CN101454309A

CN101454309A - 焦谷氨酸衍生物的合成和用途

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Publication number: CN101454309A
Application number: CNA2007800197234A
Authority: CN
Inventors: 胡利奥·阿尔瓦雷斯布伊拉戈麦斯; 何塞·路易斯·努瓦拉罗比斯科; 玛·帕兹·马蒂亚马尔丁; 索尼亚·瑟娜帕瑞达
Original assignee: Prodimed SA
Current assignee: Prodimed SA
Priority date: 2006-04-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2027-04-20
Also published as: US20070249678A1; CA2649762A1; JP2007291050A; MX2008013435A; RU2456271C2; EP1847536A1; AU2007242793B2; JP5616628B2; EP2021334B1; CN101454309B; US20090163555A1; WO2007122199A1; JP2009534361A; US8835466B2; RU2008145775A; ES2543199T3; EP2021334A1; US7671206B2; AU2007242793A1; CA2649762C

Abstract

分离的光学活性立体异构体形式的或者其混合物形式的新颖的焦谷氨酸衍生物(I)是可用于增强个体中免疫应答和/或用于治疗肿瘤，细菌、真菌或病毒感染，或者自体免疫疾病的化合物，其中R₁是－OH、－ORa，其中Ra是烷基、环烷基、烯基、环烯基、芳基、芳烷基或杂环基；R₂、R₃和R₄独立为H、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺；X是药物可接受的阴离子；以及Y是含N基团。

Description

焦谷氨酸衍生物的合成和用途

发明领域

本发明涉及焦谷氨酸衍生物、其分离的光学活性立体异构体及其混合物的新颖合成，以及其用途，并且涉及合成所述焦谷氨酸衍生物的新颖的中间体。本发明还涉及所述焦谷氨酸衍生物、其光学活性立体异构体及其混合物的治疗用途。

发明背景

欧洲专利EP 0768308 B1公开了具有下列通式的焦谷氨酸衍生物的立体异构体的混合物可以刺激免疫生物反应

其中R₁、R₂和R₃可以是氢或-C(＝O)Me并且A可以是Cl-、CH₃COO-或HO-。其中公开的合成所述化合物的方法包括在加热下使L-丝氨酸与过量1摩尔的乙酸酐和吡啶反应。因此，如所述文献中所公开的，从未分离出不同的立体异构体并且其中所公开的体内和体外测定是用总共四种可能的光学活性立体异构体的混合物进行的。未公开关于纯的单一立体异构体或单一立体异构体的富集的混合物的指示。此外，未给出关于由所公开的混合物分离不同光学活性立体异构体的指示。

技术人员知道，化合物的不同光学活性立体异构体可具有不同的、或甚至相反的作用。例如，化合物可具有治疗效果而其对映体可能是有毒的。这样的情况的实例是技术人员公知的。右美沙芬是减充血剂，而左美沙芬是有效的麻醉剂。

右美沙芬左美沙芬

还已知哌克昔林的对映体的不同体内行为。

S-哌克昔林 R-哌克昔林

它们均为心律调节剂，但该对映体之一代谢更缓慢并在体内蓄积，这种情况在80年代造成了大量死亡。

可能最不幸的和公知的实例是沙利度胺，将其以外消旋混合物给予孕妇来治疗妊娠恶阻。

S-沙利度胺 R-沙利度胺

尽管R-沙利度胺是有效的，但后来发现S-沙利度胺的致畸作用。

因此，在寻找新的具有有益治疗效果的化合物中，通常有必要用对映纯的立体异构体进行测定以试图选择最具活性的对映体和/或放弃最终有毒的对映体。因此，亟需提供焦谷氨酸衍生物的分离的立体异构体。

发明概述

本发明提供获得焦谷氨酸衍生物、其光学活性立体异构体及其混合物的方法。该方法涉及使用能够很容易分离和随后转化的焦谷氨酸衍生物的前体的光学活性立体异构体以得到期望的光学活性立体异构体。

具体地，发明人设想了一种合成方法，其中，若需要，分离不同的具有期望的立体化学的中间体。这些中间体产物可以被进一步转化以提供期望的焦谷氨酸衍生物，其可为期望的基本纯的立体异构体形式或立体异构体的混合物的形式。发明人由对映异构纯的通式IV化合物开始，然后产生非对映异构中间体和终产物，其能够很容易分离和纯化。使用具有期望的立体化学的通式IV化合物，可以得到基本纯的立体异构体形式的或者立体异构体的混合物形式的中间体。所述通式IV化合物可使用对映异构纯的谷氨酸来合成。

因此，一方面，本发明涉及获得通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物的方法，其包括使通式IV化合物与通式V化合物反应以获得通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物；将所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物转化成通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物；以及，最终，使所述通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式HX化合物反应以得到期望的通式I焦谷氨酸衍生物，其为基本纯的立体异构体或其混合物。

本发明的另一方面涉及通式I(即Ia、Ib、Ic或Id)化合物的基本纯的立体异构体。本发明的另一方面涉及某些包含通式Ia、Ib、Ic和/或Id化合物的基本纯的立体异构体的混合物的组合物，例如包含通式Ia、Ib、Ic和/或Id的立体异构体的组合物，条件是所述组合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体的混合物：

(i)1-(3-氨基-5-羰基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐，或

(ii)1-(1-乙酰基-3-氨基-5-羰基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐。

本发明另一方面涉及通式III化合物的基本纯的立体异构体及其混合物。获得所述化合物的方法构成本发明的另一方面。

本发明另一方面涉及获得通式II化合物的基本纯的立体异构体或者所述通式I化合物的基本纯的立体异构体的方法。通式II(即IIa、IIb、IIc或IId)化合物的基本纯的立体异构体构成本发明的另一方面。某些包含通式IIa、IIb、IIc和/或IId的基本纯的立体异构体的混合物的组合物也构成本发明的另一方面。

本发明另一方面涉及某些药物组合物，其包含选自通式Ia、Ib、Ic、Id化合物及其混合物和药物可接受的赋形剂。

本发明另一方面涉及选自通式Ia、Ib、Ic、Id化合物及其某些混合物在制备用于预防或治疗肿瘤的组合物中用途。

附图的简要描述

图1显示所测定的异构体(1-4)对Renca肿瘤细胞生长的抑制作用与安慰剂(P.S.)对比[实施例6]，抑制作用以肿瘤表面积的均值表示。

图2显示所测定的异构体(1-4)对Renca肿瘤细胞生长的抑制作用与安慰剂(P.S.)对比[实施例6]，抑制作用以肿瘤体积的中值表示。

图3显示所测定的异构体(1-4)对Renca肿瘤细胞生长的抑制作用与安慰剂(P.S.)对比[实施例6]，抑制作用以肿瘤表面积的均值表示。

图4显示所测定的异构体(1-4)对Renca肿瘤细胞生长的抑制作用与安慰剂(P.S.)对比[实施例6]，抑制作用以肿瘤体积的中值表示。

发明详述

定义

为了方便理解本发明，本文包括了本发明的上下文中所用的某些术语和表达方式的含义。

“烷基”指由碳和氢原子组成的直链或支链的烃链基团，其不含不饱和键，具有1至12个、优选1至8个碳原子，并且其通过单键与分子的其余部分连接，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。烷基基团可任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如卤素、羟基、烷氧基、O-丙基、O-苄基、O-苯甲酸酯、羧基、氰基、羰基、酰基、烷氧基羰基、氨基、亚氨基、硝基、巯基和烷硫基。

“烯基”指由碳和氢原子组成的直链或支链的烃链基团，其含有至少一个不饱和键，具有1至12个、优选1至8个碳原子，并且其通过单键与分子的其余部分连接，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。烷基基团可任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如卤素、羟基、烷氧基、O-丙基、O-苄基、O-苯甲酸酯、羧基、氰基、羰基、酰基、烷氧基羰基、氨基、亚氨基、硝基、巯基和烷硫基。

“烷氧基”指通式-O-烷基基团，其中烷基如前文所定义，如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

“芳基”指芳香烃基团，如苯基、萘基或蒽基。芳基基团可任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基如本文所定义的羟基、巯基、卤素、烷基、苯基、烷氧基、卤代烷基、硝基、氰基、二烷基氨基、氨基烷基、酰基和烷氧基羰基。

“芳氧基”指通式-O-芳基基团，其中芳基如前文所定义。芳氧基的某些实例为-O-苯基、-O-对甲苯基、-O-间甲苯基、-O-邻甲苯基或-O-萘基。

“氨基”指通式-NH₂、-NHRa、-NRaRb基团，其中Ra和Rb独立地选自取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、或取代的或未取代的杂环基；或者Ra和Rb一起形成取代的或未取代的杂环、取代的或未取代的环烷基或取代的或未取代的环烯基。

“芳烷基”指连接于烷基基团的芳基基团，如苄基和苯乙基。

“羧酸酯”指-CO₂Ra，其中Ra选自取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、或取代的或未取代的杂环基。

“环烷基”指具有3至8个碳原子的饱和碳环。

“环烯基”指具有3至8个碳原子以及至少一个不饱和键的碳环。

“杂环基”指由碳原子和1至5个选自氮、氧和硫的杂原子组成的稳定的3至15元环，优选具有一个或多个杂原子的4至8元环，更优选具有一个或多个杂原子的5或6元环。为了本发明的目的，所述杂环可以是单环、二环或三环体系，其可包括稠合的环体系；以及所述杂环基中的氮、碳或硫原子可被任选地氧化；氮原子可被任选地季铵化；以及杂环基可以是部分或全部饱和的或是芳香性的。这样的杂环的实例包括但不限于氮杂环庚三烯、苯并咪唑、苯并噻唑、呋喃、异噻唑、咪唑、吲哚、哌啶、哌嗪、嘌呤、喹啉、噻二唑、四氢呋喃。

“杂芳基”指其中至少一个环是芳香环的杂环基团。

“保护基团”指封闭有机官能团并且能够在受控条件下移除的基团。保护基团、其相对活泼性以及其保持惰性的条件是技术人员已知的。可参考Greene and Wuts“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)”，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1999。

在本发明的化合物中提及取代的基团是指可被一个或多个适当的基团在一个或多个可利用的位置取代的指定部分，所述适当的基团例如：诸如氟、氯、溴和碘的卤素；氰基；羟基；硝基；叠氮基；诸如C₁-C₆烷酰基基团的烷酰基，如乙酰基等；甲酰胺基；烷基基团，包括那些具有1至约12个碳原子或1至约6个碳原子或更优选地1至3个碳原子的基团；烯基和炔基基团，包括具有一个或多个不饱和键和2至约12个碳或2至约6个碳原子的基团；具有一个或多个氧键和1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的烷氧基基团；诸如苯氧基的芳氧基；烷硫基基团，包括那些具有一个或多个硫醚键和1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的部分；烷基亚磺酰基团，包括那些具有一个或多个亚磺酰键和1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的部分；烷基磺酰基团，包括那些具有一个或多个磺酰键和1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的部分；氨基烷基基团，例如具有一个或多个N原子和1至约12个碳原子或1至约6个碳原子的基团；具有6个或多个碳的碳环芳基，尤其是苯基或萘基；以及诸如苄基的芳烷基。除非另外指明，任选取代的基团可在该基团的每一可取代位置具有取代基，并且每一取代基彼此独立。

术语“药物可接受的阴离子”是指当存在适当的相反阳离子时能够形成药物可接受的盐的任何阴离子。药物可接受的阴离子的实例为Cl^-、Br^-、I^-、F^-、SO₄ ^2-、乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。药物可接受的阴离子的其它实例对于技术人员是显然的。

术语“药物可接受的盐”指当向接受者给药时能够提供(直接或间接)本文所述的化合物的任何药物可接受的盐。然而应当理解，非药物可接受的盐也落入本发明的范围内，因为它们可用于制备药物可接受的盐。盐的制备能够通过本领域已知的方法进行。

例如，本文所提供的化合物的药物可接受的盐可以是酸加合盐、碱加合盐或金属盐，并且它们能够通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这样的盐是通过例如使这些化合物的游离酸或碱形式与水或有机溶剂或二者的混合物中的化学计量量的适当的碱或酸反应而制备的。通常，优选非水介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。酸加合盐的实例包括矿物酸加合盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐；以及有机酸加合盐，例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加合盐的实例包括无机盐，例如铵盐；以及有机碱盐，例如乙二胺、乙醇胺、N，N-二烯基乙醇胺、三乙醇胺、葡糖胺和碱性氨基酸盐。金属盐的实例包括例如钠、钾、钙、镁、铝和锂盐。

“对映富集的”应用于对映体的混合物是指化合物的对映体的混合物，其中这些对映体之一存在的量大于其它对映体的量。因此，对映富集的混合物对于其对映体之一的对映体过量值超过0％、优选超过20％、优选超过40％、优选超过70％、更优选超过80％、更优选超过90％以及更优选超过95％。

“对映纯的”化合物能够被看作两种对映体的混合物，其对映体过量值超过95％、优选超过98％、更优选超过99％更优选超过99.5％。

本专利申请中“基本纯的”化合物是指纯度超过95％、优选超过98％、更优选超过99％、更优选超过99.5％的化合物。

本专利申请中“立体异构体”是指这样的化合物，其由通过相同顺序的化学键结合的相同原子构成但具有不同的不可互换的三维结构。

“含氮亲核试剂”指具有至少一个带有至少一对自由电子对的氮的分子，所述电子对能够与另一分子的亲电(缺电子)部分形成化学键或在同一分子内形成化学键。含氮亲核试剂的实例为伯、仲或叔胺，形成一部分杂环的未取代的氮原子，甚至酰胺部分的氮原子在某些情况下也可作为亲核试剂。

EP 0768308 B1得到焦谷氨酸衍生物的立体异构体的混合物

将EP 0768308 B1中公开的立体异构体的混合物分离成为其基本纯的化合物的所有尝试均失败了。依照发明人的实验部分，获得了所有四种可能立体异构体混合物形式的5％的上述欧洲专利中确定为BLAS-236(Cl)的化合物(1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐)。

还使用不同的操作合成了其中间体前体BLAS-320(Ac)(1-(1-乙酰基-3-乙酰氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓)。

以立体异构体混合物的形式得到式BLAS-320(Ac)化合物，其不可能纯化，主要是因为溶解度问题(化合物BLAS-320(Ac)仅溶于水和甲醇)。

此外，尝试了用其它阴离子替代式BLAS-320(Ac)化合物中的反离子乙酸盐，但不成功。此外，试图将式BLAS-320(Ac)化合物转化(或直接合成)并进一步纯化成其酯衍生物。在所有情况下得到的黑色粗混合物均不可能纯化。

考虑到上述事实，人们认识到EP 0768308 B1的公开不足以获得本文提到的焦谷氨酸衍生物的期望的基本纯的立体异构体。因此，开发了完全不同的方法。

通式I化合物及其混合物的基本纯的立体异构体的合成

一方面，本发明涉及合成通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物的方法，下文称为本发明的方法

其中

R₁选自-OH、-ORa，其中Ra选自取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、或取代的或未取代的杂环基；

R₂、R₃和R₄独立地选自氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺；

X是药物可接受的阴离子；以及

Y是选自下列的有机基团

(i)式VIa的含N基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基，并且X如上文所定义；或

(ii)式VIb的含N基团

其中

X如上文所定义；并且

Ra和Rb独立地选自取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、或取代的或未取代的杂环基；或者

Ra和Rb与它们所连接的氮原子一起形成取代的或未取代的杂环；

所述方法包括

a)使对映纯的通式IV化合物或其混合物

其中R₁和R₂如上文所定义；

与通式V化合物反应

其中R₄如上文所定义；

以得到通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，

其中R₁、R₂和R₄如上文所定义；

b)将所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物转化为通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物

其中

R₁、R₂和R₄如上文所定义；

R₅选自负电荷或R₃，其中R₃如上文所定义；以及

Y是选自下列的含N有机基团

(i)当R₅是负电荷时，Y是式VIIa的含N有机基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基；或

(ii)当R₅是R₃时，Y是选自下列的含N有机基团

(ii.a)式VIIb的含N基团

其中Ra和Rb如上文所定义；或

(ii.b)式VIIc的含N有机基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基；以及

Z是药物可接受的阴离子；以及

c)使所述通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与含有式HX的酸的酸介质接触以得到所述通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中X如上文所定义。

