BRPI0622294A2

BRPI0622294A2 - Métodos e aparelhos para a redução do conteúdo protéico em extensores de células de esperma

Info

Publication number: BRPI0622294A2
Application number: BRPI0622294-3A
Authority: BR
Inventors: John L Schenk
Original assignee: Xy Llc
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-24
Publication date: 2014-10-29
Also published as: NZ566129A; CA2619951C; EP1924139A4; AU2006275984B2; JP2013066491A; US8426197B2; JP5394737B2; JP2009502169A; CA2619951A1; AR054180A1; BRPI0614912B1; IL189638A0; DK1924139T3; ES2538979T3; PT1924139E; NZ592269A; UY29708A1; NZ592267A; US20100216111A1; EP1924139A2

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para “MÉTODOS E APARELHOS PARA A REDUÇÃO DO CONTEÚDO PROTÉICO EM EXTENSORES DE CÉLULAS DE ESPERMA”.

Dividido do ??0614912-0, depositado em 24/07/2006.

Este e um pedido de patente internacional que reivindica a prioridade e o beneficio do pedido de patente provisório dos Estados Unidos número 60/704,001, depositado em 29 de Julho de 2005, e do pedido de patente não provisório dos Estados Unidos número 11/219,607, depositado em 2 de Setembro de 2005, cada um dos quais é aqui incorporado como referência.

Canipo Técnico De um modo geral, a tecnologia inventiva aqui revelada reiaciona-se a métodos e aparelhos para a redução do conteúdo protéico em extensores de células de esperrna. Mais especificamente, esta tecnologia inventiva pode envolver a eliminação do conteúdo protéico de um componente crioprotetor utilizado em um processo de extensão de células de esperma de etapas múltiplas. A tecnologia inventiva pode ser particularmente adequada para o uso em aplicações de identificação de esperma.

Fundamentos Extensores de células de esperma podem ser comumenle utilizados em uma variedade de disciplinas biológicas que requerem trabalho com células de esperma. Por exemplo, uma disciplina que pode fazer uso extenso dos extensores de células de esperma é o campo da inseminação artificial. Enquanto a inseminação natural pode envolver a direta inseminação de macho para fêmea, a inseminação artificial pode tipicamente envolver a coleta de células de esperma de um macho, a realização de um grau de manipulação humana dessas células de esperma removidas de seu ambiente natural, e então a inserção das células de esperma manipuladas em uma fêmea. O grau preciso de manipulação humana pode variar dependendo da natureza precisa da aplicação particular. Por exemplo, alguma manipulação humana pode envolver simplesmente a divisão de uma amostra de esperma coletada em múltiplas doses para uso em múltiplos eventos de inseminação, possivelmente com múltiplas fêmeas animais. Contudo, outras aplicações podem requerer uma manipulação humana mais intensa.

Por exemplo, a manipulação humana em algumas aplicações pode envolver a identificação de células de esperma em populações com base nas características exibidas pelas células de esperma. Uma dessas aplicações pode incluir o uso de cilornetria de fluxo para separar células de esperma em populações de células de esperma que portam cromossornos-X e populações de células de esperma que portam cromossomos-Y. Um citòmetro de fluxo pode tipicamente atingir esta separação fazendo com que células de esperma fluam arrastadas em urna corrente fluida uma de cada vez através de uma região de interrogação, onde informações sobre cada uma das células de esperma podem ser obtidas. A interrogação pode ser tipicamente obtida através do uso da óptica, por exemplo, talvez através da interseção de um feixe de laser com uma célula de esperma e a medição do espalhamento ou da fluorescência de luz resultante. A determinação de uma característica sexual talvez possa ser feita manchando-se as células de esperma com uma tina fluorescente que se liga ao DNA dentro de células de esperma individuais. Quando um laser ilumina células de esperma individuais, a tinta poclerã brilhar. A identificação de células de esperma de acordo com uma característica sexual pode ser então alcançada, talvez pelo reconhecimento de que células de esperma que portam um cromossomo X possuem mais DMA do que as células de esperma que portam um cromossomo Y, desta forma possivelmente emitindo mais luz fluorescente quando excitadas por um laser e talvez permitindo que a célula seja identificada e separada.

Outro exemplo de manipulação humana pode envolver talvez o congelamento de células de esperma para uso em um momento posterior. O congelamento dc células de esperma pode muitas vezes ser crucial para o uso eficaz das células de esperma, porque o congelamento pode preservar ao menos algum grau da viabilidade das células de esperma por um período de tempo estendido para além de urn ponto em que tal viabilidade seria de outra forma prejudicada. Esta extensão da viabilidade das células de esperma pode ser obtida em técnicas de congelamento possivelmente desacelerando-se o metabolismo das células de esperma e possivelmente estendendo desta forma sua vida útil. Em particulai·, talvez seja sabido que o metabolismo das células de esperma pode ser desacelerado em aproximadamente 50% por cada 10 graus Celsius a que uma célula de esperma é esfriada. Além disso, as células de esperma congeladas podem ser empacoladas ern formatos convenientes para aplicações particulares, por exemple*, talvez como varas congeladas, bolas congeladas, ou outras formas de amostras artificiais congeladas. As células de esperma congeladas podem também ser bem adaptadas a transportes ao longo de grandes distâncias, por exemplo, como quando uma instalação de coleta de células de esperma, uma instalação de extensão de células de esperma, e uma instalação de inseminação artificial podem estar muito afastadas em diferentes localidades.

Pode-se notar que a remoção do esperma de seu ambiente natural pode removê-lo de mecanismos naturais de suporte que mantêm a sua viabilidade. Extensores de células de esperma podem atuar para restituir ao menos um grau deste suporte para as células de esperma. Por exemplo, uma função dos extensores de células de esperma pode ser a de defender as células de esperma, possivelmente ajustando o pl 1 ou a osmolalidade de um meio ern que as células de esperma possam ser colocadas. Uma outra função dos extensores de células de esperma seja talvez a de provei nutrientes para células de esperma ou a de servir como uma fonte de energia de células de esperma. Em aplicações de congelamento, uma outra função pode ser a de servir comc» um crioprotelor para minimizar os efeitos adversos do congelamento sobre as células de esperma. Pode-se notai que essas funções dos extensores de células de esperma podem ser alcançadas ao menos em algum grau pelas partes constitutivas que compõem qualquer exíensor de células de esperma individual.

Por exemplo, o conteúdo protéico pode ser uma parte constitutiva frequentemente utilizada de vários tipos de extensores de células de esperma. O conteúdo protéico pode servir para uma ou mais funções em urn exíensor de células de esperma. Um propósito essencial do conteúdo protéico pode ser o de prover nutrientes e possivelmente servir corno uma fonte de energia para células de esperma. Contudo, alguns tipos de proteína podem ler também uma função crioproteíora, por exemplo, possivelmente o uso de lipoproleínas para substituir líquidos perdidos de membranas de células cie esperma devido a um processo de congelamento. Além disso, o conteúdo protéico nos extensores de células de espenna pode tomar uma variedade de formas. Parte do conteúdo protéico pode ser baseada em plantas, por exemplo, a lecitina derivada da soja. Outra parte do conteúdo protéico pode ser baseada em animais, por exemplo, talvez uma gema de ovo derivada de fontes que incluem ovos dc galinhas comuns.

Os crioproletores podem também ser um exemplo de lima parte constitutiva frequentemente utilizada de vários tipos de extensores de células de espenna. Além disso, os crioproletores podem assumir uma variedade de formas nos extensores de células de espenna. Um erioprotelor comumente utilizado pode ser o glicerol. O glicerol pode proteger as células de espenna durante um processo de congelamento, talvez ligando-se à água contida dentro e envolvida em torno de uma célula de espenna, possivelmente desidralando a célula de espenna como resultado, e desta forma possivelmente reduzindo a formação de gelo intracelular que possa causar dano á célula de espenna. Contudo, o uso de glicerol para crioproteger células de espenna pode também acaireíar certas desvantagens. Por exemplo, o glicerol pode oferecer ao menos algum grau de toxicidade às células de espenna, cujo efeito pode se tornar mais pronunciado com grandes quantidades de glicerol. Além disso, o glicerol pode ser hiper-osmólieo para as células de espenna, o que pode resultar em um grau de choque para as células de espenna às quais o glicerol foi adicionado. Em particular, tais propriedades hiper-osmólicas do glicerol podem fazer com que uma célula de espenna que venha em contato com o glicerol se encolha ou expanda rapidamente como resultado de uma diferença na concentração de solulo ao longo da membrana da célula de espenna. Tai encolhimento ou expansão rápida pode talvez causar danos a uma célula cie espenna. E'<esta fonna, certos procedimentos puderam ser desenvolvidos para que os extensores de células de espenna minimizem os efeitos adversos do glicerol sobre as células de esperrna. Por exemplo, por urna questão prática talvez possa ser compreendido que a combinação de glicerol com células de esperrna em temperaturas reduzidas pode reduzir os efeitos tóxicos do glicerol sobre as células de esperrna. Assim, os extensores de células de esperrna que usam o glicerol podem muitas vezes ser preparadas em um processo de múltiplas etapas envolvendo duas ou mais frações extensoras. Mais particularmente, certos extensores de células de esperrna podem conter uma fração “A” sem glicerol e uma fração “B” com glicerol. Isto pode permitir que um extensor de células de esperrna seja preparado em duas ou mais etapas, por exemplo, uma primeira etapa na qual as células de esperrna podem scr adicionadas à fração A de um extensor de células de esperrna, talvez na temperatura ambiente, seguida por uma segunda etapa em que as células de esperrna adicionadas à fração A são resfriadas até uma temperatura mais baixa, e a fração B contendo glicerol é adicionada nesta temperatura mais baixa. Além disso, para mitigar os efeitos hiper-osrnóticos do glicerol sobre as células de esperrna, a fração B pode talvez ser adicionada ern múltiplas etapas, possivelmente cie modo a reduzir o choque das células de esperrna, sujeitando as células de esperrna a quantidades menores de glicerol em eacla etapa de adição de glicerol. O número cie etapas em que o glicerol pode ser adicionado pode variar possivelmente desde duas etapas ou quatro etapas até um grande número de etapas, incluindo possivelmente a adição de glicerol em gotas por urn período de tempo.

Contudo, a interação do glicerol com outros componentes de extensão de células de esperrna em tais procedimentos pode acarretar prejuízos significativos. Em particular, os componentes protéicos de extensores de células de esperrna tal como a gema de ovo podem apresentar complicações para a manipulação de tais extensores quando presentes na fração B. Isto pode dever-se ao bolo volurnélrico que tais componentes protéicos criam ern um extensor de células de esperrna. Este fenômeno pode talvez ser evidenciado pelo uso de gema de ovo na fração B de urn extensoí de células de esperrna que requeira centrifugação. A cenüifúgaçáo pode ser uma técnica comumente utilizada em várias aplicações de células de esperrna para concentrar as células de esperrna. Por exemplo, em aplicações de eitometria de fluxo, a passagem de células de esperrna através de um citômelro de fluxo pode tender a diluir a concentração de células de esperrna para uma concentração mais baixa do que a encontrada na natureza. Isto pode ocorrer porque os citòmetros de fluxo tipicamente podem requerer a condução das células de esperrna em urna corrente fluida, que pode adicionar-se ao volume do material em que as células de esperrna estiverem contidas, A centrifugação pode levar as células de esperma até uma concentração mais alta talvez sujeitando-as a forças centrífugas e concentrando-as desta forma. Contudo, a centriiugação da fração B de um cxlensor de células de esperma contendo gema de ovo pode ser problemática, porque o bolo volumétrico de lipoproteínas contido na gema de ovo poderá tender a compactar quaisquer células de esperma que possam estar presentes na fração B, possivelmente com o resultado da trituraçáo ou de outros danos a tais células de esperma.

Como resultado, pode ser talvez necessário clarificar a fração B de urna célula de esperma contendo cometido proléico tal como a gema de ovo. O objetivo da clarificação pode ser o de conferir um grau de densidade menor e mais uniforme a tal cxlensor contendo proteína, em particular possivelmente pela remoção de agrupamentos ou de outras regiões localmente densas, talvez devido às concentrações de proteína tais como os componentes de lipoproteína da gema de ovo, de modo que a centrifugação possa talvez ser alcançada sem comprimir adversamente as células de esperma. A clarificação pode ser obtida através de qualquer um dentre vários métodos apropriados, por exemplo, possivelmente por filtração. Contudo, todas as formas de clarificação podem requerer uma alocação de recursos devida. Por exemplo, a clarificação pode significar custos em materiais tais como filtros ou outros dispositivos necessários, custos em trabalho que poderão ocupar recursos de pessoal que de outra formar poderíam estar dedicados para outros fins, custos de tempo que poderão tomar lento um processo de extensão de células de esperma, e os custos financeiros relacionados a todos os anteriores.

Além disso, a simples preparação de urna fração B de um cxlensor de células de esperma para que contenha conteúdo protéicc» tal como a gema de ovo pode acarretar um grau de complicações inerentes. Semelhantemente à clarificação, a preparação de tal fração B pode levar a custos em materiais, custos em trabalho, custos de tempo, e custos financeiros. Além disso, a tendência em direção à espoliação ao longo do tempo devido ao conteúdo protéicc» de tal fração B pode complicar ainda mais o seu uso. Em particular, como tal fração B não pode permanecer bem, ela pode requerer uma preparação com base em necessidades imediatas, possivelmente arruinando agendamentos e reduzindo efieiências que poderíam ser alcançadas caso a fração B pudesse ser ao invés preparada em grandes quantidades antes do tempo. Este problema pode ser particular mente agudo em situações em que uma aplicação de células de espenna possa requerer uma taxa relativamente alta de fração B para fração A. As tendências de espoliação de tal fiação B podem também apresentar um risco de contaminação, por exemplo, como quando a fração B puder ser possivelmente contaminada com bactérias devido à espoliação, o que pode afetar adversamente uma aplicação de células de espenna em que a fração B contaminada seja inadvertidamente utilizada. Essas tendências de espoliação podem também limitar o uso de tal fração B em situações nas quais as condições ambientais não podem ser monitoradas precisamente, por exemplo, como quando for desejado transportar a fração B de urn local para outro possivelmente ao longo de uma grande distância.

Os problemas anteriores relacionados aos extensores de células de espenna convencionais podem representar uma necessidade de há muito sentida por uma solução eficaz para eles. Embora elementos de implementação pudessem estar disponíveis, as tentativas reais de satisfazer esta necessidade poderíam ser insuficientes ern algum grau. Isto pode ter-se devido a uma falha dos técnicos versados no assunto em reconhecer ou compreender inteiramente· a natureza dos problemas e dos desafios envolvidos. Como resultado desta falta de entendimento, as tentativas de satisfazer esta necessidade de há muito sentida falharam na solução eficaz de um ou mais dos problemas ou desafios aqui identificados. Estas tentativas podem até mesmo ter se desviado das direções técnicas tomadas pela presente tecnologia inventiva, e podem ate mesmo resultar nos benefícios da presente tecnologia inventiva sendo considerados até certo ponto como um resultado inesperado da abordagem feita por alguns na técnica.

Revelação da Invenção A tecnologia inventiva relaciona-se a métodos e aparelhos para reduzir o conteúdo protéico em extensores de células de espenna e pode incluir um ou mais dos seguintes recursos: técnicas para a redução do conteúdo protéico em um extensor de células de esperma; técnicas para a redução do conteúdo protéico em uma fração B contendo crioprotetores de um extensor de célula de esperma; técnicas pai a a preparação de extensores de células de espenna que não requeiram classificação; técnicas para a preparação de extensores de células de esperma de gradiente de baixa densidade adequados para centrifugação; técnicas para a redução do conteúdo protéiec» entre etapas individuais na preparação de um extensor de células de esperma; e técnicas para o estabelecimento de novos valores de conteúdo protéico reduzido em extensores de células de esperma. Desta forma, os objetivos dos métodos e aparelhos para reduzir o conteúdo protéico em extensores de células de esperma aqui descritos abordam cada um dos problemas mencionados anleriormente de uma forma prática. Naturalmente, outros objetivos da invenção serão aparentes a partir da descrição abaixo e dos desen hos.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é uma ilustração de várias substâncias nascentes em relação de mistura. A Fig. 2a é uma ilustração dc um extensor de células de esperma do estado da técnica. A Fig. 2b é urna ilustração de meio de centrifugação não clarificado. A Fig. 3 é uma representação de um extensor de células de esperma intermediário.

