JP5616628B2 - ピログルタミン酸誘導体の合成および使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ピログルタミン酸誘導体、それらの単離された光学活性立体異性体およびその混合物の新規合成およびそれらの使用、並びにそれの合成に向けた新規中間体に関する。本発明は、前記ピログルタミン酸誘導体、それらの光学活性立体異性体、およびその混合物の治療上の使用にも関する。
欧州特許EP0768308B1号は、免疫生物学的応答を賦活させる、下記一般式を有したピログルタミン酸誘導体の立体異性体の混合物について開示している:
(i)1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムクロリド塩酸塩または
(ii)1‐(1‐アセチル‐3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムクロリド塩酸塩
の全4種立体異性体の混合物を同時に含有しない組成物が、本発明の別の態様を構成する。
本発明の理解を促すために、本発明に関連して用いられているようなある用語および表現の意味がここでは含まれる。
EP0768308B1号において開示された立体異性体の混合物をその実質的に純粋な化合物へ分割させるすべての試みが失敗に終わった。本発明者らの実験セクションによれば、上記欧州特許でBLAS‐236(Cl)(1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムクロリド塩酸塩):
ある態様において、本発明は、本発明の工程として以下で言及される、下記式Iの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物の合成のための工程に関し:
R1は‐OH、‐ORaから選択され、ここでRaは置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換シクロアルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換、または非置換アラルキルもしくは置換または非置換ヘテロシクリルから選択され、
R2、R3、およびR4は、独立して、水素、酸性条件下において加水分解する窒素保護基またはフタルアミドから選択され、
Xは薬学上許容可能なアニオンであり、および
Yは以下から選択される有機残基である:
(i)下記式VIaのN含有基:
点線は、窒素原子と共に置換または非置換ヘテロアリールを形成し、および
Xは前記と同義であり、または
(ii)下記式VIbのN含有基:
Xは前記と同義であり、および
RaおよびRbは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換シクロアルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、または置換もしくは非置換ヘテロシクリルから選択され、または
RaおよびRbは、それらが結合している窒素原子と共に、置換または非置換ヘテロ環を形成する〕、
a)下記式IVのエナンチオ純粋化合物:
b)前記式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を下記式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体:
R1、R2、およびR4は前記と同義であり、
R5は負電荷またはR3から選択され、ここでR3は前記と同義であり、および
Yは以下から選択されるN含有有機残基である:
(i)R5が負電荷である場合、Yは下記式VIIaのN含有有機残基である:
(ii)R5がR3である場合、Yは以下から選択されるN含有有機残基である:
(ii.a)下記式VIIbのN含有基:
(ii.b)下記式VIIcのN含有有機残基:
Zは薬学上許容可能なアニオンである)〕
またはその混合物へ変換し、および
c)前記式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を、式HXの酸(Xは前記と同義である)を含んでなる酸媒体と接触させて、式Iの化合物の前記実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を生じさせることを含んでなる。
(A)R 5 が負電荷でかつYが式VIIaのN含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を製造するために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が下記式VIIIaの窒素含有求核剤と反応される:
(B)R 5 がR 3 でかつYが式VIIbのN含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を製造するために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が下記式VIIIbの窒素含有求核剤と反応され:
所望であれば、得られた混合物が下記式Xの化合物により急冷される(quenched):
R3Z (X)
(上記式中、R3およびZは前記と同義である)、または
(C)R 5 がR 3 でかつYが式VIIcのN含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を製造するために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が式VIIIaのN含有求核剤と反応され、得られた混合物が前記式Xの化合物で処理される。
‐式VIIIaの化合物と、または一方で
‐式VIIIbの化合物と、および所望であれば、式Xの化合物と、または一方で
‐式VIIIaの化合物および式Xの化合物と
反応させることを含んでなる。
nは0、1、2、3、4、または5であり、および
R6は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロシクリル、置換もしくは非置換アルコキシ、置換もしくは非置換アリールオキシ、ハロゲン、置換もしくは非置換カルボキシエステル、置換もしくは非置換アミノから選択され、および/または前記ピリジンが一以上の置換もしくは非置換縮合環を形成する。
a)式IIaの実質的に純粋な化合物:
b)式IIbの実質的に純粋な化合物:
c)式IIcの実質的に純粋な化合物:
d)式IIdの実質的に純粋な化合物:
e)(等モル比またはそれ以外で)式IIa、IIb、IIc、および/またはIIdの上記化合物の混合物。
式Iの化合物は二つのキラル中心を有する、したがって、それらは本質的に純粋な立体異性体またはその混合物のいずれの形態もとることができる。具体的態様において、式Iの化合物は以下からなる群より選択される:
a)式Iaの実質的に純粋な立体異性体化合物:
b)式Ibの実質的に純粋な立体異性体化合物:
c)式Icの実質的に純粋な立体異性体化合物:
d)式Idの実質的に純粋な立体異性体化合物:
e)等モル比またはそれ以外で式Ia、Ib、Ic、および/またはIdの上記実質的に純粋な化合物の混合物、前記混合物は下記化合物の全4種立体異性体を同時に含有しない:
(i)1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムクロリド塩酸塩または
(ii)1‐(1‐アセチル‐3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムクロリド塩酸塩。
3S,5S‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩、
3R,5S‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩、
3R,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩、および
3S,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩
(i)1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムクロリド塩酸塩または
(ii)1‐(1‐アセチル‐3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムクロリド塩酸塩。
式IIのある化合物、即ち1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、1‐(1‐アセチル‐3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、1‐(1‐アセチル‐3‐アセチルアミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、または1‐(1‐アセチル‐3‐アセチルアミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム塩酸塩は、その全4種の可能な立体異性体の混合物として記載されてきたが、それらの実質的に純粋な立体異性体の合成は今日まで達成されていなかった。
1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、
1‐(1‐アセチル‐3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、
1‐(1‐アセチル‐3‐アセチルアミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、または
1‐(1‐アセチル‐3‐アセチルアミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム塩酸塩。
1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、
1‐(1‐アセチル‐3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、
1‐(1‐アセチル‐3‐アセチルアミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム酢酸塩、または
1‐(1‐アセチル‐3‐アセチルアミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウム塩酸塩。
