ES2527425T3

ES2527425T3 - Composiciones y métodos de terapia de la fibrosis quística

Info

Publication number: ES2527425T3
Application number: ES07732165.1T
Authority: ES
Inventors: Stephen Hyde; Deborah Gill
Original assignee: Imperial Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2015-01-23
Anticipated expiration: 2027-03-28
Also published as: US11214815B2; EP2007895A2; US8871503B2; PT2007895E; US20150232878A1; DK2007895T3; WO2007110628A2; GB0606190D0; EP2007895B1; US20100292307A1; WO2007110628A3; SI2007895T1

Abstract

Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a una secuencia para la expresión, en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende: (i) una secuencia de los nucleótidos 7 a 538 de SEC ID Nº 1; o (ii) una secuencia de al menos 200 nucleótidos de (i); o (iii) una secuencia de al menos un 80 % de identidad de secuencia con (i), en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende menos de dinucleótidos CpG.

Description

Composiciones y métodos de terapia de la fibrosis quística

Campo de la invención

La presente invención se refiere a construcciones. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las construcciones, al uso de las construcciones en la fabricación de medicamentos, así como al uso de las construcciones en diversos métodos.

Antecedentes de la invención

En las construcciones para la expresión génica, se usa una variedad de promotores. Con frecuencia, la elección del promotor se ve influida por el uso específico para el que se emplea la construcción. Sin embargo, en general, se desean construcciones que proporcionen una expresión de alto nivel durante un período sostenido, particularmente para aplicaciones terapéuticas, pero también para cuando se desea expresar genes para cosechar las proteínas expresadas y, en casos tales como la agricultura, para obtener características deseadas en animales de cría.

En el uso de construcciones en un contexto terapéutico, la expresión sostenida a un alto nivel es particularmente importante. La obtención de una expresión sostenida y de alto nivel puede significar que un determinado tratamiento se tenga que administrar con menor frecuencia y que conserve su eficacia durante más tiempo. En condiciones crónicas y en defectos genéticos heredados, esto puede cobrar una particular importancia cuando, en esencia, el defecto subyacente se traduce en la necesidad de un tratamiento continuo. Los ejemplos de dichas condiciones incluyen la fibrosis quística, donde el tratamiento puede tener que administrarse de manera permanente y, por tanto, cualquier medio para aumentar el intervalo entre los tratamientos es importante.

Las construcciones de expresión génica pueden adolecer de una variedad de problemas. En algunos casos, la expresión puede ser solo por un breve período de tiempo antes de su silenciamiento. Esto ocurre particularmente in vivo y en una variedad de tejidos. Además, o como alternativa, algunas construcciones solo dan lugar a una expresión muy débil e inadecuada para lograr el efecto deseado.

Un problema adicional con algunas construcciones para la expresión génica cuando se emplean in vivo es que pueden activar el sistema inmune del sujeto de una manera no deseada. Por lo tanto, un sujeto puede presentar una respuesta inmune contra determinadas construcciones de expresión de genes virales que limitan su eficacia, especialmente cuando se usan repetidamente en el mismo sujeto, que puede ser el caso descrito anteriormente para muchas afecciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la estructura de la construcción pGM160 en la que se pueden clonar secuencias para la expresión a partir del promotor hCEFI. La Figura 2 representa la estructura de la construcción pGM151 en la que las secuencias de codificación para el polipéptido CFTR se clonan en la unión operativa con el promotor hCEFI. La Figura 3 representa la estructura de la construcción pGM144 en la que las secuencias de codificación para el polipéptido indicador de luciferasa se clonan en la unión operativa con el promotor hCEFI. La Figura 4a representa niveles de síntomas gripales e inflamación pulmonar tras la administración a ratones de construcciones con contenido de dinucleótidos CpG decreciente con, de izquierda a derecha en cada gráfico, 317 dinucleótidos CpG, 193 dinucleótidos CpG, 0 dinucleótidos CpG y ratones de control a quienes no se ha administrado una construcción. Se muestran los niveles de TNF-, IFN- e IL-12, así como el número de neutrófilos del BALF (fluido pulmonar de lavado broncoalveolar). La Figura 4b muestra el efecto de la adición de un solo motivo CpG a una construcción en la respuesta inflamatoria a la construcción en el pulmón de un ratón. Más concretamente, la Figura 4b muestra el efecto de la adición de un solo dinucleótido CpG a una construcción sin dinucleótidos CpG. De izquierda a derecha en cada gráfico, se muestran los resultados para una construcción con 317 dinucleótidos CpG, un solo dinucleótido CpG, ningún dinucleótido CpG y los ratones de control sin tratar. La Figura 4c muestra que la sustitución del gen Lux con un gen CFTR sin dinucleótidos CpG no tiene ningún efecto sobre la respuesta inflamatoria observada. La Figura 5 muestra los niveles de expresión en el pulmón a lo largo del tiempo tras la administración en aerosol GL67 de las construcciones pG4hCEFI soLux (expresión desde un promotor hCEFI de la invención), pG4GZB soLux (emplea el potenciador y promotor CMV humano), pG4mCEFI soLux (emplea el potenciador CMV murino y la promotor EFIa humano), pG2Ubc Lux (emplea el promotor poliubiquitina C humano) y pG1 CMV lux (que emplea el promotor y el potenciador CMV-IE). La Figura 6 muestra los niveles de expresión en el pulmón a lo largo del tiempo tras la administración en aerosol PEI de las construcciones pG4 hCEFI soLux, pG4GZB soLux, pG4mCEFI soLux y pG3mCEFI soLux. Las Figuras 7a y b muestran vectores de primera, segunda, tercera y cuarta generación, con el número de dinucleótidos CpG representado en forma de piruletas e indicado en el centro de cada construcción.

La Figura 8 muestra los niveles de expresión en el pulmón a lo largo del tiempo tras la administración en aerosol GL67 de las construcciones pG2EFla Lux (emplea el promotor EFIa y tiene 245 CpG), pG2CEF1a Lux (emplea el potenciador CMV humano y el promotor EF1a, y tiene 262 CpG), pG2hCEFI Lux (emplea un potenciador CMV humano sin CpG y un promotor EFIa humano, la construcción tiene 149 CpG) y pG4hCEFI soLux (emplea un potenciador CMV humano sin CpG y un promotor EFIa humano y toda la estructura carece de CpG). La Figura 9 muestra los niveles de expresión en el pulmón durante 56 días tras la administración en aerosol GL67 de las construcciones pG4hCEFI soLux y pG4EF1 soLux (emplea un promotor EFIa humano sin CpG y la construcción entera carece de CpG).

Breve descripción de las secuencias

La SEC ID Nº 1 es la secuencia de polinucleótido de la construcción pGM160 para la clonación de secuencias para la expresión usando el promotor hCEFI.

La SEC ID Nº 2 es la secuencia de polinucleótido de la construcción pGM151, que incluye las secuencias de codificación para CFTR que no contienen dinucleótidos CpG y que también se han optimizado en codones para la expresión (soCFTR). La invención también permite una secuencia de polinucleótidos alternativa de CFTR en la que el nucleótido 2595 es C, el nucleótido 3234 es T y el nucleótido 3236 es C.

La SEC ID Nº 3 es la secuencia polipeptídica del polipéptido CFTR codificada por la construcción pGM151 de SEC ID Nº 2. La invención también permite una secuencia polipeptídica alternativa de CFTR en la que el aminoácido 620 es H (histidina) y el aminoácido 833 es F (fenilalanina).

La SEC ID Nº 4 es la secuencia de polinucleótido de la construcción pGM144, que incluye las secuencias de codificación para un polipéptido de luciferasa, que no contiene dinucleótidos CpG y que también se han optimizado en codones para la expresión (soLux).

La SEC ID Nº 5 es la secuencia polipeptídica del polipéptido luciferasa codificado por la construcción pGM144 de la SEC ID Nº 4.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a una secuencia para la expresión, en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende:

(i): una secuencia de los nucleótidos 7 a 538 de SEC ID Nº 1; o

(ii): una secuencia de al menos 200 nucleótidos de (i); o

(iii) una secuencia de al menos un 80 % de identidad de secuencia con (i).

en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende menos de 15 dinucleótidos CpG.

La construcción puede ser una construcción plasmídica.

En la construcción, la secuencia potenciadora y promotora puede no comprender dinucleótido CpG alguno.

La construcción puede no comprender dinucleótido CpG alguno.

En la construcción, la secuencia para la expresión puede codificar un polipéptido terapéutico.

En la construcción, la secuencia por expresar puede codificar un polipéptido CFTR, donde la construcción comprende:

(i): la secuencia de SEC ID Nº 2 o la secuencia de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es C y/o el nucleótido 3234 y 3236 son T y C respectivamente; o

(ii): una construcción con al menos un 70 % de identidad de secuencia con (i).

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una construcción de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la construcción de la invención es para usarla en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o cirugía, o para usarla como un medicamento.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una construcción de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno genético, una afección crónica, cáncer,

alergia, autoinmunidad, infección o un cáncer. La enfermedad por tratar puede ser un trastorno de las vías respiratorias. En otro aspecto, la invención proporciona un método no terapéutico de expresión de una secuencia en un sujeto animal no humano, método que comprende la administración de una construcción de acuerdo con la invención, en la que la secuencia potenciadora y promotora está unida operativamente a una secuencia no terapéutica para la expresión.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia, o el complemento de una secuencia, seleccionada del grupo que comprende:

(i) la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2; y (ii)la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2, en la que el nucleótido 2595 se cambia de A a C y/o los nucleótidos 3234 y 3236 se cambian de C a T y de G a C, respectivamente.

En un aspecto adicional más, la invención proporciona un método in vitro o ex vivo de expresión de un gen en una célula, un tejido o un órgano, método que comprende la introducción de una construcción de acuerdo con la invención en dicha célula, tejido u órgano.

En otro aspecto, la invención proporciona una secuencia potenciadora y promotora aislada, en el que la secuencia potenciadora y promotora es como se define en el presente documento.

En otro aspecto, la invención proporciona una construcción que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a un sitio de restricción, en el que:

(i): la secuencia potenciadora y promotora es como se define en el presente documento; y

(ii): la inserción de secuencias de codificación en el sitio de restricción producirá su unión operativa a la secuencia potenciadora y promotora.

También se describen promotores hCEFI que comprenden un potenciador CMV humano unido operativamente a un promotor EF1a humano, fragmentos funcionales del mismo o variantes funcionales de cualquiera de ellos. En un caso particularmente preferido, los promotores hCEFI se han modificado para reducir el número de, o eliminar todos, los dinucleótidos CpG.

Se ha observado que los promotores hCEFI dan lugar a niveles inesperadamente elevados y sostenidos de expresión. Por lo tanto, el promotor hCEFI de la invención es particularmente útil para construcciones destinadas a la expresión génica. Así pues, las construcciones de la invención son preferentemente construcciones de expresión génica. La invención también proporciona construcciones que se han optimizado más para la expresión génica y, en particular, para su uso terapéutico, mediante la eliminación o la reducción del número de dinucleótidos CpG para reducir las respuestas inmunes no deseadas.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un promotor hCEF1 unido operativamente a una secuencia para la expresión, donde el promotor hCEF1 comprende:

(i): un potenciador CMV humano unido operativamente a un promotor EF1a humano;

(ii): un fragmento funcional de (i); o

(iii) una variante funcional de (i) o (ii).

La presente invención proporciona además:

-: una composición farmacéutica que comprende una construcción de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable;

-: una construcción de la invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o cirugía; y

-: uso de la construcción de la presente invención en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno genético, una afección crónica, alergia, autoinmunidad, infección o un cáncer.

La descripción comprende además un método de tratamiento de un trastorno que comprende administrar una construcción de la descripción en una cantidad eficaz a un sujeto que padece dicho trastorno.

La invención también proporciona:

-: un método no terapéutico de expresión de una secuencia en un sujeto, método que comprende administrar una construcción de la invención, en la que el promotor hCEFI está unido operativamente a una secuencia no terapéutica para la expresión;

-: un método in vitro o ex vivo de expresión de un gen en una célula, un tejido o un órgano, método que comprende la introducción de una construcción de la invención en dicha célula, tejido u órgano; y

-: un promotor hCEFI aislado para la descripción.

La invención también proporciona una construcción que comprende un promotor hCEFI unido operativamente a un sitio de restricción, en el que la inserción de secuencias de codificación en el sitio de restricción dará lugar a su enlace operativo con el promotor hCEFI.

La invención también proporciona un animal no humano que comprende un promotor hCEFI de la invención.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir la presente invención detalladamente, se ha de entender que la presente invención no se limita a las moléculas ni a los parámetros de proceso ilustrados en particular, pues, como es evidente, pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en el presente documento solo tiene el fin de describir realizaciones particulares de la invención, y no se pretende que sea limitante. Además, la práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas de ADN recombinante e inmunología, perteneciendo todos ellos al alcance de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (II edición, 1989); “DNA Cloning: A Practical Approach”, vol. I y II (D. Glover, ed.); “Oligonucleotide Synthesis” (N. Gait, ed., 1984); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984); y “Fundamental Virology”, II edición, vol. I y II (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds.).

Cabe señalar que, como se usan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", “uno”, "una", "el" y “la” incluyen los referentes en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

En los casos donde se especifica que un agente en particular comprende determinadas unidades, en un caso preferido, el agente puede consistir esencialmente en dichas unidades.

Visión general de conjunto

La invención se refiere, en particular, a construcciones que permiten la expresión eficaz de secuencias debido a la presencia del promotor hCEFI. Las construcciones proporcionan altos niveles de expresión y, lo que es más importante, la expresión sostenida. Esto hace que las construcciones sean adecuadas para cualquier aplicación donde se deseen expresar secuencias particulares, especialmente en la expresión de secuencias para tratar trastornos, particularmente aquellas en las que se requiera una expresión génica sostenida. Debido a la longitud de expresión observada con el uso de las construcciones de la invención, puede ser que las construcciones se puedan administrar con menor frecuencia y/o que den lugar a mejores resultados donde el nivel de expresión con otras construcciones sería de corta duración y/o de una magnitud demasiado baja.

En particular, las construcciones son construcciones de ácidos nucleicos. La expresión "molécula de ácido nucleico" y el término "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. En un ejemplo particularmente preferido, las construcciones de la invención comprenden ADN y, preferentemente, son construcciones de ADN.

La invención proporciona construcciones que comprenden, o en algunas realizaciones, que consisten esencialmente en una secuencia de promotor hCEFI y un sitio de clonación, de manera que cuando se inserta una secuencia de codificación en el sitio de clonación, la secuencia de codificación está en unión operativa con el promotor. La invención también proporciona construcciones con secuencias para la expresión insertadas en el sitio o los sitios de clonación. Las secuencias que se expresan pueden ser, en particular, secuencias de codificación. Las secuencias de codificación pueden codificar cualquiera de los polipéptidos mencionados en el presente documento.

Las construcciones de la invención se pueden emplear en una variedad de composiciones farmacéuticas, vacunas, en la fabricación de medicamentos y también en una serie de métodos.

El promotor hCEFI

Las diversas construcciones de la invención emplean el promotor hCEFI. El promotor hCEFI da lugar a la expresión prolongada y de alto nivel de secuencias, y comprende:

(ii): un fragmento funcional de (i); o

(iii) una variante funcional de (i) o (ii).

"Unido operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes así descritos están configurados para realizar su función habitual. Así pues, un promotor unido operativamente a una secuencia de

ácido nucleico es capaz de efectuar la expresión de esa secuencia cuando las enzimas apropiadas están presentes. El promotor hCEFI no necesita estar contiguo a la secuencia, siempre y cuando funcione para dirigir la expresión de la misma. Así pues, la secuencia que se expresa se transcribirá debido al promotor hCEFI. En un caso preferido, cualquiera de los componentes descritos en el presente documento estará en unión operativa cuando esté presente en una construcción de la invención.

En una realización preferida, el promotor hCEFI, por lo tanto, es un material compuesto de un potenciador CMV humano ligado a un promotor EF1a humano, aunque también se pueden emplear fragmentos funcionales de los mismos y variantes funcionales de los mismos. Se ha encontrado inesperadamente que el uso del potenciador CMV humano ligado al promotor EF1a humano da lugar a una expresión elevada y, en particular, sostenida.

En algunas realizaciones, se puede emplear un potenciador CMV humano en combinación con un fragmento funcional o variante funcional de un promotor EF1a humano. En otras realizaciones, se puede emplear un fragmento funcional o variante funcional de un potenciador CMV humano con un promotor EF1a humano. En otras realizaciones, se puede emplear un fragmento o variante funcional de un potenciador CMV humano con un fragmento o variante funcional de un promotor EF1a humano.

El promotor hCEFI es para la expresión eucariota. Los promotores hCEFI de la invención son funcionales en células de mamífero y se pueden usar para la expresión en células de mamífero. El hCEFI también se puede usar para la expresión en aves. Por lo tanto, las construcciones de la invención expresarán las secuencias para la expresión unidas operativamente al promotor hCEFI en células eucariotas, en particular, células de mamíferos y células de ave y, preferentemente, en células de mamífero. En un ejemplo particularmente preferido, se usarán para la expresión en células humanas.

En un ejemplo particularmente preferido, el promotor hCEF1 puede comprender la secuencia de nucleótidos 7 a 538 de la SEC ID Nº 1, un fragmento funcional de la misma o una variante funcional de cualquiera. Un fragmento funcional puede ser, por ejemplo, de al menos 200, preferentemente de al menos 300, incluso más preferentemente de al menos 400 e incluso más preferentemente de al menos 500 nucleótidos de longitud. Una variante funcional puede, por ejemplo, tener al menos un 50 %, preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 70 %, incluso más preferentemente al menos un 80 % y todavía más preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con los nucleótidos 7 a 538 de SEC ID Nº 1. En un caso preferido, una variante funcional puede tener al menos un 92 %, preferentemente al menos un 95 %, incluso más preferentemente al menos un 97 % e incluso más preferentemente al menos un 99 % de identidad de secuencia con los nucleótidos 7 a 538 de la SEC ID Nº 1. Dicha identidad de secuencia puede ser a lo largo de cualquiera de las longitudes especificadas en el presente documento, por ejemplo, a lo largo de al menos 20, preferentemente al menos 50, más preferentemente al menos 100, incluso más preferentemente al menos 300 e incluso más preferentemente a lo largo de toda la longitud de la secuencia en cuestión.

Cualquiera de las longitudes de los fragmentos y de los niveles de identidad de secuencia a los que se hace referencia en el presente documento puede definir los fragmentos y las variantes funcionales. Los fragmentos y las variantes serán funcionales. En una realización preferida, darán al menos un 10 %, preferentemente al menos un 25 %, incluso más preferentemente al menos un 50 %, todavía más preferentemente al menos un 75 % e incluso más preferentemente al menos un 90 % de la expresión del promotor de los nucleótidos 7 a 538 de la SEC ID Nº 1. En algunos casos, el nivel de expresión puede ser superior y puede ser al menos el doble, triple, cuádruplo o más de la expresión observada con los nucleótidos 7 a 538 de la SEC ID Nº 1. La duración de la expresión también puede ser, por ejemplo, cualquiera de los niveles especificados, tales como al menos un 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 90 % de la observada con los nucleótidos 7 a 538 de la SEC ID Nº 1 o puede ser, por ejemplo, al menos el doble, triple o cuádruplo de la observada con los nucleótidos 7 a 538 de la SEC ID Nº 1. En un caso preferido, el nivel y la duración de la expresión pueden tener cualquiera de las magnitudes anteriores especificadas en comparación con la expresión usando el promotor de los nucleótidos 7 a 538 de la SEC ID Nº 1.