在酸性条件下水解的氮保护基团(R₂、R₃和/或R₄)的作用是保护氮官能团直至步骤c)(通过将通式II化合物与通式HX化合物反应而将所述通式II化合物转化为通式I化合物)。任何能够保护氮原子直至步骤c)的氮保护基团均可适用于本发明。优选的在酸性条件下水解的氮保护基团是那些可以在步骤c)的过程中在形成盐或二盐以得到通式I化合物的同时水解的氮保护基团。在该方法中，在步骤c)的过程中，在单一合成步骤中使分子的氮原子脱保护和形成盐或二盐。然而，根据本发明，在使氮原子脱保护的同时形成盐或二盐并不是必须的。因此，根据本发明的实施方案，盐或二盐形成与氮原子的脱保护可能需要超过一步。

根据优选实施方案，在酸性条件下水解的氮保护基团选自式-(O＝)C-O-Ra氨基甲酸盐，其中Ra具有与上文相同的含义，优选其中Ra是苄基、-C(CH₃)₃或-CH₂CH₃；或者式-(O＝)S(＝O)-Ra磺酸盐，其中Ra具有与上文相同的含义，优选其中Ra是-CH₃或甲苯磺酰基。

在酸性条件下水解的其它保护基团是本领域技术人员已知的；参见参考书，例如Greene and Wuts“Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基团)”，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，1999。

当R₂、R₃和R₄至少之一是邻苯二甲酰胺时，有必要在形成盐或二盐之前(步骤c之前)进行另一步骤，其包括还原或与肼反应(关于如何移除邻苯二甲酰胺基团的更多细节，参见Greene and Wuts“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)”，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1999)。

本发明方法的通式IV起始化合物可以是对映纯化合物(即R或S)的形式或者是对映体的混合物(R和S)的形式，任选地富含它们之一。本文所用的术语“对映体的混合物”包括两种对映体的等摩尔比的或不等摩尔比的任意混合物，并且从而不仅包括所述两种对映体的外消旋混合物，而且包括富含任一所述对映体的混合物。

当通式IV化合物是对映纯化合物的形式时，上述反应可得到两种产物(立体异构体)，一种对应于从β面的进攻并且另一种对应于从α面的进攻。在这种情况下，反应显示低的立体选择性并且从通式IV化合物的每一对映体获得两种可能的化合物(立体异构体)的混合物。

因此，根据一具体实施方案，通式IV化合物是对映纯化合物的形式。若通式IV化合物的S异构体被用做起始原料，则反应通常得到通式IIIa化合物

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义；

与通式IIIb化合物

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义的混合物。

因此，当所用的通式IV化合物的异构体是S立体异构体时，得到的通式III化合物通常会是其通式IIIa和IIIb的立体异构体的混合物的形式。若需要，可将所述立体异构体混合物形式的所述通式III化合物通过常规方法(如硅胶、重结晶等)分离以获得等摩尔比或非等摩尔比的IIIa和IIIb的混合物。或者，若需要，可将所述通式IIIa和IIIb立体异构体的混合物通过常规方法(如重结晶、色谱法等)处理以分离每一立体异构体并获得作为对映纯化合物的通式IIIa和IIIb的立体异构体。

此外，若通式IV化合物的R异构体被用作起始原料，反应通常得到通式IIIc化合物

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义；

和通式IIId化合物

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义的混合物。

因此，当所用的通式IV化合物的异构体是R立体异构体时，得到的通式III化合物通常会是其通式IIIc和IIId的立体异构体混合物的形式。如上文所述，若需要，可将所述立体异构体混合物形式的所述通式III化合物通过常规方法分离以获得等摩尔比或非等摩尔比的IIIc和IIId的混合物；或者，若需要，可将所述立体异构体的混合物通过常规方法处理以分离每一立体异构体并获得作为对映纯化合物的通式IIIc和IIId的立体异构体。

尽管这似乎是个缺点，本发明人已发现由通式IV化合物与通式V化合物的反应最终获得的混合物的化合物能够被很容易分离成相应的通式III化合物的基本纯的立体异构体，即IIIa、IIIb、IIIc或IIId。这允许合成通式I化合物的基本纯的立体异构体，这是本发明的一方面。

根据另一具体实施方案，通式IV化合物是两种可能对映体(R或S)混合物的形式，任选地对于所述对映体之一是对映富集的。在这种情况下，得到的通式III化合物选自IIIa、IIIb、IIIc和IIId的混合物(以等摩尔比或非等摩尔比)；等摩尔比或非等摩尔比的IIIa和IIIc的混合物；或者等摩尔比或非等摩尔比的IIIb和IIId的混合物。

通式IV化合物能够通过本领域已知的方法获得。例如，本发明人所用的一合成方法如方案1所述。谷氨酸1(在该情况下为D-谷氨酸)可被转化成式2化合物，如Silverman，R.B.；Levy，M.A.，J.Org.Chem.1980，45，815所述。第二步是酰胺氮的保护，使用已知的方法(Flyn，D.L.，et al.，J.Org.Chem.，1983，48，2424)以获得3化合物。然后，随后两步是：首先，用二甲氨基甲基基团取代2-吡咯烷酮的3-位，得到4[其实际上是两种非对映异构体的混合物，因为在该过程中不控制3-位的手性中心]以及用MeI进行季铵化，并且消除得到式5化合物(通式IV化合物，其中R₁是-OEt以及R₂是BOC)，其已被描述于Panday，S.K.；Griffart-Brunel，D.；Langlois，N.；Tetrahedron Lett.，1994，35，6673。在该情况下，得到的通式IV化合物具有R构型。当期望S构型时，使用L-谷氨酸作为起始原料(总的来看，5具有与起始的谷氨酸相同的构型)。

方案1

用于合成化合物5上述方法的第一变化包括将谷氨酸1(在该情况下为D-谷氨酸)转化为式1’的焦谷氨酸，如Lennox，J.R.；Turner，S.C.；Rapoport，H.J.Org.Chem.2001，66，7078-7083所述。随后通过在甲醇和SOCl₂存在下的酯化反应将所述式1’的焦谷氨酸转化成上述式2化合物(参见方案2)。

方案2

用于合成化合物5上述方法的第二变化包括使用DMAP作为碱和乙腈(MeCN)溶剂将式2化合物转化成式3化合物。

用于合成化合物5上述方法的第三变化包括通过与tBuOCH(NMe₂)₂(Bredereck试剂)反应而将式3化合物转化成式4’化合物。在两步序列中将所述式4’化合物转化成式5化合物。首先，通过使式4’化合物与稀HCl反应。然后，通过使得到的化合物与HCHO水溶液(37％)在无机碱的存在下反应，如WO 2004039314所述(参见方案3)。

方案3

为了实现形成氮丙啶环，本领域技术人员知道多种试剂。然而，选择用于由碳-碳双键合成螺-氮丙啶的试剂并不容易。例如，在HBr/H₂O₂存在下使用氯胺-T(L.J.Suman；B.S.Sharma；S.Bir.Tetrahedron Letters 2004，45，8731)不能得到期望的氮丙啶，而是得到下列通式的氯代衍生物

经过大量实验，发现用于该反应的最适合的试剂是通式V的benzyliodinane。根据一具体实施方案，R₄选自-(O＝)C-O-C(CH₃)₃、-(O＝)C-O-CH₂CH₃、-(O＝)S(＝O)-对甲苯磺酰基或邻苯二甲酰胺。在一优选实施方案中，通式V化合物是N-对甲苯磺酰基亚氨基benzyliodinane(Baron E.；O’Brien P.；Towers T.D.Tetrahedron Lett.，2002，43，723)，其可按照Gillepia，K.，Synthetic Comunn.2001，123所述的方法合成。

若需要，能够在催化剂的存在下进行对映纯的通式IV化合物或其混合物与通式V化合物反应以得到通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，所述催化剂优选铜基催化剂，更优选自Cu(ft)₂或Cu(acac)₂，其中“ft”是酞菁并且“acac”是乙酰乙酸盐。关于催化剂和条件的更多细节，参见Baron，E.；O’Brien，P.；Towers，T.D.TetrahedronLett.，2002，43，723和S.L.Jain，B.Sain，Journal of molecular catalysisA：Chemical 2003，195，283。该反应通常在适当的有机溶剂中、在适当的温度下进行，优选在0℃至100℃的温度下进行。尽管在所述反应中实际上能够使用任何适当的有机溶剂(如乙腈、二甲基甲酰胺等)，在一具体实施方案中，当通式IV化合物是4-亚甲基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯并且通式V化合物是N-甲苯磺酰亚氨基benzyliodinane(PhI＝NTs)时[实施例3.1和4.1]，有机溶剂是乙腈并且反应在0℃至室温(约18℃-24℃)下进行。

此外，能够使用通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，以经由通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物获得通式I的焦谷氨酸衍生物的基本纯的立体异构体或其混合物。

因此，将通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物进一步转化成通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，转化的方法取决于R₅和Y的性质，因此：

(A)为了制备通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中R ₅ 是负电荷以及Y是通式VIIa的含N有机基团，将通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa的含氮亲核试剂反应

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基，或者

(B)为了制备通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中R ₅ 是R ₃ 以及Y是通式VIIb的含N有机基团，将通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIb的含氮亲核试剂反应

其中Ra和Rb如前文所定义；

并且，若需要，将得到的混合物用通式X化合物淬灭

R₃Z (X)

其中R₃和Z如前文所定义；或者

(C)为了制备通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中R ₅ 是R ₃ 以及Y是通式VIIc的含N有机基团，将通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa的含N亲核试剂反应，并将得到的混合物用所述通式X化合物淬灭。

简单地说，如上文所述，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物的合成包括使通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物

-与通式VIIIa化合物反应，或者

-与通式VIIIb化合物反应，并且若需要，与通式X化合物反应，或者

-与通式VIIIa化合物和通式X化合物反应。

起始的通式III化合物可以是基本纯的立体异构体的形式[即(3R，5R)；(3S，5S)；(3R，5S)；或(3S，5R)]或者是所述基本纯的立体异构体的混合物形式，如以相同或不同比例的非对映异构体混合物的形式。本文所用的术语“立体异构体混合物”包括化合物的两种或多种立体异构体的等摩尔比或非等摩尔比的任何混合物。通常，起始原料(通式III化合物)的立体化学保留在得到的产物(通式II化合物)中。

因此，根据一具体实施方案，通式III化合物是其基本纯的立体异构体的形式[即(3R，5R)；(3S，5S)；(3R，5S)；或(3S，5R)]，在这种情况下，获得保留了起始通式III化合物的立体化学的基本纯的通式II化合物。

根据另一具体实施方案，通式III化合物是所述立体异构体的等摩尔比或非等摩尔比的混合物的形式(即两种或多种选自通式IIIa、IIIb、IIIc和IIId化合物的立体异构体的混合物)。在这种情况下，获得通式II化合物的立体异构体的混合物，保持起始通式III的立体异构体的立体化学。可按照常规的方法，如硅胶色谱法或重结晶，将通式II的立体异构体的混合物分离成其相应的基本纯的立体异构体。

在一实施方案中，将通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa化合物反应以得到通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中R₅是负电荷以及Y是通式VIIa的含N有机基团[选项(A)]。

在这种情况下，在一实施方案中，含氮的亲核试剂VIIIa是通式IX的吡啶

其中，

n是0、1、2、3、4或5；以及

R₆选自取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂环基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的芳氧基、卤素、取代的或未取代的羧酸酯、取代的或未取代的氨基和/或所述吡啶形成一个或多个取代的或未取代的稠合环。

此外，根据一具体实施方案，所述通式IX的吡啶选自吡啶和下列化合物之一

根据另一具体实施方案，含氮的亲核试剂VIIIa是下式化合物：

通常，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa化合物的反应在加热下进行。实际上，本领域技术人员已知，诸如通式III化合物向通式II化合物转化的反应，即氮丙啶环在亲核试剂存在下的开环反应，通常需要加热。若需要，能够使用微波。在一具体实施方案中，通过对反应混合物进行微波照射而实现加热，这易于允许达到期望的温度并将该温度保持期望的时间。根据一实施方案，反应在催化剂存在下进行，如多孔酸催化剂蒙脱石(如实施例3.2.1、3.2.2、4.2.1、4.2.2)。

在另一实施方案中，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIb化合物反应，并且任选地与通式X化合物反应，以得到通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中R₅是R₃以及Y是通式VIIb的含N有机基团[选项(B)]。

在这种情况下，在一实施方案中，含氮的亲核试剂VIIIb是选自下列化合物的化合物：

在选项(B)中实际上有两种可能的条件，这取决于攻击氮丙啶环的活性物种。一方面，可以通过使通式VIIIb化合物与强碱(即丁基锂等)接触以产生所述通式VIIIb化合物的阴离子。一旦形成通式VIIIb化合物的阴离子，即可加入通式III化合物并且使氮丙啶环被通式VIIIb化合物的阴离子攻击。还可通过加入通式X化合物使反应继续进行，例如加入诸如碘甲烷的烷基化化合物(R₃＝烷基)等。形成通式VIIIb化合物的阴离子所需的条件是本领域技术人员已知的。某些所述物质甚至是可商购的。或者，可以在加入通式X化合物之前使反应淬灭，在这种情况下得到的通式II化合物中R₃会是氢。另一方面，可以直接使用通式VIIIb化合物。这些条件通常需要加热或微波并得到通式II化合物，其中R₃是氢。

在另一实施方案中，将通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa化合物和通式X化合物反应，以得到通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中R₅是R₃以及Y是通式VIIc的含N有机基团[选项(C)]。通式VIIIa和X化合物如前文所定义。

本领域技术人员已知，诸如通式III化合物向通式II化合物转化的反应，即氮丙啶环在亲核试剂存在下的开环反应，通常需要加热。若需要，能够使用微波。

通式II化合物具有两个手性中心；因此，其能够是基本纯的立体异构体中任何一个或其混合物的形式。在一具体实施方案中，通式II化合物选自下列化合物：

a)基本纯的通式IIa化合物，

其中R₁、R₂、R₄、R₅和Y如前文所定义；

b)基本纯的通式IIb化合物，

其中R₁、R₂、R₄、R₅和Y如前文所定义；

c)基本纯的通式IIc化合物，

其中R₁、R₂、R₄、R₅和Y如前文所定义；

d)基本纯的通式IId化合物，

其中R₁、R₂、R₄、R₅和Y如前文所定义；以及

e)上述通式IIa、IIb、IIc和/或IId化合物的任意混合物(以等摩尔比或非等摩尔比)。

优选的通式II化合物，包括其基本纯的立体异构体，描述于下文的相应标题之下。

得到的通式II化合物可被分离或直接用于下一步骤而不经进一步纯化。

当得到通式II化合物的立体异构体的混合物时，可以通过本领域技术人员已知的常规方法分离期望的立体异构体。

因此，根据本发明，通过纯化得到的通式III化合物的立体异构体的混合物，随后使分离的立体异构体与相应的试剂反应，或者，通过纯化所述通式III化合物与通式VIIIa或VIIIb的亲核试剂和X(若需要)反应得到的混合物，可获得具有期望的立体化学的通式I的焦谷氨酸衍生物的基本纯的立体异构体或其混合物的直接前体通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物。

因此，根据本发明方法的步骤c)，通过使通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与含有通式HX的酸的酸介质接触而将所述通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物转化为通式I的焦谷氨酸衍生物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中X如上文所定义。

本领域技术人员已知适于与通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物反应的通式HX的有机或无机酸。在一具体实施方案中，所述酸HX是无机酸，如HCl、HBr等。根据一优选的实施方案，HX是HBr。

根据通式I和II化合物的性质，反应需要1或2当量的HX。技术人员已知形成盐所必需的条件。根据本发明的一实施方案，使通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与过量的通式HX的酸接触，其中X如上文所定义。根据另一实施方案，将通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物溶于HBr水溶液并加热。

根据上文，可以从通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物以分步的次序获得通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物。然而，也可以从通式III化合物按照一锅法获得通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物。因此，本发明的另一方面为合成通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物的一锅法，其包括使通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa或VIIIb的含氮亲核试剂反应；并且随后使上一步得到的化合物与通式HX的酸反应。

