ES2538979T3 - Método y aparato para reducir el contenido en proteínas en extendedores de células espermáticas - Google Patents

Abstract

Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación, que comprende las etapas de: - obtener una pluralidad de células espermáticas; - someter dicha pluralidad de células espermáticas a tensiones de clasificación; - seleccionar dicha pluralidad de células espermáticas para una característica deseada; - añadir un extendedor de células espermáticas que contienen yema de huevo a dicha pluralidad de células espermáticas para formar una primera mezcla de células espermáticas extendidas que tiene un primer valor de contenido de proteínas; - enfriar dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas a una temperatura menor que 10 grados Celsius para crear una primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada; - añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas que tiene un volumen igual a un volumen de dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada que tiene un segundo valor de contenido de proteínas que incluye más de 0,4 a 3,2 por ciento en volumen de yema de huevo; - mantener dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada en un estado sin clarificar; - someter a centrifugación a dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada; - añadir un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas suplementario a la segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada centrifugada para aumentar el contenido total en proteínas de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas de este tipo que tiene un tercer valor de contenido de proteínas mayor que el primer valor de contenido de proteínas y que incluye más de 1 a 50 por ciento en volumen de yema de huevo; -congelar dicha mezcla de células espermáticas extendidas.

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DESCRIPCIÓN

Método y aparato para reducir el contenido en proteínas en extendedores de células espermáticas

La presente invención se refiere a un método para congelar células espermáticas clasificadas.

El documento US2003 0157 475 describe un método para la crioconservación de esperma.

Extendedores de células espermáticas pueden ser utilizados comúnmente en una diversidad de disciplinas biológicas que requieren que se trabaje con células espermáticas. Por ejemplo, una disciplina que puede hacer un amplio uso de extendedores de células espermáticas es el campo de la inseminación artificial. Considerando que la inseminación natural puede implicar una inseminación macho a hembra, la inseminación artificial puede implicar típicamente la recogida de las células espermáticas de un macho, la realización de un grado de manipulación humana de tales células espermáticas retiradas de su entorno natural, y luego insertar en una hembra las células espermáticas manipuladas. El grado exacto de la manipulación humana puede variar dependiendo de la naturaleza precisa de la aplicación particular. Por ejemplo, una cierta manipulación humana puede implicar simplemente dividir una muestra de esperma recogida en múltiples dosis para su uso en múltiples eventos de inseminación, posiblemente con múltiples animales hembras. Sin embargo, otras aplicaciones pueden requerir una manipulación humana más intensa.

Por ejemplo, la manipulación humana en algunas aplicaciones puede implicar la clasificación células espermáticas en poblaciones basadas en características exhibidas por las células del esperma. Una de estas aplicaciones puede incluir el uso de citometría de flujo para separar las células espermáticas en poblaciones de células del esperma portadoras de cromosoma X y portadoras del cromosoma Y. Un citómetro de flujo típicamente puede lograr una separación de este tipo haciendo fluir las células espermáticas arrastradas en una corriente de fluido de una en una a través de una región de interrogación, donde se puede obtener información acerca de cada una de las células espermáticas. La interrogación puede lograrse normalmente a través del uso de la óptica, por ejemplo tal vez por la intersección de un haz de láser con una célula espermática y la medición de la dispersión de la luz o fluorescencia resultante. La determinación de una característica de sexo tal vez puede hacerse mediante la tinción de las células espermáticas con un colorante fluorescente que se une al ADN dentro de las células espermáticas individuales. Cuando un láser ilumina células espermáticas individuales, el colorante puede emitir fluorescencia. Se puede entonces logara una clasificación de las células espermáticas de acuerdo con una característica del sexo, tal vez mediante el reconocimiento de que las células espermáticas que portan un cromosoma X tienen más ADN que las células espermáticas que portan un cromosoma Y, por lo tanto, posiblemente, emitiendo más luz fluorescente cuando son excitadas por un láser y tal vez permitiendo que la célula sea identifica y separada.

Otro ejemplo de la manipulación humana puede implicar, quizás, la congelación de células espermáticas para su uso en un momento posterior. La congelación de células espermáticas a menudo puede ser crítica para el uso eficaz de células espermáticas, porque la congelación puede preservar, al menos en cierta medida, la viabilidad de las células espermáticas durante un período de tiempo que se prolonga más allá de un punto en el que dicha viabilidad, de lo contrario, puede llegar a verse típicamente comprometida. Tal extensión de la viabilidad de células espermáticas puede lograrse en técnicas de congelación, tal vez ralentizando el metabolismo de las células espermáticas y quizás prolongando su vida útil de manera correspondiente. En particular, tal vez puede conocerse que el metabolismo de células espermáticas se puede disminuir en torno a un 50% aproximadamente por cada 10 grados Celsius a los que se enfría una célula espermática. Además, las células espermáticas congeladas se pueden envasar en formatos convenientes para aplicaciones particulares, por ejemplo tal vez como pajas congelados, gránulos congelados, u otras formas de muestras artificiales congeladas. Células espermáticas congeladas también pueden prestarse por sí mismas a transporte a lo largo de grandes distancias, por ejemplo tal como en un centro de recogida de células espermáticas, centro de dilución de células espermáticas y las instalaciones de la inseminación artificial pueden estar muy dispersadas en diferentes lugares.

Se puede apreciar que la separación de esperma de su entorno natural puede separarlo de mecanismos de apoyo naturales que mantienen su viabilidad. Extendedores de células espermáticas pueden actuar para restaurar al menos un grado de ese apoyo a las células espermáticas. Por ejemplo, una función de los extendedores de células espermáticas puede ser para tamponar las células espermáticas, por ejemplo tal vez mediante el ajuste del pH o la osmolalidad de un medio en el que se colocan las células espermáticas. Otra función de los extendedores de células espermáticas quizá pueda ser la de proporcionar nutrientes a las células espermáticas o para servir como una fuente de energía de las células espermáticas. En aplicaciones de congelación, una función adicional puede ser para servir como un crioprotector para minimizar los efectos adversos de la congelación sobre células espermáticas. Se puede apreciar que tales funciones de los extendedores de células espermáticas pueden llevarse a cabo, al menos en cierto grado, por las partes constituyentes que componen cualquier extendedor de célula espermática individual.

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Por ejemplo, el contenido de proteínas puede ser una parte constituyente utilizada con frecuencia de diversos tipos de extendedores de células espermáticas. El contenido de proteínas puede cumplir una o más funciones en un extendedor de células espermáticas. Un propósito principal del contenido de proteínas puede ser proporcionar nutrientes y tal vez servir como una fuente de energía para las células espermáticas. Sin embargo, algunos tipos de proteínas también pueden tener una función crioprotectora, por ejemplo, tal vez el uso de lipoproteínas para reemplazar los lípidos perdidos de las membranas de las células espermáticas, lo cual puede ser debido a un proceso de congelación. Además de ello, el contenido de proteínas en los extendedores de células espermáticas puede adoptar una diversidad de formas. Alguna parte del contenido de proteínas puede ser de base vegetal, por ejemplo lecitina derivada de la soja. Otro contenido de proteína puede ser de base animal, por ejemplo, tal vez la yema de huevo derivada de fuentes que incluyen huevos de gallina común.

Los crioprotectores también pueden ser un ejemplo de una parte constituyente utilizado con frecuencia de diversos tipos de extendedores de células espermáticas. Además de ello, los crioprotectores pueden adoptar una diversidad de formas en extendedores de células espermáticas. Un crioprotector comúnmente utilizado puede ser glicerol. El glicerol puede proteger a las células espermáticas durante un proceso de congelación, tal vez mediante la unión a agua contenida dentro y que rodea a una célula espermática, resultando tal vez en la deshidratación de la célula espermática y, por consiguiente reduciendo tal vez la formación de hielo intracelular que puede causar daño a la célula espermática. Sin embargo, utilizando glicerol para crioproteger células espermáticas también puede implicar ciertas desventajas. Por ejemplo, glicerol puede suponer al menos un grado de toxicidad para las células espermáticas, volviéndose más pronunciado el efecto con grandes cantidades de glicerol. Además, el glicerol puede ser hiperosmótico para las células espermáticas, lo cual puede resultar en un grado de choque para las células espermáticas a las que se ha añadido glicerol. En particular, dichas propiedades hiperosmóticas de glicerol pueden provocar que una célula espermática entre en contacto con glicerol para contraerse o expandirse rápidamente como resultado de una diferencia en la concentración de soluto a través de la membrana de la célula espermática. Dicha contracción y expansión rápidas tal vez pueden causar daño a una célula espermática.