La funcionalidad de los fragmentos y de las variantes se puede evaluar en cualquier sistema de ensayo adecuado. En un caso preferido, se evalúa la misma construcción aparte del cambio en el promotor. El promotor objeto del ensayo puede ser, por ejemplo, un fragmento o una variante del promotor original de la construcción. En un caso preferido, se compara la expresión entre la construcción de SEC ID Nº 2 o 4 y la construcción equivalente, pero con los nucleótidos 7 a 538 sustituidos con el fragmento o la variante objeto del ensayo. En un caso, la construcción objeto del ensayo puede comprender el gen de la luciferasa de los nucleótidos 738 a 2390 de SEC ID Nº 4, un fragmento funcional del mismo o una variante funcional de cualquiera y, para determinar la funcionalidad, se puede medir la expresión de la luciferasa. En una realización, se emplea la construcción de SEC ID Nº 1, pero que ha tenido una secuencia para la expresión y, en particular, una secuencia de codificación clonada en ella, incluyendo cualquiera de las mencionadas en el presente documento.

Para evaluar la funcionalidad, se puede usar cualquier sistema adecuado. Se puede usar un sistema in vitro incluyendo cualquiera de los tipos de células medidos en el presente documento. En un caso particularmente preferido, se puede usar un sistema in vivo y, en particular, un animal no humano para evaluar la funcionalidad. Se puede usar cualquiera de los animales no humanos y, en particular, los mamíferos no humanos mencionados en el

presente documento. Se pueden emplear roedores y, en particular, ratones. En la evaluación de la funcionalidad, se puede emplear cualquiera de las vías de administración mencionadas en el presente documento y, en una realización preferida, se pueden emplear la administración en el pulmón, en particular, a través de la administración en aerosol y, en particular, la administración en aerosol que emplea liposomas y, preferentemente, liposomas catiónicos o polímeros catiónicos. La formulación de liposomas puede ser cualquiera de las mencionadas en el presente documento. En particular, se puede usar una formulación de liposomas GL67. En el caso de los polímeros catiónicos, PEI es una elección particularmente preferida para la formulación.

En un caso preferido, los complejos de una construcción de la invención, y los liposomas catiónicos o los polímeros catiónicos se administran en los pulmones de los ratones en forma de aerosoles, y la expresión se mide durante al menos 7, preferentemente al menos 14, más preferentemente al menos 14, incluso más preferentemente al menos 21 e incluso más preferentemente al menos 28 días, todavía más preferentemente al menos 56 días. La expresión se puede medir, por ejemplo, en cualquiera de dichos puntos temporales, todos los puntos temporales y así sucesivamente. Dichas duraciones se pueden usar en cualquiera de las formas de evaluación de la funcionalidad descritas en el presente documento. En dicha evaluación, se puede emplear cualquiera de los animales no humanos y vías de expresión que se mencionan en el presente documento. En un caso preferido, se mide la expresión de la luciferasa.

La expresión alta y sostenida observada con el empleo del promotor hCEFI significa que las construcciones de la invención encuentran una amplia selección de usos. El nivel de expresión alto y sostenido fue inesperado, ya que las construcciones previas de la técnica anterior existían empleando el potenciador CMV murino y no se dio indicación alguna de que el potenciador CMV murino realizara otra cosa que no fuera óptima en células humanas y diera lugar a una expresión sostenida. Sorprendentemente, por lo tanto, el potenciador CMV humano en tándem con el promotor EF1a humano genera expresión muy superior y sostenida en comparación con dichas construcciones de la técnica anterior.

En un caso preferido adicional, los promotores hCEFI de la invención tienen un contenido bajo o nulo de dinucleótidos CpG. La ausencia de dinucleótidos CpG mejora aún más el rendimiento de las construcciones de la invención y, en particular, en situaciones donde no se desea generar una respuesta inmune contra un antígeno expresado o una respuesta inflamatoria contra la construcción de expresión administrada. La eliminación de los dinucleótidos CpG reduce la aparición de síntomas gripales y la inflamación que pueden derivarse de la administración de las construcciones, especialmente cuando se administran en las vías respiratorias.

La presente invención también proporciona cualquiera de los promotores hCEFI anteriormente mencionados en forma aislada, así como un ácido nucleico que comprende el promotor hCEFI. En un caso preferido, el promotor hCEFI está presente en una construcción de la invención.

Variantes, fragmentos e identidad de secuencia

En las construcciones de la descripción, se puede emplear una serie de elementos. En las construcciones de la presente descripción, se pueden emplear fragmentos funcionales y variantes funcionales de secuencias específicas. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 1 a 5 proporcionan la secuencia de varios elementos específicos. Sin embargo, se pueden emplear los fragmentos funcionales de dichas secuencias específicas, así como las variantes funcionales de cualquiera de los dos. Lo mismo se aplica a cualquiera de los elementos, polipéptidos y otros números enteros a los que se hace referencia en el presente documento.

Las variantes de una secuencia específica se pueden definir en referencia a un grado de identidad u homología de secuencia con la secuencia específica a la que la que se hace referencia en el presente documento. En algunos casos, el nivel de identidad de secuencia puede ser de al menos un 25 %, preferentemente al menos un 30 %, más preferentemente al menos un 50 %, incluso más preferentemente al menos un 60 % e incluso más preferentemente al menos un 75 %. En algunos casos, el nivel de identidad de secuencia puede ser de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, incluso más preferentemente de al menos un 95 %, aún más preferentemente de al menos un 97 % y, en algunos casos, de al menos un 99 %. Por lo tanto, siempre que se haga referencia a la identidad de secuencia en el presente documento, se pueden aplicar, por ejemplo, dichos niveles de identidad.

La longitud en la que se da dicha identidad de secuencia puede ser, por ejemplo, superior a al menos 15, preferentemente al menos 30, por ejemplo, al menos 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos. La región de homología puede darse a lo largo de al menos 150, preferentemente de al menos 200 e incluso más preferentemente de al menos 300 nucleótidos. En algún caso, el nivel de identidad de secuencia puede darse a lo largo de al menos un 25 %, más preferentemente de al menos un 50 %, aún más preferentemente de al menos un 75 % e incluso más preferentemente de al menos un 95 % de la longitud del elemento o de la construcción en cuestión. En un caso particularmente preferido, el nivel de identidad de secuencia se da a lo largo de toda la longitud del elemento o construcción en cuestión. En referencia a los polipéptidos, pueden estar presentes, por ejemplo, los mismos niveles y longitudes de identidad de secuencia.

Los métodos de medición de la homología o identidad de polinucleótidos y polipéptidos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT, que se puede usar para calcular la homología (por ejemplo, usado en su configuración por defecto) (Devereux et al. (1984) “Nucleic Acids Research” 12, pág. 387395).

También se pueden usar los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular la homología o alinear secuencias (por lo general, en su configuración por defecto), por ejemplo, como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290300; Altschul, S., F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10.

El programa informático para realizar el análisis BLAST está disponible para el público en general a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dicho algoritmo implica identificar primero el par de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden con o satisfacen alguna puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al, supra). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuación de alineación acumulativa se pueda aumentar. Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, las alineaciones (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915-10919) de 50, la expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se produciría por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en la comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es inferior a aproximadamente 1, preferentemente inferior a aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

En algunos casos, una variante puede diferir de una secuencia específica en 100 o menos, 50 o menos, 20 o menos, 15 o menos, 10 o menos, 5 o menos, 3 o menos o 2 o menos cambios (pudiendo ser cada uno de los cuales una sustitución, duplicación, deleción o inserción) o más de dichos números de cambios. En algunos casos, puede haber solo un único cambio. Estas mutaciones se pueden medir sobre una región de al menos 30, por ejemplo de al menos 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos de los elementos en cuestión y, en particular, en toda su longitud. Puede haber niveles similares de cambios en las secuencias de polipéptidos. En un caso preferido, la variación en cuestión no introducirá dinucleótidos CpG en las secuencias de nucleótidos en cuestión.

Cuando un polinucleótido codifica un polipéptido, las sustituciones pueden crear preferentemente cambios "conservadores" en el aminoácido codificado. Estos se definen de acuerdo a la Tabla 1 que figura a continuación. Los aminoácidos del mismo bloque en la segunda columna y preferentemente de la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir entre sí en cambios conservadores.

Tabla 1

ALIFÁTICO: No polar G A P

I L V

Polar no cargado: C S T M

N Q

Polar cargado: D E

K R

AROMÁTICO: H F W Y

En algunos casos, se pueden emplear fragmentos funcionales de determinados números enteros mencionados en el presente documento. El término "fragmento" indica una parte más pequeña de una entidad mayor. En la descripción, se pueden emplear fragmentos de elementos específicos mencionados en el presente documento. En particular, dichos fragmentos conservarán parte o toda la funcionalidad del elemento original y, en particular, cualquiera de las funciones mencionadas en el presente documento. Pueden conservar cualquiera de los niveles de funcionalidad mencionados en el presente documento.

En algunos casos, un fragmento puede ser al menos un 50 %, preferentemente al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 70 %, todavía más preferentemente al menos un 80 %, incluso más preferentemente al menos un 90 % e incluso más preferentemente al menos un 95 % de la longitud del original. Un fragmento puede ser igual o inferior a dichos porcentajes de longitud del original. En la presente descripción, se pueden emplear variantes de fragmentos funcionales.

Las variantes y los fragmentos de secuencias particulares serán funcionales, es decir, conservarán al menos un grado de una determinada función poseída por la secuencia de la que derivan. Por lo tanto, en el caso de los promotores, serán capaces de dar lugar a la transcripción y, en particular, mostrarán al menos una proporción de los niveles de expresión y de la duración mostrados por el promotor inicial. De igual manera, las variantes y los fragmentos pueden conservar una cualquiera o más de las otras funciones mencionadas en el presente documento poseídas, en cierta medida, por la molécula original.

Construcciones

En un caso preferido, en las construcciones, se utilizan los promotores hCEFI de la presente invención. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende un promotor hCEFI unido operativamente a una secuencia para la expresión, donde el promotor hCEFI comprende:

(ii): un fragmento funcional de (i); o

(iii) una variante funcional de (i) o (ii).

Las construcciones se pueden usar para dar lugar a la expresión de la secuencia unida operativamente al promotor hCEFI. La secuencia para la expresión puede, en un caso preferido, comprender una secuencia de codificación para la traducción en un polipéptido. En otros casos, la secuencia para la expresión se puede transcribir para dar lugar a una molécula de ARN funcional, o la transcripción se puede procesar para dar lugar a una molécula de ARN funcional.

En los casos en los que se hace referencia a la construcción específica de la SEC ID Nº 1, se pueden emplear los elementos equivalentes de las construcciones de SEC ID Nº 2 y 4 como variantes y fragmentos funcionales de dichas secuencias.

En una realización particularmente preferida, la construcción de la invención puede incluir uno o varios intrones. Por lo tanto, por ejemplo, en las construcciones en las que la secuencia que se va a expresar comprende secuencias de codificación, en un caso preferido, puede haber un exón inicial cadena arriba del exón o de los exones que comprenden las secuencias de codificación y, entonces, puede haber un intrón entre ambos.

Por lo tanto, la invención proporciona, en un caso, construcciones que comprenden un intrón entre el promotor hCEFI y las secuencias de codificación que se van a expresar. El intrón estará unido operativamente al promotor hCEFI, el exón o los exones iniciales y el exón o los exones que comprenden las secuencias de codificación que se van a expresar. Por lo tanto, el intrón estará unido operativamente a las otras secuencias con las que se va a transcribir, de manera que se corta de la transcripción.

Por tanto, la construcción también puede incluir las secuencias donantes y aceptoras de cortes y empalmes apropiadas para permitir el corte y empalme de cualquier intrón incluido. Los intrones también pueden estar presentes entremezclados con los exones que comprenden las secuencias de codificación, y luego cortarse y empalmarse para la traducción o, en algunos casos, dichos intrones pueden no estar presentes.

Se puede emplear cualquier intrón adecuado y, en particular, se puede emplear, por ejemplo, cualquier intrón que comprenda los niveles de dinucleótidos CpG o que carezca de dichos dinucleótidos como se especifica en el presente documento. Los exones también pueden contener preferentemente dichos niveles de dinucleótidos CpG y, en un caso particularmente preferido, carecer de cualquier dinucleótido CpG.

En un caso preferido, una construcción de la descripción comprenderá:

(i): el intrón de los nucleótidos 570 a 709 de SEC ID Nº 1;

(ii): un fragmento funcional de (i); o

(iii) una variante funcional de (i) o (ii).

En un caso preferido, cualquiera de las construcciones de la invención puede comprender dicho intrón. La variante o el fragmento funcional pueden tener cualquiera de los niveles de identidad de secuencia y longitud especificados en el presente documento o incluso otras características. El intrón será funcional en tanto en cuanto será el corte y empalme de la transcripción resultante producida desde el promotor hCEFI en la construcción. Una variante puede tener, por ejemplo, al menos un 40 %, preferentemente al menos un 50 %, incluso más preferentemente al menos

un 60 % y más preferentemente al menos un 75 % de identidad de secuencia con los nucleótidos 570 a 709 de la SEC ID Nº 1. En algunos casos, el nivel de identidad de secuencia puede ser de al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % e incluso más preferentemente al menos un 95 %. La variante o el fragmento funcional pueden tener una longitud de, por ejemplo, al menos 50, preferentemente al menos 75 e incluso más preferentemente al menos 100 nucleótidos.

En una realización preferida adicional, una construcción de la descripción comprenderá un exón unido operativamente al promotor hCEFI y las secuencias de codificación que se van a expresar con un intrón intercalado que se cortará de la construcción. Uno o más de dichos exones pueden estar presentes y, en particular, dichos exones, por lo general, estarán cadena arriba de la secuencia Kozak, es decir, 5' de la misma.

En un caso preferido, una construcción de la descripción puede comprender un exón que comprende:

(i): la secuencia de nucleótidos 539 a 569 de SEC ID Nº 1;

(ii): un fragmento funcional de (i); o

(iii) una variante funcional de (i) o (ii).

Cualquiera de los niveles de características y, en particular, el nivel de identidad de secuencia y la longitud del fragmento especificado en el presente documento, puede definir el exón. Un fragmento o una variante, pueden tener, por ejemplo, al menos 10 nucleótidos, preferentemente al menos 15 e incluso más preferentemente al menos 20 nucleótidos de longitud o pueden tener 30 nucleótidos de longitud. Además, el exón o los exones tienen preferentemente cualquiera de los niveles de dinucleótidos CpG especificados en el presente documento y, en particular, ningún dinucleótido CpG.

En un caso, uno de los exones anteriores también puede incluir el inicio de la secuencia de codificación que se va a expresar. En un caso preferido, hay al menos un exón no codificante y un intrón previo al exón o exones que componen la secuencia de codificación.

En otro caso preferido, puede haber un exón que comprende:

(i): la secuencia de nucleótidos 710 a 727 de SEC ID Nº 1;

(ii): un fragmento funcional de (i); o

(iii) una variante funcional de (i) o (ii).

Cualquiera de los niveles de características y, en particular, el nivel de identidad de secuencia y la longitud del fragmento, puede definir el exón. Un fragmento o una variante pueden tener una longitud, por ejemplo, de al menos 5 nucleótidos, preferentemente de al menos 10 e incluso más preferentemente de al menos 12 nucleótidos o pueden tener una longitud de 17 nucleótidos.

En un ejemplo particularmente preferido, una construcción de la descripción puede comprender una combinación de dichos exones y un intrón, en particular, previo al exón o a los exones que comprenden las secuencias de codificación. Así pues, en un caso preferido de la descripción una construcción puede comprender:

(i) la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 539 a 727 de SEC ID Nº 1; (Ii) un fragmento funcional de (i); o

(iii) una variante funcional de (i) o (ii).

Los fragmentos y las variantes funcionales pueden tener cualquiera de las características especificadas en el presente documento y, en particular, el nivel de identidad de secuencia y la longitud especificados. Por ejemplo, una variante puede tener al menos un 40 %, preferentemente al menos un 50 %, incluso más preferentemente al menos un 60 % y más preferentemente al menos un 75 % de identidad de secuencia con los nucleótidos 539 a 727 de SEC ID Nº 1. En algunos casos, el nivel de identidad de secuencia puede ser al menos un 80 %, preferentemente al menos un 90 % e incluso más preferentemente al menos un 95 %. La variante o el fragmento funcional pueden tener una longitud de, por ejemplo, al menos 75, preferentemente al menos 100 e incluso más preferentemente al menos 150 nucleótidos. Un fragmento o una variante funcional incluirán preferentemente un intrón que está cortado y empalmado apropiadamente. Los cortes y empalmes deben generar una transcripción capaz de expresar el polipéptido deseado. En una realización, una construcción de la descripción comprende dichos exones e intrones y un sitio de restricción de modo que se puede insertar una secuencia seleccionada en la construcción en unión operativa con ellos.

En situaciones en las que la secuencia que se expresa comprende una secuencia de codificación para la expresión, estará preferentemente unida operativamente a los elementos necesarios para la traducción de las secuencias de codificación. Por lo general, una secuencia Kozak y una señal de poliadenilación pueden estar unidas operativamente a la secuencia de codificación. Se puede emplear cualquier secuencia Kozak y de poliadenilación apropiada. En un caso preferido:

i) la secuencia Kozak puede comprender los nucleótidos 733 a 737 de SEC ID Nº 2 o 4, un fragmento funcional de la misma o una variante funcional de cualquiera; y/o

(ii) la secuencia de poliadenilación puede comprender los nucleótidos 2396 a 2597 de SEC ID Nº 4, un fragmento funcional de la misma o una variante funcional de cualquiera.

La longitud y el nivel de identidad de secuencia del fragmento y de la variante pueden ser cualquiera de los que se especifican en el presente documento. En el caso de las secuencias de poliadenilación, por ejemplo, el fragmento puede tener una longitud de al menos 50, preferentemente al menos 100 e incluso más preferentemente al menos 150 nucleótidos. El nivel de identidad de secuencia para la secuencia Kozak y/o la secuencia de poliadenilación puede ser de al menos un 50 %, preferentemente de al menos un 60 %, más preferentemente de al menos un 70 %, incluso más preferentemente de al menos un 80 % e incluso más preferentemente de al menos un 90 % o incluso cualquiera de los niveles superiores de identidad de secuencia especificados en el presente documento.