Motlo(s) de Realização da Invenção A presente tecnologia inventiva inclui uma variedade de aspectos, que podem ser combinados de diferentes formas. As seguintes descrições são fornecidas para listar elementos e descrever algumas das modalidades da presente tecnologia inventiva. Esses elementos estão listados com modalidades iniciais, contudo, deve ser entendido que eles podem ser combinados de qualquer modo e em qualquer número para criai modalidades adicionais. Os diversos exemplos descritos e modalidades preferidas não devem ser interpretados como iimitativos da presente tecnologia inventiva apenas aos sistemas, técnicas, métodos, dispositivos e aplicações explicitam ente descritas. Além disso, esta descrição deve ser compreendida como suporte abrangente das descrições e reivindicações de todas as diversas modalidades, sistemas, técnicas, métodos, dispositivos, e aplicações com qualquer número dos elementos revelados, com cada elemento sozinho, e também com cada urna das permutações e com todas as várias permutações e combinações de todos os elementos nesta aplicação ou em qualquer aplicação subseqüente.

Agora com referência principalmente à Fig. 1, algumas modalidades podem incluir um método para o congelamento de células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação. A expressão “evento de identificação” deve ser entendida como incluindo qualquer um dentre uma variedade de eventos em que células de esperma sejam identificadas com base na discriminação de características retidas por tais células de esperma, o que pode incluir, em várias modalidades, técnicas de imunossexagem, técnicas de flutuação, ou possivelmente até mesmo técnicas de citometria. A expressão “afetadas” pode ser entendida como incluindo qualquer efeito de um evento de identificação que possa tender a afetar adversamente qualquer aspecto desejado para o qual as células de esperma podem ser utilizadas, incluindo, por exemplo, a viabilidade de células de esperma, a fecundidacle de células de esperma, ou talvez até mesmo a longevidade das células de esperma. A expressão “congelamento” deve ser entendida como incluindo qualquer técnica para a preservação de células de esperma que inclua a diminuição de sua temperatura abaixo de 0 graus Celsius ao menos em algum ponto na técnica.

Além disso, as modalidades podern envolver a obtenção de uma pluralidade de células de esperma, a sujeição desta pluralidade de células de esperma a estímulos de identificação, e a seleção desta pluralidade quanto a uma característica desejada. Pela expressão “obtenção”, deve ser entendida que qualquer uma das varias técnicas conhecidas para a obtenção de células de esperma pode ser utilizada, por exemplo, possivelmente incluindo técnicas manuais ou técnicas que envolvam uma vagina artificial. A expressão “estímulos de identificação” deve ser entendida como incluindo estímulos que as células de esperma podem experimentar como resultado de um evento de identificação, e a sujeição de células de esperma a estímulos de identificação pode incluir talvez meramente a realização de um evento de identificação.

Um extensor de células de esperma contendo proteína pode ser adicionado a uma pluralidade de células de esperma selecionadas em algumas modalidades para formar uma primeira mistura de células de esperma estendidas. A expressão “extensor de células de esperma” pode ser entendida c omo incluindo uma substância que confere ao menos algum grau de função de manutenção às células de esperma. Esses tipos de função de manutenção podem incluir, por exemplo, servir como proteção para as células de esperma, providenciar nutrientes para as células de esperma, ou possivelmente até mesmo atuar como um ciioprotetor para as células de esperma. Deve-se notar que várias espécies de extensores de células de esperma podem ser conhecidas, possivelmente incluindo extensores baseados ern gema de ovo, extensores baseados em leite, extensores baseados ern citrato, extensores contendo citrato de sódio, extensores contendo Tris, e extensores contende» TEST. Além disso, a expressão “primeira mistura de células de esperma estendidas” pode ser compreendida como incluindo a combinação de tal extensor de células de esperma contendo proteína com tal pluralidade de células de esperma selecionadas. Várias modalidades podem envolver também o resfriamento dessa primeira mistura de células de esperma estendidas para criar uma primeira mistura de células de esperma estendidas resfriadas. A expressão “resfriamento” deve ser entendida como incluindo a redução da temperatura de uma primeira mistura de células de esperma estendidas para qualquer temperatura acima de 0 graus Celsius. O resfriamento pode talvez ser alcançado por muitas das várias técnicas conhecidas, tal como possivelmente a refrigeração, banhos de água, ou banhos dc gelo. Em várias modalidades, urna primeira mistura de células estendidas pode ser resfriada até possivelmente menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, menos do que aproximadamente 9 graus Celsius, menos do que aproximadamente S graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, menos do que aproximadamente 5 graus Celsius, menos do que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, ou possivelmente menos do que aproximadamente i grau Celsius. Ceitas modalidades podem envolver o resfriamento de uma mistura de células de espeima estendidas até 5 graus Celsius. Além disso, um extensor de células de espenna contendo crioprotetores livre de proteínas pode ser adicionado a tal primeira mistura de células de espeima resfriada em algumas modalidades para formar uma segunda mistura de células de espeima estendidas resfriada. A expressão “segunda mistura de células de espenna estendidas resfriada” pode ser entendida corno incluindo a combinação da tal primeira mistura de células de espenna estendidas resfriada com o tal extensor de células de espenna contendo crioprotetores livre de proteínas. Várias modalidades podem incluir também o congelamento dessa segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada.

Uma primeira mistura de células de esperma estendidas pode em algumas modalidades conter um percentual de gema de ovo. Este pode ser uma função, por exemplo, da quantidade de proteína contida em um extensor de células de esperma contendo proteína adicionado a uma pluralidade de células selecionadas, sendo que ta! proteína pode ser gema de ovo. Em várias modalidades, o percentual de gema de ovo contido em uma primeira mistura de células de esperma estendidas pode incluir mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo, ou mais do que aproximadamente 6,4 por cento de gema de ovo. Algumas modalidades podem incluir um percentual de gema de ovo contido em uma primeira mistura de células de esperma estendidas de aproximadamente 3,2 por cento.

Além disso, urna segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada ern algumas modalidades pode conter também um percentual de gema de ovo. Este pode ser uma função, por exemplo, possivelmente de um efeito de diluição ao quando se adiciona um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteína a uma primeira mistura de células de esperma estendidas. Em várias modalidades, o percentual de gema de ove* contido em uma segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada pode incluir mais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 0,8 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, ou possivelmente mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo. Algumas modalidades podem incluir um percentual de gema de ovo contido em uma segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada de aproximadamente 1,6 por cento.

Em algumas modalidades, uma segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada pode ser mantida em um estado não clarificado. Ao manter a segunda mistura dc células de esperma estendidas resfriadas ern um estado não clarificado, deve ser entendido que tal segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada pode não sei' submetida a uma clarificação antes de qualquer etapa de centrifugação. Além disso, certas modalidades podem envolver a sujeição desta segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada a uma centrifugação. Esta centrifugação pode talvez servir para concentrar as células de esperma contidas na tal segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada, possivelmente separando tais células de esperma de outros componentes da segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada com base na densidade devido à aplicação de forças centrifugas às células de esperma. Várias modalidades podem envolver também a decantação de uma porção dessa segunda mistura de células de esperma estendidas resfriada centrifugada. Por exemplo, as células de esperma concentradas por centrifugação poderão estar concentradas em grande parte dentro de uma região, e a remoção de urna seção volumétrica poderá possivelmente incluir a remoção da seção volumétriea que contém tais células de esperma ou talvez até mesmo a remoção de todas as seç ões voluméiricas que não incluam essas células de esperma concentradas.

Agora com referência principalmente à Fig. 2, algumas modalidades podem incluir um método para o processamento de células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação. A expressão “processamento” pode ser compreendida como incluindo qualquer evento no qual células de esperma são tratadas para mudar ao menos urna característica de tais células de esperma em ao menos algum grau. Em várias modalidades, o processamento pode incluir, por exemplo, o congelamento, derreíimento, ou possivelmente até mesmo a centrifugação de tais células de esperma.

Além disso, as modalidades podem envolver a obtenção de uma pluralidade de céiulas de esperma, a sujeição dessa pluralidade de células de esperma a estímulos de identificação, e a seleção dessa pluralidade de células de esperma quanto a uma característica desejada. Algumas modalidades podem incluir ainda a provisão de um extensor de células de esperma contendo erioprotetores livre de proteínas, e a combinação de tal extensor de células de esperma contendo erioprotetores livre de proteínas para formar um meio cie ccníri fuga cão contendo erioprotetores. A expressão ' meio de centrifugaçâo” pode ser compreendida como incluindo qualquer meio condutor para células de esperma que em algum ponto seja submetido a uma centrifugaçâo.

Em algumas modalidades, a combinação de tal extensor de células de esperma livre de proteínas com tal extensor de células de esperma contendo erioprotetores livre de proteínas, para formar um meio cie centrifugaçâo contendo erioprotetores, pode ser obtida a uma temperatura fria. Esta temperatura fria pode incluir menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, menos do que aproximadamente 9 graus Celsius, menos do que aproximadamente S graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, menos do que aproximadamente 5 graus Celsius, menos do que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, ou talvez até rnenos do que aproximadamente 1 grau Celsius. Certas modalidades podem envolver a combinação de Lal extensor cie células de esperma livre de proteínas com tal extensor de células de esperma contendo erioprotetores iivre de proteínas para formar um meio cie centrifugaçâo contendo erioprotetores a aproximadamente 5 graus Celsius.

Um meio de centrifugaçâo contendo erioprotetores em algumas modalidades pode ser mantido em um estado não clarificado. Um estado não clarificado pode ser entendido como incluindo urn estado em que urna substância pode existir no qual esia substância não foi clarificada. A elaríficação pode ser entendida como incluindo conferir um grau de densidade menor e mais uniforme a uma substância, e possivelmente pode envolver técnicas tais corno a filtracão ou a deformação. Ao manter um meio cie centrifugaçâo contendo erioprotetores em urn estado não clarificado, deve ser entendido que tal meio de centrifugaçâo contendo erioprotetores pode não ser submetido à elaríficação antes de qualquer etapa de centrifugaçâo. Várias modalidades podem envolver ainda a adição de urna pluralidade de células de esperma sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada a tal meio de centrifugueão contendo crioproletores não clarificado, talvez para formar um meio de eentrifugação de céiuias de esperma contendo ciioproietores não clarificado. A expressão “meio de eentrifugação cie células de esperma contendo crioproteíores não clarificado” pode ser compreendida corno incluindo talvez simplesmente um meio de eentrifugação contendo crioproletores não clarificado ao qual tal pluralidade de células de esperma foi adicionada. Além disso, certas modalidades podem envolver a sujeição de tal meio de eentrifugação de células de esperma contendo croprotelores nãc» clarificado a uma eentrifugação. A expressão “eentrifugação” pode ser compreendida corno incluindo a aplicação de uma força centrífuga a uma substância de modo a separar ao menos dois componentes constitutivos dessa substancia com base na densidade. Esta eentrifugação pode possivelmente servir para concentrar as células de esperma contidas em tal meio de eentrifugação de células de esperma contendo crioproletores não clarificado, talvez separando tais céiuias de esperma de outros componentes do meio de eentrifugação de células de esperma contendo crioproletores não clarificado com base na densidade devido à aplicação da força centrífuga às células de esperma. Várias modalidades podem envolver ainda a decantação de uma porção de tal meio de eentrifugação de células de esperma contendo crioproletores não clarificado. A decantação pode ser compreendida como incluindo a remoção dc ao menos u.ma seção volumétrica de urna substância, talvez este meio de eentrifugação de células de esperma contendo crioproletores não clarificado, o que possivelmente pode ser alcançado através de qualquer urna dentre as várias técnicas conhecidas, incluindo, por exemplo, o derramamento de tal seção volumétrica. Significai!vam ente, pode ser possível selecionar tal seção volumétrica a ser removida com base na quantidade de um componente centrifugado presente nessa seção volumétrica. Por exemplo, células de esperma concentradas por eentrifugação podem ser concentradas em grande parte dentro de uma região, e a remoção de uma seção volumétrica talvez possa incluir a remoção da seção volumétrica contendo tais células de esperma concentradas ou talvez até mesmo a remoção de toda a seção volumétrica não incluindo tais c élulas de esperma concentradas.

Certas modalidades podem envolver ainda o fornecimento de um extensor de células de esperma contendo proteína e a combinação desse extensor de céiuias de esperma contendo proteína com um meio de centrifugação contendo crioproietores para criar um meio de eentrifugaçao contendo crioprotetores que contenha proteína. Além disso, várias modalidades podem incluir também a adição de uma pluralidade de células de esperma sujeitas a estímulos de identificação c selecionadas quanto a uma característica desejada a tal meio de centrifugação contendo crioprotetores e contendo proteína para criar um meio de cenlrifugação de células de esperma contendo crioprotetores e contendo proteína. Algumas modalidades podem envolver ainda a manutenção de tal meio de cenlrifugação de células de esperma contende» crioprotetores e contendo proteína em um estado não clarificado.

Aiem disso, tal meio de cenlrifugação de células de esperma contendo crioprotetores e contendo proteína em certas modalidades pode conter um percentual de gema de ovo. Este pode ser uma função, por exemplo, da quantidade de proteína conLida em um extensor de células de esperma contendo proteína combinado com um meio de centrifugação contendo crioprotetores , em que tal proteína pode ser da gema de ovo. Em várias modalidades, o percentual de gema de ovo contido em um meio de centrifugação de células de espenna contendo crioprotetores e contendo proteína pode incluir mais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 0,8 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, ou talvez rnais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo. Algumas modalidades podem incluir um percentual de gema cie ovo contido em um meie» de centrifugação de células de espenna contendo crioprotetores e contendo proteína de aproximadamente 1,6 por cento.

Em algumas modalidades, a sujeição de um meio de centrifugação de células de esperma contendo crioprotetores e contendo proteína a uma centrifugação pode incluir possivelmente a centrifugação de tal meio de centrifugação de células de espenna contendo crioprotetores e contendo proteína com uma fração de gema de ovo em comparação com um meio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células de espenna identificadas. Os métodos típicos para a centrifugação de células de esperma identificadas podem sc-r compreendidos como incluindo possivelmente todos os métodos para a centrifugação de células de esperma identificadas que não utilizem as novas técnicas aqui reveladas, e pode particularmente incluir talvez os métodos de centrifugação de células de esperma que são bem conhecidos do estado da técnica. Além disso, a expressão fração pode ser compreendida como incluindo uma quantidade de gema de ovo menor do que a contida em um meio de centrifugação utilizado em tal método típico. Em algumas modalidades, essa fração pode incluir talvez rnenos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo em comparação com um meio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células cie esperma identificadas, menos do que aproximadamente 25 por cento ern comparação com um rneio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células de esperma identificadas, menos do que aproximadamente 10 por cento em comparação com um meio de centrifugação utilizado ern um método típico para a centrifugação de células de esperma identificadas, menos do que aproximadamente 5 por cento em comparação com um meio de centrifugação utilizado em um método típic o para a centrifugação de células de espenna identificadas, menos do que aproximadamente 4 por cento ern comparação com um rneio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células de espenna identificadas, menos dc> que aproximadamente 3 por cento em comparação com um meio de centrifugaç ão utilizado em um método típico para a centrifugação de células de esperma identificadas, menos cio que aproximadamente 2 por cento em comparação com um meio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células de espenna identificadas, ou talvez menos do que aproximadamente 1 por cento em comparação com urn meio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células de esperma identificadas. Em algumas modalidades, tal fração do percentual de gema de ovo ern comparação com um meio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células de espenna identificadas pode ser um meio de centrifugação de células de esperma contendo erioprotetores e contendo proteína com menos do que aproximadamente 3 por cento de gema de ovo. Algumas modalidades podem possivelmente incluir até mesmo a centrifugação de um um meio de centrifugação de células de esperma contendo erioprotetores, contendo proteína e contendo glicerol com menos do que aproximadamente 1 1 por cento de gema de ovo.

