ES2535466T3 - Compuestos específicos de diariltiohidantoína - Google Patents

Compuestos específicos de diariltiohidantoína

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ES2535466T3
ES2535466T3 ES10746795.3T ES10746795T ES2535466T3 ES 2535466 T3 ES2535466 T3 ES 2535466T3 ES 10746795 T ES10746795 T ES 10746795T ES 2535466 T3 ES2535466 T3 ES 2535466T3
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receptor
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Rajendra Parasmal Jain
Jacqueline A. Gibbons
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Medivation Prostate Therapeutics LLC
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende (a) un compuesto que es de la fórmula l:**Fórmula** donde: X es S, y R1 es OH o NH2; o es una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

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23-04-2015
DESCRIPCIÓN
Compuestos específicos de diariltiohidantoína
5 Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº 61/155.119, depositada el 24 de febrero de 2009 y de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº 61/156.398, depositada el 27 de febrero de 2009.
10
Campo de la invención
En este documento se proporcionan dos compuestos específicos de diariltiohidantoína, y composiciones farmacéuticas y otras formas que comprenden estos dos compuestos específicos, y dichos compuestos para su uso
15 en métodos para la prevención y/o el tratamiento de afecciones en mamíferos tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer de próstata.
Antecedentes de la invención
20 Los compuestos de diarilhidantoína, incluyendo los compuestos de diariltiohidantoína, han sido descritos en las Publicaciones de EE.UU. Nos 2007/0004753, 2007/0254933 y 2009/0111864. No obstante, sigue habiendo una necesidad de nuevas terapias para el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer de próstata. También se desean nuevas terapias para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y de la enfermedad de Alzheimer.
25 (MI) -(MII) según se detalla en este documento son metabolitos del compuesto RD162’ divulgado en la publicación de EE.UU. Nº 2007/0004753 y pueden hallar uso en terapia.
Breve resumen de la invención
30 Se describen los compuestos (MI) -(MII). La fórmula (I) según se proporciona en este documento describe y se refiere a los compuestos de la fórmula (MI) -(MII). El compuesto (MI) ejerce su efecto a través del transportador de norepinefrina. Los moduladores del transportador de norepinefrina han sido útiles en las terapias para el tratamiento de la depresión, la enfermedad de Alzheimer, los trastornos por déficit de atención y la enfermedad de Parkinson. El
35 compuesto (MII) ejerce su efecto a través del receptor de progesterona. Los moduladores del receptor de progesterona se han usado en terapias en las que está implicada la progesterona. Los moduladores del receptor de progesterona tienen un uso potencial en el control de la natalidad, bien para evitar el embarazo o bien para producir un aborto. Los compuestos (MI) -(MII) son metabolitos del compuesto RD162’. El RD162’ ha hallado uso en el tratamiento del cáncer de próstata.
40 También se describen métodos y composiciones. En una variación, el método comprende la administración de un compuesto de fórmula (MI) o (MII) a un individuo en una cantidad eficaz para modular un receptor, tal como uno de los receptores indicados en las Tablas 5 y 9. En este documento se detallan los métodos de aislamiento de un compuesto de fórmula (MI) o (MII). También se proporcionan métodos de uso de un compuesto de fórmula (MI) y
45 (MII) en terapia. En un aspecto, la terapia es el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, de la enfermedad de Alzheimer o del cáncer de próstata. También están englobadas composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (MI) o (MII) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, ya que son formas aisladas y/o purificadas de un compuesto de fórmula (MI) o (MII). También se describen formas de dosificación unitarias de un compuesto de fórmula (MI) o (MII).
50 Consecuentemente, en un aspecto, se proporcionan compuestos que son de la fórmula (I):
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en la que: X es S, y R1 es OH o NH2,
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se describen los compuestos de las fórmulas (MI), (MII), (MIII), (MIV) y (MV):
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10 Se entiende que también se proporcionan las sales de los compuestos, tales como las sales farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de la fórmula (I) han sido identificados como metabolitos del compuesto RD162’, que ha hallado utilidad en el tratamiento del cáncer de próstata y se describe en la publicación de la solicitud de EE.UU. Nº
15 2007/0004753. Según se describe en los Ejemplos, a continuación, el RD162’ y los metabolitos del mismo se aislaron mediante una precipitación de proteínas inducida por acetonitrilo de 100 μl de plasma. Los metabolitos fueron identificados mediante mediciones por escáner del tiempo de vuelo de los iones positivos desde 55 hasta 800 amu. Una molécula en particular fue identificada como un potencial metabolito del RD162’ si su fragmentación daba como resultado subespecies con un patrón coherente con el del RD162’ parental. Había presentes cinco supuestos
20 metabolitos en el plasma de ratas, perros y/o seres humanos: (MI), (MII), (MIII), (MIV) y (MV). Las estructuras de los metabolitos se dedujeron mediante un análisis del espectro de masas, y después se sintetizaron los supuestos metabolitos. Las estructuras moleculares de los metabolitos fueron confirmadas a través de un experimento de elución conjunta de CL/EM/EM en el que las moléculas sintetizadas se comparaban directamente con las estructuras aisladas a partir de las muestras de plasma de ratas, de perros y de seres humanos.
25 Los compuestos de la fórmula (I) también pueden hallar uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de próstata o en el tratamiento de otras indicaciones relacionadas con la actividad de dichos compuestos, tales como la actividad de unión al receptor detallada en este documento.
30 En una forma de realización, con respecto a los compuestos de fórmula (I) (es decir, los compuestos (MI) -(MII)), los compuestos se proporcionan en una forma sustancialmente pura.
En un aspecto se proporcionan composiciones que comprenden los compuestos, en las que la composición está exenta de sangre o de otros líquidos corporales.
35 En otro aspecto se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I), y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender uno o más de los compuestos descritos en este documento, o sales o solvatos de los mismos.
40 En otro aspecto, los compuestos son para ser usados en métodos para la prevención o el tratamiento de una afección de entre las indicadas en este documento, y particularmente, dicha afección puede estar relacionada con, por ejemplo, la depresión, alteraciones de la memoria tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, y el cáncer de próstata, método que comprende la administración a un individuo en necesidad de los mismos de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la fórmula (I), o de una sal o un solvato del
45 mismo, o de una composición farmacéutica que comprende los anteriores.
La invención también engloba el uso de cualquiera de los compuestos de la invención para la preparación de medicamentos, que pueden ser administrados para una terapia, tal como para el tratamiento de las indicaciones divulgadas en este documento, incluyendo el cáncer de próstata.
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En aspectos adicionales, se proporcionan métodos para la síntesis de los compuestos descritos en este documento, describiéndose a continuación algunos protocolos y rutas sintéticas representativas.
Se proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un compuesto de la fórmula (I):
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en la que:
X es S, y 10 R1es OH o NH2;
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una variación particular de la fórmula (I), el compuesto es de la fórmula (MI):
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra variación de la fórmula (I), el compuesto es de la fórmula (MII):
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
15
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También se proporciona una composición del compuesto sustancialmente puro, en la que el compuesto es de la fórmula l:
25
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en la que: 30 X es S, y
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R1 es OH o NH2;
o una sal o un solvato del mismo. En una variación particular de la fórmula (I), el compuesto es de la fórmula (MI):
o una sal o un solvato del mismo. En otra variación de la fórmula (I), el compuesto es de la fórmula (MII):
o una sal o un solvato del mismo. También se proporciona una composición de cualquiera de las formas de
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10 realización y variaciones precedentes, en la que la composición contiene menos de aproximadamente el 10 por ciento en peso de impurezas.
La invención también engloba un compuesto de la fórmula (I):
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en la que:
X es S, y
R1 es OH o NH2; 20
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de administración a un individuo para una terapia. En una forma de realización en particular, la terapia es el tratamiento del cáncer de próstata. En otra forma de realización, la terapia es el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o de la enfermedad de Alzheimer.
25 También se proporciona un kit que comprende un compuesto de la fórmula (I):
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en la que:
X es S, y
R1 es OH o NH2;
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o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En una forma de realización, el kit comprende adicionalmente instrucciones para su uso, que en una variación, son instrucciones para el uso del compuesto en el tratamiento del cáncer de próstata o instrucciones para el uso del compuesto en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o de la enfermedad de Alzheimer.
10 También se proporciona en este documento una forma de dosificación unitaria que comprende un compuesto de la fórmula (I):
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15 en la que: X es S, y R1 es OH o NH2; 20 o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. También se proporciona un compuesto aislado de la fórmula (I):
imagen12
25 en la que:
X es S, y R1 es OH o NH2; 30
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Otros objetos y ventajas se harán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la siguiente descripción detallada. 35
Descripción detallada de la invención
Definiciones
40 Salvo que claramente se indique de otro modo, los términos "un", "uno" y similares, se refieren a uno o más.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en este documento incluye (y describe) formas de realización que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
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Según se usa en este documento, por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente ni de otro modo indeseable, por ejemplo, el material puede ser incorporado en una composición farmacéutica administrada a un paciente sin provocar ningún efecto biológico indeseable significativo, ni interactuar de una forma perjudicial con cualquiera de los demás componentes de la composición en la que está contenido. Los
5 vehículo o los excipientes farmacéuticamente aceptables cumplen preferiblemente los requisitos habituales de ensayos toxicológicos y de elaboración y/o están incluidos en la Inactive Ingredient Guide preparada por la Food y Drug Administration de Estados Unidos.
Las "sales farmacéuticamente aceptables" son aquellas sales que conservan al menos parte de la actividad biológica
10 del compuesto libre (no salino) y que pueden ser administradas como fármacos o productos farmacéuticos a un individuo. Una sal farmacéuticamente aceptable tiene interacciones iónicas y no un enlace covalente. Dichas sales, por ejemplo, incluyen: (I) sales de adición ácida, formadas con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares; o formadas con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido propiónico, ácido succínico, ácido maleico, tartárico ácido y similares; (2)
15 sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto parental es sustituido por un ión metálico, por ejemplo, un ión de un metal alcalino, un ión alcalinotérreo o un ión de aluminio; o coordina con una base orgánica. Algunas bases orgánicas aceptables incluyen etanolamina, dietanolamina, trietanolamina y similares. Algunas bases inorgánicas aceptables incluyen hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de sodio, y similares. Algunos ejemplos adicionales de sales farmacéuticamente aceptables incluyen los
20 recogidos en Berge y col., Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci., enero de 1977; 66 (1): 1 -19. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse in situ en el proceso de elaboración, o mediante una reacción por separado de un compuesto purificado de la invención en su forma de ácido o de base libre con una base o un ácido orgánico o inorgánico adecuado, respectivamente, y aislando la sal así formada durante la posterior purificación. Debería entenderse que una referencia a una sal farmacéuticamente aceptable incluye las formas de adición con el
25 disolvente o las formas cristalinas de la misma, particularmente solvatos o polimorfos. Los solvatos contienen cantidades estequiométricas o no estequiométricas de un disolvente, y a menudo se forman durante el proceso de cristalización. Los hidratos se forman cuando el disolvente es agua, o los alcoholatos se forman cuando el disolvente es un alcohol. Los polimorfos incluyen los diferentes ordenamientos de empaquetamiento cristalino de la misma composición elemental de un compuesto. Los polimorfos tienen habitualmente diferentes patrones de difracción por
30 rayos X, espectros de infrarrojos, puntos de fusión, densidades, durezas, formas cristalinas, propiedades ópticas y eléctricas, estabilidades y solubilidades. Diversos factores tales como el disolvente de recristalización, la velocidad de cristalización y la temperatura de almacenamiento pueden provocar el predominio de una única forma cristalina.
El término "excipiente" se usa de forma intercambiable con "vehículo" en este documento, y según se usa en este
35 documento se refiere a una sustancia inerte o inactiva que puede ser usada en la producción de un fármaco o de un producto farmacéutico, tal como un comprimido que contiene un compuesto de la invención como principio activo. Diversas sustancias pueden ser englobadas por el término excipiente, incluyendo, sin limitación, cualquier sustancia usada como aglutinante, disgregante, recubrimiento, coadyuvante de compresión / encapsulación, crema o loción, lubricante, soluciones para administración parenteral, materiales para comprimidos masticables, edulcorante o
40 saborizante, agente suspensor / gelificante o agente de granulación en húmedo. Algunos aglutinantes incluyen, por ejemplo, carbómeros, povidona, goma xántica, etc.; algunos recubrimientos incluyen, por ejemplo, acetato ftalato de celulosa, etil celulosa, goma gellan, maltodextrina, recubrimientos entéricos, etc.; algunos coadyuvantes de compresión / encapsulación incluyen, por ejemplo, carbonato de calcio, glucosa, fructosa dc (dc = "directamente compresible"), miel dc, lactosa (anhidra o monohidratada; opcionalmente junto con aspartamo, celulosa, o celulosa
45 microcristalina), almidón dc, sacarosa, etc.; algunos disgregantes incluyen, por ejemplo, croscarmelosa de sodio, goma gellan, glucolato sódico de almidón, etc.; algunas cremas o lociones incluyen, por ejemplo, maltodextrina, carragenanos, etc.; algunos lubricantes incluyen, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico, estearil fumarato sódico, etc.; algunos materiales para comprimidos masticables incluyen, por ejemplo, glucosa, fructosa dc, lactosa (monohidratada, opcionalmente junto con aspartamo o celulosa), etc.; algunos agentes suspensores /
50 gelificantes incluyen, por ejemplo, carragenano, glucolato sódico de almidón, goma xántica, etc.; algunos edulcorantes incluyen, por ejemplo, aspartamo, glucosa, fructosa dc, sorbitol, sacarosa dc, etc.; y algunos agentes de granulación en húmedo incluyen, por ejemplo, carbonato de calcio, maltodextrina, celulosa microcristalina, etc.