Por consiguiente, se pueden haber desarrollado ciertos procedimientos para extendedores de células espermáticas para reducir al mínimo los efectos adversos de glicerol sobre las células espermáticas. Por ejemplo, como una cuestión práctica, puede quizás reconocerse que la combinación de glicerol con células espermáticas a temperaturas reducidas puede reducir los efectos tóxicos de glicerol en las células espermáticas. Por consiguiente, extendedores de células espermáticas utilizando glicerol se pueden preparar a menudo en un proceso de múltiples etapas que implica dos o más fracciones de extendedor. Más particularmente, determinados extendedores de células espermáticas pueden contener una fracción “A” sin glicerol y una fracción "B" con glicerol. Esto puede permitir que un extendedor de célula espermática sea preparado en dos o más etapas, por ejemplo, una primera etapa en la que las células espermáticas se pueden añadir a la fracción A de un extendedor de células espermáticas, quizás a la temperatura ambiente, seguido por una segunda etapa en la que las células espermáticas añadidas a la fracción A se enfrían a una temperatura más baja, y la fracción B que contiene glicerol se añade a dicha temperatura inferior. Además de ello, para mitigar los efectos hiperosmóticos de glicerol en las células espermáticas, la fracción B tal vez pueda ser añadida en múltiples etapas, posiblemente con el fin de reducir el choque para las células espermáticas, sometiendo éstas a cantidades reducidas de glicerol en cada etapa de glicerol añadida. El número de etapas en las que el glicerol puede ser añadido puede variar de quizás tan sólo dos etapas o cuatro etapas a tal vez un gran número de etapas, incluyendo quizás la adición de glicerol gota a gota durante un período de tiempo.

Sin embargo, la interacción de glicerol con otros componentes de extendedores de células espermáticas en tales procedimientos puede implicar desventajas significativas. En particular, los componentes proteicos de extendedores de células espermáticas tales como la yema de huevo pueden implicar complicaciones para el manejo de tales extendedores cuando están presentes en la fracción B. Esto puede ser debido al depósito volumétrico que tales componentes proteicos crean en un extendedor de células espermáticas. Este fenómeno tal vez puede ser resaltado por el uso de yema de huevo en la fracción B de un extendedor de célula espermática que requiere centrifugación. La centrifugación puede ser una técnica comúnmente utilizada en diversas aplicaciones de células espermáticas para concentrar las células espermáticas. Por ejemplo, en aplicaciones de citometría de flujo, el paso de las células espermáticas a través de un citómetro de flujo puede tender a diluir la concentración de células espermáticas a una concentración más baja que la encontrada en la naturaleza. Esto puede ser debido a que los citómetros de flujo típicamente pueden requerir un arrastre de las células espermáticas en un fluido de revestimiento, que puede añadir al volumen de material en el que las células espermáticas están contenidas. La centrifugación puede devolver las células espermáticas a una concentración más alta, quizás sometiéndolas a fuerzas centrífugas y concentrándolas en consecuencia. Sin embargo, la centrifugación de la fracción B de un extendedor de célula espermática que contiene yema de huevo puede ser problemática debido a que el depósito volumétrico de las lipoproteínas contenidas en la yema de huevo puede tender a compactar las células espermáticas que pueden estar presentes en la fracción B, tal vez con el resultado de la trituración o el daño de otro modo de estas células espermáticas.

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Como resultado de ello, tal vez sea necesario clarificar la fracción B de un extendedor de célula espermática que tiene un contenido en proteínas tal como yema de huevo. El objetivo de la clarificación puede ser para conferir un grado menor y más uniforme de densidad de un extendedor de este tipo que contiene proteínas, quizás, en particular, mediante la eliminación de grumos o otras regiones localmente densas debido quizás a las concentraciones de proteína tales como componentes lipoproteicos de la yema de huevo, de modo que la centrifugación tal vez pueda llevarse a cabo sin compactar de manera adversa las células espermáticas. La clarificación puede lograrse por cualquiera de diversos métodos adecuados, por ejemplo, tal vez por filtración. Sin embargo, todas las formas de clarificación pueden requerir una dedicación de recursos a lograr. Por ejemplo, la clarificación puede implicar costos de materiales, tales como filtros u otros dispositivos necesarios, costos de mano de obra que puede inmovilizar recursos de personal que de otro modo podrían ser dedicados a otro lugar, costos de tiempo que pueden ralentizar un proceso de dilución de células espermáticas y costos financieros relacionados con todos lo anterior.

Además de ello, simplemente preparando una fracción B de un extendedor de células espermáticas para que tenga un contenido de proteínas tal como la yema de huevo puede implicar un grado de inconvenientes inherentes. De manera similar a la clarificación, la preparación de una fracción B de este tipo puede implicar costos de materiales, costos de mano de obra, costos de tiempo y costos financieros. Además de ello, la tendencia hacia la expoliación con el tiempo debido al contenido de proteínas de una fracción B de este tipo puede complicar aún más su uso. En particular, debido a que una fracción B de este tipo no puede seguir así, se puede requerir la preparación en una función de las necesidades, tal vez alterando los horarios y reduciendo la eficiencia que podrían lograrse si la fracción B de lo contrario se preparara en grandes cantidades antes de tiempo. Este inconveniente puede ser particularmente agudo en situaciones en las que una aplicación de células espermáticas puede requerir una relación relativamente alta de fracción B a fracción A. Las tendencias expoliación de dicha fracción B también pueden suponer un riesgo de contaminación, por ejemplo, dado que la fracción B quizá puede contaminarse con bacterias debido al expolio, lo que puede afectar negativamente a una aplicación de células espermáticas en la que inadvertidamente se puede utilizar la fracción B contaminada. Tendencias de expoliación de este tipo también pueden limitar el uso de dicha fracción B en situaciones en las que las condiciones ambientales no pueden ser vigiladas estrechamente, por ejemplo, como en las que puede ser deseable transportar la fracción B de un lugar a otro, tal vez a lo largo de una gran distancia.

Los problemas anteriores con respecto a extendedores de células espermáticas convencionales pueden representar una necesidad percibida durante tiempo de una solución efectiva para la misma. Aun cuando pueden haber estado disponibles elementos de implementación, pueden haber faltado en cierta medida intentos reales para satisfacer esta necesidad. Esto puede haber sido debido a un fallo de los que tienen una experiencia ordinaria en la técnica para apreciar plenamente o entender la naturaleza de los problemas y desafíos implicados. Como resultado de esta falta de comprensión, los intentos de satisfacer estas necesidades percibidas durante tiempo pueden no haber logrado resolver efectivamente uno o más de los problemas o desafíos aquí identificados. Estos intentos pueden incluso haber dejado apartadas las direcciones técnicas adoptadas por la actual tecnología inventiva e incluso pueden dar lugar a considerar los logros de la actual tecnología inventiva en cierta medida como un resultado inesperado del enfoque adoptado por algunos en el sector.

La tecnología de la invención se refiere a un método para congelar células espermáticas clasificadas de acuerdo con la reivindicación 1.

La presente tecnología de la invención incluye una diversidad de aspectos, que pueden combinarse de diferentes maneras. Las siguientes descripciones se proporcionan para enumerar elementos y describir las realizaciones de la presente tecnología inventiva.

La presente invención se refiere a un método para la congelación de células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación. Se puede entender que el evento de clasificación incluya cualquiera de una diversidad de eventos en los que células espermáticas se clasifican en base a una discriminación de las características retenidas por dichas células espermáticas, que pueden incluir en diversas realizaciones de técnicas de inmunosexo, técnicas de flotabilidad, o tal vez incluso técnicas de citometría de flujo. El término comprometido puede entenderse que incluye cualquier efecto de un evento de clasificación que pueden tender a afectar adversamente cualquier aspecto deseado para el que se pueden usar las células espermáticas, incluyendo, por ejemplo, la viabilidad de las células espermáticas, la fecundidad de las células espermáticas o tal vez incluso la longevidad de las células espermáticas. El término congelación puede entenderse que incluye cualquier técnica para la preservación de las células espermáticas que incluye reducir su temperatura por debajo de 0 grados Celsius, al menos en algún punto en la técnica.