La funcionalidad se puede medir mediante cualquier ensayo apropiado incluyendo cualquiera de los mencionados en el presente documento, y el nivel de funcionalidad puede ser cualquiera de los mencionados en el presente documento. En el caso de la secuencia Kozak, por ejemplo, el nivel de traducción puede ser de al menos un 10 %, preferentemente de al menos un 25 %, más preferentemente de al menos un 50 %, incluso más preferentemente de al menos un 75 % e incluso más preferentemente de al menos un 90 % del nivel observado con la secuencia original. En el caso de la secuencia de poliadenilación, el nivel de poliadenilación y/o traducción puede ser, por ejemplo, cualquiera de dichos niveles. También se puede medir la funcionalidad en el nivel de la expresión global y/o la duración de la expresión observada. En algunos casos, la variante o el fragmento puede dar lugar a un nivel de funcionalidad superior al de la secuencia original para cualquiera de los parámetros medidos, tales como, por ejemplo, al menos el doble, triple, cuádruplo o más.

En un caso preferido, las construcciones de la invención son construcciones lanzadera, es decir, las construcciones son capaces de replicarse en sistemas bacterianos y usarse luego para la expresión en sistemas eucariotas. Por lo tanto, las construcciones pueden tener, por lo general, un origen de replicación bacteriano que permita el mantenimiento de las construcciones en huéspedes bacterianos y, en particular, en E. coli. Se puede emplear cualquier origen de replicación adecuado. En un caso preferido, se puede emplear el origen de replicación R6K. El origen R6K es activado por la proteína B iniciadora específica de R6K codificada por el gen pir y, por lo tanto, las construcciones de la invención que comprenden el origen R6K normalmente crecerán en cepas que expresan el gen pir. Se puede emplear cualquier cepa adecuada que exprese el gen pir. En un caso preferido, las construcciones de la invención que emplean el origen R6K se cultivan en la cepa de E. coli GT115, EC100Dpir-116 o DH10Bpir116.

En un caso particularmente preferido, el origen de replicación puede comprender la secuencia de nucleótidos 2599 a 2870 de SEC ID Nº 4, un fragmento funcional de la misma o una variante funcional de cualquiera. El fragmento y las variantes pueden ser de cualquier longitud y poseer cualquiera de los niveles de identidad de secuencia especificados en el presente documento. El nivel de funcionalidad puede ser cualquiera de los niveles especificados en el presente documento. Por ejemplo, la funcionalidad se puede medir según el rendimiento de la construcción en comparación con la misma construcción, pero con el origen de replicación original en condiciones equivalentes durante el mismo período de tiempo. El rendimiento puede ser, por ejemplo, de al menos un 10 %, al menos un 25 %, preferentemente al menos un 50 %, más preferentemente al menos un 75 % e incluso más preferentemente al menos un 90 % en comparación con las construcciones con el origen de replicación original.

En un caso preferido adicional, una construcción de la descripción puede comprender un gen para la expresión en bacterias y, en particular, un marcador de selección bacteriano. Se puede emplear cualquier marcador de selección apropiado. En una realización preferida, se emplea un marcador de selección de kanamicina. El empleo del marcador de resistencia a la kanamicina tiene la ventaja de que es particularmente adecuado para su uso en construcciones para la administración a sujetos humanos. En particular, se pueden emplear las secuencias codificantes de la kanamicina de los nucleótidos 2878 a 3693 de SEC ID Nº 4, o un fragmento funcional de las mismas o una variante funcional de cualquiera. La secuencia del gen de kanamicina se presenta en sentido contrario a las agujas del reloj en la SEC ID Nº 4 y, por lo tanto, el gen se traduce de los nucleótidos 3693 a 2878. En un caso preferido, la unidad del gen de la kanamicina de los nucleótidos 2878 a 3693 puede estar presente en una construcción de la descripción o incluso un fragmento funcional de la misma o una variante funcional de cualquiera. La funcionalidad se puede medir por la capacidad de seleccionar el plásmido en bacterias eficazmente.

El uso del promotor hCEFI implica que las construcciones de la invención normalmente dan lugar a la expresión génica alta y sostenida. Además, también se puede haber diseñado una construcción de la descripción para reducir el contenido de los dinucleótidos CpG. Los dinucleótidos CpG pueden provocar inflamación cuando se administran y, en particular, pueden provocar síntomas gripales, expresión de citoquinas, y la activación y migración de las células inflamatorias. Aunque los dinucleótidos CpG pueden ser de ayuda cuando las construcciones se usan para la vacunación destinada a generar una respuesta inmune, dicha inflamación es indeseable cuando las construcciones se quieren usar para expresar genes con otros fines tales como para el tratamiento de defectos genéticos.

Las construcciones de la descripción pueden ser cualquier tipo de construcción. En un caso preferido de la descripción, la construcción puede ser una construcción no viral. En una realización alternativa, la construcción

puede ser una construcción viral. Las construcciones de la presente descripción pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, YAC, siendo un ejemplo especialmente preferido los plásmidos. El promotor hCEFI se puede emplear con cualquier estructura del plásmido apropiada. En un caso, las construcciones de la descripción pueden integrarse en el genoma de una célula, en otro, no pueden integrarse. En un ejemplo, se puede proporcionar una construcción de la descripción en forma circular, en otro, se puede proporcionar en forma lineal y puede haber sido linealizada. Una construcción de la descripción puede comprender un sitio de restricción para la linealización.

En un ejemplo, se puede emplear un promotor la descripción en una construcción viral. En un ejemplo particularmente preferido, dicha construcción puede ser una construcción viral que se integre en el genoma de las células. En un caso preferido, dichas construcciones pueden carecer, o el gen que comprende el promotor puede carecer, o tener un número reducido de, dinucleótidos CpG como se describe en el presente documento.

En un caso particularmente preferido, una construcción viral de la descripción que emplea el promotor hCEFI puede ser una construcción retroviral o lentiviral. Las construcciones retrovirales y las construcciones lentivirales se integran en el genoma de las células, pudiéndose reducir o silenciar la expresión de sus genes debido a la metilación de los dinucleótidos CpG. Así pues, en un caso particularmente preferido, el promotor hCEFI de dichas construcciones carecerá de dinucleótidos CpG, preferentemente el gen que comprende el promotor hCEFI y las secuencias que se van a expresar carecerá de dinucleótidos CpG y, en particular, uno o más de cualquiera de los otros elementos mencionados en el presente documento presentes en la construcción carecerán de dinucleótidos CpG. En un caso preferido adicional, no habrá dinucleótidos CpG en el gen que comprende el promotor hCEFI, preferentemente en 100 pb, más preferentemente en 250 pb, todavía más preferentemente en 500 pb e incluso más preferentemente en 1.000 pb cadena arriba del promotor hCEFI y/o cadena abajo del extremo de la unidad transcrita o, en algunos casos, no en al menos dichas distancias. En un caso, puede no haber dinucleótidos CpG en dichas distancias desde el promotor hCEFI ya sea 5 y/o 3', y preferentemente ambos. En un caso, la construcción puede carecer de dinucleótidos CpG por completo o solo tener cualquiera de los números de dinucleótidos CpG especificados en el presente documento.

Por lo general, las construcciones de la invención pueden estar en una forma adecuada para la administración a cualquiera de los sujetos mencionados en el presente documento y, en particular, a seres humanos. En un caso preferido, las construcciones no incluyen regiones de unión a la matriz (MAR), aunque en otros casos, sí pueden incluirlas. En una realización, las construcciones no emplean un gen de resistencia a la zeocina. En otro caso preferido, una construcción de la invención puede no comprender, por ejemplo, alguno de entre MAR de -globina, MAR de IFN-, un gen de resistencia a la zeocina y/o la señal de poliadenilación SV40.

En una realización preferida, la invención proporciona una construcción que comprende un promotor hCEFI, donde se puede clonar una secuencia de codificación en el vector a través de un sitio de enzima de restricción. En particular, se proporciona una construcción de este tipo que comprende un sitio de restricción en el que se puede insertar una secuencia de codificación en unión operativa con el promotor hCEFI. El sitio de restricción, puede ser, por ejemplo, un sitio de enzima de restricción para cualquiera de las enzimas de restricción mencionadas en el presente documento. En un caso, el sitio de restricción es un sitio de restricción NheI o Apal.

El sitio de restricción puede ser único para la construcción. Una construcción de este tipo puede comprender cualquiera de los otros elementos mencionados en el presente documento. En un caso particularmente preferido, una construcción de este tipo comprende un exón o exones iniciales y un intrón o intrones, de manera que se puede insertar simplemente una secuencia de codificación en unión operativa con ellos.

En un caso particularmente preferido, se proporciona una construcción que comprende:

(i): la secuencia de SEC ID Nº 1; o

(ii): una construcción con al menos un 70 % de identidad de secuencia con (i) y que comprende un promotor hCEFI de la invención.

Se puede proporcionar una construcción con cualquiera de los niveles de identidad de secuencia especificados en el presente documento con la SEC ID Nº 1. La invención también comprende un método que comprende la inserción de una secuencia de codificación en dicha construcción, de modo que esté unida operativamente al promotor hCEFI. La invención también proporciona una construcción de este tipo con la secuencia que se va a expresar clonada en la misma en unión operativa con el promotor hCEFI incluyendo cualquiera de las secuencias mencionadas en el presente documento.

En un caso preferido adicional, la presente descripción proporciona una construcción, en la que la secuencia que se va a expresar unida operativamente al promotor hCEFI codifica un polipéptido CFTR, donde la construcción comprende:

(i) la secuencia de SEC ID Nº 2, o una variante de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es C, el nucleótido 3234 es T y el nucleótido 3236 es C; o

(ii) una construcción con al menos un 70 % de identidad de secuencia con (i) y que comprende un promotor hCEFI como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

Se proporciona una construcción con cualquiera de los niveles de identidad de secuencia especificados en el presente documento con la SEC ID No: 2 que codifica un gen CFTR funcional capaz de corregir totalmente, o al menos parcialmente, la expresión de CFTR unido operativamente a un promotor hCEFI de la descripción. En un caso preferido, la variante de construcción comprenderá la secuencia de codificación de CFTR de SEC ID Nº 2 y, por lo tanto, expresará la misma proteína. Se pueden emplear fragmentos y variantes funcionales de la secuencia de codificación específica de CFTR. Las variantes y los fragmentos tendrán preferentemente una optimización de los codones.

En un caso preferido adicional, la presente descripción proporciona una construcción, en la que la secuencia que se va a expresar operativamente unida al promotor hCEFI codifica un polipéptido de la luciferasa, donde la construcción comprende:

(i): la secuencia de SEC ID Nº 4; o

(ii): una construcción con al menos un 70 % de identidad de secuencia con (i) y que comprende un promotor hCEFI como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

Una variante de construcción puede tener cualquiera de los niveles de identidad de secuencia especificados en el presente documento con la SEC ID No: 4 y, en particular, puede tener la misma secuencia de codificación de la luciferasa que SEC ID Nº 4.

En un ejemplo más, la secuencia de codificación de la luciferasa puede estar reemplazada por secuencias que codifican cualquier gen marcador. Así pues, en una realización, una construcción de la invención puede comprender un marcador o un gen indicador en unión operativa con el promotor hCEFI. Los ejemplos de genes indicadores cuyas secuencias de codificación se pueden usar incluyen cloranfenicol acetiltransferasa, -galactosidasa, glucuronidasa y la proteína verde fluorescente. También se pueden emplear fragmentos funcionales y variantes funcionales.

En algunos casos, una construcción de la invención puede comprender secuencias que codifiquen una secuencia que permita la purificación del polipéptido expresado tal como un marcador de histidina o una secuencia c-myc u otra secuencia de detección de anticuerpos. Las construcciones también pueden comprender las secuencias de codificación para las señales de secreción de una célula. En algunos casos, la construcción de la invención puede comprender dichas secuencias, pudiéndose entonces clonar una secuencia de codificación en la construcción según proceda, en unión operativa con dichas secuencias.

En otro caso preferido, la secuencia de codificación unida operativamente al promotor hCEFI puede haber sido optimizada en cuanto a los codones para la expresión en el sujeto apropiado y, en particular, para la expresión en seres humanos. Se proporcionan las secuencias de codificación específicas de la luciferasa y CFTR proporcionadas en el presente documento que han sido optimizadas en codones, así como los fragmentos funcionales y las variantes funcionales de los mismos, con cualquiera de los niveles de identidad de secuencia, longitud y otras características especificadas en el presente documento.

Las secuencias de codificación clonadas en las construcciones de la invención pueden ser de cualquier tamaño apropiado para la construcción en cuestión. Así pues, por ejemplo, un plásmido puede comprender una secuencia de codificación de 30 pb a 25 kb, aunque en algunos casos, se pueden emplear secuencias de codificación menores

o mayores. En algunos casos, las secuencias de codificación pueden ser de 250 a 30 kb, preferentemente de 300 pb a 25 kb, más preferentemente de 500 pb a 20 kb, todavía más preferentemente de 500 pb a 15 kb e incluso más preferentemente de 1.000 pb a 10 kb. El intervalo puede comprender cualquier combinación de esos tamaños y la secuencia que se expresa normalmente dictará la longitud de la secuencia de codificación. Las construcciones tales como los cósmidos y YAC pueden comprender insertos mayores. Se seleccionará una construcción apropiada para la secuencia de codificación que se vaya a expresar.

Una construcción de la invención puede estar sustancialmente exenta de, o asociada con, células o con material celular. Puede estar en forma sustancialmente aislada o puede estar en forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprenderá generalmente al menos un 90 %, por ejemplo al menos un 95 %, 98 %, 99 % o más del polinucleótido o masa seca de la preparación.

Dinucleótidos CpG

En una realización especialmente preferida de la invención, uno o más de los elementos, y preferentemente toda la construcción, carecerán de dinucleótidos CpG. Dichas construcciones son particularmente útiles cuando las construcciones no están destinadas a generar una respuesta inmune contra un antígeno. La presencia de dinucleótidos CpG puede generar síntomas gripales e inflamación, particularmente cuando se administran en las vías respiratorias. La eliminación de los dinucleótidos CpG puede ayudar a suprimir dichos efectos.

La respuesta inflamatoria observada tras la administración de complejo de plásmido/liposoma surge en parte del reconocimiento de los dinucleótidos CpG no metilados presentes en el ADNp derivado de bacterias. El ADN de mamífero difiere del ADN bacteriano en que la frecuencia de los dinucleótidos CpG está muy inhibida en comparación con la del ADN bacteriano, y la mayoría de las secuencias CpG de mamíferos están metiladas. El ADN de plásmido derivado de bacterias activa varios tipos de células inmunes/inflamatorias, incluyendo linfocitos B, macrófagos, células dendríticas y linfocitos citolíticos naturales. Como se muestra en los ejemplos de la presente solicitud, la presencia de un solo dinucleótido CpG puede conducir a una respuesta inflamatoria.

Se podrían emplear varias estrategias para reducir las propiedades inmunoestimulantes de las construcciones. Un enfoque podría ser el de metilar enzimáticamente todas las secuencias CpG. Aunque la metilación in vitro de todos los dinucleótidos CpG de un ADNp dado disminuye significativamente las consecuencias inflamatorias de la administración de plásmido/liposoma en el pulmón, también inhibe gravemente la expresión del transgén. Así pues, aunque la metilación se puede emplear, en un caso preferido no se emplea.

Un enfoque alternativo que se puede emplear en la presente invención es el de eliminar o reducir la frecuencia de las secuencias CpG en las construcciones de la invención. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante la eliminación de regiones no esenciales de la construcción (por ejemplo, secuencias que flanquean el origen de replicación) y también, por ejemplo, mediante el rediseño de los elementos reguladores y fases abiertas de lectura para reducir al mínimo las secuencias CpG.

Así pues, por ejemplo, los elementos y las construcciones empleados en la descripción pueden haber sido modificados para eliminar al menos uno, preferentemente al menos cinco, incluso más preferentemente al menos diez, todavía más preferentemente al menos 20 y en algunos casos al menos 30 dinucleótidos CpG de la secuencia de origen natural.

La presencia de un contenido mínimo o nulo de dinucleótidos CpG ayuda a minimizar las respuestas inflamatorias inducidas por el vector. Por lo tanto, el promotor u otro elemento y, preferentemente, la construcción en su conjunto, puede comprender, por ejemplo, menos de 15, preferentemente menos de 10, más preferentemente menos de 5, incluso más preferentemente 4, 3, 2, 1 o cero dinucleótidos CpG. En una realización especialmente preferida, el promotor no comprenderá dinucleótidos CpG para eliminar las respuestas inmunes inducidas por los dinucleótidos CpG.

En una realización preferida, las construcciones de la descripción se habrán modificado para eliminar al menos un nucleótido CpG del promotor hCEFI, pudiendo estar también modificados de este modo, si están presentes, uno o varios de entre la secuencia unida operativamente para la expresión, la secuencia Kozak, la señal de poliadenilación, el origen de replicación y/o el marcador de selección. En algunos casos, se pueden haber eliminado al menos dos, preferentemente al menos cinco, más preferentemente al menos diez, más preferentemente al menos quince e incluso más preferentemente al menos veinte, más preferentemente al menos 50 e incluso más preferentemente al menos 100 dinucleótidos CpG e incluso más preferentemente todos los dinucleótidos CpG de un determinado elemento o de la construcción en su conjunto. Se puede usar, por ejemplo, la mutagénesis dirigida y la síntesis de oligonucleótidos específicos de secuencia para eliminar los dinucleótidos CpG, así como cualquier técnica de biología molecular apropiada.

La invención proporciona la secuencia de codificación de CFTR de los nucleótidos 738 a 5180 de la SEC ID Nº 2, un fragmento funcional de la misma o una de sus variantes funcionales y, en particular, cuando dichas secuencias no tienen dinucleótidos CpG. El nivel de identidad de secuencia o la longitud de la variante o del fragmento puede ser cualquiera de los especificados en el presente documento. Más concretamente, la invención proporciona una variante de la región de codificación de CFTR de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2, en la que el nucleótido de la posición 2595 es una C en lugar de una A, cambiando así el codón de AAT, que codifica la asparagina, a CAT, que codifica la histidina en la posición del amino ácido 620 del polipéptido correspondiente. La región que codifica CFTR de SEC ID Nº 2 se puede modificar además o alternativamente de manera que el nucleótido de la posición 3234 sea una T en lugar de una C, y el nucleótido de la posición 3236 sea una C en lugar de una G, cambiando así el codón de CTG, que codifica la leucina, a TTC, que codifica la fenilalanina en la posición del amino ácido 833 del polipéptido correspondiente.

La invención también proporciona fragmentos funcionales o variantes funcionales de una secuencia de codificación de CFTR que incluye uno de los cambios de codón o ambos anteriormente mencionados.

Se pretende que toda referencia realizada en el presente documento a una secuencia que codifica el CFTR incluya la secuencia de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2, y una variante de la misma con cualquiera de los dos cambios de codón anteriormente mencionados. Del mismo modo, la invención permite construcciones de plásmidos que incluyen una secuencia que codifica CFTR con cualquiera de los cambios de codón o ambos. Preferentemente, se realizan ambos cambios de codón.