Salvo que claramente se indique de otro modo, "un individuo" según se usa en este documento se refiere a un
55 mamífero, incluyendo, pero no se limita a, un ser humano, un animal bovino, un primate, un equino, un canino, un felino, un porcino y un ovino. Por lo tanto, la invención halla uso tanto en la medicina humana como en el contexto veterinario, incluyendo su uso en animales agrícolas y en mascotas domésticas.
El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a dicha cantidad de un compuesto que
60 debería ser eficaz en una forma terapéutica dada. Como se entiende en la técnica, una cantidad eficaz puede estar en una o más dosis, por ejemplo, puede ser necesaria una dosis individual o dosis múltiples para conseguir el punto final de tratamiento deseado. Pueden usarse los métodos habituales para la medición de la magnitud de este efecto, tales como los ensayos in vitro con enzimas purificadas, los ensayos basados en células, los modelos animales o los ensayos en seres humanos.
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Según se usa en este documento, "tratamiento" o "tratar" es una metodología para la obtención de un resultado beneficioso o deseado, incluyendo los resultados clínicos. Para los fines de esta invención, algunos resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de un síntoma y/o la disminución de la magnitud de un síntoma y/o la prevención del empeoramiento de un síntoma asociado con una enfermedad o
5 afección.
Según se usa en este documento, un compuesto que es un "modulador" del receptor se refiere a, y engloba, un compuesto que se une o que inhibe la unión de un ligando al receptor, o que reduce o elimina o que aumenta o mejora o mimetiza una actividad del receptor. Como tal, un "modulador del receptor" engloba tanto un antagonista
10 del receptor como un agonista del receptor.
Según se usa en este documento, una "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias, que contienen cada una, una cantidad predeterminada de un principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
15 Una composición de un compuesto "sustancialmente puro" se refiere a que la composición contiene menos de aproximadamente el 35 % o menos de aproximadamente el 20 % o menos de aproximadamente el 15 % o preferiblemente menos de aproximadamente el 10 % o más preferiblemente menos de aproximadamente el 5 % o incluso más preferiblemente menos de aproximadamente el 3 %, y lo más preferiblemente menos de
20 aproximadamente el 1 %, de impurezas.
Se entiende que cualquiera de las formas de realización que se describen en este documento con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan asimismo formas de realización análogas descritas en términos de "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en".
25
Compuestos y composiciones
En ciertos aspectos, en este documento se proporcionan compuestos y composiciones que comprenden dichos compuestos, por ejemplo, en forma de composiciones farmacéuticas. Los compuestos y las composiciones pueden
30 hallar uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de próstata, de la enfermedad de Parkinson o de la enfermedad de Alzheimer. También se proporcionan composiciones con los compuestos sustancialmente puros, ya que son compuestos aislados y sintéticos. También se proporcionan formas de dosificación unitarias de los compuestos.
35 En este documento se detallan métodos de aislamiento de un compuesto de fórmula (MI) y/o (MII), tales como un método de aislamiento de los compuestos a partir de la sangre o de cualquier otro líquido corporal. También están englobadas composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (MI) o (MII) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, ya que son formas aisladas y/o purificadas de un compuesto de fórmula (MI) o (MII).
40 En un aspecto de la invención se describen los compuestos de las fórmulas (MI) y (MII) y las sales de los mismos. Un compuesto de fórmula (MI) o (MII) puede estar en forma aislada, y se engloban las composiciones que comprenden formas aisladas. Un compuesto de fórmula (MI) o (MII) puede estar en una forma purificada, y las composiciones que comprenden los compuestos en forma purificada se detallan en este documento.
45 En un aspecto se proporciona una composición que comprende un compuesto de la fórmula (I), en el que la composición está exenta de sangre o de cualquier otro líquido corporal. En un aspecto se proporciona una composición que comprende una forma purificada de un compuesto de la fórmula (I). Dicha composición puede contener otros componentes, tales como un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto se proporciona una composición de una forma sustancialmente pura de un compuesto de fórmula (I), en el que la composición
50 comprende menos de aproximadamente cualquiera del 15 %, del 10 %, del 5 %, del 3 % y del 1 % de impurezas, impurezas que pueden ser, por ejemplo, un compuesto que no sea de la fórmula (I) o sangre u otro líquido corporal. En un aspecto, una composición del compuesto sustancialmente puro comprende únicamente uno de (MI) y (MII).
El compuesto (MI) es de la fórmula:
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El compuesto (MII) es de la fórmula:
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Los compuestos (MI) -(MII) pueden estar presentes en forma de sales, tales como sales farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan compuestos que son de la fórmula (I):
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10 en la que: X es S, y R1 es OH o NH2; 15 o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos. Por lo tanto, se proporcionan compuestos de acuerdo con las fórmulas (MI) y (MII):
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20 y pueden usarse en las composiciones y los métodos descritos en este documento.
En una forma de realización en particular, con respecto a los compuestos de fórmula (I), X es S y R1 es OH. Por lo tanto, en una variación, un compuesto de fórmula (I) es de la fórmula (MI):
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En otra forma de realización en particular, con respecto a los compuestos de fórmula (I), X es S y R1 es NH2. Por lo tanto, en una variación, un compuesto de fórmula (I) es de la fórmula (MII):
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En otro aspecto de la invención, en este documento se proporciona una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de acuerdo con las fórmulas (MI) o (MII). En una forma de realización, la sal farmacéuticamente 5 aceptable es de un compuesto de acuerdo con las fórmulas (MI) o (MII).
Se describen los compuestos de las fórmulas (MI) y (MII) y las sales de los mismos. Por lo tanto, los compuestos (MI) -(MII) pueden estar presentes en forma de sales, tales como sales farmacéuticamente aceptables. Un compuesto de fórmula (MI) o (MII) puede estar en una forma aislada, aquí se engloban las composiciones que
10 comprenden las formas aisladas. Un compuesto de fórmula (MI) o (MII) puede estar en una forma purificada, y las composiciones que comprenden un compuesto en forma purificada están detalladas en este documento.
Se proporciona una composición de un compuesto sustancialmente puro de acuerdo con las fórmulas (I), o una sal del mismo. En un aspecto, la composición es una composición sustancialmente pura del compuesto (MI) o (MII). Las
15 composiciones sustancialmente puras en un aspecto contienen menos de aproximadamente cualquiera del 10 por ciento en peso o del 5 por ciento en peso o del 1 por ciento en peso de impurezas.
Por lo tanto, se proporcionan composiciones que comprenden un compuesto de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo, tales como composiciones de compuestos sustancialmente puros. En algunas formas de realización, una 20 composición que contiene un compuesto de fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo está en una forma sustancialmente pura. En una variación, "sustancialmente pura" se refiere a una composición que contiene menos de aproximadamente el 35 % de impurezas, en la que la impureza representa un compuesto distinto al compuesto de la fórmula (MI) o (MII) o una sal de los mismos. En una variación, se proporciona una composición del compuesto sustancialmente puro de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo en la que la composición contiene menos de 25 aproximadamente el 25 % de impurezas. En otra variación, se proporciona una composición del compuesto sustancialmente puro de la fórmula (MI) o (MII) o a sal del mismo en la que la composición contiene menos de aproximadamente el 20 % de impurezas. En otra variación más, se proporciona una composición del compuesto sustancialmente puro de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo en la que la composición contiene menos de aproximadamente el 10 % de impurezas. En una variación adicional, se proporciona la composición del compuesto 30 sustancialmente puro de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo en la que la composición contiene menos de aproximadamente el 5 % de impurezas. En otra variación, se proporciona una composición del compuesto sustancialmente puro de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo en la que la composición contiene menos de aproximadamente el 3 % de impurezas. En otra variación más, se proporciona una composición del compuesto sustancialmente puro de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo en la que la composición contiene menos de
35 aproximadamente el 1 % de impurezas. En una variación adicional, se proporciona una composición del compuesto sustancialmente puro de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo en la que la composición contiene menos de aproximadamente el 0,5 % de impurezas. En un aspecto, el % de impurezas se refiere al porcentaje de impurezas determinado como porcentaje en peso.
40 Se proporcionan composiciones farmacéuticas en las que la composición comprende un compuesto de la fórmula (MI) o (MII) o una sal del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto de la invención, en este documento se proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la fórmula (MI) o (MII) o una sal
o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
45 En una forma de realización, con respecto a la composición farmacéutica, el vehículo o excipiente son adecuados para una administración parenteral. En una forma de realización, con respecto a la composición farmacéutica, el vehículo es adecuado para una administración oral. En una forma de realización, con respecto a la composición farmacéutica, el vehículo es adecuado para una administración tópica.
50 En una forma de realización, la composición farmacéutica comprende un compuesto de acuerdo con la fórmula (MI)
o (MII). En otro aspecto, la composición farmacéutica está exenta de un compuesto de acuerdo con las fórmulas (MIII), (MIV) o (MV).
55 En una forma de realización, se proporciona una composición farmacéutica de una forma sustancialmente pura del compuesto de acuerdo con las fórmulas (MI) o (MII).
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Un compuesto de la fórmula (I) puede formularse con vehículos adecuados para cualquier vía de administración disponible, incluyendo una administración por vía oral, mucosal (por ejemplo, nasal, sublingual, vaginal, bucal o rectal), parenteral (por ejemplo, intramuscular, subcutánea o intravenosa), tópica o transdérmica. Un compuesto de la fórmula (I) puede formularse con vehículos adecuados para proporcionar formas de administración que incluyen,
5 pero no se limitan a: comprimidos, capsuletas, cápsulas (tales como cápsulas de gelatina dura y cápsulas elásticas de gelatina blanda), obleas, trociscos, tabletas, gomas, dispersiones, supositorios, ungüentos, cataplasmas (apósitos), pastas, polvos, apósitos, cremas, soluciones, parches, aerosoles (por ejemplo, pulverizadores o inhaladores nasales), geles, suspensiones (por ejemplo, suspensiones líquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua o emulsiones líquidas de agua en aceite), soluciones y elixires.
Una formulación farmacéutica puede prepararse mediante la combinación de un compuesto de la fórmula (I) como principio activo con un vehículo farmacológicamente aceptable, que son conocidos en la técnica. Dependiendo de la forma terapéutica del sistema (por ejemplo, comprimido oral), el vehículo puede estar en varias formas. Además, las preparaciones farmacéuticas pueden contener conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes rehumectantes,
15 emulsionantes, edulcorantes, colorantes, ajustadores, tampones, agentes de recubrimiento o antioxidantes. Las preparaciones que contienen un compuesto de la fórmula (I) como principio activo también pueden contener otras sustancias que tengan unas propiedades terapéuticas valiosas. Las formas terapéuticas pueden estar representadas por una dosis estándar habitual y pueden prepararse mediante un método farmacéutico conocido. Algunas formulaciones adecuadas pueden encontrarse, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 21ª ed. (2005), que se incorpora al presente documento como referencia.
La cantidad de un compuesto de la fórmula (I) en una composición farmacéutica u otra, incluyendo una forma de dosificación unitaria, puede ser una cantidad eficaz. En una variación, una composición, tal como una composición farmacéutica, comprende un compuesto de la fórmula (I) en una forma de dosificación en una cantidad de entre
25 aproximadamente 10 ng y aproximadamente 1.500 mg o más.
Se proporcionan artículos de elaboración que comprenden un compuesto de la invención, o una sal o un solvato del mismo, en un recipiente apropiado. El recipiente puede ser un vial, un tarro, una ampolla, y similares.
Los métodos y los kits en este documento pueden comprender un compuesto según se detalla en este documento, o una sal o un solvato del mismo, al igual que si todas y cada una de las formas de realización fueran enumeradas específicamente e individualmente. Asimismo, el método y los kits proporcionados en este documento pueden comprender una composición según se detalla en este documento, tal como una composición farmacéutica, al igual que si todas y cada una de las formas de realización fueran enumeradas específicamente e individualmente.
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Métodos
Los compuestos de la fórmula (I) (es decir, los compuestos (MI) -(MII)) son activos sobre uno o más objetivos moleculares, y por lo tanto pueden hallar uso en terapia. Los compuestos (MI) -(MII), o una sal o un solvato de los mismos, pueden usarse para modular un receptor de las Tablas 5 y 9, y los métodos de modulación de dicho receptor están englobados en este documento.
Se proporciona el uso en un método de terapia que comprende la administración de un compuesto de fórmula (I), o una sal o un solvato del mismo, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anteriores, a un
45 individuo. En una variación, el método comprende la administración de un compuesto de fórmula (MI) o (MII) a un individuo en una cantidad eficaz para modular un receptor, tal como un receptor indicado en las Tablas 5 y 9. En un aspecto, un método de modulación del transportador de norepinefrina en un individuo comprende la administración de un compuesto de la fórmula (MI), o de una sal o un solvato del mismo, al individuo. En otro aspecto, un método de modulación del receptor de la progesterona en un individuo comprende la administración de un compuesto de la fórmula (MII), o de una sal o un solvato del mismo, al individuo.