Además de ello, la presente invención implica obtener una pluralidad de células espermáticas, sometiendo a dicha pluralidad de células espermáticas a tensiones de clasificación, y seleccionando dicha pluralidad de células

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espermáticas para una característica deseada. Por el término obtener se puede entender que se puede utilizar cualquiera de las diversas técnicas conocidas para la obtención de células espermáticas, por ejemplo tal vez incluyendo técnicas manuales o técnicas que implican una vagina artificial. La expresión tensiones de clasificación puede ser entendida como tensiones que las células espermáticas pueden experimentar como resultado de un evento de clasificación, y someter las células espermáticas a tensiones de clasificación puede incluir quizá simplemente lograr un evento de clasificación.

Un extendedor de célula espermática que contiene yema de huevo puede añadirse a una pluralidad de células espermáticas seleccionadas en algunas realizaciones para formar una primera mezcla de células espermáticas extendida. La expresión extendedor de célula espermática puede ser entendido como que incluye una sustancia que confiere al menos cierto grado de función de mantenimiento a las células espermáticas. Tales tipos de función de mantenimiento pueden incluir, por ejemplo, que sirve para tamponar células espermáticas, proporcionando nutrientes a las células espermáticas, o tal vez incluso actuando como un crioprotector para las células espermáticas. Puede apreciarse que se conocen diversos tipos de extendedores de células espermáticas, incluyendo tal vez extendedores basados en yema de huevo, extendedores a base de leche, extendedores con contenido en citrato, extendedores con contenido en citrato de sodio, extendedores con contenido en Tris y extendedores con contenido en TEST. Además, la expresión primera mezcla de células espermáticas extendida puede entenderse que incluye la combinación de un extendedor de célula espermática que contiene yema de huevo con una pluralidad de células espermáticas seleccionadas.

La presente invención implica, además, enfriar una primera mezcla de células espermáticas extendida para crear una primera mezcla enfriada de células espermáticas extendida. El término enfriar puede entenderse que incluye la reducción de la temperatura de una primera mezcla de células espermáticas extendida a cualquier temperatura por encima de 0 grados Celsius. El enfriamiento puede llevarse a cabo tal vez por cualquiera de diversas técnicas bien conocidas, tales como quizás refrigeración, baños de agua o baños de hielo. En la presente invención, la primera mezcla de células espermáticas extendida se enfría quizás a menos de 10 grados Celsius, quizás a menos de aproximadamente 9 grados Celsius, a menos de aproximadamente 8 grados Celsius, a menos de aproximadamente 7 grados Celsius, a menos de aproximadamente 6 grados Celsius, a menos de aproximadamente 5 grados Celsius, a menos de aproximadamente 4 grados Celsius, a menos de aproximadamente 3 grados Celsius, a menos de aproximadamente 2 grados Celsius, o quizás incluso a menos de aproximadamente 1 grado Celsius. Determinadas realizaciones pueden implicar enfriar una primera mezcla de células espermáticas extendida a aproximadamente 5 grados Celsius. Además de ello, un extendedor de células espermáticas libre de proteínas, con contenido en crioprotector se añade a dicha primera mezcla de células espermáticas extendida en algunas realizaciones para formar una segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida. La expresión segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida se entiende que incluye la combinación de dicha primera mezcla enfriada de células espermáticas extendida con un extendedor de este tipo de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas. La presente invención incluye también congelar una segunda mezcla de células espermáticas extendida.

La primera mezcla de células espermáticas extendida contiene un porcentaje de yema de huevo. Esto puede ser una función, por ejemplo, de la cantidad de proteína contenida dentro de un extendedor de célula espermática que contiene proteínas añadido a una pluralidad de células espermáticas seleccionadas, en donde una proteína de este tipo puede ser yema de huevo. En diversas realizaciones, el porcentaje de yema de huevo contenida dentro de una primera mezcla de células espermáticas extendida puede incluir más de aproximadamente 0,8 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 1,6 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 3,2 por ciento de yema de huevo o tal vez incluso más de aproximadamente 6,4 por ciento de yema de huevo. Algunas realizaciones pueden incluir un porcentaje de yema de huevo contenida dentro de una primera mezcla de células espermáticas extendida de aproximadamente 3,2 por ciento.

Además de ello, la segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida también contiene un porcentaje de yema de huevo. Éste es una función tal vez de un efecto de dilución de añadir un extendedor de célula espermática que contiene crioprotector, libre de proteínas, a la primera mezcla enfriada de células espermáticas extendida. El porcentaje de yema de huevo contenida dentro de una segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida puede incluir más de 0,4 por ciento de yema de huevo a 3,2 por ciento de yema de huevo. Algunas realizaciones pueden incluir un porcentaje de yema de huevo contenida con una segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida de más de aproximadamente 0,8 por ciento de yema de huevo, más de 1,6 por ciento de yema de huevo o aproximadamente 1,6 por ciento.

En la presente invención, la segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida puede mantenerse en un estado no clarificado. En el mantenimiento de la segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida en un estado no clarificado, se entiende que dicha segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida puede no ser sometida a clarificación antes de cualquier etapa de centrifugación. Además de ello, la presente invención implica someter a centrifugación a la mezcla enfriada de células espermáticas extendida. Esta centrifugación puede

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servir quizás para concentrar las células espermáticas contenidas dentro de dicha segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida, quizás separando estas células espermáticas de otros componentes de la segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida sobre una base de densidad debido a la aplicación de la fuerza centrífuga a las células espermáticas. Diversas realizaciones pueden implicar, además, decantar una porción de dicha segunda mezcla enfriada de células espermáticas extendida centrifugada. Por ejemplo, células espermáticas concentradas por centrifugación se pueden concentrar en gran medida dentro de una zona, y la separación de una sección volumétrica quizás pueda incluir la separación de la sección volumétrica que contiene tales células espermáticas concentradas o tal vez incluso la separación de todas las secciones volumétricas que no incluyen tales células espermáticas concentradas.

La presente invención implica un método para extender células espermáticas comprometidas por un evento de clasificación. El término extender puede entenderse que incluye conferir a las células espermáticas al menos una o más de las funcionalidades de un extendedor de células espermáticas.

Además de ello, la invención incluye obtener una pluralidad de células espermáticas de este tipo, sometiendo a una pluralidad de estas células espermáticas a tensiones de clasificación y seleccionando una pluralidad de células espermáticas para una característica deseada. La presente invención incluye, además, establecer un extendedor de células espermáticas con contenido en yema de huevo que contiene una proteína que tiene un primer valor del contenido de proteína. Un primer valor del contenido en proteínas de este tipo puede entenderse que incluye el contenido en proteínas de un extendedor de células espermáticas con contenido en yema de huevo establecido de este tipo antes de cualesquiera eventos subsiguientes que puedan alterar un contenido en proteínas de este tipo.

La presente invención incluye también añadir una pluralidad de células espermáticas sometidas a tensiones de clasificación y seleccionadas por una característica deseada a un extendedor de células espermáticas con contenido en yema de huevo que tiene un primer valor del contenido de proteínas y también añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector, libre de proteínas a dicho extendedor de células espermáticas con contenido en yema de huevo que tiene un primer valor de contenido de proteínas. En diversas realizaciones, añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector, libre de proteínas a un extendedor de células espermáticas con contenido de proteínas que tiene un primer valor de contenido de proteínas se puede conseguir a una temperatura fresca. Esta temperatura fresca puede incluir menos de aproximadamente 10 grados Celsius, menos de aproximadamente 9 grados Celsius, menos de aproximadamente 8 grados Celsius, menos de aproximadamente 7 grados Celsius, menos de aproximadamente 6 grados Celsius, menos de aproximadamente 5 grados Celsius, menos de aproximadamente 4 grados Celsius, menos de aproximadamente 3 grados Celsius, menos de aproximadamente 2 grados Celsius o quizás incluso menos de aproximadamente 1 grado Celsius. Determinadas realizaciones pueden implicar añadir un extendedor de células espermáticas libres de proteínas a un extendedor de células espermáticas que contienen proteínas que tiene un primer valor de contenido de proteínas a aproximadamente 5 grados Celsius.

Además de ello, la presente invención incluye, además, reducir un contenido total en proteínas de un extendedor de células espermáticas que contienen proteínas que tiene un primer valor de contenido de proteínas a un segundo valor de contenido de proteínas por debajo de dicho primer valor de contenido de proteínas. Un contenido total en proteínas quizás simplemente puede ser la cantidad total de proteínas en un extendedor de células espermáticas que contienen proteínas en cualquier tiempo dado, y la expresión reducir un contenido total en proteínas puede entenderse que incluye cualquiera de diversos métodos adecuados para conseguir una reducción de este tipo, que incluye quizás separar directamente el contenido de proteínas o quizás simplemente aumentar la cantidad de componentes no proteicos en un extendedor de células espermáticas que contienen proteínas.