‐式VIIIaの化合物と、または一方で
‐式VIIIbの化合物と、および所望であれば、式Xの化合物と、または一方で
‐式VIIIaの化合物および式Xの化合物と
反応させることを含んでなる工程により得られる。
他の態様において、本発明は式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物に関する。前記式IIIの化合物は二つのキラル中心を有し、したがって、それは実質的に純粋な立体異性体またはその混合物のいずれの形態をとることもできる。
式Iの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、対象者におけるある症状、例えば腫瘍、免疫不全症、感染症などの治療および/または予防のための薬剤の活性成分として用いられてもよい。
A)癌または腫瘍関連症状:実際上すべての癌および腫瘍種、例えば急性リンパ芽球性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、後天性免疫不全症候群(AIDS)関連癌、肛門癌、星状細胞腫、小児小脳星状細胞腫、基底細胞癌腫、胆管癌、肝外胆嚢癌、胆嚢癌、骨癌、骨肉腫/悪性線維性組織球腫、脳幹部神経膠腫、脳腫瘍、悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、乳癌、メイト(mate)気管支腺腫/カルチノイド、小児バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明の胃腸癌腫、中枢神経系リンパ腫、原発性小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖障害、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮体癌、食道癌、小児ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、卵巣妊娠性絨毛性腫瘍神経膠腫、成人神経膠腫、脳幹部神経膠腫、大脳星状細胞腫神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞(肝)癌、成人(原発性)肝細胞(肝)癌、小児(原発性)ホジキンリンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌腫(膵臓内分泌部)、カポジ肉腫、腎臓(腎細胞)癌、腎臓癌、喉頭癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル、口唇および口腔癌、小児(原発性)肺癌、非小細胞肺癌、小細胞性リンパ腫、AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞、ホジキン成人リンパ腫、ホジキン小児リンパ腫、非ホジキン成人リンパ腫、非ホジキン小児リンパ腫、原発性中枢神経系、マクログロブリン血症、骨のワルデンシュトレーム型悪性線維性組織球腫/骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、眼内(目)メルケル細胞癌腫、中皮腫、成人悪性中皮腫、原発不明の小児転移性扁平上皮頸部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、小児多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍菌状息肉症骨髄異形性症候群、骨髄異形性/骨髄増殖疾患骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄腫、多発性骨髄増殖障害、慢性鼻腔および副鼻腔癌鼻咽頭癌、鼻咽頭癌、小児神経芽腫、口腔癌、小児口腔癌、口唇および中咽頭癌、骨肉腫/骨卵巣癌の悪性線維性組織球腫、小児卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、小児膵臓癌、膵島細胞副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞(腎臓)癌、腎細胞(腎臓)癌、小児腎盂および尿管、移行上皮細胞癌網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児唾液腺癌、唾液腺癌、小児肉腫、腫瘍のユーイングファミリー、肉腫、カポジ肉腫、軟部組織、成人肉腫、軟部組織、小児肉腫、子宮セザリー症候群、皮膚癌(非黒色腫)、小児皮膚癌(黒色腫)、皮膚癌腫、メルケル細胞小細胞肺癌小腸癌軟質組織肉腫、成人軟質組織肉腫、小児扁平上皮細胞癌腫、原発不明の扁平上皮頸部癌、転移性、胃癌、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児T細胞リンパ腫、睾丸癌、胸腺腫、小児胸腺腫および胸腺癌腫甲状腺癌、甲状腺癌、腎盂の小児移行上皮細胞癌および尿管絨毛性腫瘍、妊娠性不明原発部位、移行上皮細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、小児外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症型ウィルムス腫瘍などを含む、
B)感染症:実際上、全種類の感染症、例えば細菌、真菌、およびウイルス源の感染症を含む、または
C)自己免疫疾患:”American Autoimmune Related Diseases Association”[http://www.aarda.org]のウェブサイトにおいて挙げられた実際上すべての自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(MS)、クローン病、リウマチ様関節炎、1型糖尿病、乾癬、狼瘡、潰瘍性大腸炎、白斑、シリアック病、血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、甲状腺炎(橋本、Graves)、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、ブドウ膜炎、扁平苔癬、側頭動脈炎、サルコイドーシス、乾燥症候群(シェーグレン)、気管支喘息、天疱瘡、硬直性脊椎炎、強皮症、線維筋痛症、リウマチ熱などを含む。
式IVの化合物:(R)‐5‐(2R‐4‐メチレン‐5‐オキソピロリジン‐1,2‐ジカルボン酸 1-tert-ブチルエステル 2‐エチルエステル)の合成
標題化合物の合成がスキーム1において示される。
1.1 化合物2:2S‐5‐オキソピロリジン‐2‐カルボン酸エチルエステルの合成
10Lリアクターを無水エタノール(5.0L)中、D‐グルタミン酸1(1kg,6.80mol)で充填し、−10℃に冷却し、滴下漏斗から塩化チオニル(2.0kg,14.9mol)を2時間かけてゆっくり加えた。添加が完了した後、混合液を室温において1時間攪拌し、次いで更に1時間80℃に加熱した。得られた溶液を濃縮乾固させた(注意:HClおよびSO2ガスが発生した)。残渣をエタノール(2.5L)で希釈し、エタノール中水酸化カリウムの溶液(10%wt,約2.0L)の添加によりpH=7に中和した。形成された固体物を濾去し、溶液を濃縮して、ロウ様固体物として1のジエチルエステルを得た。
残渣を次いで真空下(90℃,3.1mbar)において2時間蒸留し、残留物を更に5.2mbarにおいて2時間にわたり150℃に加熱した。室温において、残渣は固化した。MTBE/ヘキサン(2:1)からの再結晶化で、褐色様固体物として2の望ましい生成物を得た(960g,90%)。m.p.49‐51℃.
1H‐NMR(CDCl3,300MHz):6.82(bs,1H);4.29‐4.23(m,1H);4.21(q,2H,J=7.3Hz);2.48‐2.17(m,4H);1.28(t,3H,J=7.3Hz)ppm.
リアクター中におけるジクロロメタン(8.0L)中ピログルタミン酸エチル2(900g,5.73mol)の攪拌溶液に、ジ-tert-ブチルジカーボネート(2.5kg,11.5mol)、トリエチルアミン(800mL,5.73mol)およびDMAP(700g,5.73mol)を加え、反応液を2時間攪拌した。赤褐色溶液を濃縮乾固させ、酢酸エチル(10.0L)で希釈し、3N水性HCl(4×2.5L)で洗浄した。合わせた有機層を水(6×2.5L)および塩水(1.0L)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応混合液を濃縮乾固させ、氷で冷却し、MTBEおよびヘキサン(1:1)で摩砕して、褐色固体物(390g)を得た。母液の濃縮により油状物(600g)を得、クロマトグラフィー(SiO2,ヘキサン/酢酸エチル3:1)後に無色固体物(386g)3を得た。全収率(776g,54%).m.p.48‐49℃.
1H‐NMR(CDCl3,300MHz):4.57(dd,1H,J=9.5Hz,J=3.3Hz);4.20(q,2H,J=7.3Hz);2.72‐1.77(m,4H);1.46(s,9H);1.26(t,3H,J=7.3Hz)ppm.
−78℃でTHF中LiHMDS(1M,0.24L,0.24mol)の攪拌溶液に、乾燥THF(1.0L)中3(30g,0.12mol)の溶液をゆっくり加えた。−78℃において40分間攪拌後、Eschenmoser塩(45.5g,0.24mol)を加え、攪拌を更に20分間続けた。反応混合液を室温まで加温し、更に16時間攪拌した。混合液を濃縮し、残渣を酢酸エチル(300mL)と水(300mL)に分配した。水層を再び酢酸エチル(2×300mL)で抽出した。合わせた有機抽出液を1M水性HCl(3×150mL)で洗浄した。酸性層を直ちに重炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル(3×300mL)で抽出した。有機相を水(300mL)、塩水(50mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固させ、淡褐色油状物として望ましい生成物4を得(26.9g,72%)、これを次の工程において直接用いた。
1H‐NMR(CDCl3,300MHz):4.62(dd,1H,J=9.4Hz,J=3.3Hz);4.21(q,2H,J=7.3Hz);4.18‐4.07(m,1H);2.57‐2.20(m,3H);2.22(s,3H);2.17(s,3H);1.47(s,9H);1.24(t,3H,J=7.3Hz)ppm.