En algunas formas de realización, un compuesto según se describe en este documento que modula un receptor (un modulador de receptor) inhibe la unión de un ligando en al menos aproximadamente o en aproximadamente uno cualquiera del 10 %, del 20 %, del 30 %, del 40 %, del 50 %, del 60 %, del 70 %, del 80 %, del 90 %, del 95 % o del 55 100 % según se determina en los ensayos descritos en este documento. En algunas formas de realización, el modulador del receptor reduce una actividad de un receptor en al menos aproximadamente o en aproximadamente cualquiera del 10 %, del 20 %, del 30 %, del 40 %, del 50 %, del 60 %, del 70 %, del 80 %, del 90 %, del 95 % o del 100 % en comparación con la correspondiente actividad en el mismo sujeto antes del tratamiento con el modulador del receptor, o en comparación con la correspondiente actividad en otros sujetos que no reciben el modulador del receptor. En algunas formas de realización, el modulador del receptor mejora la actividad de un receptor en al menos aproximadamente o en aproximadamente cualquiera del 10 %, del 20 %, del 30 %, del 40 %, del 50 %, del 60 %, del70 %, del 80 %, del 90 %, del 95 % o del 100o del 200 %o del 300 % o del 400 %o del 500 % o másen comparación con la correspondiente actividad en el mismo sujeto antes del tratamiento con el modulador del receptor, o en comparación con la correspondiente actividad en otros sujetos que no reciben el modulador del 65 receptor. En algunas formas de realización, el modulador del receptor es capaz de unirse al sitio activo de un receptor (por ejemplo, un sitio de unión para un ligando). En algunas formas de realización, el modulador del
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receptor es capaz de unirse a un sitio alostérico de un receptor.
En otro aspecto de la invención, en este documento se proporciona un compuesto de acuerdo con las fórmulas (MI)
o (MII), o una sal del mismo, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anteriores, para su
5 uso en un método para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección divulgado en este documento en un individuo, que comprende la administración al individuo de una cantidad eficaz de dicho compuesto, sal o composición.
En otro aspecto de la invención, en este documento se proporciona un compuesto de acuerdo con las fórmulas (MI)
o (MII), o una sal del mismo, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anteriores, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer de próstata que comprende la administración a un individuo en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto, sal o composición.
En una forma de realización, con respecto al uso en un método de tratamiento, la enfermedad o la afección se elige
15 de entre la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, en una forma de realización, el uso es en un método para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En otra forma de realización, el uso es en un método para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización en particular, se proporciona un compuesto de la fórmula (MI), o una sal o un solvato del mismo, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anteriores, para su uso en un método para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en el que el método comprende la administración a un individuo en necesidad del mismo de dicho compuesto, sal, solvato o composición. En otra forma de realización, se proporciona un compuesto de la fórmula (MI), o una sal o un solvato del mismo, o una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anteriores para su uso en un método para el tratamiento de la enfermedad de
25 Alzheimer, en el que el método comprende la administración a un individuo en necesidad del mismo de dicho compuesto, sal, solvato o composición
También se proporciona un compuesto de la fórmula (I), o una sal o un solvato del mismo, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer de próstata, de la alopecia, del carcinoma hepatocelular o del acné vulgar, en el que el método comprende la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto, sal o solvato. En un aspecto, el uso comprende la administración de un compuesto de la fórmula (MI) o (MII). En una forma de realización, el uso es un método para el tratamiento del cáncer de próstata. En otra forma de realización, el uso es un método para el tratamiento de la alopecia. En otra forma de realización más, el uso es un método para el tratamiento del carcinoma hepatocelular. Aun en otra forma de realización, el uso es un método para el tratamiento
35 del acné vulgar.
En una variación en particular, se proporciona un compuesto de la fórmula (MI), o una sal o un solvato del mismo, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer de próstata, de la alopecia, del carcinoma hepatocelular o del acné vulgar, en el que el método comprende la administración a un individuo de dicho compuesto, sal o solvato. En otra variación se proporciona un compuesto de la fórmula (MII), o una sal o un solvato del mismo, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer de próstata, de la alopecia, del carcinoma hepatocelular o del acné vulgar, en el que el método comprende la administración a un individuo de dicho compuesto, sal o solvato.
En otra variación, se proporciona un método de control de la natalidad para un individuo femenino, en el que el
45 método comprende la administración de un compuesto de la fórmula (MII) al individuo. En una variación, el compuesto se administra al individuo en una cantidad para evitar el embarazo. En otra variación, se proporciona un compuesto de la fórmula (MII) para su uso en un método abortivo. En una variación, se administra el compuesto (MII) a un individuo femenino que está embarazada. En otra variación, se administra el compuesto (MII) a un individuo femenino que no está embarazada.
En una variación adicional, se proporciona el uso en un método para el tratamiento de un trastorno por déficit de atención.
En cualquiera de los métodos proporcionados, en un aspecto, el individuo es un ser humano.
55 En una forma de realización, el tratamiento de una enfermedad o afección con un compuesto de la invención o con una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no está acompañado o tiene menos efectos secundarios que los asociados con las terapias disponibles actualmente para la enfermedad o afección y/o mejora la calidad de vida del individuo.
Un régimen de tratamiento que implique un compuesto de la fórmula (I) puede implicar la administración del compuesto a un individuo, tal como un ser humano, en una dosis de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, al menos una vez al día y durante el periodo de tiempo requerido para conseguir el efecto terapéutico. En otras variaciones, la dosis diaria (u otra frecuencia de dosificación) de un 65 compuesto de la fórmula (I) es de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 8 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 6 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 4 mg/kg;
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o de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 2 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 10 mg/kg; o de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/kg; o de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 mg/kg; o de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 10 mg/kg; o de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 10 5 mg/kg; o de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 10 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 4 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5 mg/kg; o de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 mg/kg; o de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 mg/kg; o de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4 mg/kg; o de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 mg/kg; o de entre aproximadamente 1,5 y 10 aproximadamente 3 mg/kg; o de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,03 y 4 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,03 mg/kg y 2 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,05 y 10 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,05 y 8 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,05 y 4 mg/kg; o de entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 3 mg/kg; o de entre aproximadamente 10 kg y aproximadamente 50 kg; o de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 mg/kg o de entre aproximadamente 10 y
15 aproximadamente 250 mg/kg; o de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 mg/kg o de entre aproximadamente 50 y 200 mg/kg; o de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 mg/kg o de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 mg/kg; o una dosis por encima de aproximadamente 100 mg/kg; o una dosis por encima de aproximadamente 500 mg/kg.
20 Un compuesto de la fórmula (I) puede ser administrado a un individuo de acuerdo con un régimen de dosificación eficaz durante un periodo de tiempo o duración deseados, tal como al menos durante aproximadamente una semana, al menos durante aproximadamente 2 semanas, al menos durante aproximadamente tres semanas, al menos durante aproximadamente un mes, al menos durante aproximadamente 2 meses, al menos durante aproximadamente 3 meses, al menos durante aproximadamente 6 meses o al menos durante aproximadamente 12
25 meses o más. En una variación, un compuesto de la fórmula (I) se administra a un individuo con un esquema diario
o intermitente durante la duración de la vida del individuo.
La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser de aproximadamente una dosificación de una vez por semana. La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser de 30 aproximadamente una dosificación de una vez al día, una dosificación de dos veces al día o una dosificación de tres veces al día. La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser de aproximadamente una dosificación de tres veces a la semana o una dosificación de aproximadamente cuatro veces por semana o puede ser una dosificación de aproximadamente dos veces por semana. La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser mayor de aproximadamente una dosificación de una vez por semana, pero menor de 35 aproximadamente una dosificación de una vez al día. La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula
(I) puede ser de aproximadamente una dosificación de una vez al mes. La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser de aproximadamente una dosificación de dos veces por semana. La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser mayor de aproximadamente una dosificación de una vez al mes pero menor de aproximadamente una dosificación de una vez por semana. La frecuencia de 40 dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser intermitente (por ejemplo, una dosificación de una vez al día durante 7 días seguido de ninguna dosis durante 7 días, repetido durante cualquier período de tiempo de 14 días, tal como durante aproximadamente 2 meses, durante aproximadamente 4 meses, durante aproximadamente 6 meses o más). La frecuencia de dosificación de un compuesto de la fórmula (I) puede ser continua (por ejemplo, una dosificación de una vez por semana durante semanas continuas). Cualquiera de las secuencias de dosificación
45 puede emplear cualquiera de los compuestos descritos en este documento, o una sal o un solvato de los mismos, junto con cualquiera de las dosis descritas en este documento.
Kits
50 La invención también proporciona kits que comprenden un compuesto de fórmula (I). Los kits pueden incluir opcionalmente un conjunto de instrucciones, generalmente instrucciones escritas, aunque también es aceptable cualquier medio de almacenamiento (por ejemplo, un disquete magnético o un disco óptico) que contenga las instrucciones. Las instrucciones incluidas en el kit incluyen generalmente la información relativa a los componentes y a su administración a un individuo, tal como la información relativa a la dosis, el esquema de dosificación y la vía de
55 administración. En algunas formas de realización, el kit incluye (a) un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y (b) instrucciones para su uso en una afección o trastorno descrito en este documento, tal como el cáncer de próstata, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Los kits pueden usarse para uno cualquiera o más de los usos descritos en este documento, y, consecuentemente, pueden contener destrucciones para uno cualquiera o más de los usos establecidos (por ejemplo, el tratamiento y/o la
60 prevención y/o el retraso de la aparición y/o del desarrollo de cualquier indicación divulgada en este documento).
En algunas formas de realización, la cantidad del compuesto de la fórmula (I) en un kit es una cantidad suficiente para producir un resultado terapéutico deseado (por ejemplo, la reducción de la gravedad o de la duración, la estabilización de la gravedad, o la eliminación, de uno o más síntomas de una indicación que se va a tratar).
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Los kits comprenden generalmente un envase adecuado. Los kits pueden comprender uno o más recipientes que comprenden cualquiera de los compuestos descritos en este documento. Algunos envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, frascos, tarros, envases flexibles (por ejemplo, bolsas de plástico), y similares. Cada componente (cuando hay más de un componente) puede estar envasado en recipientes individuales, o alguno de los
5 componentes puede estar combinado en un recipiente cuando la reactividad cruzada y la vida de almacenamiento lo permitan. Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como excipientes.
Los recipientes pueden ser formas de dosificación unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases multidosis) o dosis subunitarias. Por ejemplo, pueden proporcionarse kits que contengan unas dosis suficientes de un compuesto
10 de fórmula (I) para proporcionar un tratamiento eficaz de un individuo con una indicación que se va a tratar durante un periodo prolongado, tal como cualquiera de una semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses o más. Los kits también pueden incluir múltiples dosis unitarias de los compuestos e instrucciones para su uso, y estar envasados en cantidades suficientes para su almacenamiento y uso en farmacias (por ejemplo, en farmacias hospitalarias y en farmacias magistrales).
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Métodos de preparación y aislamiento de los compuestos de la invención
Los métodos sintéticos para generar compuestos de diarilhidantoína se describen en las Publicaciones de EE.UU. Nos 2007/0004753, 2007/0254933 y 2009/0111864. Los compuestos (MI) -(MV) también pueden ser elaborados de
20 acuerdo con los métodos detallados en los Ejemplos de este documento.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención.
Ejemplo 1. Aislamiento e identificación de los compuestos a partir de plasma de rata
25 Se aislaron los metabolitos del RD162’ y se identificaron en muestras plasmáticas en estado estacionario a partir del grupo de dosis altas de un estudio de toxicología oral de 26 semanas con ratas Sprague Dawley machos y hembras.
Las muestras de plasma de rata se almacenaron aproximadamente a -20 ºC o más frío. Las muestras se obtuvieron
30 a partir de sujetos que recibían el RD162’. Las muestras de estudio se prepararon para una inyección de HPLC mediante la precipitación de cada muestra (100 μl) con un volumen de 3x (300 μl) de acetonitrilo. Las muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 5 min. Después de la centrifugación se transfirieron 380 μl de cada sobrenadante a un tubo nuevo y se evaporaron a sequedad en una Speed-Vac. Las muestras evaporadas fueron reconstituidas con 50 μl de ácido fórmico al 0,2 % en agua.
35 Las muestras se analizaron mediante el uso de las siguientes condiciones de CL/EM/EM: HPLC: sistema Shimadzu VP; fase móvil: ácido fórmico al 0,2 % en agua (A) y ácido fórmico al 0,15 % en metanol (B); columna: columna de 1 x 50 mm TITAN C18 (Peeke Scientific); volumen de inyección: 20 μl; gradiente: 5 -75 % de B en 30 min; caudal: 100 μl/min; espectrómetro de masas: Applied Biosystems/MDS SCIEX Q-STAR; interfase: división por IonSpray a ~ 1/10;
40 escáner del ión parental: TOF positivo desde 100 -900 amu; escáner del ión producto: TOF del ión producto desde 60 -900 amu del ión más intenso del escáner de ión parental; calibración del TOF: calibrado externamente mediante el uso de sustrato de renina.
Las muestras se prepararon para su inyección y se analizaron el mismo día. La Tabla 1 resume los resultados de 45 este análisis.
Tabla 1. Resumen de los metabolitos del RD162’ identificados mediante CL/EM/EM en muestras de plasma de rata
Nº de áreas de pico de EM del animal (tiempo de muestra TK)
Nombre
TR (min) Compuesto o Metabolito (m/z) 1591 (2 h) 1590 (8 h) 1709 (8 h)
RD 162’
26,0 465 5,9 e5 4,0 e5 1,1 e6
(MI)
27,8 452 1,3 e4 1,0 e4 1,8 e4
(MII)
25,1 451 7,5 e3 4,2 e3 1,2 e4
50 Ejemplo 2. Aislamiento e identificación de los compuestos en plasma de perro
Se aislaron los metabolitos del RD162’ y se identificaron en muestras plasmáticas en estado estacionario a partir del grupo de dosis altas de un estudio de toxicología oral de 13 semanas con perros Beagle macho.