通式I化合物具有两个手性中心；因此，其能够是其任意基本纯的立体异构体的形式或其混合物的形式。包括其基本纯的立体异构体在内的优选的通式I化合物描述于下文相应的标题之下。

通式I化合物

通式I化合物具有两个手性中心；因此，其能够是其任意基本纯的立体异构体的形式或其混合物的形式。在一具体实施方案中，通式I化合物选自下列化合物：

a)基本纯的立体异构体通式Ia化合物

其中R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所定义；

b)基本纯的立体异构体通式Ib化合物，

其中R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所定义；

c)基本纯的立体异构体通式Ic化合物

其中R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所定义；

d)基本纯的立体异构体通式Id化合物

其中R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所定义；以及

e)等摩尔比或非等摩尔比的上述通式Ia、Ib、Ic和/或Id的基本纯的化合物的任意混合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：

(i)1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐，或者

(ii)1-(1-乙酰基-3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐。

尽管某些通式I化合物，即(i)1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐和(ii)1-(1-乙酰基-3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐，已被描述为其四种可能的立体异构体的混合物，但迄今还未实现其基本纯的立体异构体的合成。

在一具体实施方案中，在通式I化合物中，R₁是-OH或-ORa，其中Ra如前文所定义，优选-OH。

在另一具体实施方案中，在通式I化合物中，R₂是氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺，优选为氢。

在另一具体实施方案中，在通式I化合物中，R₃或R₄独立地为氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺，优选二者同时为氢。

在另一具体实施方案中，在通式I化合物中，X是药物可接受的阴离子，优选溴化物或氯化物。

在另一具体实施方案中，在通式I化合物中，R₁是OH或ORa，优选OH；R₂是氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺，优选为氢；R₃或R₄独立地为氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺，优选二者同时为氢；和/或X是药物可接受的阴离子，优选溴化物或氯化物。

在另一具体实施方案中，在通式I化合物中，Y是选自下列基团的有机基团

根据一实施方案，通式I化合物是基本纯的通式I’a化合物

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义。

根据本发明的一实施方案，所述通式I化合物是基本纯的通式I’b化合物

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义。

根据本发明一具体实施方案，所述通式I化合物是基本纯的通式I’c化合物，

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义。

根据本发明一具体实施方案，所述通式I化合物是基本纯的通式I’d化合物

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义。

根据本发明一实施方案，提供了含有等摩尔比或非等摩尔比的通式I’a、I’b、I’c和/或I’d化合物中两种或多种的混合物；如含有通式I’a和I’b化合物的混合物，或含有通式I’a和I’c化合物的混合物，或含有通式I’a和I’d化合物的混合物，或含有通式I’b和I’c化合物的混合物，或含有通式I’b和I’d化合物的混合物，或含有通式I’c和I’d化合物的混合物，或含有通式I’a、I’b和I’c化合物的混合物，或含有通式I’a、I’b和I’d化合物的混合物，或含有通式I’b、I’c和/或I’d化合物的混合物，含有通式I’a、I’b、I’c和I’d化合物的混合物。

根据本发明一具体实施方案，通式I化合物选自下列化合物：

3S，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐；

3R，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐；

3R，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐；以及

3S，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐。

本发明还提供含有所述通式Ia、Ib、Ic和/或Id化合物的等摩尔比或非等摩尔比混合物的组合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体

(i)1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐，或

通式II化合物

尽管某些通式II化合物，即1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓、1-(1-乙酰基-3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓、1-(1-乙酰基-3-乙酰基氨基-5-羧基-2-氧代-吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓或1-(1-乙酰基-3-乙酰基氨基-5-羧基-2-氧代-吡咯烷-3-基甲基)吡啶鎓盐酸盐，已被描述为其所有四种可能的立体异构体的混合物，但迄今未实现其基本纯的立体异构体的合成。

因此，另一方面，本发明涉及基本纯的通式II化合物或其混合物。

在具体实施方案中，本发明涉及基本纯的通式IIa、IIb、IIc和IId化合物。

在具体实施方案中，本发明涉及上述通式IIa、IIb、IIc和/或IId化合物以任何摩尔比的混合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：

1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓；

1-(1-乙酰基-3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓；

1-(1-乙酰基-3-乙酰基氨基-5-羧基-2-氧代-吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓；或

1-(1-乙酰基-3-乙酰基氨基-5-羧基-2-氧代-吡咯烷-3-基甲基)吡啶鎓盐酸盐。

在另一具体实施方案中，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₁是-ORa，优选其中Ra是烷基基团。

在另一具体实施方案中，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₂是-(O＝)C-O-Ra，优选BOC基团。

在另一具体实施方案中，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₄是-(O＝)S(＝O)-Ra，优选甲苯磺酰基。

在另一具体实施方案中，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₁是-ORa，优选其中Ra是烷基基团；R₂是-(O＝)C-O-Ra，优选BOC基团；以及R₄是-(O＝)S(＝O)-Ra，优选甲苯磺酰基。

根据本发明的另一实施方案，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₂、R₄和R₅独立地为氢。

根据本发明的另一实施方案，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₁是-OH。

根据本发明的另一实施方案，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₅是负电荷。

本发明还涉及含有选自上述通式IIa、IIb、IIc、IId化合物及其任意摩尔比混合物的组合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：

1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓；

如上文所述，通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物能够通过这样的方法获得，该方法包括使通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物

-与通式VIIIa化合物反应，或者

-与通式VIIIa化合物和通式X化合物反应。

所述方法构成本发明的另一方面并且可以合成通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物。

通式III化合物

另一方面，本发明涉及通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物。所述通式III化合物具有两个手性中心；因此，其能够是任意的基本纯的立体异构体形式或其混合物形式。

在具体实施方案中，通式III化合物选自通式IIIa、IIIb、IIIc、IIId化合物及其任何混合物。

在另一具体实施方案中，本发明涉及含有通式IIIa、IIIb、IIIc和IIId化合物的两种或多种的混合物。所述混合物的示例性、非限制性实例包括这些化合物中两种的混合物(如IIIa和IIIb的混合物，IIIa和IIIc的混合物，IIIa和IIId的混合物，IIIb和IIIc的混合物，IIIb和IIId的混合物或IIIc和IIId的混合物)，或者所述化合物中三种的混合物(如IIIa、IIIb和IIIc的混合物，IIIa、IIIb和IIId的混合物或IIIb、IIIc和IIId的混合物)，或者所述四种化合物的混合物(如IIIa、IIIb、IIIc和IIId的混合物)。每一具体化合物(IIIa至IIId)可在所述混合物中以任意比例或比率存在，如以等摩尔比例或比率，或者以不同的比例或比率，其中一种或多种所述化合物相对于其它化合物是过量的。

在另一具体实施方案中，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₁是-ORa，优选其中Ra是烷基基团。

在另一具体实施方案中，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₂是-(O＝)C-O-Ra，优选BOC基团。

在另一具体实施方案中，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₄是-(O＝)S(＝O)-Ra，优选甲苯磺酰基。

根据另一具体实施方案，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₁是-ORa，优选其中Ra是烷基基团；R₂是-(O＝)C-O-Ra，优选BOC基团；以及R₄是-(O＝)S(＝O)-Ra，优选甲苯磺酰基。

根据另一具体实施方案，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物是这样的化合物，其中R₂、R₄和R₅独立地为氢。

如上文所述，通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物能够通过这样的方法获得，该方法包括使对映纯形式或对映体的混合物形式的通式IV化合物与通式V化合物反应。所述方法构成本发明的另一方面。通过所述方法，还可以获得通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物。

通式I化合物的用途和药物组合物

通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物可被用作用于治疗和/或预防个体中某些疾病状态的药物的活性成分，所述疾病状态如肿瘤、免疫缺陷、感染等。

易于被通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物治疗的疾病状态的示例性、非限制性实例包括：

A)癌或肿瘤相关的疾病状态：实际上包括所有的癌和肿瘤类型，包括急性淋巴细胞白血病、成人急性淋巴细胞白血病、儿童急性髓性白血病、成人急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关的癌、肛门癌、星形细胞瘤、儿童小脑星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚叶瘤、视路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、Mate支气管腺瘤/类癌、儿童伯基特淋巴瘤、类癌肿瘤、原发部位不明的胃肠癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性骨髓增生异常、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食道癌、儿童尤因肿瘤家族、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤眼癌、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃(Stomach)癌、胃肠类癌肿瘤、生殖细胞瘤、卵巢妊娠滋养细胞肿瘤胶质瘤、成人胶质瘤、脑干胶质瘤、大脑星形细胞瘤胶质瘤、毛细胞白血病、头颈部癌、肝细胞(肝)癌、成人(原发性)肝细胞(肝)癌、儿童(原发性)霍奇金淋巴瘤、成人霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、岛细胞癌(内分泌胰腺)、Kaposi肉瘤、肾(肾脏细胞)癌、肾癌、喉癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞、唇和口腔癌、儿童(原发性)肺癌、非小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、AIDS相关的淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞、霍奇金成人淋巴瘤、霍奇金儿童淋巴瘤、非霍奇金成人淋巴瘤、非霍奇金儿童淋巴瘤、原发性中枢神经系统、巨球蛋白血症、Waldenstróm骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)Merkel细胞癌、间皮瘤、成人恶性间皮瘤、具有隐匿性原发性的儿童颈部转移性鳞癌、多发性内分泌腺瘤综合征、儿童多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤蕈样肉芽肿骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、成人急性骨髓性白血病、儿童急性骨髓瘤、多发性骨髓增殖性疾病、慢性鼻腔和鼻窦癌鼻咽癌、鼻咽癌、儿童神经母细胞瘤、口腔癌、儿童口腔癌、唇和口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、儿童卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性度肿瘤、胰腺癌胰腺癌、儿童胰腺癌、岛细胞鼻窦和鼻腔癌、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童垂体肿瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾细胞(肾)癌、儿童肾骨盆和输尿管、移行细胞癌视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童唾液腺癌、唾液腺癌、儿童肉瘤、尤因肿瘤家族、肉瘤、Kaposi肉瘤、软组织、成人肉瘤、软组织、儿童肉瘤、子宫Sezary综合征、皮肤癌(非黑色素瘤)、儿童皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌、Merkel细胞小细胞肺癌、小肠癌软组织肉瘤、成人软组织肉瘤、儿童鳞状细胞癌、具有隐匿性原发性的鳞状颈部癌、转移性胃(Gastric)癌、儿童幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、儿童胸腺瘤和胸腺癌甲状腺癌、甲状腺癌、儿童肾骨盆和输尿管滋养细胞肿瘤的移行细胞癌、原发部位不明的妊娠、移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌、视路和下丘脑胶质瘤、儿童外阴癌、Waldenstróm巨球蛋白血症、Wilms瘤等等；

B)感染：实际上包括所有类型的感染，如细菌、真菌和病毒起源的感染；或者

C)自身免疫疾病：实际上包括“美国自身免疫相关疾病协会”的网站[http://www.aarda.org]中提到的所有自身免疫疾病，包括多发性硬化症(MS)、克罗恩病、类风湿性关节炎、I型糖尿病、银屑病、狼疮、溃疡性大肠炎、白癜风、乳糜泻、脉管炎、皮肌炎、多肌炎、甲状腺炎(桥本、Graves)、重症肌无力、格林-巴利综合征、葡萄膜炎、扁平苔藓(flat lichen)、颞动脉炎、结节病、干燥综合征(

)、支气管哮喘、天疱疮、强直性脊柱炎、硬皮病、纤维肌痛、风湿热等等。

因此，根据另一方面，本发明涉及药物组合物，下文称为本发明的药物组合物，其包括通式I化合物、其基本纯的立体异构体Ia、Ib、Ic或Id，或者其等摩尔比或非等摩尔比的混合物，以及药物可接受的载体，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：(i)1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐，或(ii)1-(1-乙酰基-3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐。

在具体实施方案中，本发明的药物组合物包括治疗有效量的作为活性成分的通式I化合物的至少一种基本纯的立体异构体，即Ia、Ib、Ic或Id，或者其等摩尔比或非等摩尔比的混合物，其中所述混合物不同时含有上述化合物(i)或(ii)的所有四种立体异构体。在该描述所用的意义中，措辞“治疗有效量”指活性成分的量，其被计算以产生期望的效果并通常可根据所用活性成分的自身特征和要获得的治疗效果等因素而确定。在具体实施方案中，向需要治疗的个体给予活性成分以治疗和/或预防上述疾病状态的剂量为10^-10指10¹⁰mg/kg体重，优选10^-3至10³mg/kg体重。

术语“载体”指与活性成分一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体能够是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、蔬菜或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。水或盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液被优选用作载体，尤其是用于可注射溶液。适当的药物载体描述于E.W.Martin的“雷明顿制药学”中。此外，术语“药物可接受的”指这样的分子部分和组分，其是生理学耐受的并且在向人给药时通常不会产生变应性或类似的不良反应，如嘈杂、眩晕等等。优选地，本文所用的术语“药物可接受的”意为被联邦或州政府的管理机关批准或列于美国药典或其它公认的药典中用于动物、并且尤其用于人。

为了向需要治疗的个体给药，所述个体例如哺乳动物，如人，可将本发明的药物组合物经由任何适当的途径给药，例如口服(如口服、舌下等)、肠胃外(如皮下、肌内、静脉内、肌内等)、阴道、直肠、鼻、局部、眼等等。

通过将活性成分与适当的药物可接受的载体混合而获得的本发明的药物组合物可以以多种给药药物形式给予，如固体、液体等等。本发明的药物组合物的所述给药的药物形式的示例性、非限制性实例包括口服滴剂(溶液、混悬液、乳液等)；口服制剂(液体、溶液、混悬液、乳液、凝胶、糊、粉末等)；口服冻干剂；口服胶质；用于口服溶液或混悬液的粉末；颗粒剂；肠溶颗粒剂；缓释颗粒剂；控释颗粒剂；用于口服混悬液的颗粒剂；用于口服溶液或混悬剂的粉末和溶剂；糖浆剂；用于糖浆剂的粉末；用于糖浆剂的颗粒；片剂(如可溶性片剂、可分散片剂、包衣片、薄膜包衣片、泡腾片、口分散片、肠溶片、缓释片剂、控释片剂、含片、咀嚼片等)；凉茶；速溶凉茶；泡腾粉末或颗粒；袋剂；胶囊(如硬、软、肠溶硬或软胶囊、缓释硬或软胶囊、控释硬或软胶囊等)；小丸药；持续释放瘤胃装置；脉冲释放瘤胃装置；舔块；用于加药饲料的预混合料；小丸剂；含漱剂；用于含漱剂的浓缩物；含漱剂(用于溶液的粉末或片剂)；口腔粘膜溶液、混悬剂、滴剂、喷雾剂、凝胶、糊、胶囊等；舌下喷雾剂、片剂等；漱口水；齿龈溶液、凝胶、糊等；锭剂；压缩的锭剂；软锭剂；牙科用凝胶、棒、插入物、粉末、溶液、混悬剂、乳液等；牙膏；乳膏；凝胶；油膏；皮肤糊、泡沫、喷雾剂、溶液、混悬剂、粉末、液体、溶液、用于皮肤溶液的浓缩物、混悬剂、乳液、棒、锭剂等；膏；香波；用于离子电渗疗法的溶液；透皮贴剂；泥罨剂；浸渍溶液、混悬剂、乳液、用于浸渍溶液、混悬剂、乳液的浓缩物；浇泼溶液、混悬剂或乳液；准确(spot-on)溶液；准确混悬液；准确乳液；乳头浸渍(teat dip)溶液；乳头浸渍混悬液；乳头浸渍乳液；乳头喷雾溶液；眼霜；眼用凝胶；眼膏；滴眼液(溶液、混悬液、用于溶液的粉末和溶剂、用于混悬液的粉末和溶剂、用于重构的溶剂、洗剂、用于重构洗剂的溶剂等)；眼科插入物；耳霜；耳用凝胶；耳膏；耳滴剂(溶液、混悬剂、乳液、粉末等)；耳喷雾剂(溶液、混悬剂等)；洗耳液(溶液、乳液等)；耳塞；耳棒；鼻霜；鼻用凝胶；鼻膏；滴鼻液(溶液、混悬剂、乳液等)；鼻用粉末；鼻用喷雾剂(溶液、混悬剂、乳液等)；洗鼻液；鼻棒；阴道乳膏；阴道凝胶；阴道软膏；阴道泡沫；阴道溶液；阴道混悬剂；阴道乳液；用于阴道溶液的片剂；阴道硬或软胶囊；阴道片剂；泡腾阴道片剂；阴道给药系统；直肠乳膏；直肠凝胶；直肠软膏；直肠泡沫；直肠溶液；直肠混悬剂；直肠乳液；用于直肠溶液的浓缩物；用于直肠溶液的粉末；用于直肠混悬剂的粉末；用于直肠混悬剂的片剂；栓剂；直肠胶囊；直肠填塞喷雾器溶液；喷雾器混悬剂；用于喷雾器混悬剂的粉末；用于喷雾器溶液的粉末；喷雾器乳液；加压吸入剂(溶液、混悬剂、乳液等)；吸入剂粉末；吸入剂粉末(硬胶囊)；预分散的吸入剂粉末；吸入蒸汽(粉末、胶囊、溶液、片剂、软膏、液体等)；吸入气体；用于注射的凝胶；用于注射的溶液；用于注射的混悬剂；用于注射的乳液；用于注射的溶液的粉末；用于注射的混悬剂的粉末；用于注射的溶液的粉末和溶剂；用于注射的混悬剂的粉末和溶剂；用于注射的溶液的浓缩物；用于输注的溶液；用于输注的乳液；用于输注的溶液的粉末；用于输注的溶液的浓缩物；用于输注的溶液的粉末和溶剂；植入片剂；用于腹膜透析的溶液；用于血液滤过的溶液；用于血液透析滤过的溶液；用于血液透析的溶液；用于血液透析溶液的浓缩物；用于膀胱内用途的溶液；膀胱灌注；粉末膀胱灌注；尿道凝胶剂；尿道棒；气管肺内输注(溶液)；气管肺内输注(用于溶液的粉末)；气管肺内输注(混悬液)；气管肺内输注(用于溶液的粉末和溶剂)；宫颈凝胶剂；用于宫颈凝胶剂的粉末和溶剂；乳房内溶液；乳房内混悬剂；乳房内乳液；乳房内软膏；乳头棒；子宫内给药系统；等等。