オートクレーブ(4L)をMeOH(2.5L)中4(244.9g,0.74mol)およびヨードメタン(138.2mL,2.22mol)で充填した。反応混合液を室温で48時間攪拌した。溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル(2L)と10%NaHCO3(1L)に分配した。水相を再び酢酸エチル(3×500mL)で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル4:1→酢酸エチル)で精製し、無色油状物として(R)‐5を得た(55.1g,27%)。
1H‐NMR(CDCl3,300MHz):6.23(t,1H,J=2.7Hz);5.51(t,1H,J=2.2Hz);4.61(dd,1H,J=10.3Hz,J=3.3Hz);4.22(q,2H,J=7.1Hz);3.17‐3.05(m,1H);2.75‐2.64(m,1H);1.47(s,9H);1.23(t,3H,J=7.1Hz)ppm.
式IVの化合物:(R)‐5(2R‐4‐メチレン‐5‐オキソピロリジン‐1,2‐ジカルボン酸 1-tert-ブチルエステル 2‐エチルエステル)の合成
標題化合物の合成が下記スキーム4において示されているが、記載の中で開示された式5の化合物の合成には三つの変法がある。
Lennox,J.R.,Turner,S.C.,Rapoport,H.,J.Org.Chem.2001,66,7078-7083において記載された方法
水(400mL)中D‐グルタミン酸(1)(100g,679.7mmol)を加熱還流しながら、72時間攪拌した。得られた透明溶液をDowex 50wX8樹脂カラム(酸性形のイオン交換樹脂,135g)に通し、溶出液がもはや酸性でなくなるまで水洗した。300mLの留出液が集められるまで、合わせた水性溶出液を50℃において濃縮した。残留水の除去を助けて固体物の凝集を避けるために、メタノール(500mL)を加えた。得られた固体物を真空下において乾燥させ、白色固体物として化合物2′を得た(74.63g,85%)。
m.p.157℃,〔α〕D 22+10.5°(c2.0,H2O).
EtOH(2mL/mmol,8mL)中(2R)‐ピログルタミン酸2′(1当量,2.017g,15.62mmol)の攪拌懸濁液に、SOCl2(0.1当量,115μL,1.56mmol)を加えた。得られた溶液を室温において16時間攪拌した。反応混合液を水性1M HCO3Naで中和した。溶媒を真空下において濃縮し、残渣をAcOEt(3×25mL)で抽出した。有機相を無水Na2SO4において乾燥させ、真空下において濃縮した。化合物2を無色油状物として得、これを更なる精製なしに次の工程で用いた(79%)。
MeCN(0.3mL/mmol,180mL)中エステル2(1当量,78.6g,0.50mol)および4‐ジメチルアミノピリジン(DMAP)(0.1当量,6.10g,50mmol)の冷(5〜10℃)攪拌溶液に、t‐ブチルジカーボネート(Boc)2O(1.2当量,131g,0.60mol)を少しずつ加えた(30分間)。得られた赤色溶液を室温において3時間攪拌した。次いで、混合液を真空下において濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(EtOAc:CH2Cl2,1:4)で精製し、黄色様固体物として3を得た(95%)。m.p.48‐49℃
Dieterich,P.,Young,D,W.,Org.Biomol.Chem.2006,4,1492-1496において記載された方法
1,2‐ジメトキシエタン(2.3mL/mmol,736mL)中ピログルタメート3(1当量,83.1g,0.32mol)の溶液にtBuOCH(NMe2)2(Bredereck試薬,1.5当量,100mL,0.48mol)を加え、得られた混合液を85℃において15時間加熱した。反応混合液を室温まで冷却し、真空下において蒸発させた。得られた粗油状物を最少量のMTBEで摩砕し、得られた固体物を濾過した。化合物4′を橙色固体物として得た(59.48g,59%)。母液を再び真空濃縮し、連続再結晶化で全収率を84%(84.26g)に高めた。
WO2004039314号において記載された方法
THF(1.56mL/mmol,300mL)中、4′(59.48g,0.19mol)の溶液に、水性1M HCl(1.1当量,210mL)を加えた。混合液を室温において2時間攪拌した。水層および油層を分離し、水相を捨て、K2CO2(1.4当量,37g,0.27mol)および水性HCHO(37%)(1mL/mmol,190mL)を有機層へ加えた。得られた混合液を室温において45分間攪拌した。二相を分離し、有機層を集め、真空下において濃縮した。得られた粗生成物を(MTBE)メチルブチルエーテル(400mL)に溶解し、水(200mL)、Na2SO3(水性20%,200mL)、および水(200mL)により洗浄した。有機層を無水Na2SO4により乾燥させ、濾過し、真空下において蒸発させた。化合物5をショートフラッシュクロマトグラフィーによる精製後に無色油状物として得た(20.8g,40%)。
1H‐NMR(CDCl3,300MHz):6.23(t,1H,J=2.7Hz);5.51(t,1H,J=2.2Hz);4.61(dd,1H,J=10.3Hz,J=3.3Hz);4.22(q,2H,J=7.1Hz);3.17‐3.05(m,1H);2.75‐2.64(m,1H);1.47(s,9H);1.23(t,3H,J=7.1Hz)ppm.
3.1 式Vの化合物:N‐トシルイミノベンジルヨージナンの合成
標題化合物の合成が下記スキーム5において示される。
KOH(2.5当量,393g,7.00mol)をMeOH(11L)中p‐トルエンスルホンアミド(1当量,480g,2.80mol)の溶液へ加え、混合液を完全溶解まで室温において攪拌した。混合液を0℃に冷却し、ヨードベンゼンジアセテート(1当量,903g,2.80mol)を加え、0℃において40分間攪拌した。反応液を22℃へゆっくり加温し、一晩攪拌した。形成された固体物を濾過し、Et2O(250mL)により洗浄し、真空下室温において乾燥させた(285g)。母液を0℃に冷却してH2O/氷の混合液(5L)をゆっくり加えた場合、追加のフラクションを得た。得られた混合液を5℃において一晩保存した。次いで沈殿物を濾過し、Et2O(250mL)で洗浄し、真空下室温において乾燥させた(479g,73%全収率)。
(3R,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩)9cおよび(3S,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩)9dの合成
標題化合物(9cおよび9d)の合成が下記スキーム6において示される。
乾燥アセトニトリル(12mL)中、(R)‐5(3.02g,11.21mmol)の冷溶液(0℃,氷水浴)に、PhI=NTs(実施例2参照)(6.27g,16.8mmol)を一度に加え、次いでCu(acac)2(293mg,1.12mmol)を加えた。得られた不均質混合液を0℃で15分間撹拌し、それを室温まで加温し、一晩攪拌した。得られた混合液に1M NaOH(50mL)を加え、混合液をEtOAc(3×25mL)により抽出した。有機層を次いで塩水(25mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、蒸発乾固させた。粗油状物をフラッシュクロマトグラフィー(SiO2,ヘキサン/EtOAc:2/1)で精製し、白色固体物としてアジリジン7c(730mg)および7d(287mg)を得た(全収率:23%)。
7c:
m.p.94‐95℃
〔α〕D 25℃=+42°(0.032,CHCl3)
IR(KBr,cm−1):2977,2928,1808,1746,1352,1298,1251,1192,1161,988,690.
1H‐NMR(CDCl3,500MHz)(7c):7.82(d,2H,J=7.3Hz);7.31(d,2H,J=7.7Hz);4.74(dd,1H,J=9.7Hz,J=2.02Hz);4.25‐4.22(m,2H);3.28(dd,1H,J=14.4Hz,J=9.7Hz);2.78(s,1H);2.57(s,1H);2.53(dd,1H,J=14.4Hz,J=2.02Hz);2.42(s,3H);1.49(s,9H);1.29(t,3H,J=7.0Hz)ppm.