55 Las muestras de plasma de perro se almacenaron aproximadamente a -20 ºC o más frío. Las muestras se obtuvieron a partir de sujetos que recibían el RD162’. Las muestras de estudio se prepararon para una inyección de HPLC mediante la precipitación de cada muestra (100 μl) con un volumen de 3x (300 μl) de acetonitrilo. Las muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 5 min. Después de la centrifugación se transfirieron 380 μl de cada
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sobrenadante a un tubo nuevo y se evaporaron a sequedad en una Speed-Vac. Las muestras evaporadas fueron reconstituidas con 50 μl de ácido fórmico al 0,2 % en agua.
Las muestras se analizaron mediante el uso de las siguientes condiciones de CL/EM/EM: HPLC: sistema Shimadzu
5 VP; fase móvil: ácido fórmico al 0,2 % en agua (A) y ácido fórmico al 0,15 % en metanol (B); columna: columna de 1 x 50 mm TITAN C18 (Peeke Scientific); volumen de inyección: 20 μl; gradiente: 5 -75 % de B en 30 min; caudal: 100 μl/min; espectrómetro de masas: Applied Biosystems/MDS SCIEX Q-STAR; interfase: división por IonSpray a ~ 1/10; escáner del ión parental: TOF positivo desde 100 -900 amu; escáner del ión producto: TOF del ión producto desde 60 -900 amu del ión más intenso del escáner de ión parental; calibración del TOF: calibrado externamente mediante
10 el uso de sustrato de renina.
Las muestras se prepararon para su inyección y se analizaron el mismo día. La Tabla 2 resume los resultados de este análisis.
15 Tabla 2. Resumen de los metabolitos del RD162’ identificados mediante CL/EM/EM en muestras de plasma de perro
Nº de áreas de pico de EM del animal (tiempo de muestra TK)
Nombre
TR (min) Compuesto o Metabolito (m/z) 119 (2 h) 119 (4 h) 123 (2 h) 123 (4 h)
RD 162’
26,0 465 6,3 e5 3,1 e5 3,8 e5 4,2 e5
(MI)
27,8 452 5,6 e4 5,6 e4 2,5 e4 2,4 e4
(MII)
25,1 451 7,5 e3 2,7 e3 5,8 e3 5,1 e3
Ejemplo 3. Aislamiento e identificación de los compuestos en plasma humano
20 Se aislaron los metabolitos del RD162’ y se identificaron en muestras plasmáticas en estado estacionario a partir de pacientes con cáncer de próstata que tomaban RD162’. Las muestras humanas en estado estacionario consistían en cinco muestras de Cmáx que se obtuvieron aproximadamente el Día 84 de tratamiento a 240 mg/día.
Las muestras de plasma humano plasma se almacenaron aproximadamente a -20 ºC o más frío. Las muestras se
25 obtuvieron a partir de sujetos que recibían el RD162’. Las muestras de estudio se prepararon para una inyección de HPLC mediante la precipitación de cada muestra (100 μl) con un volumen de 3x (300 μl) de acetonitrilo. Las muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 5 min. Después de la centrifugación se transfirieron 380 μl de cada sobrenadante a un tubo nuevo y se evaporaron a sequedad en una Speed-Vac. Las muestras evaporadas fueron reconstituidas con 50 μl de ácido fórmico al 0,2 % en agua.
30 Las muestras se analizaron mediante el uso de las siguientes condiciones de CL/EM/EM: HPLC: sistema Shimadzu VP; fase móvil: ácido fórmico al 0,2 % en agua (A) y ácido fórmico al 0,15 % en metanol (B); columna: columna de 1 x 50 TITAN C18 (Peeke Scientific); volumen de inyección: 20 μl; gradiente: 5 -75 % de B en 30 min; caudal: 100 μl/min; espectrómetro de masas: Applied Biosystems/MDS SCIEX Q-STAR; interfase: división por IonSpray a ~ 1/10;
35 escáner del ión parental: TOF positivo desde 100 -900 amu; escáner del ión producto: TOF del ión producto desde 60 -900 amu del ión más intenso del escáner de ión parental; calibración del TOF: calibrado externamente mediante el uso de sustrato de renina.
Las muestras se prepararon para su inyección y se analizaron el mismo día. La Tabla 3 resume los resultados de 40 este análisis.
Tabla 3. Resumen de los metabolitos del RD162’ identificados mediante CL/EM/EM en muestras de plasma humano
ID de áreas de pico de EM del sujeto (tiempo de muestra PK)
Nombre
TR (min) Compuesto o Metabolito (m/z) 3478 (1 h) 1473 (1 h) 3475 (1 h) 1472 (1 h) 3454 (2 h)
RD 162’
26,0 465 6,4 e5 6,3 e5 5,0 e5 5,4 e5 5,7 e5
(MI)
27,8 452 3,8 e4 4,5 e4 2,5 e4 5,4 e4 6,2 e4
(MII)
25,1 451 1,7 e5 1,6 e5 1,5 e5 1,5 e5 1,6 e5
45 Ejemplo 4: cuantificación de los compuestos en plasma humano
Para estimar las concentraciones de los metabolitos en plasma humano, se cualificaron y usaron ensayos de CL/EM/EM para (MI) y (MII) para analizar el plasma de 18 pacientes de cáncer de próstata que habían recibido RD162’ a entre 150 y 480 mg al día durante aproximadamente tres meses. Los resultados de este análisis (Tabla 4)
50 demostraron que (MI) y (MII) estaban presentes en elevadas concentraciones en el plasma.
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Tabla 4. Concentraciones de los metabolitos del RD162’ en el plasma de pacientes tratados con RD162’ durante al menos tres meses
Resumen estadístico de los resultados de 18 pacientes
Concentraciones en el plasma de los pacientes expresadas como un porcentaje de la concentración de RD162’
(MI)
(MII)
Mínimo
16 % 49 %
Máximo
259 % 204 %
Promedio
60 % 112 %
El método usado para derivar los datos anteriores fue como sigue. Ensayo de CL/EM/EM por electropulverización de 5 los metabolitos del RD162’ ( (MI), (MII)):
Procedimientos de extracción del plasma para las determinaciones de concentración: se añadió una muestra de
plasma humano (50 μl) a un tubo de vidrio de 10 ml. Al tubo se añadió un volumen de solución madre de 10 μl de IS,
seguido de la adición de tampón de fosfato 1 M a pH 3,0 (400 μl). La mezcla se agitó vorticialmente y se añadió 10 tetrabutil metil éter (5 ml). El tubo se agitó vorticialmente durante 30 s y después se centrifugó a 4540 g durante 10
min. El disolvente se transfirió a un tubo de vidrio y se secó bajo un flujo de aire a 35 -40 ºC. La muestra se
reconstituyó con 100 μl de metanol: ácido fórmico al 0,1 % en agua (7:3) se agitó vorticialmente durante 30 s y se
trató con ultrasonidos durante 5 min, La muestra se transfirió a un vial de muestras para HPLC y se centrifugó a
4.540 g durante 5 min; después se inyectó un volumen de 20 μl en un sistema de CL/EM/EM para el ensayo.
15 Parámetros de la CL/EM/EM para los metabolitos del RD162’ (MII): parámetros del instrumento en modo de ión positivo -función 1; polaridad: ES+; tipo de datos: datos MRM; tipo de función: MRM del canal 5 al 8
Canal
Reacción Reposo (s) Voltaje del cono Energía de col. Compuesto
5
451,25 > 178,30 0,05 55,0 35,0 (MII)
6
451,25 > 195,40 0,05 55,0 27,0 (MII)
7
469,30 > 213,40 0,05 50,0 27,0 patrón interno de D4-RD 162’
8
469,30 > 384,40 0,05 50,0 27,0 patrón interno de D4-RD 162’
20 Condiciones iniciales de la bomba de CL HP1100: columna de HPLC: ACE C18, 5 μM, de 150 x 2,1 mm id, disolventes: % de A, 40,0; % de B, 60,0; % de C, 0,0; % de D, 0,0; válvula A ajustada al canal 1; válvula B ajustada al canal 1, Flujo: 0,300 ml/min; tiempo de detención: 9,0 min; presión mínima: 0 bar; presión máxima: 300 bar; temperatura del horno a la izquierda: 30,0 ºC; temperatura del horno a la derecha: 30,0 ºC.
25 Cronograma de gradiente de la bomba de CL HP1100:
Tiempo
% de A % de B % de C % de D Caudal (ml/min) Presión
0,00
40,0 60,0 0,0 0,0 0,300 300
1,50
40,0 60,0 0,0 0,0 0,300 300
1,60
10,0 90,0 0,0 0,0 0,300 300
3,50
10,0 90,0 0,0 0,0 0,300 300
3,60
40,0 60,0 0,0 0,0 0,300 300
Parámetros de la CL/EM/EM para el metabolito del RD162' (MI)
Parámetros del instrumento -función 1; polaridad: ES-; tipo de datos: datos MRM; tipo de función: MRM de 5 canales.
Canal
Reacción Reposo (s) Voltaje del cono Energía de col. Compuesto
1
373,30 > 315,20 0,05 50,0 35,0 Fenilcumarina IS
2
373,30 > 343,30 0,05 50,0 25,0 Fenilcumarina IS
3
373,30 > 358,30 0,05 50,0 25,0 Fenilcumarina IS
4
450,20 > 158,00 0,05 30,0 30,0 (MI)
5
450,20 > 406,30 0,05 30,0 15,0 (MI)
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Columna de HPLC: ACE C18, 5 μM de 150 x 2.1 mm id; modo de la bomba de CL HP1 100: isocrático; condiciones del disolvente en isocrático % de A, 25,0; % de B, 75,0; % de C, 0,0; % de D, 0,0; válvula A ajustada al canal 1; válvula B ajustada al canal 1; Flujo: 0,300 ml/min; tiempo de detención: 4,5 min; presión mínima: 0 bar; presión máxima: 300 bar: temperatura del horno a la izquierda: 30,0 ºC; temperatura del horno a la derecha: 30,0 ºC.
5
Síntesis de los compuestos de la invención
Ejemplo 5. Preparación del ácido 4-(3-(4-ciano-3-(trifluorometiI)fenil)-5.5-dimetil-4-oxo-2-tioxoimidazolidin-1-il)-2fluorobenzoico (Compuestos (MI)):
10
imagen19
Se suspendió 4-(3-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-5,5-dimetil-4-oxo-2-tioxoimidazolidin-1-il)-2-fluoro-Nmetilbenzamida en HCl concentrado y se calentó a 120 ºC en un recipiente a presión durante 48 h. La reacción se 15 controló mediante una cromatografía en capa fina (TLC). La mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente. El residuo se filtró y se purificó mediante una cromatografía sobre gel de sílice (100 -200 de malla. eluyente: 0 -5 % de metanol -diclorometano). EM (m/z): 452 (M+1). HPLC: columna YMC ODS AQ. de 4,6 x 250 mm, 5 μm. Fase móvil A: acetato de amonio 10 mM. Fase móvil B: acetonitrilo. Gradiente isocrático: 55 % de A:45 % de B. Tiempo de retención: 3,804 min. Pureza mediante HPLC: 95,82 %. Caudal: 1 ml/min. RMN-1H (CDCl3, base
20 libre): δ (ppm) 8,22 (t, 1H), 8,0 (d, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,82 (d, 1H), 7,2 (m, 2H) 1,6 (s, 6H).
Ejemplo 6. Preparación de 4-(3-(4-ciano-3-(trifluorometil)feniI)-5.5-dimetil-4-oxo-2-tioxoimidazolidin-1-il)-2fluorobenzamida (Compuesto (MII)).
25 Ejemplo 6a. Preparación de 4-bromo-2-fluorobenzamida:
imagen20
A una solución agitada de ácido 4-bromo-2-fluorobenzoico (1,5 g, 6,84 mmol) en DCM (15 ml) se añadió gota a gota cloruro de oxalilo (3,45 g, 27,39 mmol) a 0 ºC. Después de que se completara la adición, se añadieron 2 -3 gotas de
30 DMF a 0 ºC y la mezcla de reacción se agitó durante 2 h a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se disolvió en THF seco (20 ml). A esta solución se añadió amoníaco acuoso (50 ml) a 0 ºC. La mezcla de reacción se calentó a y se agitó a la temperatura ambiente durante 30 min. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se destiló azeotrópicamente con tolueno para obtener 1,3 g de producto. RMN-1H (CDCl3, base libre): 8 (ppm) 8,0 (t, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,30 (d, 1H), 6,60 (s a, 1H), 5,9 (s a, 1H).