Agora com referência principalmente á Fig. 3, algumas modalidades podem envolver um método para a extensão de células de esperma identificadas e afetadas por um evento de identificação. A expressão “extensão” pode ser entendida como incluindo conferir às células de esperma ao menos uma ou mais das funcionalidades de um exlensor de células de esperma. Além disso, várias modalidades podem incluir a obtenção de uma pluralidade de células de esperma quanto a uma característica desejada. As modalidades podem incluir também o estabelecimento de um exlensor de células de esperma contendo proteína com um primeiro valor de conteúdo protéico. Este primeiro valor de conteúdo protéico pode ser compreendido como incluindo o conteúdo protéico de tal extensor de células de esperma contendo proteína estabelecido antes de quaisquer eventos subsequentes que possam alterar tal conteúdo protéico.

Além disso, várias modalidades podem incluir a obtenção de uma pluralidade de células de esperma, a sujeição de tal pluralidade de células de esperma a estímulos de identificação, e a seleção de tal pluralidade de células de esperma quanto a uma característica desejada. As modalidades podem incluir ainda o estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo proteína com um primeiro valor de conteúdo protéico. Este primeiro valor de conteúdo protéico pode ser compreendido corno incluindo o conteúdo protéico de tai extensor de células de esperma contendo proteína antes de quaisquer eventos subsequentes que possam alterar tal conteúdo protéico.

Varias modalidades podem incluir também a adição de uma pluralidade de células de esperma sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada a um extensor de células de esperma contendo proteína com um primeira valor de conteúdo protéico e também a adição um extensor de células de esperma livre de proteínas ao referido extensor de células de esperma contendo proteína com um primeiro valor de conteúdo protéico. Em várias modalidades a adição de um extensor de células de esperma livre de proteínas a um extensor de células de esperma contendo proteína com um primeiro valor de conteúdo protéico pode ser obtida em uma temperatura fria. Essa temperatura fria pode incluir menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, menos do que aproximadamente 9 graus Celsius, menos do que aproximadamente 8 graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, menos do que aproximadamente 5 graus Celsius, menos do que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, ou talvez até mesmo menos do que aproximadamente 1 grau Celsius. Certas modalidades podem envolver a adição de um extensor de células de esperma livre de proteínas a um extensor de células de esperma contendo proteína com um primeiro valor de conteúdo protéico a uma temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.

Além disso, algumas modalidades podem incluir ainda a redução de um conteúdo protéico total de tal extensor de células de esperma contendo proteína com um primeiro valor de conteúdo protéico para um segundo valor de conteúdo protéico abaixo de tal primeiro conteúdo protéico. Um conteúdo protéico total possivelmente pode ser simplesmente a quantidade total de proteína em extensor de células de esperma contendo proteína em qualquer dado momento, e a expressão “redução do conteúdo protéico total" pode ser entendida como incluindo qualquer um dos vários métodos adequados para a obtenção de tal redução, incluindo possivelmente a remoção direta de conteúdo protéico ou talvez o simples aumento da quantidade de componentes sem proteínas em tal extensor de células de esperma contendo proteína. O primeiro valor de conteúdo protéico em algumas modalidades pode incluir um percentual de gema de ovo, por exemplo, em que tal proteína pode ser de gema de ovo. Em várias modalidades, esse percentual de gema de ovo pode incluir mais do que aproximadamente 0,8 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo. mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo, ou talvez até mais do que aproximadamente 6,4 pc*r cento de gema de ovo. Algumas modalidades podem incluir um percentual de gema de ovo de aproximadamente 3.2 por cento.

Além disso, a redução de um conteúdo protéico total para um segundo valor de conteúdo protéico abaixo de tal primeiro conteúdo protéico em algumas modalidades pode incluir a redução de um percentual de gema de ovo de tai extensor de células de esperma contendo proteína. Este pode ser uma função, por exemplo, possivelmente de um efeito de diluição da adição de uma pluralidade de células de esperma e da adição de um extensor de células de esperma livre de proteínas a tal extensor de células de esperma contendo proteína. Em várias modalidades, esse percentual de gema de ovo de um segundo valor de conteúdo protéico pode incluir mais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 0,S por cento de gema de ovo, mais dc> que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, ou talvez até mais cio que aproximadamente 3,2 por cento de gema ue ovo. Em algumas modalidades ta! percentual de gema de ovo de um segundo valor de conteúdo protéico pode ser de aproximadamente 1,6 por cento.

Em algumas modalidades, tal extensor de células de esperma contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico pode ser mantido em um estado não clarificado. Ao se manter um extensor de células de esperma contendo proteína em um estado não clarificado, deve ser entendido que tal extensor cie células de esperma contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico pode não sei· submetido a uma clarificação antes de qualquer etapa cie cenlriíugação. Além disso, certas modalidades podem envolver a sujeição desse extensor de células contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico a uma centrifugaçáo. Esta centriiúgação pode talvez servir para concentrar as células de esperma contidas em tal extensor de células de esperaria contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico, possivelmente separando tais células de esperma de outros componentes de um extensor de células de esperma contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico com base na densidade devido à aplicação de urna força centrífuga às células de esperma, Várias modalidades podem envolver ainda a decantação de uma porção de tal extensor de células de esperma contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico. Por exemplo, as células de esperma concentradas por centrifúgação podem ser concentradas na maior parte dentro de uma região, e a remoção de uma seção volumétrica pode talvez incluir a remoção da seção volumétrica contendo essas células de esperma concentradas ou talvez até mesmo a remoção de todas as seções volumétricas que não incluam tais células de esperma concentradas. Várias modalidades podem incluir também a adição de um extensor de células de espeiana contendo proteína suplementar com um segundo valor de conteúdo protéico e o aumento de um conteúdo protéico total de tal extensor de células de esperma contendo proteína para urn terceiro valor de conteúdo protéico mais alto do que um primeiro valor de conteúdo protéico. A expressão “extensor de células de esperma contendo proteína suplementar” pode ser compreendida como incluindo qualquer extensor de células de esperma contendo proteína adicional que suplemente um extensor de células de esperma contendo proteína com urn segundo valor de conteúdo protéico. A expressão “suplementar” pode ser compreendida como incluindo a adição de componentes adicionais de extensão de células de esperma, por exemplo, possivelmente a adição de uma quantidade adicional de proteína.

Além disso, o aumento de um conteúdo protéico total para um terceiro valor de conteúdo protéico em algumas modalidades pode incluir o aumente» cie um percentual de gema de ovo de tal extensor de células de esperma contendo proteína. Este pode ser uma função, por exemplo, possivelmente da adição de um extensor de células de esperma contendo proteína suplementar a um extensor de células de esperma contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico. Em várias modalidades, esse percentual de gema de ovo de urn terceiro valor de conteúdo protéico pode incluir mais do que aproximadamente 1 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 5 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 10 por cento de gema ?de ovo, mais do que aproximadamente 15 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, ou talvez até mais do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo. Em algumas modalidades, esse percentual de gema de ovo de um terceiro valor de conteúdo protéico pode ser de aproximadamente 16,5 por cento. Além disso, várias modalidades podem incluir o congelamento de um extensor de células de esperma contendo proteína com um terceiro valor de conteúdo protéico mais alto do que um primeiro valor de conteúdo protéico.

Agora com referência principalmente às Figs. 1-3, em várias modalidades uma pluralidade de células de esperma pode incluir talvez uma pluralidade de células de esperma de mamífero, incluindo, por exemplo, possivelmente uma pluralidade de células de esperma bovino, uma pluralidade de células de esperma equino, uma pluralidade de células de esperma suíno, uma pluralidade de células de esperma ovino, uma pluralidade de células de esperma cervídeo, uma pluralidade de células de esperma canino, ou talvez até mesmo uma pluralidade de células de esperma cie golfinho. Além disso, algumas modalidades podem envolver a seleção de tal pluralidade de células de esperma quanto a urna característica desejada. A expressão “seleção” pode ser compreendida como incluindo a identificação de células de esperma individuais com base em uma determinação quanto a elas possuírem ou não uma característica desejada sendo buscada. Em algumas modalidades, a seleção de células de esperma quanto a uma característica desejada pode incluir a identificação das células de esperma. A expressão “identificação” pode ser entendida como incluindo a ação de separação de células de esperma selecionadas com uma característica desejada das células de esperma que não possuem essa característica desejada, possivelmente incluindo populações de células de esperma com tal característica desejada e populações de células de esperma sem tal característica desejada. A identificação de células de esperma pode ser alcançada através de qualquer uma das técnicas apropriadas, incluindo possivelmente técnicas de imunossexagem. técnicas de flutuação, ou talvez até mesmo técnicas de citometria de fluxo. Adicional mente, a expressão “característica desejada” pode ser compreendida corno incluindo qualquer característica identificável de uma célula de esperma desejada para uma dada aplicação de células de esperma. Por exemplo, em algumas modalidades uma característica desejada pode incluir uma característica sexual de uma célula de esperma, talvez até mesmo uma característica portadora ue cromossomo X de uma célula de esperma ou uma característica portadora de cromossomo Y de uma c élula de esperma. A expressão “extensor de células de esperma contendo proteína” em várias modalidades pode ser compreendida como incluindo qualquer extensor de células de esperma contendo ao menos algum grau de conteúdo proléico. Além disso, em várias modalidades, um extensor de células de esperma contendo proteína pode incluir possivelmente conteúdo protéico de base vegetal ou possivelmente conteúdo protéico cie base animal, o que deve ser entendido como incluindo proteínas derivadas de fontes vegetais e animais, rc-spectivamente. Em certas modalidades, um extensor de células de esperma contendo proteína de base animal pode incluir um extensor de células de esperma contendo lipoproteína. Deve-se notar que as lipoproteínas podem ser talvez uma subclasse de proteínas em que ao menos um componente de tal proteína é um lipídio. Tal conteúdo iipoprotéico pode ser talvez derivado de várias fontes animais, incluindo possivelmente gemas de ovo coletadas a partir de várias espécies de ovos animais, incluindo talvez ovos de galinha.

Desta forma, em certas modalidades, um extensor de células de esperma contendo proteína pode incluir talvez um extensor de células de esperma contendo gema de ovo. Deve-se notar que o conteúdo em gema de ovo preciso desse extensor de células de esperma contendo gema de ovo pode ser variado, dependendo das necessidades de uma aplicação particular para a qual as células de esperma possam ser utilizadas. Contudo, em algumas modalidades, um conteúdo ern gema de ovo de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo pode incluir menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 40 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 30 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 15 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 10 por cento de gema de ovo. ou talvez até mesmo menos do que aproximadamente 5 por cento de gema de ovo. Em certas modalidades, um conteúdo em gema de ovo de um extensor de células de esperma contendo gema de c»vo pode ser de aproximadamente 20 por cento de gema de ovo. TJrn crioprotetor pode ser incluído como uma parte constitutiva de um extensor de células de esperma em várias modalidades. Desta forma, um extensor de células de esperma em várias modalidades pode incluir possivelmente um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas ou talvez até mesmo um extensor de células de esperma contendo crioprotetores e proteína. Deve-se notar que vários crioprotetores bem conhecidos talvez possam ser apropriados para tal adição a um extensor de células de esperma. Em várias modalidades, tal crioprotetor pode incluir possivelmente glicerol. Deve-se notar que o conteúdo em glicerol preciso de tal extensor de células de esperma contendo glicerol pode ser variado dependendo das necessidades de uma aplicação particular para a qual as células de esperma podem ser utilizadas. No entanto, em algumas modalidades um extensor de células de esperma contendo glicerol pode ter mais do que aproximadamente 3 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 6 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 12 por cento de glicerol, ou talvez até mais do que aproximadamente 24 por cento de glicerol. Em certas modalidades, o conteúdo em glicerol de um extensor de células cie esperma contendo glicerol pode ser de aproximadamente 6 por cento.

Além disse», em certas modalidades um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteína pode ser adicionado a uma substância em um volume igual ao desta substância, talvez incluindo a obtenção* de tal adição» em múltiplas etapas. Por exemplo», a adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteína a uma primeira mistura de células de esperma resfriada pode envolver a adição de tal extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteína com um volume igual ao volume de tal primeira mistura de células de esperma resfriadas, talvez em duas ou mais etapas. De forma semelhante, a combinação de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas e de um extensor de células de esperma livre de proteínas pode envolver a adição de tal extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas em um volume igual ao volume de tal extensor de células de esperma livre de proteínas, talvez em duas ou mais etapas. Além disso, a adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas a um extensor de células de esperma. contendo proteína pode envolver a adição de tal extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas com urn volume igual ao volume de tal extensor de células de esperma contendo proteína, talvez em duas ou mais etapas.

Um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas em certas modalidades pode incluir um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade. Desla forma, em algumas modalidades, a adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas a uma primeira mistura resfriada de células de esperma estendidas pode envolver a adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade a tal primeira mistura resfriada de células de esperma estendidas. Além disso, em algumas modalidades, a provisão de urn extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas pode envolver a provisão de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente cie baixa densidade. Ademais, em algumas modalidades, a adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas a um extensor de células de esperma contendo proteína pode envolver a adição de um extensor cie células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade a tal extensor de células de esperma contendo proteína. A expressão “gradiente de baixa densidade" pode ser entendida como incluindo urn extensor de células de esperma contende» variações de densidade mínimas ao longo de seu volume. Em algumas modalidades, um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade pode talvez incluir um extensor de células de esperma contendo crioprotetores substancialmente líquido. A expressão “subslancialmenle líquido" pode ser compreendida como incluindo um extensor de células de esperma contendo crioprotetores em que todas as partes constitutivas deste extensor de células de esperma contendo crioprotetores estão em um estado substanciaimente líquido. Em várias modalidades, um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade pode talvez incluir um extensor de células de esperma contendo crioprotetores de centri fugação eficiente. A expressão “centrifugação eficiente” deve ser compreendida como incluindo um extensor de células de esperma contendo croprotetores com propriedades que levam â centri fugação, por exemplo, possivelmente incluindo diferenças de densidade claramente demarcadas em suas partes constitutivas ou talvez até mesmo a falta de regiões de alta densidade localizada que possam apresentar um risco cie compressão para algumas de suas partes constitutivas. Em várias modalidades, um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade pode talvez incluir um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com densidade uniforme, c* que pode ser entendido como incluindo um número mínimo de regiões de densidade mais alta, possivelmente até aproximando-se de nenhuma área de densidade local elevada. Em várias modalidades, um extensor de células cie esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade pode incluir um extensor de células de esperma contendo crioprotetores substancialmente sem nenhuma partícula de compressão de células de esperma. A expressão “partícula de compressão de células de esperma” pode ser entendida como inciuindo qualquer partícula ou grupe* cie partículas unidas entre si que possam tender a comprimir as células de esperma a um nível causador de danos quando sujeitas a vários tipos de forças, possivelmente incluindo forças centrífugas. Em várias modalidades, um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade pode talvez incluir urn extensor de células de esperma contendo crioprotetores de baixa viscosidade. A expressão “baixa viscosidade” pode ser compreendida corno incluindo uma viscosidade de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores suficiente para permitir que suas partes constitutivas passem uma pela outra sem que tendam à compressão de qualquer parle constitutiva por outra parte constitutiva. Várias modalidades podem incluir o ajuste de uma concentração de células de esperma cie uma substancia para uma concentração de pre-congelamento de células de esperma. A expressão “concentração de pré- congelamento de células de esperma” pode ser compreendida como incluindo uma concentração de células de esperma ern que estas células de esperma possam ser subseqüentemente congeladas. Por exemplo, algumas modalidades podem envolver o ajuste de uma concentração de células de esperma de uma segunda mistura resfriada de células de esperma estendidas para uma concentração de pré-congelamenio de células de esperma, enquanto que outras modalidades podem envolver o ajuste de uma concentração de células de esperma de um extensor de células de esperma contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico para urna concentração de pré-ccongelamento de células de esperma. Em várias modalidades, o ajuste para tal concentração de pré-eongelamenlo de células de esperma pode incluir a adição de um extensor de células cie esperma contendo proteína, incluindo, por exemplo, possivelmente a adição de um extensor de células de esperma contendo proteína a uma segunda mistura de células de esperma estendidas, ou possível mente a adição de um extensor de células de esperma contendo proteína suplementar a um extensor de células cie esperma contendo proteína com um segundo valor de conteúdo protéico.