Un primer valor de contenido de proteínas en algunas realizaciones puede incluir un porcentaje de yema de huevo, por ejemplo, en donde dicha proteína puede ser yema de huevo. En diversas realizaciones dicho porcentaje de yema de huevo puede incluir más de aproximadamente 0,8 por ciento yema de huevo, más de aproximadamente 1,6 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 3,2 por ciento de yema de huevo, o tal vez incluso más de aproximadamente 6,4 por ciento de yema de huevo. Algunas realizaciones pueden incluir un porcentaje de yema de huevo de aproximadamente 3,2 por ciento.

Además, la reducción de un contenido de proteína total a un segundo valor del contenido de proteínas por debajo de un primer valor de dicho contenido de proteínas incluye reducir un porcentaje de yema de huevo de dicho extendedor de células espermáticas que contienen proteínas. Esta es una función, quizás, de un efecto de dilución de añadir una pluralidad de células espermáticas y añadir un extendedor de células espermáticas libres de proteínas a un extendedor de células espermáticas que contienen proteínas. El porcentaje de yema de huevo de un segundo valor de contenido de proteínas incluye más de aproximadamente 0,4 por ciento de yema de huevo a aproximadamente 3,2 por ciento de yema de huevo, preferiblemente más de aproximadamente 0,8 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 1,6 por ciento de yema de huevo. En algunas realizaciones un porcentaje

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de yema de huevo de este tipo de un segundo valor de contenido de proteína puede ser de aproximadamente 1,6 por ciento.

En la presente invención, el extendedor de células espermáticas que contiene proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteína se puede mantener en un estado no clarificado. En el mantenimiento de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteína en un estado no clarificado se puede entender que un extendedor de células espermáticas que contienen proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteína puede no estar sujeto a clarificación antes de cualquier etapa de centrifugación. Además de ello, la presente invención implica someter a centrifugación un extendedor de células espermáticas que tiene un segundo valor de contenido de proteínas. Esta centrifugación tal vez puede servir para concentrar las células espermáticas contenidas dentro de un extendedor de células espermáticas que contienen proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteína, tal vez mediante la separación de tales células espermáticas de otros componentes de un extendedor de célula espermática que contiene proteína que tiene un segundo valor de contenido de proteína sobre una base de densidad debido a la aplicación de la fuerza centrífuga a las células espermáticas. Diversas realizaciones pueden implicar, además, decantar una porción de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas centrifugado que tiene un segundo valor de contenido de proteína. Por ejemplo, las células espermáticas, concentradas por centrifugación, se pueden concentrar en gran medida dentro de una zona, y la separación de una sección volumétrica quizás puede incluir la separación de la sección volumétrica que contiene tales células espermáticas concentradas o tal vez incluso la separación de todas las secciones volumétricas que no incluyen tales células espermáticas concentradas.

La presente invención incluye también la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas suplementario a un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteínas de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas a un tercer valor de contenido de proteínas mayor que un primer valor del contenido de proteínas. La expresión extendedor de células espermáticas que contiene proteínas suplementario ha de entenderse que incluye cualquier extendedor de células espermáticas que contiene proteínas adicional que complementa un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteínas.

El término suplementario puede entenderse que incluye la adición de componentes adicionales del extendedor de células espermáticas, por ejemplo tal vez añadiendo una cantidad adicional de proteínas.

Además, el aumento de un contenido total de proteínas a un tercer valor de contenido de proteínas incluye el aumento de un porcentaje de yema de huevo de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas de este tipo. Esto puede ser una función, tal vez, de la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas suplementario a un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteínas. En la presente invención, el porcentaje de yema de huevo de un tercer valor de contenido de proteínas incluye más de aproximadamente 1 por ciento de yema de huevo a 50 por ciento de yema de huevo, preferiblemente más de aproximadamente 5 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 10 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 15 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 20 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 25 por ciento de yema de huevo. En algunas realizaciones un porcentaje de yema de huevo de un tercer valor de contenido de proteínas puede ser de aproximadamente 16,5 por ciento. Además de ello, la presente invención incluye congelar un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas que tiene un tercer valor de contenido de proteínas superior a un primer valor de contenido de proteína.

En diversas realizaciones una pluralidad de células espermáticas puede incluir tal vez una pluralidad de células espermáticas de mamífero, incluyendo, por ejemplo, tal vez, una pluralidad de células espermáticas bovinas, una pluralidad de células espermáticas equinas, una pluralidad de células espermáticas porcinas, una pluralidad de células espermáticas ovinas, una pluralidad de células espermáticas de cérvidos, una pluralidad de células espermáticas caninas, o quizás incluso una pluralidad de células espermáticas de delphinidae. Además de ello, algunas realizaciones pueden implicar la selección de una pluralidad de células espermáticas de este tipo para una característica deseada. El término selección se puede entender que incluye la identificación de células espermáticas individuales sobre la base de una determinación en cuanto a si poseen o no un ser característica deseada pretendida. En algunas realizaciones, la selección de células espermáticas para una característica deseada puede incluir la clasificación de células espermáticas. El término clasificación puede ser entendido que incluye actuar para separar células espermáticas seleccionadas que tienen una característica deseada de células espermáticas que no tienen esa característica deseada, tal vez incluyendo en poblaciones de células espermáticas con una característica deseada de este tipo y poblaciones de células espermáticas sin esa característica deseada. La clasificación de células espermáticas pueden llevarse a cabo mediante cualquiera de una diversidad de técnicas adecuadas, incluyendo tal vez técnicas de inmunosexo, técnicas de flotabilidad, o tal vez incluso técnicas de citometría de flujo. Adicionalmente, la expresión característica deseada puede ser entendida que incluye cualquier característica

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identificable de una célula espermática deseada para una aplicación dada de células espermáticas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una característica deseada puede incluir una característica de sexo de una célula espermática, tal vez incluso una característica portadora del cromosoma X de una célula espermática o una característica portadora del cromosoma Y de una célula espermática.

La expresión extendedor de células espermáticas que contiene proteínas en diversas realizaciones puede ser entendida que incluye cualquier extendedor de células espermáticas que contiene al menos algún grado de contenido de proteínas. Además de ello, en diversas realizaciones un extendedor de células espermáticas puede incluir quizás un contenido de proteínas de origen vegetal o tal vez un contenido de proteína de origen animal, que puede ser entendido que incluye proteínas derivadas de fuentes vegetales y de fuentes animales, respectivamente. En determinadas realizaciones, un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas de origen animal tal vez puede incluir un extendedor de células espermáticas que contiene lipoproteínas. Se puede apreciar que las lipoproteínas pueden ser quizás una subclase de proteínas en las que al menos un componente de esas proteínas es un lípido. Un contenido de lipoproteínas de este tipo tal vez puede derivarse de diversas fuentes animales, incluyendo tal vez la yema de huevo recogida de diversos tipos de huevos de animales, quizás incluyendo huevos de gallina.

El extendedor de células espermáticas que contiene proteínas tal vez incluye un extendedor de células espermáticas que contiene yema de huevo. Se puede apreciar que el contenido de yema de huevo preciso de un extendedor de células espermáticas que contiene yema de huevo se puede variar dependiendo de las necesidades de una aplicación particular para la cual se pueden utilizar las células espermáticas. Sin embargo, en algunas realizaciones un contenido de yema de huevo de un extendedor de células espermáticas que contiene yema de huevo puede incluir menos de aproximadamente 50 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 45 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 40 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 35 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 30 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 25 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 20 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 15 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 10 por ciento yema de huevo, o quizás incluso menos de aproximadamente 5 por ciento yema de huevo. En determinadas realizaciones, un contenido de yema de huevo de un extendedor de células espermáticas que contiene yema de huevo puede ser de aproximadamente 20 por ciento de yema de huevo.