35 Ejemplo 6b. Preparación del ácido 2-(4-carbamoiI-3-fluorofeniIamino)-2-metiIpropanoico:
imagen21
Se mezclaron 4-bromo-2-fluorobenzamida (0,5 g, 2,29 mmol), ácido 2-aminoisobutírico (0,354 g, 3,54 mmol), CUI
40 (87 mg, 0,458 mmol) y K2CO3 (0,790 g, 5,72 mmol) en DMF (5 ml), se añadieron H2O (0,5 ml) y TEA (11 mg, 0,1 mmol) seguido de 2-acetil ciclohexanona (60 mg, 0,428 mmoI). La mezcla de reacción se calentó a 95 -100 ºC durante 48 h. La mezcla de reacción se diluyó con H2O (20 ml) y la capa acuosa se lavó con acetato de etilo (20 ml). La capa acuosa se acidificó con ácido cítrico 1 M a pH 4 y el producto se extrajo con acetato de etilo (20 ml x 3). La capa orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida para obtener el
45 producto. RMN-1H (DMSO, base libre): δ (ppm) 7,55 -7,45 (t, 1H), 7,20 (s a, 1H), 7,05 (s a, 1H), 6,80 (s a, 1H), 6,35 -6,30 (d, 1H), 6,18 -6,10 (d, 1H), 1,42 (s, 6H).
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Ejemplo 6c. Preparación de 2-(4-carbamoiI-3-fluorofeniIamino)-2-metiIpropanoato de metilo:
imagen22
5 Se agitó una solución de ácido 2-(4-carbamoil-3-fluorofenilamino)-2-metilpropanoico y K2CO3 (1,5 equivalentes) en DMF (10 veces) a la TA durante 10 min. Se añadió MeI (1,5 equivalentes) y la mezcla de reacción se calentó a 55 60 ºC durante 2 h. El disolvente se eliminó a presión reducida y la mezcla de reacción se vertió en agua, se extrajo con acetato de etilo (100 ml x 2), se secó sobre Na2SO4, se concentró y se purificó mediante una cromatografía en columna. RMN-1H (CDCl3, base libre): δ (ppm) 7,9 (t, 1H), 6,5 (s a, 1H), 6,4 (d, 1H), 6,2 (d, 1H), 5,6 (s a, 1H), 4,6 (s
10 a, 1H), 3,75 (s, 3H), 1,6 (s, 6H).
Ejemplo 6d. Preparación de 4-isotiocianato-2-(trifluorometiI) benzonitrilo:
imagen23
15 Se disolvió tiofosgeno (10 g, 87,71 mmol) en agua y se agitó a la temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió en porciones 4-amino-2-trifluorometil-benzonitrilo a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 2 h. El producto se extrajo con diclorometano y la capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para obtener 12 g de producto. RMN-1H (CDCl3): δ (ppm) 7,84 (d, 1H), 7,58 (S, 1H), 7,48 (d, 1H).
20 Ejemplo 6e. Preparación de 4-(3-(4-ciano-3-(trifluorometil)fenil)-5,5-dimetil-4-oxo-2-tioxoimidazolidin-1-il)-2fluorobenzamida (Compuesto (MII)):
imagen24
Se calentó una solución de 2-(4-carbamoil-3-fluorofenilamino)-2-metilpropanoato de metilo y 2-(trifluorometil)-4-iso
25 tiocianatobenzonitrilo (1,5 equivalentes) en DMSO seco (5 ml por mmol) a 80 -82 ºC durante 12 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante una cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un 40 % de acetona hexanos. EM (m/z): 451 (M+1). HPLC: columna YMC ODS A, de 4,6 x 150 mm, 5 μm. Fase móvil A: acetato de amonio 10 mM. Fase móvil B: Acetonitrilo. Gradiente: 10 % de B hasta 2 min, del 10 % al 90 % de B en 3 min,
30 mantener durante 3 min, del 90 % al 10 % de B en 5 min. Tiempo de retención: 2,782 min. Pureza mediante HPLC: 99,4 %. Caudal: 1 ml/min. RMN-1H (CDCl3, base libre): δ (ppm) 8,3 (t, 1H), 8,0 (d, 1H) 7,98 (s, 1H), 7,8 (d, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,2 (d, 1H), 6,65 (d, 1H), 6,0 (s, 1H), 1,62 (s ,6H).
Actividad biológica de los compuestos de ensayo
35 Los siguientes ejemplos ilustran la actividad biológica de los compuestos (MI) -(MII). Los ensayos habituales de unión y enzimáticos, tales como los descritos a continuación, pueden ser llevados a cabo por profesionales tales como, por ejemplo. Cerep. lnc. (Redmond. WA. EE.UU.); MDS Pharma Services (King of Prussia. PA. EE.UU.); NovaScreen Biosciences/Caliper Life Sciences (Mountain View, CA. EE.UU.); y EuroScreen FAST (Gosselies,
40 Bélgica).
Definiciones:
En los siguientes ejemplos se usan las siguientes abreviaturas de receptores: adenosina para A1, A2a y A3;
45 adrenérgico para α1 y α2; angiotensina para AT1 y AT2; benzodiazepina para BZD; bradicinina para B1 y B2; cannabinoide para CB1 y CB2; colecistocinina para CCK1 y CCK2; factor liberador de corticotropina para CRF1; dopamina para D1, D2s, D3, D4.4; endotelina para ETA y ETB; ácido gamma-aminobutírico para GABA; ácido gammaaminobutírico ionótrofo para GABAA; propionato de alfa-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol para AMPA; ácido Nmetil-D-aspártico para NMDA; histamina para H1, H2 y H3; leucotrieno para LTB4 y LTD4; hormona liberadora de
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gonadotrofinas para GnRH; melanocortina para MC4; muscarínico para M; neurocinina para NK1, NK2 y NK3; neuropéptido para Y; opioide de nociceptina para NOP; fenciclidina para PCP; purinérgico para P2X y P2Y; serotonina para 5-HT; somatostatina para sst5; glucocorticoides para GR; estrógenos para ER; progesterona para PR; hormona tiroidea para TR; hormona liberadora de tirotrofina para TRH1; vasopresina para V1a y V2; K+ sensible
5 al ATP para KATP; K+ operado por voltaje para Kv; y dependiente de Ca2+ de baja conductancia para SKCa. En los siguientes ejemplos se usan las siguientes abreviaturas de enzimas: fosfodiesterasa para PDE1B, PDE2A, PDE3A, PDE4D, PDE5; cinasa de proteína C alfa para PKCα; transferasa de catecol-O-metilo para COMT; oxidasa de monoamino para MAO-A y MAO-B; y transferasa de feniletanolamina-N-metilo para PNMT.
10 Ejemplo B1. Farmacología in vitro: actividad de unión de los compuestos (MD-MII).
Los compuestos (MI) -(MII) fueron evaluados mediante un cribado a 10 μM frente a los objetivos mostrados en la Tabla 5. Los métodos de ensayo de unión de radioligando utilizados para medir la actividad de los compuestos de la invención serán familiares para los expertos en la técnica. Para cada ensayo de unión, los procedimientos generales
15 y las condiciones experimentales se resumen en las Tablas 5 y 6, respectivamente. En cada caso de ensayo, los componentes del ensayo tales como, por ejemplo, el tipo de célula, el ligando, el compuesto de referencia y similares, serán familiares para los profesionales de dicho ensayo.
Tabla 5: procedimientos generales
Ensayo
Origen Compuesto de referencia
A1 (h) (aa)
hr1 (células CHO) DPCPX
A2A (h) (ag)
hr1 (células HEK-293) NECA
A3 (h) (ag)
hr1 (células HEK-293) IB-MECA
α1 (ns)2 (aa)
corteza cerebral de rata prazosina
α2 (ns)2 (aa)
corteza cerebral de rata yohimbina
β1 (h) (ag)
hr1 (células HEK-293) atenolol
β2 (h) (ag)
hr1 (células CHO) ICI118551
AT1 (h) (aa)
hr1 (células HEK-293) saralasina
AT2 (h) (ag)
hr1 (células CHO) saralasina
BZD (central) (ag)
corteza cerebral de rata diazepam
B1 (h) (ag)
hr1 (células CHO) DesArg10-KD
B2 (h) (ag)
hr1 (células CHO) NPC 567
CB1 (h) (ag)
hr1 (células CHO) CP 55940
CB2 (h) (ag)
hr1 (células CHO) WIN 55212-2
CCK1 (CCKA) (h) (ag)
hr1 (células CHO) CCK-8s
CCK2 (CCKB) (h) (ag)
hr1 (células CHO) CCK-8s
CRF1 (h) (ag)
hr1 (células CHO) sauvagina
D1 (h) (aa)
hr1 (células CHO) SCH 23390
D2S (h) (aa)
hr1 (células HEK-293) (+) butaclamol
D3 (h) (aa)
hr1 (células CHO) (+) butaclamol
D4.4 (h) (aa)
hr1 (células CHO) clozapina
ETA (h) (ag)
hr1 (células CHO) endotelina-1
ETB (h) (ag)
hr1 (células CHO) endotelina-3
GABA (ns)2 (ag)
corteza cerebral de rata GABA
AMPA (ag)
corteza cerebral de rata L-glutamato
kainato (ag)
corteza cerebral de rata ácido kaínico
NMDA (aa)
corteza cerebral de rata CGS 19755
H (h) (aa)
hr1 (células HEK-293) pirilamina
H (h) (aa)
hr1 (células CHO) cimetidina
H (h) (ag)
hr1 (células CHO) (R)α-Me-histamina
I2 (aa)
corteza cerebral de rata idazoxan
BLT1 (LTB4) (h) (ag)
hr1 (células CHO) LTB4
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Ensayo
Origen Compuesto de referencia
CysLT1 (LTD4) (h) (ag)
hr1 (células CHO) Ltd4
GnRH (LH-RH) (ag)
glándula pituitaria de rata [D-Trp6]-LH-RH
MC4 (h) (ag)
hr1 (células CHO) NDP--MSH
M (ns)2 (aa)
corteza cerebral de rata Atropina
NK1 (h) (ag)
células U-373MG (endógenas) [Sar9,Met (O2)11]-SP
nk2 (h) (ag)
hr1 (células CHO) [NIeu10]-NKA (4 -10)
NK3 (h) (aa)
hr1 (células CHO) SB 222200
Y (ns)2 (ag)
corteza cerebral de rata NPY
N neuronal insensible a α-BGTX-(α4β2) (ag)
corteza cerebral de rata nicotina
opioide (ns)2 (aa)
corteza cerebral de rata naloxona
NOP (0RL1) (h) (ag)
hr1 (células HEK-293) nociceptina
PCP (aa)
corteza cerebral de rata MK 801
P2X (ag)
vejiga urinaria de rata α β-MeATP
P2Y (ag)
corteza cerebral de rata dATPaS
5-HT (ns)2 (ag)
corteza cerebral de rata serotonina
 (ns)2 (ag)
corteza cerebral de rata haloperidol
sst5 (h) (ag)
hr1 (células CHO) somatostatina-14
GR (h) (ag)
células IM-9 (citosol) dexametasona
ER (ns)2 (h) (ag)
células MCF-7 (citosol) 17-β-estradiol
PR (h) (ag)
células T47D (citosol) promegestona
TR (TH) (ag)
hígado de rata T3
TRH1 (h) (ag)
hr1 (células CHO) TRH
V1a (h) (ag)
hr1 (células CHO) [d(CH2)5 1,Tyr (Me) 2]-AVP
V2 (h) (ag)
hr1 (células CHO) AVP
canal de Ca2+ (L, sitio de la dihidropiridina) (aa)
corteza cerebral de rata nitrendipino
canal de Ca2+ (L, sitio del diltiazem) (benzotiazepinas) (aa)
corteza cerebral de rata diltiazem
canal de Ca2+ (L, sitio del verapamilo) (fenilalquilamina) (aa)
corteza cerebral de rata D 600
KATP channel (aa)
corteza cerebral de rata glibenclamida
hERG (preparación de membrana) (aa)
hr1 (células HEK-293) astemizol
canal de KV (aa)
corteza cerebral de rata α-dendrotoxina
canal de SKca (aa)
corteza cerebral de rata apamina
canal de Na+ (sitio 2) (aa)