Se pueden realizar cambios en la secuencia del gen CFTR, o incluso en cualquier parte de la construcción, usando cualquier técnica adecuada, incluyendo el uso de PCR para producir fragmentos de recambio o sintetizar fragmentos de recambio y la clonación de estos fragmentos en la construcción. El efecto de la presencia de dinucleótidos CpG se puede estudiar usando cualquier ensayo apropiado. En particular, una secuencia objeto de ensayo se puede administrar a un animal no humano y, preferentemente, medirse la inflamación. En un caso preferido, se emplean ratones y, en particular, la administración se realiza en las vías respiratorias. Se pueden medir, por ejemplo, parámetros tales como el recuento de células inflamatorias, en particular, el recuento de neutrófilos y los niveles de citocinas tales como TNF-, IFN- e IL-12.

Secuencias que se expresan y condiciones

Las construcciones de la invención pueden comprender cualquier secuencia apropiada para la expresión unida operativamente al promotor hCEFI. En un caso particularmente preferido, la secuencia que se expresa puede comprender una secuencia de codificación y, por lo tanto, codificar un polipéptido. En otros, las secuencias para la expresión se pueden transcribir para dar lugar a moléculas de ARN que bien son funcionales por sí mismas o se procesan para dar lugar a moléculas de ARN funcionales. Por ejemplo, las construcciones de la invención se pueden usar para expresar ARN antisentido, ARNip y ribozimas, y por lo tanto, se pueden usar para modular la expresión de cualquiera de los genes mencionados en el presente documento y, en particular, para disminuir o suprimir la expresión.

En caso de que la secuencia unida operativamente al promotor hCEFI comprenda una secuencia de codificación que se traduce dando lugar a un polipéptido, se puede expresar cualquier polipéptido adecuado. El polipéptido expresado puede ser, por ejemplo, un polipéptido terapéutico, una enzima, una proteína estructural, un canal de membrana o un componente del mismo, un inhibidor (en particular, un inhibidor de la enzima), una molécula de señalización (tal como una citoquina) o cualquier polipéptido que se desee expresar. Para cualquiera de los polipéptidos mencionados en el presente documento, también se pueden expresar fragmentos funcionales y variantes funcionales.

En una realización, el polipéptido expresado puede ser un polipéptido terapéutico. En particular, el polipéptido puede compensar un defecto genético, lo que significa que un determinado producto génico está ausente o es defectuoso en un sujeto. La afección puede ser aquella en la que un determinado polipéptido falta o es defectuoso en todas las células o, como alternativa, en particular, solo en determinados tipos de células, tejidos u órganos. En algunos casos, la expresión del polipéptido se puede necesitar en el pulmón, el hígado, el músculo, el cerebro y/o los ojos. Un tejido muscular preferido es el corazón. Por lo tanto, las construcciones de la invención se pueden usar para expresar las secuencias seleccionadas en dichos tejidos. En un caso particularmente preferido, el tejido es pulmón o hígado y, en particular, pulmón.

En una realización preferida de la invención, el tejido en el que se puede desear para conseguir la expresión de las secuencias unidas al promotor hCEFI puede ser el pulmón. En un caso particularmente preferido, la afección por tratar es un trastorno de las vías respiratorias o una enfermedad que afecta al pulmón. En un caso preferido, la secuencia expresada y, en particular, el polipéptido, puede ser uno destinado a tratar uno o más de los trastornos de fibrosis quística, asma, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), bronquitis y neumonía. En un caso especialmente preferido, se puede tratar la fibrosis quística.

En una realización, la construcción puede expresar una secuencia para el tratamiento de la enfermedad pulmonar bronquial aguda o crónica, tal como la neumonía infecciosa, bronquitis o traqueobronquitis, bronquiectasias, tuberculosis y/o infecciones por hongos. El sujeto puede tener una infección del tracto respiratorio. El sujeto puede tener sinusitis, congestión de los senos nasales o infecciones virales que infecten el sistema respiratorio, como un resfriado o una gripe. Las construcciones pueden expresar secuencias para el tratamiento de dichas afecciones.

En un caso especialmente preferido, la secuencia de codificación codifica un polipéptido para el tratamiento de la fibrosis quística y, en particular, codifica un regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), un fragmento funcional del mismo o una variante funcional de cualquiera. El polipéptido codificado puede ser, por ejemplo, -1-antitripsina y, por consiguiente, la construcción se puede usar para tratar el enfisema. Para las afecciones tales como EPOC y SDRA, en un caso preferido, los polipéptidos codificados pueden ser proteínas de choque térmico (HSP-70) o citoquinas antiinflamatorias, y en particular, interleucinas y, preferentemente, IL-10.

Ya se han propuesto diversos agentes terapéuticos para el tratamiento del asma y de otras enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias (véase, por ejemplo, Demoly et al., Gene Therapy (1997) 4, 507-516) y también se podrían expresar ventajosamente en las vías respiratorias por medio de una construcción de expresión de acuerdo con la invención. A modo de ejemplo de genes particulares que se pueden expresar a partir de las construcciones de la invención, se enumeran los siguientes: CD40 soluble, IL-1R, IL-4R, receptor de TNF, IL-10, IL12, interferón , TGF  e inhibidores polipeptídicos del factor de transcripción nuclear B humano. Los ejemplos de secuencias para ser expresadas de codificación incluyen:

-: Nº de acceso del GenBank M27492 (fragmento soluble del producto génico de IL-R humano) y Sims et al., “Cloning the interleukin 1 receptor from human T cells”, Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU. (1989) 86, 8946-8950;

-: Nº de acceso del GenBank X52425 (fragmento soluble del producto génico de IL4-R humano; Idzerda et al., “Human interleukin 4 receptor confers biological responsiveness and defines a novel receptor superfamily”, J. Exp. Med. (1990) 171, 861-873;

-: Nº de acceso del GenBank U53483 (fragmento soluble del producto génico del receptor de TNF humano; Santee et al., “Human tumour necrosis factor receptor p75/80 (CD120b) gene structure and promoter characterization”, J. Biol. Chem. (1996) 271, 21151-21159;

-: Nº de acceso del GenBank X13274 (producto génico del IFN humano); Gray et al., “Expression of human immune interferon 30 cDNA in E. coli and monkey cells”, Nature (1982) 295, 503-504;

-: Nº de acceso del GenBank M57627 (producto génico de IL-10 humana); Vieira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1991) 88, 1172-1176;

-: Nº de acceso del GenBank AF180562 y AF180563 (cadenas de IL-12; productos génicos de p35 y p40);

-: Nº de acceso del GenBank X02812 (producto génico de TGFp humano); Derynck et al., “Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed cells”, Nature (1985) 316, 701-705.

Las secuencias anteriores se pueden modificar para eliminar o reducir la aparición de dinucleótidos CpG como cualquiera de las secuencias de codificación descritas en el presente documento. Se pueden emplear fragmentos y variantes funcionales.

En una realización preferida adicional, una construcción de la descripción puede expresar una secuencia para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de cánceres particulares incluyen los cánceres de pulmón, próstata, mama, colon, ovario, testículos, intestino, melanoma, un linfoma y una leucemia. En un caso particularmente preferido, el cáncer es cáncer de pulmón y, en particular, cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Para usarlas para tratar el cáncer, las construcciones de la descripción, en un caso, pueden codificar genes supresores de tumores tales como p53 y Rb y, en particular, Rb. Los ejemplos de genes supresores de tumores que se pueden expresar, y las afecciones que pueden tratar incluyen RB1 (gen de susceptibilidad al retinoblastoma), WT1 (gen del tumor de Wilms), NF1 (gen de neurofibromatosis de tipo 1), NF2 (gen de neurofibromatosis de tipo 2), DCC (cáncer colorrectal) y BRCA1 y BRCA2 (cáncer de mama).

Las construcciones para su uso de acuerdo con la descripción para tratar el cáncer de pulmón se pueden basar en hCEFI para dirigir la expresión en los pulmones de diversos agentes terapéuticos propuestos anteriormente para el tratamiento de cánceres, incluyendo, por ejemplo, preferentemente, enzimas de conversión de profármacos. Por enzima de conversión de profármacos, se entenderá un producto génico que activa un compuesto con poca o ninguna citotoxicidad en un producto tóxico. Ya se han propuesto varias estrategias de activación de profármacos para el tratamiento del cáncer (véase, por ejemplo, la solicitud internacional publicada Nº WO 95/07994 y EP-B 0 702 084 de Chiron Corp.) y se pueden adoptar proporcionando un vector de acuerdo con la presente descripción junto con el profármaco apropiado y, en particular, en el pulmón. Así pues, por ejemplo, un vector para su uso en la terapia del cáncer de pulmón puede estar construido preferentemente de manera que un mismo hCEFI dirija la expresión de una timidina quinasa viral, por ejemplo, la timidina quinasa del virus Herpes simplex. Para la terapia de activación de profármacos, dicha enzima se emplea junto con una purina o un análogo de pirimidina, por ejemplo, ganciclovir, que es fosforilado por la timidina quinasa viral en una forma trifosfato tóxica. Los ejemplos de otras enzimas de conversión de profármacos que se pueden expresar ventajosamente a partir de un promotor hCEFI en los pulmones para la terapia de activación de profármacos del cáncer y, en particular, del cáncer de pulmón incluyen:

-: citosina desaminasa, que convierte el profármaco 5-fluorocitosina en el compuesto tóxico 5-fluorouracilo (Mullen, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1992) 89, 33; véase también “Efficiacy of adenovirus-mediated CD/5-FC and HSV1 thymidine kinase/ganciclovir sucide gene therapies concomitant with p53 gene therapy”, Xie et al., Clinical-Cancer Res. (1999) 5, 4224-4232);

-: carboxipeptidasa G2 que escindirá el ácido glutámico del ácido para-N-bis(2-cloroetil)aminobenzoil-glutámico creando así una mostaza de ácido benzoico tóxica;

-: la penicilina-V amidasa que convertirá derivados de fenoxiacetabida de doxorrubicina y melfalán en compuestos tóxicos (Vrudhula et al., J. Med. Chem. (1993) 36, 919-923; Kern et al., Canc. Immun. Immunother. (1990) 31, 202-206);

-: factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas y timidina fosforilasa (PD-ECGF/TP) que convierte el profármaco 5'-desoxi-5-fluorouracilo (Furtulon) en 5’-fluorouracilo y 5'-desoxi-D-ribosa-1-fosfato (véase, por ejemplo, “Thymidine phosphorylase activity and prodrug effects in a three-dimensional model of angiogenesis; implications for the treatment of ovarian cancer”, Stevens et al., Am. J. Pathol. (1998) 153, 15731578); y

-: nitrorreductasa de E. coli, que se ha utilizado con el profármaco CB1954 (“The nitroreductase/CB1954 combination in Epstein-Barr virus-positive B-cell lines: induction of bystander killing in vitro and in vivo”, Westphal et al., Cancer- Gene-Therapy (enero de 2000) 7, 97-106).

En otras realizaciones preferidas, las construcciones para el tratamiento del cáncer pueden codificar productos génicos citotóxicos y/o profármacos que incluyen combinaciones de HSVtk/GCV y CD/5-FC o incluso se puede expresar un miembro de cada combinación a partir de una construcción de la descripción. Las metástasis se podrían tratar, por ejemplo, con construcciones que codifican IL-12, FAS para modular la expresión génica del hospedador o combinaciones de producto génico citotóxico/profármaco. Una vez más, en algunos casos, se puede administrar solo un miembro de la combinación en combinación con una construcción de la descripción que exprese el otro miembro de la combinación. En algunos casos, una construcción de la descripción puede expresar una ribozima, ARNip o un ARN anti-sentido para reprimir la expresión génica en las células tumorales y, por lo tanto, tratar el cáncer. En un caso preferido, se puede usar cualquiera de dichos elementos para tratar el cáncer en el tratamiento del cáncer de pulmón.

En un aspecto adicional de la descripción, la construcción puede expresar un polipéptido para tratar una afección muscular y, en particular, una distrofia muscular. Por lo tanto, las construcciones de la descripción se pueden administrar de manera que expresen los genes distrofina, mini-distrofina o utrofina y, en particular, en el músculo esquelético para tratar dichas afecciones. Se pueden emplear fragmentos y variantes funcionales.

Las construcciones de la descripción también se pueden usar para expresar factores angiogénicos. Los factores angiogénicos que se pueden expresar incluyen angiogenina, angiopoyetina-1, Del-1, factores de crecimiento de fibroblastos, incluyendo folistatina ácida (aFGF) y básica (bFGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersión (SF), interleucina-8 (IL-8), leptina, midquina, factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento-BB derivado de plaquetas (PDGF-BB), pleyotrofina (PTN), progranulina, proliferina, factor de crecimiento transformante- (TGF-), factor de crecimiento transformante- (TGF-), factor de necrosis tumoral- (TNF-), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y factor de permeabilidad vascular (VPF). Los factores angiogénicos mencionados en particular incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Los factores angiogénicos se pueden usar para tratar cualquier afección en la que se desee estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos. Los ejemplos de dichas afecciones incluyen enfermedad coronaria, apoplejía y cicatrización retardada.

Las construcciones de la descripción también se pueden usar para expresar factores antiangiogénicos. Los ejemplos de factores antiangiogénicos incluyen angioarrestina, angiostatina (fragmento de plasminógeno), antitrombina III antiangiogénica, inhibidor derivado de cartílago (CDI), fragmento del complemento CD59, endostatina (fragmento de colágeno XVIII), fragmento de fibronectina, Gro-, heparinasas, gonadotropina coriónica humana (hCG), interferón //, proteína inducible del interferón (IP-10), interleucina-12, Kringle 5 (fragmento de plasminógeno), inhibidores de las metaloproteinasas (TIMP), inhibidor de la ribonucleasa placentaria, factor plaquetario-4 inhibidor del activador del plasminógeno (PF4), fragmento de 16 kD de prolactina, proteína relacionada con la proliferina (PRP) retinoides, tetrahidrocortisol-S, trombospondina-1 (TSP-1), factor de crecimiento transformante  (TGF-), vasculostatina y vasostatina (fragmento de calreticulina).

Las construcciones de la invención se pueden usar en el tratamiento de la angiogénesis excesiva. Por lo tanto, los ejemplos de afecciones que se pueden tratar con dichas construcciones incluyen cáncer, ceguera diabética, degeneración macular relacionada con la edad, artritis reumatoide y psoriasis.

En otro caso particularmente preferido de la descripción, las construcciones se pueden usar para expresar secuencias en el epitelio y, en particular, en el epitelio ocular. Así pues, las construcciones de la descripción se pueden usar para tratar la degeneración macular (AMD) y, por consiguiente, la descripción proporciona construcciones que expresan el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) para alterar el crecimiento celular y también construcciones que expresan el inhibidor del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF).

En un caso, la construcción puede expresar el factor VIIa, factor VIII, factor IX, glucocerebrosidasa, -galactosidasa, -glucosidasa ácida, -n-acetilgalactosaminidasa, esfingomielinasa ácida, -iduronidasa, distrofina o -1antitripsina.

En un caso, las secuencias de codificación expresadas a través de hCEFI pueden codificar un antígeno, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de cualquiera. El antígeno puede ser en particular un antígeno de patógeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico, o un antígeno tumoral. El antígeno puede ser un antígeno alérgeno. En un caso preferido, el antígeno es un antígeno viral, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de cualquiera.

En realizaciones en las que se pretende generar una respuesta inmune contra un antígeno, en un caso, una construcción, o su elemento o elementos, no se pueden haber modificado para eliminar los dinucleótidos CpG. En un caso alternativo, sí se pueden haber modificado El promotor hCEFI da lugar a una expresión potente y sostenida y, por lo tanto, será útil en la generación de una respuesta inmune.

Así pues, la presente descripción también proporciona una vacuna que comprende una construcción de la descripción que codifica un antígeno y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La descripción también proporciona un método de vacunación o inmunización que comprende la administración de una construcción de la descripción. Dichos métodos generarán preferentemente una respuesta inmune protectora contra el patógeno contra el que el antígeno está diseñado para dar una respuesta inmune. En el caso de los alérgenos y autoantígenos, la administración puede resultar intencionadamente en tolerancia.

Se pueden usar inmunizaciones o vacunaciones posteriores para estimular la respuesta inmune observada. Se pueden expresar fragmentos inmunogénicos y variantes inmunogénicas de antígenos específicos.

En una realización preferida, una construcción de la descripción puede codificar un polipéptido para tratar o prevenir un cáncer. En una realización particularmente preferida, una construcción de la descripción puede codificar un antígeno tumoral, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de cualquiera. Los ejemplos de antígenos asociados a tumores incluyen, pero sin limitación, antígenos del cáncer de testículos tales como los miembros de la familia MAGE (MAGE 1, 2, 3, etc.), NY-ESO-1 y SSX-2, antígenos de diferenciación tales como tirosinasa, gp100, PSA, Her-2 y CEA, auto-antígenos mutados y antígenos tumorales virales tales como E6 y/o E7 de los tipos de VPH oncogénicos. Otros ejemplos de determinados antígenos tumorales incluyen los antígenos MART-1, Melan-A, p97, -HCG, GalNAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA , DDC, P1A, EpCam, antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de melanoma de alto peso molecular, K19, Tyr1, Tyr2, miembros de la familia de genes pMel 17, c-Met, PSM (antígeno de mucina de próstata), PSMA (antígeno de membrana específico de la próstata), proteína secretora de la próstata, -fetoproteína, CA125, CA19.9, TAG-72, BRCA-1 y BRCA-2.

Los ejemplos de cánceres particulares de los que se puede derivar el antígeno incluyen los de los cánceres de pulmón, próstata, mama, colon, ovario, testículos, intestino, melanoma, un linfoma y una leucemia. Las construcciones de la descripción también se pueden usar para tratar o prevenir dichos cánceres.

La construcción puede codificar un antígeno para el tratamiento o la prevención de una serie de afecciones incluyendo, pero sin limitación, cáncer, alergias, toxicidad e infección por un patógeno tal como, pero sin limitación, un hongo, un virus, incluyendo virus del papiloma humano (HPV), VIH, HSV2/HSV1, virus de la gripe (tipos A, B y C), virus de la polio, virus RSV, rinovirus, rotavirus, virus de la hepatitis A, grupo de virus Norwalk, enterovirus, astrovirus, virus del sarampión, virus paragripales, virus de las paperas , virus de la varicela-zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, adenovirus, virus de la rubéola, virus del linfoma de tipo I de linfocitos T humanos (HTLV-I), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis D, virus de la viruela, Marburg y Ébola; una bacteria incluyendo M. tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera, Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospria interrogaus, Legionella pnumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (tipos A y B), Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (tipo b), Toxoplama gondii, Complybacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis y Actinomycosis; hongos patógenos incluyendo candidiasis y aspergilosis; parásitos patógenos incluyendo tenias, trematodos, gusanos redondos, Amibiasis, Giardiasis, Cryptosporidium, Schitosoma, Pneumocystis carinii, tricomoniasis y triquinosis.

