ES2543199T3 - Síntesis y usos de derivados del ácido piroglutámico - Google Patents

Síntesis y usos de derivados del ácido piroglutámico Download PDF

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Abstract

Un proceso para la síntesis de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula Id**Fórmula** donde R1 se selecciona de -OH; R2, R3 y R4 son independientemente seleccionados de hidrógeno X es un anión farmacéuticamente aceptable; y Y es un residuo orgánico seleccionado de un grupo de fórmula VIa que contiene N.**Fórmula** donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un anillo de piridina de fórmula IX sustituido o no sustituido**Fórmula** donde, n es 0; que consiste en: a)hacer reaccionar un compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV**Fórmula** donde R1 es seleccionado de -OH, -ORa, donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido; y R2 se selecciona del grupo que consiste en un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas y ftalimida;o mezclas de los mismos; con un compuesto de fórmula V**Fórmula** donde R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas y ftalimida; para obtener un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IIId**Fórmula** R1 se selecciona de -OH, -ORa, donde Ra se selecciona de un alquilo sustituido o no sustituido; yR2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza en condiciones ácidas y ftalimida;o mezclas de los mismos. b)transformar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IIId, o mezclas de los mismos, en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IId**Fórmula** donde R1 se selecciona de -OH, -ORa, donde Ra se selecciona de un alquilo sustituido o no sustituido; R2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza bajo condiciones ácidas y ftalimida; R5 se selecciona de una carga negativa o R3, en donde R3 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalimida; e Y es un residuo orgánico seleccionado que contiene -N (i) cuando R5 tiene una carga negativa, Y es un residuo orgánico de fórmula VIIa que contiene**Fórmula** Donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX**Fórmula** donde, n es 0; o (ii) cuando R5 es R3, Y es un residuo orgánico de fórmula VIIc que contiene N**Fórmula** donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX**Fórmula** donde, n es 0; y Z es un anión farmacéuticamente aceptable; o mezclas de los mismos; y c)poner en contacto dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas de los mismos, con un medio ácido que comprende un ácido de fórmula HX, donde X se define como anteriormente, para hacer que dicho estereoisómero sustancialmente puro de paso a un compuesto de fórmula Id; en el que "sustancialmente puro" hace referencia a un compuesto que tiene la pureza por encima 95%.

Description

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DESCRIPCIÓN
SINTESIS Y USOS DE DERIVADOS DEL ACIDO PIROGLUTAMICO
5 CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a una nueva síntesis de derivados del ácido piroglutámico, un estereoisómero activo ópticamente aislado y sus usos, y a nuevos intermedios para la síntesis del mismo. La presente invención también se refiere al uso terapéutico de dicho derivado del ácido piroglutámico.
10 ANTECEDENTES DE LA INVENCION La patente europea EP 0768308 B1 da a conocer mezclas de estereoisómeros de los derivados del ácido piroglutámico que tienen la siguiente fórmula general
imagen1
15 donde R1, R2 y R3 pueden ser hidrógeno o -C (= O) Me y A puede ser Cl, CH3COO-o HO-para estimular la respuesta biológica inmune. El proceso descrito en este documento para la síntesis de dichos compuestos comprende la reacción de L-serina con un exceso molar de anhídrido acético y piridina bajo condiciones de calor. Por lo tanto, como se describe en dicho documento, los diferentes estereoisómeros nunca han sido aislados y los ensayos in vitro e in vivo
20 descritos en el mismo se realizan con la mezcla de los cuatro posibles estereoisómeros ópticamente activos todos juntos. No se describe indicación alguna sobre mezclas puras o enriquecidas de los estereoisómeros aislados. Además, no se da ninguna indicación sobre el aislamiento de los diferentes estereoisómeros ópticamente activos a partir de la mezcla descrita. Es conocido por el experto en la materia que los diferentes estereoisómeros ópticamente activos de un compuesto
25 pueden tener diferentes, o incluso opuestos, efectos. Por ejemplo, un compuesto puede tener efectos terapéuticos mientras que su enantiómero puede ser tóxico. Ejemplos de tales situaciones son bien conocidos por el experto en la materia. El dextrometorfano es un descongestionante, mientras levomethorphan es un narcótico potente.
imagen2CH3
H3C N
imagen3
imagen4N H H
imagen5
imagen6
imagen7
O
imagen8O
CH3 H3C
imagen9
DestrometorfanoLevometorfano Es también conocido el diferente comportamiento in vivo de la Perhexilina.
imagen10
imagen11
imagen12
imagen13NH
HN
imagen14
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S-PerhexilinaR-Perhexilina
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EP 0768308 B1 produce mezclas de estereoisómeros de los derivados del ácido piroglutamico.
Todos los intentos por separar las mezclas de estereoisómeros descritos en EP 0768308 B1, en compuestos sustancialmente puros de los mismos fallaron. Después de la sección experimental inventores, 5% del compuesto identificado como BLAS-236 (Cl) (1-(3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) de clorhidrato de cloruro de piridinio) en lo anterior citada patente europea
imagen21
N
imagen22 imagen23Cl
imagen24
Cl
H3N CO2H O imagen25H
BLAS-236(Cl)
se obtuvo como una mezcla de los cuatro estereoisómeros posibles. Además, su precursor inmediato BLAS-320 (Ac) (1-(1-acetil-3-acetilamino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) acetato de piridinio)
N
imagen26
AcO
imagen27
imagen28
HN
imagen29 imagen30 imagen31CO2H
imagen32
imagen33
Ac
O Ac
imagen34
imagen35
BLAS-320(Ac)
se sintetizó usando diferentes procedimientos. El compuesto de fórmula BLAS-320 (Ac) se obtuvo como una mezcla de estereoisómeros imposibles de purificar, debido principalmente a problemas de solubilidad (compuesto BLAS-320 (Ac) sólo era soluble en agua y metanol). Además, se intentó la sustitución de acetato de contraión por otros aniones en el compuesto de fórmula BLAS-320 (Ac), pero fracasó. Más aún, se intentó la transformación (o síntesis directa) y purificación adicional del compuesto de fórmula BLAS-320 (Ac) en los derivados éster de los mismos. Las mezclas negras de crudo obtenidas eran imposibles para purificar en todos los casos.
En vista de los hechos anteriores, se evidenció que la descripción de la EP 0768308 B1 era insuficiente para obtener los estereoisómeros sustancialmente puros deseados de los derivados del ácido piroglutámico mencionados en el mismo. Por lo tanto, se ideó un enfoque totalmente diferente. Síntesis de los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula I y mezclas de los mismos. Aquí se describe un proceso para la síntesis de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I
imagen36R3 Y
X
R1NH R4 NOO R2
(I)
dondeR1 se selecciona de -OH, -ORa, en el que Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; R2, R3 y R4 se seleccionan de forma independiente del hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza en condiciones ácidas o X es un anión farmacéuticamente aceptable; y Y es un residuo orgánico seleccionado entre
(i)
Un N que contiene un grupo de formula VIa
imagen37
imagen38
(VIa)
imagen39
5
10
15
20
25
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35
40
45
50
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(i) cuando R5 tiene carga negativa, Y es un N-que contiene residuo orgánico de fórmula VIIa
imagen40
imagen41
imagen42
imagen43
imagen44
(VIIa) donde
la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido; o
(ii) donde R5 es R3, Y es un N-que contiene residuo orgánico seleccionado
(ii.a) un N-que contiene un grupo de fórmula VIIb
Ra
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imagen46N
imagen47 imagen48Rb (VIIb) donde Ra y Rb son aquellos previamente descritos; o
(ii.b) un N-que contiene residuo orgánico de formula VIIc
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Z
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(VIIc) donde
la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido; y Z es un anión farmacéuticamente aceptable;
o mezclas de los mismos; y c) poner en contacto dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas de los mismos con medios ácidos que comprende un ácido de fórmula HX, donde X se describe como anteriormente, para pasar a dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I o mezclas de los mismos.
El papel de los grupos protectores de nitrógeno que hidrolizan bajo condiciones acidas (R2, R3 y/o R4) es proteger la funcionalidad del nitrógeno hasta el paso c) (transformando los compuestos de formula II en compuestos de formula I reaccionando dicho compuesto de formula II con un compuesto de formula HX). Cualquier grupo protector de nitrógeno que puede proteger el átomo de nitrógeno hasta el paso c) es adecuado para el presente procedimiento. Los grupos protectores de nitrógeno preferidos que se hidrolizan en condiciones ácidas son aquellos que pueden hidrolizarse durante la etapa c) al mismo tiempo la sal o disal se forma para dar un compuesto de fórmula I. De esta manera, durante la etapa c) los átomos de nitrógeno de la molécula se desprotegen y la sal o disal se forma en un solo paso sintético. Sin embargo, de acuerdo con la presente descripción, no es esencial que la sal o disal se forman al mismo tiempo que os átomos de nitrógeno se desprotegen. Por lo tanto, de acuerdo con la realización del proceso, la formación de la sal o la disal y la desprotección de los átomos de nitrógeno, pueden requerir más de un paso.
De acuerdo con una reivindicación principal, los grupos protectores de nitrógeno que se hidrolizan en condiciones ácidas se seleccionan de los carbamatos de la fórmula –(O=)C-O-Ra, donde Ra tiene el mismo significado que anteriormente, preferiblemente donde Ra es bencilo, –C(CH3)3 o -CH2CH3; o un sulfonato de fórmula –(O=)S(=O)-Ra donde Ra tiene el mismo significado que anteriormente, preferiblemente donde Ra es –CH3 o tosilato.
Otros grupos protectores que se hidrolizan en condiciones ácidas son conocidos por el experto en la materia; veanse libros de referencia tales como Greene y Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999. Cuando al menos uno de los R2, R3 y R4 es ftalimida, es necesario llevar a cabo un paso más antes de la formación de la sal o disal (antes del paso c) una reducción o reacción con hidrazina (para más detalles sobre cómo eliminar un grupo ftalimida, ver Greene y Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999). El compuesto de partida de fórmula IV del procedimiento descrito puede estar en forma de un compuesto enantioméricamente puro (es decir, R o S) o en forma de una mezcla de enantiómeros (R y S), opcionalmente enriquecido en uno de ellos. Tal como se utiliza aquí, el término "mezcla de enantiómeros" incluye cualquier mezcla de dos enantiómeros, ya sea en relaciones equimolares o no, y, como tal, incluye no sólo las mezclas racémicas de dichos dos enantiómeros sino también mezclas enriquecidas en cualquiera de dichos enantiómeros Cuando el compuesto de fórmula IV está en forma de un compuesto enantioméricamente puro, la reacción mencionada anteriormente puede producir dos productos (estereoisómeros), uno correspondiente al ataque desde la cara- y el otro correspondiente al ataque desde la cara-. En este caso, la reacción muestra una baja estereoselectividad y se obtiene una mezcla de los dos compuestos posibles (estereoisómeros) de cada uno de los enantiómeros del compuesto de fórmula IV Así, de acuerdo con una reivindicación concreta, el compuesto de fórmula IV está en la forma de un compuesto enantioméricamente puro. Si el isómero S del compuesto de fórmula IV se utiliza como material de partida, la reacción produce, en general, una mezcla de un compuesto de fórmula IIIa
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Aunque ésto puede parecer un inconveniente, los inventores han encontrado que los compuestos de la mezcla obtenida finalmente de la reacción del compuesto de fórmula IV con el compuesto de fórmula V se pueden separar fácilmente en los correspondientes estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula III, es decir, IIIa, IIIb, IIIc o IIId. Esto permite la síntesis de los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula Id, que es un aspecto de la presente invención.