制备本发明的药物组合物的期望的给药药物形式所必需的载体和辅助物质取决于所选的给药药物形式等因素。可按照本领域技术人员已知的常规方法制备药物组合物的所述给药药物形式。不同的活性成分给药方法、所用的赋形剂以及其制备方法的综述见于“Tratado deFarmacia Galénica”，C.Faulíi Trillo，Luzán 5，S.A.de Ediciones，1993。

另一方面，本发明涉及通式I化合物的基本纯的立体异构体，即Ia、Ib、Ic或Id，或者其等摩尔比或非等摩尔比的混合物，在制备用于增强个体中免疫应答的药物组合物中的用途，或者在制备抗肿瘤药物组合物中的用途，或者在制备用于治疗细菌、真菌或病毒来源的感染的药物组合物中的用途，或者在制备用于治疗自体免疫疾病的药物组合物中的用途，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：(i)1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐，或(ii)1-(1-乙酰基-3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)氯化吡啶鎓盐酸盐。

根据优选实施方案，本发明涉及在制备用于治疗和/或预防癌的药物组合物中的所述用途。

根据其它优选实施方案，本发明涉及在制备用于治疗和/或预防选自结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肥大细胞瘤、肺癌及肾癌的疾病或疾病状态的药物组合物中的所述用途。

根据优选实施方案，本发明涉及在制备用于治疗和/或预防AIDS和相关疾病的药物组合物中的所述用途。

易于被本发明所提供的药物组合物治疗的疾病状态的示例性、非限制性实例包括前文所述的那些。

下列实施例能够用于阐述本发明，并且不能被认为是对其范围的限制。

实施例

一般操作。所有的熔点均在毛细管中测量，并且未校正。IR光谱在KBr片上使用Nicolet Impact 410光谱仪测定。¹H NMR光谱于300至500MHz下在VARIAN UNITY和UNITYPLUS仪器上获得。化学位移(δ)使用TMS作为内标而测定，并且对于每一信号标明了多重性(s，单峰；d，二重峰；dd，双二重峰；t，三峰；q，四重峰；m，多重峰)。HPLC-MS分析在Agilent 1100仪器上进行。使用色谱柱LunaC18(150×4.6mm)5μm Phenomenex，流动相由4％甲酸水溶液(A)、水(B)和乙腈(C)的三重梯度形成。梯度开始于A(2.5％)、B(93％)和C(4.5％)并且在30分钟内达到A(2.5％)、B(4.5％)和C(93％)。在质量检测器中，碎裂器在70eV下工作。元素分析在LECO CHNS-932仪器上进行。所有的收率对应于分离的纯化合物。

实施例1涉及本发明方法的起始原料(通式IV化合物)(2R-4-亚甲基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯)的合成。

实施例2涉及本发明方法的起始原料通式V化合物的合成。

实施例3和4涉及使用一锅法合成(3R，5R)、(3S，5S)、(3R，5S)和(3S，5R)-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐，其为通式I化合物。

实施例5涉及按照分布合成进行的3S，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐的一锅合成。

实施例6分析了通式I化合物的不同异构体对肿瘤生长的影响(所测定的肿瘤：RENCA)。

实施例1

通式IV化合物的合成：(R)-5(2R-4-亚甲基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸 1-叔丁酯2-乙酯)

标题化合物的合成如方案1所示。

1.1 化合物2的合成：2S-5-氧代吡咯烷-2-羧酸乙酯

在10L反应器中加入D-谷氨酸1(1kg，6.80mol)的无水乙醇(5.0L)溶液，冷却至-10℃并且通过滴液漏斗，在2h内缓慢加入亚硫酰氯(2.0kg，14.9mol)。加入完毕后，将混合物在室温下搅拌1h然后加热至80℃再保持1小时。将得到的溶液浓缩至干(注意：产生HCl和SO₂蒸汽)。将残余物用乙醇(2.5L)稀释并通过加入氢氧化钾的乙醇溶液(10％wt，约2.0L)而中和至pH＝7。通过过滤除去形成的固体并将溶液浓缩以得到1的二乙基酯，其为蜡状固体。

将残余物真空蒸馏(90℃，3.1mbar)2h并将剩余物在5.2mbar下进一步加热至150℃，保持2h。残余物在室温下固化。从MTBE/己烷(2:1)中重结晶得到期望的产物2，其为棕色固体(960g，90％)。m.p.49-51℃。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：6.82(bs，1H)；4.29-4.23(m，1H)；4.21(q，2H，J＝7.3Hz)；2.48-2.17(m，4H)；1.28(t，3H，J＝7.3Hz)ppm。

1.2 3的合成：2R-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯

搅拌下向反应器中的焦谷氨酸乙酯2(900g，5.73mol)的二氯甲烷(8.0L)溶液中加入二叔丁基二碳酸酯(2.5kg，11.5mol)、三乙胺(800mL，5.73mol)和DMAP(700g，5.73mol)，并将反应搅拌2h。将红棕色溶液浓缩至干，溶解于乙酸乙酯(10.0L)并用3N HCl水溶液洗涤(4×2.5L)。将合并的有机层用水(6×2.5L)和盐水(1.0L)洗涤，并用硫酸钠干燥。将反应混合物浓缩至干，在冰中冷却并用MTBE和己烷(1:1)研制以得到棕色固体(390g)。浓缩母液得到油状物(600g)，其经色谱分离(SiO₂，己烷/乙酸乙酯3:1)后得到无色固体3(386g)。总收率(776g，54％)。m.p.48-49℃。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：4.57(dd，1H，J＝9.5Hz，J＝3.3Hz)；4.20(q，2H，J＝7.3Hz)；2.72-1.77(m，4H)；1.46(s，9H)；1.26(t，3H，J＝7.3Hz)ppm。

1.3 4的合成：顺-和反-2R-4-二甲基氨基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1- 叔丁酯2-乙酯的混合物

在-78℃下向搅拌的LiHMDS的THF溶液(1M，0.24L，0.24mol)中缓慢加入3(30g，0.12mol)的干燥THF(1.0L)溶液。在-78℃下搅拌40min后，加入Eschenmoser盐(45.5g，0.24mol)，并继续搅拌20min。允许反应混合物升温至室温并再搅拌16小时。将混合物浓缩并将残余物在乙酸乙酯(300mL)和水(300mL)之间分配。将水层用乙酸乙酯再次萃取(2×300mL)。将合并的有机萃取液用1M HCl水溶液洗涤(3×150mL)。将酸层立即用碳酸氢钠中和并用乙酸乙酯萃取(3×300mL)。将有机层用水(300mL)、盐水(50mL)洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩至干以得到期望的产物4，其为淡棕色油状物(26.9g，72％)，将其直接用于下一步骤。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：4.62(dd，1H，J＝9.4Hz，J＝3.3Hz)；4.21(q，2H，J＝7.3Hz)；4.18-4.07(m，1H)；2.57-2.20(m，3H)；2.22(s，3H)；2.17(s，3H)；1.47(s，9H)；1.24(t，3H，J＝7.3Hz)ppm。

1.4 (R)-5的合成：2R-4-亚甲基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2- 乙酯

向高压釜(4L)中加入4(244.9g，0.74mol)的MeOH(2.5L)溶液和碘甲烷(138.2mL，2.22mol)。将反应混合物在室温下搅拌48h。除去溶剂并将残余物在乙酸乙酯(2L)和NaHCO₃10％(1L)之间分配。将水相再次用乙酸乙酯萃取(3×500mL)。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。将残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯4:1至乙酸乙酯)以获得(R)-5，其为无色油状物(55.1g，27％)。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：6.23(t，1H，J＝2.7Hz)；5.51(t，1H，J＝2.2Hz)；4.61(dd，1H，J＝10.3Hz，J＝3.3Hz)；4.22(q，2H，J＝7.1Hz)；3.17-3.05(m，1H)；2.75-2.64(m，1H)；1.47(s，9H)；1.23(t，3H，J＝7.1Hz)ppm.

实施例2

标题化合物的合成如下文的方案4所示并且包括说明书所公开的用于合成式5化合物的三种变化。

方案4

2.1 (2R)-焦谷氨酸(2’)的合成：

Lennox，J.R.；Turner，S.C.；Rapoport，H.J.Org.Chem.2001，66，7078-7083中所述的方法。

将D-谷氨酸(1)(100g，679.7mmol)的水(400mL)溶液加热至回流，同时搅拌72小时。将得到的澄清溶液经过Dowex 50w X8树脂柱(酸性形式的离子交换树脂，135g)并用水洗涤直至洗脱液不再呈酸性。将合并的水性洗脱液在50℃下浓缩至收集到300mL蒸馏物。加入甲醇(500mL)以帮助除去剩余的水并且避免固体结块。将得到的固体真空干燥以得到化合物2’，其为白色固体(74.63g，85％)。

m.p.157℃，[α]_D ²²+10.5°(c2.0，H₂O)。

2.2 (2R)-焦谷氨酸乙酯(2)的合成：

在搅拌下向(2R)-焦谷氨酸2’(1当量，2.017g，15.62mmol)在EtOH(2mL/mmol，8mL)中的悬浮液中加入SOCl₂(0.1当量，115μL，1.56mmol)。将得到的溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物用1MHCO₃Na中和。将溶剂真空浓缩并将残余物用AcOEt萃取(3×25mL)。将有机相用无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。得到化合物2，为无色油状物，将其直接用于下一步骤而不经进一步纯化(79％)。

2.3 (2R)-N-(叔丁氧基羰基)焦谷氨酸乙酯(3)的合成：

在搅拌下向冷的(5-10℃)酯2(当量，78.6g，0.50mol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.1当量，6.10g，50mmol)的MeCN(0.3mL/mmol，180mL)溶液中分批加入叔丁基二碳酸酯(Boc)₂O(1.2当量，131g，0.60mol)(30分钟)。将得到的红色溶液在室温下搅拌3小时。然后将混合物真空浓缩并将残余物通过快速色谱纯化(EtOAc:CH₂Cl₂，1:4)以得到3，为黄色固体(95％)。m.p.48-49℃。

2.4 烯胺酮(4’)的合成：

Dieterich，P.；Young，D.W.Org.Biomol.Chem.2006，4，1492-1496中描述的方法。

向焦谷氨酸酯3(1当量，83.1g，0.32mol)的1，2-二甲氧基乙烷(2.3mL/mmol，736mL)溶液中加入tBuOCH(NMe₂)₂(Bredereck试剂，1.5当量，100mL，0.48mol)，并将得到的混合物在85℃下加热15小时。将反应混合物冷却至室温并真空蒸馏。将得到的粗油状物用最少量的MTBE研制，并过滤得到的固体。得到化合物4’，其为橙色固体(59.48g，59％)。将母液再次真空浓缩，并且随后的重结晶将总收率增加至84％(84.26g)。

2.5 烯烃(5)的合成：

WO 2004039314中描述的方法。

向4’(59.48g，0.19mol)的THF(1.56mL/mmol，300mL)溶液中，加入1M HCl水溶液(1.1当量，210mL)。将混合物在室温下搅拌2小时。分离水层和有机层，弃去水层并向有机层中加入K₂CO₃(1.4当量，37g，0.27mol)和HCHO水溶液(37％)(1mL/mmol，190mL)。将得到的混合物在室温下搅拌45分钟。分离两相并收集有机层，真空浓缩。将得到的粗产物溶于(MTBE)甲基叔丁基醚(400mL)，用水(200mL)、Na₂SO₃(20％水溶液，200mL)和水(200mL)洗涤。将有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空蒸发。在通过短快速色谱纯化后获得化合物5，其为无色油状物(20.8g，40％)。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：6.23(t，1H，J＝2.7Hz)；5.51(t，1H，J＝2.2Hz)；4.61(dd，1H，J＝10.3Hz，J＝3.3Hz)；4.22(q，2H，J＝7.1Hz)；3.17-3.05(m，1H)；2.75-2.64(m，1H)；1.47(s，9H)；1.23(t，3H，J＝7.1Hz)ppm。

实施例3

3.1 通式V化合物的合成：N-甲苯磺酰基亚氨基benzyliodinane

标题化合物的合成如方案5所示。

方案5

在冰浴下将p-甲苯磺酰胺(5.13g)、氢氧化钾(4.20g)和甲醇(120mL)在锥形瓶中搅拌，保证反应混合物低于10℃。向搅拌的混合物中加入碘苯二乙酸酯(9.60g)并将得到的黄色溶液在室温下搅拌3.5小时。将反应混合物倾至大大过量的冰水中并搅拌1小时。放置过夜后沉淀出黄色固体。通过布氏漏斗过滤分离黄色固体并用空气流干燥。使用数份产物不溶于其中的醚洗去存在的碘苯。将黄色固体溶于尽可能少量的沸腾甲醇中，将溶液置于冷冻机中过夜，从而经由过滤回收米白色固体(5.1g，46％)。

3.2 通式V化合物的合成：N-甲苯磺酰基亚氨基benzyliodinane

将KOH(2.5当量，393g，7.00mol)加入到p-甲苯磺酰胺(1当量，480g，2.80mol)的MeOH(11L)溶液中，并将混合物在室温下搅拌至全部溶解。将混合物冷却至0℃并加入碘苯二乙酯(1当量，903g，2.80mol)并在0℃下搅拌40分钟。将反应缓慢升温至22℃并搅拌过夜。将形成的固体过滤，用Et₂O洗涤(250mL)并在室温下真空干燥(285g)。当将母液冷却至0℃并缓慢加入H₂O/冰(5L)混合物时获得额外的部分。将得到的混合物在5℃下储存过夜。随后，将沉淀过滤，用Et₂O洗涤(250mL)并在室温下真空干燥(479g，合并收率73％)。

实施例4

(3R，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐)9c和(3S，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐)9d的合成