Em várias modalidades, o ajuste cie uma concentração de células de esperma para urna concentração de pré-congelamento de células de esperma pode envolver o ajuste de uma concentração de células de esperma para uma concentração de pré-congelamento própria a uma espécie. A expressão “concentração de pré-congelamento de células de esperma própria a uma espécie” pode ser compreendida como incluindo uma concentração de células de esperma em que estas células de esperma podem ser subsequentemente congeladas que seja apropriada para a espécie de animal a partir uo qual tais células de esperma foram obtidas. Deve-se notar que uma concentração de pré-congelamento de células de esperma própria a uma espécie pode ser conhecida para uma variedade de espécies anirnais, ou talvez possam mesmo ser determinadas por observações empíricas rotineiras ao longo de um número de eventos de congelamento. Em algumas modalidades, uma concentração de pré-congelarnento de células de esperma própria a uma espécie uma concentração de pré-congelamento de células de esperma bovino, uma concentração de pré-congelamento de células de esperma eqliino, urna concentração de pré- congelamento de células de esperma suíno, uma concentração de pré-congelamento de células de esperma ovino, uma concentração de pré-congelamento de células de esperma cervídeo, uma concentração de pré-congelarnento de células de esperma canino, ou talvez uma concentração de pré-congelamento de células de esperma de golfinho. Além disso, em várias modalidades uma concentração de pré-congelamento de células cie esperma própria a uma espécie pode incluir menos do que aproximadamente 100 milhões de células de esperma por mililitro, menos do que aproximadamente 50 milhões de células de esperma por mililitro, menos do que aproximadamente 40 milhões de células de esperma por mililitro, menos do que aproximadamente 30 milhões de células de esperma por mililitro, menos do que aproximadamente 20 milhões de células de esperma por mililitro, menos do que aproximadamente 15 milhões de células de esperma por mililitro, menos do que aproximadamente 10 milhões de células de esperma por mililitro, menos do que aproximadamente 5 milhões de células de esperma por mililitro, ou talvez ate mesmo menos do que aproximadamente 2 milhões de células de esperma por mililitro. Em certas modalidades, possivelmente incluindo aquelas envolvendo uma concentração de pré-eongelamento cie células de esperma bovino, uma concentração de pré-congelamento de células de esperma própria a uma espécie pode ser cie aproximadamente 10 milhões de células de esperma por mililitro. O ajuste de uma concentração de células de esperma para uma concentração de pré-congelamento de células de esperma em algumas modalidades pode incluir o estabelecimento de um conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento. Por exemplo, o ajuste de uma concentração de pré-congelamento de células de esperma de uma segunda mistura resfriada de células de esperma estendidas para uma concentração de pré-congelamento de células de esperma pode incluir o estabelecimento de um conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento dessa segunda mistura de células de esperma estendidas. De forma semelhante, o ajuste de uma concentração de células de esperma de um extensor de células de esperana contendo proteína com um segundo valor de conteúdo proléico para uma concentração de pré-congelamento de células de esperma pode incluir o estabelecimento de um conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de tal extensor de células de espenna contendo proteína. Um conteúdo em gema de ovo de pré-eongelamento pode ser compreendido como incluindo possivelmente simplesmente urn conteúdo em gema de ovo de uma substância em uma concentração de pré-congelamento. Em várias modalidades, o conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento pode incluir um conteúdo em gema de ovo dentro de urn percentual do conteúdo em gema de ovo de um método típico para o congelamento de células de espenna identificadas. Tal método típico para o congelamento de células de espenna identificadas pode ser entendido como incluindo possivelmente iodos os métodos para o congelamento de células de espenna identificadas que não utilizem as novas técnicas reveladas aqui, e particulannente pode incluir possivelmente aqueles métodos para o congelamento de células de espenna identificadas que são bem conhecidos na técnica. Em várias modalidades, um conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento pode incluir possivelmente dentro de aproximadamente 50 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamenío de um método típico para o congelamento de células de espenna identificadas, dentro de aproximadamente 25 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamenío de um método típico para o congelamento de células de espenna identificadas, dentro de aproximadamente 20 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de espenna identificadas, dentro de aproximadamente 15 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, dentro de aproximadamente 10 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamenío de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, dentro de aproximadamente 5 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um rnélodo típico para o congelamento de células de esperma identificadas, dentro de aproximadamente 2 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, ou aié mesmo dentro de aproximadamente 1 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de espenna identificadas.

Ademais, em certas modalidades o conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento possivelmente pode ser estabelecido como um valor absoluto de menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, de menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, de menos do que aproximadamente 40 por cento de gema de ovo, de menos do que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, de menos do que aproximadamente 30 por cento de gema de ovo, de menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, de menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, de menos do que aproximadamente 15 por cento de gema de ovo, ou até de menos do que aproximadamente 10 por cento de gema de ovo. Em algumas modalidades, o conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento pode ser estabelecido em aproximadamente 16,5 por cento. O uso de um extensor de células de esperma estéril pode estar envolvido em certas modalidades. Por exemplo, em várias modalidades, um extensor de células de esperma livre de proteínas pode incluir um extensor de células de esperma livre de proteínas estéril, e um extensor de células de esperma contendo erioproletores livre de proteínas pode incluir um extensor cie céluias de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas estéril.

Agora com referência adicional principalmente à Fig. 1, várias modalidades podem incluir urna mescla incipiente (!), que em várias modalidades pode incluir possivelmente urna mescla incipiente de células de esperma identificadas e afetadas. Uma mescla pode ser compreendida como incluindo duas ou mais substâncias em um estado para que sejam misturadas, e uma mescla (1) incipiente pode ser compreendida como incluindo uma mescla que seja menos do que cornpleiamente saturada com relação a quaisquer dois componentes constitutivos capazes de serem misturados. Em várias modalidades, urna mescla incipiente (1) pode incluir uma mescla que atingiu menos do que 50 por cento de saturação, menos do que 25 por cento de saturação, menos do que 10 por cento de saturação, menos do que 5 por cento de saturação, menos do que 2 por cento de saturação, ou talvez até mesmo menos do que 1 por cento de saturação.

Algumas modalidades podem incluir duas ou mais substâncias nascentes em relação de mescla incipiente. Uma relação de mescla incipiente pode ser compreendida como incluindo dois ou mais substâncias relacionadas por existirem juntamente em uma mescla incipiente (1). Uma substância nascente pode ser compreendida como incluindo uma substancia que exista em uma combinação menos do que saturada com uma outra substância em relação de mescla incipiente. Além disso, uma mescla em algumas modalidades pode incluir dois ou mais componentes nascentes, sendo que tal componente pode ser entendido como sendo um componente de uma mistura incipiente (1). Por exemplo, várias modalidades podem incluir uma pluralidade nascente de células cie esperma selecionadas quanto a uma característica desejada (2 > em relação de mescla incipiente (3), um componente extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas nascente em relação de mescla incipiente (4), ou talvez até mesmo um componente extensor cie células de esperma contendo proteína nascente em relação de mescla incipiente (5 ).

Em algumas modalidades, uma substância nascente pode incluir uma substância localizada proximamente em um estado substancialmente não combinado a ao menos um componente de urna mescla incipiente (1). A expressão “localizada proximamente” pode ser compreendida como incluindo uma localização de tal substância nascente perto o suficiente de tal componente de uma mescla incipiente para permitir uma combinação dos dois. A expressão “estado substaneiaimente não combinado” pode ser compreendida como incluindo a existência de ial substância nascente em um estado de combinação predorninanlemente insalurada com tal componente de uma mescla incipiente (1), o que pode incluir possivelmente existindo como mais do que 50 por cento não combinado, existindo como mais do que 75 por cento não combinado, existindo mais do que aproximadamente 90 por cento não combinado, existindo mais do que aproximadamente 95 por cento não combinado, ou talvez até existindo mais do que aproximadamente 99 por cento não combinado. Por exemplo, várias modalidades podem incluir uma pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada proximamente localizada em um estado substancialmente não combinado a pelo menos um componente de uma mescla incipiente (1), um componente extensor de células de esperma livre de proteínas localizado proximarnente em um estado substancialmente não combinado a pelo menos um componente de uma mescla incipiente (1 ), um extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas localizado proximarnente em um estado substancialmente não combinado a pelo menos um componente de uma mescla incipiente ?), ou talvez até mesmo um componente extensor de células de esperma contendo proteína localizado proximarnente em um estado substancialmente não combinado a pelo menos um componente de uma mescla incipiente (1).

Ademais, certas modalidades podem incluir uma zona livre de barreira entre urna substancia nascente e um componente de uma mescla incipiente (1). Esta zona livre de barreira pode ser compreendida corno incluindo uma zona que não contenha elementos que possam tender a prevenir a combinação de tal substância nascente e tal componente de uma mescla incipiente (1). Algumas modalidades podem até envolver urna força de combinação induzida à qual urna substância nascente e urn componente de uma mescla incipiente (1) podem ser sensíveis. Esta força de combinação induzida pode ser compreendida como incluindo qualquer força que tenda a induzir a combinação de duas ou mais substâncias em relação de mescla incipiente. Exemplos de uma força de combinação induzida podem incluir possivelmente uma força associada â densidade, uma força associada à concentração, ou talvez até mesmo forças hidrodinâmicas simples geradas pela colocação de vários líquidos em um recipiente. A expressão “sensível” pode ser compreendida corno incluindo qualquer efeito sobre tal substância nascente ou componente de uma mescla incipiente (1 > causado por tal força de combinação induzida.

Além disso, uma mistura incipiente < 1) em algumas modalidades pode conter um conteúdo em gema de ovo. Este pode ser uma função, por exemplo, da quantidade de proteína em um componente extensor de células de esperma contendo proteína, possivelmente em que tal proteína seja de gema de ovo. Em várias modalidades, o percentual de gema de ovo contido em uma mescla incipiente (1) pode incluir rnais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente Ü,S por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, ou talvez até mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo. Algumas modalidades podem incluir um percentual de gema de ovo contido em uma mistura incipiente (l í de aproximadamente 1,6 por cento.

Em várias modalidades, uma mescla incipiente (i) pode incluir urna mescla incipiente não clarificada. Várias modalidades podem incluir também uma mescla incipiente resfriada. Em algumas rnodalidades, uma mescla incipiente resfriada pode ser uma mescla incipiente (1) em uma temperatura menor do que aproximadamente 10 graus Celsius, menor do que aproximadamente 9 graus Celsius, menor do que aproximadamente $ graus Celsius, menor do que aproximadamente 7 graus Celsius, menor do que aproximadamente 6 graus Celsius, menor do que aproximadamente 5 graus Celsius., menor do que aproximadamente 4 graus Celsius, menor do que aproximadamente 3 graus Celsius, menor do que aproximadamente 2 graus Celsius, ou talvez alé mesmo menor do que aproximadamente 1 grau Celsius.

Agora com referência adicional principal mente à Fig. 2, algumas modalidades podem incluir um meio de processamento de células de esperma identificadas e afetadas. A expressão “meio de processamento” pode ser compreendida como incluindo qualquer meio conducente a células de esperma no qual as células de esperma possam ser colocadas para passar por um processamento. Além disso, as modalidades podem incluir também uma pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada, um componente extensor de células de esperma livre de proteínas não clarificado, um componente extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas não clarificado, e um meio de centrifugação não clarificado (7 ) em que a referida pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada, o referido componente extensor de células de esperma livre de proteínas não clarificado, e o referido componente extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas não clarificado são suspensos. A expressão “não clarificado” pode ser compreendida como incluindo uma substancia mantida em um estado não clarificado, e a expressão “estado não clarificado” pocle ser compreendida como incluindo urn estado no qual uma substância possa existir em que tal substância não foi clarificada. A expressão “meio de centrifugação” pode ser entendida como incluindo qualquer meio conducenle a células de esperma que ern algum ponto é submetido a uma cen trifu gaçã o.

Certas modalidades podem incluir ainda um componente exiensor de células de esperma contendo proteína não clarificado suspenso em um meio de centrifugação não clarificado (7). Além disso., tal meio de centrifugação não clarificado < 7 > em algumas modalidades pode conter um conteúdo em gema de ovo. Este pode ser uma função, por exemplo, possivelmente da quantidade de proteína em tal componente extensor de células de esperma contendo proteína não clarificado suspenso, possivelmente em que tal proteína pode ser de gema de ovo. Em várias moda!idades, o percentual de gerna de ovo contido em tal meio de centrifugação não clarificado (7 ) pode incluir mais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 0,8 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, ou talvez até mesmo mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo. Algumas modalidades podem incluir um percentual de gema de ovo contido em tal meio de centrifugação não clarificado (7) de aproximadamente 1,6 por cento. Além disso, em certas modalidades um meio de centrifugação não clarificado (7) pode conter ao menos algum glicerol e ter menos do que aproximadamente 11 por cento de gerna de ovo.

Além disso, em certas modalidades, um meio de centrifugação não clarificado (7) pode possivelmente incluir um meio de centrifugação não clarificado resfriado (7 ). Esse meio de centrifugação não clarificado resfriado (7) pode incluir possivelmente um meio de centrifugação não clarificado <7) em uma temperatura menor do que aproximadamente 10 graus Celsius, menor do que aproximadamente 9 graus Celsius, menor do que aproximadamente S graus Celsius, menor do que aproximadamente 7 graus Celsius, menor do que aproximadamente 6 graus Celsius, menor do que aproximadamente 5 graus Celsius, menor do que aproximadamente 4 graus Celsius, menor do que aproximadamente 3 graus Celsius, menor do que aproximadamente 2 graus Celsius, ou até mesmo menor do que aproximadamente 1 grau Celsius. Em algumas modalidades, um meio de eentrifugação não clarificado resfriado (7) pode incluir um meio de eentrifugação não clarificado (7) em uma temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.

Em algumas modalidades, um meio de eentrifugação não clarificado (7) pode possivelmente possuir um número mínimo de regiões de alta densidade localizada (6), incluindo talvez até mesmo nenhuma região de alta densidade localizada (6). A expressão “localizada” deve ser compreendida como incluindo uma região de um meio de eentrifugação não clarificado (?) que possa ser concentrada dentro de um volume pequeno de tal meio de eentrifugação não clarificado (7), incluindo possivelmente um volume menor do que aproximadamente 3 por cento, menor do que aproximadamente 2 por cento, ou talvez até menor do que aproximadamente 1 por cento do volume total de um meio de eentrifugação não clarificado < 7). A expressão “região de alta densidade localizada” (6) deve ser compreendida como incluindo regiões localizadas de um meio de eentrifugação não clarificado (7) com uma densidade substanciaimente mais alta do que as regiões circundantes, incluindo possivelmente mais do que 10 por cento de uma densidade circundante, mais do que 20 por cento de uma densidade circundante, mais do que 30 por cento de uma densidade circundante, mais do que 40 por cento de urna densidade circundante, mais do que 50 por cento de uma densidade circundante, mais do que 100 por cento de uma densidade circundante, mais do que 200 por cento de urna densidade circundante, mais do que 300 por cento de uma densidade circundante, mais do que 400 por cento de uma densidade circundante, ou talvez até mesmo mais do que 500 por cento de uma densidade circundante por cento de uma densidade circundante.

Agora com referência adiciona! principal mente à Fig. 3, certas modalidades podem incluir um meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas e afetadas. Um meio de extensão de células de esperma pode ser compreendido como incluindo qualquer meio eonduc&nte a células de esperma no qual células de esperma possam ser colocadas para extensão. A expressão “intermediário” pode ser compreendida como incluindo um meio de extensão de células de esperma que represente uma etapa intermediária em um processo de tratamento de células de esperma. Por exemplo, em várias modalidades, tal etapa intermediária possivelmente pode incluir a adição de um crioprotetor a urn meio de células de espemia previamente preparado, a adição de conteúdo protéico a um meio de células de esperma previamente preparado, ou talvez a centrifúgação de um meio de células de esperma previamente preparado.