Según una reivindicación concreta de la presente invención, el compuesto de fórmula IV está en forma de una mezcla de los dos enantiómeros posibles (R o S), opcionalmente, enantioméricamente enriquecida con respecto a uno de dichos enantiómeros. En tales casos, se selecciona el compuesto resultante de fórmula III a partir de una mezcla de IIIa, IIIb, IIIc y IIId (en relaciones equimolares o no); una mezcla de IIIa y IIIc en una relación equimolar o no; o una mezcla de IIIb y IIId en una relación equimolar o no. El compuesto de fórmula IV puede obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno de los enfoques sintéticos utilizados por los inventores se describe en el Esquema 1. El ácido glutámico 1 (en este caso, ácido D-glutámico) puede transformarse en un compuesto de fórmula 2 como se describe en Silverman, R.B.; Levy, M.A., J. Org. Chem. 1980, 45, 815. El segundo paso es la protección del nitrógeno amido, utilizando un método conocido (Flyn, D.L., et al., J. Org. Chem., 1983, 48, 2424) para obtener un compuesto de fórmula 3. Entonces, los dos pasos siguientes son: primero, la sustitución de la posición 3-del 2-pirrolidona con un grupo dimetilaminometil, lo que da 4 [(Lo que es realmente una mezcla de dos diasteroisómeros, ya que el centro quiral 3-no está controlado en el proceso) y la cuaternización con MeI, y la eliminación produce el compuesto de fórmula 5 (compuesto de formula IV, donde R1 es – OEt y R2 es BOC) que ya ha sido descrito en Panday, S. K.; Griffart-Brunel, D.; Langlois, N.; Tetrahedron Lett., 1994, 35, 6673. En este caso, el compuesto de fórmula IV obtenido tiene la configuración R. Cuando se desea la configuración S, el ácido L-glutámico se utiliza como material de partida (como una visión general, 5 tiene la misma configuración que el ácido glutámico de partida).
Esquema 1
CO2H
1) SOCl2
CO2Et
imagen54(Boc)2O, DMAP
2) KOH Et3N, CH2Cl2
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HO2C
NH2 3) heat imagen56N
OH
1 2
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3 45
Una primera variante del método mencionado anteriormente para la síntesis del compuesto 5 comprende la transformación de ácido glutámico 1 (en este caso, ácido D-glutámico) en el ácido piroglutámico de fórmula 1 'como se describe en Lennox J. R.; Turner, S. C.; Rapoport, H. J. Org. Chem. 2001, 66, 7078-7083. Dicho ácido piroglutámico de fórmula 1 'se transforma entonces en el compuesto de fórmula 2, descrito anteriormente, por esterificación en presencia de etanol y SOCl2 (véase el esquema 2).
imagen59Esquema 2
CO2H
H2O,reflux
CO2H
CO2Et
imagen60SOCl2, EtOH
NHO2C NNH2 OH imagen61OH
1 1' 2
Una segunda variante del método mencionado anteriormente para la síntesis del compuesto 5 comprende la transformación del compuesto de fórmula 2 en el compuesto de fórmula 3 usando DMAP como base y acetonitrilo (MeCN) como disolvente. Una tercera variante del método mencionado anteriormente para la síntesis del compuesto 5 comprende la transformación del compuesto de fórmula 3 en un compuesto de fórmula 4' por reacción con tBuOCH (NMe2) 2 (reactivo de Bredereck). Dicho compuesto de fórmula 4' se transforma en el compuesto de fórmula 5 en una secuencia de dos etapas. En primer lugar, haciendo reaccionar el compuesto de fórmula 4' con HCl diluido. A continuación, haciendo reaccionar el compuesto resultante con HCHO acuoso (37%) en presencia de una base inorgánica tal como se describe en el documento WO 2004039314 (véase el Esquema 3).
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Esquema 3
imagen64 imagen65NCH3
tBuOCH(NMe)2 i. HCl (1N), THF
CO2Et
CO2Et
imagen66CO2Et
ii. HCHO aq.(37%),
(CH3OCH2)2, 85ºC
NN O imagen67BOC O BOC K2CO3, THF imagen68N
O BOC
3 4' 5
Con el fin de lograr la formación del anillo de aziridina hay una serie de reactivos conocidos por la persona experta. Sin embargo, la elección del reactivo para la síntesis de espiro-aziridinas de dobles enlaces carbono-carbono no es fácil. Por ejemplo, el uso de cloramine-T en presencia de HBr / H2O2 (L.J. Suman; B.S. Sharma; S. Bir. Tetrahedron Letters 2004, 45, 8731) no produjo la aziridina deseada, sino derivados clorados de la siguiente fórmula general
Cl
R4HN
Después de un número de experimentos, se encontró que el reactivo más adecuado para la reacción era la benzyliodinane de fórmula V. De acuerdo con una realización particular, R4 se selecciona de –(O=)C-O-C(CH3)3, – (O=)C-O-CH2CH3, –(O=)S(=O)-tosilo o ftalamida. En una reivindicación principal, el compuesto de fórmula V es Ntosyliminobenzyliodinane (Baron E.; O’Brien P.; Towers T.D. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 723), que puede sintetizarse siguiendo el método descrito en Gillepia, K., Synthetic Comunn. 2001, 123.
La reacción del compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV, o mezclas de los mismos, con el compuesto de fórmula V para obtener un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas de los mismos, puede llevarse a cabo, si se desea, en presencia de un catalizador, preferiblemente a base de cobre, más preferiblemente seleccionado de Cu(ft)2 o Cu(acac)2, donde “ft” es ftalocianina y “acac” es acetoacetato. Para más detalles relativos a catalizadores y condiciones, vease Baron, E.; O’Brien, P.; Towers, T. D. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 723 y S. L. Jain, B. Sain, Journal of molecular catalysis A: Chemical 2003, 195, 283. Esta reacción se lleva a cabo típicamente en un disolvente orgánico adecuado a una temperatura adecuada, preferiblemente una temperatura comprendida entre 0 y 100ºC. Aunque prácticamente cualquier disolvente orgánico adecuado puede ser utilizado en dicha reacción (por ejemplo, acetonitrilo, dimetilformamida, etc.), en una reivindicación determinada, cuando el compuesto de fórmula IV es 4-metilen-5-oxopirrolidina-1,2-dicarboxílico éster de 1-terc-butilo 2-etil éster y el compuesto de fórmula V es N-tosyliminobenzyliodinane (phi = NTs) [Ejemplos 3.1 y 4.1], el disolvente orgánico es acetonitrilo y la reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 0ºC y la temperatura ambiente (aproximadamente 18ºC24ºC). Además, los estereoisómeros sustancialmente puros del compuesto de fórmula III, o mezclas de los mismos, pueden ser utilizados para la obtención de los estereoisómeros sustancialmente puros de los derivados de ácido piroglutámico de Fórmula I, o mezclas de los mismos, a través de los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula II o mezclas de los mismos. Por lo tanto, en la presente invención, un estereoisómero sustancialmente puro de fórmula IIId o mezclas de los mismos, se transforma adicionalmente en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IId o mezclas de los mismos, por medio de una estrategia que depende de la naturaleza de R5 e Y . En consecuencia, se describe que:
(A) con a fin de preparar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IId en el que R5 tiene una carga negativa e Y es un residuo orgánico de fórmula VIIa que contiene N, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IIId o mezclas de los mismos, se hace reaccionar con un nitrógeno que contiene nucleófilo de fórmula VIIIa
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VIIIa donde
la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido, o
(B) con el fin de preparar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IId o mezclas de los mismos en donde R5 es R3 e Y es un residuo orgánico de fórmula VIIb que contiene N, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas de los mismos, se hace reaccionar con un nucleófilo que contiene nitrógeno de fórmula VIIIb
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IIb donde R1, R2, R4, R5 y Y son aquellos previamente descritos; c) un compuesto sustancialmente puro de fórmula IIc,
R5
5
IIc donde R1, R2, R4, R5 y Y son aquellos previamente descritos; d) un compuesto sustancialmente puro de formula IId,
R5
10 IId donde R1, R2, R4, R5 y Y son aquellos previamente descritos; y e) cualquier mezcla de los compuestos de fórmula IIa, IIb, IIc y/o IId (en una relación equimolar o no) anteriormente mencionados
15 Un aspecto de la presente invención se refiere al compuesto sustancialmente puro de fórmula IId,
IId wherein R1 is selected from –OH, –ORa, wherein Ra is selected from substituted or unsubstituted alkyl;
donde R1 se selecciona de -OH, -ORa, donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido;
20 R2, R3 and R4 son independientemente seleccionados del hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas seleccionados de carbamatos de la fórmula -(O =) CO-Ra, donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido; o un sulfonato de la fórmula -(O =) S (= O) -Ra donde Ra tiene el mismo significado que anteriormente, preferiblemente donde Ra es -CH3, o ftalamida; R5 se elige de carga negativa o R3, en donde R3 es como se define anteriormente; y
25 Y es un residuo orgánico seleccionado de un residuo orgánico de fórmula VIa que contiene N
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(VIa)
donde 30 la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX
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donde R1, R2, R3, R4, X e Y son aquellos previamente descritos; y a)cualquier mezcla de la mencionada compuesto sustancialmente puro anterior de fórmula Id, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los compuestos siguientes:
5 (i)1-(3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) de clorhidrato de cloruro de piridinio
Aunque algunos compuestos de fórmula I, a saber (i) 1-(3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) clorhidrato de cloruro de piridinio, y (ii) 1-(1-acetil-3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) clorhidrato de cloruro de piridinio se han descrito como mezclas de todos los cuatro estereoisómeros posibles de los mismos, no se ha logrado hasta la fecha la
10 síntesis de sus estereoisómeros esencialmente puros. En una reivindicación concreta, en el compuesto de formula Id, R1 es –OH. En otra determinada reivindicación de la presente invención, en el compuesto de fórmula Id, R2 es hidrogeno. En otra particular reivindicación de la presente invención, en el compuesto de formula Id, R3 o R4, independientemente, es hidrógeno.