El ácido nucleico también se puede usar para proporcionar una respuesta inmune adecuada contra numerosas enfermedades veterinarias, tales como la fiebre aftosa, Coronavirus, Pasteurella multocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, virus de la diarrea viral bovina (VDVB), Klebsiella pneumoniae, E. coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella brochiseptica.

En un ejemplo, una construcción de ácido nucleico de la descripción puede codificar un antígeno de un miembro de adenoviridae (incluyendo, por ejemplo, un adenovirus humano), herpesviridae (incluyendo, por ejemplo, HSV-1, HSV-2, EBV, CMV y VZV), papovaviridae (incluyendo, por ejemplo, HPV), poxvitridae (incluyendo, por ejemplo, viruela y vaccinia), parvoviridae (incluyendo, por ejemplo, parvovirus B19), reoviridae (incluyendo, por ejemplo, un rotavirus), coronaviridae (incluyendo, por ejemplo, SRAS), flaviviridae (incluyendo, por ejemplo, fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, dengue, hepatitis C y encefalitis transmitida por garrapatas), picornaviridae (incluyendo poliomielitis, rinovirus y hepatitis A), togaviridae (incluyendo, por ejemplo, virus de la rubéola), filoviridae (incluyendo, por ejemplo, Marburg y Ébola), Paramyxoviridae (incluyendo, por ejemplo, un virus paragripal, virus sincitial respiratorio, paperas y sarampión), rhabdoviridae (incluyendo, por ejemplo, virus de la rabia), bunyaviridae (incluyendo, por ejemplo, el virus Hanta), orthomyxoviridae (incluyendo, por ejemplo, los virus de la gripe A, B y C), retroviridae (incluyendo, por ejemplo, VIH y HTLV) y hepadnaviridae (incluyendo, por ejemplo, hepatitis B). En un caso preferido adicional, el antígeno puede ser de un patógeno responsable de una enfermedad veterinaria y, en particular, puede ser de un patógeno viral, incluyendo, por ejemplo, un reovirus (tal como la peste equina africana o el virus de la lengua azul) y los virus del herpes (incluyendo el herpes equino). El antígeno puede ser uno del virus de la fiebre aftosa. En un caso preferido adicional, el antígeno puede ser de un virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del dengue, SARS, virus del Nilo Occidental y virus Hanta.

El antígeno puede ser un antígeno fúngico, tal como un antígeno de Candida o Aspergillus. En particular, puede ser de Candida albicans o Aspergillus fumigatus. El antígeno puede ser de Sporothrix (por ejemplo, de Sporothrix schenckii), Histoplasma (por ejemplo, de Histoplasma capsulatum) Cryptococcus (por ejemplo, de Cryptococcus neoformans) o Pneumocystis (por ejemplo, de Pneumocystis carinii). El antígeno puede ser de un patógeno parasitario y puede ser, en particular, de tenias, trematodos, gusanos redondos, Amibiasis, Giardiasis, Cryptosporidium, Schitosoma, Pneumocystis carinii, tricomoniasis y triquinosis.

En algunos casos, el antígeno puede ser un antígeno de un prión. En particular, el antígeno puede ser uno del agente causante del kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), tembladera, encefalopatía transmisible del visón y caquexias crónicas, o de un prión asociado a una encefalopatía espongiforme, en particular, a BSE. El antígeno puede ser del prión responsable del insomnio familiar fatal.

En algunos casos, el antígeno puede ser de parásitos patógenos que incluyen, por ejemplo, uno de los géneros Plasmodium, Chtamydia, Tripanosoma, Giardia, Boophilus, Babesia, Entamoeba, Eimeria, Leishmania, Schistosome, Brugia, Fascida, Dirofilaria, Wuchereria y Onchocerca. Los ejemplos de antígenos preferidos de parásitos patógenos que se van a expresar como el antígeno heterólogo incluyen los antígenos del circumsporozoíto de las especie Plasmodium, tales como el antígeno de circumsporozoíto de P. bergerii o el antígeno de circumsporozoíto de P. falciparum; el antígeno de superficie de merozoitos de la especie Plasmodium; la lectina específica de la galactosa de Entamoeba histolytica; gp63 de la especie Leishmania; paramiosina de Brugia malayi; la triosa-fosfato isomerasa de Schistosoma mansoni, la proteína de tipo globina secretada de Trichostrongylus colubriformis; las glutatión-S-transferasas de Frasciola hepatica, Schistosoma bovis y S. japonicum; y KLH de Schistosoma bovis y S. japonicum.

El antígeno puede ser un autoantígeno. En particular, el antígeno puede ser un antígeno asociado con una enfermedad autoinmune. Los autoantígenos incluyen los asociados con enfermedades autoinmunes tales como la esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo 1 dependiente de la insulina, lupus eritematoso sistémico (LES) y artritis reumatoide. El antígeno puede ser uno asociado con el síndrome de Sjorgrens, miotis, esclerodermia o síndrome de Raynaud. Otros ejemplos de trastornos autoinmunes con los que el antígeno puede estar asociado incluyen colitis ulcerosa, enfermedad de Crohns, trastorno inflamatorio del intestino, enfermedad hepática autoinmune o tiroiditis autoinmune. Los ejemplos de autoantígenos específicos incluyen la insulina, glutamato descarboxilasa 65 (GAD65), proteína de choque térmico 60 (Hsp60), proteína básica de la mielina (MBP), proteína del oligodendrocito de la mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP) y colágeno de tipo II. En los casos en que el antígeno es un autoantígeno, el antígeno se administrará, por lo general, para promover la tolerancia al autoantígeno. Aunque en algunos casos, se pueden producir modelos de las enfermedades usando construcciones de la descripción para ser producir una respuesta inmune.

En algunos casos, el antígeno puede ser un alérgeno. El antígeno alergénico puede ser cualquier antígeno adecuado de un antígeno. Por ejemplo, el alergeno puede de Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia trifida, Artemisia vulgaris, Helianthus annuus, Mercurialis annua, Chenopodium album, Salsola kali, Parietaria judaica, Parietaria officinalis, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phalaris aquatica, Phleum pratense, Poa pratensis o Sorghum halepense. El antígeno alergénico puede ser de un árbol, tal como, por ejemplo, de Phoenix dactylifera, Betula verrucosa, Carpinus betulus, Castanea sativa, Corylus avellana, Quercus alba, Fraxinus excelsior, Ligustrum vulgare, Olea europea, Syringa vulgaris, Plantago lanceolata, Cryptomeria japonica, Cupressus arizonica, Juniperus oxycedrus, Juniperus virginiana o Juniperus sabinoides. En algunos casos, el antígeno puede ser de un antígeno de un ácaro tal como, por ejemplo, Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Glycyphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor o Tyrophagus putrescentiae.

El antígeno alergénico puede ser de un animal tal como, por ejemplo, de un animal doméstico o agrícola. Los ejemplos de alérgenos de animales incluyen los de ganado vacuno, caballos, perros, gatos y roedores (por ejemplo, de rata, ratón, hámster o cobaya). En algunos casos, el antígeno puede ser de un alérgeno alimentario y, en otros, puede ser de insectos.

En otro caso preferido el antígeno puede ser de un retrovirus (por ejemplo, HTLV-I; HTLV-11; o VIH-1 (también conocidos como HTLV-111, LAV, ARV, hTLR, etc.)). En particular, del VIH y, en particular, los aislados HIVIllb, HIVSF2, HTVLAV, HIVLAI, HIVMN; VIH-1CM235, HIV-1; o VIH-2. En una realización particularmente preferida, el antígeno puede ser un antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Los ejemplos de antígenos del VIH preferidos incluyen, por ejemplo, gp120, gp 160 gp41, antígenos gag tales como p24gag y p55gag, así como proteínas derivadas de las regiones del VIH pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu o LTR. En un caso particularmente preferido, el antígeno puede ser gp120 del VIH o una porción de gp120 del VIH. El antígeno puede ser de un virus de la inmunodeficiencia, y puede, por ejemplo, ser del SIV o un virus de la inmunodeficiencia felina.

El antígeno puede ser un antígeno modelo. El antígeno puede ser uno usado comúnmente en experimentos para evaluar las respuestas inmunes. Por ejemplo, el antígeno puede ser una lisozima y, en particular, lisozima de huevo de pollo. El antígeno puede ser la ovoalbúmina y, en particular, la ovoalbúmina de pollo.

Por lo tanto, el polipéptido codificado puede ser un antígeno, un fragmento inmunogénico del mismo o una de sus variantes inmunogénicas y, en particular, cualquiera de los antígenos mencionados en el presente documento, fragmentos inmunogénicos de los mismos o variantes inmunogénicas de cualquiera. El fragmento o la variante pueden tener, por ejemplo, cualquiera de los niveles de homología, proporción de longitud del antígeno original y funcionalidad especificados en el presente documento y, en particular, capacidad para dar lugar a una respuesta inmune.

En un ejemplo, una construcción de la descripción usa el promotor hCEFI para expresar un antígeno de la gripe, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de cualquiera. El fragmento y/o la variante pueden tener cualquiera de los niveles de homología de secuencia, longitudes de fragmentos y/o niveles de funcionalidad especificados en el presente documento. En particular, preferentemente, una secuencia de codificación de la construcción codifica un antígeno del virus de la gripe, un fragmento inmunogénico de un antígeno del virus de la gripe o una variante inmunogénica con 80 % de homología de aminoácidos con cualquiera de los anteriores, o incluso, con cualquiera de los niveles de identidad de secuencia especificados en el presente documento.

Por ejemplo, el antígeno de la gripe puede ser un antígeno NP de la gripe (nucleoproteína/proteína de la nucleocápside), HA (hemaglutinina), NA (neuraminidasa), M1, M2, PB1, PB2, PA, NS1 y/NS2, o puede ser un fragmento o variante de dichos antígenos. En una realización preferida, el antígeno codificado puede ser antígeno HA, NA y/o M2 de la gripe, o un fragmento o una variante de dichos antígenos. En un caso especialmente preferido, el antígeno codificado puede ser un antígeno HA o NA, o un fragmento o una variante de dichos antígenos y, en particular, un antígeno HA, o un fragmento o una variante de dicho antígeno.

En una realización preferida, el antígeno puede ser de la cepa H5N1 de la gripe, y se pueden emplear fragmentos inmunogénicos del mismo y variantes de cualquiera que conserve la inmunogenicidad. En particular, el antígeno puede ser uno de la cepa H5N1 o un fragmento de dicho antígeno. Se pueden emplear variantes, por ejemplo, con uno, dos, tres, cuatro, cinco o más cambios de aminoácidos, así como variantes con cualquiera de los niveles de identidad de secuencia, longitud y otras características especificadas en el presente documento. Del mismo modo, los fragmentos pueden tener cualquiera de los niveles de longitud y otros parámetros especificados en el presente documento.

El antígeno de la gripe puede ser de cualquier virus de la gripe. El antígeno puede ser del virus de la gripe A, B o C, en particular, de la gripe A y/o B. El antígeno puede ser, por ejemplo, de una de las cepas identificadas anualmente por la Organización Mundial de la Salud para su uso en vacunas contra la gripe y, en particular, puede ser un antígeno identificado por la OMS para dicho uso.

Entre los genes terapéuticos preferidos para la administración a células, y por consiguiente, para la expresión usando construcciones de la descripción están los factores hematopoyéticos, incluyendo el factor VIIa [patente de EE.UU. Nº 4.784.950]; Factor VIII [patentes de EE.UU. Nº 4.965.199; 4.868.112 [dominio B eliminado] y patente de EE.UU. Nº 5.661.008]; y el Factor IX [patente de EE.UU. Nº 4.994.371]. Otros genes preferidos son los que codifican enzimas lisosomales de almacenamiento, incluyendo los genes que codifican la glucocerebrosidasa [enfermedad de Gaucher; patentes de EE.UU. Nº 5.879.680; 5.236.838]; -galactosidasa [enfermedad de Fabry; patente de EE.UU. Nº 5.401.650]; -glucosidasa ácida [enfermedad de Pompe; WO00/12740]; -nacetilgalactosaminidasa [enfermedad de Schindler; patente de EE.UU. Nº 5.382.524]; esfingomielinasa ácida [enfermedad de NiemannPick; patente de EE.UU. Nº 5.686.240]; -iduronidasa [WO9310244A1]. Otros genes preferidos incluyen los genes para la distrofina, insulina y -1-antitripsina.

En algunos casos, las construcciones de la descripción se pueden usar para expresar secuencias en células, tejidos u órganos afectados directamente por una afección. Por ejemplo, en la fibrosis quística, las construcciones de la descripción se pueden usar para expresar CFTR en las células del pulmón para corregir el órgano más afectado por la afección. En la distrofia muscular, el gen terapéutico se puede expresar, por ejemplo, en el músculo esquelético. En otros casos, la intención puede ser expresar secuencias en un tejido de modo que el polipéptido expresado se pueda liberar y actuar en otro tejido. Por lo tanto, en algunos casos, se puede usar un tipo de célula o tejido particular como fábrica para la producción de polipéptidos deseados. Los casos preferidos incluyen usar el pulmón, el hígado y/o el músculo para producir proteínas y, en particular, para secretar los polipéptidos que producen. Los ejemplos incluyen la producción de factores de coagulación para la hemofilia, enzimas metabólicas para defectos de almacenamiento lisosomal, la insulina para la diabetes, -1-antitripsina para el enfisema. Dicha metodología se puede usar para cualquiera de las afecciones mencionadas en el presente documento en las que el polipéptido no se tiene que expresar directamente en el tejido diana o se desea que el polipéptido seleccionado entre en sistemas tales como el sistema sanguíneo, de modo que el polipéptido sea transportado por el organismo.

En un caso adicional de la descripción, la descripción proporciona construcciones que expresan polipéptidos no terapéuticos. En un caso, dichas construcciones se pueden usar para producir determinados polipéptidos deseados en sistemas in vitro o, como alternativa, en animales no humanos.

Las construcciones de la descripción se pueden usar para expresar secuencias en animales agrícolas, incluyendo cualquiera de los mencionados en el presente documento. Dichas secuencias expresadas pueden ser terapéuticas o no terapéuticas. Las construcciones de la descripción se pueden usar para expresar cualquiera de los productos génicos mencionados en el presente documento para el tratamiento de enfermedades en animales. Los polipéptidos expresados pueden incluir secuencias apropiadas de modo que se secreten en la sangre o la leche para facilitar la recogida.

Las construcciones de la descripción se pueden usar para expresar polipéptidos que aumenten el valor de los animales agrícolas. Por ejemplo, se pueden usar para expresar construcciones que generen una mayor producción de carne en animales usados por su carne. Por ejemplo, una construcción de la descripción se puede usar para expresar hormonas y, en particular, la hormona del crecimiento, en particular, para mejorar la producción de carne. Una construcción de la descripción se puede usar para expresar somatotropina. En un caso particularmente preferido, una construcción de la invención se puede emplear para expresar una somatropina para aumentar la producción de leche, particularmente en animales tales como vacas y cabras y, en particular, vacas lecheras, pudiéndose emplear la somatotropina en particular, la proteína bovina, fragmentos funcionales de la misma o variantes funcionales de cualquiera.

Para todas las secuencias expresadas mencionadas en el presente documento, se pueden emplear fragmentos funcionales de las secuencias específicas mencionadas, así como variantes funcionales de cualquiera. Por ejemplo, en el caso de los polipéptidos terapéuticos, siempre que el fragmento o las variantes conserven algún beneficio terapéutico, se pueden emplear, y el grado de funcionalidad puede ser cualquiera de los especificados en el presente documento.

En algunas realizaciones de la descripción, el promotor hCEFI se puede usar para expresar más de un polipéptido. Por lo tanto, en algunos casos, una secuencia transcrita puede dar lugar a múltiples polipéptidos, por ejemplo, una transcripción puede contener múltiples fases abiertas de lectura (ORF) y también uno o más sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) para permitir la traducción de las ORF posteriores a la primera ORF. Una transcripción se puede traducir para dar un polipéptido que se escinda posteriormente, dando una pluralidad de polipéptidos. En algunos casos, una construcción de ácido nucleico de la descripción puede comprender múltiples promotores hCEFI y, por tanto, dar lugar a una pluralidad de transcripciones y, por consiguiente, a una pluralidad de polipéptidos. Las construcciones pueden expresar, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más polipéptidos a través de un promotor o promotores hCEFI.

En una realización especialmente preferida de la presente descripción, el promotor hCEFI se puede usar para expresar el polipéptido CFTR y, por tanto, la construcción se puede usar para tratar la fibrosis quística. La fibrosis quística (FQ) es una afección hereditaria que afecta a aproximadamente uno de cada 2.000 caucásicos. La afección está causada por mutaciones en el gen del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que codifica un canal de cloruro regulado por AMPc expresado en la superficie de las células epiteliales [Riordan, J. R., et al., Science, 1989. 245(4922): pág. 1066-73]. El canal de cloruro del CFTR tiene un papel importante en la regulación del transporte transepitelial de la sal y el agua. La anomalía o ausencia del CFTR puede generar la enfermedad en muchos órganos del cuerpo, pero la principal causa de morbilidad y mortalidad en la FQ es la enfermedad pulmonar [Pilewski, J. M. y R. A. Frizzell, Physiol Rev, 1999. 79 (1 Supl): pág. S215-55]. La secreción de cloruro defectuoso y la elevada absorción de sodio en las vías respiratorias producen el desarrollo de las secreciones de moco espeso en los pulmones y, posteriormente, la infección bacteriana crónica. A pesar de los avances en el tratamiento, esta afección sigue dando lugar, en última instancia, a la muerte, frecuentemente, a una edad adulta temprana [Pilewski et al., 1999 supra]. Se predice que la transferencia de un gen de CFTR de tipo silvestre a las células de la glándula submucosa y epitelial bronquial proximal corrige el defecto del canal de cloruro en la FQ [Drumm, M. L., et al., Cell, 1990. 62(6): pág. 1227-33 y Hyde, S. C., et al., Nature, 1993. 362 (6417): pág. 250-5]. Las construcciones de la descripción se pueden usar para lograr la expresión en dichos tejidos y, en particular, en dichos tejidos en la fibrosis quística. Las construcciones se pueden administrar a través de cualquier medio apropiado para realizar la administración en dichos tejidos.