Está incluido un crioprotector como una parte constituyente de un extendedor de células espermáticas. Por consiguiente, un extendedor de células espermáticas incluye tal vez un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas o tal vez incluso un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector que contiene proteínas. Puede apreciarse que los diversos crioprotectores bien conocidos tal vez pueden ser apropiados para una adición a un extendedor de células espermáticas de este tipo. En diversas realizaciones, un crioprotector de este tipo quizás puede incluir glicerol. Se puede apreciar que el contenido preciso de glicerol de un extendedor de células espermáticas que contiene glicerol se puede variar dependiendo de las necesidades de una aplicación particular para la cual se pueden utilizar las células espermáticas. Sin embargo, en algunas realizaciones un extendedor de células espermáticas que contiene glicerol puede tener más de aproximadamente 3 por ciento de glicerol, más de aproximadamente 6 por ciento de glicerol, más de aproximadamente 12 por ciento de glicerol, o tal vez incluso más de aproximadamente 24 por ciento de glicerol. En determinadas realizaciones, un contenido de glicerol de un extendedor de células espermáticas que contiene glicerol-puede ser de aproximadamente 6 por ciento.

Además de ello, en ciertas realizaciones que contiene un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas, se añade a una sustancia en un volumen igual a esa sustancia, tal vez incluyendo lograr dicha adición en múltiples etapas. Por ejemplo, la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas a una primera mezcla de células espermáticas extendida enfriada puede implicar la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas que tiene un volumen igual a un volumen de esa primera mezcla de células espermáticas extendida enfriada, tal vez en dos o más etapas. De manera similar, la combinación de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas y un extendedor de células espermáticas libre de proteínas puede implicar la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas en un volumen igual a un volumen de un extendedor de células espermáticas libre de proteínas, tal vez en dos o más etapas. Además, la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas a un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas puede implicar la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas que tiene un volumen igual a un volumen de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas, tal vez en dos o más etapas.

Un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas en determinadas realizaciones puede incluir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad. Por 15

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consiguiente, en algunas realizaciones la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas a una primera mezcla de células espermáticas extendida enfriada puede implicar la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad a esa primera mezcla de células espermáticas extendida enfriada. Además, en algunas realizaciones el proporcionar un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas puede implicar proporcionar un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad. También, en algunas realizaciones la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas a un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas puede implicar la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad a ese extendedor de células espermáticas que contiene proteínas.

La expresión gradiente de baja densidad puede entenderse que incluye un extendedor de células espermáticas que tiene variaciones mínimas de densidad a lo largo de su volumen. En algunas realizaciones, un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad puede incluir quizás un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector sustancialmente líquido. La expresión sustancialmente líquido puede entenderse que incluye un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector en el que todas las partes constituyentes de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de este tipo están en un estado sustancialmente líquido. En diversas realizaciones, un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad puede incluir quizás un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector eficiente para la centrifugación. La expresión eficiente para la centrifugación puede entenderse que incluye un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector con propiedades que conducen a la centrifugación, por ejemplo, tal vez incluyendo diferencias de densidad claramente demarcadas de sus partes constitutivas o tal vez incluso una carencia de las regiones de mayor densidad localizadas que pueden suponer un riesgo de compactación para algunas de sus partes constituyentes. En diversas realizaciones, un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad puede incluir quizás un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de densidad sustancialmente uniforme, que puede entenderse que incluye un número mínimo de zonas localizadas de mayor densidad, tal vez incluso no acercándose a zonas de mayor densidad localizada. En diversas realizaciones, un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de bajo gradiente de densidad puede incluir quizás un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de baja viscosidad. El término baja viscosidad puede entenderse que incluye una viscosidad de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector suficiente para permitir que sus partes constituyentes se deslicen una sobre otra sin que tiendan a la compactación de cualquier parte constituyente por cualquier otra parte constituyente.

Diversas realizaciones pueden incluir el ajuste de una concentración de células espermáticas de una sustancia a una concentración de células espermáticas de pre-congelación. La expresión concentración de células espermáticas de pre-congelación puede entenderse que incluye una concentración de células espermáticas en la que dichas células espermáticas se pueden congelar subsiguientemente. Por ejemplo, algunas realizaciones pueden incluir el ajuste de una concentración de células de una segunda mezcla de células espermáticas extendida enfriada a una concentración de células espermáticas de pre-congelación, mientras que otras realizaciones pueden implicar el ajuste de una concentración de células espermáticas de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteínas a una concentración de células espermáticas de pre-congelación. En diversas realizaciones, ajustar a una concentración de células espermáticas de pre-congelación puede incluir la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas, incluyendo, por ejemplo tal vez la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas a una segunda mezcla de células espermáticas extendida o tal vez la adición de un extendedor de células espermáticas proteínas suplementario que tiene un segundo valor de contenido de proteínas.

En diversas realizaciones, el ajuste de una concentración de células espermáticas a una concentración de células espermáticas de pre-congelación puede implicar el ajuste de una concentración de células espermáticas a una concentración de pre-congelación apropiada para las especies. La expresión concentración de células espermáticas de pre-congelación apropiada para las especies puede entenderse que incluye una concentración de células espermáticas a la que dichas células espermáticas pueden ser congeladas subsiguientemente, que sea apropiado para la especie animal de la que se obtuvieron dichas células espermáticas. Se puede apreciar que una concentración de pre-congelación de células espermáticas apropiada para las especies puede ser conocida para una diversidad de especies animales, o tal vez incluso puede determinarse mediante una observación empírica de rutina a lo largo de un número de eventos de congelación. En algunas realizaciones, una concentración de precongelación de células espermáticas apropiada para las especies puede incluir una concentración de precongelación de células espermáticas bovina, una concentración de pre-congelación de células espermáticas equinas, una concentración de pre-congelación de células espermáticas porcinas, una concentración de precongelación de células espermáticas ovinas, una concentración de pre-congelación de células espermáticas de cérvidos, una concentración de pre-congelación de células espermáticas caninas, o quizás incluso una

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concentración de pre-congelación de células espermáticas de delphinidae. Además de ello, en diversas realizaciones, una concentración de pre-congelación de células espermáticas apropiada para las especies puede incluir menos de aproximadamente 100 millones de células espermáticas por mililitro, menos de aproximadamente 50 millones de células espermáticas por mililitro, menos de aproximadamente 40 millones de células espermáticas por mililitro, menos de aproximadamente 30 millones de células espermáticas por mililitro, menos de aproximadamente 20 millones de células espermáticas por mililitro, menos de aproximadamente 15 millones de células espermáticas por mililitro, menos de aproximadamente 10 millones de células espermáticas por mililitro, menos de aproximadamente 5 millones de células espermáticas por mililitro, o tal vez incluso menos de aproximadamente 2 millones de células espermáticas por mililitro. En determinadas realizaciones, incluyendo quizás las que implican una concentración de células espermáticas de pre-congelación bovinas, una concentración de precongelación apropiada para las especies puede ser de aproximadamente 10 millones de células espermáticas por mililitro.

El ajuste de una concentración de células espermáticas a una concentración de células espermáticas de precongelación en algunas realizaciones puede incluir el establecimiento de un contenido de yema de huevo de precongelación. Por ejemplo, el ajuste de una concentración de células espermáticas de una segunda mezcla de células espermáticas extendida enfriada a una concentración de células espermáticas de pre-congelación puede incluir establecer un contenido de yema de huevo de pre-congelación de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendida. De manera similar, el ajuste de una concentración de células espermáticas de un extendedor de célula espermática que contiene proteínas que tiene un segundo valor de contenido de proteínas a una concentración de células espermáticas de pre-congelación puede incluir el establecimiento de un contenido de yema de huevo de pre-congelación de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas de este tipo. Un contenido de yema de huevo de pre-congelación puede entenderse que incluye tal vez simplemente un contenido de yema de huevo de una sustancia a una concentración de pre-congelación. En diversas realizaciones, un contenido de yema de huevo de pre-congelación puede incluir un contenido de yema de huevo dentro de un porcentaje del contenido de yema de huevo de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas. Un método típico de este tipo para la congelación de células espermáticas puede entenderse que incluye tal vez todos los métodos para la congelación de células espermáticas que no utilizan las nuevas técnicas descritas en esta memoria, y en particular puede incluir tal vez los métodos para la congelación de células espermáticas que pueden ser bien conocidos en la técnica. En diversas realizaciones, un contenido de yema de huevo de pre-congelación puede incluir tal vez dentro de aproximadamente 50 por ciento del contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas, dentro de aproximadamente 25 por ciento de contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificado, dentro de aproximadamente 20 por ciento de contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas, dentro de aproximadamente 15 por ciento de contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas, dentro de aproximadamente 10 por ciento de contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas, dentro de aproximadamente 5 por ciento de contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas, dentro de aproximadamente 2 por ciento de contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas, y tal vez incluso dentro de aproximadamente 1 por ciento de contenido de yema de huevo de pre-congelación de un método típico para la congelación de células espermáticas clasificadas.