Além disso, outras modalidades podem incluir urna pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a urna característica desejada (8), um componente extensor de células de esperma livre de proteínas (9), um componente extensor de células de esperma contendo crioproletores livre de proteínas (10), e um componente extensor de células de esperma contendo proteína (11). Certas modalidades podem incluir também um conteúdo protéico total que não exceda aproximadamente 1,6 por cento (12). Este pode ser uma função, por exemplo, possivelmente da quantidade de proteína ern um componente extensor de células de esperma contendo proteína de tal meio de extensão de células de esperma intermediário. Em algumas modalidades, a proteína em um extensor de células de esperma contendo proteína pode ser possivelmente de gema de ovo. Desta forma, urn conteúdo protéico total que não excede aproximadamente 1,6 por cento pode incluir possivelmente um conteúdo de gema de ovo que não exceda aproximadamente 1,6 por cento.

Certas modalidades podc-m incluir também um meio de extensão intermediário resfriado no qual urna pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada (8), urn componente extensor de células de esperma livre cie proteínas (9), um componente extensor de células de esperma contendo crioproletores livre de proteínas (10), e um componente extensor de células de esperma contendo proteína (11) podem ser suspensos. Em algumas modalidades, tal meio de extensão intermediário resfriado pode incluir um meio de extensão intermediário a uma temperatura possivelmente menor do que aproximadamente 10 graus Celsius, menor do que aproximadamente 9 graus Celsius, menor do que aproximadamente S graus Celsius, menor do que aproximadamente 7 graus Celsius, menor do que aproximadamente 6 graus Celsius, menor do que aproximadamente 5 graus Celsius, menor do que aproximadamente 4 graus Celsius, menor do que aproximadamente 3 graus Celsius, menor do que aproximadamente 2 graus Celsius, ou até mesmo menor do que aproximadamente 1 grau Celsius. Em certas modalidades, tal meio de extensão intermediário resfriado pode possuir uma temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.

Diversas vantagens podem fazer parle da tecnologia inventiva. Em particular, o uso de um exlensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas em várias modalidades pode representar uma melhora significativa sobre os extensores de células de esperma anteriores. Por exemplo, a adição de tal exlensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas a outros extensores de células de esperma pode reduzir agrupamentos ou outras regiões localmente densas devido talvez a uma concentração mais baixa de iais proteínas, possivelmente incluindo a gema de ovo. Isto pode reduzir ou talvez até eliminar a compressão de células de esperma em certas aplicações, por exemplo, a centrifugação, que pode causar danos às células de esperma. Adicional mente, a redução de tais agrupamentos em urn exlensor de células de esperma pode eliminar a necessidade de se clarificar ial exlensor, resultando em economias em material associadas, economia de trabalho, economia de tempo, e economias financeiras. Além disso, um exlensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proteínas pode ser menos suscetível aos efeitos de espoliação. Isto pode permitir que taí extensor de células de esperma seja preparado em grandes quantidades antes do tempo, ao invés de preparados com base na necessidade imediata. Adicionalmente, a mitigação dos efeitos de espoliação pode reduzir o risco de contaminação por bactérias. Além disso, como tal extensor de células de esperma pode possivelmente ser menos sensíveis ás condições do ambiente, ele pode ser mais capaz de ser transportado ao longo de grandes distâncias ern que as condições ambientais possam variar.

Desta forma, ial extensor de células de esperma contendo crioprotetores livre de proieínas pode ser uma fração B eficaz de urna célula cie esperma em várias aplicações. Além disse», pode ser que o uso de tal extensor de células de esperma contenclo crioprotetores livre de proteínas não cause um impacto adverso significativo sobre a eficácia de um extensor de células de esperma com que ele foi utilizado. Por exemplo, em modalidades relacionadas a técnicas de inseminação artificial, o uso de tal exlensor de células de esperma talvez possa dar resultados que não são significativamente diferentes dos resultados obtidos com o uso dos extensores de células de esperrna típicos. Em particular, as taxas de gravidez obiidas com tal extensor de células de esperma em várias modalidades talvez possa ser comparável às taxas obiidas com extensores de células de esperrna típicos, incluindo possivelmente até mesmo sendo estatisticamente comparável (P > 0,05 ) em várias modalidades.

Diversos exemplos podem ser relatados utilizando a tecnologia inventiva conforme aqui descrita. Fundamentalmente, estes exemplos devem ser entendidos como representativos apenas de algumas modalidades da tecnologia inventiva. Desta forma, deve-se notar que estes exemplos não devem ser interpretados como limitativos do escopo da tecnologia inventiva aqui descrita.

Exemplo 1 Um procedimento possível para a coleta e o processamento de esperma identificado envolvendo uma fração B de um extensor contendo gema de ovo pode ser o seguinte. Um meio carch tris-A (2 ml) pode ser depositado em um tubo Falcon de 50 ml. ü esperma identificado pode ser coletado dentro do tubo Falcon de 50 ml ao longo de aproximadamente 1 hora para um volume total identificado de 12,5 ml. Este volume pode não conter glicerol e pode ser referido como a fração-A. O percentual de gema de ovo na fração-A para este exemplo é de 3,2% [(2-ml “Catch”) / (12,5-ml volume total) x (20% gema de ovo “Catch”) = 3,2%)]. A mesc la de 3,2% de gema cie ovo pode ser resfriada até 5°C ao longo de talvez 90 minutos. Em seguida ao período de resfriamento, um volume igual de extensor contendo glicerol com 20% de gerna de ovo <fração-B: 12% glicerol) pode ser adicionado em etapas corne* 2 frações iguais em intervalos talvez de 15 minutos. O esperma identificado resfriado, agora contido neste exemplo em um extensor-AB com 11,6% de gema de ovo [(í 12,5-ml fração-A) x (3,2% geir.a de ovo) (12,5-ml fração-B) x (20% gema de ovo)) / 25-m! volume total = 11,ó% gema de ovo], pode ser centrifugado para concentração. Este método de adicionar o extensor contendo glicerol ao esperma resfriado pode prevenir uma extensão excessiva das bolas de espemia que pode ocorrer quando gotíeulas que não contém esperma forem possivelmente coletadas durante o processo de identificação, caso a bola de esperma seja deixada em um volume muito grande, e pode assegurar que o conteúdo em glicerol seja sempre de 6%. Urna bola de esperma de 200-?1 pode permanecer após a remoção da suspensão. Bolas de esperma do mesmo macho podem ser juntadas e o volume total pode ser determinado por peso. C» número de esperma total identificado pode ser determinado, talvez com múltiplas contagens de um hemocitômetro, e a concentração de esperma da bola pode ser ajustada para urna concentração de congelamento desejada, talvez com um extensor AB com 2OH de gema de ovo.

Neste exemplo, se a concentração de esperma no volume identificado de 12,5-ml é de 1 x 10° esperrnas/ml, representando 12,5 x 10° de esperma total, e a taxa de recuperação pós-centrifúgação é de 85%, então a concentração de esperma na bola de esperma de 200-?1 é de ~ 53 x 10L' espermas/ml (10,6 x 106 esperma total ). Se uma concentração de congelamento de 10 x 10° espermas/ml for desejada para esta metodologia, então SõO-?? de extensor AB com 20% de gema de ovo podem ser adicionados à bola de espenna de 200-?1. Com base nesse modelo, o percentual fina! de gema de ovo para o congelamento de espenna iclenlificado é cie 18,4% [((0,200-ml bola de esperma) x (1 1,6% gema de ovo) I- (0,860-ml extensor AB) x (20% gema de ovo)) / 1,06-ml volume total = 18,4% final de gerna de ovo].

Utilizando o exemplo acima, porém substituindo com um extensor-B com 0% de gema ue ovo no lugar do exíensor-B com 20%· de gema de ovo, o percentual de gema de ovo contido no volume de 25 ml a ser centrifugado é de 1,6%. [((12,5-ml fração-A) x (3,2% gema de ovo) X (12,5-ml ffação-B) x (0% gerna de ovo)) / 25-rnl volume total = 1,6% gema de ovo]. Se a bola de esperma neste exemplo for ajustada para uma concentração final de congelamento de 10 x 10° espermas/ml com extensor AB com 20% gema de ovo, o percentual de gema de ovo final é de 16,5% [((0,200-m! bola de esperma) x (1,6% gerna de ovo) ?+? (0,860-ml extensor-AB) x (20% gema de ovo)) J,0ó-ml volume total = 16,5% gema de ovo]. E>esta fonna, pode-se ver que o percentual final de gema de ovo pode talvez variar apenas ligeiramente entre os dois extensores de fração B diferentes. Quando se usa o extensor-B com 0% de gema de ovo, o percentual final de gema de ovo pode ser menor quando concentrações de esperma mais elevadas (> 10 x 10" espermas/ml) forem desejadas.

Exemplo 2 Um exemplo adicional pode ser relatado da seguinte forma. Espermas foram estudados a parti]· das primeiras ejaculações obtidas de o touros e o estudo foi replicado três vezes. Os espermas para este estudo não foram identificados mas foram submetidos à indicação Hoechsi 33342 e a diluição extrema como ocorre durante a identificação. O objetivo foi comparar a mobilidade pós-derretimento do esperma que recebeu extensor contendo glicerol (fração-B), com ou sem gema de ovo. Um objetivo adicional foi identificar o conteúdo ideal em glicerol necessário para o esperma identificado. Portanto, 3, 4, 5, e 6% de conteúdo final em glicerol foi estudado em ambos os extensores fração-B contendo glicerol com 0% e 20% de gema de ovo. Esperma congelado em bastões de 25 ml foram derretidos em um banho de água a 37°C por 30 segundos c foram incubados a 37°C. Estimativas visuais da mobilidade total foram determinadas por 2 observadores, cegos ao tratamento, logo após 30 e 120 minutos de incubação. A exclusão da gema de ovo no extensor fração B nãc» afetou adversamente a mobilidade pós-derretimento do esperma. Com efeito, a mobilidade foi estatisticamente mais elevada para o esperma processado no extensor fração B sem gema de ovo em comparação com a do extensor com 20% cie gema de ovo (P<0,05) em ambos os tempos de incubação. Ver Gráfico 1.

Gráfico 1 - Efeito da Gema de Ovo sobre a Mobilidade Total Médias entre tratamentos diferem P < 0,05 Uma concentração final de glicerol de 3% resultou em mobilidades estatisticamente mais baixas em 30 minutos e em 120 minutos após o derretimento, enquanto que as mobilidades foram mais elevadas e não diferiram em função do glicerol de 4-6"ó. Ver Gráfico 2. A partir deste exemplo, talvez possa-se concluir que 3% de glicerol não forneceu uma cnoproíeção adequada para o esperma identificado. Como as mobilidades não diferiram entre 4-6% de glicerol, e o fornecimento de c-rioproteção pode ser desejável (a qual pode diferir entre touros), uma concentração final de 6% de glicerol para a criopreservação de esperma identificado quanto ao sexo pode ser apropriada.

Gráfico 2 — Efeito do Glicerol sobre a Mobilidade Toial Médias com diferentes subscritos diferem entre tempos de incubação P < q}05 Exempio 3 Um outro exemplo pode ser relatado da seguinte forma. Um objetivo foi comparar a taxa de gravidez em 30 dias em novilhos Holstein com esperma portador de cromossomo-X que foi processado com um extensor de glicerol (12%) com 0% gema de ovo ao extensor contendo 20% de gema de ovo.

Esperma portador de cromossomo-X de cada um dentre 2 touros foi isolado com base no conteúdo do DN A utilizando-se um citomeiro de fluxo. O esperma identificado foi coletado em tubos de plástico de 50 ml contendo 2 ml de extensor TRJS-20%. de gema de ovo sem glicerol até que cada tubo contivesse 12,5 ml e aproximadamente 12 milhões de espermatozóides. Os espermatozóides identificados foram resfriados (5°C> ao longo de 90 minutos. Após o resfriamento, tubos de identificação contendo espermatozóides (Falcon 50 ml) foram separados uniformemente e um extensor contendo glicerol (fração B) foi adicionado. O esperma resfriado recebeu o extensor fração B contendo 0% de gema de ovo ou contendo 20% de 2ema de ovo. Os tubos contendo espermatozóides identificados (volume total de 25 mi) foram então centrifugados a 850 x g por 20 minutos a 5°C. A suspensão foi removida, deixando o esperma identificado em aproximadamente 200 pí em bolas. As bolas de esperma equivalentes foram juntadas e ajustadas para 10 x 10° espermalozóides/ml em meio AB com 20% de gema de ovo (6% de conteúdo linal em glieerol). O percentual final de gema de ovo no produto variou nos dias de identificação (faixa: ló,5 - 18,2 %). Os espermatozóides (2 x 10°) foram empacotados em bastões codificados de 0,25 ml para assegurar que os tratamentos fossem invisíveis aos técnicos de IA (inseminação artificial), colocados em prateleiras de congelamento e eriopreservados em vapor de LiN2. Um numero igual cie bastões de cada touro e tratamento foi colocado dentro de taças e ligado em varas de alumínio. A mobilidade pós-derreti mento dos espermatozóides foi determinada utilizando-se a mobilidade "Track” após 30 minutos de incubação a 37°C. O percentual médio de esperma progressivamente móvel para os códigos de congelamento processados com o extensor fração B com 20% de gema de ovo foi de 44% e o do extensor fração B com 20% dc* gema de ovo foi de 43%. 119 novilhos Holslein não sincronizados foram pesados para os diferentes meios de gema de ovo e entre 2 touros. A inseminação ocorreu 12 ou 24 horas o cio observado. Três inseminadores foram utilizados neste exemplo. Aproximadamente 1 mês após a inseminação, a gravidez foi determinada por ullrassom. Os dados foram submetidos ao AN OVA.

As taxas de gravidez não diferiram (P > 0,05) entre o esperma processado com o extensor fração k‘B” com 0% de gema de ovo e o esperma fração “B” com 2u% de gema de ovo. Ver Tabela 1.

As taxas reais de gravidez foram semelhantes entre os touros ? os técnicos cie IA (P > 0,05), e não houve interações estatísticas. Numericamente, a taxa de gravidez para o touro 52HO039 foi mais elevada do que a do touro 52HO038. Ver Tabela 2. Uma amostra maior da população pode ter resultado em seja importante apontar que, para este exemplo, os intervalos de confiança (IC), de 95%, são grandes.

Como pode ser facilmente compreendido a partir da discussão anterior, os conceitos básicos da presente invenção podem ser incorporados de uma variedade de formas. Ela envolve tanto técnicas de extensão de células de esperma quanto dispositivos para a obtenção da extensão de células de esperma apropriada. Neste pedido de patente, as técnicas de extensão de células de esperma são reveladas como parle dos resultados que demonstraram ser obtidos peios vários dispositivos descritos e das etapas que são inerentes à sua utilização. Elas são simplesmente o resultado natural da utilização dos dispositivos como concebidos e descritos. Além disso, embora alguns dispositivos tenham sido revelados, deve-se entender que estes não apenas atingem certos métodos mas também podem ser variados em um número de maneiras. Fundamentalmente, quanto a todo o precedente, todas estas facetas devem ser compreendidas como abrangidas por este pedido de patente. A discussão aqui incluída é concebida para que sirva como uma descrição básica. O leitor deve estar consciente de que a discussão específica pode não descrever explicitamente todas as modalidades possíveis; muitas alternativas estão implícitas. Ela pode também não explicar total mente a natureza genérica da invenção e pode não moslrar explicitamente como cada recurso ou elemento pode ser realmente representativo de uma função maior ou de uma grande variedade de elementos alternativos ou equivalentes. Mais uma vez, estas estão implicitamente incluídas nesta publicação. Onde a invenção for descrita em terminologia voltada para dispositivos, cada elemento do dispositivo implicitamente realiza uma função. As reivindicações de aparelho podem não estar incluídas apenas quanto ao dispositivo descrito, mas reivindicações de método ou de processo podem ser incluídas para endereçar às funções que a invenção e cada elemento realizam. Nem a descrição, e nem a terminologia são concebidas para limitar o escopo das reivindicações que serão incluídas em qualquer pedido de patente subsequente. E>eve ser entendido tarnbém que uma variedade cíe alterações pode ser feita sern que se ultrapasse a essência da invenção. Tais alterações também estão implicitamente incluídas na descrição. Elas ainda caem dentro do escopo desta invenção. Uma revelação mais ampla abrangendo ais) modalidade(s) impíícita(s) mostradas, a grande variedade de modalidades alternativas implícitas, e os vastos métodos ou processos e similares, está abrangida nesta publicação e podem ser confiadas durante a confecção das reivindicações para qualquer pedido de patente subseqüente. Deve-se entender que essas mudanças de linguajar e reivindicações mais amplas ou mais detalhadas podem ser alcançadas ern uma data posterior (em conformidade com qualquer prazo requerido), ou caso a depositante busque subsequentemente um depósito de patente baseado neste depósito. Com este entendimento, o leitor deve estar consciente de que esta publicação deve ser compreendida como sendo suporte para qualquer pedido de patente depositado subsequentemente que possa requerer exame de uma base de reivindicações tão ampla quanto feita dentro do direito da depositante e que possa ser concebida para levar a uma patente que abranja numerosos aspectos da invenção tanto independentemente quanto como um sistema global.