15 En otra particular reivindicación de la presente invención, en el compuesto de fórmula Id, X es un anión farmacéuticamente aceptable, preferiblemente bromuro o cloruro. . En otra particular reivindicación de la presente invención, en el compuesto de formula Id, R1 es OH; R2 es hidrógeno; R3
o R4, independientemente, son hidrógeno, y/o X es un anión farmacéuticamente aceptable preferentemente bromuro o
cloruro. 20 En otra reivindicación concreta, en el compuesto de fórmula Id, Y es un residuo orgánico procedente de
imagen80Cl Cl
imagen81Cl
imagen82Br
Br
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N
N
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X
X
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CH3 CH3
CH3
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H3C
CH3
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N
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X
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X
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N
imagen116CO2Me
OMe
MeO
OMe
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N
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X
X
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Ph
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Según una determinada reivindicación de la invención, dicho compuesto de fórmula I es un compuesto sustancialmente puro de fórmula I’d
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-un compuesto de fórmula VIIIa y con un compuesto de fórmula X.
Compuesto de fórmula III
Aquí se describe un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas de los mismos. Dicho compuesto de fórmula III tiene dos centros quirales; por lo tanto, puede estar en forma de cualquiera de los estereoisómeros sustancialmente puro o mezcla de los mismos. En una reivindicación determinada, se selecciona el compuesto de fórmula III a partir del grupo consistente en los compuestos de fórmula IIIa, IIIb, IIIc, IIId y cualquier mezcla de los mismos. En otra concreta reivindicación, se describe una mezcla que comprende dos o más compuestos de fórmula IIIa, IIIb, IIIc y IIId. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas mezclas incluyen mezclas de dos de esos compuestos (ej., mezclas de IIIa y IIIb, IIIa y IIIc, IIIa y IIId, IIIb y IIIc, IIIb y IIId o IIIc y IIId), o mezclas de tres de los citados compuestos (ej., mezclas de IIIa, IIIb y IIIc, IIIa, IIIb y IIId, o IIIb, IIIc y IIId), o mezclas de los cuatro compuestos citados (ej., una mezcla de IIIa, IIIb, IIIc y IIId). Cada compuesto particular (IIIa a IIId) puede estar presente en dicha mezcla en cualquier proporción o relación de, por ejemplo, en proporciones o relaciones equimolares o en diferentes proporciones o ratios donde uno o más de dichos compuestos están en exceso con respecto al otro (s ). En un aspecto esta invención se refiere al estereoisómero sustancialmente puro de fórmula IIId en la que R1 procede de -OH y -ORa, donde preferiblemente Ra es un grupo alquilo. De acuerdo con otra reivindicación determinada, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas de los mismos, es un compuesto en el que R2 es -(O=)CO-Ra, preferiblemente el grupo BOC.
De acuerdo con otra reivindicación particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas de los mismos, es un compuesto donde R4 es -(O=)S(= O)-Ra, preferiblemente tosilo. De acuerdo con otra concreta reivindicación, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas de los mismos, es un compuesto en el que R1 es -ORa, preferiblemente en el que Ra es un grupo alquilo; R2 es -(O=)C-O-Ra, preferiblemente el grupo BOC; y R4 es -(O=)S(=O)-Ra, preferiblemente tosilo. De acuerdo con otra reivindicación particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas de los mismos, es un compuesto donde R2, R4 y R5, son, independientemente, hidrógeno. El compuesto estereoisómero sustancialmente puro de fórmula IIId, se puede obtener, como se mencionó anteriormente, por medio de un proceso que consiste en hacer reaccionar un compuesto de fórmula IV, ya sea en una forma enantioméricamente pura o en forma de una mezclas de enantiómeros, con un compuesto de fórmula V. Dicho proceso constituye un aspecto adicional de la presente invención. Por medio de dicho procedimiento, también es posible obtener un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IIId.
Usos del compuesto de fórmula I y composiciones farmacéuticas Los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula I, o mezclas de los mismos, se pueden utilizar como ingredientes activos de medicamentos para el tratamiento y / o profilaxis de algunas enfermedades del individuo, por ejemplo, tumores, inmunodeficiencias, infecciones, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades susceptibles de ser tratadas con el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I o mezclas de los mismos, incluyen: A) Cáncer-o enfermedades relativas a tumores: que comprenden prácticamente todos los tipos de cáncer y tumores, incluyendo La leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda en adultos, leucemia mieloide aguda infantil, leucemia mieloide aguda en adulto, Carcinoma de la corteza suprarrenal, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) Cánceres relacionados, cáncer anal, astrocitoma, astrocitoma cerebeloso infantil, Carcinoma Cali Basal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga extrahepático, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, osteosarcoma / histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de las vías ópticas y del hipotálamo, el cáncer de mama, Adenomas / carcinoides mate bronquiales, linfoma de Burkitt infantil, tumor carcinoide, carcinoma gastrointestinal de origen primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso primario, astrocitoma/glioma cerebral maligno, cáncer de cuello de utero, cáncer infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumores infantiles de Ewing, tumores extracraneales de células germinales, tumores extragonadales de células germinales, cáncer extrahepático de vias biliares , cáncer de ojo, melanoma intraocular, Retinoblastoma, cancer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de células germinales, glioma trofoblástico de ovario gestacional, glioma del adulto, glioma del tronco encefálico, glioma astrocitoma cerebral, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, hepatocelular (hígado) cáncer, cáncer hepatocelular (hígado) de Adultos, linfoma (primaria) de Hodgkin infantil, linfoma de Hodgkin en adultos, Cáncer de la hipofaringe, melanoma intraocular, carcinoma de células Islet (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, Cáncer células renales, cáncer de riñón, cáncer de laringe , leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de células pilosas, cáncer de labio y de la cavidad oral, cáncer de pulmón infantil, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin en adulto, linfoma infantil de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin adulto, linfoma no-Hodgkin infantil, Sistema Nervioso Central primario, macroglobulinemia, Histiocitoma de hueso/osteosarcoma fibroso maligno de Waldenstrom, meduloblastoma, melanoma, Carcinoma intraocular (ojo) de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma adulto maligno, Niñez cancer escamoso metastásico de cuello infantil con tumor primario oculto, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, neoplasia de celulas de plasma/mieloma multiple infantil, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos Enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leukemia mielógena, Leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda en adultos, mieloma agudo infantil, trastornos mieloproliferativos múltiples, cáncer crónico de
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la cavidad nasal y del seno paranasal, Cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma infantile , cáncer oral, cáncer infantil de la cavidad oral, cáncer de labios y de de orofaringe, osteosarcoma / fibroso maligno, histiocitoma de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial ovárico infantil, tumor de ovario de células germinales , Tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas infantil, Cáncer de células de los islotes del seno paranasal y de la cavidad nasal, Cáncer de la paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, Tumor hipofisario infantil, Neoplasia de células plasmáticas / mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales (riñón), cáncer infantil de pelvis renal y del uréter, cáncer de células de transición, , rabdomiosarcoma, cáncer infantil de glándula salival, cáncer de glándula salival, sarcoma infantil, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, Sarcoma de tejidos blandos, Sarcoma infantil de tejidos blandos, síndrome uterino de Sezary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer infantil de piel (melanoma), carcinoma de piel, cáncer de células de Merkel, cáncer de pulmón microcítico, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, Adulto sarcoma de tejido blando, el carcinoma infantil de células escamosas, cáncer escamosas del cuello como tumor primario oculto, cáncer de estómago (gástrico) metastásico, tumores infantiles neuroectodérmicos primitivos supratentorialesLinfoma infantil de células T , cáncer testicular, timoma, timoma infantil y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer infantil de células de transición, cancer la pelvis y tumor trofoblástico del uréter, tumor gestacional de localizacion primario desconocido, cáncer de células de transición, cáncer de uretra, cáncer uterino, sarcoma endometrial uterino, cáncer vaginal, glioma de las vías ópticas y del hipotálamo, cáncer infantil de vulva, tumor de Waldenstrom, Macroglobulinemia, tumor de Wilms, etc .; B) Infecciones: comprenden prácticamente todo tipo de infecciones, como las infecciones por bacterias, por hongos, y de origen viral; o C) Enfermedades autoinmunes: comprenden prácticamente todas las enfermedades autoinmunes que se mencionan en el sitio web de la "American Autoinmmunes Related Diseases Association” [http://www.aarda.org], incluyendo la esclerosis múltiple (MS), La enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo 1, psoriasis, lupus, colitis ulcerosa, vitíligo, enfermedad celíaca, vasculitis, dermatomiositis, polimiositis, tiroiditis (Hashimoto, Graves), miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barre, uveítis, liquen plano, arteritis temporal, sarcoidosis, síndrome seco (Sjoegren), asma bronquial, pénfigo, espondilitis anquilosante, la esclerodermia, la fibromialgia, la fiebre reumática, etc.
Así, de acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica, en lo sucesivo referida como la composición farmacéutica de la invención, que comprende un compuesto de fórmula Id, en donde dicha composición farmacéutica no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros del compuesto: (i) 1-(3amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium chloride hydrochloride.
En una reivindicación concreta, la composición farmacéutica de la invención contiene, como ingrediente activo, al menos el estereoisómero sustancialmente puro Id, en el que dicha composición farmacéutica no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los compuestos mencionados anteriormente (i), en una cantidad terapéuticamente eficaz. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de ingrediente activo calculada para producir el efecto deseado y se determina generalmente, entre otras razones, por las propias características del ingrediente activo usado y del efecto terapéutico a obtener. En una reivindicación concreta, la dosis de ingrediente activo administrado a un sujeto en demanda de tratamiento para el tratamiento y / o profilaxis de las enfermedades anteriormente mencionadas está dentro del rango de 10-10 a 1010 mg/kg de peso corporal, típicamente entre 10-3 y 103 mg/kg de peso corporal.