13C(CDCl3,125MHz)(7c):170.5,166.9,148.7,145.1,135.2,129.6,127.9,84.5,62.0,55.5,47.1,38.3,27.7,25.3,21.5,14.0ppm
MS(ESI+):m/z:339(M+1−Boc)
7d:
m.p.55‐56℃
〔α〕D 25℃=+11°(0.036,CHCl3)
IR(KBr,cm−1):2981,2936,1799,1749,1371,1330,1253,1203,1156,1094,989,687.
1H‐NMR(CDCl3,500MHz)(7d):7.79(d,2H,J=8.0Hz);7.30(d,2H,J=7.7Hz);4.70(dd,1H,J=9.4Hz,J=4.3Hz);4.30‐4.22(m,2H);3.06(dd,1H,J=15.1Hz,J=4.3Hz);2.92(dd,1H,J=15.4Hz,J=9.4Hz);2.82(s,1H);2.63(s,1H);2.41(s,3H);1.49(s,9H);1.28(t,3H,J=7.0Hz)ppm.
13C(CDCl3,125MHz)(7d):169.5,167.1,148.9,145.0,135.7,129.6,127.9,84.5,62.1,56.1,47.0,37.1,27.8,24.5,21.6,14.0ppm
MS(ESI+):m/z:339(M+1−Boc)
乾燥アセトニトリル(7mL)中(R)‐5(1.84g,6.82mmol)の冷溶液(0℃,氷水浴)に、PhI=NTs(3.82g,10.2mmol)を一度に加え、次いでCu(acac)2(178mg,0.682mmol)を加えた。得られた混合液を0℃において15分間撹拌し、次いでそれを室温まで加温し、一晩攪拌した。得られた混合液を真空下において蒸発させた。粗油状物をフラッシュクロマトグラフィー(SiO2,CH2Cl2/EtOAc:9/1)により精製し、p‐TsNH2不純物のないアジリジン類の混合物を得た(HPLC‐Msで調べた)。シス‐アジリジン7dが純粋白色泡状物(8%)として得られるまで、混合物を再びクロマトグラフィー(SiO2,ヘキサン/EtOAc:2/1)に付した。
アジリジン7c(200mg,0.46mmol)、モンモリロナイトMK10(20重量%,40mg)、およびピリジン(37μL,0.46mmol)の混合物をマイクロ波(300W)下100℃において10分間照射した。粗製混合物を酢酸エチル〔EtOAc〕(10mL)で希釈し、濾過し、HPLC分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン8cを更なる精製なしに次の工程で用いた(HPLCによる純度93%)。粗褐色油状物を水性48%HBr(20mL)に溶解し、還流下において18時間加熱した。混合液を水で希釈し、EtOAc(3×10mL)で洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末:SiO2:セルロース粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として9cを得た(51mg,28%)。m.p.>200℃.
〔α〕D 25℃=+40°(0.041,CH3OH)
IR(KBr,cm−1):3434,3051,1725,1633,1488,1420,1384,1280,1188,1145,1083,683.
1H‐NMR(D2O,500MHz):8.82(d,2H,J=5.3Hz);8.59(t,1H,J=7.8Hz);8.09(t,2H,J=6.8Hz);5.21(d,1H,J=14.3Hz);4.93(d,1H,J=14.3Hz);4.24(t,1H,J=9.2Hz);3.01(dd,1H,J=13.9Hz,J=9.3Hz);2.11(t,1H,J=7.8Hz)ppm.
13C(D2O,125MHz):173.2,173.1,147.1,145.6,128.6,64.4,64.2,49.3,33.0ppm
MS(ESI+):m/z:236(M+1−2Br)
アジリジン7d(200mg,0.46mmol)、モンモリロナイトMK10(20重量%,40mg)、およびピリジン(37μL,0.46mmol)の混合物をマイクロ波(300W)下100℃において10分間照射した。粗製混合物をEtOAc(10mL)により希釈し、濾過し、HPLC分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン8dを更なる精製なしに次の工程で用いた(HPLCによる純度93%)。粗褐色油状物を水性48%HBr(20mL)に溶解し、還流下において18時間加熱した。混合液を水により希釈し、EtOAc(3×10mL)で洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末:SiO2:セルロース粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として9dを得た(52mg,28%)。m.p.>200℃.
〔α〕D 25℃=+40°(0.038,CH3OH)
IR(KBr,cm−1):3435,3051,1721,1631,1509,1475,1422,1384,1280,1190,1144,683.
1H‐NMR(D2O,500MHz):8.76(d,2H,J=5.3Hz);8.59(t,1H,J=7.8Hz);8.07(t,2H,J=6.8Hz);5.19(d,1H,J=14.3Hz);4.78(d,1H,J=14.3Hz);4.33(t,1H,J=9.2Hz);2.90(dd,1H,J=13.9Hz,J=9.3Hz);2.46(t,1H,J=7.8Hz)ppm.
13C(D2O,125MHz):173.3,172.4,147.0,145.1,128.5,65.6,64.7,49.3,33.9ppm
MS(ESI+):m/z:236(M+1−2Br)
アジリジン7d(100mg,0.23mmol)、モンモリロナイトMK10(20重量%,20mg)、およびピリジン(18μL,0.23mmol)の混合物を90℃において3時間加熱した。粗製混合物をEtOAc(3mL)で希釈し、濾過し、真空下において蒸発させた。残渣をEt2Oで摩砕し、濾過し、ベタイン8dを褐色固体物として得た。この化合物を水性48%HBr(10mL)に溶解し、還流下において18〜72時間加熱した。反応をHPLC‐Ms分析により測定した。粗油状物をアセトンで摩砕して、褐色固体物を得た。この固体物を最少量のMeOH(1mL)に溶解し、沈殿が観察されるまでEt2Oまたはアセトンを加えた。固体物を次いで濾過し、真空下において乾燥させた(注意:生成物は高吸湿性である)。前記工程を2回繰返し、生成物の純度をHPLC分析により調べた(80%収率)。
(3S,5S‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩)9aおよび(3R,5S‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩)9bの合成
標題化合物(9aおよび9b)の合成が下記スキーム7において示されている。
乾燥アセトニトリル(7mL)中、(S)‐5(1.84g,6.82mmol)の冷溶液(0℃,氷水浴)に、PhI=NTs(実施例2参照)(3.82g,10.2mmol)を一度に加え、次いでCu(acac)2(178mg,0.682mmol)を加えた。得られた不均質混合液を0℃において15分間撹拌し、それを室温まで加温し、一晩攪拌した。得られた混合液に1M NaOH(20mL)を加え、混合液をEtOAc(3×25mL)により抽出した。有機層を次いで塩水(25mL)により洗浄し、無水Na2SO4により乾燥し、蒸発乾固させた。粗油状物をフラッシュクロマトグラフィー(SiO2,ヘキサン/EtOAc:2/1)で精製し、白色固体物としてアジリジン7a(641mg)および7b(478mg)を得た(全収率:37%)。
7a:
m.p.95‐96℃
〔α〕D 25℃=−57°(0.029,CHCl3)
IR(KBr,cm−1):2977,2928,1808,1746,1352,1298,1251,1192,1161,988,690.