Además de ello, en determinadas realizaciones un contenido de yema de huevo de pre-congelación tal vez se puede establecer en un valor absoluto de menos de aproximadamente 50 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 45 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 40 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 35 por ciento yema de huevo, menos de aproximadamente 30 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 25 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 20 por ciento de yema de huevo, menos de aproximadamente 15 por ciento yema de huevo, o quizás incluso menos de aproximadamente 10 por ciento yema de huevo. En algunas realizaciones, un contenido de yema de huevo de precongelación se puede establecer en aproximadamente 16,5 por ciento.

El uso de un extendedor de células espermáticas estéril puede estar implicado en determinadas realizaciones. Por ejemplo, en diversas realizaciones un extendedor de células espermáticas libre de proteína puede incluir un extendedor de células espermáticas libre de proteínas estéril, y un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas puede incluir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas estéril.

Diversas realizaciones pueden incluir una mezcla incipiente (1), que en diversas realizaciones quizás puede incluir una mezcla incipiente de células espermáticas comprometida. Una mezcla puede entenderse que incluye dos o más sustancias en un estado de ser mezclado, y una mezcla incipiente (1) puede entenderse que incluye una mezcla que

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está menos que completamente saturada con respecto a cualquiera de los dos componentes constituyentes capaces de ser mezclados. En diversas realizaciones, una mezcla incipiente (1) puede incluir quizás una mezcla que ha logrado menos de 50 por ciento de saturación, menos de 25 por ciento de saturación, menos de 10 por ciento de saturación, menos de 5 por ciento de saturación, menos de 2 por ciento de saturación, o tal vez incluso menos de 1 por ciento de saturación.

Algunas realizaciones pueden incluir dos o más sustancias nacientes en relación de mezcla incipiente. Una relación de mezcla incipiente puede entenderse que incluye dos o más sustancias relacionadas al existir juntas en una mezcla incipiente (1). Una sustancia naciente puede entenderse que incluye una sustancia que existe en menos de una combinación saturada con otra sustancia en relación de mezcla incipiente. Además de ello, una mezcla en algunas realizaciones puede incluir dos o más componentes nacientes, en donde dicho componente puede entenderse que es un componente de una mezcla incipiente (1). Por ejemplo, diversas realizaciones pueden incluir una pluralidad naciente de células espermáticas seleccionadas para una característica deseada (2) en relación de mezcla incipiente, un componente extendedor de células espermáticas libre de proteínas naciente en relación de mezcla incipiente (3), un componente de extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas naciente en relación de mezcla incipiente (4), o tal vez incluso un componente de extendedor de células espermáticas que contiene proteínas naciente en una relación de mezcla incipiente(5).

En algunas realizaciones, una sustancia naciente puede incluir una sustancia situada próxima en un estado sustancialmente sin combinar a al menos un componente de una mezcla incipiente (1). La expresión situadas próxima puede entenderse que incluye una ubicación de una sustancia naciente lo suficientemente cerca a un componente de una mezcla incipiente (1) de tal manera que permita una combinación de los dos. La expresión estado sustancialmente sin combinar puede entenderse que incluye la existencia de una sustancia naciente en un estado de combinación principalmente insaturada con un componente de este tipo de una mezcla incipiente (1), que puede incluir quizás que existe como más de 50 por ciento sin combinar, que existe como más de 75 por ciento sin combinar, que existe como más de 90 por ciento sin combinar, que existe como más de 95 por ciento sin combinar,

o tal vez incluso que existe como más de 99 por ciento sin combinar. Por ejemplo, diversas realizaciones pueden incluir una pluralidad de células espermáticas seleccionadas para un característica deseada situada en un estado sustancialmente sin combinar con al menos un componente de una mezcla incipiente (1), un componente extendedor de células espermáticas libre de proteínas situado próximo en un estado sustancialmente sin combinar a al menos un componente de una mezcla incipiente (1), un componente extendedor de células espermáticas que contienen crioprotector libre de proteínas situado próximo en un estado sustancialmente sin combinar a al menos un componente de una mezcla incipiente (1), o tal vez incluso un componente extendedor de células espermáticas que contiene proteínas situado próximo en un estado sustancialmente sin combinar a al menos un componente de una mezcla incipiente (1).

Además de ello, determinadas realizaciones pueden incluir una zona libre de obstáculos entre una sustancia naciente y un componente de una mezcla incipiente (1). Una zona libre de obstáculos de este tipo puede entenderse que incluye una zona que no contiene elementos que pueden tender a evitar la combinación de una sustancia naciente de este tipo y un componente de una mezcla incipiente (1) de este tipo. Algunas realizaciones pueden incluso implicar una fuerza de combinación inducida a la que pueden ser sensibles una sustancia naciente y un componente de una mezcla incipiente (1). Una fuerza de combinación inducida de este tipo puede entenderse que incluye cualquier fuerza que tiende a inducir una combinación de dos o más sustancias en una relación de mezcla incipiente. Ejemplos de una fuerza de combinación inducida pueden incluir quizá una fuerza relacionada con la densidad, una fuerza relacionada con la concentración, o quizás simplemente incluso fuerzas hidrodinámicas simples generadas por la colocación de diversos líquidos en un recipiente. El término sensible puede entenderse que incluye cualquier efecto sobre una sustancia o componente de una mezcla incipiente (1) provocada por una fuerza tal combinación inducida de este tipo.

Además de ello, una mezcla incipiente (1) en algunas realizaciones puede contener un contenido de yema de huevo. Esto puede ser una función, por ejemplo, de la cantidad de proteína en un componente extendedor de células espermáticas que contiene proteínas naciente, quizás en donde dicha proteína puede ser yema de huevo. En diversas realizaciones, el porcentaje de yema de huevo contenida dentro de una mezcla incipiente puede incluir más de aproximadamente 0,4 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 0,8 por ciento de yema de huevo, más de aproximadamente 1,6 por ciento de yema de huevo, o tal vez incluso más de aproximadamente 3,2 por ciento de yema de huevo. Algunas realizaciones pueden incluir un porcentaje de yema de huevo contenido con una mezcla incipiente (1) de aproximadamente 1,6 por ciento.

En diversas realizaciones, una mezcla incipiente (1) puede incluir una mezcla incipiente (1) sin clarificar. Diversas realizaciones pueden incluir también una mezcla incipiente fría. En algunas realizaciones, una mezcla incipiente fría puede ser una mezcla incipiente (1) a una temperatura de menos de aproximadamente 10 grados Celsius, de menos de aproximadamente 9 grados Celsius, de menos de aproximadamente 8 grados Celsius, de menos de

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aproximadamente 7 grados Celsius, de menos de aproximadamente 6 grados Celsius, de menos de aproximadamente 5 grados Celsius, de menos de aproximadamente 4 grados Celsius, de menos de aproximadamente 3 grados Celsius, de menos de aproximadamente 2 grados Celsius, o quizás incluso de menos de aproximadamente 1 grado Celsius. Además, en algunas realizaciones, una mezcla incipiente fría puede ser una mezcla a aproximadamente 5 grados Celsius.

Varias ventajas pueden asistir a la tecnología inventiva. En particular, el uso de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas puede representar una mejora significativa frente a anteriores extendedores de células espermáticas. Por ejemplo, la adición de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas de este tipo a otros extendedores de células espermáticas puede reducir grumos u otras regiones localmente densas, debido quizás a bajas concentraciones de tales proteínas, quizás incluyendo la yema de huevo. Esto puede reducir o incluso eliminar la compactación de células espermáticas en determinadas aplicaciones, por ejemplo la centrifugación, que puede causar daño a las células espermáticas. Adicionalmente, la reducción de tales grumos en un extendedor de células espermáticas puede eliminar la necesidad de clarificar un extendedor de este tipo, lo cual resulta en el ahorro de materiales relacionados, el ahorro de mano de obra, el ahorro de tiempo y el ahorro económico. Además, un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas puede ser menos susceptible a los efectos de la expoliación. Esto puede permitir que un extendedor de células espermáticas de este tipo se prepare en grandes cantidades antes de tiempo, y no en función de las necesidades. Adicionalmente, la mitigación de los efectos de expoliación puede reducir el riesgo de contaminación por parte de bacterias. Además, debido a que un extendedor de células espermáticas de este tipo tal vez puede ser menos sensible a las condiciones ambientales, puede ser más capaz de ser transportado a lo largo de grandes distancias en donde las condiciones ambientales pueden variar.