标题化合物(9c和9d)的合成如方案6所示。

方案6

4.1.1 3R，6R-4-氧代-1-(4-甲苯磺酰基)-1，5-二氮杂螺[2，4]庚烷-5，6-二羧酸5-叔丁酯6-乙酯7c和3S，6R-4-氧代-1-(4-甲苯磺酰基)-1，5-二氮杂螺 [2，4]庚烷-5，6-二羧酸5-叔丁酯6-乙酯7d的合成

向冷的(0℃，冰水浴)(R)-5(3.02g，11.21mmol)的干燥乙腈(12mL)溶液中一次加入PhI＝NTs(参见实施例2)(6.27g，16.8mmol)，随后加入Cu(acac)₂(293mg，1.12mmol)。将得到的多相混合物在0℃下搅拌15分钟，并允许其升温至室温并搅拌过夜。向得到的混合物中加入1M NaOH(50mL)，并将混合物用EtOAc萃取(3×25mL)。将有机层用盐水(25mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并蒸发至干。将粗油状物通过快速色谱(SiO₂，己烷/EtOAc：2/1)纯化以得到氮丙啶7c(730mg)和7d(287mg)，其为白色固体(合并收率：23％)。

7c：

M.p.：94-95℃

[α]_D ^25℃＝+42°(0.032，CHCl₃)

IR(KBr，cm^-1)：2977，2928，1808，1746，1352，1298，1251，1192，1161，988，690。

¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)(7c)：7.82(d，2H，J＝7.3Hz)；7.31(d，2H，J＝7.7Hz)；4.74(dd，1H，J＝9.7Hz，J＝2.02Hz)；4.25-4.22(m，2H)；3.28(dd，1H，J＝14.4Hz，J＝9.7Hz)；2.78(s，1H)；2.57(s，1H)；2.53(dd，1H，J＝14.4Hz，J＝2.02Hz)；2.42(s，3H)；1.49(s，9H)；1.29(t，3H，J＝7.0Hz)ppm。

¹³C(CDCl₃，125MHz)(7c)：170.5，166.9，148.7，145.1，135.2，129.6，127.9，84.5，62.0，55.5，47.1，38.3，27.7，25.3，21.5，14.0ppm。

MS(ESI+)：m/z：339(M+1-Boc)

7d：

M.p.：55-56℃

[α]_D ^25℃＝+11°(0.036，CHCl₃)

IR(KBr，cm^-1)：2981，2936，1799，1749，1371，1330，1253，1203，1156，1094，989，687。

¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)(7d)：7.79(d，2H，J＝8.0Hz)；7.30(d，2H，J＝7.7Hz)；4.70(dd，1H，J＝9.4Hz，J＝4.3Hz)；4.30-4.22(m，2H)；3.06(dd，1H，J＝15.1Hz，J＝4.3Hz)；2.92(dd，1H，J＝15.4Hz，J＝9.4Hz)；2.82(s，1H)；2.63(s，1H)；2.41(s，3H)；1.49(s，9H)；1.28(t，3H，J＝7.0Hz)ppm。

¹³C(CDCl₃，125MHz)(7d)：169.5，167.1，148.9，145.0，135.7，129.6，127.9，84.5，62.1，56.1，47.0，37.1，27.8，24.5，21.6，14.0ppm。

MS(ESI+)：m/z：339(M+1-Boc)

4.1.2 以改进的操作合成3S，6R-4-氧代-1-(4-甲苯磺酰基)-1，5-二氮杂螺 [2，4]庚烷-5，6-二羧酸5-叔丁酯6-乙酯7d

向冷的(0℃，冰水浴)(R)-5(1.84g，6.82mmol)的干燥乙腈(7mL)溶液中一次加入PhI＝NTs(3.82g，10.2mmol)，然后加入Cu(acac)₂(178mg，0.682mmol)。将得到的混合物在0℃下搅拌15分钟，然后允许其升温至室温并搅拌过夜。将得到的混合物真空蒸发。将粗油状物通过快速色谱(SiO₂，CH₂Cl₂/EtOAc：9/1)纯化以得到不含p-TsNH₂杂质的氮丙啶的混合物(通过HPLC-MS测定)。将混合物再次色谱分离(SiO₂，己烷/EtOAc：2/1)直至获得顺-氮丙啶7d，其为纯白泡沫状物(8％)。

4.2.1 一锅法合成3R，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐9c

在100℃下将氮丙啶7c(200mg，0.46mmol)、蒙脱石MK10(20％重量，40mg)和吡啶(37μL，0.46mmol)的混合物在微波(300W)下照射10分钟。将粗混合物用乙酸乙酯[EtOAc](10mL)稀释，过滤并真空蒸发直至HPLC分析显示未有保留的吡啶。将甜菜碱8c用于下一步骤而不经进一步纯化(93％的HPLC纯度)。将粗的棕色油状物溶于48％HBr水溶液(20mL)并在回流下加热18小时。将混合物用水稀释并用EtOAc洗涤(3×10mL)，将水相蒸发至干。将粗的油状物通过色谱纯化，使用纤维素粉末:SiO₂:纤维素粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)作为固定相，得到9c，其为固体(51mg，28％)。M.p.：>200℃。

[α]_D ^25℃＝+40°(0.041，CH₃OH)

IR(KBr，cm^-1)：3434，3051，1725，1633，1488，1420，1384，1280，1188，1145，1083，683。

¹H-NMR(D₂O，500MHz)8.82(d，2H，J＝5.3Hz)；8.59(t，1H，J＝7.8Hz)；8.09(t，2H，J＝6.8Hz)；5.21(d，1H，J＝14.3Hz)；4.93(d，1H，J＝14.3Hz)；4.24(t，1H，J＝9.2Hz)；3.01(dd，1H，J＝13.9Hz，J＝9.3Hz)；2.11(t，1H，J＝7.8Hz)ppm。

¹³C(D₂O，125MHz)：173.2，173.1，147.1，145.6，128.6，64.4，64.2，49.3，33.0ppm。

MS(ESI+)：m/z：236(M+1-2Br)。

4.2.2 一锅法合成3S，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐9d

在100℃下将氮丙啶7d(200mg，0.46mmol)、蒙脱石MK10(20％重量，40mg)和吡啶(37μL，0.46mmol)的混合物在微波(300W)下照射10分钟。将粗混合物用EtOAc(10mL)稀释，过滤并真空蒸发直至HPLC分析显示未有保留的吡啶。将甜菜碱8d用于下一步骤而不经进一步纯化(93％的HPLC纯度)。将粗的棕色油状物溶于48％HBr水溶液(20mL)并在回流下加热18小时。将混合物用水稀释并用EtOAc洗涤(3×10mL)，将水相蒸发至干。将粗的油状物通过色谱纯化，使用纤维素粉末:SiO₂:纤维素粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)作为固定相，得到9d，其为固体(52mg，28％)。M.p.：>200℃。

[α]_D ^25℃＝+40°(0.038，CH₃OH)

IR(KBr，cm^-1)：3435，3051，1721，1631，1509，1475，1422，1384，1280，1190，1144，683。

¹H-NMR(D₂O，500MHz)8.76(d，2H，J＝5.3Hz)；8.59(t，1H，J＝7.8Hz)；8.07(t，2H，J＝6.8Hz)；5.19(d，1H，J＝14.3Hz)；4.78(d，1H，J＝14.3Hz)；4.33(t，1H，J＝9.2Hz)；2.90(dd，1H，J＝13.9Hz，J＝9.3Hz)；2.46(t，1H，J＝7.8Hz)ppm。

¹³C(D₂O，125MHz)：173.3，172.4，147.0，145.1，128.5，65.6，64.7，49.3，33.9ppm。

MS(ESI+)：m/z：236(M+1-2Br)。

4.2.3 用改进的结晶法一锅合成3S，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷 -3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐9d

将氮丙啶7d(100mg，0.23mmol)、蒙脱石MK10(20％重量，20mg)和吡啶(18μL，0.23mmol)的混合物加热至90℃，保持3小时。将粗混合物用EtOAc(3mL)稀释，过滤并真空蒸发。将残余物在Et₂O中研制，过滤或获得甜菜碱8d，为棕色固体。将该化合物溶于48％HBr水溶液(10mL)并在回流下加热18-72小时。反应通过HPLC-MS分析来监测。将粗的油用丙酮研制以得到棕色固体。将该固体溶于最少量的MeOH(1mL)并加入Et₂O或丙酮直至观察到沉淀。然后将固体过滤并真空干燥(注意：产物高度吸湿)。该过程重复两次并通过HPLC分析测定产物的纯度(收率80％)。

实施例5

(3S，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐) 9a和(3R，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐)9b的合成

标题化合物(9a和9b)的合成如方案7所示。

方案7

5.13 S，6S-4-氧代-1-(4-甲苯磺酰基)-1，5-二氮杂螺[2，4]庚烷-5，6-二羧酸 5-叔丁酯6-乙酯7a和3R，6S-4-氧代-1-(4-甲苯磺酰基)-1，5-二氮杂螺[2，4] 庚烷-5，6-二羧酸5-叔丁酯6-乙酯7b的合成

向冷的(0℃，冰水浴)(S)-5(1.84g，6.82mmol)的干燥乙腈(7mL)溶液中一次加入PhI＝NTs(参见实施例2)(3.82g，10.2mmol)，随后加入Cu(acac)₂(178mg，0.682mmol)。将得到的多相混合物在0℃下搅拌15分钟，并允许其升温至室温并搅拌过夜。向得到的混合物中加入1MNaOH(20mL)，并将混合物用EtOAc萃取(3×25mL)。将有机层用盐水(25mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并蒸发至干。将粗油状物通过快速色谱(SiO₂，己烷/EtOAc：2/1)纯化以得到氮丙啶7a(641mg)和7b(478mg)，其为白色固体(合并收率：37％)。

7a：

M.p.：95-96℃

[α]_D ^25℃＝-57°(0.029，CHCl₃)

IR(KBr，cm^-1)：2977，2928，1808，1746，1352，1298，1251，1192，1161，988,690。

¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)(7a)：7.77(d，2H，J＝7.3Hz)；7.27(d，2H，J＝7.7Hz)；4.70(dd，1H，J＝9.7Hz，J＝2.02Hz)；4.21-4.17(m，2H)；3.22(dd，1H，J＝14.4Hz，J＝9.7Hz)；2.75(s，1H)；2.51(s，1H)；2.49(dd，1H，J＝14.4Hz，J＝2.02Hz)；2.37(s，3H)；1.45(s，9H)；1.27(t，3H，J＝7.0Hz)ppm。

¹³C(CDCl₃，125MHz)(7a)：170.5，166.9，148.7，145.1，135.2，129.6，127.9，84.5，62.0，55.5，47.1，38.3，27.7，25.3，21.5，14.0ppm。

MS(ESI+)：m/z：339(M+1-Boc)

7b：

M.p.：57-58℃

[α]_D ^25℃＝-13°(0.068，CHCl₃)

IR(KBr，cm^-1)：2982，2936，1799，1749，1371，1330，1252，1203，1154，1093，989，687。

¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)(7b)：7.78(d，2H，J＝8.0Hz)；7.29(d，2H，J＝7.7Hz)；4.70(dd，1H，J＝9.4Hz，J＝4.3Hz)；4.29-4.20(m，2H)；3.04(dd，1H，J＝15.1Hz，J＝4.3Hz)；2.91(dd，1H，J＝15.4Hz，J＝9.4Hz)；2.82(s，1H)；2.63(s，1H)；2.40(s，3H)；1.48(s，9H)；1.29(t，3H，J＝7.0Hz)ppm。

¹³C(CDCl₃，125MHz)(7b)：169.5，167.1，148.9，145.0，135.7，129.6，127.9，84.5，62.1，56.1，47.0，37.1，27.8，24.5，21.6，14.0ppm。

MS(ESI+)：m/z：339(M+1-Boc)

5.2.1 一锅法合成3S，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐9a

在100℃下将氮丙啶7a(311mg，0.71mmol)、蒙脱石MK100(20％重量，60mg)和吡啶(58μL，0.71mmol)的混合物在微波(300W)下照射10分钟。将粗混合物用EtOAc(10mL)稀释，过滤并真空蒸发直至HPLC分析显示未有保留的吡啶。将甜菜碱8a用于下一步骤而不经进一步纯化(93％的HPLC纯度)。

将粗的棕色油状物溶于48％HBr水溶液(30mL)并在回流下加热18小时。将混合物用水稀释并用EtOAc洗涤(3×10mL)，将水相蒸发至干。将粗的油通过色谱纯化，使用纤维素粉末:SiO₂:纤维素粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)作为固定相，得到9a，为固体(110mg，40％)。

M.p.：>200℃

[α]_D ^25℃＝-49°(0.069，CH₃OH)

IR(KBr，cm^-1)：3433，3051，1724，1633，1488，1420，1384，1281，1188，1144，1083，683。

¹H-NMR(D₂O，500MHz)8.82(d，2H，J＝5.3Hz)；8.59(t，1H，J＝7.8Hz)；8.08(t，2H，J＝6.8Hz)；5.23(d，1H，J＝14.3Hz)；4.97(d，1H，J＝14.3Hz)；4.28(t，1H，J＝9.2Hz)；3.06(dd，1H，J＝13.9Hz，J＝9.3Hz)；2.13(t，1H，J＝7.8Hz)ppm。

¹³C(D₂O，125MHz)：173.1，172.6，147.2，145.6，128.6，63.9，63.7，49.2，32.7ppm。

MS(ESI+)：m/z：236(M+1-2Br)

5.2.2 一锅法合成3R，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐9b

在100℃下将氮丙啶7b(200mg，0.46mmol)、蒙脱石MK10(20％重量，40mg)和吡啶(37μL，0.46mmol)的混合物在微波(300W)下照射10分钟。将粗混合物用EtOAc(10mL)稀释，过滤并真空蒸发直至HPLC分析显示未有保留的吡啶。将甜菜碱8b用于下一步骤而不经进一步纯化(93％的HPLC纯度)。将粗的棕色油状物溶于48％HBr水溶液(20mL)并在回流下加热18小时。将混合物用水稀释并用EtOAc洗涤(2×10mL)，将水相蒸发至干。将粗的油状物通过色谱纯化，使用纤维素粉末:SiO₂:纤维素粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)作为固定相，得到9b，其为固体(44mg，24％)。M.p.：>200℃。

[α]_D ^25℃＝-09°(0.12，CH₃OH)

IR(KBr，cm^-1)：3435，3049，1724，1631，1513，1475，1420，1384，1280，1190，1144，683。

¹³C(D₂O，125MHz)：173.4，172.4，147.0，145.0，128.5，65.7，64.8，49.3，33.9ppm。

MS(ESI+)：m/z：236(M+1-2Br)

实施例6

3S，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐的分步合成

6.1 甜菜碱8a的合成

按照如实施例5中相同的操作，在100℃下将氮丙啶7a(311mg，0.71mmol)、蒙脱石MK10(20％重量，60mg)和吡啶(58μL，0.71mmol)的混合物在微波(300W)下照射10分钟。将粗混合物用EtOAc(10mL)稀释，过滤并真空蒸发直至HPLC分析显示未有保留的吡啶。将甜菜碱8a通过用二乙醚处理而纯化，分离的产物为白色固体。

M.p.：127-128℃

IR(KBr，cm^-1)：3434，2980，1786，1746，1489，1370，1311，1287，1199，1153，1121，555。

¹H-NMR(CDCl₃ ，300MHz)：9.2(d，2H，J＝5.6Hz)；8.3(t，1H，J＝7.7Hz)；7.89(t，2H，J＝6.9Hz)；7.69(d，2H，J＝8.0Hz)；7.10(d，2H，J＝8.0Hz)；5.07(d，1H，J＝13.0Hz)；4.89(d，1H，J＝12.6Hz)；4.27(t，2H，J＝7.1Hz)；4.20-4.13(m，2H)；2.81(dd，1H，J＝12.8Hz，J＝7.1Hz)；2.31(s，3H)；2.04-1.98(m，1H)；1.38(s，9H)；1.25(t，3H，J＝7.1Hz)ppm。