1H‐NMR(CDCl3,500MHz)(7a):7.77(d,2H,J=7.3Hz);7.27(d,2H,J=7.7Hz);4.70(dd,1H,J=9.7Hz,J=2.02Hz);4.21‐4.17(m,2H);3.22(dd,1H,J=14.4Hz,J=9.7Hz);2.75(s,1H);2.51(s,1H);2.49(dd,1H,J=14.4Hz,J=2.02Hz);2.37(s,3H);1.45(s,9H);1.27(t,3H,J=7.0Hz)ppm.
13C(CDCl3,125MHz)(7a):170.5,166.9,148.7,145.1,135.2,129.6,127.9,84.5,62.0,55.5,47.1,38.3,27.7,25.3,21.5,14.0ppm
MS(ESI+):m/z:339(M+1−Boc)
7b:
m.p.57‐58℃
〔α〕D 25℃=−13°(0.068,CHCl3)
IR(KBr,cm−1):2982,2936,1799,1749,1371,1330,1252,1203,1154,1093,989,687.
1H‐NMR(CDCl3,500MHz)(7b):7.78(d,2H,J=8.0Hz);7.29(d,2H,J=7.7Hz);4.70(dd,1H,J=9.4Hz,J=4.3Hz);4.29‐4.20(m,2H);3.04(dd,1H,J=15.1Hz,J=4.3Hz);2.91(dd,1H,J=15.4Hz,J=9.4Hz);2.82(s,1H);2.63(s,1H);2.40(s,3H);1.48(s,9H);1.29(t,3H,J=7.0Hz)ppm.
13C(CDCl3,125MHz)(7b):169.5,167.1,148.9,145.0,135.7,129.6,127.9,84.5,62.1,56.1,47.0,37.1,27.8,24.5,21.6,14.0ppm
MS(ESI+):m/z:339(M+1−Boc)
アジリジン7a(311mg,0.71mmol)、モンモリロナイトMK10(20重量%,60mg)、およびピリジン(58μL,0.71mmol)の混合物をマイクロ波(300W)下100℃において10分間照射した。粗製混合物をEtOAc(10mL)で希釈し、濾過し、HPLC分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン8aを更なる精製なしに次の工程で用いた(HPLCによる純度93%)。
粗褐色油状物を水性48%HBr(30mL)に溶解し、還流下において18時間加熱した。混合液を水で希釈し、EtOAc(3×10mL)により洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末:SiO2:セルロース粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として9aを得た(110mg,40%)。
m.p.>200℃
〔α〕D 25℃=−49°(0.069,CH3OH)
IR(KBr,cm−1):3433,3051,1724,1633,1488,1420,1384,1281,1188,1144,1083,683.
1H‐NMR(D2O,500MHz):8.82(d,2H,J=5.3Hz);8.59(t,1H,J=7.8Hz);8.08(t,2H,J=6.8Hz);5.23(d,1H,J=14.3Hz);4.97(d,1H,J=14.3Hz);4.28(t,1H,J=9.2Hz);3.06(dd,1H,J=13.9Hz,J=9.3Hz);2.13(t,1H,J=7.8Hz)ppm.
13C(D2O,125MHz):173.1,172.6,147.2,145.6,128.6,63.9,63.7,49.2,32.7ppm
MS(ESI+):m/z:236(M+1−2Br)
アジリジン7b(200mg,0.46mmol)、モンモリロナイトMK10(20重量%,40mg)、およびピリジン(37μL,0.46mmol)の混合物をマイクロ波(300W)下100℃において10分間照射した。粗製混合物をEtOAc(10mL)で希釈し、濾過し、HPLC分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン8bを更なる精製なしに次の工程において用いた(HPLCによる純度93%)。粗褐色油状物を水性48%HBr(20mL)に溶解し、還流下において18時間加熱した。混合液を水により希釈し、EtOAc(2×10mL)により洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末:SiO2:セルロース粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として9bを得た(44mg,24%)。m.p.>200℃.
〔α〕D 25℃=−09°(0.12,CH3OH)
IR(KBr,cm−1):3435,3049,1724,1631,1513,1475,1420,1384,1280,1190,1144,683.
1H‐NMR(D2O,500MHz):8.82(d,2H,J=5.3Hz);8.59(t,1H,J=7.8Hz);8.08(t,2H,J=6.8Hz);5.23(d,1H,J=14.3Hz);4.97(d,1H,J=14.3Hz);4.28(t,1H,J=9.2Hz);3.06(dd,1H,J=13.9Hz,J=9.3Hz);2.13(t,1H,J=7.8Hz)ppm.
13C(D2O,125MHz):173.4,172.4,147.0,145.0,128.5,65.7,64.8,49.3,33.9ppm
MS(ESI+):m/z:236(M+1−2Br)
3S,5S‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩の段階的合成
6.1 ベタイン8aの合成
実施例5の場合と同様の操作に従い、アジリジン7a(311mg,0.71mmol)、モンモリロナイトMK10(20重量%,60mg)、およびピリジン(58μL,0.71mmol)の混合物をマイクロ波(300W)下100℃において10分間照射した。粗製混合物をEtOAc(10mL)により希釈し、濾過し、HPLC分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン8aをジエチルエーテルでの処理により精製し、白色固体物として生成物を単離した。
m.p.127‐128℃
IR(KBr,cm−1):3434,2980,1786,1746,1489,1370,1311,1287,1199,1153,1121,555.
1H‐NMR(CDCl3,300MHz):9.2(d,2H,J=5.6Hz);8.3(t,1H,J=7.7Hz);7.89(t,2H,J=6.9Hz);7.69(d,2H,J=8.0Hz);7.10(d,2H,J=8.0Hz);5.07(d,1H,J=13.0Hz);4.89(d,1H,J=12.6Hz);4.27(t,2H,J=7.1Hz);4.20‐4.13(m,2H);2.81(dd,1H,J=12.8Hz,J=7.1Hz);2.31(s,3H);2.04‐1.98(m,1H);1.38(s,9H);1.25(t,3H,J=7.1Hz)ppm.
MS(ESI+):m/z:518(M+1)
前工程で得られた純粋ベタイン8aを水性48%HBr(30mL)に溶解し、還流下において18時間加熱した。混合液を水によって希釈し、EtOAc(3×10mL)により洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末:SiO2:セルロース粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として9aを得た(110mg,40%)。m.p.>200℃.
〔α〕D 25℃=−49°(0.069,CH3OH)
IR(KBr,cm−1):3433,3051,1724,1633,1488,1420,1384,1281,1188,1144,1083,683.
1H‐NMR(D2O,500MHz):8.82(d,2H,J=5.3Hz);8.59(t,1H,J=7.8Hz);8.08(t,2H,J=6.8Hz);5.23(d,1H,J=14.3Hz);4.97(d,1H,J=14.3Hz);4.28(t,1H,J=9.2Hz);3.06(dd,1H,J=13.9Hz,J=9.3Hz);2.13(t,1H,J=7.8Hz)ppm.