Por consiguiente, un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas de este tipo puede ser una fracción B efectiva de un extendedor de células espermáticas en diversas aplicaciones. Además de ello, puede ser que el uso de un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas de este tipo puede no impactar significativamente de manera negativa sobre la eficacia de un extendedor de células espermáticas en el que se utiliza. Por ejemplo, en realizaciones relacionadas con técnicas de inseminación artificial, el uso de un extendedor de células espermáticas de este tipo tal vez puede proporcionar resultados que no son significativamente diferentes de los conseguidos con el uso de extendedores de células espermáticas típicos. En particular, las tasas de embarazo logradas con un extendedor de células espermáticas de este tipo en diversas realizaciones tal vez pueden ser equiparables a las conseguidas con extendedores de células espermáticas típicos, incluyendo quizás incluso siendo estadísticamente equiparables (P> 0,05) en diversas realizaciones.

Ejemplo 1

Un posible procedimiento para la recogida y el procesamiento de esperma clasificado que implica una fracción B de un extendedor que contiene yema de huevo puede ser de la siguiente manera. Medio de captura Tris-A (2 ml) se puede depositar en un tubo Falcon de 50 ml. Esperma clasificado puede ser recogido en el tubo Falcon de 50 ml en el transcurso de aproximadamente 1 hora para un volumen total clasificado de 12,5 ml. Este volumen puede no contener glicerol y puede referirse como la fracción A. El porcentaje de yema de huevo en la fracción A para este ejemplo es 3,2% [(2-ml de “Captura”) / (volumen total de 12,5 ml) x (20% de “Captura” yema de huevo) = 3,2%)]. La mezcla de yema de huevo al 3,2% puede ser enfriada a 5ºC a lo largo de quizás 90 min. Tras el período de enfriamiento, un volumen igual de glicerol que contiene 20% de extendedor de yema de huevo (fracción B; 12% de glicerol) se puede añadir escalonadamente como 2 fracciones iguales a intervalos de quizás 15 min. Esperma clasificado refrigerado, ahora contenido en este ejemplo en un 11,6% de extendedor de yema de huevo AB [((12,5 ml de fracción A) x (3,2% de yema de huevo) + (12,5 ml de fracción B) x (20% de yema de huevo)) / 25 ml de volumen = 11,6% de yema de huevo total] se puede centrifugar para la concentración. Este método de añadir el extendedor que contiene glicerol a esperma enfriado puede evitar la sobre extensión de gránulos de esperma que pueden producirse cuando gotitas que no contienen esperma son quizás recogidas en el proceso de clasificación, si el gránulo de esperma se deja en demasiado volumen, y puede asegurar que el contenido final de glicerol sea siempre 6%. Un gránulo de 200 µl de esperma puede permanecer después de la separación del sobrenadante. Gránulos de esperma de un mismo macho pueden agruparse y puede determinarse el volumen total en peso. El número de esperma total clasificado puede ser determinado, tal vez con múltiples recuentos en el hemocitómetro, y la concentración de esperma del gránulo se puede ajustar a una concentración de congelación deseada, tal vez con 20% de extendedor de yema de huevo AB.

En este ejemplo, si la concentración de esperma en el volumen clasificado de 12,5 ml es 1 x 106 espermas/ml, lo que representa 12,5 x 106 espermas totales y la tasa de recuperación post-centrífuga es 85%, entonces la concentración de esperma en el gránulo de esperma de 200 µl es de  53 x 106 espermas/ml (10,6 x 106 espermas totales). Si se desea una concentración de congelación de 10 x 106 espermas/ml para esta metodología, entonces se pueden añadir 860 µl de 20% de extendedor de yema de huevo AB al gránulo de esperma de 200 µl. Basándose en este

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modelo, el porcentaje de yema de huevo final para congelar esperma clasificado es 18,4% [((gránulo de esperma de 0,200 ml) x (11,6% de yema de huevo) + (0,860 ml de extendedor AB) x (20% de yema de huevo)) / volumen total de 1,06 ml = 18,4% de yema de huevo final].

Utilizando el ejemplo anterior, pero sustituyendo el 0% de extendedor B de yema de huevo en lugar del 20% de

5 extendedor B de yema de huevo, el porcentaje de yema de huevo contenida en el volumen de 25 ml a ser centrifugado es 1,6% [((12,5 ml de fracción A) x (3,2% de yema de huevo) + (12,5 ml de fracción B) x (0% de yema de huevo)) volumen total / 25 ml = 1,6% de yema de huevo]. Si el gránulo de esperma en este ejemplo se ajusta a una concentración de congelación final de 10 x 106 espermas / ml con 20% de extendedor AB de yema de huevo, el porcentaje final de la yema de huevo es 16,5% [((gránulo de esperma 0,200 ml) x (1,6% de yema de huevo) + (0,860

10 ml de extendedor AB) x (20% de yema de huevo)) + volumen total de 1,06 ml = 16,5% de yema de huevo].

Por consiguiente, puede verse que el porcentaje final de la yema de huevo puede variar tal vez sólo ligeramente entre los dos diferentes extendedores de la fracción B. Cuando se utiliza el 0% de extendedor B de yema de huevo, el porcentaje de yema de huevo final puede ser menor cuanto más alta se desee la concentración de esperma (> 10 x 106 espermas / ml).

15 Ejemplo 2

Un ejemplo adicional se puede reseñar de la siguiente manera. El esperma se estudió a partir de primeros eyaculados obtenidos de 6 toros y el estudio se repitió tres veces. El esperma para este estudio no se clasificó, sino que fue sometido a la tinción Hoechst 33342 y dilución extrema como ocurre durante la clasificación. El objetivo fue comparar después de la descongelación la motilidad del esperma que recibió extendedor que contiene glicerol 20 (fracción B) con o sin yema de huevo. Un objetivo adicional fue identificar el contenido de glicerol óptimo necesario para el esperma clasificado. Por lo tanto, se estudió contenido final de glicerol de 3, 4, 5 y 6% tanto 0 como en 20% de extendedor de fracción B que contiene yema de huevo. Esperma congelado en pajillas de 0,25 ml se descongelaron en un baño de agua a 37ºC durante 30 segundos y se incubaron a 37ºC. Las estimaciones visuales de la motilidad total fueron determinadas por 2 observadores, ciegos al tratamiento, en 30 y 120 minutos de

25 incubación.

La exclusión de extendedor de fracción B que contiene yema de huevo no afectó de manera adversa a la motilidad del esperma después de la descongelación. De hecho, la motilidad fue estadísticamente superior para el esperma procesado en el extendedor de fracción B sin yema de huevo en comparación con 20% de yema de huevo (P < 0,05) en ambos tiempos de incubación. Véase el Gráfico 1.

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Una concentración de glicerol final de 3% resultó en motilidades estadísticamente inferiores a los 30 min y 120 min después de la descongelación, mientras que las motilidades fueron mayores y no difirieron en función de 4-6% de glicerol. Véase el Gráfico 2. A partir de este ejemplo, tal vez se puede concluir que 3% de glicerol no proporcionó una crioprotección adecuada para el esperma clasificado. Dado que las motilidades no difirieron entre 4-6% de glicerol, y puede ser deseable la provisión de una crioprotección adecuada (que puede variar entre los toros), una concentración final de 6% de glicerol puede ser apropiada para el esperma clasificado por sexo.

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Ejemplo 3

Otro ejemplo se puede reseñar de la siguiente manera. Un objetivo fue comparar la tasa de embarazo de 30 días en vaquillas Holstein inseminadas con esperma portador de cromosoma X que se procesaron con 0% de glicerol de 5 yema de huevo (12%) que contiene extendedor con el que contenía 20% de yema de huevo.