corteza cerebral de rata veratridina
canal de Cl(operado por GABA) (aa)
corteza cerebral de rata picrotoxinina
transportador de norepinefrina (h) (aa)
hr1 (células CHO) protriptilina
transportador de dopamina (h) (aa)
hr1 (células CHO) BTCP
transportador de GABA (aa)
corteza cerebral de rata ácido nipecótico
transportador de colina (CHT1) (h) (aa)
hr1 (células CHO) hemicolinio-3
transportador de 5-HT (h) (aa)
hr1 (células CHO) imipramina
(ag) = radioligando agonista; (aa) = radioligando antagonista; 1. hr -recombinante humano; 2. ns -no selectivo
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Tabla 6: condiciones experimentales
Ensayo
Ligando Concentra ción No específico Incubación
A1 (h) (aa)
[3H]DPCPX 1 nM DPCPX (1 μM) 60 min / 22 ºC
A2A (h) (ag)
[3H]CGS 21680 6 nM NECA (10 μM) 120 min / 22 ºC
A3 (h) (ag)
[125I]ab-meca 0,15 nM IB-MECA (1 μM) 120 min / 22 ºC
α1 (ns) (aa)
[3H]prazosina 0,25 nM prazosina (0,5 μM) 60 min / 22 ºC
α2 (ns) (aa)
[3H]RX 821002 0,5 nM (-)epinefrina (100 μM) 60 min / 22 ºC
β1 (h) (ag)
[3H](-)CGP 12177 0,15 nM alprenolol (50 μM) 60 min / 22 ºC
β2 (h) (ag)
[3H](-)CGP 12177 0,2 nM alprenolol (50 μM) 120 min / 22 ºC
AT1 (h) (aa)
[125l][Sar1,lle8]-AT-N 0,05 nM angiotensina-ll (10 μM) 120 min / 37 ºC
AT2 (h) (ag)
[125I]CGP 42112A 0,04 nM angiotensina-ll (1 μM) 180 min / 37 ºC
BZD (central)(ag)
[3H]flunitrazepam 0,4 nM diazepam (3 μM) 60 min / 4 ºC
B1 (h) (ag)
[3H]desArg10-KD 0,35 nM desArg9[Leu8]-BK (10 μM) 60 min / 22 ºC
B2 (h) (ag)
[3H]bradicinina 0,2 nM bradicinina (1 μM) 60 min / 22 ºC
CB1 (h) (ag)
[3H]CP 55940 0,5 nM WIN 55212-2 (10 μM) 120 min / 37 ºC
CB2 (h) (ag)
-[3H]WIN 55212-2 0,8 nM WIN 55212-2 (5 μM) 120 min / 37 ºC
CCK1 (CCKA) (h) (ag)
[125I]CCK-8s 0,08 nM CCK-8s (1 μM) 60 min / 22 ºC
CCK2 (CCKB) (h) (ag)
[125I]CCK-8s 0,08 nM CCK-8s (1 μM) 60 min / 22 ºC
CRF1 (h) (ag)
[125l]sauvagina 0,075 nM sauvagina (0,5 μM) 120 min / 22 ºC
D1 (h) (aa)
[3H]SCH 23390 0,3 nM SCH 23390 (1 μM) 60 min / 22 ºC
D2s (h) (aa)
[3H]spiperona 0,3 nM (+)butaclamol (10 μM) 60 min / 22 ºC
D3 (h) (aa)
[3H]spiperona 0,3 NM (+)butaclamol (10 μM) 60 min / 22 ºC
D4.4 (h) (aa)
[3H]spiperona 0,3 nM (+)butaclamol (10 μM) 60 min / 22 ºC
ETA (h) (ag)
[125l]endotelina-1 0,03 nM endotelina-1 (0,1 μM) 120 min / 37 ºC
ETB (h) (ag)
[125l]endotelina-1 0,03 nM endotelina-1 (0,1 μM) 120 min / 37 ºC
GABA (NS) (ag)
[3H]GABA 10 nM GABA (100 μM) 60 min / 22 ºC
AMPA (ag)
[3H]AMPA 8 nM L-glutamato (1 mM) 60 min / 4 ºC
kainato (ag)
[3H]ácido kaínico 5 nM L-glutamato (1 mM) 60 min / 4 ºC
NMDA (aa)
[3H]CGP 39653 5 nM L-glutamato (100 μM) 60 min / 4 ºC
H1 (h) (aa)
[3H]pirilamina 3 nM pirilamina (1 μM) 60 min / 22 ºC
H2 (h) (aa)
[125I]APT 0,075 nM tiotidina (100 μM) 120 min / 22 ºC
H3 (h) (ag)
[3H]Nα-Me-histamina 1 nM (R)α-Me-histamina (1 μM) 60 min / 22 ºC
l2 (aa)
[3H]idazoxan (+ yohimbina 1 μM) 2 nM cirazolina (10 μM) 30 min / 22 ºC
BLT1 (LTB4) (h) (ag)
[3H]LTB4 0,2 nM LTB4 (0,2 μM) 60 min / 22 ºC
CysLT1 (LTD4) (h) (ag)
[3H]LTD4 0,3 nM LTD4 (1 μM) 60 min / 22 ºC
GnRH (LH-RH) (ag)
[125I][D-Trp6]-LH-RH 0,05 nM [D-TRP6]-LH-RH (1 μM) 90 min / 4 ºC
MC4 (h) (ag)
[125l]NDP-α-MSH 0,05 nM NDP--MSH (1 μM) 120 min / 37 ºC
M (ns) (aa)
[3H]QNB 0,05 nM atropina (1 μM) 120 min / 22 ºC
NK1 (h) (ag)
[125I]BH-SP 0,13 nM [Sar9, Met(O2)11]-SP (1 μM) 60 min / 22 ºC
NK2 (h) (ag)
[125I]NKA 0,1 nM [Nleu10]-NKA (4 -10) (10 μM) 60 min / 22 ºC
NK3 (h) (aa)
[3H]SR 142801 0,4 nM SB 222200 (10 μM) 120 min / 22 ºC
Y (ns) (ag)
[121I]péptido YY 0,05 nM NPY (1 μM) 120 min / 22 ºC
N neuronal insensible a α-BGTX(α4β2) (ag)
[3H]citisina 1,5 nM nicotina (10 μM) 75 min / 4 ºC
opioide (ns) (aa)
PH]naIoxona 1 nM naIoxona (1 μM) 40 min / 22 ºC
E10746795
23-04-2015
Ensayo
Ligando Concentra ción No específico Incubación
NOP (ORL1) (h) (ag)
[3H]nociceptina 0,2 nM Nociceptina (1 μM) 60 min / 22 ºC
PCP (aa)
[3H]TCP 10 nM MK 801 (10 μM) 120 min / 37 ºC
P2X (ag)
[3H]α,β-MeATP 3 nM α,β-MeATP (10 μM) 120 min / 4 ºC
P2Y (ag)
[35S]dATPαS 10 nM dATPαS (10 μM) 60 min / 22 ºC
5-HT (ns) (ag)
pH]serotonina 2 nM serotonina (10 μM) 60 min / 37 ºC
 (ns) (ag)
[3H]DTG 8 nM haloperidol (10 μM) 120 min / 22 ºC
sst5 (h) (ag)
[125l]Tyr11-somatostatina14 0,1 nM somatostatina-14 (1 μM) 120 min / 22 ºC
GR (h) (ag)
[3H]dexametasona 1,5 nM triamcinolona (10 μM) 6 h / 4 ºC
ER (ns) (h) (ag)
[3H]estradiol 1 nM 17-β-estradiol (6 μM) 20 h / 4 ºC
PR (h) (ag)
[3H]progesterona 0,5 nM promegestona (1 μM) 20 h / 4 ºC
TR (TH) (ag)
[125I]T3 0,1 nM T3 (1 μM) 18 h / 4 ºC
TRH1 (h) (ag)
[3H]Me-TRH 2 nM TRH (10 μM) 120 min / 4 ºC
V1a (h) (ag)
[3H]AVP 0,3 nM AVP (1 μM) 60 min / 22 ºC
V2 (h) (ag)
[3H]AVP 0,3 nM AVP (1 μM) 120 min / 22 ºC
canal de Ca2+ (L, sitio de la dihidropiridina) (aa)
[3H]nitrendipino 0,2 nM Nifedipino (1 μM) 120 min / 22 ºC
canal de Ca2+ (L, sitio del diltiazem) (benzotiazepinas) (aa)
[3H]diltiazem 5 nM diltiazem (10 μM) 120 min / 22 ºC
canal de Ca2+ (L, sitio del verapamilo) (fenilalquilamina) (aa)
[3H](-)D 888 3 nM D 600 (10 μM) 120 min / 22 ºC
canal de KATP (aa)
[3H]glibenclamida 0,1 nM glibenclamida (1 μM) 60 min / 22 ºC
hERG (preparación de membrana) (aa)
[3H]astemizol 2 nM astemizol (10 μM) 75 min / 22 ºC
canal de KV (aa)
[125l]-dendrotoxina 0,01 nM α-dendrotoxina (50 nM) 60 min / 22 ºC
canal de SKCa (aa)
[125l]apamina 0,007 nM apamina (100 nM) 60 min / 4 ºC
canal de Na+ (sitio 2) (aa)
[3H]batracotoxina en 10 nM veratridina (300 μM) 60 min / 22 ºC
canal de Cl(operado por GABA) (aa)
[35S]TBPS 3 nM picrotoxinina (20 μM) 120 min / 22 ºC
transportador de norepinefrina (h) (aa)
[3H]nisoxetina 1 nM desipramina (1 μM) 120 min / 4 ºC
transportador de dopamina (h) (aa)
[3H]BTCP 4 nM BTCP (10 μM) 120 min / 4 ºC
transportador de GABA (aa)
[3H]GABA (+ isoguvacina 10 μM) (+ baclofen 10 μM) 10 nM GABA (1 mM) 30 min / 22 ºC
transportador de colina (CHT1) (h) (aa)
[3H]hemicolinio m-3 3 nM hemiecolinio-3 (10 μM) 60 min / 22 ºC
transportador de 5-HT (h) (aa)
[3H]imipramina 2 nM imipramina (10 μM) 60 min / 22 ºC
(ag) = radioligando agonista; (aa) = radioligando antagonista; (ns) -no selectivo
Análisis y Expresión de los Resultados: los compuestos de la invención se ensayaron en ensayos bioquímicos, y se determinó el porcentaje de inhibición de la unión específica. La unión específica del ligando a los receptores se definió como la diferencia entre la unión total y la unión no específica determinada en presencia de un exceso de ligando no marcado. Los resultados están expresados como el porcentaje de inhibición de la unión específica del control (100-((unión específica medida / unión específica del control) x 100)) obtenidos en presencia de los compuestos de ensayo. Los resultados de los ensayos se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7. Resultados de los ensayos de unión
% de inhibición de la unión específica del control @ 10 μM
(MI)
(MII)
A1 (h) (aa)
10 9
A2A (h) (ag)
10 -5
A3 (h) (ag)
69 17
E10746795
23-04-2015 E10746795
% de inhibición de la unión específica del control @ 10 μM
(MI)
(MII)
α1 (ns) (aa)
-4 -7
α2 (ns) (aa)
-7 -9
β1 (h) (ag)
-2 -7
β2 (h) (ag)
6 -3
AT1 (h) (aa)
11 0
AT2 (h) (aa)
-1 -6
BZD (central) (ag)
-35 -37
B (h) (ag)
0 6
B2 (h) (ag)
2 -12
CB1 (h) (ag)
-20 11
CB2 (h) (ag)
-2 1
CCK1 (CCKA) (h) (ag)
47 0
CCK2 (CCKB) (h) (ag)
-10 -18
CRF1 (h) (ag)
-4 1
D1 (h) (aa)
-18 -14
D2s (h) (aa)
-16 -8
D3 (h) (aa)
7 11
D4 4 (h) (aa)
1 9
ETA (h) (ag)
-21 -16
ETB (h) (ag)
-7 -4
GABA (NS) (ag)
-12 0
AMPA (ag)
1 -10
kainato (ag)
-4 -21
NMDA (aa)
2 5
H1 (h) (aa)
-8 2
H2 (h) (aa)
-41 -27
H3 (h) (ag)
-3 -2
l2 (aa)
28 22
BLT1 (LTB4) (h) (ag)
-15 -8
CysLT1 (LTD4) (ag)
. 3 18
GnRH (LH-RH) (ag)
-21 -51
MC4 (h) (ag)
-23 -25
M (ns) (aa)
18 1
NK1 (h) (ag)
-7 9
NK2 (h) (ag)
-6 -3
NK3 (h) (aa)
-11 3
Y(ns)(ag)
-6 -6
neuronal insensible a α-BGTX-(α4β2) (ag)
0 -3
opioide (ns) (aa)
-6 -14
NOP (ORL1) (h) (ag)
-10 -4
PCP (aa)
0 5
P2X (ag)
4 4
P2Y (ag)
-19 -2
5-HT (ns) (ag)
21 14
23-04-2015
% de inhibición de la unión específica del control @ 10 μM
(MI)
(MII)
 (ns) (ag)
20 39
sst5 (h) (ag)
-25 16
GR (h) (ag)
5 3o
ER (NS) (h) (ag)
-8 3
PR (h) (ag)
23 74
TR (TH) (ag)
-7 o
TRH1 (h) (ag)
18 -4
V1a (h) (ag)
2 15
V2 (h) (ag)
5 3
canal de Ca2+ (L, sitio de la dihidropiridina) (aa)
16 18
canal de Ca2+ (L, sitio del diltiazem) (benzotiazepinas) (aa)
2 22
canal de Ca2+ (L, sitio del verapamilo) (fenilalquilamina) (aa)
-2 -13
canal de KATP (aa)
17 24
hERG (preparación de membrana) (aa)
-39 7
canal de KV (aa)
-2 -3
canal de SKCa (aa)
-6 4
canal de Na+ (sitio 2) (aa)
-5 13
canal de Cl(operado por GABA) (aa)
47 81
transportador de norepinefrina (h) (aa)
56 -13
transportador de dopamina (h) (aa)
32 23
transportador de GABA (aa)
-16 7
transportador de colina (CHT1) (h) (aa)
-16 -22
transportador de 5-HT (h) (aa)
1 16
(ag) = radioligando agonista; (aa) = radioligando antagonista; (ns) -no selectivo
Resultados de la Farmacología in vitro: generalmente se considera que los resultados que muestran una inhibición (o una estimulación para los ensayos realizados en condiciones basales) mayor del 50 % representan unos efectos significativos de los compuestos de ensayo. Los resultados que muestran una inhibición (o una estimulación) de
5 entre el 20 % y el 50 % son generalmente indicativos de unos efectos entre débiles y moderados. Los resultados que muestran una inhibición (o una estimulación) menor del 20 % generalmente se consideran menos significativos.