El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el ingrediente activo. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen en el petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Las soluciones de agua o soluciones acuosas, las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa acuosa y glicerol se emplean preferiblemente como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Vehículos farmacéuticos apropiados son descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Además, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y normalmente no producen una reacción adversa alérgica o similar, como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, como se usa en este documento, el término "farmacéuticamente aceptable" quiere decir que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o listado en la Farmacopea de los EE.UU. o en otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Para su administración a un sujeto, tal como un mamífero, por ejemplo, un ser humano, que necesita tratamiento, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse por cualquier vía apropiada, tales como, oral (por ejemplo, oral, sublingual, etc.), parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intramuscular, etc.), vaginal, rectal, nasal, tópica, oftálmica, etc. La composición farmacéutica de la invención, que se obtiene mezclando el ingrediente activo (s) con el adecuado vehículo-s farmacéuticamente aceptable, se puede administrar en una pluralidad de formas farmacéuticas de administración, por ejemplo, sólido, líquido, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de dichas formas farmacéuticas de administración de la composición farmacéutica de la invención incluyen gotas orales (solución, suspensión, emulsión, etc.); formulaciones orales (líquido, solución, suspensión, emulsión, gel, pasta, polvo, etc.); liofilizado oral; goma oral; polvo para solución oral o suspensión; gránulos; gránulos gastrorresistentes; gránulos de liberación prolongada; gránulos de liberación modificada; gránulos para suspensión oral; polvo y disolvente para solución oral o suspensión; jarabe; polvo para jarabe; gránulos para el jarabe; tabletas (por ejemplo, comprimidos soluble, comprimidos dispensables, tabletas recubiertas, comprimidos recubiertos con película, tableta efervescente, comprimidos bucodispensables, tableta gastrorresistente, comprimido de liberación prolongada, tabletas de liberación modificada,
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Esquema 6
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CO2Et
(R)-5
PhI=NTs
CO2Et
imagen155CO2Et imagen156CO2Et
imagen157N imagen158Separation imagen159N imagen160
imagen161Separation N
NBOC Ts Ts
Ts OO O
7c 7 7d
1) Pyridine
1) Pyridine
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imagen164N imagen165N
imagen166CO2Et CO2Et
N NBOC
N
NBOC Ts
Ts imagen167O O 8d 8c
2) H+, heat 2) H+, heat
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Br
N
Br imagen170
imagen171
N
Br Br
imagen172
imagen173H3N
H3N CO2H
CO2H
N Oimagen174H N Oimagen175H
9d 9c
5
4.1.1 Síntesis de 3R, 6R-4-oxo-1-(4-toluenesulfonyl)-1,5-diazaspiro[2,4]heptane-5,6-dicarboxylic acid 5-tertbutylester 6ethyl ester 7c y 3S, 6R-4-oxo-1-(4-toluenesulfonyl)-1,5-diazaspiro[2,4]heptane-5,6-dicarboxylic acid 5-tertbutylester 6ethyl ester 7d A una solución fría (0ºC, baño de agua helada) de (R)-5 (3.02 g, 11.21 mmol) se añadió acetonitrilo seco (12 mL),
10 PhI=NTs (ver ejemplo 2) (6.27 g, 16.8 mmol), seguido de Cu(acac)2 (293 mg, 1.12 mmol). La mezcla heterogénea resultante se removió a 0ºC durante 15 minutos, y se dejó templar a temperatura ambiente y fue removida durante la noche. A la mezcla resultante se añadió NaOH 1 M (50 mL), y la mezcla se extrajo con EtOAc (3x 25 mL). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera (25 mL), secadas sobre anhidro Na2SO4 y evaporadas hasta sequedad. El aceite crudo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, hexanos / EtOAc: 2/1) para obtener la aziridina 7c (730 mg) y 7d
15 (287 mg) en forma de sólidos blancos (rendimiento combinado: 23%). 7c: M.p.: 94-95ºC []D25ºC= +42º (0.032, CHCl3) IR (KBr, cm-1): 2977, 2928, 1808, 1746, 1352, 1298, 1251, 1192, 1161, 988,690.
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Esquema 7
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(S)-5
PhI=NTs
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imagen181CO2Et
CO2Et
CO2Et
N Separation
Separation imagen182N
NBOC
NBOC Ts Ts imagen183Ts OO O
7b 7 7a
1) Pyridine
1)Pyridine
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imagen187CO2Et
CO2Et
N
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NBOC
Ts
Ts
O
O
8a
8b
2)H+, heat
2) H+, heat
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Br
N
N
Br
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H3N
CO2H
CO2H
N
N imagen195OH
Oimagen196H
9a
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5.2.2 Síntesis one-pot de 3R,5S-1-(3-amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hydrobromide 9b Una mezcla de aziridina 7b (200 mg, 0.46 mmol), montmorillonita MK10 (20% weight, 40 mg) y piridina (37 L, 0.46 mmol) fue radiada en microondas (300 W) a 100ºC, y durante 10 minutos. La mezcla cruda se diluyó en EtOAc (10mL), filtro y evaporó en vacío hasta que el análisis por HPLC no mostró resto de piridina. La betaína 8b fue utilizada en el siguiente paso sin purificación adicional (93% pureza por HPLC). El aceite crudo marrón se disolvió en HBr acuoso al 48% (20 ml) y se calentó a reflujo durante 18 horas. La mezcla se diluyó con agua y se lavó con EtOAc (2x10 ml), la fase acuosa se evaporó a sequedad. El aceite crudo fue purificado por cromatografía empleando polvo de celulosa: SiO2 polvo de celulosa: carbón activado, (1cm: 0.5cm: 0,5 cm: 2 cm) como fase estacionaria, obteniéndose 9b como un sólido (44 mg, 24%). M.p.> 200ºC. []D25ºC= -09º (0.12, CH3OH) IR (KBr, cm-1): 3435, 3049, 1724, 1631, 1513, 1475, 1420, 1384, 1280, 1190, 1144, 683. 1H-NMR (D2O, 500 MHz) 8.82 (d, 2H, J=5.3Hz); 8.59 (t, 1H, J=7.8Hz); 8.08 (t, 2H, J=6.8Hz); 5.23 (d, 1H, J=14.3Hz);
4.97 (d, 1H, J=14.3Hz); 4.28 (t, 1H, J=9.2Hz); 3.06 (dd, 1H, J=13.9Hz, J=9.3Hz); 2.13 (t, 1H, J=7.8Hz) ppm.13C (D2O, 125 MHz): 173.4, 172.4, 147.0, 145.0, 128.5, 65.7, 64.8, 49.3, 33.9 ppm. MS (ESI+): m/z: 236 (M+1-2Br)
EJEMPLO 6 Síntesis pore tapas de 3S,5S-1-(3-amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hydrobromide
6.1 Síntesis de la Betaína 8a Siguiendo el mismo procedimiento del ejemplo 5, una mezcla de aziridina 7a (311 mg, 0.71 mmol), montmorillonita MK10 (20% peso, 60 mg) y piridina (58 L, 0.71 mmol) es radiada en microondas (300 W) a 100ºC, y durante 10 minutos. La mezcla cruda se diluyó con EtOAc (10 ml), se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis HPLC no mostró piridina restante. La betaína 8a se puede purificar mediante tratamiento con éter dietílico, siendo el producto aislado un sólido blanco.M.p.: 127-128ºC IR (KBr, cm-1): 3434, 2980, 1786, 1746, 1489, 1370, 1311, 1287, 1199, 1153, 1121, 555.1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 9.2 (d, 2H, J=5.6Hz); 8.3 (t, 1H, J=7.7Hz); 7.89 (t, 2H, J=6.9Hz); 7.69 (d, 2H, J=8.0Hz); 7.10 (d, 2H, J=8.0Hz); 5.07 (d, 1H, J=13.0Hz); 4.89 (d, 1H, J=12.6Hz); 4.27 (t, 2H, J=7.1Hz); 4.20-4.13 (m, 2H); 2.81 (dd, 1H, J=12.8Hz, J=7.1Hz); 2.31 (s, 3H); 2.04-1.98 (m, 1H); 1.38 (s, 9H); 1.25 (t, 3H, J=7.1Hz) ppm. MS (ESI+): m/z: 518 (M+1).
Alternativamente, la betaína 8a se obtuvo por calentamiento de la misma mezcla de reacción (7a aziridina (311 mg, 0,71 mmol), MK10 montmorillonita (20% peso, 60 mg) y piridina (58 L, 0,71 mmol)) a 90ºC durante 7 horas. La mezcla cruda se diluyó con EtOAc (10 ml), se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis HPLC no mostró piridina restante. El rendimiento obtenido fue similar al rendimiento obtenido usando microondas.
6.2 Síntesis de 3S,5S-1-(3-amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hydrobromide 9a La betaína pura 8a obtenida en el paso anterior se disolvió en HBr acuoso al 48% (30 ml) y se calentó a reflujo durante 18 horas. La mezcla se diluyó con agua y se lavó con EtOAc (3x10 ml), la fase acuosa se evaporó a sequedad. El aceite crudo se purificó por cromatografía empleando polvo de celulosa: SiO2 polvo de celulosa: carbón activado, (1cm: 0.5cm: 0,5 cm: 2 cm) como fase estacionaria, produciendo 9a como un sólido (110 mg, 40%). M.p.: > 200ºC. []D25ºC= -49º (0.069, CH3OH) IR (KBr, cm-1): 3433, 3051, 1724, 1633, 1488, 1420, 1384, 1281, 1188, 1144, 1083, 683. 1H-NMR (D2O, 500 MHz) 8.82 (d, 2H, J=5.3Hz); 8.59 (t, 1H, J=7.8Hz); 8.08 (t, 2H, J=6.8Hz); 5.23 (d, 1H, J=14.3Hz);
4.97 (d, 1H, J=14.3Hz); 4.28 (t, 1H, J=9.2Hz); 3.06 (dd, 1H, J=13.9Hz, J=9.3Hz); 2.13 (t, 1H, J=7.8Hz) ppm.13C (D2O, 125 MHz): 173.1, 172.6, 147.2, 145.6, 128.6, 63.9, 63.7, 49.2, 32.7 ppm. MS (ESI+): m/z: 236 (M+1-2Br).
EJEMPLO 7 Efectos de los distintos isómeros (9a, 9b, 9c and 9d) en el crecimiento del tumor.Tumor ensayado: Renca
Este ensayo se hizo con el fin de comprobar el efecto de cada estereoisómero en el crecimiento tumoral in vivo en ratones estimulados con células RENCA. Su efecto se comparó con placebo. Los estereoisómeros ensayados fueron:
Isómero 1: 3R,5S-1-(3-Amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hidrobromide (9b) Isómero 2: 3R,5R-1-(3-Amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hidrobromide (9c) Isómero 3: 3S,5S-1-(3-Amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hidrobromide (9a) Isómero 4: 3S,5R-1-(3-Amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hidrobromide (9d)
Estos isómeros se pueden obtener de acuerdo con el procedimiento descrito en los Ejemplos 4, 5 y 6.
MATERIALES Y METODOS Tumor Renca es un carcinoma de células renales originado en la cepa de ratón Balb/C, y por lo tanto singénico en ratones con antecedentes genéticos Balb/C (Melder RJ et al., Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54:535-547; Felluga B et al., 1969, J. Natl. Cancer Inst. 43:319-333). Renca se considera un tumor inmunogénico moderado y se utiliza como modelo
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adecuado para testar enfoques de immuno-intervencion (Salup RR, et al., 1992, The Journal of Urology, 147:11201123). Las células Renca (CLS, Eppelheim, Germany) se mantuvieron in vitro por pases seriados cada 3-4 días. Los cultivos se llevaron a cabo con medio de medio RPMI (RPMI, 10% de suero fetal de ternera, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, 80 µg/ml de gentamicina, todos ellos adquiridos de Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) cultivando 5 x 106 células en frascos de cultivo de 75 cm2. Las células tumorales recogidas a partir de cultivos de 48 horas sobre tripsinización (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se utilizaron como fuente de células Renca para los estudios descritos a continuación.