Los ensayos clínicos previos de evaluación de la administración de genes de CFTR mediada por vectores adenovirales manifestaron toxicidades limitantes a dosis pulmonares justo suficientes para detectar bajos niveles de expresión de CFTR [Crystal, R. G., et al., Nat Genet, 1994. 8(1): pág. 42-51; Knowles, M. R., et al., N Engl J Med, 1995. 333(13): pág. 823-31; Wilmott, R. W., et al., Hum Gene Ther, 1996. 7(3): pág. 301-18; y Zabner, J., et al.,. J Clin Invest, 1996. 97(6): p. 1504-11. Estudios similares que evalúan vectores virales adeno-asociados no han mostrado toxicidad, pero el nivel de la reconstitución funcional de CFTR ha sido modesto [Conrad, C. K., et al., Gene Ther, 1996. 3(8): pág. 658-68, Aitken, M. L., et al., Hum Gene Ther, 2001. 12(15): pág. 1907-16, Wagner, J. A., et al., Hum Gene Ther, 2002. 13(11): pág. 1349-59, Flotte, T. R., et al., Hum Gene Ther, 2003. 14(11): pág. 1079-88. Es importante destacar que la administración de cualquier vector viral conduce a la generación de anticuerpos neutralizantes que inhiben la eficacia de las administraciones posteriores [Zabner et al., 1996, supra, Harvey, B. G., et al., J Clin Invest, 1999. 104(9): pág. 1245-55, Sun, J. Y., et al., Gene Ther, 2003. 10(11): pág. 964-76, Moss, R. B., et al., Chest, 2004. 125(2): pág. 509-21].

Las construcciones de la presente descripción que expresan el CFTR se pueden usar para abordar los problemas observados en los ensayos de la técnica anterior de tratamiento genético de la FQ. En particular, como la invención proporciona construcciones con un contenido mínimo, o nulo, de dinucleótidos CpG, los síntomas gripales y la inflamación resultante de dichas secuencias se ha minimizado o eliminado. Además, el promotor hCEFI de la presente invención muestra una expresión de alto nivel y sostenida. Esto significa que la terapia que emplea las construcciones de la invención tendrá un efecto prolongado. Esto puede significar que la terapia se tenga que administrar con menor frecuencia, lo que es importante para las afecciones genéticas, en particular, cuando el defecto genético subyacente implica tratar la afección de manera continua. Esto puede ser particularmente importante para afecciones tales como la fibrosis quística, donde la expresión prolongada de CFTR ayudará a restablecer la función pulmonar durante más tiempo. Así pues, en un caso especialmente preferido, una construcción de la invención se puede usar en el tratamiento de una afección genética, en particular, de cualquiera de las mencionadas en el presente documento y, en especial, de la fibrosis quística.

Sujetos

En un aspecto, las construcciones de la invención se pueden administrar a un sujeto. En un caso preferido, las construcciones se administran a un mamífero. En un caso preferido, el sujeto es un ser humano y, en particular, el sujeto puede ser un ser humano a quien se pretende tratar un estado patológico, particularmente cualquiera de los mencionados en el presente documento.

En un aspecto adicional, el sujeto puede no ser un ser humano. En particular, las construcciones de la invención se pueden administrar a un animal no humano y, preferentemente, un mamífero no humano. Dichos sujetos pueden estar padeciendo alguna de las afecciones mencionadas en el presente documento. Las construcciones se pueden administrar, por ejemplo, a animales domésticos no humanos o un animal de valor agrícola. Por ejemplo, los sujetos pueden ser ganado, cerdos, caballos, ovejas o cabras, pudiendo ser animales deportivos tales como caballos y perros. El animal puede ser un animal de compañía tal como un perro o un gato. El animal puede ser un mono tal como un primate no humano, tal como un chimpancé, un gorila o un orangután. El sujeto puede ser un conejo.

Las construcciones de la invención se pueden administrar a sujetos aviares. Así pues, por ejemplo, las construcciones se pueden administrar a aves domésticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos y gansos, incluyendo dichos animales usados por su carne.

En un caso preferido adicional, las construcciones de la invención se pueden administrar a roedores. Los ejemplos de roedores incluyen ratones, ratas, cobayas y hámsteres y, en particular, ratones y ratas, y especialmente ratones. Las construcciones se pueden administrar a dichos animales para evaluar su eficacia. También se pueden administrar para evaluar la funcionalidad de determinados elementos de la construcción y también la construcción en su conjunto. En un caso de la invención, una construcción de la invención se puede administrar a un modelo animal de cualquiera de las afecciones mencionadas en el presente documento, incluyendo los modelos genéticos e inducidos. Por ejemplo, las construcciones se pueden administrar a modelos de ratones knock-out y transgénicos de cualquiera de las afecciones mencionadas en el presente documento y, en un aspecto particularmente preferido, los modelos de ratones knock-out o transgénicos de la FQ pueden recibir una construcción de la invención y cualquier reversión en el fenotipo controlado.

El término “sujeto” no denota una edad en particular. Por lo tanto, se pretende englobar tanto a adultos como a individuos recién nacidos. En una realización, el sujeto es susceptible a o se encuentra en riesgo de padecer la enfermedad en cuestión. En una realización preferida adicional, el sujeto tiene una de las afecciones patológicas mencionadas en el presente documento. El sujeto puede tener un defecto genético para cuya corrección se ha diseñado la administración de la construcción y, en particular, cualquiera de las afecciones patológicas mencionadas el presente documento.

Formulación y administración

Con respecto a la introducción de una construcción de la invención en células, tejidos u órganos, los métodos in vitro adecuados para la administración de ácidos nucleicos a dichas células son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, electroporación y microinyección directa en núcleos. Por lo tanto, la invención proporciona una célula transformada con una construcción de la invención. La invención proporciona una célula que comprende una construcción de la invención. En un caso, la presente invención proporciona una célula aislada o una población de células que comprende una construcción de la invención. La presente invención proporciona dichas células in vitro. Las células de la presente invención se pueden proporcionar en forma congelada para su almacenamiento en algunos casos.

Las construcciones de la invención se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada para la administración a un sujeto. Por ejemplo, pueden estar en forma de ADN desnudo o complejado con uno o más anfifilos catiónicos, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos (también denominados ADN/liposomas, ADN de plásmido/liposomas o Lipoplex). Las construcciones se pueden administrar bien directamente a un sujeto, o como alternativa,

administrarse ex vivo a células derivadas del sujeto, tras lo que las células se vuelven a implantar en el sujeto. En un caso preferido, las construcciones se administran directamente al sujeto.

En la administración de las construcciones de la invención, se puede usar cualquier vía de administración adecuada. Las construcciones se pueden administrar por vía enteral o parenteral, tal como por vía oral, bucal, anal, pulmonar, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, tópica, por inhalación, a través de aerosoles, subcutánea, intramuscular, intranasal o transmucosa. Las construcciones se pueden administrar mediante inyección sin aguja. Por lo tanto, la invención también proporciona partículas portadoras para la inyección sin aguja recubiertas con una construcción de la invención y dispositivos de inyección sin aguja cargados con dichas partículas portadoras recubiertas.

Preferentemente, las construcciones de la invención se pueden administrar por inhalación y/o por vía intranasal. Así pues, se pueden administrar a través de la nariz y/o la boca. Los métodos adecuados para la formulación y preparación de medicamentos para ser administrados por inhalación, instilación y por vía intranasal son bien conocidos en la técnica, y se pueden emplear en la presente invención. La administración intranasal puede ser, en algunos casos, en la forma de un pulverizado nasal de polvo fino o aerosol, o en casos particulares, en la forma de Dischaler o Turbuhaler modificado. Las construcciones también se pueden administrar por instilación. En una realización preferida, los medicamentos de la invención son adecuadas para la administración por inhalación. Para la terapia de inhalación, el medicamento puede estar, por ejemplo, en una solución útil para la administración con inhaladores de dosis medidas de aerosol líquido o en una forma adecuada para un inhalador de polvo seco. El medicamento puede estar presente en un blíster o una cápsula rompible.

En algunas realizaciones preferidas, los medicamentos de la presente invención se pueden formular en forma de aerosoles. La formulación de aerosoles farmacéuticos es rutinaria para los expertos en la materia, véase, por ejemplo, Sciarra, J. en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” (supra). Los agentes se pueden formular en forma de aerosoles en solución, aerosoles en dispersión o suspensión de polvos secos, emulsiones o preparaciones semisólidas. El aerosol se puede administrar usando cualquier sistema propulsor conocido por los expertos en la materia. Los aerosoles se pueden aplicar en el tracto respiratorio superior, por ejemplo, por inhalación nasal, o en el tracto respiratorio inferior o en ambos. La parte del pulmón en la que se administra el medicamento puede estar determinada por el trastorno. En una realización particularmente preferida, la administración puede ser en, o conseguir la expresión en, las células de las glándulas submucosas y/o epiteliales bronquiales proximales.

En algunas realizaciones y, en particular, cuando se va a usar la administración intranasal, los medicamentos pueden comprender un humectante. Este puede ayudar a reducir o prevenir la sequedad de la membrana mucosa y a prevenir la irritación de las membranas. Los humectantes adecuados incluyen, por ejemplo, sorbitol, aceite mineral, aceite vegetal y glicerol; agentes calmantes; acondicionadores de membrana; edulcorantes; y sus combinaciones. Los medicamentos pueden comprender un tensioactivo. Los tensioactivos adecuados incluyen tensioactivos no iónicos, aniónicos y catiónicos. Los ejemplos de tensioactivos que se pueden usar incluyen, por ejemplo, derivados de polioxietileno de ésteres parciales de ácidos grasos de anhídridos de sorbitol, tales como, por ejemplo, Tween 80, polioxil 40 estearato, polioxietileno 50 estearato, fusieatos, sales biliares y octoxinol.

Los medicamentos de la presente invención se pueden administrar, por ejemplo, con cualquier dispositivo adaptado para introducir una o más composiciones terapéuticas en el tracto respiratorio superior y/o inferior. En algunas realizaciones preferidas, los dispositivos de la presente invención pueden ser inhaladores de dosis medidas. Los dispositivos pueden estar adaptados para suministrar las composiciones terapéuticas de la invención en forma de una bruma finamente dispersa de líquido, espuma o polvo. El dispositivo puede usar un efecto piezoeléctrico o una vibración ultrasónica para desalojar polvo adherido a una superficie tal como una cinta con el fin de generar bruma adecuada para inhalación. Los dispositivos pueden usar cualquier sistema propulsor conocido por los expertos en la materia incluyendo, pero sin limitación, bombas, gas licuado, gas comprimido, y similares.

Por lo general, los dispositivos de la presente invención comprenden un recipiente con una o más válvulas a través de las cuales se desplaza el flujo de la composición terapéutica y un accionador para controlar el flujo. Los dispositivos adecuados para su uso en la presente invención se pueden ver, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Sciences” (supra). Los dispositivos adecuados para la administración de las construcciones de la invención incluyen inhaladores y nebulizadores tales como los que se usan normalmente para administrar esteroides a los asmáticos. En algunos casos, donde el sujeto es, por ejemplo, un niño, se puede usar un espaciador para facilitar la administración eficaz desde el inhalador.

Hay varios diseños de inhaladores disponibles el mercado, y se pueden emplear para administrar los medicamentos de la invención. Estos incluyen los dispositivos Accuhaler, Aerohaler, Aerolizer, Airmax, Autohaler, Clickhaler, Diskhaler, inhalador Easi-Breathe, Fisonair, Integra, inhalador Jet, Miat-Haler, inhalador Novolizer, inhalador Pulvinal, Rotahaler, Spacehaler, Spinhaler, inhalador Syncroner y Turbuhaler.

Una construcción para su uso de acuerdo con la invención se administrará generalmente a través de las vías respiratorias, por ejemplo, en la cavidad nasal, la tráquea o los pulmones, pero en algunos casos, se puede permitir la administración intravenosa en el tejido pulmonar. Por ejemplo, se puede preferir la administración intravenosa de

una construcción de acuerdo con la invención para tratar el cáncer de pulmón, pudiéndose acceder fácilmente al/a los tumor/es desde el lecho capilar pulmonar. Ya se han descrito diversos medios para dirigir construcciones recombinantes para la administración en tejidos y tumores específicos de agentes terapéuticos que se pueden aplicar a las construcciones de la invención. Los vectores para su uso de acuerdo con la invención se pueden administrar en las vías respiratorias, por ejemplo, mediante un catéter de alimentación introducido en la cavidad nasal o por medio de un broncoscopio. La administración para la terapia de acuerdo con la invención puede ser, sin embargo, más preferentemente, por medio de un nebulizador u otro dispositivo de pulverización, siempre que se mantenga la integridad del vector.

En realizaciones en las que se desea administrar los medicamentos al o a través del tracto respiratorio, el tamaño de partícula del medicamento se puede seleccionar en base a la parte del tracto respiratorio en la que se desee administrar el medicamento.

Los medicamentos de la invención pueden adoptar una variedad de formas. En los casos en que se van a administrar a través del tracto respiratorio pueden estar en forma de polvos, microesferas de polvo, soluciones, suspensiones, geles, suspensiones de nanopartículas, liposomas, emulsiones o microemulsiones. Los líquidos presentes pueden ser agua u otros disolventes adecuados, tales como CFC o HFA. En el caso de soluciones y suspensiones, estas pueden ser acuosas o implicar soluciones distintas del agua.

En un caso particularmente preferido, las construcciones de la invención se administran al pulmón y, en particular, a las vías respiratorias del pulmón. En un caso especialmente preferido, la administración a las vías respiratorias se puede realizar mediante el uso de liposomas. En particular, la construcción puede formar un complejo con una formulación de transferencia génica a base de lípidos catiónicos y, en particular, con GL67 o PEI.

Las construcciones de la invención se pueden formular como preparaciones farmacéuticas. Esto se puede realizar usando las químicas y metodologías de formulación farmacéutica convencionales, que están disponibles para los expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones que contienen una o más construcciones se pueden combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para proporcionar una composición farmacéutica. Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una construcción de la invención, y un vehículo y excipiente farmacéuticamente aceptable.

Puede haber sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH y similares, en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares, generalmente, son agentes farmacéuticos que se pueden administrar sin generar toxicidad y que, en el caso de las composiciones de vacuna, no producirán una respuesta inmune en el individuo que reciba la composición. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. También se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. También se prefiere, aunque no es necesario, que la preparación contenga un excipiente farmacéuticamente aceptable que sirva como estabilizante, en particular, para el péptido, proteína u otras moléculas similares, si se incluyen en la composición. Los ejemplos de vehículos adecuados que también actúan como estabilizantes incluyen, sin limitación, calidades farmacéuticas de dextrosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, dextrano, y similares. Otros vehículos adecuados incluyen, de nuevo sin limitación, almidón, celulosa, fosfatos de sodio o calcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietilenglicoles de alto peso molecular (PEG), y combinaciones de los mismos. En REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. 1991), se puede encontrar una descripción completa de excipientes, vehículos y sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables. También se pueden incluir ciertos facilitadores de la absorción y/o expresión de ácido nucleico ("agentes facilitadores de la transfección") en las composiciones, por ejemplo, facilitadores tales como bupivacaína, cardiotoxina y sacarosa, y vehículos que facilitan la transfección tales como preparaciones de liposomas o lípidos usadas habitualmente para la administración de moléculas de ácido nucleico. Los liposomas aniónicos y neutros están ampliamente disponibles y son bien conocidos para la administración de moléculas de ácido nucleico (véase, por ejemplo, “Liposomes: A Practical Approach”, (1990) RPC New Ed., IRL Press). Las preparaciones de lípidos catiónicos también son vehículos muy conocidos para su uso en la administración de moléculas de ácido nucleico. Las preparaciones de lípidos adecuadas incluyen DOTMA (cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio), disponible con la marca comercial LipofectinaTM, y DOTAP (1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano), véanse, por ejemplo, Felgner et al. (1987) Pro. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:7413-7416; Malone et al. (1989) Pro. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:6077-6081; patentes de EE.UU. Nº 5.283.185 y 5.527.928, y publicaciones internacionales Nº WO 90/11092, WO 91/15501 y WO 95/26356. Estos lípidos catiónicos se pueden usar preferentemente en asociación con un lípido neutro, por ejemplo, DOPE (dioleil fosfatidiletanolamina). Otras composiciones facilitadoras de la transfección que se pueden añadir a las preparaciones de lípidos o liposomas anteriores incluyen derivados de espermina (véase, por ejemplo, la publicación internacional Nº WO 93/18759) y compuestos de permeabilización de la membrana tales como GALA, Gramicidina S y sales biliares catiónicas (véase, por ejemplo, la publicación internacional Nº WO 93/19768).

En una realización especialmente preferida de la invención, se puede administrar una construcción usando un lípido catiónico. En particular, se pueden emplear los lípidos catiónicos que comprenden un grupo espermina y

preferentemente un grupo espermina ligado a un anclaje de colesterol. En un caso preferido, dichos agentes se pueden emplear con DOPE, particularmente a relaciones molares de 1:1 a 1:5, y preferentemente de 1:1,5 a 1:2,5, y especialmente de 1:2. Una formulación especialmente preferida es el empleo de GL67 (Lee et al., 1996, Hum. Gen. Ther. 7: 1701-1717). En un caso preferido adicional, se pueden usar lípidos catiónicos que comprenden un grupo espermina en combinación con PEG-DMP-5000 y, en particular, se puede usar GL-67 en combinación con una formulación de este tipo. En un caso, las relaciones molares empleadas pueden ser cualquiera de las mencionadas en relación con DOPE. Eastman, et al. (1997) Hum Gene Ther 8 (6): 765-73 describe el uso de PEG-DMP-5000.

En un caso, se pueden formular GL-67, DOPE y DMPE-PEG-5000 usando la construcción y, en particular, como se describe en Eastman et al y Lee et al, y también como se describe en los ejemplos. Por lo tanto, en un caso, se formulan GL-67, DOPE y DMPE-PEG-5000 y, por ejemplo, se liofilizan para el almacenamiento. Luego se puede volver a hidratar la formulación y prepararse los liposomas mediante métodos tales como agitación vorticial, se pueden añadir las construcciones mediante la combinación de volúmenes iguales de ADN y GL67 y, en particular, a una relación molar de 0,25:1 o, por ejemplo, de 1:16 a 1:1, preferentemente de 1:8 a 1:1, más preferentemente de

1:5 a 1:1. Para la aplicación por aerosol, por ejemplo, se pueden emplear relaciones molares de GL67 con respecto al plásmido de 0,1:1 a 1:1, preferentemente de 0,3:1 a 1:1 y en particular de 0,5:1 a 1:1 mM y, en particular, de 0,75:1 mM.

En otra realización especialmente preferida de la invención, la construcción de la invención se puede administrar usando polietilenimina (PEI) (Boussif et al, 1995, PNAS 92: 7297-301). En particular, se puede emplear PEI de 1 a 100 kd, preferentemente de 10 a 50 kd, preferentemente de 15 a 35 y en particular de 19 a 31 kd. Dichos PEI pueden ser ramificados o lineales y, en particular, ramificados. En un caso preferido, se pueden emplear PEI lineales de 22 kd y ramificados de 25 kd.

Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden encapsular, adsorber a o asociar con vehículos particulados. En particular, se pueden proporcionar en vehículos con núcleo para inyecciones sin aguja. Los vehículos particulados adecuados incluyen los derivados de polímeros de polimetilmetacrilato, así como micropartículas de PLG derivadas de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glicólidos). Véase, por ejemplo, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10: 362-368. También se pueden usar otros sistemas particulados y polímeros, por ejemplo, polímeros tales como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, así como conjugados de estas moléculas. En una realización preferida, las construcciones de la invención se precipitan sobre vehículos en presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de iones metálicos. Los agentes de condensación preferidos incluyen polímeros catiónicos, en particular, poliaminas y, en particular, una poliargina o una polilisina. Se pueden emplear vehículos de núcleo metálico y, en particular, vehículos de núcleo de oro para la inyección sin aguja.