13C(D2O,125MHz):173.1,172.6,147.2,145.6,128.6,63.9,63.7,49.2,32.7ppm
MS(ESI+):m/z:236(M+1−2Br)
腫瘍増殖に及ぼす異なる異性体(9a,9b,9cおよび9d)の効果。検定される腫瘍:Renca
このアッセイは、Renca細胞で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす各立体異性体の効果を調べるために行った。それらの効果をプラセボと比較した。検定された立体異性体は以下であった:
異性体1:3R,5S‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩(9b)
異性体2:3R,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩(9c)
異性体3:3S,5S‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩(9a)
異性体4:3S,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩(9d)
これらの異性体は実施例4、5および6で開示された工程に従い得られる。
腫瘍
RencaはBalb/cマウス株に由来する腎臓細胞癌腫であり、したがってBalb/c遺伝的背景をもつマウスと同系である(Melder RJ et al.,Cancer Immunol.Immunother.,2005,54:535-547、Felluga B et al.,1969,J,Natl.Cancer Inst.43:319-333)。Rencaは中度の免疫原性腫瘍とみなされ、免疫介在アプローチを試験するための適切なモデルとして用いられる(Salup RR,et al.,1992,The Journal of Urology,147:1120-1123)。
活性成分
無菌生理食塩水中2.815mg/mLの異性体1(9b)
無菌生理食塩水中2.520mg/mLの異性体2(9c)
無菌生理食塩水中2.080mg/mLの異性体3(9a)
無菌生理食塩水中3.040mg/mLの異性体4(9d)
プラセボ
生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)
先のデータに従い、有意水準に達する上で必要なサンプルサイズは1群当たり動物26匹であった。Epi-info v6.0ソフトウェア(Fleiss.Statistical Methods for rates and Proportions.2nd Ed,Wiley,1981:38-45)を用いてこのサンプルサイズを計算し、0.8検定力、腫瘍面積1/2減少で0.95の信頼レベルおよび1‐1コントロール‐ケース比により評価した。
層状フラッドフード、浴槽、倒立顕微鏡、計数板、CO2インキュベーター、遠心機、キャリパー、バランス、アジャスタブルピペット、窒素容器、冷蔵庫/フリーザー、および免疫不全マウスラック。
トリパンブルー(Sigma,St.Louis,MO,USA)
無菌PBS(Sigma,St.Louis,MO,USA)
生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)
用量
腫瘍接種後、6、7、および14日目に投与される260ngの用量レベルで各異性体を試験した。
ビヒクル
異性体が希釈されるビヒクルは生理食塩水であった。
投与経路および容量
処理は腹腔内経路(i.p.)により行った。接種される用量は0.2mL/動物であった。この経路がオリジナル方法(Perez S,et al.,2003,Clinical Cancer Research,9;5776-5785)で記載されたものであるため、それを選択した。
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウス(Balb/c)を105Renca生細胞含有0.2mLで接種した。皮下接種の日が試験の0日目とみなされる。
腫瘍面積=L×W(mm2)
腫瘍容積=L×W2×1/2(mm3)
結果は各実験群から単一値としておよび/または平均±SDまたはメジアンとして表示した。
異性体とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスにおいてケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ(腫瘍面積および容積)を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定p<0.05。異性体が腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのU検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis2群検定の双方に相当する。
データの高分散により、範囲逸脱動物(25日目に腫瘍面積で25パーセンタイルまたは75パーセンタイルから外れる動物)は研究から除外した。
用いられた統計ソフトウェアはSPSSv12.0であった。
Renca腫瘍細胞増殖に及ぼす異性体の阻害効果
30匹マウス/群(プラセボ群31匹)を研究に用いた。異性体2群のマウス2匹は腫瘍接種後2週目に未知の原因で死亡したため、除外した。
表1および2はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日で異性体またはP.S.マウス群における面積(表1)または容積(表2)のメジアンを要約する。
異なる異性体(9a,9b,9cおよび9d)とBLASの混合物との腫瘍増殖の比較
検定される腫瘍:ASB XIV
このアッセイは、ASB XIV腫瘍で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす各立体異性体の効果をそれらすべての混合物の効果と比較するために行った。検定された立体異性体は前記実施例7の場合と同一のもの+それらすべての混合物(BLAS)であった。装置(所要時)、試薬、投与の用量、ビヒクル、経路、および容量は実施例7の場合と同一であった。
腫瘍
ASB XIVはBalb/cマウス株に由来する肺扁平上皮細胞癌腫であり、したがってBalb/c遺伝的背景をもつマウスと同系である。
ASB XIV細胞(CLS,Eppelheim,Germany)を3〜4日毎の連続継代によりインビトロにおいて維持した。5×106細胞を75cm2培養フラスコへ接種することによりRPMI培地(RPMI、10%牛胎児血清、2mM L‐グルタミン、非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、20mM HEPES、80μg/mLゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,MO,USAから購入した)において培養を行った。トリプシン(Sigma,St.Louis,MO,USA)処理した48時間培養物から集められた腫瘍細胞を本実施例でASB XIV細胞源として用いた。
活性成分
無菌生理食塩水中濃度65μg/mLのBLAS(異性体1、2、3、および4の混合物)
無菌生理食塩水中濃度65μg/mLの異性体1(9b)
無菌生理食塩水中濃度65μg/mLの異性体2(9c)
無菌生理食塩水中濃度65μg/mLの異性体3(9a)
無菌生理食塩水中濃度65μg/mLの異性体4(9d)
プラセボ
生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)
先のデータに従い、有意水準に達する上で必要なサンプルサイズは1群当たり動物26匹であった。Epi-info v6.0ソフトウェアを用いてこのサンプルサイズを計算し、0.8検定力、腫瘍面積1/2減少で0.95の信頼レベルおよび1‐1コントロール‐ケース比で評価した。
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウス(Balb/c)を2×105ASB XIV生細胞含有0.2mLで接種した。皮下接種の日が試験の0日目とみなされる。
腫瘍面積=d1×d2(mm2)
腫瘍容積=d1×d22×1/2(mm3)
結果は各実験群から単一値としておよび/または平均±SDまたはメジアンとして表示した。
BLASまたは異なる各立体異性体とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ(腫瘍面積および容積)を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定p<0.05。BLASが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのU検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis2群検定の双方に相当する。
データの高分散のせいで、範囲逸脱動物(33日目に腫瘍面積で10パーセンタイルまたは90パーセンタイルから外れる動物)は研究から除外した。
用いられた統計ソフトウェアはSPSSv12.0であった。
ASB XIV腫瘍細胞増殖に及ぼすBLASまたは各異性体の阻害効果
31匹マウス/群(プラセボ群32匹)を研究に用いた。異性体4(9d)群のマウス2匹は腫瘍接種後1週目に未知の原因で死亡したため、除外した。
表5および6はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日でBLAS、異性体またはP.S.マウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
異なる異性体(9a,9b,9cおよび9d)と、BLASの混合物との腫瘍増殖の比較。検定される腫瘍:Ehrlich
このアッセイは、Ehrlich腫瘍で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす各立体異性体の効果をそれらすべての混合物の効果と比較するために行った。実施例8の場合と同一の生成物、装置、試薬、投与の用量、ビヒクルおよび経路が用いられた。
腫瘍
マウスをEhrlich腫瘍細胞で接種した。それはネズミ哺乳類腺癌として記載されていた。Ehlrich腫瘍は異系交配マウスで当初作製されたネズミ哺乳類癌腫であり、したがってそれはいわゆる非特異的腫瘍に属する(Subiza JL,Vinuela JE,Rodriguez R,Gil J,Figueredo MA,de la Concha.EG.Development of splenic natural suppressor(NS)cells in Ehrlich tumor bearing mice.,Int.J.Cancer,44:307-315,1989)。それは組織適合性障壁を越えて増殖してもよく、したがってマウス株特異性ではない(Carry PJ,Prescott DM,Ogilvie GK,Resistance to Ehrlich ascites tumor in a strain of dystrophic mice,Cancer Res.,39;2139-2140,1979)。