MS(ESI+)：m/z：518(M+1)。

或者，通过将相同的反应混合物(氮丙啶7a(311mg，0.71mmol)、蒙脱石MK10(20％重量，60mg)和吡啶(58μL，0.71mmol))在90℃下加热7小时而获得甜菜碱8a。将粗混合物用EtOAc(10mL)稀释，过滤并真空蒸发直至HPLC分析显示未有保留的吡啶。获得的收率与使用微波获得的收率类似。

6.2 3S，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐9a的合成

将前一步骤中获得的纯甜菜碱8a溶于48％HBr水溶液(30mL)并在回流下加热18小时。将混合物用水稀释并用EtOAc洗涤(3×10mL)，将水相蒸发至干。将粗的油状物通过色谱纯化，使用纤维素粉末:SiO₂:纤维素粉末:活性炭(1cm:0.5cm:0.5cm:2cm)作为固定相，得到9a，其为固体(110mg，40％)。M.p.：>200℃。

[α]_D ^25℃＝-49°(0.069，CH₃OH)

MS(ESI+)：m/z：236(M+1-2Br)。

实施例7

不同异构体(9a、9b、9c和9d)对肿瘤生长的影响被测肿瘤：Renca

进行该测定是为了检查每一立体异构体对被Renca细胞激发的小鼠体内肿瘤生长的影响。其影响与安慰剂进行比较。所测定的立体异构体是：

异构体1：3R，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐(9b)

异构体2：3R，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐(9c)

异构体3：3S，5S-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐(9a)

异构体4：3S，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐(9d)

这些异构体能够按照实施例4、5和6中公开的方法获得。

材料和方法

肿瘤

Renca是源自Balb/c小鼠品系的肾细胞癌，并且因此在具有Balb/c基因背景的小鼠中是同源的[Melder RJ et al.，Cancer Immunol.Immunother.，2005，54：535-547；Felluga B et al.，1969，J.Natl.CancerInst.43：319-333]。Renca被认为是温和的免疫原性肿瘤并被用作测试免疫干预方法的适当模型[Salup RR，et al.，1992，The Journal ofUrology，147：1120-1123]。

每3-4天通过连续传代将Renca细胞(CLS，Eppelheim，Germany)进行体外维持。通过将5×10⁶细胞接种于75cm²培养瓶上，用RPMI培养基(RPMI，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸，非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，20mM HEPES，80μg/mL庆大霉素；所有这些均购自Sigma，St.Louis，MO，USA)进行培养。通过胰酶消化(Sigma，St.Louis，MO，USA)从48小时培养物中收集的肿瘤细胞被用作用于下文所述研究的Renca细胞的来源。

研究中的药物

活性成分

异构体1(9b)，2.815mg/mL的无菌生理盐水溶液。

异构体2(9c)，2.520mg/mL的无菌生理盐水溶液。

异构体3(9a)，2.080mg/mL的无菌生理盐水溶液。

异构体4(9d)，3.040mg/mL的无菌生理盐水溶液。

安慰剂

生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)

小鼠

样本大小

根据前述数据，达到显著性必需的样本大小为每组26只动物。该样本大小是使用Epi-info v6.0软件计算的[Fleiss，Statistical Methods forrates and Proportions(速率和比例的统计学方法).2^nd Ed，Wiley，1981：38-45]并且对于0.8的统计功效进行估计，其对于肿瘤表面积的两倍增长和1-1的对照-案例比具有0.95的置信度。

设备

层流净化罩、浴、倒置显微镜、计数室、CO₂培养箱、离心机、卡尺、天平、可调移液管、氮容器、冰箱/冷冻机和免疫缺陷小鼠架。

试剂

台盼蓝(Sigma，St.Louis，MO，USA)

无菌PBS(Sigma，St.Louis，MO，USA)

生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)

剂量、载体、给药途径和体积

剂量

肿瘤接种后6、7和14天给药，在260ng的剂量水平测试每一异构体。

载体

异构体溶于其中的载体是生理盐水。

给药途径和体积

通过腹膜内途径(i.p.)进行治疗。接种体积是0.2mL/动物。选择该途径是因为其是原始方法中所述的途径[Pérez S，et al.，2003，ClinicalCancer Research.9：5776-5785]。

研究设计

通过在右后侧进行皮下接种而建立肿瘤。用0.2mL含有10⁵存活的Renca细胞对小鼠(Balb/c)进行接种。皮下接种日被认为是测试的第0日。

将用Renca细胞接种的Balb/c小鼠分成5个实验组：

组 n 性别治疗剂量^＊天数途径
组 n 性别治疗剂量^＊天数途径	(A1)BALB/C 31 雄性安慰剂(P.S.) 6、7、14 i.p.(C1)BALB/C 30 雄性异构体1 260ng 6、7、14 i.p.(C2)BALB/C 30 雄性异构体2 260ng 6、7、14 i.p.(C3)BALB/C 30 雄性异构体3 260ng 6、7、14 i.p.(C4)BALB/C 30 雄性异构体4 260ng 6、7、14 i.p.

^*每日和每小鼠的剂量

每日观察小鼠并且每周记录两次肿瘤大小。这是通过用卡尺测量两个垂直直径(L/W)而进行的。这些测量用于获得肿瘤表面积和体积：

肿瘤表面积＝L×W(mm²)

肿瘤体积＝L×W²×1/2(mm³)

结果以单一值表示和/或以每一实验组的均值±标准偏差或中值表示。

统计

用治疗小鼠和对照小鼠进行案例-对照研究以确定异构体和安慰剂的给药之间是否存在差异。在组内测试所获得的数据(肿瘤表面积和体积)的正态分布-柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验p<0，05-。对于不成对样本进行非参数假设检验以对比异构体对肿瘤生长是否具有有害作用。选择Mann Withney的U检验是因为它是较公知的非参数检验之一，不管怎样，该检验的结果与Wilcoxon范围总和的结果以及Kruskal-Wallis两组检验的结果均相当。

由于数据的高离散度，研究中排除输出层(在第25天肿瘤表面积超出百分之25或超过百分之75的动物)。

所用的统计软件是SPSSv12.0。

结果

异构体对Renca肿瘤细胞生长的抑制作用

计划研究每组30只小鼠(安慰剂组为31只)。异构体2组中的两只小鼠在肿瘤接种后第二周因未知原因死亡并被排除。

表1和2显示以中值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日异构体或P.S.小鼠组中表面积(表1)或体积(表2)的中值。

表1

表面积(mm²)

全部值(中值)

表2

体积(mm³)

全部值(中值)

表3和4显示以均值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日异构体或P.S.小鼠组中表面积(表3)或体积(表4)的均值。

表3

表面积(mm²)

全部值(均值)

表4

体积(mm³)

全部值(均值)

在接受异构体3和安慰剂的小鼠之间存在Renca肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第18天和第25天是统计学显著的(p<0.05)。

在接受异构体4和安慰剂的小鼠之间存在Renca肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第18天后所有评分日是统计学显著的(p<0.01)。

图1代表肿瘤表面积的中值的图(组A1、C1、C2、C3、C4)，而图2代表肿瘤体积的中值的图(组A1、C1、C2、C3、C4)。从这些图中能够看出，在接受异构体3和异构体4与接受安慰剂的小鼠之间存在Renca肿瘤生长速率的差异。

图3代表平均肿瘤表面积的图(组A1、C1、C2、C3、C4)，而图4表示平均肿瘤体积的图(组A1、C1、C2、C3、C4)。从这些图中能够看出，在接受异构体3和异构体4与接受安慰剂的小鼠之间存在Renca肿瘤生长速率的差异。

结果显示异构体3和异构体4抑制肝细胞癌(Renca)的体内生长，异构体4对Renca肿瘤生长显示最高的抑制作用。

实施例8

不同异构体(9a、9b、9c和9d)以及BLAS的混合物之间肿瘤生长的比较

被测肿瘤：ASB XIV

进行该测定是为了比较每一立体异构体与所有这些立体异构体的混合物对被ASB XIV肿瘤激发的小鼠体内肿瘤生长的影响。所测的立体异构体为与上文的实施例7相同的立体异构体加上所有这些立体异构体的混合物(BLAS)。设备(若需要)、试剂、剂量、载体以及给药途径和体积与实施例7中相同。

材料和方法

肿瘤

ASB XIV是源自Balb/c小鼠品系的肺鳞状细胞癌，并且因此在具有Balb/c基因背景的小鼠中是同源的。

每3-4天通过连续传代将ASB XIV细胞(CLS，Eppelheim，Germany)进行体外维持。通过将5×10⁶细胞接种于75cm²培养瓶上，用RPMI培养基(RPMI，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸，非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，20mM HEPES，80μg/mL庆大霉素；所有这些均购自Sigma，St.Louis，MO，USA)进行培养。通过胰酶消化(Sigma，St.Louis，MO，USA)从48小时培养物中收集的肿瘤细胞被用作本实施例中ASB XIV细胞的来源。

研究中的药物

活性成分

BLAS(异构体1、2、3和4的混合物)，浓度为65μg/mL的无菌生理盐水溶液。

异构体1(9b)，浓度为65μg/mL的无菌生理盐水溶液。

异构体2(9c)，浓度为65μg/mL的无菌生理盐水溶液。

异构体3(9a)，浓度为65μg/mL的无菌生理盐水溶液。

异构体4(9d)，浓度为65μg/mL的无菌生理盐水溶液。

安慰剂

生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)

小鼠

样本大小

根据前述数据，达到显著性必需的样本大小为每组26只动物。该样本大小是使用Epi-info v6.0软件计算的，并且对于0.8的统计功效进行估计，其对于肿瘤表面积的两倍增长和1-1的对照-案例比具有0.95的置信度。

研究设计

通过在右后侧进行皮下接种而建立肿瘤。用0.2mL含有2×10⁵存活的ASB XIV细胞对小鼠(Balb/c)进行接种。皮下接种日被认为是测试的第0日。

将用ASB XIV细胞接种的Balb/c小鼠分成6个实验组：

组 n 性别治疗剂量＊天数途径
组 n 性别治疗剂量＊天数途径	(A1)BALB/C 32 雄性安慰剂(P.S.) 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(B1)BALB/C 31 雄性 BLAS 260ng 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(C1)BALB/C 31 雄性异构体1 260ng 6、7和14 i.p. 6、7和14 i.p.(C2)BALB/C 31 雄性异构体2 260ng 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(C3)BALB/C 31 雄性异构体3 260ng 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(C4)BALB/C 31 雄性异构体4 260ng 6、7和14 i.p.

^*每日和每小鼠的剂量

每日观察小鼠并且每周记录两次肿瘤大小。这是通过用卡尺测量两个垂直直径(d1/d2)而进行的。这些测量用于获得肿瘤表面积和体积：

肿瘤表面积＝d1×d2(mm²)

肿瘤体积＝d1×d2²×1/2(mm³)

统计

用治疗小鼠和对照小鼠进行案例-对照研究以确定BLAS或每一不同立体异构体和安慰剂的给药之间是否存在差异。在组内测试所获得的数据(肿瘤表面积和体积)的正态分布-柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验p<0，05-。对于不成对样本进行非参数假设检验以对比BLAS对肿瘤生长是否具有有害作用。选择Mann Withney的U检验是因为它是较公知的非参数检验之一，不管怎样，该检验的结果与Wilcoxon范围总和的结果以及Kruskal-Wallis两组检验的结果均相当。

由于数据的高离散度，研究中排除输出层(在第33天肿瘤表面积超出百分之10或超过百分之90的动物)。

所用的统计软件是SPSSv12.0。

结果

BLAS或每一异构体对ASB XIV肿瘤细胞生长的抑制作用

研究了每组31只小鼠(安慰剂组为32只)。异构体4(9d)组中的两只小鼠在肿瘤接种后第一周因未知原因死亡并被排除。

表5和6显示以中值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日BLAS、异构体或P.S.小鼠组中表面积或体积的中值。

表5

表面积(mm²)

全部值(中值)

表6

体积(mm³)

全部值(中值)

表7和8显示以均值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日BLAS、异构体或P.S.小鼠组中表面积或体积的均值。

表7

表面积(mm²)

全部值(均值)

表8

体积(mm³)

全部值(均值)

在接受BLAS和安慰剂的小鼠之间存在ASB XIV肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第26天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受异构体3和安慰剂的小鼠之间存在ASB XIV肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第26天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受异构体4和安慰剂的小鼠之间存在ASB XIV肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第26天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

BLAS、异构体3和异构体4抑制肺癌ASB XIV的体内生长。每一种对ASB XIV肿瘤生长的抑制效果没有差别。

实施例9

被测肿瘤：Ehlrich

进行该测定是为了比较每一立体异构体与所有这些立体异构体的混合物对被Ehlrich肿瘤激发的小鼠体内肿瘤生长的影响。使用与实施例8中相同的产物、设备、试剂、剂量、载体以及给药途径。

材料和方法

肿瘤

将小鼠用Ehrlich肿瘤细胞接种。其被描述为小鼠乳腺癌。Ehrlich肿瘤是最初出现在远系繁殖的小鼠中的小鼠乳腺癌，并且因此其属于所谓的非特异性肿瘤(Subiza JL，

JE，Rodriguez R，Gil J，Figueredo MA，de la Concha.EG.Development of splenic naturalsuppressor(NS)cells in Ehrlich tumor bearing mice(带有Ehrlich肿瘤的小鼠中脾自然抑制(NS)细胞的发展).Int J Cancer，44：307315；1989)。其可以跨越组织相容性屏障而生长并因此不是小鼠品系特异性的(Carry PJ，Prescott DM，Ogilvie GK.Resistance to Ehrlich ascites tumorin a strain of dystrophic mice(营养障碍小鼠品系中对Ehrlich腹水肿瘤的抵抗).Cancer Res.，39：2139-2140；1979)。

每3-4天通过连续传代将Ehrlich细胞进行体外维持。通过将5×10⁶细胞接种于75cm²培养瓶上，用RPMI培养基(RPMI，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸，非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，20mM HEPES，80μg/mL庆大霉素；所有这些均购自Sigma，St.Louis，MO，USA)进行培养。从48小时培养物中收集的肿瘤细胞被用作下文所述研究中细胞的来源。

小鼠

研究设计

通过在右后侧进行皮下接种而建立肿瘤。用0.2mL含有2×10⁵存活的Ehrlich细胞对小鼠(Balb/c)进行接种。皮下接种日被认为是测试的第0日。

将用Ehrlich细胞接种的Balb/c小鼠分成6个实验组：

组 n 性别治疗剂量^＊天数途径
组 n 性别治疗剂量^＊天数途径	(A1)BALB/C 16 雄性安慰剂(P.S.) 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(B1)BALB/C 16 雄性 BLAS 260ng 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(C1)BALB/C 16 雄性异构体1 260ng 6、7和14 i.p. 6、7和14 i.p.(C2)BALB/C 16 雄性异构体2 260ng 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(C3)BALB/C 16 雄性异构体3 260ng 6、7和14 i.p.6、7和14 i.p.(C4)BALB/C 16 雄性异构体4 260ng 6、7和14 i.p.