Las composiciones se administran a un sujeto en una cantidad que sea compatible con la formulación de dosificación y que sea profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. Una cantidad eficaz apropiada estará un intervalo relativamente amplio, pero puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia mediante ensayos rutinarios. Las publicaciones "Physicians Desk Reference" y "Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics" son útiles para determinar la cantidad necesaria. Por ejemplo, generalmente, se espera que una dosis eficaz del polinucleótido esté en un intervalo de aproximadamente 0,001 g a 1 g. En particular, se pueden administrar dosis de 0,1 a 500 mg, preferentemente de 10 a 400 mg, más preferentemente de 25 a 350 mg, incluso más preferentemente de 35 a 300 mg. En algunos casos, se puede administrar una dosis de aproximadamente 50 mg, 100 mg, 150 mg, 250 mg o 300 mg o una dosis de 25 mg de dichas dosis. En un caso preferido, las dosis se pueden aplicar para la administración por aerosol. En el caso de la administración intravenosa, la dosis puede ser, por ejemplo, cualquiera de las mencionadas y, en particular, puede estar en el intervalo de 0,1 a 100 mg, preferentemente de 0,5 a 25 mg, e incluso más preferentemente de 5 a 10 mg.

En algunos casos, tras una administración inicial, se puede realizar una administración posterior de la construcción. La administración se puede realizar, por ejemplo, al menos una semana, dos semanas, un mes, dos meses o seis meses después de la administración inicial. En algunos casos, las construcciones de la invención se pueden administrar al menos una vez a la semana, cada dos semanas, una vez al mes o a intervalos más prolongados. Las construcciones se pueden administrar, por ejemplo, a intervalos dictados por la reducción de los efectos de la administración anterior.

Cualquiera de las dos entidades de la invención se puede administrar por separado, secuencial o simultáneamente. Así pues, dos construcciones o más construcciones, donde al menos una construcción es una construcción de la invención, se pueden administrar por separado, simultánea o secuencialmente y, en particular, dos o más construcciones de la invención se pueden administrar de dicha manera. Las dos se pueden administrar en la misma

o diferentes composiciones. En un caso preferido, las dos construcciones se pueden administrar en la misma composición.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una construcción de la invención y cualquiera de los otros agentes descritos en el presente documento.

Medicamentos y métodos

La invención también proporciona el uso de una construcción de la invención en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. El método puede ser para tratar, prevenir o mejorar cualquiera de las afecciones mencionadas en el presente documento. En un caso, el método puede ser un método de terapia génica. En otro caso, el método puede ser un método de vacunación o inmunización. En un caso, la vacunación o inmunización es para tratar, prevenir o mejorar una infección, una afección autoinmune, alergia o cáncer.

La invención también proporciona el uso de una construcción de la invención en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno genético, una afección crónica, cáncer, alergia, autoinmunidad, infección o un cáncer. En un caso preferido, la invención proporciona la fabricación de medicamentos para tratar cualquiera de las afecciones mencionadas en el presente documento. En un caso particularmente preferido, la enfermedad por tratar es un trastorno de las vías respiratorias. En particular, el trastorno de las vías respiratorias se selecciona entre fibrosis quística, asma, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), bronquitis, edema pulmonar y cáncer de pulmón.

La descripción también proporciona un método de tratamiento de un trastorno que comprende la administración de una construcción de la invención en una cantidad eficaz a un sujeto que padece un trastorno de este tipo. Se puede tratar cualquiera de las afecciones mencionadas en el presente documento. La invención también proporciona agentes que comprenden construcciones de la invención y, opcionalmente, cualquiera de los otros números enteros especificados en el presente documento para su uso en el tratamiento de las afecciones mencionadas en el presente documento.

La presente invención también proporciona un método no terapéutico de expresión de una secuencia en un sujeto, método que comprende la administración de una construcción de la invención que codifica una secuencia no terapéutica para la expresión, en la que el promotor hCEFI está unido operativamente a una secuencia no terapéutica para la expresión.

La presente invención también proporciona un método de expresión in vitro o ex vivo de un gen en una célula, un tejido u un órgano, método que comprende introducir una construcción de la invención en dichas células, tejido u órgano.

Animales no humanos y células

En una realización adicional, la descripción proporciona un animal no humano o un ave que comprende una construcción de la invención. El animal no humano puede ser cualquiera de los mencionados en el presente documento y, en particular, puede ser un roedor o un animal de importancia agrícola, o un ave tal como, por ejemplo, las mencionadas en el presente documento.

Dichos animales no humanos pueden ser transgénicos y, por tanto, pueden comprender normalmente la construcción en todas las células de su organismo. En otros casos, la construcción solo puede estar presente, estar principalmente presente o estar presente casi en su totalidad en uno de los tejidos o tipos de células mencionados en el presente documento.

En una realización, la descripción proporciona, por tanto, un animal transgénico que comprende una construcción de la invención. Además, se puede usar la dirección de genes para introducir un promotor de la invención en una ubicación deseada del genoma de un animal.

Así pues, la invención también proporciona una construcción de dirección que comprende un promotor de la invención y, por lo general, al menos dos regiones de homología con el genoma del animal de destino a permitir la recombinación homóloga. La descripción también proporciona células madre no humanas aisladas y, en particular, células madre embrionarias que comprenden un promotor la invención, particularmente, uno introducido a través de la dirección de genes. En una realización adicional, se describen células madre humanas aisladas, incluyendo células madre embrionarias y no embrionarias y, en particular, células madre no embrionarias. Se describen células madre hematopoyéticas que comprenden una construcción de la descripción.

La presente descripción también proporciona células aisladas que comprenden una construcción de la invención y, en particular, de cualquiera de los tejidos mencionados en el presente documento. En particular, se proporcionan células hepáticas y pulmonares. También se describen tipos de células tales como células HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamíferos que comprenden promotores o construcciones de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Ratones

Se usaron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas durante todo el estudio. Los ratones fueron alojados de acuerdo con las directrices éticas y de bienestar del ministerio del interior británico, y se alimentaron con comida y agua convencionales a voluntad, dejando que se aclimataran durante al menos 7 días antes de los procedimientos que se estaban realizando.

ADN de plásmido

El ADN de plásmido se preparó usando el kit de purificación de plásmidos EndoFree de QIAGEN (QIAGEN Ltd, Crawley, Reino Unido) o mediante un método patentado por Aldevron Inc (Fargo, ND, EE.UU.). En todos los casos, los niveles de contaminación de endotoxina fueron < 5 UE (unidades de endotoxina) por mg de ADN. El ADN se mantuvo en agua exenta de endonucleasa (Promega UK Ltd, Southampton, Reino Unido) a -80 ºC.

Preparación de GL67/ADNp y PEI/ADNp para instilación

Se formó un complejo de ADN plasmídico con GL67 (GL67 = formulación de GL67, DOPE, DMPE-PEG-5000 descrita por Eastman, et al. (1997) Hum Gene Ther 8(6): 765-73 según lo descrito (Lee, et al. (1996) Hum Gene Ther 7(14): 1701-17). En pocas palabras, se hidrató GL67 liofilizado (Genzyme, Massachusetts, EE.UU.) hasta 1,21 mM con agua para inyección (WFI) (B. Braun Medical) y se prepararon los liposomas por agitación vorticial. Se prepararon complejos de ADN plasmídico y liposoma GL67 combinando volúmenes iguales de soluciones de ADN y GL67. Las formulaciones finales contenían 80 g de ADN plasmídico complejado con GL67 en una relación molar de 0,25:1 en 100 l de agua para inyección. Se administraron 100 l de los complejos GL67/ADNp por instilación en el pulmón de los ratones.

Como alternativa, se formó un complejo de ADN plasmídico y polietilenimina (PEI) ramificada de 25 kDa (Sigma, Missouri, EE.UU.) esencialmente según lo descrito (Densmore, et al (2000). Mol Ther 1(2): 180-8). Se prepararon 4,3 mg/ml de soluciones de PEI (0,1 M de N) en PBS, se esterilizaron por filtración y se almacenaron a 4 ºC durante no más de un mes. Para preparar PEI/ADNp a una proporción de N:P de 10:1, se mezclaron 25,8 g de PEI con 20 g de ADNp hasta un volumen total de 100 l en WFI (0,2 mg/ml). Se administraron 100 l de los complejos de PEI/ADNp en el pulmón de los ratones.

Instilación de ADN plasmídico en las vías respiratorias de los ratones

Se anestesiaron los ratones mediante exposición al anestésico volátil Metofane (metoxiflurano) (Mallinckrodt Veterinary Inc., Illinois, EE.UU.) hasta que se alcanzó un estado de la anestesia de equilibrio, según lo determinado por un nivel de respuesta a pellizcos en la planta del pie. Se administró el ADN plasmídico en cualquier formulación de administración a los pulmones a través de la nariz, mientras se mantenía verticalmente con la boca cerrada. Se mantuvo una sola gota continua pipeteando el volumen de dosis con una pipeta Gilson P200 (Gilson Inc., Middleton, WI, EE.UU.), siendo el líquido absorbido por el ratón al insuflar.

Preparación de GL67/ADNp y PEI/ADNp para aplicación por aerosol

Para los estudios de aplicación por aerosol, se preparó GL67/ADN plasmídico en una proporción de 0,75:1 mM. Los liposomas se generaron por hidratación de GL67 a 11,4 mM con WFI. Se formaron complejos entre 10 ml de la mezcla final que contenía 2,5 mg/ml de ADN plasmídico y GL67. Se preparó PEI/ADN plasmídico para una sola administración por aerosol a una concentración de 0,2 mg/ml en un volumen total de 10 ml en WFI, a una proporción de N:P de 10:1. Los complejos se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de la aplicación por aerosol.

Aplicación por aerosol de ADN plasmídico en las vías respiratorias de los ratones

Se dispusieron los ratones en el interior de una cámara de exposición de 8,4 l (dimensiones interiores de 24,6 cm x 24,6 cm x 13,8 cm). Se colocó un máximo de 36 ratones dentro de la cámara para cualquier exposición al aerosol dada, y se dejó que los ratones se movieran libremente por el interior de la cámara mientras duró el estudio. Una vez dentro de la cámara, se cerró la tapa y se selló usando cinta aislante de 38 mm de anchura para crear un sello hermético del aerosol. Se dispuso un total de 10 ml de formulación de transferencia de genes en el depósito de bien el nebulizador de chorro Aerotech II (CIS-US Inc, Bedford, MA, EE.UU.) (para los aerosoles de PEI/ADN) o el nebulizador de chorro PARI LC+ (PARI GmbH, Starnberg, Alemania) (para los aerosoles de GL67/ADN), y se generó el aerosol haciendo pasar gas comprimido desde un cilindro a través del dispositivo. El aerosol generado se dirigió desde el nebulizador de la cámara de exposición a lo largo de un tubo de PVC de 15 mm de diámetro interno conectado centralmente en el techo de la cámara por medio de un adaptador de poliacetilo construido especialmente para el estudio. Se ventiló el exceso de aerosol del interior de la cámara a la atmósfera por medio de un tubo de 10 mm de diámetro situado en un lado de la cámara y conectado a un filtro de aire Midistart 2000 PTFE de 0,2 m (Sartorius AG, Goettingen, Alemania) para los experimentos en los que se usó el nebulizador Aerotech II. No se incluyó filtro para los experimentos en los que se usó el nebulizador PARI LC+, pues se encontró que la retropresión

generada ponía en grave peligro la producción del aerosol. Se administraron por aerosol 10 ml de ambos complejos en aproximadamente 30 minutos.

Recogida de BALF y preparación de homogeneizados pulmonares de ratón

Cuando fue necesario, se sacrificaron los ratones por exposición a una concentración creciente de CO2 o por dislocación cervical. Para recoger el BALF, se dejó la tráquea al descubierto y se canuló, se lavaron los pulmones cuatro veces con 1 ml de solución de BALF (1 PBS, BSA al 0,1 % p/v, EDTA 0,05 mM) extraída y mantenida en hielo. Se retiraron los pulmones y la tráquea en bloque y se incubaron en 200 l de 1 x tampón de lisis indicador (RLB) (Promega, Southampton, Reino Unido) a 4 ºC durante hasta 30 minutos antes de su almacenamiento a -80 ºC. A continuación, se descongelaron los pulmones a temperatura ambiente y se homogeneizaron durante 15-30 segundos a la máxima potencia con un homogeneizador de tejidos Ultra-Turrax T8 (Janke y Kunkel GmbH, Staufen, Alemania). Se centrifugaron los lisados pulmonares durante 5 minutos a 16.000 rcf en un microcentrifugador. Se recogió el sobrenadante de lisado, se transfirió a una columna QIAshredder (Qiagen, Crawley, Reino Unido) y se centrifugó durante otros dos minutos. Se almacenaron los lisados a -80 ºC y se descongelaron a temperatura ambiente antes de ensayarlos para determinar la actividad de la luciferasa y el contenido de proteína.

Análisis de BALF - Recuentos de neutrófilos y niveles de citoquinas

Se concentraron las células del BALF por centrifugación a 400 rcf durante 10 minutos a 4 ºC. Se volvió a suspender el sedimento celular en 1,1 ml de solución de BALF; se recogió el sobrenadante y se conservó para el análisis por separado. Se retiró una muestra de 100 l de las células resuspendidas para realizar el recuento de las células nucleadas. Se mezcló la muestra con un volumen igual de solución de Turks (ácido acético glacial al 3 % v/v, cristal violeta al 1 % v/v) y se contaron las células nucleadas en un hemacitómetro. Se cuantificaron los niveles de TNF-, IL-12 e IFN- en el sobrenadante de BALF usando el ensayo de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA), kits de inmunoensayo Quantikine M (R & D Systems, Minneapolis, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cuantificación de la actividad de la luciferasa

Se determinó la actividad de la luciferasa en lisados pulmonares usando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Southampton, Reino Unido) y un luminómetro TD-20/20 Turner Designs (Steptech Instrument Services). Se normalizó la actividad de la luciferasa frente a la proteína pulmonar total cuantificada usando el kit de ensayo convencional de proteínas II Bio-Rad (Bio-Rad, Larne, Reino Unido) usando un lector de placa de espectrofotómetro Spectramax 250 y el programa informático SOFTmax Pro (Molecular Devices, Wokingham, Reino Unido).

Ejemplo 1

Para estudiar los efectos de los dinucleótidos CpG, se administraron diversas construcciones a ratones. Las construcciones se administraron en el pulmón de los ratones, y se midieron los niveles de citoquinas y neutrófilos del BALF para evaluar la inducción de la inflamación.

En la primera serie de experimentos, se administraron construcciones que comprendían lo siguiente:

(i) una construcción de primera generación del tipo representado en la Figura 7, que contenía 317 dinucleótidos CpG en la construcción; (Ii) una construcción de segunda generación del tipo representado en la Figura 7, que contenía 193 dinucleótidos CpG en la construcción; y

(iii) una construcción de tercera generación del tipo representado en la Figura 7, que contenía cero dinucleótidos CpG en la construcción.

Además, se emplearon ratones sin tratamiento previo. Se midieron los niveles de TNF-, IFN- e IL-12, así como el número de neutrófilos del BALF. Los resultados obtenidos se muestran gráficamente en los cuatro gráficos de la Figura 4a. Estos muestran que la administración de construcciones que no comprenden dinucleótidos CpG elimina casi por completo el aumento de los marcadores inflamatorios medidos que se observan con las construcciones que comprenden dinucleótidos CpG.

En una serie adicional de experimentos, se midió el efecto de la adición de un solo dinucleótido CpG. Se administraron las siguientes construcciones:

(i) una construcción de primera generación del tipo representado en la Figura 7, que contenía 317 dinucleótidos CpG en la construcción; (Ii) una construcción de tercera generación del tipo representado en la Figura 7, pero que se había modificado para volver a introducir un solo dinucleótido CpG; y

(iii) una construcción de tercera generación del tipo representado en la Figura 7 con cero dinucleótidos CpG.

Los resultados obtenidos se muestran en los tres gráficos de la Figura 4b, y muestran que la adición de solo una secuencia CpG es suficiente para dirigirse a los síntomas gripales y la inflamación pulmonar.

Así pues, las construcciones que emplean cero dinucleótidos CpG ayudarán a eliminar los síntomas gripales y la inflamación pulmonar cuando las construcciones se administran in vivo. Los plásmidos de primera generación tales como pCIK Lux y pUb Lux han sido descritos por Gill D. R. et al (2001) “Gene Therapy”, octubre; 8 (20): 1539-1546.

Los plásmidos de tercera generación son derivados de pCpG-LacZ disponibles en Invivogen, cuya secuencia se puede encontrar en http://www.invivogen.com/sequence/pCpG-LacZ_Seq.rtf.

Para apoyar todavía más estas observaciones, la Figura 4c muestra los resultados obtenidos cuando los ratones reciben:

(i): la construcción pCIKLux - un plásmido de primera generación con 317 CpG;

(ii): pGM169 que contiene la secuencia de codificación de CFTR, la combinación del potenciador/promotor hCEFI, y ningún CpG. (PGM169 tiene la secuencia modificada de la SEC ID Nº 2, en la que el nucleótido 2595 es C, el nucleótido 3234 es T y el nucleótido 3236 es C); y

(iii) agua - como control negativo.

Los resultados obtenidos muestran que, en ausencia de CpG, las construcciones han provocado una escasa o nula respuesta inflamatoria

Ejemplo 2

Los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 mostraron que la eliminación de los dinucleótidos CpG eliminaba las respuestas inflamatorias no deseadas debidas a la presencia de los dinucleótidos. Sin embargo, las construcciones de tercera generación no lograron dar lugar a una expresión sostenida y de alto nivel. Por consiguiente, se realizaron otras modificaciones en las construcciones.

En particular, se generaron construcciones de cuarta generación introduciendo un promotor hCEFI que consistía en un potenciador CMV humano y el promotor EF1a humano. Además, se hicieron otras modificaciones para emplear un gen de resistencia a antibióticos alternativo y eliminar las regiones de unión a la matriz (MAR). La secuencia de las construcciones de cuarta generación ilustrativas se proporciona en la SEC ID Nº 1 (construcción pGM160 con ninguna secuencia de codificación), SEC ID Nº 2 (construcción pGM151 que codifica un polipéptido CFTR expresado a partir del promotor hCEFI y que ha sido optimizado en codones; se obtienen resultados similares usando una construcción de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es C y los nucleótidos 3234 y 3236 son T y C, respectivamente) y SEC ID Nº 4 (construcción pGM144 que codifica un polipéptido de luciferasa de luciérnaga, soLux, expresado a partir del promotor hCEFI y que ha sido optimizado en codones.