Fármacos en estudio
Principio activo Isómero 1 (9b) a 2,815 mg/mL en solución salina fisiológica estéril. Isómero 2 (9c) a 2.520 mg/mL en solución salina fisiológica estéril. Isómero 3 (9a) a 2.080 mg/mL en solución salina fisiológica estéril. Isómero 4 (9d) a 3.040 mg/mL en solución salina fisiológica estéril. Placebo Solución salina fisiológica. (Grifols, Barcelona, Spain)
Ratones
Animal Balb/c AnNHsd
Justificación para la selección: cepa de ratón singénico inbred con Renca
Proveedor CRIFFA – Charles River
Número de animales del estudio ca. 181 machos
Edad
al inicio
8-10 semanas
Peso
Tratamiento 25-30 g
Identificación
Por medio de una técnica de perforación en la oreja
Tamaño de la muestra
Según los datos anteriores, el tamaño de la muestra necesario para alcanzar significación era de 26 animales por grupo. Este tamaño de la muestra se calculó utilizando el software Epi-Info v6.0 (Fleiss. Statistical Methods for rates and Proportions. 2nd Ed, Wiley, 1981: 38-45) y fue estimada para una potencia estadística de 0,8, con un nivel de confianza de 0,95 para una disminución de dos veces en la superficie del tumor y una relación de 1-1 de control de caso.
Equipamiento
Campana de flujo laminar, baño, microscopio invertido, cámara de recuento, incubadora de CO2, centrífuga, pinza, saldos, pipetas ajustables, contenedor de nitrógeno, nevera / congelador y jaulas de ratones immunodeficientes.
Reactivos
Trypan blue (Sigma, St. Louis, MO, USA) PBS estéril (Sigma, St. Louis, MO, USA) Suero salino fisiológico (Grifols, Barcelona, Spain)
Dosis, vehículo, ruta y volumen de administración
Dosis
Cada isómero se ensayó a los niveles de dosis de 260 ng administrados en los días 6, 7 y 14 después de la inoculación del tumor.
Vehículo
El vehículo en el que se diluyeron los isómeros era solución salina fisiológica.
Ruta de administración y volumen.
Los tratamientos se dieron por vía intraperitoneal (ip). El volumen inoculado fue de 0,2 ml/animal. Esta ruta fue elegida porque es la descrita en el método original (Pérez S, et al., 2003, Clinical Cancer Research. 9:5776-5785).
Diseño del estudio
Los tumores se crearon mediante inoculación subcutánea en el flanco posterior derecho. Los ratones (Balb/c) fueron inoculados con 0,2 ml que contenían 105 células RENCA viables. El día de la inoculación subcutánea será considerado el Día 0 del ensayo.
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Tabla 2 VOLUMEN (mm3) Valores globales (Mediana)
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (1er día) Días después de la inoculación del tumor
0
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P.S.
- A1 31 0 0 10 108 256 726
isómero 1
260 C1 30 0 0 22,75 108 329,25 907,5
isómero 2
260 C2 28 0 0 13,5 126 278,75 613,25
isómero 3
260 C3 30 0 0 4 36 148,75 405
isómero 4
260 C4 30 0 0 0 13,5 62,5 238,25
5
Las tablas 3 y 4 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como valores medios. Estas tablas resumen la media de superficie (Tabla 3) o del volumen (Tabla 4) en los grupos de ratones de los isómeros o del PS en cada día marcado.
Tabla 3 10 SUPERFICIE (mm2)Valores Totales (Media)
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (1er día) Días después de la inoculación del tumor
0
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P.S.
- A1 31 0 0,19 10,52 33,16 68,45 134,9
isomero 1
260 C1 30 0 1,2 14,1 44,07 86,6 149,97
isomero 2
260 C2 28 0 1,6 14,46 55,14 96,86 156,53
isomero 3
260 C3 30 0 0,3 7,5 31 64,57 106,17
isomero 4
260 C4 30 0 0 2,87 15,47 37,37 81,3
Tabla 4 VOLUMEN (mm3) Valores Totales (Media)
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (1er día) Días después de la inoculación del tumor
0
11 14 18 21 25
P.S.
- A1 31 0 0,16 24,52 106,71 312,58 816,93
isomero 1
260 C1 30 0 1,73 36,88 174,37 429,07 895,58
isomero 2
260 C2 28 0 2,34 32,05 217,43 453,89 938,48
isomero 3
260 C3 30 0 0,28 14,55 101,4 278,15 557,18
isomero 4
260 C4 30 0 0 4,73 40,67 126,42 372,82
20 Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 3 frente a placebo. Estas diferencias, tanto en superficie como en volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0,05) en los días 18 y 25 del desarrollo de tumores según los cálculos del U-test de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 4 frente a placebo. Estas diferencias, tanto en superficie como en volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0.01) todos
25 los días marcados después del día 14 del desarrollo del tumor, calculado según el U-Test de Mann-Whitney. La Figura 1 representa la gráfica de la mediana de superficies tumorales (Grupos A1, C1, C2, C3, C4) mientras que la Figura 2 representa la gráfica de la mediana de los volúmenes tumorales (Grupos A1, C1, C2, C3, C4). Como puede verse en estas figuras hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 3 y el isómero 4 frente a placebo.
30 La Figura 3 representa la gráfica de las medias de las superficies tumorales (Grupos A1, C1, C2, C3, C4) mientras que la Figura 4 representa el gráfico de las medias de los volúmenes tumorales (Grupos A1, C1, C2, C3, C4). Como puede verse en estas figuras hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 3 y el isómero 4 frente a placebo. Los resultados muestran que el isómero 3 y el isómero 4 inhiben el crecimiento in vivo del carcinoma de células renales
35 (Renca), el isómero 4 muestra el mayor efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral Renca.
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EJEMPLO 8
Comparativa del crecimiento del tumor entre los diferentes isómeros (9a, 9b, 9c y 9d) y la mezcla BLAS.
Tumor ensayado: ASB XIV
Este ensayo se realizó para comparar el efecto de cada estereoisómero sobre el crecimiento in vivo del tumor en ratones con el efecto de la mezcla de todos ellos frente a tumores ASB XIV. Los estereoisómeros ensayados fueron los mismos que los del ejemplo 7 anterior más una mezcla de todos ellos (BLAS). El equipamiento (cuando sea necesario), los reactivos, la dosis, el vehículo y la ruta y el volumen de la administración fueron los mismos que en el ejemplo 7.
MATERIALES Y METODOS Tumor ASB XIV es un carcinoma pulmonar de células escamosas creado en la cepa de ratón Balb/c, y por tanto singénico en ratones con antecedentes genéticos Balb/c.
Las células ASB XIV (CLS, Eppelheim, Alemania) se mantuvieron in vitro mediante pases seriados cada 3-4 días. Los cultivos se realizaron con medio RPMI (RPMI, 10% de suero fetal de ternera, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, 80 µg/mL de gentamicina, todos ellos fueron adquiridos a Sigma, St . Louis, MO, EE.UU.) mediante el cultivo de 5 x 106 células en frascos de cultivo de 75 cm2. Las células tumorales recogidas a partir de cultivos 48 horas sobre tripsinización (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se utilizaron como fuente de células ASB XIV en el presente ejemplo.
FARMACO EN ESTUDIO
Principio Activo
BLAS (mezcla de isómeros 1, 2, 3 y 4) a una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril.
Isómero 1 (9b) una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril.
Isómero 2 (9c) a una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril.
Isómero 3 (9a) a una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril.
Isómero 4 (9d) a una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril. Placebo Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, Spain)
Ratones
Animal Balb/c AnNHsd
Justificación de la selección de cepas de ratón singénico Inbred con células ASB XIV Proveedor CRIFFA – Charles River
Nº de animales en estudio 187 ca. machos
Edad
al inicio del
8-10 semanas
Peso
tratamiento 25-30 g
Identificación
Mediante una técnica de perforación de oreja
Tamaño de la muestra
De acuerdo con los datos anteriores el tamaño de la muestra necesario para alcanzar significación fue de 26 animales por grupo. Este tamaño de la muestra se calculó utilizando el software Epi-info v6.0 y se estimó para una potencia estadística de 0,8, con un nivel de confianza de 0,95 para una disminución de dos veces en la superficie del tumor y una relación de 1-1 de control del caso.
Diseño del estudio
Los tumores se crearon mediante inoculación subcutánea en el flanco posterior derecha. Los ratones (Balb/c) fueron inoculados con 0,2 ml que contenían 2 x 105 células viables de ASB XIV. El día de la inoculación subcutánea será considerado Día 0 de la prueba. Los ratones Balb/c inoculados con células ASB XIV se distribuyeron en 6 grupos experimentales:
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Grupo (A1) BALB/C
n 32 Sexo Macho Tratamiento Placebo (P.S.) Dosis* Días 6, 7 y 14 Ruta i.p.
(B1) BALB/C
31 Macho BLAS 260 ng 6, 7 y 14 6, 7 y 14 i.p. i.p.
(C1) BALB/C
31 Macho isomero 1 260 ng 6, 7 y 14 6, 7 y 14 i.p. i.p.
(C2) BALB/C
31 Macho isomero 2 260 ng 6, 7 y 14 6, 7 y 14 i.p. i.p.
(C3) BALB/C
31 Macho isomero 3 260 ng 6, 7 y 14 6, 7 y 14 i.p. i.p.
(C4) BALB/C
31 Macho isomero 4 260 ng 6, 7 y 14 6, 7 y 14 i.p. i.p.
* Dosís por día y ratón
Los ratones se observaron diariamente y el tamaño del tumor controlado dos veces por semana. Esto se llevó a cabo mediante la medición de dos diámetros perpendiculares (d1/d2) con una pinza. Se utilizaron estas medidas para obtener
5 tanto la superficie del tumor como el volumen: Supeficie del tumor = d1 x d2 (mm2) Volumen del tumor = d1 x d22 x 1/2 (mm3)
Los resultados se expresaron como valores individuales y/o como la media ± SD o la mediana de cada grupo 10 experimental.
Estadísticas
Un estudio de control-caso se realizó con los ratones tratados y con los ratones control con el fin de determinar si existían diferencias entre BLAS o cada diferente estereoisómero y administración del placebo. Los datos obtenidos
15 (superficie tumoral y volumen) fueron probados para la distribución Normal dentro de los grupos (test de Kolmogorov Smirnov de p <0,05). Se realizó una prueba de hipótesis no paramétrica para muestras no apareadas con el fin de contrastar si BLAS tenía un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral. El U-test de Mann Withney fue elegido por ser una de las pruebas no paramétricas más conocidas, de todos modos, los resultados de esta prueba son equivalentes tanto a los de la suma de rangos de Wilcoxon y al test de dos grupos de Kruskal-Wallis.