^*每日和每小鼠的剂量

肿瘤表面积＝L×W(mm²)

肿瘤体积＝L×W²×1/2(mm³)

统计

所用的统计软件是SPSSv12.0。

结果

BLAS对Ehrlich肿瘤细胞生长的抑制作用

计划研究每组16只小鼠。

表9和10显示以中值表示的每一实验组的结果(在所有情况下n(第一天)是16并且剂量是260ng/小鼠)。这些表总结了在每一评分日BLAS、异构体或P.S.小鼠组中表面积或体积的中值。

表9

表面积(mm²)

全部值(中值)

表10

体积(mm³)

全部值(中值)

表11和12显示以均值表示的每一实验组的结果(在所有情况下n(第一天)为16并且剂量为260ng/小鼠)。这些表总结了在每一评分的日BLAS、异构体或P.S.小鼠组中表面积或体积的均值。

表11

表面积(mm²)

全部值(均值)

表12

体积(mm³)

全部值(均值)

在接受BLAS和安慰剂的小鼠之间存在Ehrlich肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第16天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。在第35天和第38天观察到表面积的倾向(分别为p＝0.056和p＝0.08)。在第13天、第16天、第20天和第38天观察到体积的倾向(分别为p＝0.08、p＝0.056、p＝0.051和p＝0.067)。

在接受异构体1和安慰剂的小鼠之间存在Ehrlich肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第13天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受异构体2和安慰剂的小鼠之间存在Ehrlich肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第13天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受异构体3和安慰剂的小鼠之间存在Ehrlich肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第8天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受异构体4和安慰剂的小鼠之间存在Ehrlich肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第8天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。在第35天和第38天观察到表面积和体积的倾向(分别为p＝0.061和p＝0.08；二者均为p＝0.102)。

在接受BLAS和异构体3的小鼠之间存在Ehrlich肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第13天、第16天、第20天和第23天是统计学显著的(p<0.05)。

BLAS、异构体1、异构体2、异构体3和异构体4抑制Ehrlich肿瘤细胞的体内生长。异构体3对Ehrlich肿瘤生长显示最高的抑制效果。

实施例10

异构体4(9d)对不同肿瘤生长的影响

按照与实施例8和9中所用的类似的方法和材料进行下列测定以检查异构体4(9d)对不同肿瘤的影响。在所有情况下无菌生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)被用作安慰剂。在肿瘤接种后第6天、第7天和第14天在表13指明的剂量水平下测试异构体4(9d)。在所有情况下载体均为生理盐水并且通过腹膜内途径进行治疗。接种的体积为0.2mL/动物。结果如表13所示。

表13

肿瘤	小鼠(样本大小)	剂量(ng/小鼠)	肿瘤生长抑制？
肿瘤	小鼠(样本大小)	剂量(ng/小鼠)	肿瘤生长抑制？	CT26.wt(高剂量结肠癌)	Balbc/cByl(约40雄性)	250	是
CT26.CL25(低剂量结肠癌)	Balbc/cBl(约40雄性)	250	是	CT26.wt(高剂量结肠癌)	Balbc/cByl(约40雄性)	250	是
CT26.CL25(低剂量结肠癌)	Balbc/cBl(约40雄性)	250	是	Mm5MT(乳腺肿瘤)	C3H/HeN(42雄性)	250	是
KLN205(高剂量肺癌)	DBA/2NCrI(约62雄性)	260	是	Mm5MT(乳腺肿瘤)	C3H/HeN(42雄性)	250	是
KLN205(高剂量肺癌)	DBA/2NCrI(约62雄性)	260	是	ASB XIV(high dose lung癌)	Balb/cAnNCrI(61雄性)	260	是
ASB XIV(高剂量肺癌)	Balb/cAnNCrI(62雄性)	260	是	ASB XIV(high dose lung癌)	Balb/cAnNCrI(61雄性)	260	是

Lewis(低剂量肺癌)	C57BL/6NCrI(62雄性)	260	是
Lewis(低剂量肺癌)	C57BL/6NCrI(62雄性)	260	是	P-815(肥大细胞瘤)	DBA/2NCrI(42雄性)	250	是

实施例11、12和13

异构体4(9d)vs安慰剂以及9d+顺铂的联合的作用

被测肿瘤：KLN 205和Lewis肺细胞

进行该测定是为了比较异构体4(9d)与异构体4(9d)+顺铂的混合物对被KLN 205肿瘤和Lewis肺细胞激发的小鼠体内肿瘤生长的影响。使用与实施例7中相同的设备、试剂、载体和给药途径和体积。

研究中的药物

在实施例11、12和13中，研究中使用下列药物：

活性成分

顺铂(Sigma，St.Louis，MO，USA)的无菌生理盐水溶液。

异构体(9d)(3S，5R-1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)溴化吡啶鎓氢溴酸盐)的无菌生理盐水溶液。

安慰剂

生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)

在实施例11、12和13中，每日观察小鼠并且每周记录两次肿瘤大小。这是通过用卡尺测量两个垂直直径(d1/d2)而进行的。这些测量用于获得肿瘤表面积和体积：

肿瘤表面积＝d1×d2(mm²)

肿瘤体积＝d1×d2²×1/2(mm³)

实施例11

9d与顺铂的联合对肿瘤生长的影响

被测肿瘤：KLN 205

进行该测定是为了检查对被KLN 205细胞激发的小鼠体内肿瘤生长的影响。其影响与顺铂+9d和/或安慰剂的影响进行比较。

材料和方法

肿瘤

KLN 205是源自DBA/2小鼠品系的肺细胞癌，并且因此在具有DBA/2基因背景的小鼠中是同源的(Kaneko T and LePage GA.Growthcharacteristics and drug responses of a murine lung cancer in vitro and invivo(小鼠肺癌的体外和体内生长特征和药物响应).Cancer Res.38：2084-2090；1978)。

每3-4天通过连续传代将KLN205细胞(CLS，Eppelheim，Germany)进行体外维持。通过将5×10⁶细胞接种于75cm²培养瓶上，用RPMI培养基(RPMI，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸，非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，20mM HEPES，80μg/mL庆大霉素；所有这些均购自Sigma，St.Louis，MO，USA)进行培养。用胰岛素-EDTA(Sigma，St.Louis，MO，USA)处理后通过收集分离的细胞而进行次培养。从48小时培养物中收集的肿瘤细胞被用作用于下文所述研究的KLN 205细胞的来源。

小鼠

剂量

肿瘤接种后三周在每周给药二次的65μg的剂量水平下测试顺铂。

肿瘤接种后三周在每周给药二次的250μg的剂量水平下测试异构体4(9d)。

研究设计

通过在右后侧进行皮下接种而建立肿瘤。用0.2mL含有2×10⁵存活的KLN 205细胞对小鼠(DBA/2)进行接种。皮下接种日被认为是测试的第0日。

将用KLN 205细胞接种的DBA/2小鼠分成6个实验组：

^*每日和每小鼠的剂量

统计

用治疗小鼠和对照小鼠进行案例-对照研究以确定安慰剂、9d、顺铂或9d+顺铂之间是否存在差异。在组内测试所获得的数据(肿瘤表面积和体积)的正态分布-柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验p<0，05-。对于不成对样本进行参数假设检验以对比9d和/或顺铂对肿瘤生长是否具有协同作用。选择t检验是因为它是较公知的参数检验之一。

所用的统计软件是SPSSv12.0。

结果

9d和/或顺铂对KLN 205肿瘤细胞生长的抑制作用

计划研究每组16只或15只小鼠。

表14和15显示以中值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日9d、顺铂、9d+顺铂或P.S.小鼠组中表面积或体积的中值。

表14

表面积(mm²)

全部值(中值)

表15

体积(mm³)

全部值(中值)

表16和17显示以均值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日9d、顺铂、9d+顺铂或P.S.小鼠组中表面积或体积的均值。

表16

表面积(mm²)

全部值(均值)

表17

体积(mm³)

全部值(均值)

在接受9d+顺铂和安慰剂的小鼠之间存在KLN 205肿瘤生长速率的差异。如由t检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第17天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受顺铂和安慰剂的小鼠之间存在KLN 205肿瘤生长速率的差异。如由t检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第20天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受9d和安慰剂的小鼠之间不存在KLN 205肿瘤生长速率的差异。如由t检验所计算的，在肿瘤发展的第31天后所有评分日存在表面积或体积方面的显著倾向。

因此，顺铂和9d或顺铂抑制KLN 205细胞的体内生长。9d和顺铂具有协同作用。

实施例12

异构体(9d)与顺铂的联合对经过皮下、皮内或肌内接种的肿瘤生长的作用

被测肿瘤：KLN 205

进行该测定是为了检查对被KLN 205细胞激发的小鼠体内肿瘤生长的影响。通过皮下、皮内或肌内接种而建立肿瘤。

比较顺铂和/或异构体(9d)的联合与安慰剂对皮内激发的小鼠的作用。此外，比较了9d与安慰剂对通过肌内或皮下途径激发的小鼠的体内肿瘤生长的作用。

材料和方法

肿瘤

每3-4天通过连续传代将KLN 205细胞(CLS，Eppelheim，Germany)进行体外维持。通过将5×10⁶细胞接种于75cm²培养瓶上，用RPMI培养基(RPMI，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸，非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，20mM HEPES，80μg/mL庆大霉素；所有这些均购自Sigma，St.Louis，MO，USA)进行培养。用胰岛素-EDTA(Sigma，St.Louis，MO，USA)处理后通过收集分离的细胞而进行次培养。从48小时培养物中收集的肿瘤细胞被用作用于下文所述研究的KLN 205细胞的来源。

小鼠

剂量

肿瘤接种后在第7天、第11天、第14天、第18天、第21天、第25天和第28天给药的65μg的剂量水平下测试顺铂。

肿瘤接种后在第7天、第11天、第14天、第18天、第21天、第25天和第28天给药的250μg的剂量水平下测试异构体(9d)。

研究设计

通过在右后侧进行皮下和皮内接种以及在右后腿进行肌内接种而建立肿瘤。用0.05mL含有2×10⁵存活的KLN 205细胞对小鼠(DBA/2)进行接种。皮下、皮内和肌内接种日被认为是测试的第0日。

将用KLN 205细胞接种的DBA/2小鼠分成8个实验组：

^*每日和每小鼠的剂量

^**在肌内接种时，除了这些天之外，还在第32天和第35天治疗小鼠。

统计

用治疗小鼠和对照小鼠进行案例-对照研究以确定安慰剂、9d、顺铂或9d+顺铂之间是否存在差异。在组内测试所获得的数据(肿瘤表面积和体积)的正态分布(柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验p<0，05)。对于不成对样本进行非参数假设检验以对比9d、顺铂或9d+顺铂对肿瘤生长是否具有有害作用。选择Mann Withney的U检验是因为它是较公知的非参数检验之一，不管怎样，该检验的结果与Wilcoxon范围总和的结果以及Kruskal-Wallis两组检验的结果均相当。

用SPSS(用于社会科学的统计包)v13.0进行所有的统计分析。

结果

异构体4(9d)对KLN 205肿瘤细胞生长的抑制作用

计划研究每组10只小鼠。

表18和19显示以中值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日表面积或体积的中值。

表18

表面积(mm²)

全部值(中值)

表19

体积(mm³)

全部值(中值)

表20和21显示以均值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日表面积或体积的均值。

表20

表面积(mm²)

全部值(均值)

表21

体积(mm³)

全部值(均值)

在接受9d和安慰剂的小鼠之间存在皮下KLN 205肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第20天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受9d和安慰剂的小鼠之间不存在真皮内KLN 205肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在肿瘤发展的第17天后所有评分日在表面积或体积方面存在显著倾向。

在接受顺铂和安慰剂的小鼠之间存在真皮内KLN 205肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第17天、第20天和第31天是统计学显著的(p<0.05)。

在接受9d+顺铂和安慰剂的小鼠之间存在真皮内KLN 205肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第13天后的所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

如由Mann-Whitney U检验所计算的，在接受9d和安慰剂的小鼠之间存在肌内KLN 205肿瘤生长速率的差异。

异构体4(9d)抑制皮下KLN 205细胞的体内生长。9d+顺铂或顺铂抑制真皮下KLN 205细胞的体内生长。

实施例13

9d与顺铂的联合对肿瘤生长的作用

被测肿瘤：Lewis

进行该测定是为了检查对被Lewis肺细胞激发的小鼠体内肿瘤生长的作用。将其作用与化疗剂+9d的联合和/或安慰剂进行比较。

材料和方法

肿瘤

Lewis肺是源自C57BL/6J小鼠品系的肺细胞癌，并且因此在具有C57BL/6J基因背景的小鼠中是同源的(Rodrigo Garzón M，TirapuFernández de la Cuesta I，Arina Iraeta A，Noel Centelles Llorente M andZulueta Francés J.Use of Gene Therapy in a Subcutaneous Murine Modelof Lung Cancer(基因疗法在肺癌的皮下小鼠模型中用途).ArchBronconeumology.42：526-532；2006)。

每3-4天通过连续传代将Lewis肺细胞(CLS，Eppelheim，Germany)进行体外维持。通过将5×10⁶细胞接种于75cm²培养瓶上，用RPMI培养基(RPMI，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酸，非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，20mM HEPES，80μg/mL庆大霉素；所有这些均购自Sigma，St.Louis，MO，USA)进行培养。用胰岛素-EDTA(Sigma，St.Louis，MO，USA)处理后通过收集分离的细胞而进行次培养。从48小时培养物中收集的肿瘤细胞被用作用于下文所述研究的Lewis肺细胞的来源。

小鼠

剂量

肿瘤接种后在第7天、第11天、第14天、第18天、第21天、第24天和第27天给药的65μg的剂量水平下测试顺铂。

肿瘤接种后在第7天、第11天、第14天、第18天、第21天、第24天和第27天给药的250μg的剂量水平下测试异构体4(9d)。

研究设计

通过在右后侧进行皮下接种而建立肿瘤。用0.2mL含有2×10⁵存活细胞对小鼠进行接种。皮下接种日被认为是测试的第0日。

将小鼠分成4个实验组：

^*每日和每小鼠的剂量

肿瘤表面积＝d1×d2(mm²)

肿瘤体积＝d1×d2²×1/2(mm³)

统计

我们排除了肿瘤接种后第31天不具有可检测或可评分的肿瘤的研究动物。由于数据的高离散度，研究中排除输出层。

用SPSS(用于社会科学的统计包)v13.0进行所有的统计分析。

结果

异构体4(9d)对Lewis肺肿瘤生长的作用

计划研究每组15只小鼠。安慰剂组的一只小鼠在肿瘤接种后的第二周因未知原因死亡并被排除。

表22和23显示以中值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日P.S、9d、顺铂或9d+顺铂小鼠组中表面积或体积的中值。

表22

表面积(mm²)

全部值(中值)

表23

体积(mm³)

全部值(中值)

表24和25显示以均值表示的每一实验组的结果。这些表总结了在每一评分日P.S、9d、顺铂或9d+顺铂小鼠组中表面积或体积的均值。

表24

表面积(mm²)

全部值(均值)

表25

体积(mm³)

全部值(均值)

在接受9d和安慰剂的小鼠之间存在皮下Lewis肺肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第13天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

在接受顺铂和安慰剂的小鼠之间存在皮下Lewis肺肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第10天、第13天和第17天是统计学显著的(p<0.05)。

在接受9d+顺铂和安慰剂的小鼠之间存在皮下Lewis肺肿瘤生长速率的差异。如由Mann-Whitney U检验所计算的，在表面积或体积方面的这些差异在肿瘤发展的第17天后所有评分日是统计学显著的(p<0.05)。

9d、顺铂和9d+顺铂抑制近亲繁殖的小鼠中Lewis肺肿瘤的体内生长。

实施例14

毒性

进行该测定是为了检查小鼠中BLAS和IL-2治疗的耐受性(致死率/毒性)。

材料和方法

研究中的药物

BLAS(异构体1、2、3和4的等摩尔混合物)的1，25mg/mL无菌生理盐水溶液。

人重组IL-2，为18×10⁶IU/mL(Proleukin；Chiron Iberia，Madrid，Spain)。

小鼠

剂量、载体、给药途径和体积

剂量

^*每小鼠每日剂量，使用0.2mL的恒定体积

载体

BLAS和IL-2稀释于其中的载体是注射用无菌生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)和注射用无菌蒸馏水(Grifols，Barcelona，Spain)。

给药途径

以i.p.方式进行治疗。

研究设计

在30内每日观察每一小鼠。

进行两种测量：

1.致死率。这以存活百分数表示。

2.毒性。在活的小鼠上检查下列参数和评分标准：

参数评分

一般方面：
一般方面：			正常	0
	影响皮毛	1	正常	0
	影响皮毛	1	影响皮毛+眼/鼻分泌	2
	反常位置	3	影响皮毛+眼/鼻分泌	2
	反常位置	3
反常行为：
反常行为：			未有	0
	有	3	未有	0

结果

与BLAS和IL-2处理相关的致死率和毒性

表26显示用两种处理的致死率。结果以存活百分数表示。从该表中能够看出，组B2中接受最高剂量IL-2的两只小鼠死亡于第一次给药后的第6日和第7日。在所用的任何剂量下，无论是用IL-2(更低剂量)或BLAS处理。在其它任何组的小鼠中未观察到其它死亡