Para evaluar la eficacia del promotor hCEFI, se usó la construcción pGM144. Se usó el gen de la luciferasa de luciérnaga (soLux) bajo el control transcripcional de hCEFI como gen indicador. El gen indicador de la luciferasa permite el control de la expresión desde el promotor hCEFI y, por lo tanto, se pueden medir el nivel y la duración de la expresión.

Para evaluar la eficacia de la administración en aerosol de pGM144 a los ratones, se usaron dos formulaciones diferentes, en concreto los aerosoles GL67 y PEI. La construcción pGM144 se evaluó de un lado a otro con una serie de diferentes construcciones.

En particular, usando los aerosoles GL67 que comprendían las construcciones, se administraron las siguientes construcciones:

(i): pGM144 (también conocido como pG4hCEFI soLux), que usa el promotor hCEFI para la expresión de la luciferasa y que tiene cero dinucleótidos CpG en la construcción;

(ii): pG2Ubc Lux (pGM105), que usa el promotor poliubiquitina C humano para la expresión y comprende 245 dinucleótidos CpG en la construcción;

(iii) pG4GZB soLux (pGM142), que usa el potenciador y el promotor CMV humano, y que tiene cero dinucleótidos CpG en la construcción;

(iv): pG4mCEFI soLux (pGM141), que emplea el potenciador CMV murino y el promotor EFIa humano, y que tiene cero dinucleótidos CpG en la construcción; y

(v): pG1 CMV lux (pCILux) que usa el promotor CMV IE y el potenciador para la expresión, y que comprende 317 dinucleótidos en la construcción.

Además, se administraron las siguientes construcciones usando el polímero catiónico PEI:

(i): pGM144 (pG4hCEFI soLux), que usa el promotor hCEFI para la expresión de la luciferasa y que tiene cero dinucleótidos CpG en la construcción;

(ii): pG4GZB soLux (pGM142, que usa el potenciador y el promotor CMV humano, y que tiene cero dinucleótidos CpG en la construcción;

(iii) pG4 mCEFI soLux (pGM141), que emplea el potenciador CMV murino y el promotor EFIa humano, y tiene cero dinucleótidos CpG en la construcción; y

(iv) pG3 mCEFI Lux (pGM139), una construcción adicional que emplea el potenciador CMV murino y el promotor EFIa humano, y que tiene cero dinucleótidos CpG en la construcción. La construcción también comprende regiones de unión a la matriz.

Inesperadamente, la construcción pGM144, en la que se empela el promotor hCEFI de la invención, fue la única construcción que dio lugar a una expresión sostenida y de alto nivel con GL67 (Figura 5) y PEI (Figura 6). Ninguna de las otras construcciones dio lugar a una expresión comparable con la administración de GL67 o PEI. La otra única construcción que dio lugar a una expresión apreciable 28 días después de la administración fue el promotor poliubiquitina C humano presente en la construcción pG2 UBC Lux, que dio sustancialmente menos expresión que el promotor hCEFI.

Los resultados fueron sorprendentes, en particular, dado que la construcción pGM141 tiene un material compuesto de potenciador CMV murino y el promotor EF1a humano y, sin embargo, no da ninguna expresión significativa, mientras que el promotor hCEFI comprende un material compuesto de potenciador CMV humano y el promotor EF1a humano, y es muy superior. No hubo indicios de que el potenciador CMV murino en combinación con el promotor EF1a humano fuera algo más que funcional.

Los resultados obtenidos muestran que el promotor hCEFI se puede usar para obtener expresión sostenida y alta usando el gen indicador de la luciferasa como modelo para las secuencias de codificación en general. El modelo de pulmón de ratón sirve como un buen modelo in vivo y es particularmente útil para los trastornos de las vías respiratorias tales como la fibrosis quística.

Ejemplo 3

Los resultados obtenidos en el Ejemplo 2 mostraron que la combinación de promotor potenciador hCEFI exento de CpG en una estructura de plásmido exenta de CpG de cuarta generación (pGM144) dirigió una expresión sostenida y de alto nivel al formar un complejo bien con GL67 o con PEI y administrarlo en los pulmones del ratón.

En una serie adicional de experimentos, se evaluaron permutaciones alternativas de las versiones que contenían CpG y exentas de CpG del potenciador CMV humano, promotor del factor de alargamiento humano 1  y la estructura plasmídica.

Se formaron complejos entre las siguientes construcciones de expresión con GL67 y se administraron en los pulmones del ratón por aerosol.

(i): pGM146 (también denominado PG2 EF1a Lux), una construcción de segunda generación que usa el promotor del factor de alargamiento nativo 1a para la expresión de la luciferasa. Es importante destacar que el promotor contiene 18 CpG dentro de la región promotora y un total de 245 CpG en toda la construcción.

(ii): pGM147 (también denominada pG2 CEF1a Lux), una construcción de segunda generación que usa el potenciador CMV humano nativo acoplado al promotor del factor de alargamiento nativo 1a para la expresión de la luciferasa. Es importante destacar que la región promotora/potenciadora contiene 35 CpG dentro de la región promotora/potenciadora y un total de 262 CpG en toda la construcción.

(iii) pGM157 (también denominada pG2 hCEFI Lux), una construcción de segunda generación que usa el potenciador CMV humano exento de CpG acoplado con el promotor del factor de alargamiento 1a exento de CpG (promotor/potenciador hCEFI) para la expresión de la luciferasa. Es importante destacar que la región promotora/potenciadora contiene 0 CpG dentro de la región potenciadora/promotora y un total de 149 CpG en toda la construcción.

(iv) pGM144 (también denominado pG4 hCEFI soLux) descrito anteriormente, una construcción de cuarta generación que usa el potenciador CMV humano exento de CpG acoplado al promotor del factor de alargamiento 1a exento de CpG (el promotor potenciador hCEFI) para la expresión de la luciferasa. Es importante destacar que la totalidad de la construcción contiene 0 CpG.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8, la única construcción que dirigió la expresión sostenida de alto nivel en el pulmón murino fue pGM144 exenta de CpG, en la que la expresión fue dirigida por el potenciador/promotor hCEFI. El potenciador/promotor hCEFI en el contexto de una estructura de plásmido que contiene CpG de segunda generación (pGM157) dirigió la expresión transitoria de la luciferasa pulmonar. Además, el promotor del factor de alargamiento 1  que contenía CpG nativo con (pGM147) o sin (pGM146) el potenciador CMV humano dirigió la expresión transitoria de la luciferasa pulmonar.

Los resultados del Ejemplo 2 y 3 demuestran que, de las construcciones descritas, solo la combinación del potenciador/promotor hCEFI en el contexto de la estructura de plásmido de cuarta generación exenta de CpG dirige la expresión transgénica pulmonar sostenida y de alto nivel. Ni el uso del potenciador/promotor hCEFI en una estructura de plásmido de segunda generación ni el uso de combinaciones alternativas de potenciador/promotor en la estructura de plásmido de cuarta generación dirigió la expresión transgénica pulmonar sostenida y de alto nivel.

Ejemplo 4

Los resultados obtenidos en los Ejemplos 2 y 3 muestran que la combinación de promotor potenciador hCEFI exento de CpG en una estructura de plásmido exenta de CpG de cuarta generación (pGM144) dirige una expresión sostenida y de alto nivel cuando forma un complejo bien con GL67 o con PEI y se administra en los pulmones del ratón durante al menos 28 días.

En una serie adicional de experimentos, se evaluó la expresión génica pulmonar durante un período prolongado de tiempo tras la administración, y se comparó la expresión génica pulmonar con un derivado de pGM148 en el que se eliminó la versión exenta de CpG del potenciador CMV humano.

Se formaron complejos entre las siguientes construcciones de expresión y GL67, y se administraron en los pulmones del ratón por aerosol:

(i): pGM144 (también denominado pG4 hCEFI soLux) descrito anteriormente, una construcción de cuarta generación que usa el potenciador CMV humano exento de CpG acoplado al promotor del factor de alargamiento 1a exento de CpG (el promotor potenciador hCEFI) para la expresión de la luciferasa. Es importante destacar que toda la construcción contiene 0 CpG.

(ii): pGM148 (también denominado pG4 EFI soLux), que es una construcción de cuarta generación que usa solo el promotor del factor de alargamiento 1a exento de CpG para la expresión de la luciferasa. Es importante destacar que toda la construcción contiene 0 CpG.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9. La única construcción que dirigió una expresión en pulmón de ratón sostenida y de alto nivel fue pGM144 exenta de CpG, en la que la expresión fue dirigida por el potenciador/promotor hCEFI. El promotor EFI solo en el contexto de la estructura de plásmido exenta de CpG de cuarta generación (pGM148) dirigió una expresión de la luciferasa pulmonar irrelevante. Además, pGM144 muestra una expresión de la luciferasa pulmonar sostenida y de alto nivel durante al menos 56 días tras una sola administración.

Conclusiones

En la expresión de secuencias, se desea una expresión de alto nivel y sostenida. El promotor hCEFI proporciona dicha expresión y ha demostrado ser superior a una gran variedad de promotores. Además, también se desea la eliminación, o al menos la reducción, de la inflamación inducida por vectores cuando se administra in vivo. El trabajo descrito en el presente documento también muestra que la eliminación de secuencias CpG encontradas en los vectores de expresión de plásmidos comunes inhibe la inflamación asociada con dichas secuencias y, en particular, cuando las construcciones se administran en el pulmón. Por lo tanto, se puede conseguir la expresión de alto nivel y sostenida, y la reducción o eliminación de la inflamación no deseada.

Listado de secuencias

<110> Isis Innovation Limited

<120> Construcción

<130> JA38566P.WOP

<150> GB0606190.7

<151>

<160>5

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2103

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> construcción de plásmido pGM160

<220>

<221> misc_feature 5 <222> (1)..(6)

<223> sitio de restricción BglII

<220>

<221> potenciador

<222> (7)..(308)

<223> potenciador CMV humano

<220>

<221> misc_feature

<222>: (309)..(314) 15 <223> sitio de restricción EcoRI

<220>

<221 > promotor

<222> (315)..(538)

<223> promotor del factor de alargamiento humano 1 

<220>

<221> misc_feature

<222>: (329)..(334) 25 <223> sitio de la enzima de restricción SphI

<220>

<221> misc_feature

<222> (539)..(569)

<223> Exón

<220>

<221> misc_feature

<222>: (570)..(709) 35 <223> Intrón

<220>

<221> misc_feature

<222> (710)..(727)

<223> Exón

<220>

<221> misc_feature

<222>: (728)..(733) 45 <223> sitio de restricción NheI

<220>

<221> misc_feature

<222> (734)..(734)

<223> A incluido para evitar el dinucleótido CpG

<220>

<221> misc_feature

<222>: (735)..(740) 55 <223> sitio de la enzima de restricción Apal

<220>

<221 > señal de polyA

<222> (740)..(941)

<223> secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento bovina

<220>

<221> misc_feature

<222>: (936)..(941) 65 <223> sitio de restricción SphI de polyA

<220>

<221> misc_feature

<222> (942)..(942)

<223>: A incluido para evitar el dinucleótido CpG 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (943)..(1214)

<223>: origen de replicación R6K 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (1215)..(1215)

<223>: A incluido para evitar el dinucleótido CpG 15

<220>

<221> misc_feature

<222> (1216)..(1221)

<223>: sitio de restricción KpnI 20

<220>

<221> misc_feature

<222> (1222)..(2036)

<223>: marcador de resistencia a la kanamicina 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (2038)..(2043)

<223>: sitio de restricción Bam HI 30

<220>

<221> misc_feature

<222> (2044)..(2049)

<223>: sitio de unión al ribosoma de Shine Delgarno 35

<220>

<221 > promotor

<222> (2050)..(2103)

<223>: promotor bacteriano EM7 40

<400> 1

<210>2

<211> 6549 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223>: construcción de plásmido 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223>: sitio de enzima de restricción BglII 15

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(308)

<223>: potenciador CMV humano 20

<220>

<221> misc_feature

<222> (309)..(314)

<223>: sitio de restricción Eco RI 25

<220>

<221 > promotor

<222> (315)..(538)

<223>: promotor del factor de alargamiento humano 1  30

<220>

<221> misc_feature

<222> (329)..(334)

<223>: sitio de restricción Sph I 35

<220>

<221> misc_feature

<222> (539)..(569)

<223>: exón 40

<220>

<221 > Intrón

<222> (570)..(709)

<223>: Intrón 45

<220>

<221> misc_feature

<222> (710)..(727)

<223>: exón 50

<220>

<221> misc_feature

<222> (728)..(733)

<223>: sitio de restricción Nhe I 55

<220>

<221 > misc_feature

<222> (733)..(737)

<223>: secuencia Kozak 60

<220>

<221 > CDS

<222> (738)..(5180)

<223> ADNc de CFTR optimizado en codones

5 <220>

<221> misc_feature

<222> (1183)..(1188)

<223> sitio de restricción Sph I

<220>

<221> misc_feature

<222> (4865)..(4870)

<223> sitio de restricción Bam HI

15 <220>

<221 > señal de polyA

<222> (5181)..(5186)

<223> sitio de restricción Apal

<220>

<221 > señal de polyA

<222> (5186)..(5387)

<223> secuencia poly A del gen de la hormona del crecimiento bovino

25 <220>

<221> misc_feature

<222> (5382)..(5387)

<223> sitio de restricción Sph I de poly A

<220>

<221> misc_feature

<222> (5388)..(5388)

<223> A incluido para evitar la aparición del dinucleótido cpg

35 <220>

<221> rep_origin

<222> (5389)..(5660)

<223> origen de replicación R6K

<220>

<221> misc_feature

<222> (5661)..(5661)

<223> A incluido para evitar la aparición del dinucleótido cpg

45 <220>

<221> misc_feature

<222> (5662)..(5667)

<223> sitio de restricción kpn I

<220>

<221> misc_feature

<222> (5668)..(6483)

<223> marcador de resistencia a la kanamicina

55 <221>misc_feature <222>(6484)..(6489)

<223> sitio de restricción Bam Hi

<220> <221>misc_feature <222>(6490)..(6495)

<223> sitio de unión al ribosoma de shine delgarno

65 <220> <221>promotor

<222> (6496)..(6549)

<223> promotor bacteriano EM7

<400> 2

<210>3

<211> 1480

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética

10 <400> 3

<210>4

<211> 3759

<212> ADN

<213> secuencia artificial 5

<220>

<223> construcción de plásmido pGM144

<220>

<221 > misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> sitio de restricción Bgl II

<220>

<221: > potenciador 15 <222> (7)..(308)

<223> potenciador CMV humano

<220>

<221 > misc_feature

<222> (309)..(314)

<223> sitio de restricción EcoRI

<220>

<221: > promotor 25 <222> (315)..(538)

<223> promotor del factor de alargamiento humano 1 

<220>

<221 > misc_feature

<222> (329)..(334)

<223> sitio de restricción Sph I

<220>

<221: > misc_feature 35 <222> (539)..(569)

<223> Exón

<220>

<221 > misc_feature

<222> (570)..(709)

<223> Intrón

<220>

<221: > misc_feature 45 <222> (710)..(727)

<223> Exón

<220>

<221 > misc_feature

<222> (728)..(733)

<223> sitio de restricción NheI

<220>

<221: > misc_feature 55 <222> (733)..(737)

<223> secuencia Kozak

<220>

<221 > CDS

<222> (738)..(2390)

<223> gen indicador de la luciferasa

<220>

<221> misc_feature 65 <222> (2391)..(2396)

<223> sitio de enzima de restricción Apa I

<220>

<221 > polyA_signal

<222> (2396)..(2597)

<223>: secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento bovina 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2592)..(2597)

<223>: sitio de la enzima de restricción Sph I de poly A 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (2598)..(2598)

<223>: A incluido para evitar el dinucleótido cpg 15

<220>

<221> rep_origin

<222> (2599)..(2870)

<223>: origen de replicación R6K 20

<220>

<221> misc_feature

<222> (2871)..(2871)

<223>: A incluido para evitar el dinucleótido cpg 25

<220>

<221> misc_feature

<222> (2872)..(2877)

<223>: sitio de restricción KpnI 30

<220>

<221> misc_feature

<222> (2878)..(3693)

<223>: marcador de resistencia a la kanamicina 35

<220>

<221> misc_feature

<222> (3694)..(3699)

<223>: sitio de restricción BamHI 40

<220>

<221> misc_feature

<222> (3700)..(3705)

<223>: secuencia de unión al ribosoma de Shine Delgarno 45

<220>

<221 > promotor

<222> (3706)..(3759)

<223> promotor bacteriano EM7

50 <400>4

<210>5

<211> 550

<212> PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> construcción sintética

10 <400> 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a una secuencia para la expresión, en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende:

(i)

una secuencia de los nucleótidos 7 a 538 de SEC ID Nº 1; o

(ii)

una secuencia de al menos 200 nucleótidos de (i); o

(iii) una secuencia de al menos un 80 % de identidad de secuencia con (i),

en la que la secuencia potenciadora y promotora comprende menos de 15 dinucleótidos CpG.
2.

Una construcción de acuerdo con la reivindicación 1, que es una construcción plasmídica.
3.

Una construcción de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la secuencia potenciadora y promotora no comprende ningún dinucleótido CpG.
4.

Una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la construcción no comprende ningún dinucleótido CpG.
5.

Una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia para la expresión codifica un polipéptido terapéutico.
6.

Una construcción de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la secuencia que se va a expresar codifica un polipéptido CFTR, donde la construcción comprende:

(i)

la secuencia de SEC ID Nº 2 o la secuencia de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es C y/o el nucleótido 3234 y 3236 son T y C respectivamente; o

(ii)

una construcción con al menos un 70 % de identidad de secuencia con (i).
7.

Una composición farmacéutica que comprende una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
8.

Una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o cirugía, o para su uso como un medicamento.
9.

Uso de una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno genético, una afección crónica, cáncer, alergia, autoinmunidad, infección o un cáncer.
10.

Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la enfermedad que se va a tratar es un trastorno de las vías respiratorias.
11.

Un método no terapéutico de expresión de una secuencia en un sujeto animal no humano, método que comprende administrar una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia potenciadora y promotora está unida operativamente a una secuencia no terapéutica para la expresión.
12.

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia o el complemento de una secuencia, seleccionado del grupo que comprende:

(i)

la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2; y

(ii)

la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 738 a 5180 de SEC ID Nº 2 en la que el nucleótido 2595 es modificado de A a C y/o los nucleótidos 3234 y 3236 son modificados de C a T y de G a C, respectivamente.
13.

Un método in vitro o ex vivo de expresión de un gen en una célula, un tejido o un órgano, método que comprende introducir una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en dichas células, tejido u órgano.
14.

Una secuencia potenciadora y promotora aislada, siendo la secuencia potenciadora y promotora como se ha definido en la reivindicación 1 o 4.
15.

Una construcción que comprende una secuencia potenciadora y promotora unida operativamente a un sitio de restricción, en la que:

(i)

la secuencia potenciadora y promotora es como se ha definido en la reivindicación 1 o 3; y

(ii)

la inserción de las secuencias de codificación en el sitio de restricción generará su unión operativa con la secuencia potenciadora y promotora.