La biología de los objetivos seleccionados se resume como sigue. Receptor A3 de adenosina: receptor acoplado a proteínas G con un papel poco definido en las funciones cardiacas, inflamatorias y neuronales (Fishman, y col. 10 "Pharmacology and therapeutic applications of A3 receptor subtype." Curr. Top. Med. Chem. (2003), 3 (4): 463 -9); Cannabinoid CB2 receptor: G-protein coupled receptor involved in nociception, and immune cell function (Jhaveri, y col. "Cannabinoid CB2 receptor-mediated anti-nociception in models of acute and chronic pain." Mol Neurobiol. (2007), 36 (1): 26 -35; Marriott, y col. "Recent advances in the development of selective ligands for the cannabinoid CB (2) receptor." Curr. Top. Med. Chem. (2008), 8 (3): 187 -204); canal de Cl-(rata): el canal de cloruro operado por 15 el GABA regula la actividad de las neuronas (Treiman, D. "GABAergic Mechanisms in Epilepsy." Epilepsy (2001), 42 (3): 8 -12); α1 adrenérgico (no selectivo, de rata): receptor acoplado a proteínas G para catecolaminas. Estos receptores regulan la contracción del músculo liso y la liberación de neurotransmisores (Michelotti, y col. "Alpha 1-Adrenergic receptor regulation: basic science and clinical implications." Pharmacol. Ther. (2000), 88 (3): 281 -309); Sigma (no selectivo): receptor del SNC unido membrana que modula el comportamiento relacionado con la 20 depresión (Stahl, S. "Antidepressant Treatment of Psychotic Major Depression: Potential Role of the Sigma Receptor." CNS Spectr. (2005), 10 (4): 319 -323); transportador de norepinefrina: transporta la noradrenalina, y en un menor grado la dopamina, desde la sinapsis de vuelta a las vesículas intraneuronales para su almacenamiento hasta su uso posterior (Mandela, y col. "The Norepinephrine Transporter and Its Regulation." J. Neurochemistry (2006), 97 (2): 310 -333); PR de progesterona: es expresado en todos los sistemas fisiológicos superiores, con
25 picos en el útero / ovario, el cerebelo, la médula espinal y el hipotálamo (Edwards, y col. "Progesterone receptor transcription and non-transcription signaling mechanisms." Steroids (2003), 68 (10 -13): 761 -770).
E10746795
23-04-2015
Ejemplo B2: Farmacología in vitro: unión al receptor de andrógenos (AR) humano
Preparación tisular: se expresó el receptor de andrógenos humano en células LNCAP que se cultivaron y se recogieron mediante tripsinización en matraces T-175. El sedimento congelado se descongeló y se resuspendió
5 mediante la aplicación de ultrasonidos, después se diluyó hasta la concentración apropiada. El homogeneizado se centrifugó @ 48.000 g durante 10 min a 4 ºC. Se usó el sobrenadante. Se determinaron las proteínas. El tejido se diluyó a 0,325 mg/ml con tampón de ensayo, de forma que cada tubo recibió 65 μg de proteína, o que la concentración final de ensayo fuera de 0,260 mg/ml.
10 Materiales y reactivos: se diluyó [3H]-metiltrienolona hasta una concentración de 5 nM en HEPES 25 mM a pH 7,4 (que contenía EDTA 1,0 mM, molibdato de sodio 10 mM, 10 % de glicerol, PMSF 0,5 mM) de forma que la concentración final de radioligando en el ensayo fuera de 0,5 nM. La unión no específica se definió como la remanente en presencia de 2 x 10-7 M de metiltrienolona (R1881). El compuesto de referencia era metiltrienolona (R1881), analizado a las siguientes concentraciones finales de: 2 x 10-11, 5 x 10-11, 1 x 10-10, 2 x 10-10, 5 x 10-10, 1 x
15 10-9, 2x 10-9, 5x 10-9, 1x 10-8, 2x 10-8, 5x 10-8 y1x 10-7 M.
Tampones: HEPES 25 mM a pH 7,4; EDTA 1,0 mM; molibdato de sodio 10 mM; 10 % de glicerol; PFSM 0,5 mM (en primer lugar se disolvió el PMSF en EtOH, antes de añadirlo al resto de tampón).
20 Reacción de unión: (Liao, y col. "The Use of a Hidroxilapatite-Filter Steroid Receptor Assay Method in the Study of the Modulation of Androgen Receptor Interaction." J. Steroid Biochem. (1984), 20: 11 -17 (con modificaciones)). Cada vial recibió los siguientes componentes: compuesto de ensayo / de referencia o vehículo (25 μl); [3H]metiltrienolona (25 μl); suspensión tisular (200 μl). La reacción de unión se inició con la adición de tejido, y se incubó a 0 -4 ºC (en un refrigerador) durante 18 -22 h (durante una noche). La reacción de unión fue finalizada mediante
25 una rápida filtración del contenido del tubo con filtros GF/B tratados con un 0,1 % de PEI. Los tubos de ensayo se aclararon una vez con HEPES 25 nM enfriado en hielo, después se aclararon rápidamente con 6 x 1 ml/tubo del mismo tampón de lavado. La radioactividad atrapada por los filtros fue evaluada mediante el uso de una espectrofotometría de centelleo líquido después de empapar los filtros durante al menos 1 h en cóctel de centelleo. La unión no específica se definió como la cantidad de radioactividad remanente en presencia de 2 x 10-7 M de
30 metiltrienolona sin marcar (R1881). La unión específica se calculó a partir de la diferencia entre la unión específica total y la no específica. Se determinaron los valores de la CI50 mediante la representación de la unión específica en función de la concentración del compuesto de ensayo. Los valores de la Ki se obtuvieron directamente a partir de los valores de la CI50 mediante el uso de la ecuación de Cheng-Prusoff (Ki = CI50 / (1 + (L / KD)), en la que L = concentración de radioligando en el ensayo, y KD = afinidad del radioligando por el receptor determinada de forma
35 independiente. Los resultados de los ejemplos de ensayo se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8. Actividad de unión al AR de los compuestos (MI) -(MII)
Ki (μM)
Compuesto de referencia
Mibolerona Mibolerona Metiltrienolona
Ki del compuesto de referencia
0,0051 0,0051 0,000063
Compuesto de ensayo
(MI)
NR NR NR (> 10)
(MII)
0,074 0,051 0,059
Los datos de la Tabla 8 demuestran que el compuesto MII tiene actividad frente al receptor de andrógenos. 40
Ejemplo B3: Farmacología in vitro: ensayos enzimáticos
Los ensayos enzimáticos proporcionados a continuación serán familiares para los expertos en la técnica. Para cada
ensayo enzimático, los procedimientos generales y las condiciones experimentales se resumen en las Tablas 9 y 10, 45 respectivamente.
Tabla 9: procedimientos generales
Ensayo
Origen Compuesto de referencia
PDE1B (h)
recombinante humano (células Sf9) calmidazolio
PDE2A (h)
recombinante humano (células Sf9) EHNA
PDE3A (h)
recombinante humano (células Sf9) milrinona
PDE4D (h)
recombinante humano (células Sf9) rolipram
PDE5 (h) (ns)
plaquetas humanas zaprinast
ciclasa de adenililo (basal)
cerebro de rata forskolina
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23-04-2015
Ensayo
Origen Compuesto de referencia
ciclasa de guanililo (basal)
pulmón bovino nitroprusiato sódico
PKC (h)
recombinante humano (células de insecto) Bis 10
acetilcolinasterasa (h)
recombinante humano (células HEK-293) neostigmina
COMT
hígado porcino RO 41-0960
transaminasa de GABA
cerebro de rata AoAA
MAO-A (h)
placenta humana clorgilina
MAO-B (h)
plaquetas humanas deprenilo
PNMT
médula adrenal bovina LY 78335
hidroxilasa de tirosina
cuerpo estriado de rata 3-yodo L-tirosina
ATPasa (Na+ / K+)
corteza cerebral porcina ouabaína
(ns) -no selectivo

Tabla 10: condiciones experimentales
Ensayo
Sustrato / estímulo / marcador Incubación Producto de la reacción Método de detección
PDE1B (h)
GMPc (240 nM) 30 min/ 22 ºC GMPc residual HTRF
PDE2A (h)
AMPc (40 nM) 30 min / 22 ºC AMPc residual HTRF
PDE3A (h)
AMPc (40 nM) 30 min / 22 ºC AMPc residual HTRF
PDE4D (h)
AMPc (40 nM) 30 min / 22 ºC AMPc residual HTRF
PDE5 (h) (ns)
GMPc (240 nM) 30 min / 22 ºC GMPc residual HTRF
ciclasa de adenililo (basal)
ATP (0,5 mM) (forskolina 300 μM como control) 60 min / 30 ºC AMPc HTRF
ciclasa de guanililo (basal)
GTP (0,1 mM) (nitroprusiato sódico 1 mM sodium como control) 90 min / 30 ºC GMPc HTRF
PKCα (h)
ATP + péptido de biotinilneurogranina 28 -43 (60 nM) 15 min / 22 ºC péptido de fosfobiotinilneurogranina 28 -43 HTRF
acetilcolinasterasa (h)
AMTCh (50 μM) 30 min / 37 ºC tio-conjugado fotometría
COMT
EscuIetina (1 μM) 30 min / 37 ºC escopoletina fluorimetría
transaminasa de GABA
GABA (9 mM) + α-cetoglutarato (9 mM) 60 min / 37 ºC semialdehído succínico fluorimetría
MAO-A (h)
Kinuramina (0,15 mM) 30 min / 30 ºC 4-OHquinolina fotometría
MAO-B (h)
Bencilamina (0,5 mM) 45 min / 37 ºC benzaldehído fotometría
PNMT
[14C]SAM (4 μM) + normetanofrina (28 mM) 20 min / 37 ºC [14C]metanofrina Resuelto por centelleo
hidroxilasa de tirosina
[3H]tirosina (10 μM) 40 min / 37 ºC [3H]H2O Resuelto por centelleo
ATPasa (Na+ / K+)
ATP (2 mM) 60 min / 37 ºC Pi fotometría
(ns) -no selectivo

Tabla 11: resultados de los ensayos enzimáticos
Análisis y Expresión de los Resultados: los resultados están expresados como un porcentaje de la actividad específica de control ((actividad específica medida / actividad específica de control) x 100) obtenida en presencia de los compuestos de ensayo. Los resultados se presentan en la Tabla 11.
Ensayo
% de inhibición de los valores de control @ 10 μM
(MI)
(MII)
PDE1B (h)
0 -11
PDE2A (h)
12 2
PDE3A (h)
3 0
PDE4D (h)
1 -9
PDE5 (h) (ns)
4 -I
E10746795
23-04-2015
Ensayo
% de inhibición de los valores de control @ 10 μM
(MI)
(MII)
PKCα (h)
4 6
acetilcolinasterasa (h)
51 9
COMT
1 -I
transaminasa de GABA
-7 -5
MAO-A (h)
-5 0
MAO-B (h)
8 -4
PNMT
-6 -4
hidroxilasa de tirosina
-4 2
ATPasa (Na+ / K+)
4 -10
% de estimulación con respecto al control @ 10 μM
ciclasa de adenililo (basal)
0 3
ciclasa de guanililo (basal)
0 0
(ns) -no selectivo
Ejemplo B4: ensayo de translocación nuclear del receptor de andrógenos
Manipulación de las células: se expandieron las líneas celulares PathHunter NHRPro a partir de reservas
5 congeladas en matraces T25 de acuerdo con los procedimientos habituales, y se mantuvieron en medio de crecimiento selectivo antes del ensayo. Una vez se estableció que las células estaban sanas y crecían normalmente, las células se transfirieron desde los matraces mediante el uso de un tampón de disociación celular exento de tripsina, y se sembraron en microplacas de 384 pocillos de fondo transparente y paredes blancas para la caracterización de los compuestos. Para la caracterización, las células se sembraron a una densidad 10.000 células
10 por pocillo en un volumen total de 50 μl y se dejaron adherir y recuperarse durante una noche antes de la adición del compuesto. El medio contenía suero filtrado con carbón-dextrano para reducir el nivel de hormonas presentes.
Modo de cribado: los compuestos se ensayaron en los modos de agonista y de antagonista a las siguientes respuestas de dosis: 60, 20, 6,67, 2,22, 0,74, 0,25, 0,08, 0,03, 0,009 y 0,003 μM, por duplicado, con diluciones
15 sucesivas de tres veces, y se obtuvieron los resultados de la CE50 y de la CI50.
Formato agonista: se generaron diluciones intermedias de las reservas de compuestos, de forma que pudieran añadirse 5,5 μl de 10x compuesto a cada pocillo con una concentración final de DMSO del 1 % del volumen total. Para la caracterización del compuesto en modo agonista, las células se incubaron en presencia de compuesto a 37
20 ºC durante 5 h.
Formato antagonista: se realizaron las curvas de dosis de agonista para determinar el valor de la CE50 para los siguientes ensayos antagonistas con los compuestos. Se añadieron 5,5 μl de 10x agonista a cada pocillo con una concentración igual del vehículo presente. Se determinó la concentración CE80 de agonista directamente a partir de
25 la curva de dosis de agonista. Para la determinación antagonista, las células se incubaron previamente con antagonista, seguido de una exposición al agonista a la concentración CE80: se añadieron 5,5 μl de 10x compuesto a las células y se incubaron a 37 ºC durante 1 h; se añadieron 5,5 μl de 11x la CE80 de agonista a las células y se incubaron a 37 ºC durante 5 h.
30 Detección de la señal: después de la apropiada incubación del compuesto se generó la señal de ensayo a través de una única adición de 30 μl (50 % v/v) del cóctel de reactivos de detección de PathHunter para los ensayos de agonista y de antagonista, respectivamente, seguido de la incubación durante 1 h a la temperatura ambiente. Se leyeron las microplacas después de la generación de la señal con un instrumento PerkinElmer ViewLux™ para la detección de la señal quimioluminiscente.