20 Debido a la alta dispersión de los datos, los valores atípicos (animales más allá de percentil 10 o por encima del percentil 90 para la superficie de tumor en el día 33) fueron excluidos del estudio. El software estadístico utilizado fue SPSSv12.0
25 RESULTADOS
El efecto inhibidor de BLAS o cada isómero en el crecimiento de células tumorales ASB XIV
Se estudiaron treinta y uno ratones por grupo (treinta y dos en el grupo placebo). Dos ratones del grupo del isómero 4 (9d) murieron por causas desconocidas, la primera semana después de la inoculación del tumor y fueron excluidos. Las tablas 5 y 6 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana. Estas
30 tablas resumen la mediana de la superficie o del volumen en los grupos de ratones de BLAS, isómeros o PS, en cada día marcado.
Tabla 5 SUPERFICIE (mm2)35 Valores Totales (Mediana)
Tratamiento
Dósis ng/ratón Grupo n (1er día) Días después de la inoculación del tumor
0
8 12 15 19 22 26 29 33
P.S.
- A1 32 0 0 0 0 16 39 81 120,5 161
BLAS
260 B1 31 0 0 0 0 9 30 64 81 120
Isomero 1
260 C1 31 0 0 0 0 16 36 72 110 154
Isomero 2
260 C2 31 0 0 0 0 25 56 110 144 210
Isomero 3
260 C3 31 0 0 0 0 9 25 64 99 140
Isomero 4
260 C4 29 0 0 0 0 9 25 49 81 110
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Tabla 6 VOLUMEN (mm3) Valores Totales (Mediana)
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (1er día) Días después de la inoculación
0
8 12 15 19 22 26 29 33
P.S.
- A1 32 0 0 0 0 32 117 364,5 632,75 936
BLAS
260 B1 31 0 0 0 0 13,5 75 245 364,5 600
Isomero 1
260 C1 31 0 0 0 0 32 108 288 550 864
Isomero 2
260 C2 31 0 0 0 0 62,5 196 550 864 1436,5
Isomero 3
260 C3 31 0 0 0 0 13,5 62,5 256 445,5 700
Isomero 4
260 C4 19 0 0 0 0 13,5 62,5 171,5 364,5 550
5
Las tablas 7 y 8 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como valores medios. Estas tablas resumen la media de la superficie o del volumen de los grupos de ratones BLAS, isómeros o PS en cada día marcado.
10 Tabla 7 SUPERFICIE (mm2)Valores Totales (Media)
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (1er día) Días después de la inoculación
0
8 12 15 19 22 26 29 33
P.S.
- A1 32 0 0 0,5 3,84 22,72 47,69 92,41 126,34 169,25
BLAS
260 B1 31 0 0 0,19 2,45 13,81 34,19 68,84 96,52 131,42
Isomero 1
260 C1 31 0 0 0,32 3,45 19,65 46,81 92,52 125,16 165,65
Isomero 2
260 C2 31 0 0 0,71 6,19 29,84 63,55 105,97 142,45 188,87
Isomero 3
260 C3 31 0 0 0,29 2,81 15,16 33,16 68,67 94,61 131,35
Isomero 4
260 C4 29 0 0 0,17 2,79 14,59 34,52 65,86 90,28 123,45
15
Tabla 8 VOLUMEN (mm3)Valores Totales (Media)
20
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (1er día) Días después de la inoculación
0
8 12 15 19 22 26 29 33
P.S.
- A1 32 0 0 0,69 7,52 69,89 197,25 492,77 751,27 1165,34
BLAS
260 B1 31 0 0 0,19 4,26 34,29 116,52 322,06 511,90 806,10
Isomer 1
260 C1 31 0 0 0,45 5,34 53,37 179,79 474,10 733,26 1114,37
Isomer 2
260 C2 31 0 0 1 12,68 102,44 292,39 603,66 913,90 1377,02
Isomer 3
260 C3 31 0 0 0,44 6,31 44,13 116,65 337,18 529,37 848,87
Isomer 4
260 C4 29 0 0 0,16 5,29 36,5 118,19 297,83 451,55 700,66
Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor ASB XIV entre los ratones que recibieron BLAS frente a placebo. Estas diferencias, ya sea en la superficie o el volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0.05) todos los días
25 marcados después de los 26 días de desarrollo del tumor según los cálculos de Mann-Whitney U test. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor ASB XIV entre los ratones que recibieron el isómero 3 frente a placebo. Estas diferencias, ya sea en la superficie o el volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0.05) todos los días marcados después de la jornada 26 de desarrollo del tumor según los cálculos de la prueba de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor ASB XIV entre los ratones que recibieron el isómero 4 frente a
30 placebo. Estas diferencias, ya sea en la superficie o el volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0.05) todos los días marcados después del día 26 de desarrollo del tumor según los cálculos de la prueba de Mann-Whitney. BLAS, el isómero 3 y el isómero 4 inhiben el crecimiento in vivo del carcinoma de pulmón ASB XIV. No hubo diferencias entre el efecto inhibidor de cada uno sobre el crecimiento tumoral ASB XIV.
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Grupo (A1) BALB/C
n 16 Sexo Male Tratamiento Placebo (P.S.) Dosis* Dias 6, 7 and 14 Ruta i.p.
(B1) BALB/C
16 Male BLAS 260 ng 6, 7 and 14 6, 7 and 14 i.p. i.p.
(C1) BALB/C
16 Male isomer 1 260 ng 6, 7 and 14 6, 7 and 14 i.p. i.p.
(C2) BALB/C
16 Male isomer 2 260 ng 6, 7 and 14 6, 7 and 14 i.p. i.p.
(C3) BALB/C
16 Male isomer 3 260 ng 6, 7 and 14 6, 7 and 14 i.p. i.p.
(C4) BALB/C
16 Male isomer 4 260 ng 6, 7 and 14 6, 7 and 14 i.p. i.p.
* Dosis por día y ratón
Los ratones fueron observados diariamente y el tamaño del tumor controlado dos veces por semana. Esto se llevó a 5 cabo mediante la medición de dos diámetros perpendiculares (L/W) con una pinza. Se utilizaron estas medidas para obtener tanto la superficie del tumor como el volumen:
Superficie del tumor = L x W (mm2) Volumen del tumor = L x W2 x 1/2 (mm3) Los resultados fueron expresados por cada grupo experimental como valores individuales y/o medias ± SD o medianas.
10
Estadísticas
Se realizó un estudio de casos y control con ratones tratados y ratones control con el fin de determinar si existían diferencias entre BLAS o cada estereoisómero y la administración de placebo. Los datos obtenidos (superficie tumoral y volumen fueron comprobados para la distribución normal dentro de los grupos (test de Kolmogorov Smirnov, p <0,05).
15 Una prueba de hipótesis no paramétrica para muestras no apareadas se realizó con el fin de contrastar si BLAS tuvo un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral. La prueba U de Mann Withney fue elegida por ser una de las pruebas no paramétricas más conocidas, de todos modos, los resultados de esta prueba son equivalentes tanto a los de la suma de rangos de Wilcoxon y a la del test de dos grupos de Kruskal-Wallis. El software estadístico utilizado fue SPSSv12.0
20
RESULTADOS El efecto inhibidor de BLAS sobre el crecimiento celular del tumor Ehrlich Se planificó un estudio de dieciséis ratones por grupo. Las tablas 9 y 10 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana (n
25 (primer día) está en todos los casos 16 y la dosis es de 260 ng/ratón). Estas tablas resumen la mediana de la superficie
o el volumen de BLAS, o los isómeros o el PS del grupo de ratones en cada día registrado.
Tabla 9 SUPERFICIE (mm2)Valores totales (Media)
30
Tratamiento
Grupo Días después de la inoculación del tumor
0
8 13 16 20 23 29 31 35 38
P.S.
A1 0 10,5 25 49 64 84 103 119 138 148,5
BLAS
B1 0 6,5 18 27,5 39 49 49 52,5 56 64
Isómero 1
C1 0 2 16 20,5 27,5 39,5 39,5 46,5 52,5 53
Isómero 2
C2 0 4 16 20 27,5 33 42 45 51 71
Isómero 3
C3 0 0 9 16 20 25 27,5 36 43 49,5
Isómero 4
C4 0 0 12,5 18 27,5 39 45 48,5 52,5 68
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una tendencia los días 35y 38, tanto en la superficie como en el volumen (p = 0,061 y p = 0,08, respectivamente; p = 0,102, dos de ellos). Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Ehrlich entre los ratones que recibieron BLAS frente a isómero 3. Estas diferencias, ya sea en la superficie o volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0,05) en los días 13, 16,
5 20 y 23 del desarrollo del tumor según los cálculos de la prueba de Mann-Whitney. BLAS, el isómero 1, isómero 2, isómero 3y el isómero 4 inhiben el crecimiento in vivo de las células tumorales de Ehrlich. El isómero 3 muestra el mayor efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral Ehrlich.
10 EJEMPLO 10 Efecto del isómero 4 (9d) sobre el crecimiento de diferentes tumores
Los siguientes ensayos se realizaron con el fin de comprobar el efecto de isómero 4 (9d) en diferentes tumores siguiendo métodos y materiales análogos a los utilizados en los ejemplos 8 y 9, en todos los casos la solución salina fisiológica estéril (Grifols, Barcelona, España) se utilizó como placebo. El isómero 4 (9d) se ensayó a los niveles de
15 dosis indicados en la Tabla 13 en los días 6, 7 y 14 después de la inoculación del tumor. En todos los casos el vehículo fue una solución salina fisiológica y los tratamientos fueron administrados por vía intraperitoneal. El volumen inoculado fue de 0,2 ml/animal. Los resultados se muestran en la Tabla 13.
Tabla 13
Tumor
Ratones (tamaño de la muestra) Dosis ng/ratones) La inhibición del crecimiento del tumor
CT26.wt (dosis alta de carcinoma de colon)
Balbc/cByl (40 c.a. machos) 250 SI
CT26.CL25 (dosis baja de carcinoma de colon)
Balbc/cByl (40 c.a. machos) 250 SI
Mm5MT (tumor de mama)
C3H/HeN (42 machos) 250 SI
KLN 205 (dosis alta de carcinoma pulmón)
DBA/2NCrI (62 c.a. machos) 260 SI
ASB XIV (dosis alta de carcinoma pulmón)
Balb/cAnNCrI (61 machos) 260 SI
ASB XIV (dosis baja de carcinoma pulmón)
Balb/cAnNCrI (62 machos) 260 SI
Lewis (dosis baja de carcinoma de pulmón)
C57BL/6NCrI (62 machos) 260 SI
P-815 (Mastocitoma)
DBA/2NCrI (42 machos) 250 SI
20
EJEMPLOS 11, 12 and 13 Efecto del isómero 4 (9d) vs placebo y combinaciones de 9d + cisplatino Tumores ensayados: KLN 205 y célulasde pulmón de Lewis
25 Este ensayo se hizo con el fin de comparar el efecto de isómero 4 (9d) in vivo en el crecimiento tumoral en ratones con el efecto de la mezcla de isómero 4 (9d) + Cisplatino frente a los tumores KLN 205 y Lewis-células de pulmón. El mismo equipo, reactivos, vehículo, y la ruta y el volumen de administración fueron utilizados como los del ejemplo 7.