Esperma portador de cromosoma X de cada uno de 2 toros fue aislado sobre la base del contenido de ADN utilizando un citómetro de flujo. El esperma clasificado se recogió en tubos de plástico de 50 ml que contenían 2 ml de extendedor TRIS con 20% de yema de huevo sin glicerol hasta que cada uno de los tubos contenía 12,5 ml y aproximadamente 12 millones de espermatozoides. El esperma clasificado se enfrió (5ºC) durante 90 minutos. 10 Después de enfriar, tubos de clasificación que contienen esperma (Falcon de 50 ml) fueron separados de manera uniforme y se añadió extendedor que contenía glicerol (fracción B). El esperma enfriado recibido extendedor de fracción B que contenía 0% de yema de huevo o 20% de yema de huevo. Tubos que contenían esperma clasificado (volumen total de 25 ml) se centrifugaron a 850 x g durante 20 minutos a 5ºC. Se separó el sobrenadante, dejando esperma clasificado en gránulos de aproximadamente 200 µl. Gránulos de esperma similares se agruparon y se

15 ajustaron a 10 x 106 espermas / ml con medio AB con 20% de yema de huevo (6% de contenido de glicerol final). El porcentaje final de yema de huevo en el producto varió según el día de clasificación (intervalo: 16,5-18,2%). Los espermas (2 x 106) se envasaron en pajillas codificadas de 0,25 ml para asegurar que los tratamientos fueran ciegos a los técnicos de AI, colocados en bastidores de congelación y se criopreservaron en vapor de LN2. Un número igual de pajillas de cada uno de los toros y de tratamiento se colocó en copas y se fijaron a bastones de aluminio.

E06800316

09-06-2015

La motilidad del esperma después de la descongelación se determinó utilizando la motilidad "Track" después de 30 min de incubación a 37ºC. La media del porcentaje de esperma con motilidad progresiva para los códigos de congelación procesados con extendedor de fracción B con 20% de yema de huevo fue del 44% y la de para extendedor de fracción B con 0% de yema de huevo fue del 43%.

5 119 vaquillas Holstein no sincronizadas estaban equilibradas a través de los diferentes medios de yema de huevo y 2 toros Holstein. La inseminación se produjo 12 ó 24 horas después del estro permanente observado. Tres inseminadores se utilizaron en este ejemplo. Aproximadamente 1 mes después de la inseminación, el embarazo se determinó a través de ultrasonidos. Los datos se sometieron a ANOVA.

La tasa de embarazo no difirió (P> 0,05) entre el esperma clasificado procesado con extendedor de fracción “B” con 10 0% de yema de huevo y la de extendedor de fracción “B” con 20% de yema de huevo. Véase la Tabla 1.

Las tasas de embarazo reales fueron similares para los toros y de los técnicos de AI (P> 0,05), y no hubo interacciones estadísticas. Numéricamente, la tasa de embarazo para el toro 52H0039 era más alta que para el toro 52H0038. Véase la Tabla 2. Una muestra más grande de la población puede haber dado lugar a una diferencia significativa en la tasa de embarazo entre los dos toros. Puede ser importante tener en cuenta para este ejemplo que

15 los intervalos de confianza (CI) del 95% son grandes.

Tabla 1 Ensayo de Campo con Extendedor “B” de 0% de Yema de Huevo frente a 20% de Yema de Huevo por Tratamiento

Tratamiento (n) Embarazo (%) ± EMT 95% de CI

“B” con 0% de Yema de Huevo 59 56 ± 0,065 43-68 “B” con 20% de Yema de Huevo 60 55 ± 0,065 42-67

Se presentan medias reales Toros (n = 2), técnicos AI (n = 3) y Tratamientos (n = 2) eran similares (P > 0,05).

Tabla 2 Ensayo de Campo con Extendedor “B” de 0% de Yema de Huevo frente a 20% de Yema de Huevo por Toro

Toro nº (n) Embarazo (%) ± EMT 95% de CI 52HO039 60 62 ± 0,063 49-73 52HO038 59 49 ± 0,065 38-62 Se presentan medias reales Toros (n = 2) eran similares (T > 0,05)

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación, que comprende las etapas de:

   5 -obtener una pluralidad de células espermáticas; -someter dicha pluralidad de células espermáticas a tensiones de clasificación; -seleccionar dicha pluralidad de células espermáticas para una característica deseada; -añadir un extendedor de células espermáticas que contienen yema de huevo a dicha pluralidad de células espermáticas para formar una primera mezcla de células espermáticas extendidas que tiene un primer valor

   10 de contenido de proteínas; -enfriar dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas a una temperatura menor que 10 grados Celsius para crear una primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada; -añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas que tiene un volumen igual a un volumen de dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas a dicha primera

   15 mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada que tiene un segundo valor de contenido de proteínas que incluye más de 0,4 a 3,2 por ciento en volumen de yema de huevo; -mantener dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada en un estado sin clarificar; -someter a centrifugación a dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada;

   20 -añadir un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas suplementario a la segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada centrifugada para aumentar el contenido total en proteínas de un extendedor de células espermáticas que contiene proteínas de este tipo que tiene un tercer valor de contenido de proteínas mayor que el primer valor de contenido de proteínas y que incluye más de 1 a 50 por ciento en volumen de yema de huevo;

   25 -congelar dicha mezcla de células espermáticas extendidas.

2. 2.

   Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de obtener una pluralidad de células espermáticas comprende la etapa de obtener una pluralidad de células espermáticas de mamífero.

3. 3.

   Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según

   30 se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de seleccionar dicha pluralidad de células espermáticas para una característica de sexo seleccionada del grupo que consiste en una característica portadora de cromosoma X y una característica portadora de cromosoma Y.
4. 4. Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que

   35 contienen yema de huevo a dicha pluralidad de células espermáticas para formar una primera mezcla de células espermáticas extendidas comprende la etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contienen yema de huevo a dicha pluralidad de células espermáticas seleccionadas para formar una primera mezcla de células espermáticas extendidas que tiene 3,2 por ciento en volumen de yema de huevo.
5. 5. Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según

   40 se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada comprende la etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene glicerol a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada.

   45 6. Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 5, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene glicerol a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada comprende la etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene glicerol que tiene un porcentaje en volumen de glicerol seleccionado del grupo que

   50 consiste en más de 3 por ciento en vol. de glicerol, más de 6 por ciento en vol. de glicerol, más de 12 por ciento en vol. de glicerol y más de 24 por ciento en vol. de glicerol.
6. 7. Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para

   55 formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada comprende la etapa de añadir un

   17 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector estéril a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada.

7. 8.

   Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector libre de proteínas a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada comprende la etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de gradiente de baja densidad a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada.

8. 9.

   Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 8, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de gradiente de baja densidad a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada comprende la etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de densidad sustancialmente uniforme a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada.

9. 10.

   Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 8, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de gradiente de baja densidad a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada comprende la etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector sustancialmente sin partículas de compactación de células espermáticas.

10. 11.

    Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 8, en el que dicha etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de gradiente de baja densidad a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada comprende la etapa de añadir un extendedor de células espermáticas que contiene crioprotector de baja viscosidad a dicha primera mezcla de células espermáticas extendidas enfriada para formar una segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada.

11. 12.

    Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa de decantar una parte de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada, sin clarificar, centrifugada.

12. 13.

    Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de ajustar una concentración de células espermáticas de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada a una concentración de células espermáticas de pre-congelación comprende la etapa de ajustar una concentración de células espermáticas de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada a una concentración de células espermáticas de precongelación apropiada para las especies.

13. 14.

    Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 13, en el que dicha etapa de ajustar una concentración de células espermáticas de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada a una concentración de células espermáticas de pre-congelación apropiada para las especies comprende la etapa de ajustar una concentración de células espermáticas de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada a una concentración de células espermáticas de pre-congelación seleccionada del grupo que consiste en una concentración de pre-congelación de células espermáticas bovina, una concentración de pre-congelación de células espermáticas equinas, una concentración de pre-congelación de células espermáticas porcinas, una concentración de pre-congelación de células espermáticas ovinas, una concentración de pre-congelación de células espermáticas de cérvidos, una concentración de pre-congelación de células espermáticas caninas y una concentración de pre-congelación de células espermáticas de delphinidae.

14. 15.

    Un método para congelar células espermáticas clasificadas comprometidas por un evento de clasificación según se describe en la reivindicación 13, en el que dicha etapa de ajustar una concentración de células espermáticas de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada a una concentración de células espermáticas de pre-congelación apropiada para las especies comprende la etapa de ajustar una concentración de células espermáticas de dicha segunda mezcla de células espermáticas extendidas enfriada a una concentración de células

    18

    espermáticas seleccionada del grupo que consiste en menos de 100 millones de células espermáticas por mililitro, menos de 50 millones de células espermáticas por mililitro, menos de 40 millones de células espermáticas por mililitro, menos de 30 millones de células espermáticas por mililitro, menos de 20 millones de células espermáticas por mililitro, menos de 15 millones de células espermáticas por mililitro, menos de 10 millones de células espermáticas por mililitro, menos de 5 millones de células espermáticas por mililitro y menos de 2 millones de células espermáticas por mililitro.

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