Além disso, cada um dos vários elementos da invenção e das reivindicações pode ser tambérn obtido em uma variedade de maneiras. Adicionalmeute, quando utilizado ou sugerido, um elemento deve ser entendido como abrangendo estruturas individuais assim como plurais que podem ou não estar físicamente conectadas. Esta publicação deve ser entendida como abrangendo cada uma destas variações, seja ela uma variação de uma modalidade de qualquer modalidade de aparelho, modalidade de método ou de processo, ou mesmo meramente uma variação de qualquer elemento destas. Particularmente, deve ser entendido que uma vez que a divulgação trata de elementos da invenção, as palavras para cada elemento podem sei* expressas por termos de aparelho ou de método equivalentes—ainda que somente a função ou o resultado seja o mesmo. Tais termos equivalentes, mais amplos ou mesmo mais genéricos devem ser considerados abrangidos pela descrição de cada elemento ou ação. Tais termos podem ser substituídos onde desejado para tomar explícita a cobertura implicitamente vasta à qual esta invenção está associada. Apenas como um exemplo, deve ser entendido que todas as ações podem ser expressas como um meio para realizar aquela ação ou como um elemento que ocasiona aquela ação. De forma semelhante, cada elemento físico revelado deve ser entendido como abrangendo uma revelação da ação que aquele elemento físico facilita. Com respeito a esse último aspecto, apenas como um exemplo, a revelação de um “exíensor” deve ser entendida como abrangendo a revelação da acão de “estender’'—seja esta discutida explicitamente ou não—e, por outro lado, caso houvesse efetivam ente a revelação da ação de “estender”, tal revelação deve ser entendida como abrangendo a revelação de um “exíensor” e até mesmo de um “meio para a extensão”. Tais mudanças e termos alternativos devem ser compreendidos como expliciíarnente incluídos na descrição.

Quaisquer patentes, publicações, ou outras referencias mencionadas neste pedido de patente são aqui incorporadas como referencias. Adicionalmente, quanto a cada termo utilizado, deve-se entender que, a não ser que sua utilização neste pedido seja incongruente com uma interpretação de apoio, as definições comuns dos dicionários deve ser compreendidas como incorporadas para cada termo e para todas as definições, termos alternativos, e sinônimos, tais como os contidos no Random Hoitse Webster ’s Unabridged Dictionarv, segunda edição, são aqui incorporados como referências. Por fim, todas as referências listadas na Declaração de Efivulgação de Informações ou em outra declaração de informações depositada junto com o pedido são aqui anexadas e incorporadas como referências; contudo, quanto a cada uma das discussões acima, até o ponto em que tais informações ou declarações aqui incorporadas como referências possam ser consideradas incongruentes com o palenteamento desta(s) invenção( ões), tais declarações expressamente não devem ser consideradas feitas pelais) depositante(s).

Assim, ais) depositanle(s) deveinu ser eonsiderada(s ) como tendo a fundamentação para reivindicar e fazer urna declaração de invenção sobre ao menos: i) cada um dos dispositivos extensores de células de espenna conforme aqui revelados e descritos, ii) os métodos relacionados revelados e descritos, iii) variações semelhantes, equivalentes, ou mesmo implícitas de cada um desses dispositivos e métodos, iv) as concepções alternativas que alcançam cada uma das funções mostradas conforme reveladas e descritas, v) as concepções e métodos alternativos que alcançam cada uma das funções mostradas implicitamente para se obter aquilo que é revelado e descrito, vi) cada recurso, componente, e etapa mostrada corno invenções separadas e independentes, vii) as aplicações melhoradas pelos vários sistemas ou componentes revelados, viii) os produtos resultantes produzidos por tais sistemas ou componentes, ix) cada sisterna, método e elemento mostrado ou descrito conforme hoje aplicado a qualquer campo específico ou a quaisquer dispositivos mencionados, x) métodos e aparelhos substancialmente conforme aqui descritos anleriormente e com referência a qualquer um dos exemplos acompanhantes, xi> as várias combinações e permutações de cada um dos elementos revelados, e xii) cada potencial reivindicação dependente ou conceito como uma dependência sobre qualquer uma ou todas as reivindicações independentes ou conceitos apresentados.

Com relação ás reivindicações, sejam as feitas nesse momento ou apresentadas posteriormeníe para exame, deve ser entendido que por razões práticas e para que se evite uma grande expansão do fardo ao exame, a depositante pode a qualquer tempo apresentar apenas reivindicações iniciais ou possivelmente apenas reivindicações iniciais somente com dependências iniciais. A fundamentação deve ser considerada existente até o grau requerido sob as leis sobre novas matérias—incluindo, mas não se limitando, à Convenção Européia de Patentes Artigo 123(2) e à Lei de Patentes dos Estados Unidos 35 USC 132 ou a outras leis do gênero—para permitir a adição de qualquer uma das várias dependências ou outros elementos sob qualquer outra reivindicação independente ou conceito. Ao se confeccionar quaisquer reivindicações a qualquer tempo, seja neste pedido ou em qualquer outro pedido subsequente, deve ser entendido também que a depositante ientou capturar um escopo de cobertura tão completo e vasto quanto o legalmente permitido. Até o ponto em que substituições não substanciais sejam feitas, até o ponto em que a depositante não confeccionou de fato nenhuma reivindicação de maneira a abranger literalmenle qualquer modalidade particular, e até o ponto em que seja de outra forma relevante, a depositante não deve ser compreendida corno tendo tentado ue qualquer forma ou de ter sido capaz de antecipar todas as eventualidades; não se espera que alguém versado na técnica tenha confeccionado urna reivindicação que teria literalmente abrangido Laís modalidades alternativas.

Além disso, quando, ou se, utilizada, a expressão de transição “compreendendo” é utilizada para manter as reivindicações “abertas” aq ui, de acordo com a interpretação tradicional de reivindicações. Assim, a não ser que o contexto requeira de outra forma, deve ser entendido que o termo “compreender” ou variações como “compreende” ou “compreendendo” tem a intenção de sugerir a inclusão de um elemento declarado ou etapa ou grupo de elementos declarados, porem sem excluir qualquer outro elemento ou etapa ou grupe» dc elementos ou de etapas. Tais lermos devem sei interpretados em sua forma mais expandida de modo a conferir á depositante a cobertura mais ampla legalmente permissível.

Por fim, quaisquer reivindicações feitas aqui a qualquer momento são incorporadas aqui como referências corno parte desta descrição da invenção, e a depositante preserva o direito de utilizar todo ou uma porção desse conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrições adicionais para dar suporte a qualquer uma ou a todas as reivindicações ou a qualquer elemento ou componente deste, e a depositante ainda preserva expressamente o direito de mover qualquer porção ou todo o conteúdo de tais reivindicações ou de qualquer elemento ou componente deste da descrição para as reivindicações ou vice-versa conforme for necessário para definir a matéria para a qual deseja-se obter proteção através deste pedido de patente ou de qualquer outro pedido de patente subseqüente de continuação, dividido ou de continuação-em-parte deste, ou para obter qualquer benefício, redução de taxas, ou para adequar-se às leis, regras ou regulamentações sobre patentes de qualquer país ou tratado, e esse conteúdo incorporado como referência deve sobreviver durante toda a pendência deste pedido de patente incluindo qualquer pedido de patente subseqüente de continuação, dividido ou de continuação-em-parte ou de qualquer nova publicação ou extensão deste.

Claims

1. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes, caracterizada por compreender: • uma pluralidade nascente de células de esperrna selecionadas quanto a urna característica desejada em relação de mistura incipiente; • um componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas em relação de mistura incipiente; • um componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores ern relação de mistura incipiente; e • um componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína em relação de mistura incipiente.

2. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela pluralidade nascente de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada compreender urna pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada localizada proxirnamente ern um estado substancialmente não combinado em relação a ao menos um componente da referida mistura incipiente.

3. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por compreender ainda urna zona sem barreira entre a referida pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a urna característica desejada e ao menos um referido componente da referida mistura incipiente.

4. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender ainda urna força de combinação induzida à qual a referida pluralidade de células de esperrna selecionadas quanto a uma característica desejada e ao menos um referido componente da referida mistura incipiente reagem.

5. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida pluralidade nascente de células de esperma compreender uma pluralidade nascente de células de esperma de mamífero.

6. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela referida pluralidade nascente de células de esperma de mamífero compreender uma pluralidade nascente de células de esperma de mamífero selecionada a partir do grupo que consiste em células de esperma bovino, células de esperma eqüino, células de esperma suíno, células de esperma ovino, células de esperma cervídeo, células de esperma canino, e células de esperma de golfinho.

7. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida pluralidade nascente de células de esperma quanto a uma característica desejada compreender uma pluralidade nascente de células de esperma identificadas.

8. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela referida pluralidade nascente de células de esperma identificadas compreender uma pluralidade nascente de células de esperma identificadas por cilometria de fluxo.

9. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida pluralidade nascente de células de esperma quanto a uma característica desejada compreender uma pluralidade nascente de células de esperma selecionadas quanto a uma característica sexual.

10. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pela referida pluralidade nascente de células de esperma selecionadas quanto a urna característica sexual compreender uma pluralidade nascente de células de esperma. selecionadas quanto a uma característica sexual selecionada a partir do grupo que consiste em uma característica de presença de cromossomo X e uma característica de presença de cromossomo V.

11. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente exlensor nascente de células de esperma livre de proteínas compreender um componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas localizado proximamente ern um estado substancialmente não combinado em relação a ao menos um componente da referida mistura incipiente.

12. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1 1, caracterizada por compreender ainda uma zona sein barreira entre o referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas e ao menos urn referido componente da referida mistura incipiente.

13. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por compreender ainda urna força de combinação induzida ã qual o referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas e ao menos um referido componente da referida mistura incipiente reagem.

14. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas compreender extensor nascente de células de esperma livre de proteínas estéril.

15. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de céiuias de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender um componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contende· crioprotetores localizado proximamente em um estado substancialmente não combinado em relação a ao menos um componente da referida mistura incipiente.

16. Mistura de células dc esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender ainda uma zona sem barreira entre o referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores e ao menos um referido componente da referida mistura incipiente.

17. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender ainda uma força de combinação induzida á qual o referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores e ao menos um referido componente da referida mistura incipiente reagem.

18. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo corn a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender urn componente de glicerol.

19. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo c-orn a reivindicação 18. caracterizada pelo referido componente de glicerol compreender urn percentual de glicerol selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 3 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 6 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 12 por cento de glicerol, e mais do que aproximadamente 24 por cento de glicerol.

20. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 18. caracterizada pelo referido componente de glicerol compreender aproximadamente 6% de glicerol.

21. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo corn a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender um componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores estéril.

22. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender um componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade.

23. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 22, caracterizada peio referido componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores corn gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores substancialmente líquido.

24. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma contendo crioproteíores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores de centrifugação eficiente.

25. Misiura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores de densidade substancialmente uniforme.

26. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores substancialmente sem nenhuma partícula de compressão de células de esperma.

27. Misiura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de céiulas de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor nascente de células de esperma contendo crioprotetores de baixa viscosidade.

28. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína compreender urn componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína proxirnameníe cm um estado substancíalmente nso combinado em relação a ao menos um componente da referida mistura incipiente.

29. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acorclo com a reivindicação 28, caracterizada por compreender ainda uma zona sem barreira entre o referido componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína e ao menos um referido componente da referida mistura incipiente.

30. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por compreender ainda uma força de combinação induzida à qual o referido componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína e ao menos um referido componente da referida mistura incipiente reagem.

31. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína compreender um componente de base animal extensor de células de esperma que contenha proteína.

32. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 31. caracterizada pelo referido componente de base animal extensor de células de esperma contendo proteína compreender um componente extensor de células de esperma que contenha lipoproteínas.

33. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo referido componente extensor de células de esperma contendo lipoproteínas compreender um componente extensor de células de esperma que contenha gema de ovo.

34. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo corn a reivindicação 33, caracterizada pelo referido componente extensor de células de esperma contendo gema de ovo compreender um percentual de gema de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 40 por cento de gema de evo, menos do que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 15 por cento cie gema de ovo, menos do que aproximadamente 10 por cento de gema de ovo, rnenos do que aproximadamente 5 por cento de gema de ovo..

35. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo referido componente extensor de células de esperma contendo gema de ovo compreender aproximadamente 20 por cento de gema de ovo.

36. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por compreender ainda um conteúdo em gema de ovo da referida mistura incipiente selecionado a partir dc» grupo que consiste em mais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 0,8 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo, e mais do que aproximadamente 6,4 por cento de gema de ovo.

37. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por compreender ainda um conteúdo ern gema de ovo da referida mistura incipiente de aproximadamente 1,6 por cento.

38. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida mistura incipiente compreender ainda uma mistura incipiente não clarificada.

39. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida mistura incipiente compreender ainda uma mistura incipiente resfriada.

40. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pela referida mistura incipiente resfriada compreender uma mistura incipienie a uma temperatura selecionada a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, menos do que aproximadamente 9 graus Celsius, rnenos do que aproximadamente 8 graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, menos do que aproximadamente 5 graus Celsius, menos do que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, menos do que aproximadamente 1 grau Celsius.

41. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pela referida mistura incipiente resfriada compreender uma rnistura incipiente a uma temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.

42. Mistura de células de esperma identificadas afetadas incipientes de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína compreender um componente extensor nascente de células de esperma contendo proteína selecionado a partir do grupo que consiste em um extensor baseado em gema de ovo, um extensor baseado ern leite, um extensor baseado em citrato, um extensor Tris, e um extensor TEST.

43. Método para processar células cie esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação, caracterizado por compreender as etapas de: * obtenção de uma pluralidade de células de esperma; * sujeição da referida pluralidade de células de esperma a estímulos de identificação: * seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a urna característica desejada; » provimento de um extensor de céiulas de esperma livre de proteínas; * provimento de um extensor de céiulas de esperma livre de proteínas que contenha crioprotetores; * combinação do referido extensor de células de esperma livre de proteínas e do referido extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de centrifugação contendo crioprotetores; * conservação do referido meio de centrifugação contendo crioprotetores ern um estado não clarificado; • adição da referida pluralidade de células de esperma sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada ao referido meio de centrifugação não clarificado para formar um meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores; • sujeição do referido meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores a uma centrifugação; • decantação de uma porção do meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores centrifugado.

44. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela referida etapa de obtenção de uma pluralidade de células de esperma compreender a etapa de obtenção de urna pluralidade de células de esperma de mamífero.

45. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pela referida etapa de obtenção de uma pluralidade de células de esperma de mamífero compreender a etapa de obtenção de uma pluralidade de células de esperma de mamífero selecionadas a partir do grupo que consiste em células de esperma bovino, células de esperma eqüino, células de esperma suíno, células de esperma ovino, células de esperma cervídeo, células de esperma canino, e células de esperma de golfinho.

46. Métoclo paia processar células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela referida etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a uma característica desejada compreender a etapa de identificação da referida pluralidade de células de esperma.

47. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pela referida etapa de identificação da referida pluralidade de células de esperma compreender a etapa de identificação da referida pluralidade de células de esperma por citometria de fluxo.

48. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela referida etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a uma característica desejada compreender a etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a uma característica sexual.

49. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pela referida etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a urna característica sexual compreender a etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a uma característica sexual selecionada a partir do grupo que consistem em uma característica de presença de cromossomo X e uma característica de presença de cromossomo Y.

50. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 43. caracterizado pela referida etapa de provimento de uma células de esperma livre de proteínas compreender a etapa de provimento de um exlensor de células de esperma estéril.

51. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela referida etapa de provimento de um exlensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetorcs compreender a etapa de provimento de um exlensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores estéril.

52. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela referida etapa de provimento de um exlensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender a etapa de provimento de um exlensor de células de esperma livre de proteínas que contenha glicerol.

53. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de espenna livre de proteínas contendo glicerol compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo glicerol que tenha um percentual de glicerol selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 3 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 6 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 12 por cento de glicerol, e mais do que aproximadamente 24 por cento de glicerol.

54. Método para processar células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação cie acordo com a reivindicação 51, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo glicerol compreender a elapa de provimento cie um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo glicerol que tenha aproximadamente 6 por cento de glicerol.

55. Método para processar células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperrna livre cie proteínas contendo crioprotetores compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade.

56. Método para processar células dc esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperrna contendo crioprotetores substancialmente líquido.

57. Método para processar células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender a etapa de provimento de urn extensor de células de esperrna contendo crioprotetores de cenlrifugação eficiente.

58. Método para processar células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores de densidade substancialmente uniforme.

59. Método para processar céiuias de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 54. caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores substancialrnente sem nenhuma partícula de compressão de células de esperma.

60. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores de baixa viscosidade.

61. Mélodo para processar células de esperma identificadas, afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pela referida etapa de combinação do referido extensor de células de esperma livre de proteínas e do referido extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de centrifugação contendo crioprotetores compreender a etapa de adição do referido extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores em um volume igual a um volume do referido extensor de células de esperma livre de proteínas.

62. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo corn a reivindicação 61, caracterizado pela referida etapa de adição do referido extensor de células de esperaria livre de proteínas contendo crioprotetores em um volume igual a um volume do referido extensor de células de esperma livre de proteínas compreender a etapa de adição do referido extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores em um volume igual a um volume do referido extensor de células de esperma livre de proteínas em duas etapas.

63. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pela referida etapa de combinação do referido extensor de células de esperma livre de proteínas e do referido extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de centrifugac-ào contendo crioprotetores compreender a etapa de combinação do referido extensor de células de esperma livre de proteínas e do referido extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de cenlrifugação contendo crioprotetores em uma temperatura resfriada.

64. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pela referida etapa de combinação do referido extensor de células de esperma livre de proteínas e do referido extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de cenlrifugação contendo crioprotetores em uma temperatura resfriada compreender a etapa de combinação do referido extensor de células de esperma livre de proteínas e do referido extensor de células de esperma iivre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de centrifugação contendo crioprotetores ern uma temperatura selecionada a partir do grupo que consistem ern menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, rnenos do que aproximadamente 9 graus Celsius, rnenos do que aproximadamente 8 graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, rnenos uo que aproximadamente 5 graus Celsius, rnenos cio que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, rnenos do que aproximadamente 1 grau Celsius,

65. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pela referida etapa de combinação do referido extensor de células de esperma livre de proteínas e do referido extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de centrifugação contendo crioprotetores em uma temperatura resfriada compreender a etapa de combinação do referido extensor de células de esperrna livre de proteínas e do referido extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores para formar um meio de centrifugação contendo crioprotetores em uma temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.

66. Método para processar células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por compreender ainda a etapa de provimento de urn extensor de células de esperrna que contenha proteína; e por compreender ainda a etapa de combinação do referido extensor de células de esperrna contendo proteína com o referido meio de centrifugação contendo crioproteção; e pela referida etapa de conservação do referido meio de centrifugação contendo crioprotetores ern um estado não clarificado, e pela referida etapa de adição da referida pluralidade de células de esperrna sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada ao referido meio de centrifugação contendo crioprotetores para formar urn meio de centrifugação não clarificado de células de esperrna contendo crioprotetores compreender a etapa de adição da referida pluralidade de células de esperrna sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada ao referido meio de centrifugação não clarificado de células de esperrna contendo crioprotetores para formar um meio de centrifugação não clarificado de células de esperrna contendo proteína e crioprotetores; e pela referida etapa de sujeição do referido meio de centrifugação não clarificado de células de esperrna contendo crioprotetores a uma centrifugação compreender a etapa de sujeição do referido meio de centrifugação não clarificado de células de esperrna contendo proteína e crioprotetores a uma centrifugação, e pela referida etapa de decantação de uma porção do referido meio de cenírifugacão não clarificado de células de esperrna contendo crioprotetores centrifugado compreender a etapa de decantação dc urna porção do referido meio de centrifugação não clarificado de células de esperrna contendo proteína e crioprotetores.

67. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pela referida etapa de provimento de um exlensor de células de esperma contendo proteína compreender a etapa de provimento de um extensor de base animal de células de esperma que contenham proteínas.

68. Método para processar ceiulas de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação <57, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de base animal de células de esperma contendo proteína compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperma que contenha lipoproteínas.

69. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação <58, caracterizado pela referida etapa de provimento de um exlensor de células de esperma que contenha lipoproteínas compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperma que contenha gema de ovo.

70. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação <59, caracterizado pela referida etapa de provimento de urn exlensor de células de esperma que contenha gema de ovo compreender a etapa de provimento de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que lenha um percentual de gema de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 40 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 15 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 10 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 5 por cento de gema de ovo.

71. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação <59, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperma que contenha gema de ovo compreender a etapa de provimento de urn extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tenha aproximadamente 20 por cento de gema de ovo.

72. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela referida etapa de adição da referida pluralidade de células de esperma sujeilas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada ao referido meio de centrifugação não clarificado contendo crioproLetores para formar um meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioproletores compreender a etapa de adição da referida pluralidade de células cie esperma sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada ao referido meio de centrifugação não clarificado contendo glic-oprotelores para formar um meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores que tenha urn percentual de gerna de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 0,8 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, e mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo.

73. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela referida etapa de adição da referida pluralidade de células de esperma sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a urna característica desejada ao referido rneio de centrifugação não clarificado contendo crioprotetores para formai um meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores compreender a etapa de adição da referida pluralidade de células de esperma sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada ao referido meio de centrifugação não clarificado contendo crioprotetores para formar um rneio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores que tenha aproximadamente 1,6 por cento de gerna de ovo.

74. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acorclo com a reivindicação 69, caracterizado peia referida etapa de sujeição do referido meio de centrifugação de células de esperma contendo crioprotetores a uma centrifugação compreender a etapa de centrifugação de um meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores que lenha uma fi ação do percentual de gema de ovo em comparação com um meio de centrifugação utilizado em um método típico p>ara a centrifugação de células de esperma identificadas.

75. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 74. caracterizado pela referida etapa de centrifugação de um meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores que tenha uma fração do percentual de gema de ovo em comparação com um meio de centrifugação utilizado em um método típico para a centrifugação de células de esperma identificadas compreender a etapa de centrifugação do referido rneio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores que tenha um percentual de gema de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 40 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 15 por cento de gema cie ovo, menos do que aproximadamente 10 por cento de gerria de ovo, menos do que aproximadamente 5 por cento de gema cie ovo.

76. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela referida etapa de sujeição dc> referido meio de centrifugação de células de esperma contendo crioprotetores a uma centrifugação compreender a etapa de centrifugação de um rneio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotetores que tenha menos do que aproximadamente 3 por cento de gema de ovo.

77. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pela referida etapa de sujeição do referido meio de centrifugação de células de esperma contendo crioprotelores a uma centrifugação compreender a etapa de centrifugação de um meio de centrifugação não clarificado de células de esperma contendo crioprotelores que contenha glicerol e que tenha menos do que aproximadamente 11 por cento de gema de ovo.

78. Método para processar células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pela referida etapa de provimento de um extensor de células de esperma contendo proteína compreender a etapa de provimento de urn extensor de células de esperma contendo proteína selecionado a partir do grupo que consiste em um extensor baseado em gema de ovo, um extensor baseado em leite, um extensor de cilrato, um extensor Tris, e um extensor TEST.

79. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas, caracterizado por compreender: • uma pluralidade de céiuias de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada; • um componente extensor de células de esperma livre de proteínas: ? um componente extensor não clarificado de céiuias de esperma livre de proteínas que contenha crioprotelores; * um meie* dc centrifugação não clarificado no qual a referida pluralidade de células de esperma selecionada quanto a uma característica desejada, o referido componente extensor de células de esperma livre de proteínas, e o referido um componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas que contenha crioprotelores são suspensos.

80. Meio de processamento de céiuias de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma compreender uma pluralidade de células de esperma de mamífero.

81. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação S0, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma de mamífero compreender células de esperma de mamífero selecionadas a partir do grupo que consiste em células de esperma bovino, células de esperma eqüino, células de esperma suíno, células de esperma ovino, células de esperma cervídeo, células de esperma canino, células de esperma de golfinho.

82. Meio de processamento de céiuias de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma quanto a urna característica desejada compreender uma pluralidade de células de esperma identificadas.

83. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma identificadas compreender uma pluralidade de células de esperma identificadas por citometria de fluxo.

84. Meio de processamento de células de esperrna identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79 caracterizado pela referida pluralidade de céiuias de esperma quanto a urna característica desejada compreender uma pluralidade de células dc esperma selecionadas quanto a uma característica sexual.

85. Meio de processamento de céiuias de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pela referida pluralidade de céiuias de esperma selecionadas quanto a uma característica sexual compreender uma pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica sexual selecionada a partir do grupo que consiste em uma característica de presença de cromossomo X e uma característica de presença de cromossomo Y.

86. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo referido um componente extensor de células de esperma livre de proteínas compreender um um componente extensor de céiuias de esperma livre de proteínas estéril.

87. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioproteíores compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores estéril.

88. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender um componente de glicerol.

89. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo referido componente de gilcerol compreender um percentual de glicerol selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 3 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 6 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 12 por cento de glicerol, e mais do que aproximadamente 24 por cento de glicerol.

90. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 89. caracterizado pelo referido componente de gilcerol compreender aproximadamente 6% de glicerol.

91. Meio de processamento de células de esperrna identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre cie proteínas contendo crioprotetores compreender um componente extensor não clarificado de células ue esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade.

92. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores substaneialrnente iíquido.

93. Meio de processamento de células de esperrna identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores de centrifugação eficiente.

94. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores substancia 1 mente uniforme.

95. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores substancialmente sem nenhuma partícula de de compressão de células de esperma.

96. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores de baixa viscosidade.

97. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado por compreender ainda um componente extensor não clarificado de células de esperma contendo proteína suspenso no referido meio de centrifugação não clarificado.

98. Meio dc processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperrna contendo proteína compreender um componente extensor de base animal de células de esperma que contenha proteína.

99. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo referido componente extensor de base animal de células de esperma que contenha proteína compreender um componente extensor não clarificado de células de espemia que contenha lipoproteirias.

100. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma contendo lipoproteínas compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma que contenha gema de ovo.

101. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma contendo gema de ovo compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma que contenha gema de ovo que lenha um percentual de gema de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 40 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 3 5 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 10 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 5 por cento de gema de ovo.

102. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de céiulas de esperma contendo gema de ovo compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma que contenha gema de ovo que tenha aproximadamente 20 por cento de gema de ovo.

103. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo referido meio de centrifugação não clarificado compreender um meio de centrifugação não clarificado que tenha um percentual de gema de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 0,4 por cento de gema cie ovo, mais do que aproximadamente 0,8 por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, e mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo.

104. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo referido meio de centrifugação não clarificado compreender um meio de centrifügação não clarificado que tenha aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo.

105. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo referido meio de centrifugação não clarificado compreender um meio de centrifugação não clarificado que contenha glicerol e que tenha menos do que aproximadamente 11 por cento de gema de ovo.

106. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo referido componente extensor não clarificado de células de esperma compreender um componente extensor não clarificado de células de esperma selecionado a partir d·:» grupo que consiste em um extensor baseado em gema de ovo, um extensor baseado em leite, um extensor de citrato, um extensor Tris, e um extensor TEST.

107. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 79, caracterizado Delo referido meio de centrifugação não clarificado compreender um meio de centrifugação não clarificado resfriado.

108. Meio de processamento de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo referido rneio de centrifugação não clarificado resfriado compreender um rneio de centrifugação não clarificado resfriado até uma temperatura selecionada a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, menos do que aproximadamente 9 graus Celsius, menos do que aproximadamente 8 graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, menos do que aproximadamente 5 graus Celsius, menos do que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, menos do que aproximadamente 1 grau Celsius.

109. Meio de processamento de células de esperrna identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pe!o referido meio de centrifugação não clarificado resfriado compreender um meio de centrifugação não clarificado resfriado até urna temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.

110. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação, caraclerizado por compreender as etapas de: • obtenção de urna pluralidade de células de esperrna; • sujeição da referida pluralidade de células de esperrna a estímulos de identificação; • seleção da referida pluralidade de células de esperrna quanto a uma característica desejada; • estabelecimento de um extensor de células de esperrna contendo proteína que possua um primeiro valor de conteúdo protéico; • adição da referida pluralidade de células de esperrna sujeitas a estímulos de identificação e selecionadas quanto a uma característica desejada ao referido extensor de células de esperrna contendo proieína que possui um primeiro valor de conteúdo protéico; • adição de um extensor de células de esperrna livre de proteínas ao referido extensor de células de esperrna contendo proteína que possui um primeiro valor de conteúdo protéico; • redução de um conteúdo total em proteínas do referido extensor de células de esperrna comendo proteína para um segundo valor de conteúdo protéico abaixo do referido primeiro valor de conteúdo protéico.

111. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pela referida etapa de obtenção de uma pluralidade de células de esperrna compreender a etapa de obtenção de uma pluralidade de células de esperrna de mamífero.

112. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pela referida etapa de obtenção de uma pluralidade de células de esperma de mamífero compreender a etapa de obtenção de uma pluralidade de células de esperma de mamífero selecionadas a partir do grupo que consiste em células de esperma bovino, células de esperma eqüino, células de esperma suíno, células de esperma ovino, células de esperma cervídeo, células de esperma canino, células de esperma de golfinho.

113. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pela referida etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a uma característica desejada compreender a etapa de identificação da referida pluralidade de células de esperma.

114. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pela referida etapa de identificação da referida pluralidade de células de esperma compreender a etapa de identificação da referida pluralidade de céiulas de esperrna por citomelria de fluxo.

115. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pela referida etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a uma característica desejada compreender a etapa de seleção da referida pluralidade de céluias de esperma quanto a uma característica sexual.

116. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pela referida etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a uma característica sexual compreender a etapa de seleção da referida pluralidade de células de esperma quanto a urna característica sexual selecionada a partir do grupo que consiste em uma característica de presença de cromossomo X e uma característica de presença de cromossomo Y.

117. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindictição 110, caracterizado pela referida etapa de estabelecimento de um exíensor de células de esperma contendo proteína que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de estabelecimento de urn extensor de base animal de células de esperma contendo proteína que possua um primeiro valor de conteúdo protéico.

118. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pela referida etapa de estabelecimento de um extensor de base animal de células de esperma contendo proteína que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de estabelecimento de um extensor de base animal de células de esperma contendo lipoproteínas que possua um primeiro valor de conteúdo protéico.

119. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pela referida etapa de estabelecimento de um extensor cie base animal de células de esperma contendo lipoproteínas que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que possua urn primeiro valor de conteúdo protéico.

120. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo corrí a reivindicação 119, caracterizado pela referida etapa de estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa cie estabelecimento de urn extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tenha um percentual de gema de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 0,S por cento de gema de ovo, mais do que aproximadamente 1.6 por cento de gema de ovo. mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo. e mais do que aproximadamente 6,4 por cento de gema de ovo.

121. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pela referida etapa de estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tem um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tem aproximadamente 3,2 por cento de gerna de ovo.

122. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pela referida etapa de estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo proteína selecionado a partir do grupo que consiste em um extensor baseado em gema de ovo, um extensor baseado em leite, um extensor de citrato, um extensor Tris, e um extensor TEST.

123. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pela referida etapa de estabelecimento de um extensor de células de esperma contendo proteína que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de urn extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores que possua um primeiro valor de conteúdo protéico.

124. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 123, caracterizado peia referida etapa de adição de um extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo glicerol ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um primeiro valor de conteúdo protéico.

125. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pela referida etapa de adição cie um extensor de células de esperma contendo glicerol ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo glicerol que tenha um percentual de glicerol selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 3 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 6 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 12 por cento de glicerol, e mais do que aproximadamente 24 por cento de glicerol.

126. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo glicerol ao referido extensor cie células de esperma contendo proteína que possui urn primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de adição de um extensor de células de esperma contendo glicerol que tenha aproximadamente 6 por cento de glicerol.

127. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 123. caracterizado peia referida etapa de adição de um extensor cie células de esperma livre de proteínas contendo cri ©protetores que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor cie células cie esperma livre de proteínas contendo crioprotelores que tenha urn volume igual a um volume do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui urn primeiro valor de conteúdo protéico.

128. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotelores que tenha um volume igual a urn volume do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um primeiro valor de conteúdo protéico a etapa de adição de urn extensor de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores que tenha um volume igual a um volume do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui urn primeiro valor de conteúdo protéico em duas etapas.

129. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor cie células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores que possua urn primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores ao referido extensor de células de esperrna contendo proteína que possui urn primeiro valor de conteúdo protéico a uma temperatura selecionada a pari ir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, menos do que aproximadamente 9 graus Celsius, menos dc> que aproximadamente 8 graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, menos do que aproximadamente 5 graus Celsius, rnenos do que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, rnenos do que aproximadamente 1 grau Celsius.

130. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição cie um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores ao referido extensor de células de esperrna contendo proteína que possui um primeiro valor de conteúdo protéico a uma temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.

131. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor cie células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores que possua um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperrna contendo crioprotetores estéril ao referido extensor de células de esperrna contendo proteína que possui um primeiro valor de conteúdo protéico.

132. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperrna livre de proteínas contendo crioprotetores ao referido extensor de células de esperrna livre contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperrna contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo proiéico.

133. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores substancialmente líquido ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico.

134. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pela referida etapa de adição dc um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores de eentri fúgação eficiente ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico.

135. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade ao referido extensor de células de esperrna contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores de densidade substanciaImentc uniforme ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico.

136. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pela referida etapa de adição de um exlensor de células de espenna contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo proléico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores subslancialmente sem nenhuma partícula de compressão de eéiulas de esperma.

137. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de espenna contendo crioprotetores de baixa viscosidade ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um primeiro valor de conteúdo protéico.

138. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pela referida etapa de redução de um conteúdo protéico total do referido extensor de células de esperma contendo proteína para um segundo de conteúdo protéico abaixo do referido primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de redução de um conteúdo protéico total do referido extensor de células de esperma contendo proteína para um percentual de gema cie ovo selecionado a partir do grupo que consiste em mais do que aproximadamente 0,4 por cerito de gema de ovo, mais do que aproximadamente 0..8 por cento de gema dc ovo, mais do que aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo, e mais do que aproximadamente 3,2 por cento de gema de ovo.

139. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pela referida etapa de redução de um conteúdo protéico total do referido extensor de células de esperma contendo proteína para um segundo de conteúdo protéico abaixo do referido primeiro valor de conteúdo protéico compreender a etapa de redução cie um conteúdo protéico total do referido extensor de células de esperma contendo proteína para aproximadamente 1,6 por cento de gema de ovo.

140. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 110, caracterizado por compreender ainda a etapa de conservação do referido extensor de células de esperma contendo proteína que tem um segundo valor de conteúdo protéico abaixo do primeiro valor de conteúdo protéico em urn estado não clarificado.

141. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 140, caracterizado por compreender ainda a etapa de sujeição do referido extensor de células de esperma não clarificado contendo proteína que tem um segundo valor de conteúdo protéico abaixo do referido primeiro valor de conteúdo protéico a uma centrifugação.

142. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 141, caracterizado por compreender ainda a etapa de decantação de uma porção do referido extensor de células de esperma rião clarificado contende· proteína centrifugado que tem um segundo valor de conteúdo protéico abaixo do referido primeiro valor de conteúdo protéico.

143. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 110, caracterizado por compreender ainda as etapas de: • adição de um extensor de células de esperma contendo proteína suplementai ao referido extensor de células de esperma que possui um segundo valor de conteúdo protéico; • aumento do conteúdo protéico iotal do referido extensor de células de esperma contendo proteína para urn terceiro valor de conteúdo protéico mais alto do que o referido primeiro valor de conteúdo protéico.

144. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pela referida etapa adição de um extensor de células de esperma contendo proteína suplementar ao referido extensor de células de esperma que possui um segundo valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de urn extensor de base animal de células de esperma contendo proteína suplementar que possua um segundo valor de conteúdo protéico.

145. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo corrí a reivindicação 144. caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de base animal de células de esperma contendo proteína suplementar que possua urn segundo valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo lipoproteínas suplementar ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui urn segundo valor de conteúdo protéico.

146. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 145. caracterizado pela referida etapa de adição de urn extensor de células de esperma contendo lipoproteínas suplementar ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo suplementar ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor dc conteúdo protéico.

147. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pela referida etapa de adição de urn extensor de células de esperma contendo gema de ovo suplementar ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valeu· de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tenha um percentual de gema de ovo selecionado a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 40 por cento cie gema de ovo, menos dc· que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 15 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 10 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 5 por cento de gema de ovo.

148. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 14ó, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo suplementar ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tenha aproximadamente 20 por cento de gema de ovo.

149. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 14ó, caracterizado pela referida etapa cie adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo suplementar ao referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tenha um percentual cie glicerol selecionado a partir dc> grupo que consiste em mais do que aproximadamente 3 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 6 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 12 por cento de glicerol, e mais do que aproximadamente 24 por cento dc glicerol.

150. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pela referida etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo suplementar ao referido extensor de ccluías de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico compreender a etapa de adição de um extensor de células de esperma contendo gema de ovo que tenha aproximadamente ó por cento de glicerol.

151. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento dc identificação dc acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelas referidas etapas de adição de um extensor de células de esperma contendo proteína suplementar ao referido extensor de células de esperma que possui um segundo valor de conteúdo protéico e de aumento do conteúdo protéico total do referido extensor de células de esperma contendo proteína para um terceiro valor de conteúdo protéico mais alto do que o referido primeiro valor de conteúdo protéico compreenderem a etapa de ajuste de uma concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração de células de esperma de pré-congelamenlo.

152. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 151, caracterizado pela referida etapa de ajuste de uma concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração de células de esperma de pré-congelamenlo compreender a etapa de ajuste de urna concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração de células de esperma de pré-congelamento própria a uma espécie.

153. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por urn evento de identificação de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pela referida etapa de ajuste de uma concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para urna concentração de células de esperma de pré-congelamento própria a uma espécie compreender a etapa de ajuste de urna concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui urn segundo valor de conteúdo protéico para urna concentração de células de esperma de pré-congelamento selecionado a partir do grupo que consiste em uma concentração de células de esperma de pré-congelamento bovina, uma concentração de células de esperma de pre- congelamento equina, urna concentração de células de esperma de pré- congelamento suína, uma concentração de células de esperrna de pré- ccngelarnenio ovina, uma concentração de células de esperma de pré- congelamento cervídea, c uma concentração de células de esperma de pré-congelamento de golfinho.

154. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pela referida etapa de ajuste de uma concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração de células de esperma de pré-congelamento própria a uma espécie compreender a etapa de ajuste de uma concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração de células de esperma selecionada a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 100 milhões de células de esperma por milímetro, menos do que aproximadamente 50 milhões de células de esperma por milímetro, menos do que aproximadamente 40 milhões de células de esperma por milímetro, menos do que aproximadamente 30 milhões de células de esperma por milímetro, menos do que aproximadamente 20 milhões de células de esperma por milímetro, menos do que aproximadamente 1 5 milhões de células de esperma por milímetro, menos do que aproximadamente 10 milhões de células de esperma por milímetro, menos do que aproximadamente 5 milhões de células de esperma por milímetro, e menos do que aproximadamente 2 rnilhòes de células de esperma por milímetro.

155. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pela referida etapa de ajuste de uma concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração de células de esperma de pré-congelamento própria a uma espécie compreender a etapa de ajuste de uma concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para aproximadamente 10 milhões de células de esperma por milímetro.

156. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento dc identificação de acordo com a reivindicação 15 3, caracterizado pela referida etapa de ajuste de urna concentração de células de esperma do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração cie células de esperma de pré-congelamento compreender a etapa de estabelecimento de um conteúdo de gema de ovo de pré-congelamento do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um terceiro valor de conteúdo protéico mais alto do que o referido primeiro valor de conteúdo protéico selecionado a partir do grupo que consiste em dentre» de aproximadamente 50 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento ue um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, dentro de aproximadamente 25 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, clentro de aproximadamente 20 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelarnenío de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, dentro de aproximadamente 15 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, dentro de aproximadamente 10 por cento do conteúdo em gema dc ovo de pré-congelamento de um rnéiodo típico para o congelamento de células de esperma identificadas, dentro de aproximadamente 5 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas, e dentro cie aproximadamente 1 por cento do conteúdo em gema de ovo de pré-congelamento de um método típico para o congelamento de células de esperma identificadas.

157. Método para estender células de esperma identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 151, caracterizado peia referida etapa de ajuste de uma concentração de células de espeima do referido extensor de células de esperma contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéico para uma concentração de células de esperma de pré-congelamento compreender a etapa de estabelecimento de um conteúdo em gema de ove· do referido extensor de células de esperma comendo proteína que possui um terceiro valor de conteúdo protéico mais alto dc» que o referido primeiro valor de conteúdo protéico selecionado a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 50 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 45 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 40 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 35 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 30 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 25 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 20 por cento de gema de ovo, menos do que aproximadamente 15 por cenlo de gema de ovo, e menos do que aproximadamente 10 por cento de gema de ovo.

158. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 151, caracterizado pela referida etapa de ajuste de uma concentração de células de esperrna do referido extensor de células de esperrna contendo proteína que possui um segundo valor de conteúdo protéic-o para uma concentração de células de esperrna de pré-congelamento compreender a etapa de estabelecimento de um conteúdo em gerna de ovo do referido extensor de células de esperrna contendo proteína que possui um terceiro valor de conteúdo protéico mais alto do que o referido primeiro valor de conteúdo protéico de aproximadamente 16,5 por cento.

159. Método para estender células de esperrna identificadas afetadas por um evento de identificação de acordo com a reivindicação 143, caracterizado por compreender ainda a etapa de congelamento do referido extensor de células de esperrna contendo proteína que tenha um terceiro valor de conteúdo protéico mais alto do que o referido primeiro valor de conteúdo protéico.

160. Meio intermediário de extensão de células de esperrna identificadas afetadas, caracterizado por compreender: • uma pluralidade de células de esperrna selecionadas quanto a uma característica desejada; • um componente de extensão de células de esperrna livre de proteínas; • um componente de extensão de células de esperrna livre de proteínas que contenha crioprotetores; • um componente de extensão de células de esperrna que contenha proteína; e • um conteúdo total em proteínas que não exceda aproximadamente 1,6 por cento.

161. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo corn a reivindicação 160, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma compreender uma pluralidade de células de esperma de mamífero.

162. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo corn a reivindicação 161, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma de mamífero compreender uma pluralidade de células de esperma de mamífero selecionadas a partir do grupo que consiste em células de esperma bovino, células de esperma eqüino, células de esperma suíno, células de esperma ovino, células de esperma cervídeo, células de esperma canino, e células de esperma de golfinho.

163. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada compreender uma pluralidade de células de esperma identificadas.

164. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo corn a reivindicação 163, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma identificadas compreender urna pluralidade de células de esperma identificadas por citometria de fluxo.

165. Meio intermediário de extensão de céi ulas de esperma identificadas afetadas de acordo corn a reivindicação 160, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica desejada compreender uma pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a urna característica sexual.

166. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pela referida pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica sexual compreender uma pluralidade de células de esperma selecionadas quanto a uma característica sexual selecionada a partir do grupo que consiste em urna característica de presença de cromossomo X e uma característica de presença de cromossomo Y.

167. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma livre de proteínas compreender um componente de extensão de células de esperma livre de proteínas estéril.

168. M eio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma livre de proteínas contendo crioprolelores compreender um componente de extensão de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores estéril.

169. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender um componente de glicerol.

170. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificcidas afetadas de acordo com a reivindicação 169, caracterizado pelo referido componente de glicerol compreender um percentual de glicerol selecionado a partir do grupo que consiste em mais dc» que aproximadamente 3 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 6 por cento de glicerol, mais do que aproximadamente 12 por cento de glicerol, e mais do que aproximadamente 24 por cento de glicerol.

171. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 169, caracterizado pelo referido componente de glicerol compreender aproximadamente 6 por cento de glicerol.

172. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma livre de proteínas contendo crioprotetores compreender um componente de extensão de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade.

173. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente de extensão de células contendo crioprotetores substancialmente líquido.

174. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender urn componente de extensão de células contendo crioprotetores de c-entrifugação eficiente.

175. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente de extensão de células contendo crioprotetores de densidade substanc ialmente uniforme.

176. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo referido componente de extensão de células contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente de extensão de células de esperma contendo crioprotetores substancialmente sem nenhuma partículas de compressão de células de esperma.

177. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma contendo crioprotetores com gradiente de baixa densidade compreender um componente de extensão de células contendo crioprotetores de baixa viscosidade.

178. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo referido um componente de extensão de células de esperma que contém proteínas compreender um componente de base animal de extensão de células de esperma contendo proteína.

179. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 178, caracterizado pelo referido componente de base animai de extensão de células de esperma contendo proteína compreender um componente de extensão de células de esperma contendo lipoproteínas.

180. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação 179, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma contendo lipoproteínas compreender um componente de extensão de céiuias de esperma que contenha gema de ovo.

181. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação ISO, caracterizado pelo referido conteúdo total em proteínas que riao excede aproximadamente 1,6 por cento compreender uma gema de ovo que não exceda aproximadamente 1,6 por cento.

182. Meio intermediário de extensão de células de esperma identificadas afetadas de acordo com a reivindicação ISO, caracterizado pelo referido componente de extensão de células de esperma contendo proteína compreender um componente de extensão de células de esperma contendo proteína selecionado a partir do grupo que consiste em um exíensor baseado em gema de ovo, um exíensor baseado em leite, um exíensor de citralo, um extensor Tris, e um extensor TEST.

183. Meio inteimediário de extensão de células de esperma afetadas de acordo com a reivindicação 160, caracterizado por compreender ainda um meio intermediário de extensão resfriado no qual a referida pluralidade de células de esperma, o referido componente de extensão de células de esperma livre de proteínas, o referido componente de extensão de células de esperma livre de proteínas contendo crioproletores, e o referido componente de extensão de células de esperma contendo proteína são suspensos.

184. Meio intermediário de extensão de células de esperma afetadas de acordo com a reivindicação 1S3, caracterizado pe!o referido meio intermediário de extensão resfriado compreender um meio intermediário de extensão resfriado ern uma temperatura selecionada a partir do grupo que consiste em menos do que aproximadamente 10 graus Celsius, menos dc» que aproximadamente 9 graus Celsius, menos do que aproximadamente S graus Celsius, menos do que aproximadamente 7 graus Celsius, menos do que aproximadamente 6 graus Celsius, menos do que aproximadamente 5 graus Celsius, menos do que aproximadamente 4 graus Celsius, menos do que aproximadamente 3 graus Celsius, menos do que aproximadamente 2 graus Celsius, menos do que aproximadamente 1 grau Celsius.

185. Meio intermediário de extensão de células de esperma afetadas de acordo com a reivindicação 1S3, caracterizado pelo referido meio intermediário de extensão resfriado compreender um meio intermediário de extensão resfriado em uma temperatura de aproximadamente 5 graus Celsius.