Medicamentos en estudio
30 En los ejemplos 11, 12 y 13 los siguientes fármacos fueron estudiados: Principio activo Cisplatino (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) en solución salina fisiológica estéril.
Isómero (9d) (3S, 5R-1-(3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) de bromuro de piridinio hidrobromide) en solución salina fisiológica estéril.35 Placebo Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, España)
En los Ejemplos 11,12 y 13, los ratones fueron observados diariamente y el tamaño del tumor controlado dos veces a la semana. Esto se llevó a cabo mediante la medición de dos diámetros perpendiculares (d1 / d2) con una pinza. Se
40 utilizaron estas medidas para obtener tanto la superficie del tumor como el volumen: Superficie del tumor = d1 x d2 (mm2) Volumen del tumor = d1 x d22 x 1/2 (mm3) Los resultados se expresaron como valores individuales y/o como la media ± SD o la mediana de cada grupo experimental.
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placebo. Estas diferencias, tanto en superficie como en volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0.05) todos los días marcados tras el día 20 de desarrollo de los tumores según los cálculos del Test-t. No hubo diferencias en la tasa de crecimiento de los tumores KLN 205 entre los ratones que recibieron 9d frente a placebo. Hubo una tendencia significativa, tanto en superficie como en volumen, todos los días marcados tras el día 31 de desarrollo del tumor según los cálculos del Test-t. Por lo tanto, el cisplatino o cisplatino + 9d inhiben el crecimiento celular in vivo de KLN 205. 9d y cisplatino tienen un efecto sinérgico.
EJEMPLO12 Efecto del isómero (9d) en combinación con cisplatino sobre el crecimiento tumoral a través de inoculación subcutánea, intradérmica o intramuscular. Tumor ensayado: KLN 205 Este ensayo se hizo con el fin de comprobar el efecto in vivo sobre el crecimiento tumoral en ratones estimulados con células KLN 205. Los tumores si se han establecido por inyección subcutánea, intradérmica o inoculación intramuscular. El efecto de la combinación de cisplatino y/o isómero (9d) se comparó con placebo en ratones expuestos por vía intradérmica. Además, el efecto de 9d sobre el crecimiento in vivo de tumores en ratones expuestos por vía intramuscular o subcutánea se comparó con placebo.
METODOS Y MATERIALES
El tumor KLN 205 es un carcinoma de pulmón originado en la cepa de ratón DBA/2, y por lo tanto singénico en ratones DBA/2 con antecedentes genéticos (Kaneko T y LePage GA Características de crecimiento y las respuestas de drogas de un carcinoma de pulmón de murino in vitro e in vivo. Investigación Sobre El Cáncer. 38: 2084-2090; 1978). Las células KLN 205 (CLS, Eppelheim, Alemania) se mantuvieron in vitro en pases seriados cada 3-4 días. Los cultivos se realizaron con medio RPMI (RPMI, 10% de suero de ternera fetal, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, 80 µg ml de gentamicina; todos ellos adquiridos a Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) mediante el cultivo de 5 x 106 células en 75 cm2 de frascos de cultivo. Los subcultivos se llevaron a cabo mediante la recopilación de células desprendidas después del tratamiento con tripsina-EDTA (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Las células tumorales, recogidas a partir de cultivos de 48 horas, se utilizaron como origen de células KLN 205 para los estudios descritos a continuación.
Ratones
Animal
DBA/2NCrI
Justificación de la selección
cepa puras de ratón singénico con KLN 205 células
Proveedor
CRIFFA – Charles River
Número de animales del estudio ca. 80 machos
Edad
8-10 semanas de edad
al inicio del
Peso
tratamiento 25-30 g
Identificación
Mediante técnica de punción en la oreja
Dosis
El cisplatino se ensayó a los niveles de dosis de 65 µg administrados en los días 7, 11, 14, 18, 21, 25 y 28 después de la inoculación del tumor. El isómero (9d) se ensayó a los niveles de dosis de 250 ng administrado en los días 7, 11, 14, 18, 21, 25 y 28 después de la inoculación del tumor.
Diseño del estudio
Los tumores fueron establecidos por inoculación subcutánea e intradérmica en el flanco trasero derecho, e intramuscular en la pata trasera derecha. Los ratones (DBA/2) se inocularon con 0,05 ml que contenían 2 x 105 células viables de KLN 205. El día de la inoculación subcutánea, intradérmica e intramuscular se consideraró Día 0 de la prueba. Los ratones DBA/2 inoculados con células KLN 205 fueron distribuidos en 8 grupos experimentales:
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Grupo n Sexo Vía de inoculación Tratamiento Dosis* Días** Vía
(A1) DBA/2 10 Macho subcutáneo Placebo (P.S.)
(A2) DBA/2 10 Macho subcutáneo 9d 250 ng (B1) DBA/2 10 Macho intradérmica Placebo (P.S.) (B2) DBA/2 10 Macho intradérmica 9d 250 ng (B3) DBA/2 10 Macho intradérmica Cisplatino 65 µg 7, 11, 14, 18, 21, 25 and 28 ip. (B4) DBA/2 9d 250 ng
10 Macho intradérmica
Cisplatino 65 µg (C1) DBA/2 10 Macho intramuscular Placebo (P.S.) (C2) DBA/2 10 Macho intramuscular 9d 250 ng
* Dosis por día y ratón ** En la inoculación intramuscular, así como aquellos días, los ratones se trataron en los días 32 y 35.
5 Estadística
Un estudio caso-control se llevó a cabo con los ratones tratados y control con el fin de determinar si existían diferencias entre el placebo, 9d, cisplatino o 9d+cisplatino. Los datos obtenidos (superficie tumoral y volumen) fueron comprobados para la distribución normal dentro de los grupos (Kolmogorov Smirnov test, p <0,05). Una prueba de hipótesis no paramétrica para muestras no apareadas se llevó a cabo con el fin de contrastar si 9d, cisplatino o 9d + cisplatino tenían
10 efecto deletereo sobre el crecimiento tumoral. El U-test de Mann Withney fue elegido por ser una de las pruebas no paramétricas más conocidas, de todos modos, los resultados de esta prueba son equivalentes tanto a los de la suma de rangos de Wilcoxon y a los del test de dos grupos de Kruskal-Wallis. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales) v13.0.
15
RESULTADOS El efecto inhibidor del isómero 4 (9d) en el crecimiento celular KLN 205 tumor
Diez ratones por grupo fueron planificados para el estudio. Las tablas 18 y 19 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana. 20 Estas tablas resumen la mediana de la superficie o volumen de cada día anotado.
25

Tabla 18 SUPERFICIE (mm2)Valores totales (Media)
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (primer día) Días después de la inoculación del tumor
0
10 13 17 20 24 27 31 34 38
P.S.
- A1 10 0 18 32,5 61,5 100 156,5 206,5 268
9d
250 A2 10 0 12,5 30 45 70 118,5 159 186
P.S.
- B1 10 0 12,5 25 54 89,5 142 186 221
9d
250 ng B2 10 0 12,5 25 42 63,5 95 128 162,5
Cisplatino
65 µg B3 10 0 6,5 20 33 56 96 129 155
9d + Cisplatino
250 ng + 65 µg B4 10 0 6,5 18 30 56 88 120 143
P.S.
- C1 10 0 0 0,23 0,4 0,63 2,8 6,5 12,25 19,89 34,68
9d
250 C2 10 0 0,03 0,17 0,315 0,93 1,83 6,94 12,26 24,34 37,56
Tabla19 VOLUMEN(mm3)Valores totales (Media)
Tratamiento
Dosis ng/ratón Grupo n (primer día) Días después de la inoculación del tumor
0
10 13 17 20 24 27 31
P.S.
- A1 10 0 36 81,25 208,25 400 793,25 1217 1860,5
9d
250 A2 10 0 22,75 75 135 245 506,25 800 1058,75
P.S.
- B1 10 0 22,75 62,5 166,75 336 748,5 1116 1436,5
9d
250 ng B2 10 0 22,75 62,5 126 232,75 425,25 608,5 885,75
Cisplatino
65 µg B3 10 0 8,75 40 91,5 196 384 646,5 775
9d + Cisplatino
250 ng + 65 µg B4 10 0 8,75 36 75 196 352 600 786,5
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todos los días marcados después de la 13ª jornada de desarrollo del tumor según los cálculos de la prueba de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento de los tumores de pulmón de Lewis entre los ratones que recibieron cisplatino frente a placebo. Estas diferencias, tanto en superficie como en volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0,05) en el día décimo, 13 y 17 de desarrollo del tumor según los cálculos de la prueba de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento de los tumores de pulmón de Lewis entre los ratones que recibieron 9d + cisplatino frente a placebo. Estas diferencias, tanto en superficie como en volumen, fueron estadísticamente significativas (p <0.05) todos los días marcados después de la decimoséptima jornada de desarrollo del tumor según los cálculos de la prueba de Mann-Whitney. 9d, cisplatino y 9d + Cisplatino inhiben el crecimiento in vivo del tumor de pulmón de Lewis en ratones inbred.
EJEMPLO 14 TOXICIDAD
Este ensayo se hizo con el fin de comprobar la tolerancia (letalidad/toxicidad) de los tratamientos Blas e IL-2 en ratones.
MATERIALES Y METODOS Fármacos en estudio
BLAS (mezcla equimolar de los isómeros 1, 2, 3 y 4) 1,25 mg / ml en solución salina fisiológica estéril. IL-2 recombinante humana, en 18x106 UI / ml (Proleukin, Chiron Iberia, Madrid, España)
Ratones
Animal Balb/c AnNHsd
Justificación de la selección Cepa de ratón endogámico
Proveedor Harlan Iberica
Número de animales de estudio ca. 50 machos
Edad
12 semanas de edad
al inicio del
Peso
tratamiento 25-30 g
Identificación
Mediante técnica de punción en la oreja
Dosis, vehículo, vía y volumen de administración
Dosis
Grupo
Producto Dosis probada* Dosis de referencia Días
A1
BLAS 1 µg 260 ng 0, 1, 4 y 5
A2
25 µg
A3
250 µg
B1
IL-2 900,000 IU 300,000 IU
B2
1,800,000 IU
* Dosis por ratón y día, usando un volumen constante de 0,2 ml
Vehículo El vehículo en el que se diluyeron BLAS e IL-2 fue solución salina fisiológica estéril para inyección (Grifols, Barcelona, España) y agua destilada estéril para inyección (Grifols, Barcelona, España)
Vía de administración Los tratamientos fueron administrados i.p. Diseño del estudio: Cada ratón fue observado diariamente durante 30 días. Se realizaron dos medidas:
1.