Ehrlich細胞を3〜4日毎の連続継代によりインビトロにおいて維持した。5×106細胞を75cm2培養フラスコへ接種することによりRPMI培地(RPMI、10%牛胎児血清、2mM L‐グルタミン、非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、20mM HEPES、80μg/mLゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,MO,USAから購入した)において培養を行った。48時間培養物から集められた腫瘍細胞を下記研究で細胞源として用いた。
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウス(Balb/c)を2×105Ehrlich生細胞含有0.2mLで接種した。皮下接種の日が試験の0日目とみなされる。
腫瘍面積=L×W(mm2)
腫瘍容積=L×W2×1/2(mm3)
結果は各実験群から単一値としておよび/または平均±SDまたはメジアンとして表示した。
BLASまたは異なる各立体異性体とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ(腫瘍面積および容積)を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定p<0.05。BLASが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのU検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis2群検定の双方に相当する。
用いられた統計ソフトウェアはSPSSv12.0であった。
Ehrlich腫瘍細胞増殖に及ぼすBLASの阻害効果
16匹マウス/群を研究に用いた。
表9および10はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す(n(初日)は全ケースで16であり、用量は260ng/マウスである)。これらの表は、評点された各日でBLAS、異性体またはP.S.マウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
異なる腫瘍の増殖に及ぼす異性体4(9d)の効果
実施例8および9において用いられたものと同様の方法および材料に従い、異なる腫瘍に及ぼす異性体4(9d)の効果を調べるために、以下のアッセイを行った。すべてのケースで、無菌生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)をプラセボとして用いた。腫瘍接種後6、7、および14日目に表13で示された用量レベルで異性体4(9d)を試験した。すべてのケースにおいて、ビヒクルは生理食塩水であり、処理は腹腔内経路によるものであった。接種された容量は0.2mL/動物であった。結果が表13において示される。
異性体4(9d) vs プラセボおよび9d+シスプラチンの組合せの効果検定される腫瘍:KLN205およびLewis肺細胞
このアッセイは、KLN205腫瘍およびLewis肺細胞で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす異性体4(9d)の効果を異性体4(9d)+シスプラチンの混合物の効果と比較するために行った。実施例7で用いられたものと同様の装置、試薬、ビヒクルと、投与の経路および用量とが用いられた。
実施例11、12、および13では下記薬物が研究で用いられた:
活性成分
無菌生理食塩水中、シスプラチン(Sigma,St.Louis,MO,USA)
無菌生理食塩水中、異性体(9d)(3S,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩)
プラセボ
生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)
腫瘍面積=d1×d2(mm2)
腫瘍容積=d1×d22×1/2(mm3)
結果は各実験群から単一値としておよび/または平均±SDまたはメジアンとして表示した。
腫瘍増殖に及ぼすシスプラチンとの組み合わせた9dの効果
検定される腫瘍:KLN205
このアッセイは、KLN205細胞により感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす効果を調べるために行った。それらの効果をシスプラチン+9dの組合せおよび/またはプラセボと比較した。
腫瘍
KLN205はDBA/2マウス株に由来する肺細胞癌腫であり、したがってDBA/2遺伝的背景をもつマウスと同系である(Kaneko T and LePage GA.Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo.Cancer Res.38:2084-2090,1978)。
腫瘍接種後3週間にわたり週2回投与される65μgの用量レベルでシスプラチンを試験した。
腫瘍接種後3週間にわたり週2回投与される250ngの用量レベルで異性体4(9d)を試験した。
プラセボ、9d、シスプラチン、または9d+シスプラチン間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ(腫瘍面積および容積)を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定p<0.05。9dおよび/またはシスプラチンが腫瘍増殖に相乗作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてt検定を選択した。
用いられた統計ソフトウェアはSPSSv12.0であった。
KLN205腫瘍細胞増殖に及ぼす9dおよび/またはシスプラチンの阻害効果
16または15匹マウス/群を研究に用いた。
表14および15はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日で9d、シスプラチン、9d+シスプラチン、またはP.S.マウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
皮下、皮内、または筋肉内接種により腫瘍増殖に及ぼすシスプラチンと組み合わせた異性体(9d)の効果。検定される腫瘍:KLN205
このアッセイは、KLN205細胞により感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす効果を調べるために行った。腫瘍は皮下、皮内、または筋肉内接種により定着させた。
腫瘍
KLN205はDBA/2マウス株に由来する肺細胞癌腫であり、したがってDBA/2遺伝的背景をもつマウスと同系である(Kaneko T and LePage GA.Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo.Cancer Research.38:2084-2090,1978)。
腫瘍接種後7、11、14、18、21、25、および28日目に投与される65μgの用量レベルでシスプラチンを試験した。
腫瘍接種後7、11、14、18、21、25、および28日目に投与される250ngの用量レベルで異性体(9d)を試験した。
右後肢脇腹で皮下および皮内接種、並びに右後肢で筋肉内により腫瘍を定着させた。マウス(DBA/2)を2×105KLN205生細胞含有0.05mLで接種した。皮下、皮内および筋肉内接種の日が試験の0日目とみなされる。
プラセボ、9d、シスプラチン、または9d+シスプラチン間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスにおいてケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ(腫瘍面積および容積)を各群内で正規分布について検定した(Kolmogorov Smirnov検定p<0.05)。9d、シスプラチン、または9d+シスプラチンが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルにおいてノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのU検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis2群検定の双方に相当する。
すべての統計解析はSPSS(Statistical Package for Social Sciences)v13.0で行った。
KLN205腫瘍細胞増殖に及ぼす異性体4(9d)の阻害効果
10匹マウス/群を研究に用いた。
表18および19はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日で面積または容積のメジアンを要約する。
腫瘍増殖に及ぼすシスプラチンと組み合わせた9dの効果。検定される腫瘍:Lewis
このアッセイは、Lewis肺細胞により感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす効果を調べるために行った。それらの効果が化学療法剤+9dの組合せおよび/またはプラセボと比較される。
腫瘍
Lewis LungはC57BL/6Jマウス株に由来する肺細胞癌腫であり、したがってC57BL/6J遺伝的背景をもつマウスと同系である(Rodrigo Garzon M,Tirapu Fernandez de la Cuesta I,Arina Iraeta A,Noel Centelles Llorente M and Zulueta Frances J.Use of Gene Therapy in a Subcutaneous Murine Model of Lung Cancer,Arch Bronconeumology.42:526-532,2006)。
腫瘍接種後7、11、14、18、21、24、および27日目に投与される65μgの用量レベルでシスプラチンを試験した。
腫瘍接種後7、11、14、18、21、24、および27日目に投与される250ngの用量レベルで異性体4(9d)を試験した。
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウスを2×105生細胞含有0.2mLで接種した。皮下接種の日が試験の0日目とみなされる。
腫瘍面積=d1×d2(mm2)
腫瘍容積=d1×d22×1/2(mm3)
結果は各実験群から単一値としておよび/または平均±SDまたはメジアンとして表示した。
