세포의 이상성을 지닌 피검자에게 투여한다. 그러면, CTL이 비정상적인 세포를 용해함으로써 원하는 치료상의 목표를 이룬다.

앞서 말한 치료법은 피검자의 비정상 세포의 적어도 얼마간은 적당한 HLA/TRA 복합체를 제공할 것을 가정한다. 적당한 서열, 이경우에는 TAGE 서열의 DNA를 발현하는 세포를 확인하는 방법은 물론, 특정한 HLA 분자를 제공하는 세포를 확인하기 위한 방법에 당업계가 매우 익숙하기 때문에, 이것은 아주 쉽게 측정될 수 있다. 일단 적당한 복합체를 제공하는 세포가 앞서 말한 스크리닝 방법론을 통하여 확인되면, 그 세포들을, 환자로부터 얻은, CTL을 포함하는 표본과 조합할 수 있다. 복합체 제공 세포가 혼합된 CTL 표본에 의하여 용해되면, TAGE 유도된, 종양 거부 항원이 제공되고 있으며, 그 피검자는 상기에 보여진 치료상의 접근방법에 적당한 후보임을 추측할 수 있다.

인입면역전달은 본 발명에 따라 이용가능한 유일한 치료법의 형태가 아니다. 많은 접근방법을 이용하여, CTL을 생체내에서 생기게 할 수 있다. 하나의 접근방법, 즉 그 복합체를 발현하는 비-증식성 세포의 사용은 상기에서 면밀히 검토되어 왔다. 이 접근방법에서 사용되는 세포는, 방사선조사된 흑색종 세포 또는 그 복합체의 제공에 필수적인 유전자중의 하나 또는 둘다로 트랜스펙션된 세포와 같이 그 복합체를 정상적으로 발현하는 세포일 수 있을 것이다. Chen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:110-114(1991년 1월)은, 치료상의 제도안에서 HPV E7 펩티드를 발현하는 트랜스펙션된 세포의 사용을 보여주면서 이러한 접근방법을 예시하였다. 다양한 세포 유형이 사용될 수 있을 것이다. 유사하게, 관심있는 유전자 중의 하나 또는 둘다를 운반하는 벡터가 사용될 수 있을 것이다. 바이러스 벡터 또는 박테리아 벡터가 특히 바람직하다. 이러한 체계에서, 관심있는 유전자는, 참고에 의하여 연합된 Layton 등, Immunology 87(2):171-178(1996), Gilbert, 등, Nat. Biotechnol. 15(12):1280-1284(1997)에 의하여 설명된 대로, 예를 들어 Vaccinia 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, Yersinia 바이러스 또는 Ty 바이러스 유사 입자에 의하여 운반되거나, 박테리아 BCG에 의하여 운반되고, 그 물질은 사실상 숙주세포를 "감염"시킨다. 리포솜과 같은 다른 유형의 담체, 또는 카토닉(catonic) 지질이 또한 사용될 수 있을 것이다. 결과적인 세포는 관심있는 복합체를 제공하고 자가의 CTL에 의하여 인식된 후, CTL이 증식한다. 종양 거부 항원이나 전구체 자체를 보조제와 조합하여 HLA 제공 세포안으로의 연합을 용이하게 하여 관심있는 HLA/펩티드 복합체를 제공하게 함으로써 유사한 효과를 성취할 수 있다. TRAP는 프로세싱되어 HLA 분자의 펩티드 상대를 산출하는 반면, TRA는 추가의 프로세싱이 필요없이 제공된다.

본 발명의 다른 양태는 숙련된 장인에게는 분명할 것이고, 본원에서 반복될 필요가 없다.

사용된 용어와 표현은 한정의 용어가 아니라 설명의 용어로서 사용되고, 그런 용어와 표현의 사용에 있어서, 보여지고 설명된 특징 또는 그 일부의 어떤 등가물도 배제하려는 의도가 없으며, 본 발명의 범위내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인정된다.

〈110〉 LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH

〈120〉 ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH ENCODE TAGE MOLECULES, AND

USES THEREOF

〈130〉 1

〈150〉 US09/036,467

〈151〉 1998-03-06

〈160〉 1

〈170〉 KopatentIn 1.55

〈210〉 1

〈211〉 482

〈212〉 DNA

〈213〉 Homo sapiens

〈400〉 1

gacagagtgt gcagcacgac cagagtggct tttctggctt tgccgcccag ctgctccatg 60

ccaggaggag gaggagacac ctagagcctg cgacaccatg gctcgcctcg ctgcagtgta 120

ggttctaccc atgtaacaga tgaggaaacc aaggagcaca gttatttact aactcgcaca 180

aggttcgagg ccgagctcag acctgtggag cagaagctga gtgcgctgca gtccccgctg 240

gcccagaggc ccttcttcga ggtgccctca cccctgggcg ccgtggacct gtacgagtat 300

gcatgcgggg atgaggacct ggagccactg tgacgccacc catgagaacg ccgctgcggg 360

gccgctccac acgtgccacg gccaccactg ggacaccgcc gcttgtgtaa aaactgttgt 420

cttttgtgga aaatgagtgt gtttgcatgg aatgataaat tttatttatt cacaaaaaaa 480

aa 482

Claims

본질적으로 SEQ ID NO:1에서 보여진 뉴클레오티드 서열로 구성되는 분리된 핵산 분자.
분리된 핵산 분자로, 그것의 상보적인 서열이 스트린전트 조건하에서 SEQ ID NO:1에서 보여진 핵산분자에 혼성화하고 종양 거부 항원 전구체를 코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코드화되는 단백질의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코드화하는 분리된 핵산 분자.
제 1 항의 핵산 분자에 충분히 상보적인 분리된 mRNA 분자.
제 1 항의 핵산 분자로 트랜스펙션 또는 형질전환된 숙주세포.
제 2 항의 핵산 분자로 트랜스펙션 또는 형질전환된 숙주세포.
제 3 항의 핵산 분자로 트랜스펙션 또는 형질전환된 숙주세포.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제 1 항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제 2 항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제 3 항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
제 5 항에 있어서, 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 6 항에 있어서, 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 7 항에 있어서, 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 8 항에 있어서, 인간의 백혈구 항원을 코드하는 핵산 분자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 9 항에 있어서, 인간의 백혈구 항원을 코드하는 핵산 분자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 10 항에 있어서, 인간의 백혈구 항원을 코드하는 핵산 분자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
(i)제 1 항의 분리된 핵산 분자, 및

(ii)인간의 백혈구 항원을 코드하는 핵산 분자

의 각각의 별개의 부분을 포함하는 발현키트.
(i)제 2 항의 분리된 핵산 분자, 및

(ii)인간의 백혈구 항원을 코드하는 핵산 분자

의 각각의 별개의 부분을 포함하는 발현키트.
(i)제 3 항의 분리된 핵산 분자, 및

(ii)인간의 백혈구 항원을 코드하는 핵산 분자

의 각각의 별개의 부분을 포함하는 발현키트.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항의 핵산 분자에 의하여 코드되는 분리된 종양 거부 항원 전구체.