Letalidad. Esto se expresó como porcentaje de supervivencia.
2.
Toxicidad. Ésta se comprobó en ratones vivos para los siguientes parámetros y criterios de puntuación:
Parámetro Puntuación
Aspectos generales:
Normal
0
Pelo afectado
1
Pelo afectado más secreciones oculares /nasales
2
Posición anormal
3
imagen207
imagen208
imagen209
imagen210
E07728359
21-07-2015
5
Isómero 4 (9d compuesto) ensayado a los niveles de dosis de 250 ng administrado en los días 0 y 7. Vehículo El vehículo en el que se diluyó el Isómero 4 es solución salina fisiológica. Vía de administración y volumen Los tratamientos fueron administrados por vía intraperitoneal. El volumen inoculado fue de 200 l/animal. Diseño del estudio Se distribuyeron Ratones Balb/c en 2 grupos experimentales: Grupo n Sexo Tratamiento Dosis* Días Vía
(A1) BALB/C
5 Macho Placebo (P.S.)
0 and 7
i.p.
(B1) BALB/C
5 Macho Isómero 4 250 ng
* Dosis por día y ratón
10
Tres días después de la última dosis del tratamiento, se aisló la sangre murina. Se obtuvo directamente por punción intracardiaca. Previamente, los ratones fueron anestesiados por vía intramuscular. La sangre se mezcló con los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente. Después de 20 minutos de incubación, se añadió solución Optylise C en las muestras para lisar la población de
15 eritrocitos. Finalmente, se diluyeron las muestras en ½ con 1x PBS estéril y analizadas mediante citometría de flujo. Los porcentajes de cada población analizada se expresaron como valores individuales y como la media ± desviación estándar de cada grupo experimental.
20 RESULTADOS Screening de la Citometria de flujo
PBL (Sangre Periférica)
ID
Control (n=5) % Compuesto 9d (n=4) %
CD11b+
1 21,6 44
2
22,4 35,4
3
18,4 -
4
11,2 32,9
5
9,74 35,5
Media
16,668 36,95
Desviación estándar
5,875297439 4,851460261
ID
Control (n=5) % Compuesto 9d (n=4) %
Ly6G+
1 16,9 27
2
22,1 37,6
3
28,9 -
4
23,7 33,3
5
10,7 41,2
Media
20,46 34,775
Desviación estándar
6,934551175 6,107031467
ID
Control (n=5) % Compuesto 9d (n=4) %
CD11b+Ly6G+
1 16,1 29,7
2
20,4 32,3
3
13,7 -
4
7,78 28,5
5
8,02 33,7
Media
13,2 31,05
Desviación estándar
5,401592358 2,37416652
De acuerdo con estos resultados los ratones (Balb / C) tratados con dos dosis (una vez por semana) del compuesto 9d30 muestran un incremento positivo de células CD11b, Ly6G y CD11b + Ly6G en sangre periférica, en comparación con los ratones control (solución salina fisiológica). Estas células se comprobaron mediante citometría de flujo tres días después de la última dosis del tratamiento.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para la síntesis de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula Id imagen1Rimagen23 imagen3Y
    X
    imagen4R1NH R4
    imagen5
    imagen6
    NO
    O R2
    (Id)
    donde
    R1 se selecciona de –OH;
    R2, R3 y R4 son independientemente seleccionados de hidrógeno
    X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
    Y es un residuo orgánico seleccionado de un grupo de fórmula VIa que contiene N.
    imagen7
    imagen8
    15 (VIa)
    donde
    la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un anillo de piridina de fórmula IX sustituido
    o no sustituido
    imagen9(R6)n N
    imagen10
    20 IX donde, n es 0; que consiste en: a)hacer reaccionar un compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV H2C
    imagen11
    25 O
    IV
    donde R1 es seleccionado de –OH, –ORa, donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido; y 30 R2 se selecciona del grupo que consiste en un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas y ftalimida;o mezclas de los mismos; con un compuesto de fórmula V
    R4
    35 V donde R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas y ftalimida;
    para obtener un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IIId
    imagen12
    imagen13
    IIId R1 se selecciona de –OH, –ORa, donde Ra se selecciona de un alquilo sustituido o no sustituido; yR2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza en condiciones ácidas y ftalimida;o mezclas de los mismos.
    b)transformar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IIId, o mezclas de los mismos, en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula IId
    R5
    imagen14
    10
    IId
    donde R1 se selecciona de –OH, –ORa, donde Ra se selecciona de un alquilo sustituido o no sustituido; R2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo consistente en un hidrógeno, un grupo protector de
    15 nitrógeno que hidroliza bajo condiciones ácidas y ftalimida; R5 se selecciona de una carga negativa o R3, en donde R3 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalimida; e Y es un residuo orgánico seleccionado que contiene –N (i) cuando R5 tiene una carga negativa, Y es un residuo orgánico de fórmula VIIa que contiene
    imagen15
    20 (VIIa) Donde
    la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX
    imagen16(R6)n N IX
    imagen17
    donde, n es 0; o
    (ii) cuando R5 es R3, Y es un residuo orgánico de fórmula VIIc que contiene N
    imagen18
    imagen19
    Z
    imagen20
    (VIIc) donde
    la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX
    imagen21(R6)n N
    imagen22
    10
    IX donde, n es 0; y Z es un anión farmacéuticamente aceptable;15 o mezclas de los mismos; y
    c)poner en contacto dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas de los mismos, con un medio ácido que comprende un ácido de fórmula HX, donde X se define como anteriormente, para hacer que dicho estereoisómero sustancialmente puro de paso a un compuesto de fórmula Id;
    20 en el que "sustancialmente puro" hace referencia a un compuesto que tiene la pureza por encima 95%.
  2. 2.
    Procedimiento según la reivindicación 1, donde el compuesto de fórmula IV está en forma de un compuesto enantioméricamente puro seleccionado del isómero S y del isómero R.
  3. 3.
    Un compuesto sustancialmente puro de fórmula Id
    25
    imagen23Rimagen243 imagen25Y
    X
    imagen26R1NH R4 NOO R2
    imagen27
    imagen28
    imagen29
    Id 30 donde
    R1 se selecciona de –OH;
    R2, R3 y R4 son independientemente seleccionados del hidrógeno;
    X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
    Y es un residuo orgánico seleccionado de un grupo de fórmula VIa que contiene N
    imagen30
    (VIa) Donde
    la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX
    imagen31(R6)n N IX 40 donde, n es 0; donde "sustancialmente puro" hace referencia a un compuesto que tiene la pureza por encima de 95%.4.
    imagen32
  4. 4.Compuesto según la reivindicación 3, en el que X es un anión farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo compuesto por bromuro y cloruro.
    5
  5. 5. Compuesto según la reivindicación 3, en el que el compuesto es: 3R,5S-1-(3-amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium bromide hydrobromide.
  6. 6. Una composición que comprende un compuesto de fórmula Id, según la reivindicación 3, donde dicha composición no 10 contiene simultáneamente los cuatro estereoisómeros del siguiente compuesto:
    (i) 1-(3-amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium chloride hydrochloride.
  7. 7.
    Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o una composición de acuerdo con la reivindicación 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  8. 8.
    Un compuesto sustancialmente puro de fórmula IId,
    15
    imagen33
    IId
    20 donde R1 se selecciona de –OH, –ORa, donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido;R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza en condiciones ácidas seleccionados de carbamatos de fórmula -(O=) CO-Ra, en el que Ra se selecciona de alquilo sustituido
    o no sustituido; o de un sulfonato de la fórmula -(O=)S(=O)-Ra donde Ra tiene el mismo significado que
    25 anteriormente, preferiblemente en el que Ra es -CH3, o ftalimida; R5 se selecciona de carga negativa o de R3, en donde R3 es como se define anteriormente; e Y es un residuo orgánico seleccionado de un grupo de fórmula VIa que contiene N
    imagen34
    (VIa)
    30 donde
    la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX
    imagen35(R6)n N IX donde, n es 0; y35 donde "sustancialmente puro" hace referencia a un compuesto que tiene la pureza por encima de 95%
    imagen36
  9. 9. Una composición que comprende un compuesto de fórmula IId, de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicha composición no contiene simultáneamente los cuatro estereoisómeros de los compuestos siguientes:
    1-(3-amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium acetate;
    40 1-(1-acetyl-3-amino-5-carboxy-2-oxopyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium acetate; 1-(1-acetyl-3-acetylamino-5-carboxy-2-oxo-pyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium acetate; or 1-(1-acetyl-3-acetylamino-5-carboxy-2-oxo-pyrrolidin-3-ylmethyl)pyridinium hydrochloride.
  10. 10. Un compuesto de fórmula IIId
    R4
    imagen37
    5 IIId
    donde R1 se selecciona de –OH, –ORa, donde Ra se selecciona de un alquilo sustituido o no sustituido;R2 y R4 se seleccionan independientemente de un hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza en condiciones ácidas seleccionados de carbamatos de la fórmula -(O=)CO-Ra, en el que Ra se selecciona de
    10 alquilo sustituido o no sustituido; o un sulfonato de la fórmula -(O=)S(=O)-Ra en la que Ra tiene el mismo significado que anteriormente, preferiblemente en el que Ra es -CH3, o ftalimida.
  11. 11. Un proceso para la síntesis de un compuesto de fórmula Id,
    imagen38Rimagen393 imagen40Y
    X
    imagen41R1NH R4 NOO R2
    imagen42
    imagen43
    15
    en el que R1 se selecciona de –OH; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno;
    X es un anión farmacéuticamente aceptable; e20 Y es un residuo orgánico seleccionado de un grupo de fórmula VIa que contiene N
    imagen44
    imagen45
    (VIa) donde
    la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman una piridina no sustituida de fórmula IX
    imagen46(R6)n N IX donde, n es 0;
    imagen47
    30 que consiste en poner en contacto un compuesto de fórmula IId tal como se define en la reivindicación 8, con un medio ácido compuesto de un ácido de fórmula HX, donde X es un anión farmacéuticamente aceptable.
  12. 12. Proceso que consiste en hacer reaccionar un compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV H2C
    imagen48
    O 35 IV donde
    imagen49
    R1 se selecciona de –OH, –ORa, donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido; yR2 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalimida;;
    o mezclas de los mismos; con un compuesto de fórmula V
    5
    V
    en el que R4 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalimida;
    para obtener un compuesto de fórmula IIId según se describe en la reivindicación 10.
    10 13.Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para la fabricación de una composición farmacéutica para potenciar una respuesta inmune en un sujeto, o para la fabricación de una composición farmacéutica antitumoral, o para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección de origen bacteriano, fúngico o de origen viral, o para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una
    15 enfermedad autoinmune.
  13. 14. Compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para su uso en el tratamiento de un tumor, una infección de origen bacteriano, fúngico o de origen viral, o una enfermedad autoinmune.
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