プラセボ、9d、シスプラチン、または9d+シスプラチン間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスにおいてケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ(腫瘍面積および容積)を各群内で正規分布について検定した(Kolmogorov Smirnov検定p<0.05)。9d、シスプラチン、または9d+シスプラチンが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのU検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis2群検定の双方に相当する。
我々は腫瘍接種後31日目に非検出または非評点腫瘍を有する研究動物を除外した。データの高分散により、範囲逸脱動物は研究から除外した。
すべての統計解析はSPSS(Statistical Package for Social Sciences)v13.0で行った。
Lewis肺腫瘍増殖に及ぼす異性体4(9d)の効果
15匹マウス/群を研究に用いた。プラセボ群のマウス1匹は腫瘍接種後2週目に未知の原因で死亡したため、除外した。
表22および23はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日においてP.S.、9d、シスプラチン、または9d+シスプラチンマウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
毒性
このアッセイは、マウスでBLASおよびIL‐2処理の耐性(致死性/毒性)を調べるために行った。
研究薬物
無菌生理食塩水中1.25mg/mLのBLAS(異性体1、2、3、および4の等モル混合物)
18×106IU/mLのヒト組換えIL‐2(Proleukin;Chiron Iberia,Madrid,Spain)
BLASおよびIL‐2が希釈されるビヒクルは、注射用無菌生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)および注射用無菌蒸留水(Grifols,Barcelona,Spain)であった。
処理はi.p.により行った。
BLASおよびIL‐2処理による致死性および毒性
表26は両処理において観察される致死性を示す。結果は生存率により表示される。この表においてみられるように、最高用量のIL‐2をうけたB2群のマウス2匹が初回投与後6および7日目に死んだ。それ以上の死亡は、IL‐2(低用量)またはどの用量のBLASで処理された、他のいずれのマウス群においても観察されなかった。
BLASはIL‐2と対照的に、その治療範囲を大きく超えた用量でも、マウスにおいて非常に耐えることができる。
異性体4(9d)の毒性
このアッセイは、健常マウスにおいて高用量で用いられた異性体4(9d)の毒性効果を扱う予備研究を実施するために行った。その最終毒性がプラセボと比較される。
研究薬物
活性物質
無菌生理食塩水中、0.7mg/mLの異性体4(9d)
プラセボ
注射用無菌生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)
異性体4が希釈されるビヒクルは、注射用無菌生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)および注射用無菌蒸留水(Grifols,Barcelona,Spain)であった。
処理はi.p.またはs.c.により行った。
全マウスを10日間にわたり毎日観察した。
3回の測定を行った:
3.体重.これはグラムで測定および表示した。
4.致死性.これは生存率として表示した。
5.毒性.これは下記パラメーターおよびスコア基準下において生育マウスで調べた:
異性体4とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのU検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis2群検定の双方に相当する。
用いられた統計ソフトウェアはSPSSv12.0であった。
異性体4処理による致死性および毒性
表28および29は、評点された各日における各C57BL/6マウスの体重と、平均、標準偏差およびメジアンを示す。Mann Withney U検定で調べたところ、各群間で体重の差異が観察されなかった(p>0.05)。
表現型白血球解析
この実施例は、フローサイトメトリーにより、処理マウス間における白血球群パーセンテージの最終的差異を評価する目的で行った。膜タンパク質(CD11BおよびLy6G)を前記タンパク質に対する特異的抗体で標識した後、フローサイトメトリーを用いることにより、カウントを行った。CD11B(Mac‐1としても知られる)マーカーは単球群で発現され、一方Ly6G(GR‐1としても知られる)は顆粒球群で発現される。両マーカー(CD11BおよびLy6G)が好中球群で発現される。このアッセイは、対象者、例えばAIDSに罹患した患者で免疫応答の賦活を必要とする場合に重要である、特に骨髄細胞系からの白血球群を検定化合物が増加させることを示す。
研究薬物
無菌生理食塩水中65μg/mLの異性体4(化合物9d)
プラセボ
生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)
層状フラッドフード、フローサイトメーター、アジャスタブルピペット、無菌シリンジ、無菌針、EDTA無菌チューブ、プラスチックチューブ
・麻酔溶液
・無菌PBS(Sigma,St.Louis,MO,USA)
・生理食塩水(Grifols,Barcelona,Spain)
・ラット抗マウスCD11b‐PE(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)
・ラット抗マウスLys6G‐FITC(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)
・Optylise C(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)
用量
0および7日目に投与される250ngの用量レベルで異性体4(化合物9d)を試験した。
ビヒクル
異性体4が希釈されるビヒクルは生理食塩水である。
投与経路および容量
処理は腹腔内経路で行った。接種される容量は200μL/動物であった。
血液を前記のモノクローナル抗体と混ぜた。
20分間のインキュベート後、赤血球群を溶解させるためにOptylise C溶液をサンプルへ加えた。
最後に、サンプルを1×無菌PBSで1/2希釈し、フローサイトメトリーにより調べた。
解析される各群のパーセンテージは、各実験群から単一値としておよび平均±SDとして表示した。
Claims (13)
- 下記式Iの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物の合成方法であって:
R1は‐OH、‐ORaから選択され、ここでRaは置換もしくは非置換アルキルから選択され、
R2、R3、およびR4は、独立して、水素、または酸性条件下において加水分解する窒素保護基から選択され、
Xは臭化物アニオンであり、および
Yは、下記式VIaのN含有基:
点線は窒素原子と共に非置換ピリジンを形成し、および
Xは前記と同義であり、
a)下記式IVのエナンチオ純粋化合物:
b)前記式IIIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を、下記式IIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体:
R1、R2、およびR4は前記と同義であり、
R5は負電荷またはR3から選択され、ここでR3は前記と同義であり、およびYは以下から選択されるN含有有機残基である:
(i)R5が負電荷である場合、Yは下記式VIIaのN含有有機残基である:
(ii)R5がR3である場合、Yは
下記式VIIcのN含有有機残基:
Zは臭化物アニオンである)〕
またはその混合物へ変換し、そして
c)前記式IIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を、式HXの酸(Xは前記と同義である)を含んでなる酸媒体と接触させて、前記式Iの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を生じさせることを含んでなる、方法。 - 前記式IVの化合物が、S異性体およびR異性体から選択されるエナンチオ純粋化合物の形態である、請求項1に記載の方法。
- 前記式IVの化合物が、5R‐4‐メチレン‐5‐オキソピロリジン‐1,2‐ジカルボン酸 1-tert-ブチルエステル 2‐エチルエステルまたは5S‐4‐メチレン‐5‐オキソピロリジン‐1,2‐ジカルボン酸 1-tert-ブチルエステル 2‐エチルエステルである、請求項1に記載の方法。
- 前記式Vの化合物がN‐トシルイミノベンジルヨージナンである、請求項1に記載の方法。
- 前記式IIIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を下記式VIIIaの窒素含有求核剤:
前記式IIIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物が、R5がR3でかつYが式VIIbのN含有有機残基である式IIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体へ変換される、または
前記式IIIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を、下記式VIIIaの窒素含有求核剤:
R3Z (X)
(上記式中、R3およびZは前記と同義である)と反応させることにより、前記式IIIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体またはその混合物が、R5がR3でかつYが式VIIcのN含有有機残基である式IIの化合物の95%以上の純度を有する立体異性体へ変換される、
請求項1に記載の方法。 - 前記式IIIの化合物が、95%以上の純度を有する立体異性体(3R,5R)、(3S,5S)、(3R,5S)、または(3S,5R)の形態である、請求項1に記載の方法。
- 下記である、化合物:
95%以上の純度を有する3S,5R‐1‐(3‐アミノ‐5‐カルボキシ‐2‐オキソピロリジン‐3‐イルメチル)ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩。 - 薬学上許容可能な担体と、請求項7に記載の化合物とを含んでなる、医薬組成物。
- 請求項7に記載の化合物または請求項8に記載の組成物と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
- 請求項7に記載の化合物と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる、腫瘍の治療のための医薬組成物。
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