表26

致死率

表27显示在两种处理的小鼠中观察到的用上述标准评分的毒性。结果以每个处理组积累的毒性分数表示。

表27

毒性评分

由该表能够看出，仅在IL-2处理的小鼠(组B1&B2)中观察到毒性。组B2(最高IL-2剂量)显示更显著的不良反应但组B1(较低剂量)也被评分，结果程度较低。在IL-2处理过程中和之后(第2天至第15天)均观察到不良反应。能够期待，随后这些不良反应消失，因为在初始剂量之后6天停止IL-2。应当注意，BLAS显然根本无毒，并且后续在任何小鼠中均未有可评分的点。这是很显著的，因为本研究中所用的剂量超过上述大部分实施例中所用的治疗剂量的1,000倍。

与IL-2相反，BLAS甚至在大大超过其治疗范围的剂量也可被小鼠很好地耐受。

实施例15

异构体4(9d)的毒性

进行该测定是为了进行初步的研究以研究在高剂量下使用的异构体4(9d)对健康小鼠的毒性作用。其最终毒性会与安慰剂进行比较。

材料和方法

研究中的药物

活性物质

异构体4(9d)的0.7mg/mL的无菌生理盐水溶液。

安慰剂

注射用无菌生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)。

小鼠

剂量、载体、给药途径和体积

剂量

^*每一小鼠每天的剂量，使用1.8mL(A1、B1)或0.2mL(C1、D1)的恒定体积

载体

异构体4稀释于其中的载体是注射用无菌生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)和注射用无菌蒸馏水(Grifols，Barcelona，Spain)。

给药途径

以i.p.或s.c.方式进行治疗。

研究设计

在10天内每天观察小鼠。

进行三种测量

3.重量。其被测量并以克表示。

4.致死率。这以存活百分数表示。

5.毒性。在活的小鼠上检查下列参数和评分标准：

参数全身毒性评分

一般方面：
一般方面：				正常	0
	影响皮毛	1		正常	0
	影响皮毛	1		影响皮毛+眼/鼻分泌	2
	反常位置	3		影响皮毛+眼/鼻分泌	2
	反常位置	3		反常位置+不动	4
				反常位置+不动	4
			反常行为：	未有	0
	有	3	反常行为：	未有	0

参数局部毒性评分

正常	0
正常	0	接种部位的红斑	1
红斑+暴躁/风团	2	接种部位的红斑	1
红斑+暴躁/风团	2	红斑+暴躁/风团+影响皮毛	3
接种部位坏死	4	红斑+暴躁/风团+影响皮毛	3

统计

用治疗小鼠和对照小鼠进行案例-对照研究以确定异构体4和安慰剂给药之间是否存在差异。选择Mann Withney的U检验是因为它是较公知的非参数检验之一，不管怎样，该检验的结果与Wilcoxon范围总和的结果以及Kruskal-Wallis两组检验的结果均相当。

所用的统计软件是SPSSv12.0。

结果

与异构体4治疗相关的致死率和毒性

表28和29显示每一评分日每一C57BL/6小鼠的体重，以及均值、标准偏差和中值。通过Mann-Whitney U检验的检测，未观察到各组之间体重的差异(p>0.05)。

表28

体重减轻

组A1(异构体4)

表29

体重减轻

组B1(安慰剂)

在用异构体4(组A1)或生理盐水(组B1)治疗的任何小鼠组中均未观察到死亡或毒性。应当注意到，全身毒性中所用的剂量超过治疗剂量的总量的50,000倍。

在异构体4(组C1)或安慰剂(组D1)治疗的小鼠中也未观察到局部毒性。应当注意到，该研究的局部毒性中所用的剂量超过治疗剂量正常浓度的500倍。

因此，甚至在大大超过其治疗范围的剂量下，异构体4也是被小鼠很好地耐受的。在受激发的任何小鼠中均未观察到接种部位的局部毒性。

实施例16

表型白细胞分析

进行该实施例是为了通过流式细胞术评价被治疗小鼠中白细胞群落百分数的最终差异。用膜蛋白(CD11B和Ly6G)的特异性抗体标记所述蛋白之后使用流式细胞仪进行计数。CD11B(也称为Mac-1)标记被表达在单细胞群落中，而Ly6G(也称为GR-1)被表达在粒细胞群落中。两种标记(CD11b和Ly6G)均被表达在中性粒细胞群落中。该测定显示，被测定的化合物增加白血细胞群落，尤其是从骨髓性细胞系中，这在要求增加个体中，例如患有AIDS的患者中免疫应答的情况下是很重要的。

材料和方法

研究中药物

异构体4(化合物9d)的65μg/mL的无菌生理盐水溶液。

安慰剂

生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)。

小鼠

设备

层流净化罩、流式细胞仪、可调移液管、无菌注射器、无菌针头、EDTA无菌试管、塑料试管。

试剂

●麻醉剂溶液

●无菌PBS(Sigma，St.Louis，MO，USA)

●生理盐水(Grifols，Barcelona，Spain)

●大鼠抗小鼠CD11b-PE(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)

●大鼠抗小鼠Ly6G-FITC(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)

●Optylise C(Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)剂量、载体、给药途径和体积

剂量

于第0日和第7日给药的250ng的剂量水平下测试异构体4(化合物9d)。

载体

异构体4稀释于其中的载体是生理盐水。

给药途径和体积

通过腹膜内途径进行治疗。接种体积为200μl/动物。

研究设计

Balb/c小鼠分成2个实验组：

^*每日每小鼠剂量

最后治疗剂量3天后分离小鼠血液。它是直接由心脏穿刺获得。在此之前，对小鼠进行肌内麻醉。

将血液与上述单克隆抗体混合。

孵育20分钟后，向样品中加入OptyliseC溶液以溶解红细胞群落。

最后，将样品用1×无菌PBS稀释1/2并通过流式细胞术检查。

被分析的每一群落的百分数以单一值表示以及以每一实验组的均值±标准偏差表示。

结果

流式细胞术筛选

PBL(外周血)

ID	对照(n＝5)％	化合物9d(n＝4)％
ID	对照(n＝5)％	化合物9d(n＝4)％	CD11b+	1	21，6	44
2	22，4	35，4	CD11b+	1	21，6	44
2	22，4	35，4		3	18，4	-
4	11，2	32，9		3	18，4	-
4	11，2	32，9		5	9，74	35，5
介质	16，668	36，95		5	9，74	35，5
介质	16，668	36，95		标准偏差	5，875297439	4，851460261

ID	对照(n＝5)％	化合物9d(n＝4)％
ID	对照(n＝5)％	化合物9d(n＝4)％	Ly6G+	1	16，9	27
2	22，1	37，6	Ly6G+	1	16，9	27
2	22，1	37，6		3	28，9
4	23，7	33，3		3	28，9
4	23，7	33，3		5	10，7	41，2
介质	20，46	34,775		5	10，7	41，2
介质	20，46	34,775		标准偏差	6，934551175	6，107031467

ID	对照(n＝5)％	化合物9d(n＝4)％
ID	对照(n＝5)％	化合物9d(n＝4)％	CD11b+Ly6G+	1	16，1	29，7
2	20，4	32，3	CD11b+Ly6G+	1	16，1	29，7
2	20，4	32，3		3	13，7
4	7，78	28，5		3	13，7
4	7，78	28，5		5	8，02	33，7
介质	13，2	31，05		5	8，02	33，7
介质	13，2	31，05		标准偏差	5，401592358	2，37416652

根据这些结果，与对照小鼠(生理盐水)相比，用两次剂量(每周一次)的化合物9d治疗的小鼠(Balb/C)显示外周血中CD11b、Ly6G和CD11b+Ly6G阳性细胞的增加。这些细胞在最后治疗剂量3天后通过流式细胞术检查。

Claims

1.合成通式I化合物的基本纯的立体异构体或其化合物的方法

其中

X是药物可接受的阴离子：以及

Y是选自下列基团的有机基团

(i)通式VIa的含N基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基，以及

X如前文所定义；或者

(ii)通式VIb的含N基团

其中

X如前文所定义；以及

所述方法包括

a)使对映纯的通式IV化合物或其混合物

其中R₁和R₂如前文所定义；

与通式V化合物反应

其中R₄如前文所定义；

以得到通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义；

b)将所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物转化成通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物

其中

R₁、R₂和R₄如前文所定义；

R₅选自负电荷或R₃，其中R₃如前文所定义；以及

Y为选自下列基团的含N有机基团

(i)当R₅是负电荷时，Y是通式VIIa的含N有机基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基；或者

(ii)当R₅是R₃时，Y是选自下列基团的含N有机基团

(ii.a)通式VIIb的含N基团

其中Ra和Rb如前文所定义；或者

(ii.b)通式VIIc的含N有机基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基；以及

Z是药物可接受的阴离子；以及

c)使所述通式II化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与含有通式HX的酸的酸介质接触以得到所述通式I化合物的基本纯的立体异构体或其混合物，其中X如上文所定义。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述通式IV化合物是选自S异构体和R异构体的对映纯的化合物形式。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述通式IV化合物是5R-4-亚甲基-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁酯2-乙酯或者5S-4-亚甲基-5-氧代吡咯烷-1，2-羧酸1-叔丁酯2-乙酯。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述通式V化合物是N-甲苯磺酰亚氨基benzyliodinane。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述对映纯的通式IV化合物或其混合物与所述通式V化合物的所述反应在催化剂的存在下进行，所述催化剂优选铜基催化剂，优选选自Cu(ft)₂和Cu(acac)₂的催化剂，其中“ft”是酞菁以及“acac”是乙酰乙酸盐。

6.如权利要求1所述的方法，其中将所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物转化成通式II化合物的基本纯的立体异构体，其中R₅是负电荷以及Y是通式VIIa的含N有机基团，所述转化是通过使所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa的含氮的亲核试剂反应

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基。

7.如权利要求1所述的方法，其中将所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物转化成通式II化合物的基本纯的立体异构体，其中R₅是R₃以及Y是通式VIIb的含N有机基团，所述转化是通过使所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIb的含氮的亲核试剂反应

其中Ra和Rb如前文所定义；

以及，若需要，将得到的混合物用通式X化合物淬灭

R₃Z (X)

其中R₃和Z如前文所定义。

8.如权利要求1所述的方法，其中将所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物转化成通式II化合物的基本纯的立体异构体，其中R₅是R₃以及Y是通式VIIc的含N有机基团，所述转化是通过使所述通式III化合物的基本纯的立体异构体或其混合物与通式VIIIa的含氮的亲核试剂反应

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基；并且

与通式X化合物反应

R₃Z (X)

其中R₃和Z如前文所定义。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述通式III化合物是基本纯的立体异构体(3R，5R)、(3S，5S)、(3R，5S)、或(3S，5R)的形式。

10.如权利要求6或8所述的方法，其中所述通式VIIIa的含氮的亲核试剂是通式IX的吡啶

其中，

n是0、1、2、3、4或5；以及

11.如权利要求1所述的方法，其中通式III化合物向通式II化合物的转化是在加热下进行的，优选用微波加热。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述通式HX的酸是无机酸，优选HCl或HBr。

13.通式I化合物，其选自下列化合物：

a)基本纯的通式Ia化合物

其中

X是药物可接受的阴离子；以及

Y是选自下列基团的有机基团

(i)通式VIa的含N基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基以及

X如前文所定义；或

(ii)通式VIb的含N基团

其中

X如前文所定义；以及

Ra和Rb独立地选自取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、或取代的或未取代的杂环基；或

b)基本纯的通式Ib化合物，

其中R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所定义；

c)基本纯的通式Ic化合物

其中R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所定义；

d)基本纯的通式Id化合物

其中R₁、R₂、R₃、R₄、X和Y如前文所定义；以及

e)任意摩尔比的上述通式Ia、Ib、Ic和/或Id的基本纯的化合物的任何混合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：

14.如权利要求13所述的化合物，其中R₁是OH或ORa，优选OH；R₂是氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺，优选氢；R₃或R₄独立地是氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺，优选R₃或R₄同时是氢；和/或X是药物可接受的阴离子，优选溴化物或氯化物。

15.如权利要求13所述的化合物，其中Y选自下列基团的有机基团

或是选自下列基团的有机基团

16.如权利要求13所述的化合物，其选自下列化合物：

-通式I’a化合物

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义；

-通式I’b化合物

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义；

-通式I’c化合物

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义；

-通式I’d化合物

其中R₁、R₂、R₆和n如前文所定义；以及

-其混合物。

17.如权利要求13所述的化合物，其选自下列化合物：

18.组合物，其含有任意摩尔比的权利要求13所述的选自通式Ia、Ib、Ic、Id化合物或其混合物的化合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：

19.药物组合物，其含有权利要求13至17中任一权利要求所定义的化合物或者权利要求18所述的组合物，以及药物可接受的载体。

20.通式II化合物，其选自下列化合物：

a)基本纯的通式IIa化合物，

其中

R₂、R₃和R₄独立地选自氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺；以及

Y是选自下列基团的有机基团

(i)通式VIa的含N基团

其中

虚线与氮原子一起形成取代的或未取代的杂芳基，以及

X是药物可接受的阴离子；或

(ii)通式VIb的含N基团

其中

X如前文所定义；以及

b)基本纯的通式IIb化合物，

其中R₁、R₂、R₄、R₅和Y如前文所定义；

c)基本纯的通式IIc化合物，

其中R₁、R₂、R₄、R₅和Y如前文所定义；以及

d)基本纯的通式II的化合物，

其中R₁、R₂、R₄、R₅和Y如前文所定义；以及

e)任意摩尔比的上述通式IIa、IIb、IIc和/或IId的基本纯的化合物的任何混合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：

1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓；

21.如权利要求20所述的化合物，其中R₁是-ORa，优选其中Ra是烷基基团；R₂是-(O＝)C-O-Ra，优选BOC基团；和/或R₄是-(O＝)S(＝O)-Ra，优选甲苯磺酰基。

22.如权利要求20所述的化合物，其中R₂、R₄和R₅独立地是氢。

23.如权利要求20所述的化合物，其中R₅是负电荷。

24.组合物，其含有任意摩尔比的权利要求20所述的选自通式IIa、IIb、IIc、IId化合物或其混合物的化合物，其中所述混合物不同时含有下列化合物的所有四种立体异构体：

1-(3-氨基-5-羧基-2-氧代吡咯烷-3-基甲基)乙酸吡啶鎓；

25.通式III化合物，其选自下列化合物：

a)基本纯的通式IIIa化合物，

其中

R₂和R₄独立地选自氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺；

b)通式IIIb化合物

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义；

c)通式IIIc化合物，

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义；

d)通式III的化合物

其中R₁、R₂和R₄如前文所定义；以及

e)其混合物。

26.如权利要求25所述的化合物，其中R₁是-ORa，优选其中Ra是烷基基团；R₂是-(O＝)C-O-Ra，优选BOC基团；和/或R₄是-(O＝)S(＝O)-Ra，优选甲苯磺酰基。

27.如权利要求25所述的化合物，其中R₂、R₄和R₅独立地是氢。

28.合成权利要求13所定义的通式I化合物的方法，其包括使权利要求20所定义的通式II化合物与含有通式HX的酸的酸介质接触，其中X是药物可接受的阴离子。

29.方法，其包括使对映纯的通式IV化合物或其混合物

其中

R₁选自-OH、-ORa，其中Ra选自取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的环烯基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、或取代的或未取代的杂环基；以及

R₂是氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺；

与通式V化合物反应

其中R₄是氢、在酸性条件下水解的氮保护基团或邻苯二甲酰胺；

以得到权利要求25所定义的通式III化合物。

30.权利要求13至17中任一权利要求所述的化合物在制备用于增强个体中免疫应答的药物组合物中的用途，或者在制备抗肿瘤药物组合物中的用途，或者在制备用于治疗细菌、真菌或病毒来源的感染的药物组合物中的用途，或者在制备用于治疗自体免疫疾病的药物组合物中的用途。

31.如权利要求30所述的在制备用于治疗和/或预防癌的药物组合物中的用途。

32.如权利要求30或31所述的在制备用于治疗和/或预防选自结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肥大细胞瘤、肺癌和肾癌的疾病或疾病状态的药物组合物中的用途。

33.如权利要求30所述的在制备用于治疗和/或预防AIDS和相关疾病的药物组合物中的用途。