35 Análisis de los datos: se representaron las curvas de las dosis en presencia y en ausencia de compuesto mediante el uso de GraphPad Prism. En la Tabla 12 se proporciona un resumen de los resultados del ensayo.
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Tabla 12. Resultados del ensayo de translocación nuclear del receptor de andrógenos para los compuestos (MI) -(MII)
Ensayo de translocación nuclear del AR
CE50 μM del modo agonista
CI50 μM del modo antagonista
Norgesterol (ag)
0,0029
Geldanamicina (aa)
0,018
(MI)
nr > 60
(MII)
nr 3,2
(ag) = agonista; (aa) = antagonista
Ejemplo B5: ensayo funcional del GABAA
5 El objetivo de este estudio era evaluar los efectos funcionales de MI -MII sobre los receptores humanos ionótrofos del GABAA. Se expresaron los receptores humanos del GABAA α1β3 y α1β32 en ovocitos de Xenopus. Se usaron los efectos de una exposición aguda para evaluar los posibles efectos agonistas de los compuestos, mientras que se usó una exposición previa y conjunta con GABA para evaluar los posibles efectos inhibidores de los compuestos.
10 Preparación de los ovocitos: todos los experimentos se realizaron con GABAA humano expresado en ovocitos de Xenopus mediante el uso del método de expresión del ADNc. Los ovocitos de Xenopus se prepararon y se inyectaron mediante el uso de los procedimientos habituales. En resumen, se recogieron ovarios de Xenopus laevis hembras que habían sido anestesiadas profundamente y se punzaron siguiendo las normas de derechos animales
15 del cantón de Ginebra. Se aisló un trozo pequeño de ovario para su preparación inmediata, mientras que la parte restante se puso a 4 ºC en una solución estéril de Barth que contenía NaCl (88 mM), KCI (1 mM), NaHCO3 (2,4 mM), HEPES (10 mM), MgSO4 · 7 H2O (0,82 mM), Ca(NO3)2 · 4 H2O (0,33 mM), CaCI2 · 6 H2O (0,41 mM), a pH 7,4, y se complementó con 20 μg/ml de canamicina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Todos los registros se llevaron a cabo a 18 ºC y las células se superfundieron con medio OR2 que contenía NaCl (82,5 mM),
20 KCI (2,5 mM), HEPES (5 mM), CaCI2 · 2 H2O (1,8 mM), MgCI2 · 6 H2O (1 mM), pH 7,4.
Registros electrofisiológicos: se registraron las corrientes provocadas por el GABA mediante el uso de un proceso automatizado equipado con una configuración estándar de fijación de voltaje de dos electrodos (TVEC). Salvo que se indique, las células se mantuvieron a -80 mV. Los datos fueron capturados y analizados mediante el uso de un
25 programa informático patentado de adquisición y análisis de datos HiQScreen ejecutado bajo Matlab (Mathworks INC.).
Preparación del agonista: se preparó el GABA en forma de una solución madre concentrada (10-1 M) en agua y después se diluyó en el medio de registro para obtener la concentración de ensayo deseada. Los compuestos se
30 prepararon en forma de una solución madre (10-2 M) en DMSO y después se diluyeron en el medio de registro para obtener la concentración de ensayo deseada. El DMSO residual no superaba la concentración del 1 % a una concentración que había demostrado no tener ningún efecto sobre la función de los ovocitos de Xenopus.
Análisis de los datos y estadístico: para el análisis estadístico los valores fueron analizados bien con Excel
35 (Microsoft) o bien con Matlab (Mathworks INC.). Para obtener la significación estadística, todos los experimentos se realizaron mediante el uso de al menos tres células. Los valores se presentan como la media + EEM.
Procedimientos experimentales: se realizaron inyecciones de ADNc que codifica para las subunidades del GABAA humano en al menos cien ovocitos mediante el uso de un dispositivo de inyección automatizado patentado (Hogg y
40 col., J. Neurosci. Methods, 2008) y la expresión del receptor se examinó al menos dos días después. En los ovocitos se insertaron dos electrodos, y su potencial de membrana se mantuvo en un valor fijo (-80 mV) a lo largo del experimento.
Medición de la actividad agonista de MI -MII: se evaluaron los efectos de MI -MII sobre la función del receptor del
45 GABAA con un protocolo de exposición única (30 s). En este protocolo, la célula se expone en primer lugar a un pulso de ensayo de referencia de GABA (10 μM, 5 s) y se usa su respuesta como control. Se elimina el GABA y la célula se expone entonces durante 30 s al compuesto de ensayo, tiempo durante el cual se realizan los registros. Finalmente, se elimina el compuesto de ensayo y se vuelve a aplicar el GABA (3 μM, 5 s) al final de la incubación. Los registros tomados durante el periodo de 30 s cuando hay presente MI -MII no mostraron corrientes hacia el
50 interior detectables, lo que indica que estos compuestos no activan el receptor α1β3 del GABAA.
Medición de la actividad antagonista de MI -MII: para evaluar los posibles efectos inhibidores de MI -MII se diseñaron protocolos de inhibición por concentración. En este protocolo se exponen ovocitos que expresan fuertes respuestas al GABA durante 45 s a una concentración dada del compuesto bajo supervisión, y se registra la
55 respuesta a una concentración fija de GABA aplicada en presencia del compuesto. Después de un breve lavado para eliminar el GABA, la célula se devuelve durante otros 45 s a la misma concentración, y entonces se repite el
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proceso con una concentración mayor del compuesto. Como los ovocitos están expuestos continuamente al compuesto de ensayo se observa un efecto acumulativo para las concentraciones más altas. El control positivo en este ensayo, el antagonista tionato de terc-butilbiciclofosforo (TBPS), demostró un efecto inhibidor dependiente de la concentración sobre el receptor α1β3. La CI50 derivada para el TBPS era de 0,6 ± 0,06 μM. Este valor de la CI50 es 5 coherente con lo que se había publicado en la bibliografía [Hamann y col, Mol. Pharmacol. (1990), 37 (4): 578 -582].
Resultados: MI demostró una inhibición dependiente de la concentración del receptor α1β3 y del receptor α1β32, con unos valores derivados de la CI50 de 20,7 ± 6 μM y de 68,3 ± 6,0 μM. A la concentración más alta, se consiguió una inhibición prácticamente completa (75 ± 18,4 %). M2 demostró una inhibición dependiente de la concentración del receptor α1β3, con un valor derivado de la CI50 de 2,3 ± 0,3 μM. A la concentración más alta, se consiguió una inhibición prácticamente completa (80 ± 10 %).
Resumen: efectos agonistas: una breve exposición a MI -MII no provocó corrientes hacia el interior detectables ni en el receptor α1β3 ni en el α1β32 del GABAA, lo que indica que estos compuestos no activan ninguna de estas dos
15 formas del receptor GABAA. Efectos antagonistas: MI -MII antagonizaron el receptor α1β3 del GABAA con unos valores de la CI50 y del % de inhibición según se resumen en la Tabla 13. Dado que se observó inhibición en el intervalo μM, estos datos indican que MI -MII son antagonistas funcionales del receptor GABAA.
Tabla 13: resultados del ensayo funcional del GABAA para MI -MII
Compuesto
α1β3 del GABAA
CI50 (μM)
% de inhibición @ 100 μM
M1
20,7 ± 6,03 90
M2
2,3 ± 1,5 75 ± 2,1 88
Ejemplo B6. Identificación de (MI) -(MII) en plasma de rata
Se aislaron los metabolitos del RD162’ y se identificaron en muestras de plasma en estado estacionario procedentes de tres ratas Sprague Dawley macho a las que se les había administrado por vía oral una mezcla de RD162’ no
25 radiomarcado y RD162’ radiomarcado ([14C]RD162’) a 100 mg/kg/día (RD162’ total) y a 250 μCi/kg/día (radioactividad del [14C]). A las ratas se les administró una vez al día durante siete días consecutivos; cuatro horas después de la dosis del séptimo día, se recogió plasma de las tres ratas. Las muestras de plasma se almacenaron aproximadamente a -70 ºC o más frío.
El [14C] RD162’ tenía una actividad específica de 57,6 mCi/mmol y, a través de un análisis mediante HPLC, tenía una pureza > 98 %. La posición del átomo de [14C] se muestra a continuación, en la que * significa la posición del radiomarcaje:
imagen25
35 Se combinaron las muestras de plasma de los tres animales en una mezcla 1:1:1 (denominada "plasma de rata agrupado") y se analizaron para comprobar las concentraciones de RD162’ y de sus metabolitos. La identificación del [14C]RD162’ y de los metabolitos del [14C]RD162’ en el plasma de rata agrupados se basó en una elución conjunta en HPLC con los patrones de referencia y en el análisis de los espectros de masas. Se usaron CL/EM y CL/EM/EM de electronebulización de ión positivo para el análisis de los metabolitos.
Para preparar el plasma de rata agrupado para el análisis HPLC, se combinó aproximadamente 1 g de la muestra de plasma con acetonitrilo (ACN, muestra:ACN, 1:3, V:V), se mezcló con agitación vorticial, se le aplicó ultrasonidos en agua fría, se centrifugó y se eliminaron los sobrenadantes. La extracción se repitió dos veces y se combinaron los respectivos sobrenadantes. Se analizaron alícuotas por duplicado mediante un recuento con líquido de centelleo
45 (LSC) para determinar la recuperación de extracción, que fue del 100 %. Los sobrenadantes combinados se evaporaron a sequedad y se reconstituyeron con 1 ml de ácido fórmico al 0,1 % en ósmosis inversa (RO) de agua:ACN:metanol (MeOH, 50:45:5, V:V:V). La muestra se mezcló con agitación vorticial, se le aplicó ultrasonidos, se microcentrifugó, y las alícuotas por duplicado se analizaron mediante un LSC para determinar la recuperación de reconstitución, que fue del 98,1 %. La muestra reconstituida se analizó mediante una HPLC para determinar el perfil de metabolitos, con las fracciones recogidas a intervalos de 10 segundos y analizadas mediante un recuento con centelleo sólido.
Las muestras preparadas fueron analizadas mediante el uso de las siguientes condiciones de CL/EM/EM: HPLC: Hewlett Packard 1100 series; Fase móvil: ácido fórmico al 0,1 % en ósmosis inversa de agua (A) y acetonitrilo (B);
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Columna: Agilent Eclipse XDB-C18, de 4,6 x 150 mm, 5 μm; columna de guarda: Phenomenex Security Guard Cartridge C18, de 3 x 4 mm; temperatura de la columna: 20 ºC; gradiente: 20 -80 % de B en 40 min; caudal: 1,5 ml/min.
5 Para los experimentos de elución conjunta se determinaron los tiempos de elución para el RD162’ y para sus metabolitos. El RD162’ y sus metabolitos (MI) y (MII) se inyectaron en la HPLC y se midió el tiempo de elución desde la columna mediante una detección con luz ultravioleta a 254 nm. Los tiempos de retención resultantes, que se resumen en la Tabla 14, se usaron para determinar cualitativamente las entidades
10 Tabla 14. Porcentaje cromatográfico mediante HPLC de radioactividad de la muestra en forma de [14C]RD162’
o de los metabolitos de [14C]RD162’ en muestras de plasma agrupadas en estado estacionario con la administración oral de [14C]RD162’ en ratas macho
%de %de
Finalización Retención Altura del pico Área del pico
Nombre Inicio (min) radioactividad radioactividad
(min) (min) (mV) (mV)
recuperada (%)
inyectada (%)
(MII) 18,57 19,17 18,90 43 288 8,45 5,38 RD162’ 22,27 23,13 22,63 164 1159 34,03 21,66 (MI) 24,03 24,93 24,50 86 589 17,31 11,02
Las estructuras de (MI) y de (MII) fueron confirmadas mediante un análisis espectral de masas. 15
B7. Determinación de los valores de la CI50 y/o de la CE50
Los compuestos de la invención pueden evaluarse adicionalmente mediante la determinación de los valores de la
CI50 y/o de la CE50 a partir de las curvas de concentración-respuesta. El método de determinación de los valores de 20 la CI50 y/o de la CE50 puede llevarse a cabo de acuerdo con los métodos conocidos.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición farmacéutica que comprende (a) un compuesto que es de la fórmula l:
    imagen1
    5 donde:
    X es S, y R1 es OH o NH2; 10 o es una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
    imagen2
  2. 3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el compuesto es de la fórmula (MI):
    imagen3
    o es una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  3. 4. Un compuesto que es de la fórmula l:
    imagen4
    25 donde:
    X es S, y R1 es OH o NH2;
    30 o es una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para el tratamiento de un individuo.
    31
  4. 5. El compuesto para su uso según se define en la reivindicación 4 en el que el compuesto es según se define en la reivindicación 2 o 3.
  5. 6. El compuesto de la reivindicación 4 o 5 para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata. 5
  6. 7.
    El compuesto de la reivindicación 4 o 5 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o de la enfermedad de Alzheimer.
  7. 8. Uso de un compuesto que es de la fórmula I: imagen5
    10 donde:
    X es S, y R1 es OH o NH2;
    15 o es una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un individuo.
  8. 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 en el que el compuesto es según se define en la reivindicación 2 ó 3.
    20 10. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata, de la enfermedad de Parkinson o de la enfermedad de Alzheimer.
  9. 11. Una forma de dosificación unitaria que comprende un compuesto de la fórmula I o una sal o un solvato
    farmacéuticamente aceptable del mismo, según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 25
  10. 12. Un compuesto aislado de la fórmula I o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
    32
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